JPS615787A - 昆虫細胞内でのポリペプチド類の産生 - Google Patents
昆虫細胞内でのポリペプチド類の産生Info
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- JPS615787A JPS615787A JP60017702A JP1770285A JPS615787A JP S615787 A JPS615787 A JP S615787A JP 60017702 A JP60017702 A JP 60017702A JP 1770285 A JP1770285 A JP 1770285A JP S615787 A JPS615787 A JP S615787A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は外来遺伝子を昆虫の細胞内で発現させるための
方法ならびにその産物に関し、より詳細には目的の遺伝
子産物をコードする外来遺伝子を昆虫ウィルスのウィル
ス染色体（これは染色体に組み込まれた強力な遺伝子プ
ロモーターの制御下にある）の中に挿入し、そのウィル
スベクターを昆虫細胞内に導入し、そして目的の遺伝子
産物を発現させることに関する。
方法ならびにその産物に関し、より詳細には目的の遺伝
子産物をコードする外来遺伝子を昆虫ウィルスのウィル
ス染色体（これは染色体に組み込まれた強力な遺伝子プ
ロモーターの制御下にある）の中に挿入し、そのウィル
スベクターを昆虫細胞内に導入し、そして目的の遺伝子
産物を発現させることに関する。
微生物系殺虫剤への関心は化学薬剤系殺虫剤の使用に関
係した問題の結果として生じてきた。化学薬剤系殺虫剤
は一般に害虫だけでなく益虫にも作用し、また昆虫はこ
の種の化学薬剤に対して耐性を獲得ずろ傾向があるので
化学薬剤系殺虫剤に耐性を示す新しい昆虫集団が急速に
発生ずる。さらに、残留化学薬剤は環境汚染をもたらし
、また健康上の問題をも引き起こすかもしれない。それ
故、昆虫に対して病原性を示す微生物（昆虫病原体）は
別の害虫駆除方法のための機会を提供し、統合された害
虫管理において１つの役割を演じかつ化学薬剤系殺虫剤
への依存性を減することができる。
係した問題の結果として生じてきた。化学薬剤系殺虫剤
は一般に害虫だけでなく益虫にも作用し、また昆虫はこ
の種の化学薬剤に対して耐性を獲得ずろ傾向があるので
化学薬剤系殺虫剤に耐性を示す新しい昆虫集団が急速に
発生ずる。さらに、残留化学薬剤は環境汚染をもたらし
、また健康上の問題をも引き起こすかもしれない。それ
故、昆虫に対して病原性を示す微生物（昆虫病原体）は
別の害虫駆除方法のための機会を提供し、統合された害
虫管理において１つの役割を演じかつ化学薬剤系殺虫剤
への依存性を減することができる。
自然界に存在する微生物または微生物の副産物が有用な
殺虫剤であり得ると認められてきた。多くの昆虫病原体
は比較的狭い宿主範囲を有しており、このことは特定の
害虫集団の減少を可能にするが、自然界の食肉動物や益
虫は保護されまた回復への機会が与えられる。昆虫駆除
に適する昆虫病原体にはある種の細菌、ウィルスおよび
真菌が含まれる。
殺虫剤であり得ると認められてきた。多くの昆虫病原体
は比較的狭い宿主範囲を有しており、このことは特定の
害虫集団の減少を可能にするが、自然界の食肉動物や益
虫は保護されまた回復への機会が与えられる。昆虫駆除
に適する昆虫病原体にはある種の細菌、ウィルスおよび
真菌が含まれる。
昆虫集団内で自然流行性の病気を引き起こすウィルス類
は殺虫剤として商業的に開発されてきた。
は殺虫剤として商業的に開発されてきた。
広く研究された１つのこのようなウィルス属は、二一り
ロヴイリグエ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｊ、ｄ−ａｅ’）て
ある。バクロウィルス類は膜で包まれた約１０〜１７Ｉ
Ｏナノメートル（径）Ｘ２５０〜／１００ナノメートル
（長さ）の桿状カブンドに包み込まれた大きい（約１０
０〜２００キロ塩基）、二本鎖の、共有結合で閉環した
環状ＤＮＡゲノムを有してし・る。
ロヴイリグエ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｊ、ｄ−ａｅ’）て
ある。バクロウィルス類は膜で包まれた約１０〜１７Ｉ
Ｏナノメートル（径）Ｘ２５０〜／１００ナノメートル
（長さ）の桿状カブンドに包み込まれた大きい（約１０
０〜２００キロ塩基）、二本鎖の、共有結合で閉環した
環状ＤＮＡゲノムを有してし・る。
゛バクロウィルス°°という名称はこの属に特徴的な桿
状ヌクレオカブ／トゝ構造に由来している。ヌクレオカ
ブ／、ドはウィルス構造の１単位であり、カノンド（タ
ン・ξり弥包膜）の中に核酸を包み込んだものから成っ
ている。
状ヌクレオカブ／トゝ構造に由来している。ヌクレオカ
ブ／、ドはウィルス構造の１単位であり、カノンド（タ
ン・ξり弥包膜）の中に核酸を包み込んだものから成っ
ている。
バクロウィルスはヌクレアーポリヘトゝローノスウイル
ス（ＮＰＶ）およびグラニュローシスウイルス（ＧＶ）
のサブグループを包含する。ＮＰＶおよびＧＶのウィル
ス粒子はタンパク質性結晶の中に内蔵されている。バク
ロウィルスの内蔵体においてはそのヴイリオン（膜で包
まれたヌクレオカブ７ド）が結晶タンパク質のマトリッ
クス内に埋封されている。この構造（多面形封入体とも
呼ばれる）は自然界にお（・て細胞外に見い出される形
体であって、生物にそのウィルス感染を広がらせる原因
となっている。サブグループＮＰＶは１個の大きな（１
５マイクロメートル以下）多面形結晶の中に用ｊ封され
た多数のヴイリオンを含むが、サブグループＧＶは小さ
な結晶中に埋封された１個のヴイリオンを訝む。両刀の
形体ともその結晶タンパク質のマトリックスは元来２５
０００〜３３０００グルトンの単一のポリＳブチトゝが
ら構成されている。
ス（ＮＰＶ）およびグラニュローシスウイルス（ＧＶ）
のサブグループを包含する。ＮＰＶおよびＧＶのウィル
ス粒子はタンパク質性結晶の中に内蔵されている。バク
ロウィルスの内蔵体においてはそのヴイリオン（膜で包
まれたヌクレオカブ７ド）が結晶タンパク質のマトリッ
クス内に埋封されている。この構造（多面形封入体とも
呼ばれる）は自然界にお（・て細胞外に見い出される形
体であって、生物にそのウィルス感染を広がらせる原因
となっている。サブグループＮＰＶは１個の大きな（１
５マイクロメートル以下）多面形結晶の中に用ｊ封され
た多数のヴイリオンを含むが、サブグループＧＶは小さ
な結晶中に埋封された１個のヴイリオンを訝む。両刀の
形体ともその結晶タンパク質のマトリックスは元来２５
０００〜３３０００グルトンの単一のポリＳブチトゝが
ら構成されている。
バクロウィルスのサブグループＮＰＶおよびＧＶは昆虫
病原体としての用途にっ℃・て研究された。バクロヴイ
リダエ属からのウィルスを使用する利点は（１）それら
が無を椎動物にだけ致死感染をおこさせる；（２）それ
らが比較的狭い宿主範囲を有する；（３）それらが−匹
の昆虫あたり十分なウィルス子孫を生産して商業的生産
を可能にする；および（４１ｔｊＰ■およびＧＶのウィ
ルス粒子が、環境内でそのウィルスをより安定化させ、
商業的に製造される微生物系釡虫剤としての貯蔵寿命を
増加させ、他の殺虫剤配合物との組合せを容易にするタ
ンパク質性Ｒ１晶の中に内蔵されている；などである。
病原体としての用途にっ℃・て研究された。バクロヴイ
リダエ属からのウィルスを使用する利点は（１）それら
が無を椎動物にだけ致死感染をおこさせる；（２）それ
らが比較的狭い宿主範囲を有する；（３）それらが−匹
の昆虫あたり十分なウィルス子孫を生産して商業的生産
を可能にする；および（４１ｔｊＰ■およびＧＶのウィ
ルス粒子が、環境内でそのウィルスをより安定化させ、
商業的に製造される微生物系釡虫剤としての貯蔵寿命を
増加させ、他の殺虫剤配合物との組合せを容易にするタ
ンパク質性Ｒ１晶の中に内蔵されている；などである。
殺虫剤として使用する場合、内蔵ウィルスは通常葉に散
布される。汚染された葉を食べた昆虫はウィルスにより
誘発される病気にががる。摂取されたウィルスは昆虫の
前隅を通って中腸へ行き、ここでアルカリ性ｐＨにより
タンパク質結晶が可溶化される。ヴイリオンはマトリッ
クスから放出されて微小絨毛膜との融合により中腸の柱
状細胞に感染し始める。昆虫が死亡してその外皮が分解
されると内蔵ウィルスはその周囲に放出され、それが感
受性宿主に取り込まれるとその感染を広める。
布される。汚染された葉を食べた昆虫はウィルスにより
誘発される病気にががる。摂取されたウィルスは昆虫の
前隅を通って中腸へ行き、ここでアルカリ性ｐＨにより
タンパク質結晶が可溶化される。ヴイリオンはマトリッ
クスから放出されて微小絨毛膜との融合により中腸の柱
状細胞に感染し始める。昆虫が死亡してその外皮が分解
されると内蔵ウィルスはその周囲に放出され、それが感
受性宿主に取り込まれるとその感染を広める。
最も広く研究されたバクロウィルスは比較的広ヘトゝロ
ーンスウイルス（ＡｃＮＰＶ）である。この型のウィル
スは非内蔵ウィルス体（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄｖｉ
ｒｕｓ、 Ｎ０Ｖ）および内蔵ウィルス体（ｏｃｃｌｕ
ｄｅｄｖｉｒｕｓ、 ＯＶ）または多面形封入体（ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒａ、１１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ＋
ＰＩＢ）と呼ばれる２つの成熟′ 形体に複製される。
ーンスウイルス（ＡｃＮＰＶ）である。この型のウィル
スは非内蔵ウィルス体（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄｖｉ
ｒｕｓ、 Ｎ０Ｖ）および内蔵ウィルス体（ｏｃｃｌｕ
ｄｅｄｖｉｒｕｓ、 ＯＶ）または多面形封入体（ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒａ、１１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ＋
ＰＩＢ）と呼ばれる２つの成熟′ 形体に複製される。
ＮＯＶ体および０１体の両方ともそのヌクレオカプシド
は膜で包まれているが、これらの表面膜の正確な性状は
異なっている。ＮＯＶのヌクレオカブノビは細胞膜、一
般には原形ｐ膜を通って成長し始めることにより表面膜
を獲得するが、○Ｖのヌクレオカプシドは核内で表面膜
を獲得する。
は膜で包まれているが、これらの表面膜の正確な性状は
異なっている。ＮＯＶのヌクレオカブノビは細胞膜、一
般には原形ｐ膜を通って成長し始めることにより表面膜
を獲得するが、○Ｖのヌクレオカプシドは核内で表面膜
を獲得する。
ＡｃＮＰＶのヌクレオカプシドゝは、膜による包囲が核
内で生じる場合に、通常１つの膜内に封入される。細胞
核内の膜で包まれたヌクレオカプシドは結晶タンパク質
のマトリックス中に埋封され得る。
内で生じる場合に、通常１つの膜内に封入される。細胞
核内の膜で包まれたヌクレオカプシドは結晶タンパク質
のマトリックス中に埋封され得る。
こうして生成したタンパク質結晶は多数の膜で包まれた
ヌクレオカプシドを富み、内蔵体、多面形封入体（ＰＩ
Ｂ）または多面体として知られている。
ヌクレオカプシドを富み、内蔵体、多面形封入体（ＰＩ
Ｂ）または多面体として知られている。
ＡｃＮＰＶの内蔵体は直径が約１〜４マイクロメートル
であって光学顕微鏡で見ることができる。各ヴイリオン
は１つの膜で包まれた１個またはそれ以上のヌクレオカ
プシドから成っている。１つの膜につ六１個以上のヌク
レオカブノビが存在し得るその形態学的特徴は多重埋封
ウィルスとして知られるＮＰＶの１つの型に特有であっ
て、１個のヌクレオカブノビが個々に膜で包まれている
ＮＰＶとは区別される。遺伝子繰作の見地からすると、
１つの膜につき多数のヌクレオカブノビの存在はＮＰＶ
の内蔵体にのみ特有であって非内蔵体には見られないと
いうことが重要であり、それ故非内蔵体を使用してよ゛
り簡単にこのウィルスをクローン化しかつ遺伝子操作す
ることが可能である。
であって光学顕微鏡で見ることができる。各ヴイリオン
は１つの膜で包まれた１個またはそれ以上のヌクレオカ
プシドから成っている。１つの膜につ六１個以上のヌク
レオカブノビが存在し得るその形態学的特徴は多重埋封
ウィルスとして知られるＮＰＶの１つの型に特有であっ
て、１個のヌクレオカブノビが個々に膜で包まれている
ＮＰＶとは区別される。遺伝子繰作の見地からすると、
１つの膜につき多数のヌクレオカブノビの存在はＮＰＶ
の内蔵体にのみ特有であって非内蔵体には見られないと
いうことが重要であり、それ故非内蔵体を使用してよ゛
り簡単にこのウィルスをクローン化しかつ遺伝子操作す
ることが可能である。
ＡｃＮＰＶのＤＮＡゲノム（１２８キロ塩基）は種々の
制限エンドゝヌクレアーゼのための制限部位に関して地
図が作成されており、このＤＮＡゲノムは主に独特のヌ
クレオチド配列で構成されている。Ｌ、 Ｋ、 Ｍｉｌ
ｌｃｒらによる５ｃｉｅｎｃｅ、第２１９巻、７１５〜
７２１パージ（１９８３年２月１１日）を参照されたい
。
制限エンドゝヌクレアーゼのための制限部位に関して地
図が作成されており、このＤＮＡゲノムは主に独特のヌ
クレオチド配列で構成されている。Ｌ、 Ｋ、 Ｍｉｌ
ｌｃｒらによる５ｃｉｅｎｃｅ、第２１９巻、７１５〜
７２１パージ（１９８３年２月１１日）を参照されたい
。
ＡｃＮＰＶのＯｖ体はヴイリオンがアルカリ破壊によっ
て内蔵体から放出されない限り細胞培養において伝染性
でない。それ故、細胞培養で作られた０１体は細胞培養
中で非伝染性である。むしろ、ＮＯＶ体が細胞から細胞
へと伝染を広がらせる原因となっている。この伝染がさ
らに広がると、ウィルスは中腸細胞内で複製され、そし
て水底膜を通って昆虫の血リンパの中で生長し始めるＮ
ＯＶ体を生産する。血リンパの中へ放出される弁内蔵ヴ
イリオンは細胞培養にお℃・てその感染を広がらせるば
かりでなく、昆虫の全身感染の原因となる。
て内蔵体から放出されない限り細胞培養において伝染性
でない。それ故、細胞培養で作られた０１体は細胞培養
中で非伝染性である。むしろ、ＮＯＶ体が細胞から細胞
へと伝染を広がらせる原因となっている。この伝染がさ
らに広がると、ウィルスは中腸細胞内で複製され、そし
て水底膜を通って昆虫の血リンパの中で生長し始めるＮ
ＯＶ体を生産する。血リンパの中へ放出される弁内蔵ヴ
イリオンは細胞培養にお℃・てその感染を広がらせるば
かりでなく、昆虫の全身感染の原因となる。
ＡｃＮＰＶを感染させた細胞内でのウィルス誘導タンパ
ク質の合成は一時的に制御された方法である。ウィルス
誘導タンパク質の合成には次の４つの段階：（１）感染
の約２〜３時間後の初期アルファ相；（２）機能性タン
パク質およびＤＮＡの合成を必要とする中期ベータ相（
感染の６〜７時間後）；（３）ヴイリオンの構造タン・
ξり質の合成を含むガンマ相（１０時間後）；および（
４１内蔵に関係する後期デルタ相（１５時間後）；があ
る。
ク質の合成は一時的に制御された方法である。ウィルス
誘導タンパク質の合成には次の４つの段階：（１）感染
の約２〜３時間後の初期アルファ相；（２）機能性タン
パク質およびＤＮＡの合成を必要とする中期ベータ相（
感染の６〜７時間後）；（３）ヴイリオンの構造タン・
ξり質の合成を含むガンマ相（１０時間後）；および（
４１内蔵に関係する後期デルタ相（１５時間後）；があ
る。
