JPS615787A - 昆虫細胞内でのポリペプチド類の産生 - Google Patents
昆虫細胞内でのポリペプチド類の産生Info
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- JPS615787A JPS615787A JP60017702A JP1770285A JPS615787A JP S615787 A JPS615787 A JP S615787A JP 60017702 A JP60017702 A JP 60017702A JP 1770285 A JP1770285 A JP 1770285A JP S615787 A JPS615787 A JP S615787A
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は外来遺伝子を昆虫の細胞内で発現させるための
方法ならびにその産物に関し、より詳細には目的の遺伝
子産物をコードする外来遺伝子を昆虫ウィルスのウィル
ス染色体(これは染色体に組み込まれた強力な遺伝子プ
ロモーターの制御下にある)の中に挿入し、そのウィル
スベクターを昆虫細胞内に導入し、そして目的の遺伝子
産物を発現させることに関する。
方法ならびにその産物に関し、より詳細には目的の遺伝
子産物をコードする外来遺伝子を昆虫ウィルスのウィル
ス染色体(これは染色体に組み込まれた強力な遺伝子プ
ロモーターの制御下にある)の中に挿入し、そのウィル
スベクターを昆虫細胞内に導入し、そして目的の遺伝子
産物を発現させることに関する。
微生物系殺虫剤への関心は化学薬剤系殺虫剤の使用に関
係した問題の結果として生じてきた。化学薬剤系殺虫剤
は一般に害虫だけでなく益虫にも作用し、また昆虫はこ
の種の化学薬剤に対して耐性を獲得ずろ傾向があるので
化学薬剤系殺虫剤に耐性を示す新しい昆虫集団が急速に
発生ずる。さらに、残留化学薬剤は環境汚染をもたらし
、また健康上の問題をも引き起こすかもしれない。それ
故、昆虫に対して病原性を示す微生物(昆虫病原体)は
別の害虫駆除方法のための機会を提供し、統合された害
虫管理において1つの役割を演じかつ化学薬剤系殺虫剤
への依存性を減することができる。
係した問題の結果として生じてきた。化学薬剤系殺虫剤
は一般に害虫だけでなく益虫にも作用し、また昆虫はこ
の種の化学薬剤に対して耐性を獲得ずろ傾向があるので
化学薬剤系殺虫剤に耐性を示す新しい昆虫集団が急速に
発生ずる。さらに、残留化学薬剤は環境汚染をもたらし
、また健康上の問題をも引き起こすかもしれない。それ
故、昆虫に対して病原性を示す微生物(昆虫病原体)は
別の害虫駆除方法のための機会を提供し、統合された害
虫管理において1つの役割を演じかつ化学薬剤系殺虫剤
への依存性を減することができる。
自然界に存在する微生物または微生物の副産物が有用な
殺虫剤であり得ると認められてきた。多くの昆虫病原体
は比較的狭い宿主範囲を有しており、このことは特定の
害虫集団の減少を可能にするが、自然界の食肉動物や益
虫は保護されまた回復への機会が与えられる。昆虫駆除
に適する昆虫病原体にはある種の細菌、ウィルスおよび
真菌が含まれる。
殺虫剤であり得ると認められてきた。多くの昆虫病原体
は比較的狭い宿主範囲を有しており、このことは特定の
害虫集団の減少を可能にするが、自然界の食肉動物や益
虫は保護されまた回復への機会が与えられる。昆虫駆除
に適する昆虫病原体にはある種の細菌、ウィルスおよび
真菌が含まれる。
昆虫集団内で自然流行性の病気を引き起こすウィルス類
は殺虫剤として商業的に開発されてきた。
は殺虫剤として商業的に開発されてきた。
広く研究された1つのこのようなウィルス属は、二一り
ロヴイリグエ(Baculovirj、d−ae’)て
ある。バクロウィルス類は膜で包まれた約10〜17I
Oナノメートル(径)X250〜/100ナノメートル
(長さ)の桿状カブンドに包み込まれた大きい(約10
0〜200キロ塩基)、二本鎖の、共有結合で閉環した
環状DNAゲノムを有してし・る。
ロヴイリグエ(Baculovirj、d−ae’)て
ある。バクロウィルス類は膜で包まれた約10〜17I
Oナノメートル(径)X250〜/100ナノメートル
(長さ)の桿状カブンドに包み込まれた大きい(約10
0〜200キロ塩基)、二本鎖の、共有結合で閉環した
環状DNAゲノムを有してし・る。
゛バクロウィルス°°という名称はこの属に特徴的な桿
状ヌクレオカブ/トゝ構造に由来している。ヌクレオカ
ブ/、ドはウィルス構造の1単位であり、カノンド(タ
ン・ξり弥包膜)の中に核酸を包み込んだものから成っ
ている。
状ヌクレオカブ/トゝ構造に由来している。ヌクレオカ
ブ/、ドはウィルス構造の1単位であり、カノンド(タ
ン・ξり弥包膜)の中に核酸を包み込んだものから成っ
ている。
バクロウィルスはヌクレアーポリヘトゝローノスウイル
ス(NPV)およびグラニュローシスウイルス(GV)
のサブグループを包含する。NPVおよびGVのウィル
ス粒子はタンパク質性結晶の中に内蔵されている。バク
ロウィルスの内蔵体においてはそのヴイリオン(膜で包
まれたヌクレオカブ7ド)が結晶タンパク質のマトリッ
クス内に埋封されている。この構造(多面形封入体とも
呼ばれる)は自然界にお(・て細胞外に見い出される形
体であって、生物にそのウィルス感染を広がらせる原因
となっている。サブグループNPVは1個の大きな(1
5マイクロメートル以下)多面形結晶の中に用j封され
た多数のヴイリオンを含むが、サブグループGVは小さ
な結晶中に埋封された1個のヴイリオンを訝む。両刀の
形体ともその結晶タンパク質のマトリックスは元来25
000〜33000グルトンの単一のポリSブチトゝが
ら構成されている。
ス(NPV)およびグラニュローシスウイルス(GV)
のサブグループを包含する。NPVおよびGVのウィル
ス粒子はタンパク質性結晶の中に内蔵されている。バク
ロウィルスの内蔵体においてはそのヴイリオン(膜で包
まれたヌクレオカブ7ド)が結晶タンパク質のマトリッ
クス内に埋封されている。この構造(多面形封入体とも
呼ばれる)は自然界にお(・て細胞外に見い出される形
体であって、生物にそのウィルス感染を広がらせる原因
となっている。サブグループNPVは1個の大きな(1