Ａ ｃ ＮＰＶの伝染性弁内蔵ヴイリオンは感染の約１
０時間後に培地中に見い出される。内蔵用マトリックス
の主タンパク質であるポリヘトゝリン（ｐｏｌｙｈｅｄ
ｒｉｎ）の合成は感染の１２時間後に検出され、これは
感染の１６〜１８時間後の内蔵ウィルスの出現に先行す
る。
０時間後に培地中に見い出される。内蔵用マトリックス
の主タンパク質であるポリヘトゝリン（ｐｏｌｙｈｅｄ
ｒｉｎ）の合成は感染の１２時間後に検出され、これは
感染の１６〜１８時間後の内蔵ウィルスの出現に先行す
る。
ＡｃＮＰＶのタンパク質合成の一時的制御は恐らく転写
の一時的制御が原因している。ホリヘドリン遺伝子の転
写は感染の１２時間後に初めて観察され、そして１．２
キロ塩基の転写物が感染後２４時間またはそれ以上まで
に次第にその数を増していく。細胞培養においては通常
ＮＯＶ放出が内蔵に先行する。自然界のＡｃＮＰＶの場
合に、その感 、染はかなり広がるので死亡した感染宿
主生物の１０重量％程度が内蔵ウィルスで占められるか
もしれない。１０重量％という関係はウィルスの内蔵体
が確かに多量に生産されたことを示しており、かつこれ
と関連してポリヘトす／タフバク質も多量に生産された
ことを示している。
の一時的制御が原因している。ホリヘドリン遺伝子の転
写は感染の１２時間後に初めて観察され、そして１．２
キロ塩基の転写物が感染後２４時間またはそれ以上まで
に次第にその数を増していく。細胞培養においては通常
ＮＯＶ放出が内蔵に先行する。自然界のＡｃＮＰＶの場
合に、その感 、染はかなり広がるので死亡した感染宿
主生物の１０重量％程度が内蔵ウィルスで占められるか
もしれない。１０重量％という関係はウィルスの内蔵体
が確かに多量に生産されたことを示しており、かつこれ
と関連してポリヘトす／タフバク質も多量に生産された
ことを示している。
遺伝子操作の見地からすると、内蔵を制御する遺伝子は
細胞培養での感染にとって必要でなく、これらの遺伝子
の排除または置換は内蔵を制御する領域へパラセンジャ
ーＤ Ｎ４ （ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ＤＮＡ）を置換さ
せる機会を提供し、これは感染サイクルの後期にパラセ
ンジャー遺伝子を高水準で発現させるだろう。ＡｃＮＰ
Ｖ の内蔵体のマトリックスを構成する結晶性ポリヘト
す／タノ・ξり質は元来約３００００ダルト／の単一タ
ンパク廼である。内蔵体の約９５重量％はポリヘドリノ
から成って℃・る。それ故、感染宿主の体重中のウィル
スの比率が高いことで明らかなようにポリヘトす／は極
めて多量合成される。さらに、この単一タンパク廼の合
成レベルは、１個の細胞につき平均して６０個以上の内
蔵Ｉ＊（各内蔵体は直径が約４マイクロメートルである
）を生産するＡｃＮＰＶ の野性株を感染させた細胞に
より高められる。こうして、ポリヘトゞ’） ／ｍＲＮ
Ａ合成のためのプロモーターは格別強力であると考えら
れる。
細胞培養での感染にとって必要でなく、これらの遺伝子
の排除または置換は内蔵を制御する領域へパラセンジャ
ーＤ Ｎ４ （ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ＤＮＡ）を置換さ
せる機会を提供し、これは感染サイクルの後期にパラセ
ンジャー遺伝子を高水準で発現させるだろう。ＡｃＮＰ
Ｖ の内蔵体のマトリックスを構成する結晶性ポリヘト
す／タノ・ξり質は元来約３００００ダルト／の単一タ
ンパク廼である。内蔵体の約９５重量％はポリヘドリノ
から成って℃・る。それ故、感染宿主の体重中のウィル
スの比率が高いことで明らかなようにポリヘトす／は極
めて多量合成される。さらに、この単一タンパク廼の合
成レベルは、１個の細胞につき平均して６０個以上の内
蔵Ｉ＊（各内蔵体は直径が約４マイクロメートルである
）を生産するＡｃＮＰＶ の野性株を感染させた細胞に
より高められる。こうして、ポリヘトゞ’） ／ｍＲＮ
Ａ合成のためのプロモーターは格別強力であると考えら
れる。
Ａ、カリフォルニア ヌクレアーポリヘトゝローンスウ
イルスは無を椎動物での組み換えＤＮＡ研究および遺伝
子操作のためのベクターとして提案された。Ｌ、 Ｋ９
ＭｉｌｌｅｒのＪ、 Ｖｉｒｏｌ 、＋ ３９３９７３
を参照された（・。この開示は参照によりここに引用さ
れる。しがしながら、本発明の完成まで、このウィルス
または他の昆虫ウィルスのいずれもベクターとして使用
することはできなかった。
イルスは無を椎動物での組み換えＤＮＡ研究および遺伝
子操作のためのベクターとして提案された。Ｌ、 Ｋ９
ＭｉｌｌｅｒのＪ、 Ｖｉｒｏｌ 、＋ ３９３９７３
を参照された（・。この開示は参照によりここに引用さ
れる。しがしながら、本発明の完成まで、このウィルス
または他の昆虫ウィルスのいずれもベクターとして使用
することはできなかった。
従って、本発明の目的は昆虫細胞内で外来物ア１を発現
させるのに役立つベクターを提供することである。
させるのに役立つベクターを提供することである。
発明の概要
本発明によれば、組み換えＤＮＡ技術を用いて昆虫細胞
により外来遺伝子産物を発現させるのに初めて発現ベク
ターが使用される。本明細物で用（・る“遺伝子産物°
゛という用語は遺伝子の発現の最終産物を意味し、そし
て自然界における役割が構造的または酵素的でありうる
ＲＮＡ、ならびに自然界における役割が構造的または酵
素的でありうるｍＲＮＡの翻訳産物（すなわちグリコジ
ル化されたまたはグリコジル化されて（・ないポリペプ
チド）を含む。この定義はさらに遺伝子発現の際に調節
的役割を演するＲＮＡおよび＋ＯＩＪ ｏブチドを含
むものである。本発明は、有効なプロモーター（好まし
くは昆虫細胞での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーター）の制御下にある外来遺伝子産物を発現させるた
めに、例えばプラスミドまたはウィルスベクターなどの
発現ベクター（好ましくは昆虫ウィルスまたは昆虫病原
体ウィルスの発現ベクター）を用いる新規方法を提供す
る。さらに好適な実悔態様において詳しく述べると、本
発明はポリヘドリン遺伝子を取り囲むＮＰＶ（例えばＡ
ｃ ＮＰＶ ）の領域をクロフン化し、ポリヘビリフ
遺伝子領域を陰むプラスミドを得、プラスミドの形のま
までポリヘドリン遺伝子へ適当な・ぐクセ／ジャー遺伝
子を挿入するかまたはポリヘトす／遺伝子の少なくとも
１部分を適当な・ξクセ／ジャーＤＮＡで置換し、こう
して得られたパンセノジャーブラスミト″ＤＮＡを野性
株Ａｃｌ団ｐｖ のＤＮＡと共に適当な宿主細胞へ導
入して同時トラ／スフエクトシ、この形質転換宿主を使
用し′て外来遺伝子産物を産生ずることから成る。適切
に形質転換された宿主細胞は１例えばパラ七／ジャーＤ
ＮＡを用（・ての、ｆ ＩＪヘトす／遺伝：、−の対立
的置換（ａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が
内蔵体形成を欠くウィルスをもたらした表現型のウィル
スを選択することにより同定することができる。
により外来遺伝子産物を発現させるのに初めて発現ベク
ターが使用される。本明細物で用（・る“遺伝子産物°
゛という用語は遺伝子の発現の最終産物を意味し、そし
て自然界における役割が構造的または酵素的でありうる
ＲＮＡ、ならびに自然界における役割が構造的または酵
素的でありうるｍＲＮＡの翻訳産物（すなわちグリコジ
ル化されたまたはグリコジル化されて（・ないポリペプ
チド）を含む。この定義はさらに遺伝子発現の際に調節
的役割を演するＲＮＡおよび＋ＯＩＪ ｏブチドを含
むものである。本発明は、有効なプロモーター（好まし
くは昆虫細胞での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーター）の制御下にある外来遺伝子産物を発現させるた
めに、例えばプラスミドまたはウィルスベクターなどの
発現ベクター（好ましくは昆虫ウィルスまたは昆虫病原
体ウィルスの発現ベクター）を用いる新規方法を提供す
る。さらに好適な実悔態様において詳しく述べると、本
発明はポリヘドリン遺伝子を取り囲むＮＰＶ（例えばＡ
ｃ ＮＰＶ ）の領域をクロフン化し、ポリヘビリフ
遺伝子領域を陰むプラスミドを得、プラスミドの形のま
までポリヘドリン遺伝子へ適当な・ぐクセ／ジャー遺伝
子を挿入するかまたはポリヘトす／遺伝子の少なくとも
１部分を適当な・ξクセ／ジャーＤＮＡで置換し、こう
して得られたパンセノジャーブラスミト″ＤＮＡを野性
株Ａｃｌ団ｐｖ のＤＮＡと共に適当な宿主細胞へ導
入して同時トラ／スフエクトシ、この形質転換宿主を使
用し′て外来遺伝子産物を産生ずることから成る。適切
に形質転換された宿主細胞は１例えばパラ七／ジャーＤ
ＮＡを用（・ての、ｆ ＩＪヘトす／遺伝：、−の対立
的置換（ａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が
内蔵体形成を欠くウィルスをもたらした表現型のウィル
スを選択することにより同定することができる。
本発明に関連して用いられる他のプロモーターは単に７
．２Ｋプロティ／゛と呼ばれる７２００ゲルト／のタノ
ノξり賀のＡ、カリフォルニアによる合成を制餌１する
プロモーターである。Ａｄａ、ｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ
のＪ、Ｖｉｒｏｌ、旦、７８２−７９３（１９８２）
を参照されたい。ポリヘトす／タンノミりｅと同様に
、このり／−ξり質はウィルス抄製の内蔵相期間中に感
染後遅く発現される。このり／ノでり負の内蔵での正確
な機能はまだ知られていな℃・が、このタフバク賀を産
生ずる遺伝子はその位置が定められて確認されているの
で利用可能である。第１図を参照されたい。本明細書で
用いる”７．２Ｋプロモーター゛という用語は７．２Ｋ
プロティン゛の発現に関係する遺伝子を制御するプロモ
ーターを意味する。ＡｃＮＰＶ または他のところか
らの別のプロモーターも昆虫に外来遺伝子産物を発現さ
せる際に使用することができ、ノぐクロヴイリダエから
の他のプロモーター、ならびに他のウィルス、細菌、酵
母、他の真菌、昆虫および哺乳動物のプロモーターでさ
えも包含される。昆虫細胞内で機能的であるこれらのプ
ロモーターは、例えば対象の昆虫細胞に導入されてβ−
ガラクト／グーセ゛の産生が監視された以下に述べるＡ
ｃＮＰＶプロモーターｐＭｃｓ ７４ と置き換える
ことにより同定し得る。
．２Ｋプロティ／゛と呼ばれる７２００ゲルト／のタノ
ノξり賀のＡ、カリフォルニアによる合成を制餌１する
プロモーターである。Ａｄａ、ｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ
のＪ、Ｖｉｒｏｌ、旦、７８２−７９３（１９８２）
を参照されたい。ポリヘトす／タンノミりｅと同様に
、このり／−ξり質はウィルス抄製の内蔵相期間中に感
染後遅く発現される。このり／ノでり負の内蔵での正確
な機能はまだ知られていな℃・が、このタフバク賀を産
生ずる遺伝子はその位置が定められて確認されているの
で利用可能である。第１図を参照されたい。本明細書で
用いる”７．２Ｋプロモーター゛という用語は７．２Ｋ
プロティン゛の発現に関係する遺伝子を制御するプロモ
ーターを意味する。ＡｃＮＰＶ または他のところか
らの別のプロモーターも昆虫に外来遺伝子産物を発現さ
せる際に使用することができ、ノぐクロヴイリダエから
の他のプロモーター、ならびに他のウィルス、細菌、酵
母、他の真菌、昆虫および哺乳動物のプロモーターでさ
えも包含される。昆虫細胞内で機能的であるこれらのプ
ロモーターは、例えば対象の昆虫細胞に導入されてβ−
ガラクト／グーセ゛の産生が監視された以下に述べるＡ
ｃＮＰＶプロモーターｐＭｃｓ ７４ と置き換える
ことにより同定し得る。
こうして、真核生物環境内で真核細胞、原核細胞または
ウィルスのメツセンジャーＤＮＡの大キなセグメントを
増殖かつ発現させるために使用できる価値ある宿主／ベ
クター系が提供される。それ故、本発明は外来メツセン
ジャーＤＮＡ （遺伝子産物が細胞死を引き起こすもの
を含む）が無を椎動物環境内で高水準で増殖かつ発現さ
れるのを可能にする。
ウィルスのメツセンジャーＤＮＡの大キなセグメントを
増殖かつ発現させるために使用できる価値ある宿主／ベ
クター系が提供される。それ故、本発明は外来メツセン
ジャーＤＮＡ （遺伝子産物が細胞死を引き起こすもの
を含む）が無を椎動物環境内で高水準で増殖かつ発現さ
れるのを可能にする。
イルス（ＡｃＮＰＶ）を発現ベクターとして使用する方
法が開発され、ここにおいて、ｆ ＩＪヘトリン遺伝子
を包囲するＡｃＮＰＶ ＤＮＡのセグメントがプレスミ
１−゛ベクターを用いて太陽菌内でクロー／化される。
法が開発され、ここにおいて、ｆ ＩＪヘトリン遺伝子
を包囲するＡｃＮＰＶ ＤＮＡのセグメントがプレスミ
１−゛ベクターを用いて太陽菌内でクロー／化される。
先に述べたように、 ＡｃＮＰＶは広く研究されてきた
。Ａ ｃ ＮＰＶのす／プルはコネチカット州ニューヘ
プノのｔｈｅ Ｙａｌｅ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＵｎｉｔ（ＹＡＲＵ）を含む多数の入手源か
ら得ることができる。制限酵素は組み換えプラスミドＤ
ＮＡ土のｌ ＩＪヘドリノ遺伝子を切り開いてメツセン
ジャーＤＮＡの挿入部位をつくるために用いられる。
。Ａ ｃ ＮＰＶのす／プルはコネチカット州ニューヘ
プノのｔｈｅ Ｙａｌｅ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＵｎｉｔ（ＹＡＲＵ）を含む多数の入手源か
ら得ることができる。制限酵素は組み換えプラスミドＤ
ＮＡ土のｌ ＩＪヘドリノ遺伝子を切り開いてメツセン
ジャーＤＮＡの挿入部位をつくるために用いられる。
メツセンジャーＤＮＡは選択されて、クローノ化プラス
ミドの制限酵素で開かれた部位へ挿入される。次いでプ
ラスミド８は野性型ＡｃＮＰＶのＥＩＮＡと共に適当な
宿主細胞内へ導入しく例えばトラ７スフェクト）される
。その後、遺伝子変換または二重組み換え現象によって
、組み換えプラスミドからのＤＮ’Ａは全長野性型Ａｃ
ＮＰＶ染色体上のその対立遺伝子、すなわちポリヘドリ
ノ遺伝子と置き換わる。それ故、ウィルス内でＲＮＡ合
成がおこる場合、挿入されたノミラセンジャーＤＮＡか
ら読み取うれたメツセンジャーＦＩＮＡはその指示のも
とに新しい遺伝子産物を発現させるのに役立つ。
ミドの制限酵素で開かれた部位へ挿入される。次いでプ
ラスミド８は野性型ＡｃＮＰＶのＥＩＮＡと共に適当な
宿主細胞内へ導入しく例えばトラ７スフェクト）される
。その後、遺伝子変換または二重組み換え現象によって
、組み換えプラスミドからのＤＮ’Ａは全長野性型Ａｃ
ＮＰＶ染色体上のその対立遺伝子、すなわちポリヘドリ
ノ遺伝子と置き換わる。それ故、ウィルス内でＲＮＡ合
成がおこる場合、挿入されたノミラセンジャーＤＮＡか
ら読み取うれたメツセンジャーＦＩＮＡはその指示のも
とに新しい遺伝子産物を発現させるのに役立つ。
メツセンジャーＤＮＡを含む特定のライ”ルスは適切な
技術のいずれかで選択することができる。選択されたウ
ィルスはその後このノミラセンジャーＤＮＡの能力を利
用して目的の遺伝子産物を合成させるべく増殖される。
技術のいずれかで選択することができる。選択されたウ
ィルスはその後このノミラセンジャーＤＮＡの能力を利
用して目的の遺伝子産物を合成させるべく増殖される。
第１図はバクロウィルスＡｃＮＰＶの物理地図（ｐｈｙ
ｓｉｃａｌ ｍａｐ）および遺伝子構成を表わす。
ｓｉｃａｌ ｍａｐ）および遺伝子構成を表わす。
１２８キロ塩基の二本鎖環状ＤＮＡゲノムの制限工７ド
ヌクレアーゼ部位の物理地図は内側の８つの同心円で表
わされる。外側の同心円はＡｃＮＰＶ 。
ヌクレアーゼ部位の物理地図は内側の８つの同心円で表
わされる。外側の同心円はＡｃＮＰＶ 。
の遺伝子構成についての情報を表わす。点描区域は温度
感受性突然変異遺伝子のし・くつがの位置に関し、そし
て斜線区域はＡｃＮＰＶの種々の構造り／バク質および
非構造タンパク質をコードする領域に関し、そのタフバ
ク質の大きさはキロゲルト／の数字で示されている。約
３３０００ダルト／のポリヘトす／夕／・ξり質の遺伝
子は外側の円め０〜約１０％の位置に存在し、同様に遅
〜・段階で発現される約７２００ダルト／のタフバク負
（“７２°゛）の遺伝子は外側の円の約８５〜９゜％の
位置に存在することに注目されたい。
感受性突然変異遺伝子のし・くつがの位置に関し、そし
て斜線区域はＡｃＮＰＶの種々の構造り／バク質および
非構造タンパク質をコードする領域に関し、そのタフバ
ク質の大きさはキロゲルト／の数字で示されている。約
３３０００ダルト／のポリヘトす／夕／・ξり質の遺伝
子は外側の円め０〜約１０％の位置に存在し、同様に遅
〜・段階で発現される約７２００ダルト／のタフバク負
（“７２°゛）の遺伝子は外側の円の約８５〜９゜％の
位置に存在することに注目されたい。
第２図はＡｃＮＰＶのＬ−１変異株における制限エツト
ヌクレアーゼ゛認識部位を線状に表示したものである。
ヌクレアーゼ゛認識部位を線状に表示したものである。
Ｌ−１変異株はＨｌｎｄ ｍ −Ｂ内に別のＢｉｎｄ
ｍ部位を有し、２つの断片はＢ１およびＢ２と呼ばれて
合計ゲノムの大きさは約１２８キロ塩基である。
ｍ部位を有し、２つの断片はＢ１およびＢ２と呼ばれて
合計ゲノムの大きさは約１２８キロ塩基である。
第３図はＡｃＮＰＶ Ｌ −Ｉ ＤＮＡの００〜８．７
領域を含むｐＥＸｓ ９４２ブラスミビＤＮＡの物理地
図を表わし、ＥｃｏＲＩ−Ｉ 、 Ｒおよび０断片を含
む。
領域を含むｐＥＸｓ ９４２ブラスミビＤＮＡの物理地
図を表わし、ＥｃｏＲＩ−Ｉ 、 Ｒおよび０断片を含
む。
ベクターセグメントハｐＢＲ３２５（７）ＥＣＯＲＩお
よび５ａｌＩでの消化により゛誘導される。
よび５ａｌＩでの消化により゛誘導される。
第４図は全長が１２．３キロ塩基であってカナマイシン
耐性のための遺伝子を含むｐＧＰ−Ｂ ６８７４／ Ｓ
ａｌプラスミ）ＤＮＡの物理地図である。
耐性のための遺伝子を含むｐＧＰ−Ｂ ６８７４／ Ｓ
ａｌプラスミ）ＤＮＡの物理地図である。
第５図は全長が２５２キロ塩基であってタフバク質β−
ガラクトシり−ゼをコードする大腸菌からの遺伝子を含
むｐ（、Ｐ−Ｂ６８７４プラスミドＤＮＡの物理地図で
ある。
ガラクトシり−ゼをコードする大腸菌からの遺伝子を含
むｐ（、Ｐ−Ｂ６８７４プラスミドＤＮＡの物理地図で
ある。
本発明の１つの観点からすると、無を推動物の真核細胞
環境内で外来ＤＮＡを増殖かつ発現させるためのベクタ
ーとしてバクロウィルスを使用すルコとができるとわか
った。バクロウィルス’ｔＡハそれ“らが次のような特
徴：（１）共有結合で閉環した環状の植接製ＤＮＡゲノ
ム；（２）別の２０キロ塩基またはそれ以上のＤＮＡセ
グメ／トを受は入れるべく大きく広がることのできる桿
状カブ／’ト’ ； （３）内蔵の際には組み入れられ
るが、伝染性ウィルスの産生には、必須のものでなく、
従って欠失されてもよい一群の遺伝子；および（４）伝
染性ウィルス産生後に作働し、感染細胞の１０％以上の
タフバク質を構成する内蔵体に包含されるタフバク質（
例えばポリヘトす／および７．２ Ｋプロティン）の合
成を制御する１つまたはそれ以上の強力なプロモーター
；を有するので組み換えＤＮＡベクター系として非常に
都合がよい。ＡｃＮＰＶはパラセンジャーＤ Ｎ Ａ含
有ブラスミドイクターを使用して内蔵タンパク質合成を
コードするウィルスＤＮＡゲノムを置換させることによ
り本発明方法において用いられる。こうして、パラセン
ジャーＤＮＡがひとたびウィルスＤ Ｎ Ａに糸目み入
れられるとそれはポリヘトす／および／または７．２
Ｋプロティンの強力なプロモーターという利点を有し、
それがひとたび作働し始めるとパラセンジャーＤ Ｎ
Ａにコードされる遺伝子産物を望ましい量で発現させる
だろう。これとは別に、パラセンジャーＤＮＡはそれ自
体のまたは以下に述べるごとき他の外来プロモーターの
制御下にあってもよいということが見出された。最後に
、パッセ、ノジャーＤＮＡを発現したウィルスは容易に
選択されて増殖されうる。
環境内で外来ＤＮＡを増殖かつ発現させるためのベクタ
ーとしてバクロウィルスを使用すルコとができるとわか
った。バクロウィルス’ｔＡハそれ“らが次のような特
徴：（１）共有結合で閉環した環状の植接製ＤＮＡゲノ
ム；（２）別の２０キロ塩基またはそれ以上のＤＮＡセ
グメ／トを受は入れるべく大きく広がることのできる桿
状カブ／’ト’ ； （３）内蔵の際には組み入れられ
るが、伝染性ウィルスの産生には、必須のものでなく、
従って欠失されてもよい一群の遺伝子；および（４）伝
染性ウィルス産生後に作働し、感染細胞の１０％以上の
タフバク質を構成する内蔵体に包含されるタフバク質（
例えばポリヘトす／および７．２ Ｋプロティン）の合
成を制御する１つまたはそれ以上の強力なプロモーター
；を有するので組み換えＤＮＡベクター系として非常に
都合がよい。ＡｃＮＰＶはパラセンジャーＤ Ｎ Ａ含
有ブラスミドイクターを使用して内蔵タンパク質合成を
コードするウィルスＤＮＡゲノムを置換させることによ
り本発明方法において用いられる。こうして、パラセン
ジャーＤＮＡがひとたびウィルスＤ Ｎ Ａに糸目み入
れられるとそれはポリヘトす／および／または７．２
Ｋプロティンの強力なプロモーターという利点を有し、
それがひとたび作働し始めるとパラセンジャーＤ Ｎ
Ａにコードされる遺伝子産物を望ましい量で発現させる
だろう。これとは別に、パラセンジャーＤＮＡはそれ自
体のまたは以下に述べるごとき他の外来プロモーターの
制御下にあってもよいということが見出された。最後に
、パッセ、ノジャーＤＮＡを発現したウィルスは容易に
選択されて増殖されうる。
好適な実姉態様において、ポリヘトす／プロモーターを
用いて外来ＤＮＡを発現させる第一工程はＡｃＮＰＶ
Ｈ： ＋）ヘトす／遺伝子を含むベクターを適当な宿主
内で゛クローン化することである。
用いて外来ＤＮＡを発現させる第一工程はＡｃＮＰＶ
Ｈ： ＋）ヘトす／遺伝子を含むベクターを適当な宿主
内で゛クローン化することである。
Ａｃｌ’ｌＰＶの１．２キロ塩基のポリヘドリノ遺伝子
の３′末端６２チの位置は第１図および第２図に示すご
と（ＡｃＮＰＶ のＨｌｎｄ ｍ −Ｖの領域に位置す
る。
の３′末端６２チの位置は第１図および第２図に示すご
と（ＡｃＮＰＶ のＨｌｎｄ ｍ −Ｖの領域に位置す
る。
こうして、パラセンジャーＤＮＡを用いてのポリへドリ
ノ遺伝子の置換用プラスミドは、ｏ、ｏ〜約６０キロゲ
ルト／のＡｃＮＰＶ ＤＮＡ（＝グメ／トをプラスミ
ドベクターを使用して大腸菌内でクロー／化することに
より開始される。これは、完全な遺伝子でない場合には
、少なくともポリヘドリノの３′末端セグメント（約３
，３〜４１キロダルトンで存在する）を包含するだろう
。このポリヘドリ／遺伝子領域内に作用部位を１個所ま
たはそれ以」−有する制限エツトヌクレアーゼは、その
後パラセンジャーＤＮＡの挿入部位をつくるべくこの組
み換えプラスミド’ＤＮＡを切断するために使用され得
る。制限エツトヌクレアーゼＢａｒｎ ＨＩ ハこの領
域にいくつかの有益な作用部位を有するということが注
目される。ひとたびパソ七／ンヤーＤＮＡがクローン化
プラスミドへ挿入されると、このプラスミド９ば゛マー
カーレスキーＬ −（ｍａｒｋｅｒ ｒｅｓ−ｃｕｅ）
”法に用いることができる。Ｌ、に、ＭｌｌｌｅｒのＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３９巻、９
７３ページ（１９８１年）を参照されたい。この技術を
用いることにより、全長ＡｃＮＰＶ ＤＮＡはプラスミ
ドによりもたらされるパラセンジャーＤＮＡを含むＡｃ
ＮＰＶ ＤＮＡ断片と同時トランスフェクトさ」する
。対立遺伝子の置換・は遺伝子変換または二市組み換え
現象により行われ、全長ウィルスＤＮＡ内のＤＮＡがプ
ラスミド９によってもたらされる断片からのＤＮＡで置
換される。こうして、天然ポリヘドリノ遺伝子は遺伝子
操作されたｓ９ ＋）へピリノ遺伝子およびパラセンジ
ャーＤＮＡで置換され、パラセンジャーＤＮＡ含有ウィ
ルスの選択は内蔵体が存在しないプラークを、例えば光
学類＠（幌でウィルスプラークを肉眼観察して、スクリ
ーニングすることにより行うことができる。ポリヘドリ
ノ遺伝子の欠失の正確な大きさの置換はバクロウィルス
の桿状ヌクレオカブ）・ドがより大きく広がることがで
きるので心安でない。
ノ遺伝子の置換用プラスミドは、ｏ、ｏ〜約６０キロゲ
ルト／のＡｃＮＰＶ ＤＮＡ（＝グメ／トをプラスミ
ドベクターを使用して大腸菌内でクロー／化することに
より開始される。これは、完全な遺伝子でない場合には
、少なくともポリヘドリノの３′末端セグメント（約３
，３〜４１キロダルトンで存在する）を包含するだろう
。このポリヘドリ／遺伝子領域内に作用部位を１個所ま
たはそれ以」−有する制限エツトヌクレアーゼは、その
後パラセンジャーＤＮＡの挿入部位をつくるべくこの組
み換えプラスミド’ＤＮＡを切断するために使用され得
る。制限エツトヌクレアーゼＢａｒｎ ＨＩ ハこの領
域にいくつかの有益な作用部位を有するということが注
目される。ひとたびパソ七／ンヤーＤＮＡがクローン化
プラスミドへ挿入されると、このプラスミド９ば゛マー
カーレスキーＬ −（ｍａｒｋｅｒ ｒｅｓ−ｃｕｅ）
”法に用いることができる。Ｌ、に、ＭｌｌｌｅｒのＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３９巻、９
７３ページ（１９８１年）を参照されたい。この技術を
用いることにより、全長ＡｃＮＰＶ ＤＮＡはプラスミ
ドによりもたらされるパラセンジャーＤＮＡを含むＡｃ
ＮＰＶ ＤＮＡ断片と同時トランスフェクトさ」する
。対立遺伝子の置換・は遺伝子変換または二市組み換え
現象により行われ、全長ウィルスＤＮＡ内のＤＮＡがプ
ラスミド９によってもたらされる断片からのＤＮＡで置
換される。こうして、天然ポリヘドリノ遺伝子は遺伝子
操作されたｓ９ ＋）へピリノ遺伝子およびパラセンジ
ャーＤＮＡで置換され、パラセンジャーＤＮＡ含有ウィ
ルスの選択は内蔵体が存在しないプラークを、例えば光
学類＠（幌でウィルスプラークを肉眼観察して、スクリ
ーニングすることにより行うことができる。ポリヘドリ
ノ遺伝子の欠失の正確な大きさの置換はバクロウィルス
の桿状ヌクレオカブ）・ドがより大きく広がることがで
きるので心安でない。
多くの場合に、本発明に従って発現されるポリ投プチド
または他の遺伝子産物はそれが発現される昆虫細胞膜外
へ分泌されるのが好ましい。このことは１例えば意図す
る。６ リヘブチドと共て発現されかつ細胞がその産物
を分ａ・できるようにする適当なリーダー配列をコード
化させることにより、既知方法で達成される。
または他の遺伝子産物はそれが発現される昆虫細胞膜外
へ分泌されるのが好ましい。このことは１例えば意図す
る。６ リヘブチドと共て発現されかつ細胞がその産物
を分ａ・できるようにする適当なリーダー配列をコード
化させることにより、既知方法で達成される。
Ａソセ：ｙ：、ｙ−’ｖ−ＤＮＡヲＡｃＮＰＶ Ｌ −
］ ヘ挿入ｔルタメＫ 、 ＡｃＮＰＶ Ｌ−Ｉ Ｄ
ＮＡ ｔｆ） ０． Ｑ 〜Ｂ、 ７領域はベクターと
してｐＢＲ３２５を使用して大腸菌内でクロー７化され
る。ＡｃＮＰＶ Ｌ −１はこの組み換えＤＮＡ作製に
用いるととができる野性型のウィルスであり、その物理
地図を第２図に示す。
］ ヘ挿入ｔルタメＫ 、 ＡｃＮＰＶ Ｌ−Ｉ Ｄ
ＮＡ ｔｆ） ０． Ｑ 〜Ｂ、 ７領域はベクターと
してｐＢＲ３２５を使用して大腸菌内でクロー７化され
る。ＡｃＮＰＶ Ｌ −１はこの組み換えＤＮＡ作製に
用いるととができる野性型のウィルスであり、その物理
地図を第２図に示す。
ＭｉｌｌｅｒらによるＶｉｒｏｌｏｇｙｏ 第１２６
巻、３７６〜３８０投−ジ（１９８３年）を参照された
い。
巻、３７６〜３８０投−ジ（１９８３年）を参照された
い。
この開示は参照によりここに引用される。ブラスミ）’
ｐＢＲ３２５（コれはＢｏｌｉｖａｒのＧｅｎｅ、第４
巻、１２１Ｒ−ジ（１９７８年〕に記載されている）は
ブラスミｌ−’ｐＢＲ３２２の誘導体であって、Ｅｃｏ
ＲＩ により生成される組み換えＤＮＡ分子の選択の
ための特異なＥｃｏＲ工 部位を有する。
ｐＢＲ３２５（コれはＢｏｌｉｖａｒのＧｅｎｅ、第４
巻、１２１Ｒ−ジ（１９７８年〕に記載されている）は
ブラスミｌ−’ｐＢＲ３２２の誘導体であって、Ｅｃｏ
ＲＩ により生成される組み換えＤＮＡ分子の選択の
ための特異なＥｃｏＲ工 部位を有する。
組み換えプラスミドは、クロラムフェニコール耐性遺伝
子およびテ）７サイクリ／耐性遺伝子内をそれぞれ切断
するＥｃｏＲＩ および５ａＩＩ の各制限エツトゝ
ヌクレアーゼを用いてｐＢＫ ３２５ を消化し、１
ツノＥｃｏＲＩ 付着端と１つの５ａＩＩ 付着端
な作ってア７ビ７す／耐性遺伝子および複製開始点をそ
のまま残しておくことにより作られる。
子およびテ）７サイクリ／耐性遺伝子内をそれぞれ切断
するＥｃｏＲＩ および５ａＩＩ の各制限エツトゝ
ヌクレアーゼを用いてｐＢＫ ３２５ を消化し、１
ツノＥｃｏＲＩ 付着端と１つの５ａＩＩ 付着端
な作ってア７ビ７す／耐性遺伝子および複製開始点をそ
のまま残しておくことにより作られる。
ＡｃＮＰＶ Ｌ −］ ＤＮＡは同時Ｋ ＥｃｏＲＩ
およびＸｈｏＩで消化される。ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｈｏ
ＩまたはＳａｌ′１で消化されたウィルスＤＮＡ断片
／ ｐＢＲ３２５ＤＮＡ断片の結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ
）の後、大腸菌を形質転換する。ＡｐＲＣＭＳＴＥＴＳ
コロニーがＢａｍ Ｆを含むプラスミドのためにスクリ
ーニングされる。
およびＸｈｏＩで消化される。ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｈｏ
ＩまたはＳａｌ′１で消化されたウィルスＤＮＡ断片
／ ｐＢＲ３２５ＤＮＡ断片の結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ
）の後、大腸菌を形質転換する。ＡｐＲＣＭＳＴＥＴＳ
コロニーがＢａｍ Ｆを含むプラスミドのためにスクリ
ーニングされる。
スクリーニングの間にｐＥＸＳ ９４２が発見され。
これはＡｃＮＰＶのＸｈｏ −ＥｃｏＲ’Ｉ断片とＥｃ
ｏＲＩ −Ｉ、ＲおよびＯを含むＥｃｏＲＩ 部分消
化産物との同時クローニングにより生じたと考えられる
。ｐＥｘＳ９４２は１９辷５９よりもむしろ０．０〜８
７の領域を含むので、Ｈｉｎｄｍ−Ｖ領域（３，３〜４
．０）の両側にＡｃＮＰＶゲノムのより大きな領域およ
びより多くのＤ Ｎ ！′、が提供される。このより大
きな領域はプラスミド’Ｄ Ｎ ＡとＡｃＮＰＶＤＮＡ
との間の±ノビボでのマーカーレスキューに必要な二重
組み換え（または遺伝子変換現象）を促進すると思われ
る。他の利点はパラ七／′）ヤーＩ）ＮＡをポリヘドリ
ン領域へ挿入するために次の作製において有用なウィル