5マイクロメートル以下)多面形結晶の中に用j封され
た多数のヴイリオンを含むが、サブグループGVは小さ
な結晶中に埋封された1個のヴイリオンを訝む。両刀の
形体ともその結晶タンパク質のマトリックスは元来25
000〜33000グルトンの単一のポリSブチトゝが
ら構成されている。
バクロウィルスのサブグループNPVおよびGVは昆虫
病原体としての用途にっ℃・て研究された。バクロヴイ
リダエ属からのウィルスを使用する利点は(1)それら
が無を椎動物にだけ致死感染をおこさせる;(2)それ
らが比較的狭い宿主範囲を有する;(3)それらが−匹
の昆虫あたり十分なウィルス子孫を生産して商業的生産
を可能にする;および(41tjP■およびGVのウィ
ルス粒子が、環境内でそのウィルスをより安定化させ、
商業的に製造される微生物系釡虫剤としての貯蔵寿命を
増加させ、他の殺虫剤配合物との組合せを容易にするタ
ンパク質性R1晶の中に内蔵されている;などである。
病原体としての用途にっ℃・て研究された。バクロヴイ
リダエ属からのウィルスを使用する利点は(1)それら
が無を椎動物にだけ致死感染をおこさせる;(2)それ
らが比較的狭い宿主範囲を有する;(3)それらが−匹
の昆虫あたり十分なウィルス子孫を生産して商業的生産
を可能にする;および(41tjP■およびGVのウィ
ルス粒子が、環境内でそのウィルスをより安定化させ、
商業的に製造される微生物系釡虫剤としての貯蔵寿命を
増加させ、他の殺虫剤配合物との組合せを容易にするタ
ンパク質性R1晶の中に内蔵されている;などである。
殺虫剤として使用する場合、内蔵ウィルスは通常葉に散
布される。汚染された葉を食べた昆虫はウィルスにより
誘発される病気にががる。摂取されたウィルスは昆虫の
前隅を通って中腸へ行き、ここでアルカリ性pHにより
タンパク質結晶が可溶化される。ヴイリオンはマトリッ
クスから放出されて微小絨毛膜との融合により中腸の柱
状細胞に感染し始める。昆虫が死亡してその外皮が分解
されると内蔵ウィルスはその周囲に放出され、それが感
受性宿主に取り込まれるとその感染を広める。
布される。汚染された葉を食べた昆虫はウィルスにより
誘発される病気にががる。摂取されたウィルスは昆虫の
前隅を通って中腸へ行き、ここでアルカリ性pHにより
タンパク質結晶が可溶化される。ヴイリオンはマトリッ
クスから放出されて微小絨毛膜との融合により中腸の柱
状細胞に感染し始める。昆虫が死亡してその外皮が分解
されると内蔵ウィルスはその周囲に放出され、それが感
受性宿主に取り込まれるとその感染を広める。
最も広く研究されたバクロウィルスは比較的広ヘトゝロ
ーンスウイルス(AcNPV)である。この型のウィル
スは非内蔵ウィルス体(non−occludedvi
rus、 N0V)および内蔵ウィルス体(occlu
dedvirus、 OV)または多面形封入体(po
lyhedra、11nclusion body+
PIB)と呼ばれる2つの成熟′ 形体に複製される。
ーンスウイルス(AcNPV)である。この型のウィル
スは非内蔵ウィルス体(non−occludedvi
rus、 N0V)および内蔵ウィルス体(occlu
dedvirus、 OV)または多面形封入体(po
lyhedra、11nclusion body+
PIB)と呼ばれる2つの成熟′ 形体に複製される。
NOV体および01体の両方ともそのヌクレオカプシド
は膜で包まれているが、これらの表面膜の正確な性状は
異なっている。NOVのヌクレオカブノビは細胞膜、一
般には原形p膜を通って成長し始めることにより表面膜
を獲得するが、○Vのヌクレオカプシドは核内で表面膜
を獲得する。
は膜で包まれているが、これらの表面膜の正確な性状は
異なっている。NOVのヌクレオカブノビは細胞膜、一
般には原形p膜を通って成長し始めることにより表面膜
を獲得するが、○Vのヌクレオカプシドは核内で表面膜
を獲得する。
AcNPVのヌクレオカプシドゝは、膜による包囲が核
内で生じる場合に、通常1つの膜内に封入される。細胞
核内の膜で包まれたヌクレオカプシドは結晶タンパク質
のマトリックス中に埋封され得る。
内で生じる場合に、通常1つの膜内に封入される。細胞
核内の膜で包まれたヌクレオカプシドは結晶タンパク質
のマトリックス中に埋封され得る。
こうして生成したタンパク質結晶は多数の膜で包まれた
ヌクレオカプシドを富み、内蔵体、多面形封入体(PI
B)または多面体として知られている。
ヌクレオカプシドを富み、内蔵体、多面形封入体(PI
B)または多面体として知られている。
AcNPVの内蔵体は直径が約1〜4マイクロメートル
であって光学顕微鏡で見ることができる。各ヴイリオン
は1つの膜で包まれた1個またはそれ以上のヌクレオカ
プシドから成っている。1つの膜につ六1個以上のヌク
レオカブノビが存在し得るその形態学的特徴は多重埋封
ウィルスとして知られるNPVの1つの型に特有であっ
て、1個のヌクレオカブノビが個々に膜で包まれている
NPVとは区別される。遺伝子繰作の見地からすると、
1つの膜につき多数のヌクレオカブノビの存在はNPV
の内蔵体にのみ特有であって非内蔵体には見られないと
いうことが重要であり、それ故非内蔵体を使用してよ゛
り簡単にこのウィルスをクローン化しかつ遺伝子操作す
ることが可能である。
であって光学顕微鏡で見ることができる。各ヴイリオン
は1つの膜で包まれた1個またはそれ以上のヌクレオカ
プシドから成っている。1つの膜につ六1個以上のヌク
レオカブノビが存在し得るその形態学的特徴は多重埋封
ウィルスとして知られるNPVの1つの型に特有であっ
て、1個のヌクレオカブノビが個々に膜で包まれている
NPVとは区別される。遺伝子繰作の見地からすると、
1つの膜につき多数のヌクレオカブノビの存在はNPV
の内蔵体にのみ特有であって非内蔵体には見られないと
いうことが重要であり、それ故非内蔵体を使用してよ゛
り簡単にこのウィルスをクローン化しかつ遺伝子操作す
ることが可能である。
AcNPVのDNAゲノム(128キロ塩基)は種々の
制限エンドゝヌクレアーゼのための制限部位に関して地
図が作成されており、このDNAゲノムは主に独特のヌ
クレオチド配列で構成されている。L、 K、 Mil
lcrらによる5cience、第219巻、715〜
721パージ(1983年2月11日)を参照されたい
。