スＰｓｔＩ部位が８．０に存在するということである。
ｏＲＩ −Ｉ、ＲおよびＯを含むＥｃｏＲＩ 部分消
化産物との同時クローニングにより生じたと考えられる
。ｐＥｘＳ９４２は１９辷５９よりもむしろ０．０〜８
７の領域を含むので、Ｈｉｎｄｍ−Ｖ領域（３，３〜４
．０）の両側にＡｃＮＰＶゲノムのより大きな領域およ
びより多くのＤ Ｎ ！′、が提供される。このより大
きな領域はプラスミド’Ｄ Ｎ ＡとＡｃＮＰＶＤＮＡ
との間の±ノビボでのマーカーレスキューに必要な二重
組み換え（または遺伝子変換現象）を促進すると思われ
る。他の利点はパラ七／′）ヤーＩ）ＮＡをポリヘドリ
ン領域へ挿入するために次の作製において有用なウィル
スＰｓｔＩ部位が８．０に存在するということである。
最後に、この００〜８．７領域は温度感受性変異体であ
るｔｓＢ １１３を含むＡ ｃ ＮＰＶ のＨｌｎｄ
ｍ −Ｎ領域を完全に包含している。こうして、ｔｓ
Ｂ１１３およびｐＥＸｓ ９４２は対立遺伝子置換のた
めの別の選択物として共に使用することができる。
るｔｓＢ １１３を含むＡ ｃ ＮＰＶ のＨｌｎｄ
ｍ −Ｎ領域を完全に包含している。こうして、ｔｓ
Ｂ１１３およびｐＥＸｓ ９４２は対立遺伝子置換のた
めの別の選択物として共に使用することができる。
Ｂａｍ Ｆを取り囲むＡｃＮＰＶ Ｌ −１の領域が全
部欠失されうるかどうかを決定するために、ｐＥＸＳ９
４２をＢａｍ ＨＩで消化し、ＢａｍＦ断片を欠失させ
るように再結合させた。得られたプラスミドの中で新し
い構成物が単離され、これは以後ＰＥＸ５９４２ Ｂ
６と名づけられた。このプラスミドはＢａｍ Ｆを欠失
してい・ないが４５でＢａｍ ＨＩ部位を失っている。
部欠失されうるかどうかを決定するために、ｐＥＸＳ９
４２をＢａｍ ＨＩで消化し、ＢａｍＦ断片を欠失させ
るように再結合させた。得られたプラスミドの中で新し
い構成物が単離され、これは以後ＰＥＸ５９４２ Ｂ
６と名づけられた。このプラスミドはＢａｍ Ｆを欠失
してい・ないが４５でＢａｍ ＨＩ部位を失っている。
こうして、Ｂａｍ ＨＩ部位が４５で欠失されたのでｐ
ＢＫ３９４２ Ｂ ６は３．０図単位に゛ １つの
Ｂａｍ ＨＩ部位のみを有する。この方法知おいて、ポ
リヘドリン遺伝子を包囲するＡｃＮＰＶ の領域が大腸
菌内でクロー７化され、これからプラスミドｐＥＸｓ９
４２ ’ Ｂ６が単離される。このプラスミドは００〜
８７図単位のＡｃＮ Ｐ Ｖ領域を含み、こうして３３
と４１の間に少なくＱも６２％のポリヘトす／３′末端
を包含する。それ故、ｐＢＫ８ ９４２ Ｂ６または
その誘導体のポリヘドリン領域はプラスミドゝの形のま
まで適当なパラ七ノジャーＤＮＡと置換することができ
る。得られたｐＥＸ３９４２ Ｂ６パツセンジヤーブ
ラスミト９ＤＮＡはその後野性型ＡｃＮＰＶゲノムと同
時トランスフェクトされる。組み換えブラスミ）’ＤＮ
Ａと野性型ＡｃＮＰＶとの間の二重組み換えまたは遺伝
子変換現象は、ＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子とパラ
センジャーＤＮＡとの対立遺伝子置換をもたらす。ポリ
ヘドリン遺伝子とパラセンジャーＤＮＡとの対立遺伝子
置換が成功すると内蔵体形成を欠くウィルスが生じる。
ＢＫ３９４２ Ｂ ６は３．０図単位に゛ １つの
Ｂａｍ ＨＩ部位のみを有する。この方法知おいて、ポ
リヘドリン遺伝子を包囲するＡｃＮＰＶ の領域が大腸
菌内でクロー７化され、これからプラスミドｐＥＸｓ９
４２ ’ Ｂ６が単離される。このプラスミドは００〜
８７図単位のＡｃＮ Ｐ Ｖ領域を含み、こうして３３
と４１の間に少なくＱも６２％のポリヘトす／３′末端
を包含する。それ故、ｐＢＫ８ ９４２ Ｂ６または
その誘導体のポリヘドリン領域はプラスミドゝの形のま
まで適当なパラ七ノジャーＤＮＡと置換することができ
る。得られたｐＥＸ３９４２ Ｂ６パツセンジヤーブ
ラスミト９ＤＮＡはその後野性型ＡｃＮＰＶゲノムと同
時トランスフェクトされる。組み換えブラスミ）’ＤＮ
Ａと野性型ＡｃＮＰＶとの間の二重組み換えまたは遺伝
子変換現象は、ＡｃＮＰＶのポリヘドリン遺伝子とパラ
センジャーＤＮＡとの対立遺伝子置換をもたらす。ポリ
ヘドリン遺伝子とパラセンジャーＤＮＡとの対立遺伝子
置換が成功すると内蔵体形成を欠くウィルスが生じる。
この表現型は適当なプラーク検定法を用（・て選択する
ことができる。
ことができる。
さらに、ＡｃＮＰＶ変異株であるｔθＢ１１３の突然変
異位置はポリヘドリン遺伝子に隣接して存在するので、
この領域内の成功した対立遺伝子置換は温度感受性の低
下により選択可能である。この宿主／ベクター系はひと
たびパソセ／ジャーＤＮＡ挿入のだめの適切な制限部位
が確認されると種々の目的のために使用することができ
る。
異位置はポリヘドリン遺伝子に隣接して存在するので、
この領域内の成功した対立遺伝子置換は温度感受性の低
下により選択可能である。この宿主／ベクター系はひと
たびパソセ／ジャーＤＮＡ挿入のだめの適切な制限部位
が確認されると種々の目的のために使用することができ
る。
ＡｃＮＰＶベクター系の利点には桿状ウイルスカブソト
゛内にパノセノジャーＤＮＡの大きなセグメントを包み
込む能力、および伝染性の非内蔵ウィルスの産生後に誘
発されるポリヘドリンおよび７、２ Ｋプロティンのプ
ロモーターのごとき強力なプロモーターの利用可能性が
含まれる。この位置に外来パラ七／ジャーＤＮＡを配置
することの他の利点は、これらのプロモーターの合成が
ＮＯＶ放出開始後であって細胞溶解の２４時間以上前の
、感染サイクルの遅い時期に行われると℃・うことであ
る。その結果、伝染性のウィルス産生はいずれの活性パ
ンセフジャー遺伝子産物てよっても損なわれることがな
い。長期間の細胞生存能力が達成サレ、このことはパラ
センジャータンパク質合成の間代謝機能が続行すること
を示唆している。
゛内にパノセノジャーＤＮＡの大きなセグメントを包み
込む能力、および伝染性の非内蔵ウィルスの産生後に誘
発されるポリヘドリンおよび７、２ Ｋプロティンのプ
ロモーターのごとき強力なプロモーターの利用可能性が
含まれる。この位置に外来パラ七／ジャーＤＮＡを配置
することの他の利点は、これらのプロモーターの合成が
ＮＯＶ放出開始後であって細胞溶解の２４時間以上前の
、感染サイクルの遅い時期に行われると℃・うことであ
る。その結果、伝染性のウィルス産生はいずれの活性パ
ンセフジャー遺伝子産物てよっても損なわれることがな
い。長期間の細胞生存能力が達成サレ、このことはパラ
センジャータンパク質合成の間代謝機能が続行すること
を示唆している。
ＡｃＮＰＶのゲノムは約ｓ ２００ ｏ、 ｏ ｏ ｏ
ゲルト／の二本鎖の、共有結合で閉環した環状ＤＮＡ分
子である。これらの特徴には２０キロ塩基以」−のパツ
セ／ジャＤＮＡを収容しうる桿状カブンド、および伝染
性ウィルスの初期産生これに続く多数のプロモーターか
らのウィルス誘導タ／バク質の長期間合成をもたらすウ
ィルス遺伝子の段階的発現が含まれる。
ゲルト／の二本鎖の、共有結合で閉環した環状ＤＮＡ分
子である。これらの特徴には２０キロ塩基以」−のパツ
セ／ジャＤＮＡを収容しうる桿状カブンド、および伝染
性ウィルスの初期産生これに続く多数のプロモーターか
らのウィルス誘導タ／バク質の長期間合成をもたらすウ
ィルス遺伝子の段階的発現が含まれる。
本発明の他の実施態様において、７．２ Ｋプロティン
の合成を制御するプロモーターもまた・ξソ七ノジャー
遺伝子発現のために利用できる。７．２Ｋプロティ／遺
伝子は第１図の８８〜９１図栄位に位置する。Ａｄａｎ
ｇ およびＭｉｌｌｅｒのＪ、 ｏｆＶｉｒｏｌｏｇ
、ｙ、４４，７８２（１９８２）を参照されたい。この
開示は参照によりここに引用される。
の合成を制御するプロモーターもまた・ξソ七ノジャー
遺伝子発現のために利用できる。７．２Ｋプロティ／遺
伝子は第１図の８８〜９１図栄位に位置する。Ａｄａｎ
ｇ およびＭｉｌｌｅｒのＪ、 ｏｆＶｉｒｏｌｏｇ
、ｙ、４４，７８２（１９８２）を参照されたい。この
開示は参照によりここに引用される。
７、２ Ｋプロティンをコート９するｍ ＲＮ Ａ
の合成はＨｉｎａ ｍ−ＱからＨｌｎｄｍ−Ｐ ヘと
伸びる。７２ＫプロティンをコードするＤＮＡの大部分
を含むブラミトゝがクローン化されており（Ａｄａｎｇ
およびＭｉｌｌｅｒの上記文献を参照された（・）、こ
れはパラセンジャー遺伝子挿入および７．２ Ｋプロテ
ィ／遺伝子内での対立遺伝子置換のために使用できるだ
ろう。
の合成はＨｉｎａ ｍ−ＱからＨｌｎｄｍ−Ｐ ヘと
伸びる。７２ＫプロティンをコードするＤＮＡの大部分
を含むブラミトゝがクローン化されており（Ａｄａｎｇ
およびＭｉｌｌｅｒの上記文献を参照された（・）、こ
れはパラセンジャー遺伝子挿入および７．２ Ｋプロテ
ィ／遺伝子内での対立遺伝子置換のために使用できるだ
ろう。
本発明の他の実姉態様において、バクロウィルスプロモ
ーター以外の外来プロモーター、例えば他のウィルス、
細菌、真菌、昆虫、呻乳動物などのプロモーターの制御
下にノξソセンジャー遺伝子を導入することが可能であ
る。どの方法ではパラセンジャー遺伝子が外来プロモー
ターに結合され。
ーター以外の外来プロモーター、例えば他のウィルス、
細菌、真菌、昆虫、呻乳動物などのプロモーターの制御
下にノξソセンジャー遺伝子を導入することが可能であ
る。どの方法ではパラセンジャー遺伝子が外来プロモー
ターに結合され。
そして外来プロモーター−遺伝子の組合せが適当す”ト
ラ：／スプレイスメントベクター°゛内に挿入される。
ラ：／スプレイスメントベクター°゛内に挿入される。
このトランスプレイスメントベクターはウィルスＤＮＡ
の適切な領域の対立遺伝子置換を可能知するように構成
される。プラスミ）’ｐＧＰ−Ｂ ６８７４ ／ ５ａ
１（第４図）はこの種のトランスプレイスメントベクタ
ーの１種である。このプラスミドはその本質的でない領
域内に１つのＰｓｔ Ｉ部位を有する。外来プロモータ
ー遺伝子はこのＰｓｔ； Ｉ部位へ挿入することができ
る。得られた組み換えプラスミドは野性型ウィルスＤＮ
Ａと同時トランスフェクトされ１組み換え体は適当な技
術によって選択される。ｐＧＰ−Ｂ ６８７４ ／ Ｓ
ａｌ の場合に、このベクターは対立遺伝子置換から得
られた組み換えウィルスに青色が生ずるように作製され
る。外来プロモーターの１例は広く入手用能な家禽肉腫
ウィルスであるラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒ
ｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）のロングターミナルリピートプ
ロモーター（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅ
ａｔｐｒｏｍｏｔｅｒ）である。このプロモーター（Ｒ
３Ｖ−ＬＴＲ）はＡｃＮ、ＰＶ内に挿入されて、大腸菌
のクロラムフエニコールアセチルトランスノエラーゼの
ような外来タンパク質の昆虫細胞内合成を誘発させるこ
とが立証された。この性角の外来プロモーターを使用す
ることの１つの利点は、そのプロモーターがウィルス複
製過程の後期だけでなく初期にも活性化されるというこ
とである。初期発現はバクロウィルスおよび／または昆
虫細胞の遺伝子操作のいくつかの用途、特に生物系殺虫
剤としてのバクロウィルスの使用において役立つかもし
れない。昆虫細胞を使用してポ、すＲプチドを大規模生
産することが目的である場合、初期生産体は例えば生産
されたタンパク質が細胞の生存能力および生産能力に悪
影響を及ぼさない場合には有利であるだろう。
の適切な領域の対立遺伝子置換を可能知するように構成
される。プラスミ）’ｐＧＰ−Ｂ ６８７４ ／ ５ａ
１（第４図）はこの種のトランスプレイスメントベクタ
ーの１種である。このプラスミドはその本質的でない領
域内に１つのＰｓｔ Ｉ部位を有する。外来プロモータ
ー遺伝子はこのＰｓｔ； Ｉ部位へ挿入することができ
る。得られた組み換えプラスミドは野性型ウィルスＤＮ
Ａと同時トランスフェクトされ１組み換え体は適当な技
術によって選択される。ｐＧＰ−Ｂ ６８７４ ／ Ｓ
ａｌ の場合に、このベクターは対立遺伝子置換から得
られた組み換えウィルスに青色が生ずるように作製され
る。外来プロモーターの１例は広く入手用能な家禽肉腫
ウィルスであるラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒ
ｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）のロングターミナルリピートプ
ロモーター（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅ
ａｔｐｒｏｍｏｔｅｒ）である。このプロモーター（Ｒ
３Ｖ−ＬＴＲ）はＡｃＮ、ＰＶ内に挿入されて、大腸菌
のクロラムフエニコールアセチルトランスノエラーゼの
ような外来タンパク質の昆虫細胞内合成を誘発させるこ
とが立証された。この性角の外来プロモーターを使用す
ることの１つの利点は、そのプロモーターがウィルス複
製過程の後期だけでなく初期にも活性化されるというこ
とである。初期発現はバクロウィルスおよび／または昆
虫細胞の遺伝子操作のいくつかの用途、特に生物系殺虫
剤としてのバクロウィルスの使用において役立つかもし
れない。昆虫細胞を使用してポ、すＲプチドを大規模生
産することが目的である場合、初期生産体は例えば生産
されたタンパク質が細胞の生存能力および生産能力に悪
影響を及ぼさない場合には有利であるだろう。
次の実施例は今や本発明を実姉することが好適であるの
でその実殉態様を例示するために提供される。これらの
実施例は例示的なものであって、本発明は添付の特許請
求の範囲に示したものを除いてそれに限定が加えられる
べきでないと理解されるだろう。
でその実殉態様を例示するために提供される。これらの
実施例は例示的なものであって、本発明は添付の特許請
求の範囲に示したものを除いてそれに限定が加えられる
べきでないと理解されるだろう。
実捲例Ｉ
ＡｃＮＰＶはポリヘドリン遺伝子へ挿入された９、 ２
ＫｂパッセンジャーＤＮＡを安定して増殖させること
により組み換えＤＮＡはフタ−として都合よく使用する
ことができる。さらに、ポリヘドリンプロモーターは大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなパラセンジ
ャー遺伝子を高水準で発現させる。
ＫｂパッセンジャーＤＮＡを安定して増殖させること
により組み換えＤＮＡはフタ−として都合よく使用する
ことができる。さらに、ポリヘドリンプロモーターは大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなパラセンジ
ャー遺伝子を高水準で発現させる。
プラスミド５ｐＥＸＳ ９４２ Ｂ６はＡｃＮＰＶの
００〜８７図単位領域を含むがＢａｍ Ｆ ／ Ｃ接合
部でＢａｍＨＩ部位を欠き、こうしてこのプラスミドは
ポリヘドリン遺伝子内またはその近辺にＢａｍ ＨＩ部
位を１つだけ含む。
００〜８７図単位領域を含むがＢａｍ Ｆ ／ Ｃ接合
部でＢａｍＨＩ部位を欠き、こうしてこのプラスミドは
ポリヘドリン遺伝子内またはその近辺にＢａｍ ＨＩ部
位を１つだけ含む。
ｐＭＣ８７４プラスミドはβ−ガラクトシダーぜのポリ
ヘドリン遺伝子のＢａｍ、ＨＩ ｆｐｓ位と同じ読み取
り枠で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の第８コド
ンに１つのＢａｍＨＩ部位を有する。