制限エンドゝヌクレアーゼのための制限部位に関して地
図が作成されており、このDNAゲノムは主に独特のヌ
クレオチド配列で構成されている。L、 K、 Mil
lcrらによる5cience、第219巻、715〜
721パージ(1983年2月11日)を参照されたい
。
AcNPVのOv体はヴイリオンがアルカリ破壊によっ
て内蔵体から放出されない限り細胞培養において伝染性
でない。それ故、細胞培養で作られた01体は細胞培養
中で非伝染性である。むしろ、NOV体が細胞から細胞
へと伝染を広がらせる原因となっている。この伝染がさ
らに広がると、ウィルスは中腸細胞内で複製され、そし
て水底膜を通って昆虫の血リンパの中で生長し始めるN
OV体を生産する。血リンパの中へ放出される弁内蔵ヴ
イリオンは細胞培養にお℃・てその感染を広がらせるば
かりでなく、昆虫の全身感染の原因となる。
て内蔵体から放出されない限り細胞培養において伝染性
でない。それ故、細胞培養で作られた01体は細胞培養
中で非伝染性である。むしろ、NOV体が細胞から細胞
へと伝染を広がらせる原因となっている。この伝染がさ
らに広がると、ウィルスは中腸細胞内で複製され、そし
て水底膜を通って昆虫の血リンパの中で生長し始めるN
OV体を生産する。血リンパの中へ放出される弁内蔵ヴ
イリオンは細胞培養にお℃・てその感染を広がらせるば
かりでなく、昆虫の全身感染の原因となる。
AcNPVを感染させた細胞内でのウィルス誘導タンパ
ク質の合成は一時的に制御された方法である。ウィルス
誘導タンパク質の合成には次の4つの段階:(1)感染
の約2〜3時間後の初期アルファ相;(2)機能性タン
パク質およびDNAの合成を必要とする中期ベータ相(
感染の6〜7時間後);(3)ヴイリオンの構造タン・
ξり質の合成を含むガンマ相(10時間後);および(
41内蔵に関係する後期デルタ相(15時間後);があ
る。
ク質の合成は一時的に制御された方法である。ウィルス
誘導タンパク質の合成には次の4つの段階:(1)感染
の約2〜3時間後の初期アルファ相;(2)機能性タン
パク質およびDNAの合成を必要とする中期ベータ相(
感染の6〜7時間後);(3)ヴイリオンの構造タン・
ξり質の合成を含むガンマ相(10時間後);および(
41内蔵に関係する後期デルタ相(15時間後);があ
る。
A c NPVの伝染性弁内蔵ヴイリオンは感染の約1
0時間後に培地中に見い出される。内蔵用マトリックス
の主タンパク質であるポリヘトゝリン(polyhed
rin)の合成は感染の12時間後に検出され、これは
感染の16〜18時間後の内蔵ウィルスの出現に先行す
る。
0時間後に培地中に見い出される。内蔵用マトリックス
の主タンパク質であるポリヘトゝリン(polyhed
rin)の合成は感染の12時間後に検出され、これは
感染の16〜18時間後の内蔵ウィルスの出現に先行す
る。
AcNPVのタンパク質合成の一時的制御は恐らく転写
の一時的制御が原因している。ホリヘドリン遺伝子の転
写は感染の12時間後に初めて観察され、そして1.2
キロ塩基の転写物が感染後24時間またはそれ以上まで
に次第にその数を増していく。細胞培養においては通常
NOV放出が内蔵に先行する。自然界のAcNPVの場
合に、その感 、染はかなり広がるので死亡した感染宿
主生物の10重量%程度が内蔵ウィルスで占められるか
もしれない。10重量%という関係はウィルスの内蔵体
が確かに多量に生産されたことを示しており、かつこれ
と関連してポリヘトす/タフバク質も多量に生産された
ことを示している。
の一時的制御が原因している。ホリヘドリン遺伝子の転
写は感染の12時間後に初めて観察され、そして1.2
キロ塩基の転写物が感染後24時間またはそれ以上まで
に次第にその数を増していく。細胞培養においては通常
NOV放出が内蔵に先行する。自然界のAcNPVの場
合に、その感 、染はかなり広がるので死亡した感染宿
主生物の10重量%程度が内蔵ウィルスで占められるか
もしれない。10重量%という関係はウィルスの内蔵体
が確かに多量に生産されたことを示しており、かつこれ
と関連してポリヘトす/タフバク質も多量に生産された
ことを示している。
遺伝子操作の見地からすると、内蔵を制御する遺伝子は
細胞培養での感染にとって必要でなく、これらの遺伝子
の排除または置換は内蔵を制御する領域へパラセンジャ
ーD N4 (passenger DNA)を置換さ
せる機会を提供し、これは感染サイクルの後期にパラセ
ンジャー遺伝子を高水準で発現させるだろう。AcNP
V の内蔵体のマトリックスを構成する結晶性ポリヘト
す/タノ・ξり質は元来約30000ダルト/の単一タ
ンパク廼である。内蔵体の約95重量%はポリヘドリノ
から成って℃・る。それ故、感染宿主の体重中のウィル
スの比率が高いことで明らかなようにポリヘトす/は極
めて多量合成される。さらに、この単一タンパク廼の合
成レベルは、1個の細胞につき平均して60個以上の内
蔵I*(各内蔵体は直径が約4マイクロメートルである
)を生産するAcNPV の野性株を感染させた細胞に
より高められる。こうして、ポリヘトゞ’) /mRN
A合成のためのプロモーターは格別強力であると考えら
れる。
細胞培養での感染にとって必要でなく、これらの遺伝子
の排除または置換は内蔵を制御する領域へパラセンジャ
ーD N4 (passenger DNA)を置換さ
せる機会を提供し、これは感染サイクルの後期にパラセ
ンジャー遺伝子を高水準で発現させるだろう。AcNP
V の内蔵体のマトリックスを構成する結晶性ポリヘト
す/タノ・ξり質は元来約30000ダルト/の単一タ
ンパク廼である。内蔵体の約95重量%はポリヘドリノ
から成って℃・る。それ故、感染宿主の体重中のウィル
スの比率が高いことで明らかなようにポリヘトす/は極
めて多量合成される。さらに、この単一タンパク廼の合
成レベルは、1個の細胞につき平均して60個以上の内
蔵I*(各内蔵体は直径が約4マイクロメートルである
)を生産するAcNPV の野性株を感染させた細胞に
より高められる。こうして、ポリヘトゞ’) /mRN
A合成のためのプロモーターは格別強力であると考えら
れる。
A、カリフォルニア ヌクレアーポリヘトゝローンスウ
イルスは無を椎動物での組み換えDNA研究および遺伝
子操作のためのベクターとして提案された。L、 K9
MillerのJ、 Virol 、+ 393973
を参照された(・。この開示は参照によりここに引用さ
れる。しがしながら、本発明の完成まで、このウィルス
または他の昆虫ウィルスのいずれもベクターとして使用
することはできなかった。
イルスは無を椎動物での組み換えDNA研究および遺伝
子操作のためのベクターとして提案された。L、 K9
MillerのJ、 Virol 、+ 393973
を参照された(・。この開示は参照によりここに引用さ
れる。しがしながら、本発明の完成まで、このウィルス
または他の昆虫ウィルスのいずれもベクターとして使用
することはできなかった。
従って、本発明の目的は昆虫細胞内で外来物ア1を発現
させるのに役立つベクターを提供することである。
させるのに役立つベクターを提供することである。
発明の概要
本発明によれば、組み換えDNA技術を用いて昆虫細胞
により外来遺伝子産物を発現させるのに初めて発現ベク
ターが使用される。本明細物で用(・る“遺伝子産物°
゛という用語は遺伝子の発現の最終産物を意味し、そし
て自然界における役割が構造的または酵素的でありうる
RNA、ならびに自然界における役割が構造的または酵
素的でありうるmRNAの翻訳産物(すなわちグリコジ
ル化されたまたはグリコジル化されて(・ないポリペプ
チド)を含む。この定義はさらに遺伝子発現の際に調節
的役割を演するRNAおよび+OIJ oブチドを含
むものである。本発明は、有効なプロモーター(好まし
くは昆虫細胞での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーター)の制御下にある外来遺伝子産物を発現させるた
めに、例えばプラスミドまたはウィルスベクターなどの
発現ベクター(好ましくは昆虫ウィルスまたは昆虫病原
体ウィルスの発現ベクター)を用いる新規方法を提供す
る。さらに好適な実悔態様において詳しく述べると、本
発明はポリヘドリン遺伝子を取り囲むNPV(例えばA
c NPV )の領域をクロフン化し、ポリヘビリフ
遺伝子領域を陰むプラスミドを得、プラスミドの形のま
までポリヘドリン遺伝子へ適当な・ぐクセ/ジャー遺伝
子を挿入するかまたはポリヘトす/遺伝子の少なくとも
1部分を適当な・ξクセ/ジャーDNAで置換し、こう
して得られたパンセノジャーブラスミト″DNAを野性
株Acl団pv のDNAと共に適当な宿主細胞へ導
入して同時トラ/スフエクトシ、この形質転換宿主を使
用し′て外来遺伝子産物を産生ずることから成る。適切
に形質転換された宿主細胞は1例えばパラ七/ジャーD
NAを用(・ての、f IJヘトす/遺伝:、−の対立
的置換(allelic replacement)が
内蔵体形成を欠くウィルスをもたらした表現型のウィル
スを選択することにより同定することができる。
により外来遺伝子産物を発現させるのに初めて発現ベク
ターが使用される。本明細物で用(・る“遺伝子産物°
゛という用語は遺伝子の発現の最終産物を意味し、そし
て自然界における役割が構造的または酵素的でありうる
RNA、ならびに自然界における役割が構造的または酵
素的でありうるmRNAの翻訳産物(すなわちグリコジ
ル化されたまたはグリコジル化されて(・ないポリペプ
チド)を含む。この定義はさらに遺伝子発現の際に調節
的役割を演するRNAおよび+OIJ oブチドを含
むものである。本発明は、有効なプロモーター(好まし
くは昆虫細胞での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーター)の制御下にある外来遺伝子産物を発現させるた
めに、例えばプラスミドまたはウィルスベクターなどの
発現ベクター(好ましくは昆虫ウィルスまたは昆虫病原
体ウィルスの発現ベクター)を用いる新規方法を提供す
る。さらに好適な実悔態様において詳しく述べると、本
発明はポリヘドリン遺伝子を取り囲むNPV(例えばA
c NPV )の領域をクロフン化し、ポリヘビリフ
遺伝子領域を陰むプラスミドを得、プラスミドの形のま
までポリヘドリン遺伝子へ適当な・ぐクセ/ジャー遺伝
子を挿入するかまたはポリヘトす/遺伝子の少なくとも
1部分を適当な・ξクセ/ジャーDNAで置換し、こう
して得られたパンセノジャーブラスミト″DNAを野性
株Acl団pv のDNAと共に適当な宿主細胞へ導
入して同時トラ/スフエクトシ、この形質転換宿主を使
用し′て外来遺伝子産物を産生ずることから成る。適切
に形質転換された宿主細胞は1例えばパラ七/ジャーD
NAを用(・ての、f IJヘトす/遺伝:、−の対立
的置換(allelic replacement)が
内蔵体形成を欠くウィルスをもたらした表現型のウィル
スを選択することにより同定することができる。
本発明に関連して用いられる他のプロモーターは単に7
.2Kプロティ/゛と呼ばれる7200ゲルト/のタノ
ノξり賀のA、カリフォルニアによる合成を制餌1する
プロモーターである。Ada、ngおよびMiller
のJ、Virol、旦、782−793(1982)
を参照されたい。ポリヘトす/タンノミりeと同様に
、このり/−ξり質はウィルス抄製の内蔵相期間中に感
染後遅く発現される。このり/ノでり負の内蔵での正確
な機能はまだ知られていな℃・が、このタフバク賀を産
生ずる遺伝子はその位置が定められて確認されているの
で利用可能である。第1図を参照されたい。本明細書で
用いる”7.2Kプロモーター゛という用語は7.2K
プロティン゛の発現に関係する遺伝子を制御するプロモ
ーターを意味する。AcNPV または他のところか
らの別のプロモーターも昆虫に外来遺伝子産物を発現さ
せる際に使用することができ、ノぐクロヴイリダエから
の他のプロモーター、ならびに他のウィルス、細菌、酵
母、他の真菌、昆虫および哺乳動物のプロモーターでさ
えも包含される。昆虫細胞内で機能的であるこれらのプ
ロモーターは、例えば対象の昆虫細胞に導入されてβ−
ガラクト/グーセ゛の産生が監視された以下に述べるA
cNPVプロモーターpMcs 74 と置き換える
ことにより同定し得る。
.2Kプロティ/゛と呼ばれる7200ゲルト/のタノ
ノξり賀のA、カリフォルニアによる合成を制餌1する
プロモーターである。Ada、ngおよびMiller
のJ、Virol、旦、782−793(1982)
を参照されたい。ポリヘトす/タンノミりeと同様に