ヘドリン遺伝子のＢａｍ、ＨＩ ｆｐｓ位と同じ読み取
り枠で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の第８コド
ンに１つのＢａｍＨＩ部位を有する。
Ｃａ５ａｄａｂａｎ らのＪ、 Ｂａｃｔ、 、 Ｌ
４３．９７１〜９８０（１９８０）を参照されたし・。
４３．９７１〜９８０（１９８０）を参照されたし・。
β−ガラクト７ダーゼ遺伝子に加えて、ｃ＋２Ｋｂのｐ
ＭＣ８７４プラスミドはｌａｃ Ｙ 遺伝子、ｌａｃ
Ａ 遺伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝子の一部
、Ｃｏ１Ｅ１複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子
を含む。
ＭＣ８７４プラスミドはｌａｃ Ｙ 遺伝子、ｌａｃ
Ａ 遺伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝子の一部
、Ｃｏ１Ｅ１複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子
を含む。
Ｂａｍ ＨＩで消化したｐＭＣ８７４とプラスミドｐＥ
Ｘｓ９４２ Ｂ６ ＤＮＡ トノインビトロ結合
による融合は２５．２ＫｂのプラスミドｐＧＰ−８６８
７４（第５図参照）の形成をもたらし、これは以後プラ
スミドゝと呼ばれる。
Ｘｓ９４２ Ｂ６ ＤＮＡ トノインビトロ結合
による融合は２５．２ＫｂのプラスミドｐＧＰ−８６８
７４（第５図参照）の形成をもたらし、これは以後プラ
スミドゝと呼ばれる。
２５２Ｋｂのプラスミド’ｐＧＰ、Ｂ６８７４はｐＥＸ
Ｓ９４２ Ｂ６およびｐＭＣ８７４をＢａｍＨＩで消化
し、続いて２分子融合の方を行わせるべく高ＤＮＡ濃度
で結合させることによって作製された。
Ｓ９４２ Ｂ６およびｐＭＣ８７４をＢａｍＨＩで消化
し、続いて２分子融合の方を行わせるべく高ＤＮＡ濃度
で結合させることによって作製された。
ＭａｎｉａｔｉｅらのＭｏ１ｅｃｕｘａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、 Ｃｏ１ａＳ’ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ研究所
（１’９８２）を参照されたい。この開示は参照により
ここに引用される。大腸菌ＨＢＩＯＩをその結合産物で
形質転換させた畝その融合プラスミドはアンピシリンお
よびカナマイシンに対するそれらの耐性により選択され
た。アンピシリン耐性遺伝子はｐＥＸＳ９４２ Ｂ６
によってもたらされ、カナマイシン耐性遺伝子は’ｐＭ
Ｃ８７４〜くたらされる。アンビンリン、カナマイシン
およびＸ−ｇａｌ （β−ガラクトシダーゼ酵素活性
のための発色指示薬）を含む平板上の青色コロニーが選
択された。
ｎｇ、 Ｃｏ１ａＳ’ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ研究所
（１’９８２）を参照されたい。この開示は参照により
ここに引用される。大腸菌ＨＢＩＯＩをその結合産物で
形質転換させた畝その融合プラスミドはアンピシリンお
よびカナマイシンに対するそれらの耐性により選択され
た。アンピシリン耐性遺伝子はｐＥＸＳ９４２ Ｂ６
によってもたらされ、カナマイシン耐性遺伝子は’ｐＭ
Ｃ８７４〜くたらされる。アンビンリン、カナマイシン
およびＸ−ｇａｌ （β−ガラクトシダーゼ酵素活性
のための発色指示薬）を含む平板上の青色コロニーが選
択された。
青色形成を伴うプラーク検定法のために、鱗翅目単層細
胞のニュートラルレッド染色を伴うプラーク検定法に類
似した方法が応用された。ＬｅｅおよびＭｉｌｌｅｒの
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ２７．７５４〜７６７（１９７８）
を参照されたい。青色形成に用も・られた方法は１
２０ ｔｔ９／ｙｔｌのＸ −ｇａｌをアガロース含有
培地の中に入れることを除けば同様であつた。ニュート
ラルレットゝ染色の代わりに、プラークはそれらの青色
によって視覚化され、青色は平板を３７℃で４〜６時間
暖めるかまたは室温で一晩発色させること短より強めら
れる。これとは別に迅速に視覚化させるためには組織培
養皿を液体窒素中で５〜ＩＯ秒間凍結させ、室温で溶か
し、そして２〜３時間で重色発色を行わせる。伝染性ウ
ィルスはプラークから採取され、そして直接再プラーク
形成させるかまたはウィルス株へ増殖させた。
胞のニュートラルレッド染色を伴うプラーク検定法に類
似した方法が応用された。ＬｅｅおよびＭｉｌｌｅｒの
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ２７．７５４〜７６７（１９７８）
を参照されたい。青色形成に用も・られた方法は１
２０ ｔｔ９／ｙｔｌのＸ −ｇａｌをアガロース含有
培地の中に入れることを除けば同様であつた。ニュート
ラルレットゝ染色の代わりに、プラークはそれらの青色
によって視覚化され、青色は平板を３７℃で４〜６時間
暖めるかまたは室温で一晩発色させること短より強めら
れる。これとは別に迅速に視覚化させるためには組織培
養皿を液体窒素中で５〜ＩＯ秒間凍結させ、室温で溶か
し、そして２〜３時間で重色発色を行わせる。伝染性ウ
ィルスはプラークから採取され、そして直接再プラーク
形成させるかまたはウィルス株へ増殖させた。
ポリへ１・゛リンＮ−末端に融合したβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を有する融合プラスミドｐＣ，Ｐ−Ｂ６８７
４ （第５図）を含む＝＋ｏ＝−は、 ５ａｌＩ、Ｅ
ｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ｍ 酵素を用いる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により立証された。これらの酵素
分析は融合されたプラスミドの２つの起こりうる配向を
識別する。
ーゼ遺伝子を有する融合プラスミドｐＣ，Ｐ−Ｂ６８７
４ （第５図）を含む＝＋ｏ＝−は、 ５ａｌＩ、Ｅ
ｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ｍ 酵素を用いる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により立証された。これらの酵素
分析は融合されたプラスミドの２つの起こりうる配向を
識別する。
ポリヘドリン／ ｐＭｃ８７４融合配列（融合プラスミ
ドｐＧＰ−Ｂ ６８７４で表わされる）をＡｃＮＰＶＤ
ＮＡ ゲノムへ転移させるために、対立遺伝子置換また
は°°トランスプレイスメント°゛法が採用される。Ｌ
、に０Ｍ１ｌｌｅｒ のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
３９．９７３〜９７６（１９８，１）を参照されたい、
この開示はＡｃＮＰＶおよび１０倍モル過剰のｐＧＰ−
Ｂ６８７４ＤＮＡ を用℃・て燐酸カルシウム共沈降法
により同時トランスフェクトされた。Ｐｏｔｔｅｒおよ
びＭｉ］、ｌｅｒのＪ、Ｉｎｖｅｒｔ、 Ｐａｔｈ、
、 ３６．４３ ］〜４３２（１９８０）を参照された
℃・。この開示は参照によりここに引用される。β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現するウィルスはＸ −ｇａ
ｌ の存在下で青色プラークとして検出された。
ドｐＧＰ−Ｂ ６８７４で表わされる）をＡｃＮＰＶＤ
ＮＡ ゲノムへ転移させるために、対立遺伝子置換また
は°°トランスプレイスメント°゛法が採用される。Ｌ
、に０Ｍ１ｌｌｅｒ のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
３９．９７３〜９７６（１９８，１）を参照されたい、
この開示はＡｃＮＰＶおよび１０倍モル過剰のｐＧＰ−
Ｂ６８７４ＤＮＡ を用℃・て燐酸カルシウム共沈降法
により同時トランスフェクトされた。Ｐｏｔｔｅｒおよ
びＭｉ］、ｌｅｒのＪ、Ｉｎｖｅｒｔ、 Ｐａｔｈ、
、 ３６．４３ ］〜４３２（１９８０）を参照された
℃・。この開示は参照によりここに引用される。β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現するウィルスはＸ −ｇａ
ｌ の存在下で青色プラークとして検出された。
プラスミドＤＮＡはラピッド クリアー リゼイｌ゛（
ｒａｐｉｄ ｃｌｅａｒ １ｙｓａｔｅ）法により調整
された。ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ のＡｎａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
ｒａｐｉｄ ｃｌｅａｒ １ｙｓａｔｅ）法により調整
された。ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ のＡｎａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
１１４．１９３（１９８１）を参照されたい。ＡｃＮＰ
ＶＤＩ喝Ａは５℃で９０分間９００００ＸＦで２０％シ
ョ糖溶液中の遠心にかけることにより、感染培地から部
分的に精製された細胞外ウィルスより調製された。この
沈殿物は１０ ｍＭ ）’ＩＪスーＨＣｅｐ）Ｉ７６．
１０ｍＭＥＤＴＡおよび０．２５％ＳＤＳの２００μｅ
中にゼ）懸濁した。ブロテイナーぜＫを０．５ｍ？／駐
の最終濃度になるまで添加し、そしてこの混合物を３０
℃で３０分間インキュベートし、次いでＤ Ｎ Ａを沈
降させる前に２回フェノール抽出した。
ＶＤＩ喝Ａは５℃で９０分間９００００ＸＦで２０％シ
ョ糖溶液中の遠心にかけることにより、感染培地から部
分的に精製された細胞外ウィルスより調製された。この
沈殿物は１０ ｍＭ ）’ＩＪスーＨＣｅｐ）Ｉ７６．
１０ｍＭＥＤＴＡおよび０．２５％ＳＤＳの２００μｅ
中にゼ）懸濁した。ブロテイナーぜＫを０．５ｍ？／駐
の最終濃度になるまで添加し、そしてこの混合物を３０
℃で３０分間インキュベートし、次いでＤ Ｎ Ａを沈
降させる前に２回フェノール抽出した。
組み換えＤ Ｎ Ａ作製に使用した野性型ウィルスは先
に示したＡ ｃ ＮＰＶのＬ−１変異株であり、この変
異株は単離され、 ＬｅｅおよびＭｊ、］ｌｅｒのＪ。
に示したＡ ｃ ＮＰＶのＬ−１変異株であり、この変
異株は単離され、 ＬｅｅおよびＭｊ、］ｌｅｒのＪ。
Ｖｉｒｏｌ。、２７，７５４〜７６７（１９７８）
に記載されており、この開示は参照によりここに引用さ
ラインは０．２６％トリプトースブロス、１０％ウシ胎
児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＴＣ−１００培地（微生物
学協会）で増殖させた。
に記載されており、この開示は参照によりここに引用さ
ラインは０．２６％トリプトースブロス、１０％ウシ胎
児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＴＣ−１００培地（微生物
学協会）で増殖させた。
ニュートラルレッドで染色した単層とＸ −ｇａｌで染
色した単層との比較は、１０００のプラーク巾約１つの
プラークがＡｃＮＰＶ とβ−ガラクトンダーゼ゛を
発現させたｐＧＰ −８６８７４との同時トランスフェ
クトヨ／から生じたことを示した。いくつかの青色プラ
ークが選択され、それらは直接Ｓ、フルギベルダ細胞の
単層上で再度プラーク形成させた。
色した単層との比較は、１０００のプラーク巾約１つの
プラークがＡｃＮＰＶ とβ−ガラクトンダーゼ゛を
発現させたｐＧＰ −８６８７４との同時トランスフェ
クトヨ／から生じたことを示した。いくつかの青色プラ
ークが選択され、それらは直接Ｓ、フルギベルダ細胞の
単層上で再度プラーク形成させた。
トランスフェクトョ／はグリセロール促進工程を除く燐
酸カルソウム沈降法を使用して、 Ｐｏｔｔｅｒおよび
Ｍｉ］ｌｅｒの」二記文献記載の方法で行われた。
酸カルソウム沈降法を使用して、 Ｐｏｔｔｅｒおよび
Ｍｉ］ｌｅｒの」二記文献記載の方法で行われた。
ＤＮＡ沈殿物を２０分間インキュベートシた後、Ｓ、フ
ルギ投ルグ細胞は２〜３時間液体培地で穆われ、その後
この覆いはプラーク発現のために新しい液体培地または
アガロース含有培地と取り替えられた。トランスプレイ
スメ／トの実験にはウィルスＤＮＡ１分子あたりプラス
ミドゝＤ Ｎ Ａ ＩＱＱ分子が慣例的に使用された。
ルギ投ルグ細胞は２〜３時間液体培地で穆われ、その後
この覆いはプラーク発現のために新しい液体培地または
アガロース含有培地と取り替えられた。トランスプレイ
スメ／トの実験にはウィルスＤＮＡ１分子あたりプラス
ミドゝＤ Ｎ Ａ ＩＱＱ分子が慣例的に使用された。
トランスフェクンヨ／法に用゛いられるＤＮＡはトリス
−ＥＤＴＡ溶液よりむしろ水の中に貯蔵された。
−ＥＤＴＡ溶液よりむしろ水の中に貯蔵された。
青色プラーク（内蔵体を含まな℃・）は採取され。
ウィルス株へと増殖させて制限エンビヌクレアーゼ分析
により性状決定がなされた。これらのウィルスの１つで
あるＡｃＮＰＶ Ｌ ］、 Ｇ Ｐ −ｇａｌ ３
のＰｓｔ Ｉ およびＢ−ａ、ｍＨＩパターンを第６
図に示す。
により性状決定がなされた。これらのウィルスの１つで
あるＡｃＮＰＶ Ｌ ］、 Ｇ Ｐ −ｇａｌ ３
のＰｓｔ Ｉ およびＢ−ａ、ｍＨＩパターンを第６
図に示す。
ＬＩＧＰ−ｇａ、１３ ではＰｓｔ−Ｄ が欠けて
おり、２つの新しく・断片が存在している。新しい断片
の一方はＰ＃ｔ−ＣおよびＤ の間に見出され、他方は
Ｐｅｔ −Ｆ 以下に見出される。後渚の断片はＰＭ
Ｃ８７４のＡｐＳ 領域がらＡｃＮＰＶのＥｃｏＲＩ
−０領域までのｐＧＰ−Ｂ６８７４のＰｓｔ Ｉ断片と
一緒に泳動する。Ｐｅｔ Ｇ とＰｓｔ Ｄ の間
の新しいＰｓｔ断片はＡｃＮＰＶ（１１のＥｃｏＲニー
ＢがらＥｃｏＲＩ−王におけるＰｓｔＩ−０／Ｎ接合部
および犬腸酌β−ｇａｌ、 ｌａｃ Ｙおよびｌａｃ
Ａ 領域に相当する。
おり、２つの新しく・断片が存在している。新しい断片
の一方はＰ＃ｔ−ＣおよびＤ の間に見出され、他方は
Ｐｅｔ −Ｆ 以下に見出される。後渚の断片はＰＭ
Ｃ８７４のＡｐＳ 領域がらＡｃＮＰＶのＥｃｏＲＩ
−０領域までのｐＧＰ−Ｂ６８７４のＰｓｔ Ｉ断片と
一緒に泳動する。Ｐｅｔ Ｇ とＰｓｔ Ｄ の間
の新しいＰｓｔ断片はＡｃＮＰＶ（１１のＥｃｏＲニー
ＢがらＥｃｏＲＩ−王におけるＰｓｔＩ−０／Ｎ接合部
および犬腸酌β−ｇａｌ、 ｌａｃ Ｙおよびｌａｃ
Ａ 領域に相当する。
ＢａｍＨＩ 、２ターンもまた全ＰＭＣ８７４がＡｃ
ＮＰＶ内に適切に挿入されたことを示している。野性株
ＡｃＮＰＶからのＢａｍＨＩ断片はどれもＬＩＧＰ−ｇ
ａｌ３ Ｋ存在しなｌ、−が、ｐＭＣ８７４と−緒に泳
動する新しい９．２キロ塩基の断片が見出される。
ＮＰＶ内に適切に挿入されたことを示している。野性株
ＡｃＮＰＶからのＢａｍＨＩ断片はどれもＬＩＧＰ−ｇ
ａｌ３ Ｋ存在しなｌ、−が、ｐＭＣ８７４と−緒に泳
動する新しい９．２キロ塩基の断片が見出される。
Ｂａｍ Ｆ゛もまたＬＩＧＰ−ｇａｌ３ ウィルスに
観察され、ＡｃＮ Ｐ Ｖ とｐＧＰ−Ｂ６８７４と
（７）間の相同的組み換えがｐＭｃ１３７４ およびＥ
ｃｏ ＲＩ−Ｉ（ｓ）接合部の近辺でおこったことを示
した。こうして。
観察され、ＡｃＮ Ｐ Ｖ とｐＧＰ−Ｂ６８７４と
（７）間の相同的組み換えがｐＭｃ１３７４ およびＥ
ｃｏ ＲＩ−Ｉ（ｓ）接合部の近辺でおこったことを示