、このり/−ξり質はウィルス抄製の内蔵相期間中に感
染後遅く発現される。このり/ノでり負の内蔵での正確
な機能はまだ知られていな℃・が、このタフバク賀を産
生ずる遺伝子はその位置が定められて確認されているの
で利用可能である。第1図を参照されたい。本明細書で
用いる”7.2Kプロモーター゛という用語は7.2K
プロティン゛の発現に関係する遺伝子を制御するプロモ
ーターを意味する。AcNPV または他のところか
らの別のプロモーターも昆虫に外来遺伝子産物を発現さ
せる際に使用することができ、ノぐクロヴイリダエから
の他のプロモーター、ならびに他のウィルス、細菌、酵
母、他の真菌、昆虫および哺乳動物のプロモーターでさ
えも包含される。昆虫細胞内で機能的であるこれらのプ
ロモーターは、例えば対象の昆虫細胞に導入されてβ−
ガラクト/グーセ゛の産生が監視された以下に述べるA
cNPVプロモーターpMcs 74 と置き換える
ことにより同定し得る。
こうして、真核生物環境内で真核細胞、原核細胞または
ウィルスのメツセンジャーDNAの大キなセグメントを
増殖かつ発現させるために使用できる価値ある宿主/ベ
クター系が提供される。それ故、本発明は外来メツセン
ジャーDNA (遺伝子産物が細胞死を引き起こすもの
を含む)が無を椎動物環境内で高水準で増殖かつ発現さ
れるのを可能にする。
ウィルスのメツセンジャーDNAの大キなセグメントを
増殖かつ発現させるために使用できる価値ある宿主/ベ
クター系が提供される。それ故、本発明は外来メツセン
ジャーDNA (遺伝子産物が細胞死を引き起こすもの
を含む)が無を椎動物環境内で高水準で増殖かつ発現さ
れるのを可能にする。
イルス(AcNPV)を発現ベクターとして使用する方
法が開発され、ここにおいて、f IJヘトリン遺伝子
を包囲するAcNPV DNAのセグメントがプレスミ
1−゛ベクターを用いて太陽菌内でクロー/化される。
法が開発され、ここにおいて、f IJヘトリン遺伝子
を包囲するAcNPV DNAのセグメントがプレスミ
1−゛ベクターを用いて太陽菌内でクロー/化される。
先に述べたように、 AcNPVは広く研究されてきた
。A c NPVのす/プルはコネチカット州ニューヘ
プノのthe Yale Arbovirus Re5
earchUnit(YARU)を含む多数の入手源か
ら得ることができる。制限酵素は組み換えプラスミドD
NA土のl IJヘドリノ遺伝子を切り開いてメツセン
ジャーDNAの挿入部位をつくるために用いられる。
。A c NPVのす/プルはコネチカット州ニューヘ
プノのthe Yale Arbovirus Re5
earchUnit(YARU)を含む多数の入手源か
ら得ることができる。制限酵素は組み換えプラスミドD
NA土のl IJヘドリノ遺伝子を切り開いてメツセン
ジャーDNAの挿入部位をつくるために用いられる。
メツセンジャーDNAは選択されて、クローノ化プラス
ミドの制限酵素で開かれた部位へ挿入される。次いでプ
ラスミド8は野性型AcNPVのEINAと共に適当な
宿主細胞内へ導入しく例えばトラ7スフェクト)される
。その後、遺伝子変換または二重組み換え現象によって
、組み換えプラスミドからのDN’Aは全長野性型Ac
NPV染色体上のその対立遺伝子、すなわちポリヘドリ
ノ遺伝子と置き換わる。それ故、ウィルス内でRNA合
成がおこる場合、挿入されたノミラセンジャーDNAか
ら読み取うれたメツセンジャーFINAはその指示のも
とに新しい遺伝子産物を発現させるのに役立つ。
ミドの制限酵素で開かれた部位へ挿入される。次いでプ
ラスミド8は野性型AcNPVのEINAと共に適当な
宿主細胞内へ導入しく例えばトラ7スフェクト)される
。その後、遺伝子変換または二重組み換え現象によって
、組み換えプラスミドからのDN’Aは全長野性型Ac
NPV染色体上のその対立遺伝子、すなわちポリヘドリ
ノ遺伝子と置き換わる。それ故、ウィルス内でRNA合
成がおこる場合、挿入されたノミラセンジャーDNAか
ら読み取うれたメツセンジャーFINAはその指示のも
とに新しい遺伝子産物を発現させるのに役立つ。
メツセンジャーDNAを含む特定のライ”ルスは適切な
技術のいずれかで選択することができる。選択されたウ
ィルスはその後このノミラセンジャーDNAの能力を利
用して目的の遺伝子産物を合成させるべく増殖される。
技術のいずれかで選択することができる。選択されたウ
ィルスはその後このノミラセンジャーDNAの能力を利
用して目的の遺伝子産物を合成させるべく増殖される。
第1図はバクロウィルスAcNPVの物理地図(phy
sical map)および遺伝子構成を表わす。
sical map)および遺伝子構成を表わす。
128キロ塩基の二本鎖環状DNAゲノムの制限工7ド
ヌクレアーゼ部位の物理地図は内側の8つの同心円で表
わされる。外側の同心円はAcNPV 。
ヌクレアーゼ部位の物理地図は内側の8つの同心円で表
わされる。外側の同心円はAcNPV 。
の遺伝子構成についての情報を表わす。点描区域は温度
感受性突然変異遺伝子のし・くつがの位置に関し、そし
て斜線区域はAcNPVの種々の構造り/バク質および
非構造タンパク質をコードする領域に関し、そのタフバ
ク質の大きさはキロゲルト/の数字で示されている。約
33000ダルト/のポリヘトす/夕/・ξり質の遺伝
子は外側の円め0〜約10%の位置に存在し、同様に遅
〜・段階で発現される約7200ダルト/のタフバク負
(“72°゛)の遺伝子は外側の円の約85〜9゜%の
位置に存在することに注目されたい。
感受性突然変異遺伝子のし・くつがの位置に関し、そし
て斜線区域はAcNPVの種々の構造り/バク質および
非構造タンパク質をコードする領域に関し、そのタフバ
ク質の大きさはキロゲルト/の数字で示されている。約
33000ダルト/のポリヘトす/夕/・ξり質の遺伝
子は外側の円め0〜約10%の位置に存在し、同様に遅
〜・段階で発現される約7200ダルト/のタフバク負
(“72°゛)の遺伝子は外側の円の約85〜9゜%の
位置に存在することに注目されたい。
第2図はAcNPVのL−1変異株における制限エツト
ヌクレアーゼ゛認識部位を線状に表示したものである。
ヌクレアーゼ゛認識部位を線状に表示したものである。
L−1変異株はHlnd m −B内に別のBind