した。こうして。
ウィルｙ、ＡＣＮＰＶ ＬＩＧＰ−ｇａｌ ３はβ−
ガラクトシダーゼ活性を発現し、ｐＭＣ８７４由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子がこのウィルス内に組み入れ
られたことを示す。
ガラクトシダーゼ活性を発現し、ｐＭＣ８７４由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子がこのウィルス内に組み入れ
られたことを示す。
β−ガラクトシダＴ−ぜ活性の発現調節β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の発現がポリヘドリン遺伝子の発現と同じ
時間的調節のもとにあるかどうかを決定するために、Ｓ
、フルギＲルダ細胞の単層に野性型ＡｃＮＰＶまたはＡ
ｃＮＰＶ ＬＩＧＰ−ｇａｌ ３を細胞あたり２０プラ
一ク形成単位（ＰＦＵ ）の感染の多重度で感染させた
。感染後いろいろな時間に、感染細胞はβ−ガラクトシ
ダーゼ活性および全タン・ξり質含有量について検定さ
れた。β−ガラクト７ダーゼ活性は最初１８〜２４時間
の間にあられれ、その後感染の４８時間後まで劇的に増
加する。
ダーゼ遺伝子の発現がポリヘドリン遺伝子の発現と同じ
時間的調節のもとにあるかどうかを決定するために、Ｓ
、フルギＲルダ細胞の単層に野性型ＡｃＮＰＶまたはＡ
ｃＮＰＶ ＬＩＧＰ−ｇａｌ ３を細胞あたり２０プラ
一ク形成単位（ＰＦＵ ）の感染の多重度で感染させた
。感染後いろいろな時間に、感染細胞はβ−ガラクトシ
ダーゼ活性および全タン・ξり質含有量について検定さ
れた。β−ガラクト７ダーゼ活性は最初１８〜２４時間
の間にあられれ、その後感染の４８時間後まで劇的に増
加する。
β−ガラクトシダーゼの量はＭｉｌｌｅｒによるＳｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ６ｐ究所、ニューヨーク（１９
７２）に記載のオルト−ニトロフェニルガラクト／ト９
（ＯＮＰＣ）検定法を使用して測定した。試験用昆虫細
胞に２０ＰＦＵ／１ａ胞の感染の多重度でウィルスを感
染させた。ウィルスは穏やかにゆすりながら室温で１時
間吸着させた。接種物を取り除いて適当な培地とおきか
え、そしてインキュベーションを指示時間の間２７℃で
実施した。細胞は燐酸緩衝化塩化す） ｌ）ラム水溶液
（ＬｅｅおよびＭｉｌｌｅｒの上記文献参照）で洗浄し
、細胞を平板からかき取って２００Ｘ、９で５分間遠心
沈殿させた。上澄みを捨て、細胞沈殿物は液体窒素中で
凍結して検定まで一７０℃で貯蔵した。細胞を蒸留水に
再び懸濁し、次いで２緩衝液中に適当に（１：１〜１：
１ＯＯＯ）希釈し、こうすると０ＮＰＧ添加後１５分な
いし１時間の間に薄い黄色があられれた。
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ６ｐ究所、ニューヨーク（１９
７２）に記載のオルト−ニトロフェニルガラクト／ト９
（ＯＮＰＣ）検定法を使用して測定した。試験用昆虫細
胞に２０ＰＦＵ／１ａ胞の感染の多重度でウィルスを感
染させた。ウィルスは穏やかにゆすりながら室温で１時
間吸着させた。接種物を取り除いて適当な培地とおきか
え、そしてインキュベーションを指示時間の間２７℃で
実施した。細胞は燐酸緩衝化塩化す） ｌ）ラム水溶液
（ＬｅｅおよびＭｉｌｌｅｒの上記文献参照）で洗浄し
、細胞を平板からかき取って２００Ｘ、９で５分間遠心
沈殿させた。上澄みを捨て、細胞沈殿物は液体窒素中で
凍結して検定まで一７０℃で貯蔵した。細胞を蒸留水に
再び懸濁し、次いで２緩衝液中に適当に（１：１〜１：
１ＯＯＯ）希釈し、こうすると０ＮＰＧ添加後１５分な
いし１時間の間に薄い黄色があられれた。
細胞はＭｉｌｌｅｒ（１９７２年）により推せんされた
クロロホルムおよびＯ１％Ｓ Ｄ 、Ｓを用いて破壊し
た。比活性はｎモル（分解されたＯ Ｎ Ｐ Ｇ／分／
ｍｇ（タンパク質）として定義された。
クロロホルムおよびＯ１％Ｓ Ｄ 、Ｓを用いて破壊し
た。比活性はｎモル（分解されたＯ Ｎ Ｐ Ｇ／分／
ｍｇ（タンパク質）として定義された。
感染後４８時間に観察された比活性は８００゜ｎ モ／
ｌ／ （分解０ＮＰＧ）、％／ａｔ （タンパク質）で
あり、これはβ−ガラクトシダーゼ活性が約９００倍高
めらねたことを表わす、、８０００という比活性は純粋
なβ−ガラクト７ダーゼが３×１０５単位／ ｍｙの比
活性を有するので全細胞タンパク質の少なくとも３％が
β−ガラクトンダ〜ゼであるということを意味する。感
染後７２時間で、比活性は細胞溶解が始まるために大抵
降下する。
ｌ／ （分解０ＮＰＧ）、％／ａｔ （タンパク質）で
あり、これはβ−ガラクトシダーゼ活性が約９００倍高
めらねたことを表わす、、８０００という比活性は純粋
なβ−ガラクト７ダーゼが３×１０５単位／ ｍｙの比
活性を有するので全細胞タンパク質の少なくとも３％が
β−ガラクトンダ〜ゼであるということを意味する。感
染後７２時間で、比活性は細胞溶解が始まるために大抵
降下する。
ポリヘドリン／β−ガラクトノダーゼ遺伝子発現の調節
はまた感染後いろいろな時間に３５３メチオニノで感染
細胞をパルス標識することにより分析された。３５３で
標識されたタンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析される。
はまた感染後いろいろな時間に３５３メチオニノで感染
細胞をパルス標識することにより分析された。３５３で
標識されたタンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析される。
タンハク質ノクーマシーブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
ｂｌｕｅ）染色は感染の初期に野性型またはＬＩＣＰ−
ｇａｌ ３のプロフィールに有意な差がないことを示す
。感染の１８〜７２時間後、３３０００ダルトノのポリ
ヘドリン遺伝子ξり質が野性型を感染させた細胞で合成
され、ＬＩＧＰ−ｇａｌ３ を感染させた細胞では合
成されない。
ｂｌｕｅ）染色は感染の初期に野性型またはＬＩＣＰ−
ｇａｌ ３のプロフィールに有意な差がないことを示す
。感染の１８〜７２時間後、３３０００ダルトノのポリ
ヘドリン遺伝子ξり質が野性型を感染させた細胞で合成
され、ＬＩＧＰ−ｇａｌ３ を感染させた細胞では合
成されない。
ＬＩＧＰ−ｇａｌ３のプロフィールは感染の約１８時間
後に野性型感染細胞には見られない約１２００００グル
トンの新しいタンパク質および９５０００ダルトン範囲
の数種の小さなタンパク質を示す。最も大きなタン／ξ
り質はポリへドリフ／β−ガラクトシダーゼ融合ポリ投
ブチドに妥当な大きさである。１２００００ダルトン領
域のクーマン−ブルー染色の強さは活性β−ガラクトシ
ダーゼが感染４８時間後に全細胞タン／８り質の少な（
とも３％を占めるという比活性の推定を確かなものとす
る。
後に野性型感染細胞には見られない約１２００００グル
トンの新しいタンパク質および９５０００ダルトン範囲
の数種の小さなタンパク質を示す。最も大きなタン／ξ
り質はポリへドリフ／β−ガラクトシダーゼ融合ポリ投
ブチドに妥当な大きさである。１２００００ダルトン領
域のクーマン−ブルー染色の強さは活性β−ガラクトシ
ダーゼが感染４８時間後に全細胞タン／８り質の少な（
とも３％を占めるという比活性の推定を確かなものとす
る。
クーマノ−ブルー染色はまたポリヘドリノ／β−ガラク
ト／ダーゼ融合タンパク質の量が感染後７２時間で減少
することも反映する。
ト／ダーゼ融合タンパク質の量が感染後７２時間で減少
することも反映する。
Ｍｉｌｌｅｒらの１９８３年の上記文献記載の方法は感
染したＳ、フルギにルダ細胞におけるウィルス誘導タン
パク質の分析に使用されるが、ただし平板３５叫あたり
細胞１×１０６個が用いられ。
染したＳ、フルギにルダ細胞におけるウィルス誘導タン
パク質の分析に使用されるが、ただし平板３５叫あたり
細胞１×１０６個が用いられ。
また細胞は低速度で遠心沈殿させた後媒体で洗浄された
。
。
ポリヘトす／抗体を用いての免疫沈降
野性型およびＬＩＧＰ−ｇａｌ３ を感染させた細胞
内で感染の４８時間後に産生されたホリハブチドの性質
をさらに調べるために、感染４８時間後の３５８−標識
タン・ぐり質を精製ポリヘドリノを抗原として得られた
抗血清で沈降させた。、Ｄ Ｉ７ヘドリン抗血清を用℃
・る免疫沈降はＫｅｓｓｌｅｒ のＩｍｍｕｎＯ］、
Ｏｇｙ、１１７．１４８２〜１４９０（’１９７６）に
記載の方法をわずかに変更することによって行われた。
内で感染の４８時間後に産生されたホリハブチドの性質
をさらに調べるために、感染４８時間後の３５８−標識
タン・ぐり質を精製ポリヘドリノを抗原として得られた
抗血清で沈降させた。、Ｄ Ｉ７ヘドリン抗血清を用℃
・る免疫沈降はＫｅｓｓｌｅｒ のＩｍｍｕｎＯ］、
Ｏｇｙ、１１７．１４８２〜１４９０（’１９７６）に
記載の方法をわずかに変更することによって行われた。
感染４８時間後の３５３−標識夕７・ξり仰４１μｅを
ポリヘドリン抗血清４１μｅと室温で１時間イノキュベ
ートし、次いで沈降緩衝液（０，１５ＭＮａＣｅ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ、５ＱｍＭ ）リス−ＨＣｅ。００２％Ｎ
ａＮ３．０．０５％ＮＰ４Ｑおよび０１％ＢＳＡ）
中の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ −ｃｏｃｃｕ
ｅ ａｕｒｅｕｓ、 Ｓｉｇｍａ）の２％懸濁液１６０
ｔｉｅを加えた。この混合物を室温で２０分間インキ
ュイードし、生じた沈殿物を１ｓｏｏｏｘｙで１分間遠
心にかけて集めた。上澄みを捨て、沈殿物は沈降緩衝液
０．５ｍ（＋で洗浄した。その後、この沈殿物を可溶化
緩衝液（１％ＳＤＳ、’０．５％β−メルカプトエタノ
ールおよび０．５Ｍ尿素）中に渦を発生させながら再懸
濁し、１００℃で５分間加熱した。破壊片を１５０００
Ｘ；で５分間遠心沈殿させ、上澄みは５ＤＳ−ｙｌ＋）
アクリルアミビゲル亀気泳動で分析した。
ポリヘドリン抗血清４１μｅと室温で１時間イノキュベ
ートし、次いで沈降緩衝液（０，１５ＭＮａＣｅ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ、５ＱｍＭ ）リス−ＨＣｅ。００２％Ｎ
ａＮ３．０．０５％ＮＰ４Ｑおよび０１％ＢＳＡ）
中の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ −ｃｏｃｃｕ
ｅ ａｕｒｅｕｓ、 Ｓｉｇｍａ）の２％懸濁液１６０
ｔｉｅを加えた。この混合物を室温で２０分間インキ
ュイードし、生じた沈殿物を１ｓｏｏｏｘｙで１分間遠
心にかけて集めた。上澄みを捨て、沈殿物は沈降緩衝液
０．５ｍ（＋で洗浄した。その後、この沈殿物を可溶化
緩衝液（１％ＳＤＳ、’０．５％β−メルカプトエタノ
ールおよび０．５Ｍ尿素）中に渦を発生させながら再懸
濁し、１００℃で５分間加熱した。破壊片を１５０００
Ｘ；で５分間遠心沈殿させ、上澄みは５ＤＳ−ｙｌ＋）
アクリルアミビゲル亀気泳動で分析した。
、ｆ ＋）ヘドリノ抗血清は野性型感染細胞から３３０
００ダルトノのＨソリヘトリンタンパクηおよび２００
００〜２５０００ダルトノ領域の数種のポリ２プチド類
を沈降させた。この大きさのポリ２プチド類はＬＩＧＰ
−ｇａｌ３ 感染細胞ではポリヘト９リノ抗血清で沈
降されなかった。その代わり、１２００００ダルト／の
タンパク質が主な沈殿物であって、先に示した９５００
０ダルトン領域ノ一連のポリペプチド類および４１００
０〜９５０’ ＯＯダルトノの目立たない大きさの数種
の別の小さなポリ２プチド類も沈降された。こうして、
１２００００ダルトンのタンパク質はポリヘドリン融合
産物であり、より小さな、Ｑ リ６ブチド類はその融合
産物の別の形体を表わしている。
００ダルトノのＨソリヘトリンタンパクηおよび２００
００〜２５０００ダルトノ領域の数種のポリ２プチド類
を沈降させた。この大きさのポリ２プチド類はＬＩＧＰ
−ｇａｌ３ 感染細胞ではポリヘト９リノ抗血清で沈
降されなかった。その代わり、１２００００ダルト／の
タンパク質が主な沈殿物であって、先に示した９５００
０ダルトン領域ノ一連のポリペプチド類および４１００
０〜９５０’ ＯＯダルトノの目立たない大きさの数種
の別の小さなポリ２プチド類も沈降された。こうして、
１２００００ダルトンのタンパク質はポリヘドリン融合
産物であり、より小さな、Ｑ リ６ブチド類はその融合
産物の別の形体を表わしている。
Ｌ］ＧＰ−ｇａｌ３ 感染細胞におけるβ−ガラクトン
ダーゼの比活性は例外的て高い。酵母において報告され
た最も高い比活性は、感染４８時間後のＬｌＧＰ−ｇａ
ｌ３ 感染細胞において観察された比活性の半分であ
る。野性型感染細胞内知見用された３３０００ダルトノ
のタン・ξり質はＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ 感染細胞内
で約１２００００ダルドアのポリヘト９リノ／β−ガラ
クトシダーゼ融合タン・ξり質およびより小さな分子量
の一連の他のタン・ξり質類と置き換えられる。より小
さなタンパク角は個々に１２００００ダルトンのタンパ
ク質よりも少量であり、１２００００ダルトノの融合タ
ンパク質の加水分解産物でありうる。
ダーゼの比活性は例外的て高い。酵母において報告され
た最も高い比活性は、感染４８時間後のＬｌＧＰ−ｇａ
ｌ３ 感染細胞において観察された比活性の半分であ
る。野性型感染細胞内知見用された３３０００ダルトノ
のタン・ξり質はＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ 感染細胞内
で約１２００００ダルドアのポリヘト９リノ／β−ガラ
クトシダーゼ融合タン・ξり質およびより小さな分子量
の一連の他のタン・ξり質類と置き換えられる。より小
さなタンパク角は個々に１２００００ダルトンのタンパ
ク質よりも少量であり、１２００００ダルトノの融合タ
ンパク質の加水分解産物でありうる。
実姉例２
ポリヘトす／／β−ガラクト／ダーゼ融合タン・ぞり質
はまたＡｃＮＰＶ複製を許容する他の昆虫細胞によって
も発現される。例えば、鱗翅目ヤガ科のＴｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ、 ＴＮ−３６８から誘導された細胞
ラインは０．２６％トリプトースブロス、１０％ウソ胎
児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＴＯ−１００培地（微生物
学協会）中で増殖させた。この細胞ラインの単層は・組
み換えウィルスＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ の種々の希釈
物で感染させ、そして１２０μ＆／ｒｎｅのβ−ガラク
トシダーゼ用発色指示薬Ｘ−ｇａｌを含有するアガロー
ス−培地で覆った。この単層は２７℃で４日間インキュ
ベートし、次いで平板を３７℃に４〜６時間暖めること
によって発色させた。ポリヘトゝリン／β−ガラクトシ
ダーゼ融合タン・ξり質の発現は′ｒ、ｎ１単層上の鮮
明な青色プラークにより確認された。この滴定濃度は組
み換えウィルスがＳ、フルギにルグ単層と大体同程度に
Ｔ、ｎｉ単層にも伝染性であることを示した。
はまたＡｃＮＰＶ複製を許容する他の昆虫細胞によって
も発現される。例えば、鱗翅目ヤガ科のＴｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ、 ＴＮ−３６８から誘導された細胞