m部位を有し、2つの断片はB1およびB2と呼ばれて
合計ゲノムの大きさは約128キロ塩基である。
m部位を有し、2つの断片はB1およびB2と呼ばれて
合計ゲノムの大きさは約128キロ塩基である。
第3図はAcNPV L −I DNAの00〜8.7
領域を含むpEXs 942ブラスミビDNAの物理地
図を表わし、EcoRI−I 、 Rおよび0断片を含
む。
領域を含むpEXs 942ブラスミビDNAの物理地
図を表わし、EcoRI−I 、 Rおよび0断片を含
む。
ベクターセグメントハpBR325(7)ECORIお
よび5alIでの消化により゛誘導される。
よび5alIでの消化により゛誘導される。
第4図は全長が12.3キロ塩基であってカナマイシン
耐性のための遺伝子を含むpGP−B 6874/ S
alプラスミ)DNAの物理地図である。
耐性のための遺伝子を含むpGP−B 6874/ S
alプラスミ)DNAの物理地図である。
第5図は全長が252キロ塩基であってタフバク質β−
ガラクトシり−ゼをコードする大腸菌からの遺伝子を含
むp(、P−B6874プラスミドDNAの物理地図で
ある。
ガラクトシり−ゼをコードする大腸菌からの遺伝子を含
むp(、P−B6874プラスミドDNAの物理地図で
ある。
本発明の1つの観点からすると、無を推動物の真核細胞
環境内で外来DNAを増殖かつ発現させるためのベクタ
ーとしてバクロウィルスを使用すルコとができるとわか
った。バクロウィルス’tAハそれ“らが次のような特
徴:(1)共有結合で閉環した環状の植接製DNAゲノ
ム;(2)別の20キロ塩基またはそれ以上のDNAセ
グメ/トを受は入れるべく大きく広がることのできる桿
状カブ/’ト’ ; (3)内蔵の際には組み入れられ
るが、伝染性ウィルスの産生には、必須のものでなく、
従って欠失されてもよい一群の遺伝子;および(4)伝
染性ウィルス産生後に作働し、感染細胞の10%以上の
タフバク質を構成する内蔵体に包含されるタフバク質(
例えばポリヘトす/および7.2 Kプロティン)の合
成を制御する1つまたはそれ以上の強力なプロモーター
;を有するので組み換えDNAベクター系として非常に
都合がよい。AcNPVはパラセンジャーD N A含
有ブラスミドイクターを使用して内蔵タンパク質合成を
コードするウィルスDNAゲノムを置換させることによ
り本発明方法において用いられる。こうして、パラセン
ジャーDNAがひとたびウィルスD N Aに糸目み入
れられるとそれはポリヘトす/および/または7.2
Kプロティンの強力なプロモーターという利点を有し、
それがひとたび作働し始めるとパラセンジャーD N
Aにコードされる遺伝子産物を望ましい量で発現させる
だろう。これとは別に、パラセンジャーDNAはそれ自
体のまたは以下に述べるごとき他の外来プロモーターの
制御下にあってもよいということが見出された。最後に
、パッセ、ノジャーDNAを発現したウィルスは容易に
選択されて増殖されうる。
環境内で外来DNAを増殖かつ発現させるためのベクタ
ーとしてバクロウィルスを使用すルコとができるとわか
った。バクロウィルス’tAハそれ“らが次のような特
徴:(1)共有結合で閉環した環状の植接製DNAゲノ
ム;(2)別の20キロ塩基またはそれ以上のDNAセ
グメ/トを受は入れるべく大きく広がることのできる桿
状カブ/’ト’ ; (3)内蔵の際には組み入れられ
るが、伝染性ウィルスの産生には、必須のものでなく、
従って欠失されてもよい一群の遺伝子;および(4)伝
染性ウィルス産生後に作働し、感染細胞の10%以上の
タフバク質を構成する内蔵体に包含されるタフバク質(
例えばポリヘトす/および7.2 Kプロティン)の合
成を制御する1つまたはそれ以上の強力なプロモーター
;を有するので組み換えDNAベクター系として非常に
都合がよい。AcNPVはパラセンジャーD N A含
有ブラスミドイクターを使用して内蔵タンパク質合成を
コードするウィルスDNAゲノムを置換させることによ
り本発明方法において用いられる。こうして、パラセン
ジャーDNAがひとたびウィルスD N Aに糸目み入
れられるとそれはポリヘトす/および/または7.2
Kプロティンの強力なプロモーターという利点を有し、
それがひとたび作働し始めるとパラセンジャーD N
Aにコードされる遺伝子産物を望ましい量で発現させる
だろう。これとは別に、パラセンジャーDNAはそれ自
体のまたは以下に述べるごとき他の外来プロモーターの
制御下にあってもよいということが見出された。最後に
、パッセ、ノジャーDNAを発現したウィルスは容易に
選択されて増殖されうる。
好適な実姉態様において、ポリヘトす/プロモーターを
用いて外来DNAを発現させる第一工程はAcNPV
H: +)ヘトす/遺伝子を含むベクターを適当な宿主
内で゛クローン化することである。
用いて外来DNAを発現させる第一工程はAcNPV
H: +)ヘトす/遺伝子を含むベクターを適当な宿主
内で゛クローン化することである。
Acl’lPVの1.2キロ塩基のポリヘドリノ遺伝子
の3′末端62チの位置は第1図および第2図に示すご
と(AcNPV のHlnd m −Vの領域に位置す
る。
の3′末端62チの位置は第1図および第2図に示すご
と(AcNPV のHlnd m −Vの領域に位置す
る。
こうして、パラセンジャーDNAを用いてのポリへドリ
ノ遺伝子の置換用プラスミドは、o、o〜約60キロゲ
ルト/のAcNPV DNA(=グメ/トをプラスミ
ドベクターを使用して大腸菌内でクロー/化することに
より開始される。これは、完全な遺伝子でない場合には
、少なくともポリヘドリノの3′末端セグメント(約3
,3〜41キロダルトンで存在する)を包含するだろう
。このポリヘドリ/遺伝子領域内に作用部位を1個所ま
たはそれ以」−有する制限エツトヌクレアーゼは、その
後パラセンジャーDNAの挿入部位をつくるべくこの組
み換えプラスミド’DNAを切断するために使用され得
る。制限エツトヌクレアーゼBarn HI ハこの領
域にいくつかの有益な作用部位を有するということが注
目される。ひとたびパソ七/ンヤーDNAがクローン化
プラスミドへ挿入されると、このプラスミド9ば゛マー
カーレスキーL −(marker res−cue)
”法に用いることができる。L、に、MlllerのJ