ラインは０．２６％トリプトースブロス、１０％ウソ胎
児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＴＯ−１００培地（微生物
学協会）中で増殖させた。この細胞ラインの単層は・組
み換えウィルスＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ の種々の希釈
物で感染させ、そして１２０μ＆／ｒｎｅのβ−ガラク
トシダーゼ用発色指示薬Ｘ−ｇａｌを含有するアガロー
ス−培地で覆った。この単層は２７℃で４日間インキュ
ベートし、次いで平板を３７℃に４〜６時間暖めること
によって発色させた。ポリヘトゝリン／β−ガラクトシ
ダーゼ融合タン・ξり質の発現は′ｒ、ｎ１単層上の鮮
明な青色プラークにより確認された。この滴定濃度は組
み換えウィルスがＳ、フルギにルグ単層と大体同程度に
Ｔ、ｎｉ単層にも伝染性であることを示した。
実施例３
遺伝子操作の適用のい（つかの型にとって、パラセンジ
ャー遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下にベク
ター内に挿入することが有利であるだろう。１つのこの
種の適用において、トランスプレイスメ／トベクター
プラスミドゝ ｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａ、］ が作
られた。このプラスミドは大腸菌ＨＢＩＯＩ 内に挿
入され、このす／プルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ、Ｏｎ Ｋ
ＡＴＣＣ番号３ｔ／ｒｑｏとして寄託された。このズク
ターは・ξツセノジャーＤＮＡをそれ自体のプロモータ
ーまたは他の外来プロモーターの制御下に挿入するため
の１つのＰｓｔ Ｉ部位を提供し、そしてこの組み換え
プラスミドはＡｃＮＰＶ内に挿入され、組み換えウィル
スを選択するための手段としては゛青色゛プラークが使
用される。
ャー遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下にベク
ター内に挿入することが有利であるだろう。１つのこの
種の適用において、トランスプレイスメ／トベクター
プラスミドゝ ｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａ、］ が作
られた。このプラスミドは大腸菌ＨＢＩＯＩ 内に挿
入され、このす／プルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ、Ｏｎ Ｋ
ＡＴＣＣ番号３ｔ／ｒｑｏとして寄託された。このズク
ターは・ξツセノジャーＤＮＡをそれ自体のプロモータ
ーまたは他の外来プロモーターの制御下に挿入するため
の１つのＰｓｔ Ｉ部位を提供し、そしてこの組み換え
プラスミドはＡｃＮＰＶ内に挿入され、組み換えウィル
スを選択するための手段としては゛青色゛プラークが使
用される。
第４図ニ示すれるｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ プラ
スミドゝはｐＧＰ−’Ｂ６Ｂ７４ を制限エツトヌク
レアーゼＳａｌ■ で部分消化し、そして低いＤＮＡ
濃度で再結合させることによって作製された。大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ の形質転換後、青色コロニーがカナマイシ
ン平板上で選択され、次いでア／ピノリノに対する感受
性について試験された。Ａｍ ｐ８＊ ’ Ｋａ ｎ
Ｒｈｆ色コロニーのプラスミドゝは制限エンド９ヌクレ
アービ分析によってその性状が確認された。ｐｃｐ −
Ｂ６８７４／Ｓａ］ プラスミドはＥｃｏＲニー Ｉ（
Ｓ） （７）Ｓａｌ Ｉ 部位に１．ａｃＺ（β−ガ
ラクトノダーゼ遺伝子、 ” Ｚ ” ） ｌａｃ
ｙ、 （”ｙ”）を含むβ−ｇａｌ 。
スミドゝはｐＧＰ−’Ｂ６Ｂ７４ を制限エツトヌク
レアーゼＳａｌ■ で部分消化し、そして低いＤＮＡ
濃度で再結合させることによって作製された。大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ の形質転換後、青色コロニーがカナマイシ
ン平板上で選択され、次いでア／ピノリノに対する感受
性について試験された。Ａｍ ｐ８＊ ’ Ｋａ ｎ
Ｒｈｆ色コロニーのプラスミドゝは制限エンド９ヌクレ
アービ分析によってその性状が確認された。ｐｃｐ −
Ｂ６８７４／Ｓａ］ プラスミドはＥｃｏＲニー Ｉ（
Ｓ） （７）Ｓａｌ Ｉ 部位に１．ａｃＺ（β−ガ
ラクトノダーゼ遺伝子、 ” Ｚ ” ） ｌａｃ
ｙ、 （”ｙ”）を含むβ−ｇａｌ 。
Ｒｅｐ およびＫａｎＲ遺伝子の各鎮域を含むことが
ワカッタ。］）］ＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌプラスミド
は本質的にｐＧＰ−８６８７４の場合のようＫ Ｊ ＋
）ヘドリノ遺伝子のＮ末端およびＣ末端に結合されたｐ
ＭｃＢ７４ である。Ｐｓｔ Ｉ 部位はβ−ガラ
ク］・シダーゼ発現または大腸菌内での複製にとって本
質的でない。ｐＧＰ−、Ｂ ６８７４ ／Ｓａｌを含有
する大腸菌はＸ −ｇａｌ平板とで青色であり、またＭ
ａｃｏｎｋｅｙ平板とで赤色である。
ワカッタ。］）］ＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌプラスミド
は本質的にｐＧＰ−８６８７４の場合のようＫ Ｊ ＋
）ヘドリノ遺伝子のＮ末端およびＣ末端に結合されたｐ
ＭｃＢ７４ である。Ｐｓｔ Ｉ 部位はβ−ガラ
ク］・シダーゼ発現または大腸菌内での複製にとって本
質的でない。ｐＧＰ−、Ｂ ６８７４ ／Ｓａｌを含有
する大腸菌はＸ −ｇａｌ平板とで青色であり、またＭ
ａｃｏｎｋｅｙ平板とで赤色である。
こうして、トランスプレイスメノトブラスミト５１）Ｇ
Ｐ−Ｂ６８７４／Ｓａｌが作うｔｔ、ソＬ−ｉｃコレは
、ｅクセ／ジャー遺伝子（それら自体のプロモーターの
制御下にある）をもつ組み換えウィルスの挿入および選
択を容易にするために使用することができる。パラ七／
ジャー遺伝子はこのプラスミドの大腸菌複製遺伝子に一
番近い特異なＰｓｔ Ｉ 部位に挿入され、そして大
腸菌内でクローン化される。
Ｐ−Ｂ６８７４／Ｓａｌが作うｔｔ、ソＬ−ｉｃコレは
、ｅクセ／ジャー遺伝子（それら自体のプロモーターの
制御下にある）をもつ組み換えウィルスの挿入および選
択を容易にするために使用することができる。パラ七／
ジャー遺伝子はこのプラスミドの大腸菌複製遺伝子に一
番近い特異なＰｓｔ Ｉ 部位に挿入され、そして大
腸菌内でクローン化される。
得られたプラスミドと野性型ＡｃＮ Ｐ Ｖとの同時ト
ランスフェクンヨンおよびその後の青色ウィルスの選択
は組み換えウィルスの選択を容易にするだろう。
ランスフェクンヨンおよびその後の青色ウィルスの選択
は組み換えウィルスの選択を容易にするだろう。
ｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ のトランスプレイスメ
ノトベクターとしての利用性を立証しかつ外来プロモー
ターの有益な使用を立証するために、外来プロモーター
Ｒ８Ｖ−ＬＴＲに結合したクロラムフエニコールアセチ
ルトラノスフエラ−ｔ（ＣＡＴ）をコードする大腸菌遺
伝子をｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ内に挿入した。この
作製のための略図を第７図に示す。プラスミド’ｐＲ３
Ｖ−ＣＡＴ （ＧｏｒｍａｎらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
。Ａｃａｄ、 ５ＣＩ−ｅ ７９，６７７７（１９８２
） を参照）はＰｓｔ Ｉ およびＢａｍ ＨＩで
消化した。トランスプレイスメノトプラスミドｐｃｐ−
Ｂ ６８７４ ／ Ｓａｄ、はＰｓｔ Ｉ で消化し
、’ＢａｍＨＩで部分的に消化した。２つの制限エツト
ヌクレアーゼ−消化プラスミドを混合して結合させた。
ノトベクターとしての利用性を立証しかつ外来プロモー
ターの有益な使用を立証するために、外来プロモーター
Ｒ８Ｖ−ＬＴＲに結合したクロラムフエニコールアセチ
ルトラノスフエラ−ｔ（ＣＡＴ）をコードする大腸菌遺
伝子をｐＧＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ内に挿入した。この
作製のための略図を第７図に示す。プラスミド’ｐＲ３
Ｖ−ＣＡＴ （ＧｏｒｍａｎらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
。Ａｃａｄ、 ５ＣＩ−ｅ ７９，６７７７（１９８２
） を参照）はＰｓｔ Ｉ およびＢａｍ ＨＩで
消化した。トランスプレイスメノトプラスミドｐｃｐ−
Ｂ ６８７４ ／ Ｓａｄ、はＰｓｔ Ｉ で消化し
、’ＢａｍＨＩで部分的に消化した。２つの制限エツト
ヌクレアーゼ−消化プラスミドを混合して結合させた。
得られた組み換えプラスミドを形質転換によって大腸菌
に導入し、１ａＣ＋コロニーを最少培地」二で選択した
。プラスミ）ｐＬ＋ｃ−１（第７図参照）が単離されて
、その構造は制限エノビヌクレアーゼ分析で確かめられ
た。
に導入し、１ａＣ＋コロニーを最少培地」二で選択した
。プラスミ）ｐＬ＋ｃ−１（第７図参照）が単離されて
、その構造は制限エノビヌクレアーゼ分析で確かめられ
た。
Ｓ、フルギベルダ細胞の単層はＡｃＮＰＶ Ｌ−ＩＤ
ＮＡおよびｐＬＣ−ｊ ＤＮＡ の１：１００混合物
を用いてトランスフェクトされた。青色プラークを形成
させかつ○Ｖを欠くウィルスが選択された。
ＮＡおよびｐＬＣ−ｊ ＤＮＡ の１：１００混合物
を用いてトランスフェクトされた。青色プラークを形成
させかつ○Ｖを欠くウィルスが選択された。
ウィルス ＡｃＮＰＶ Ｌｌ−Ｒ８Ｖ−ＣＡＴ が
単ｐ９．され、そして制限エツトヌクレアーゼ分析によ
ってｌａｃ Ｚ 、 ｌａｃ Ｙ、 への少Ｙｒ
くとも一部、（”Ａ”）。
単ｐ９．され、そして制限エツトヌクレアーゼ分析によ
ってｌａｃ Ｚ 、 ｌａｃ Ｙ、 への少Ｙｒ
くとも一部、（”Ａ”）。
Ｏｒｉ （複製開始点、時々” ｒ ｅ ｐ ”と呼ば
れる）およびＲ３Ｖ−ＬＴＲ−ＣＡＴのｐＬＣ−ｘ遺伝
子を含むことが見出された。
れる）およびＲ３Ｖ−ＬＴＲ−ＣＡＴのｐＬＣ−ｘ遺伝
子を含むことが見出された。
ＡｃＮＰＶ−Ｌｌ−Ｒ３Ｖ−ＣＡＴ ライ／Ｌ、 ス
ハＧｏｒｍａｎらの上記文献記載の方法でＣＡＴ活性を
検定することによって示されるごと（、感染後２時間゛
という早い時期ＫＣＡＴ遺伝子を発現させた。
ハＧｏｒｍａｎらの上記文献記載の方法でＣＡＴ活性を
検定することによって示されるごと（、感染後２時間゛
という早い時期ＫＣＡＴ遺伝子を発現させた。
活性は感染の２時間後に初めて観察され、そして感染後
６〜１２時間の間増加し続けた。こうして、外来プロモ
ーターＲ８Ｖ−ＬＴＲは昆虫細胞内で外来遺伝子を発現
させるのに使用することができる。その」二、外来プロ
モータは感染の初期に外来遺伝子を発現させるのに使用
することができる。
６〜１２時間の間増加し続けた。こうして、外来プロモ
ーターＲ８Ｖ−ＬＴＲは昆虫細胞内で外来遺伝子を発現
させるのに使用することができる。その」二、外来プロ
モータは感染の初期に外来遺伝子を発現させるのに使用
することができる。
ＡｃＮ Ｐ Ｖの多くの特徴はこのウィルスを後生動物
環境内での・ξツ七／ジャー遺伝子の増殖ならびに発現
のための優れた宿主／ベクターとさせる。
環境内での・ξツ七／ジャー遺伝子の増殖ならびに発現
のための優れた宿主／ベクターとさせる。
桿状カプシドは大きく広がって追加のＤＮＡ配列を収容
し、そしてベクターの収容能力は１００キロ塩基を超え
ることができる。細胞外ウィルスは細胞培養において伝
染性形体であるので、内蔵のための遺伝子は必要でない
。、ｆ リヘドリノまたは７．２Ｋゾロテイノをコード
化する遺伝子は、それらが感染後１８〜７２時間の間に
豊富に発現されるので、・ξツセノジャー遺伝子挿入の
ための理想的な部位である。感染後期には、これらのタ
ノ・ξり質は感染細胞の全タノパク質の２０％またはそ
れ以上を構成しうる。ポリヘドリンおよび７．２ Ｋプ
ロティン遺伝子のＡｃＮＰＶ物理地図」二の位置および
転写の方向は知られている。１２キロ塩基のポリヘドリ
ン メノセノジャーＲＮＡの合成は一時的に制御されて
、感染１２時間後に初めて検出される。ポリヘトす／プ
ロモーターからの遅い発現（感染の１８時間後）は細胞
毒の遺伝子産物を発現させる際疋特に都合がよい。
し、そしてベクターの収容能力は１００キロ塩基を超え
ることができる。細胞外ウィルスは細胞培養において伝
染性形体であるので、内蔵のための遺伝子は必要でない
。、ｆ リヘドリノまたは７．２Ｋゾロテイノをコード
化する遺伝子は、それらが感染後１８〜７２時間の間に
豊富に発現されるので、・ξツセノジャー遺伝子挿入の
ための理想的な部位である。感染後期には、これらのタ
ノ・ξり質は感染細胞の全タノパク質の２０％またはそ
れ以上を構成しうる。ポリヘドリンおよび７．２ Ｋプ
ロティン遺伝子のＡｃＮＰＶ物理地図」二の位置および
転写の方向は知られている。１２キロ塩基のポリヘドリ
ン メノセノジャーＲＮＡの合成は一時的に制御されて
、感染１２時間後に初めて検出される。ポリヘトす／プ
ロモーターからの遅い発現（感染の１８時間後）は細胞
毒の遺伝子産物を発現させる際疋特に都合がよい。
上記実施例はＡｃＮ Ｐ Ｖが上首尾で遺伝子操作され
かつ組み換えＤＮＡベクターとして用いることができる
ことを証明する。実施例はまたポリヘドリノプロモータ
ーおよび他のプロモーターが大腸菌のβ−ガラクトノダ
ーゼのごときパラセンジャ−ＤＮＡを高水準で発現させ
つることを立証する。
かつ組み換えＤＮＡベクターとして用いることができる
ことを証明する。実施例はまたポリヘドリノプロモータ
ーおよび他のプロモーターが大腸菌のβ−ガラクトノダ
ーゼのごときパラセンジャ−ＤＮＡを高水準で発現させ
つることを立証する。
得られたβ−ガラクトノダーゼの比活性は、出願人の知
る限りでは、原核細胞または真核細胞の他の発現系にお
いて以前報告されたもののどれよりも著しく高い。
る限りでは、原核細胞または真核細胞の他の発現系にお
いて以前報告されたもののどれよりも著しく高い。
この他の利点および修飾は本発明の上記開示または実施
例を考察することにより当業者にとって容易に推察でき
ることであり、本発明は添けの特許請求の範囲にのみ限
定されるものである。
例を考察することにより当業者にとって容易に推察でき
ることであり、本発明は添けの特許請求の範囲にのみ限
定されるものである。
第１図はバクロウィルス ＡｃＮ Ｐ Ｖの物理地図お
よび遺伝子構成を示す図である。 ゛第２図はＡｃＮ
ＰＶのＬ−１変異株の環状ＤＮ’Ａにおける制限エツト
ヌクレアーゼ認識部位を線状に表示した図である。 第３図はｐＥＸｓ９４２ プラスミドＤＮＡの物理地
図である。 第４図はｐＧＰ −Ｂ ６８７４ ／ Ｓａｌ プラ
スミドＤＮＡの物理地図である。 第５図はｐＧＰ−Ｂ６８７４ プラス＜ドＤＮＡの物
理地図である。 第６図はＡｃＮＰＶ ＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ のＰｓ
ｔ ＩおよびＢａｍＨＩパター７を示す写真である。 第７図は！・ランスグレイスメノｊ・ベクタートシて使
用されるｐｃＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ （７）作製図
を表わし、ここでトランスプレイスメ／トベクターの外
来パラセンジャーＤＮ、Ａはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを発現しかつラウス肉腫ウィル
スから得られてこの中に組み込まれた外来プロモーター
Ｒ８Ｖ−ＬＴＲの制御下にある。 （外５名） 狗ｆｌ坩ｍ Ａｃｌ＃ＩＰＶ−ＬＩ ＯＮ＾ＦＩＧ、２
％す“ツムｃｏＲＩ −）翻Ｒ ｐ Ｒ つ ４．８ 図面の浄書（内容に変更なし〕 Ｐｓｔｌ ＢａｍＨＩ 第６図 手続補正書（方式） 昭和乙Ｏ年隼ケ 願第 ／２２ρ２ 号３補正をする
者 事件との関係 出 願 人 住所 ４、代理人 五゛ん （７）１貼′：ｆに１船坏Ｐ／！ｒ−’；）５゜トイ
−Ｌ〜 ＝４只ρ
よび遺伝子構成を示す図である。 ゛第２図はＡｃＮ
ＰＶのＬ−１変異株の環状ＤＮ’Ａにおける制限エツト
ヌクレアーゼ認識部位を線状に表示した図である。 第３図はｐＥＸｓ９４２ プラスミドＤＮＡの物理地
図である。 第４図はｐＧＰ −Ｂ ６８７４ ／ Ｓａｌ プラ
スミドＤＮＡの物理地図である。 第５図はｐＧＰ−Ｂ６８７４ プラス＜ドＤＮＡの物
理地図である。 第６図はＡｃＮＰＶ ＬＩＧＰ−ｇａｌ ３ のＰｓ
ｔ ＩおよびＢａｍＨＩパター７を示す写真である。 第７図は！・ランスグレイスメノｊ・ベクタートシて使
用されるｐｃＰ−Ｂ６８７４／Ｓａｌ （７）作製図
を表わし、ここでトランスプレイスメ／トベクターの外
来パラセンジャーＤＮ、Ａはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを発現しかつラウス肉腫ウィル
スから得られてこの中に組み込まれた外来プロモーター
Ｒ８Ｖ−ＬＴＲの制御下にある。 （外５名） 狗ｆｌ坩ｍ Ａｃｌ＃ＩＰＶ−ＬＩ ＯＮ＾ＦＩＧ、２
％す“ツムｃｏＲＩ −）翻Ｒ ｐ Ｒ つ ４．８ 図面の浄書（内容に変更なし〕 Ｐｓｔｌ ＢａｍＨＩ 第６図 手続補正書（方式） 昭和乙Ｏ年隼ケ 願第 ／２２ρ２ 号３補正をする
者 事件との関係 出 願 人 住所 ４、代理人 五゛ん （７）１貼′：ｆに１船坏Ｐ／！ｒ−’；）５゜トイ
−Ｌ〜 ＝４只ρ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）昆虫細胞による遺伝子産物の産生に使用するベク
ターであって、遺伝子産物の発現をコードしかつ昆虫細
胞による遺伝子産物の発現を開始させるプロモーターの
制御下にある外来遺伝子セグメントを含むベクター。 （２）該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲第
１項記載のベクター。 （３）該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求の
範囲第２項記載のベクター。 （４）該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシス
ウイルスからなる特許請求の範囲第３項記載のベクター
。 （５）該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは￥アウ
トグラファ￥ ￥カリフォルニカ￥（￥Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ￥）ヌクレア−ポリヘド
ローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請求の
範囲第４項記載のベクター。 （６）該プロモーターはウイルスのプロモーターからな
る特許請求の範囲第１項記載のベクター。 （７）該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期に
活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させるプロモー
ターである、特許請求の範囲第６項記載のベクター。 （８）該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモー
ターからなる特許請求の範囲第７項記載のベクター。 （９）該ウイルスプロモーターは７．２Ｋプロモーター
からなる特許請求の範囲第７項記載のベクタ（１０）該
プロモーターはウイルス生長の初期に活性化されてウイ
ルス遺伝子産物を産生させるプロモーターである、特許
請求の範囲第１項記載のベクター。 （１１）該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターからなる特許請求の範囲第１項記載のベ
クター。 （１２）該外来セグメントは容易に検出できる遺伝子産
物の発現をコードする遺伝子セグメントからなる、特許
請求の範囲第１項記載のベクター。 （１３）容易に検出できる該遺伝子産物は抗生物質に対
して耐性を示すタンパク質または指示薬と反応して検出
可能な物理的変化をもたらすタンパク質からなる、特許
請求の範囲第１２項記載のベクター。 （１４）該ベクターはプラスミドｐＧＴＰ−Ｂ６８７４
からなる特許請求の範囲第１項記載のベクター。 （１５）該ベクターはプラスミドｐＧＰ−Ｂ６８７４／
ＳＡＬからなる特許請求の範囲第１項記載のベクター。 （１６）該ベクターはプラスミドｐＬＣ−１からなる特
許請求の範囲第１項記載のベクター。 （１７）外来遺伝子セグメントをＤＮＡセグメントに挿
入してベクターを形成させることからなる昆虫細胞内で
の使用に適する発現ベクターの調製方法であって、上記
の挿入が昆虫細胞による遺伝子産物の発現を開始させる
プロモーターにより制御されるＤＮＡセグメントの領域
内で行われることを特徴とする上記ベクターの調製方法
。 （１８）該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第１７項記載の方法。 （１９）該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第１８項記載の方法。 （２０）該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第１９項記載の方法
。 （２１）該ＤＮＡセグメントは昆虫細胞内で複製するウ
イルスから誘導されかつ遺伝子領域およびその遺伝子領
域によってコードされる遺伝子産物の発現を制御するプ
ロモーター領域を含み、その挿入が該ＤＮＡセグメント
を含むプラスミドを準備し、該ＤＮＡセグメントの遺伝
子領域に外来遺伝子セグメントを挿入して組み換えプラ
スミドベクターを形成させることにより行われる、特許
請求の範囲第１７項記載の方法。 （２２）該ウイルスベクターは、組み換えプラスミドベ
クターと昆虫細胞内で複製するウイルスとを接触させ、
外来遺伝子セグメントによってコードされる遺伝子産物
を発現する目的のウイルスを選択することにより形成さ
れる、特許請求の範囲第２１項記載の方法。 （２３）該ウイルスはバクロウイルスであり、該ＤＮＡ
セグメントはポリヘドリンプロモーターおよび少なくと
もポリヘドリン遺伝子の一部を含み、挿入がポリヘドリ
ン遺伝子領域内の部位でおこる、特許請求の範囲第２２
項記載の方法。 （２４）該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第２３項記載の方法
。 （２５）該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは￥ア
ウトグラファ￥ ￥カリフォルニカ￥ ヌクレア−ポリ
ヘドローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請
求の範囲第２４項記載の方法。 （２６）該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 （２７）該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させる、特許
請求の範囲第２６項記載の方法。 （２８）該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第２７項記載の方法。 （２９）該ウイルスプロモーターは７．２Ｋプロモータ
ーである特許請求の範囲第２７項記載の方法。 （３０）該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されるウイルスプロモーターである特許請求の範囲第１
８項記載の方法。 （３１）該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第１８項記載の方
法。 （３２）昆虫細胞内に、遺伝子産物の発現をコードしか
つ昆虫細胞内での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーターの制御下にある外来遺伝子セグメントを含むベク
ターを挿入し、該昆虫細胞を遺伝子産物の発現に好適な
条件下培養し、そして発現された遺伝子産物を回収する
ことからなる遺伝子産物の産生方法。 （３３）該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第３２項記載の方法。 （３４）該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第３３項記載の方法。 （３５）該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第３４項記載の方法
。 （３６）該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは￥ア
ウトグラファ￥ ￥カリフォルニカ￥ ヌクレア−ポリ
ヘドローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請
求の範囲第３５項記載の方法。 （３７）該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第３３項記載の方法。 （３８）該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させるプロモ
ーターである、特許請求の範囲第３７項記載の方法。 （３９）該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第３８項記載の方法。 （４１）該プロモーターは７．２Ｋプロモーターである
特許請求の範囲第３８項記載の方法。 （４１）該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されてウイルス遺伝子産物を産生させるウイルスプロモ
ーターである特許請求の範囲第３３項記載の方法。 （４２）該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第３３項記載の方
法。 （４３）特許請求の範囲第３３項記載の方法により産生
された遺伝子産物。 （４４）遺伝子産物の発現をコードしかつ昆虫細胞内で
の遺伝子産物の発現を開始させるプロモーターの制御下
にある外来遺伝子セグメントを含むベクターを挿入させ
た昆虫宿主細胞からなる遺伝子産物源。 （４５）該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第４４項記載の遺伝子産物源。 （４６）該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第４５項記載の遺伝子産物源。 （４７）該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第４６項記載の遺伝
子産物源。 （４８）該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは￥ア
ウトグラファ カリフォルニカ￥ ヌクレア−ポリヘド
ローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請求の
範囲第４７項記載の遺伝子産物源。 （４９）該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第４５項記載の遺伝子産物源。 （５０）該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルスポリペプチドを産生させるプロ
モーターである特許請求の範囲第４９項記載の遺伝子産
物源。 （５１）該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第５０項記載の遺伝子産物
源。 （５２）該ウイルスプロモーターは７．２Ｋプロモータ
ーである特許請求の範囲第５０項記載の遺伝子産物源。 （５３）該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されてウイルス遺伝子産物を産生させるウイルスプロモ
ーターである特許請求の範囲第４５項記載の遺伝子産物
源。 （５４）該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第４５項記載の遺
伝子産物源。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57545384A | 1984-01-31 | 1984-01-31 | |
| US575453 | 1984-01-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS615787A true JPS615787A (ja) | 1986-01-11 |
Family
ID=24300383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60017702A Pending JPS615787A (ja) | 1984-01-31 | 1985-01-31 | 昆虫細胞内でのポリペプチド類の産生 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0155476A1 (ja) |
| JP (1) | JPS615787A (ja) |
| KR (1) | KR850005499A (ja) |
| AU (1) | AU3824285A (ja) |
| DK (1) | DK518384A (ja) |
| ES (1) | ES8604308A1 (ja) |
| GR (1) | GR850265B (ja) |
| IL (1) | IL73942A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA848495B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH0221955A (ja) * | 1988-07-07 | 1990-01-24 | Nippon Steel Corp | 流体噴射ノズル |
| JPH03500602A (ja) * | 1987-07-24 | 1991-02-14 | カイロン コーポレーション | 昆虫細胞の増殖およびそれによる生産物の発現のための無血清培地 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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