ournal of Virology、第39巻、9
73ページ(1981年)を参照されたい。この技術を
用いることにより、全長AcNPV DNAはプラスミ
ドによりもたらされるパラセンジャーDNAを含むAc
NPV DNA断片と同時トランスフェクトさ」する
。対立遺伝子の置換・は遺伝子変換または二市組み換え
現象により行われ、全長ウィルスDNA内のDNAがプ
ラスミド9によってもたらされる断片からのDNAで置
換される。こうして、天然ポリヘドリノ遺伝子は遺伝子
操作されたs9 +)へピリノ遺伝子およびパラセンジ
ャーDNAで置換され、パラセンジャーDNA含有ウィ
ルスの選択は内蔵体が存在しないプラークを、例えば光
学類@(幌でウィルスプラークを肉眼観察して、スクリ
ーニングすることにより行うことができる。ポリヘドリ
ノ遺伝子の欠失の正確な大きさの置換はバクロウィルス
の桿状ヌクレオカブ)・ドがより大きく広がることがで
きるので心安でない。
ノ遺伝子の置換用プラスミドは、o、o〜約60キロゲ
ルト/のAcNPV DNA(=グメ/トをプラスミ
ドベクターを使用して大腸菌内でクロー/化することに
より開始される。これは、完全な遺伝子でない場合には
、少なくともポリヘドリノの3′末端セグメント(約3
,3〜41キロダルトンで存在する)を包含するだろう
。このポリヘドリ/遺伝子領域内に作用部位を1個所ま
たはそれ以」−有する制限エツトヌクレアーゼは、その
後パラセンジャーDNAの挿入部位をつくるべくこの組
み換えプラスミド’DNAを切断するために使用され得
る。制限エツトヌクレアーゼBarn HI ハこの領
域にいくつかの有益な作用部位を有するということが注
目される。ひとたびパソ七/ンヤーDNAがクローン化
プラスミドへ挿入されると、このプラスミド9ば゛マー
カーレスキーL −(marker res−cue)
”法に用いることができる。L、に、MlllerのJ
ournal of Virology、第39巻、9
73ページ(1981年)を参照されたい。この技術を
用いることにより、全長AcNPV DNAはプラスミ
ドによりもたらされるパラセンジャーDNAを含むAc
NPV DNA断片と同時トランスフェクトさ」する
。対立遺伝子の置換・は遺伝子変換または二市組み換え
現象により行われ、全長ウィルスDNA内のDNAがプ
ラスミド9によってもたらされる断片からのDNAで置
換される。こうして、天然ポリヘドリノ遺伝子は遺伝子
操作されたs9 +)へピリノ遺伝子およびパラセンジ
ャーDNAで置換され、パラセンジャーDNA含有ウィ
ルスの選択は内蔵体が存在しないプラークを、例えば光
学類@(幌でウィルスプラークを肉眼観察して、スクリ
ーニングすることにより行うことができる。ポリヘドリ
ノ遺伝子の欠失の正確な大きさの置換はバクロウィルス
の桿状ヌクレオカブ)・ドがより大きく広がることがで
きるので心安でない。
多くの場合に、本発明に従って発現されるポリ投プチド
または他の遺伝子産物はそれが発現される昆虫細胞膜外
へ分泌されるのが好ましい。このことは1例えば意図す
る。6 リヘブチドと共て発現されかつ細胞がその産物
を分a・できるようにする適当なリーダー配列をコード
化させることにより、既知方法で達成される。
または他の遺伝子産物はそれが発現される昆虫細胞膜外
へ分泌されるのが好ましい。このことは1例えば意図す
る。6 リヘブチドと共て発現されかつ細胞がその産物
を分a・できるようにする適当なリーダー配列をコード
化させることにより、既知方法で達成される。
Aソセ:y:、y−’v−DNAヲAcNPV L −
] ヘ挿入tルタメK 、 AcNPV L−I D
NA tf) 0. Q 〜B、 7領域はベクターと
してpBR325を使用して大腸菌内でクロー7化され
る。AcNPV L −1はこの組み換えDNA作製に
用いるととができる野性型のウィルスであり、その物理
地図を第2図に示す。
] ヘ挿入tルタメK 、 AcNPV L−I D
NA tf) 0. Q 〜B、 7領域はベクターと
してpBR325を使用して大腸菌内でクロー7化され
る。AcNPV L −1はこの組み換えDNA作製に
用いるととができる野性型のウィルスであり、その物理
地図を第2図に示す。
MillerらによるVirologyo 第126
巻、376〜380投−ジ(1983年)を参照された
い。
巻、376〜380投−ジ(1983年)を参照された
い。
この開示は参照によりここに引用される。ブラスミ)’
pBR325(コれはBolivarのGene、第4
巻、121R−ジ(1978年〕に記載されている)は
ブラスミl−’pBR322の誘導体であって、Eco
RI により生成される組み換えDNA分子の選択の
ための特異なEcoR工 部位を有する。
pBR325(コれはBolivarのGene、第4
巻、121R−ジ(1978年〕に記載されている)は
ブラスミl−’pBR322の誘導体であって、Eco
RI により生成される組み換えDNA分子の選択の
ための特異なEcoR工 部位を有する。
組み換えプラスミドは、クロラムフェニコール耐性遺伝
子およびテ)7サイクリ/耐性遺伝子内をそれぞれ切断
するEcoRI および5aII の各制限エツトゝ
ヌクレアーゼを用いてpBK 325 を消化し、1
ツノEcoRI 付着端と1つの5aII 付着端
な作ってア7ビ7す/耐性遺伝子および複製開始点をそ
のまま残しておくことにより作られる。
子およびテ)7サイクリ/耐性遺伝子内をそれぞれ切断
するEcoRI および5aII の各制限エツトゝ
ヌクレアーゼを用いてpBK 325 を消化し、1
ツノEcoRI 付着端と1つの5aII 付着端
な作ってア7ビ7す/耐性遺伝子および複製開始点をそ
のまま残しておくことにより作られる。
AcNPV L −] DNAは同時K EcoRI
およびXhoIで消化される。EcoRI 、 Xho
IまたはSal′1で消化されたウィルスDNA断片
/ pBR325DNA断片の結合(ligation
)の後、大腸菌を形質転換する。ApRCMSTETS
コロニーがBam Fを含むプラスミドのためにスクリ
ーニングされる。
およびXhoIで消化される。EcoRI 、 Xho
IまたはSal′1で消化されたウィルスDNA断片
/ pBR325DNA断片の結合(ligation
)の後、大腸菌を形質転換する。ApRCMSTETS
コロニーがBam Fを含むプラスミドのためにスクリ
ーニングされる。
スクリーニングの間にpEXS 942が発見され。
これはAcNPVのXho −EcoR’I断片とEc
oRI −I、RおよびOを含むEcoRI 部分消
化産物との同時クローニングにより生じたと考えられる
。pExS942は19辷59よりもむしろ0.0〜8
7の領域を含むので、Hindm−V領域(3,3〜4
.0)の両側にAcNPVゲノムのより大きな領域およ
びより多くのD N !′、が提供される。このより大
きな領域はプラスミド’D N AとAcNPVDNA
との間の±ノビボでのマーカーレスキューに必要な二重
組み換え(または遺伝子変換現象)を促進すると思われ
る。他の利点はパラ七/′)ヤーI)NAをポリヘドリ
ン領域へ挿入するために次の作製において有用なウィル
スPstI部位が8.0に存在するということである。
oRI −I、RおよびOを含むEcoRI 部分消
化産物との同時クローニングにより生じたと考えられる
。pExS942は19辷59よりもむしろ0.0〜8
7の領域を含むので、Hindm−V領域(3,3〜4
.0)の両側にAcNPVゲノムのより大きな領域およ
びより多くのD N !′、が提供される。このより大
きな領域はプラスミド’D N AとAcNPVDNA
との間の±ノビボでのマーカーレスキューに必要な二重
組み換え(または遺伝子変換現象)を促進すると思われ
る。他の利点はパラ七/′)ヤーI)NAをポリヘドリ
ン領域へ挿入するために次の作製において有用なウィル
スPstI部位が8.0に存在するということである。
最後に、この00〜8.7領域は温度感受性変異体であ
るtsB 113を含むA c NPV のHlnd
m −N領域を完全に包含している。こうして、ts
B113およびpEXs 942は対立遺伝子置換のた
めの別の選択物として共に使用することができる。
るtsB 113を含むA c NPV のHlnd
m −N領域を完全に包含している。こうして、ts
B113およびpEXs 942は対立遺伝子置換のた
めの別の選択物として共に使用することができる。
Bam Fを取り囲むAcNPV L −1の領域が全
部欠失されうるかどうかを決定するために、pEXS9
42をBam HIで消化し、BamF断片を欠失させ
るように再結合させた。得られたプラスミドの中で新し
い構成物が単離され、これは以後PEX5942 B
6と名づけられた。このプラスミドはBam Fを欠失
してい・ないが45でBam HI部位を失っている。
部欠失されうるかどうかを決定するために、pEXS9
42をBam HIで消化し、BamF断片を欠失させ
るように再結合させた。得られたプラスミドの中で新し
い構成物が単離され、これは以後PEX5942 B
6と名づけられた。このプラスミドはBam Fを欠失
してい・ないが45でBam HI部位を失っている。
こうして、Bam HI部位が45で欠失されたのでp
BK3942 B 6は3.0図単位に゛ 1つの
Bam HI部位のみを有する。この方法知おいて、ポ
リヘドリン遺伝子を包囲するAcNPV の領域が大腸
菌内でクロー7化され、これからプラスミドpEXs9
42 ’ B6が単離される。このプラスミドは00〜
87図単位のAcN P V領域を含み、こうして33
と41の間に少なくQも62%のポリヘトす/3′末端
を包含する。それ故、pBK8 942 B6または
その誘導体のポリヘドリン領域はプラスミドゝの形のま
まで適当なパラ七ノジャーDNAと置換することができ
る。得られたpEX3942 B6パツセンジヤーブ
ラスミト9DNAはその後野性型AcNPVゲノムと同
時トランスフェクトされる。組み換えブラスミ)’DN
Aと野性型AcNPVとの間の二重組み換えまたは遺伝
子変換現象は、AcNPVのポリヘドリン遺伝子とパラ
センジャーDNAとの対立遺伝子置換をもたらす。ポリ
ヘドリン遺伝子とパラセンジャーDNAとの対立遺伝子
置換が成功すると内蔵体形成を欠くウィルスが生じる。
BK3942 B 6は3.0図単位に゛ 1つの
Bam HI部位のみを有する。この方法知おいて、ポ
リヘドリン遺伝子を包囲するAcNPV の領域が大腸
菌内でクロー7化され、これからプラスミドpEXs9
42 ’ B6が単離される。このプラスミドは00〜
87図単位のAcN P V領域を含み、こうして33
と41の間に少なくQも62%のポリヘトす/3′末端
を包含する。それ故、pBK8 942 B6または
その誘導体のポリヘドリン領域はプラスミドゝの形のま
まで適当なパラ七ノジャーDNAと置換することができ
る。得られたpEX3942 B6パツセンジヤーブ
ラスミト9DNAはその後野性型AcNPVゲノムと同
時トランスフェクトされる。組み換えブラスミ)’DN
Aと野性型AcNPVとの間の二重組み換えまたは遺伝
子変換現象は、AcNPVのポリヘドリン遺伝子とパラ
センジャーDNAとの対立遺伝子置換をもたらす。ポリ
ヘドリン遺伝子とパラセンジャーDNAとの対立遺伝子
置換が成功すると内蔵体形成を欠くウィルスが生じる。
この表現型は適当なプラーク検定法を用(・て選択する
ことができる。
ことができる。
さらに、AcNPV変異株であるtθB113の突然変
異位置はポリヘドリン遺伝子に隣接して存在するので、
この領域内の成功した対立遺伝子置換は温度感受性の低
下により選択可能である。この宿主/ベクター系はひと
たびパソセ/ジャーDNA挿入のだめの適切な制限部位
が確認されると種々の目的のために使用することができ
る。
異位置はポリヘドリン遺伝子に隣接して存在するので、
この領域内の成功した対立遺伝子置換は温度感受性の低
下により選択可能である。この宿主/ベクター系はひと
たびパソセ/ジャーDNA挿入のだめの適切な制限部位
が確認されると種々の目的のために使用することができ
る。
AcNPVベクター系の利点には桿状ウイルスカブソト
゛内にパノセノジャーDNAの大きなセグメントを包み
込む能力、および伝染性の非内蔵ウィルスの産生後に誘
発されるポリヘドリンおよび7、2 Kプロティンのプ
ロモーターのごとき強力なプロモーターの利用可能性が
含まれる。この位置に外来パラ七/ジャーDNAを配置
することの他の利点は、これらのプロモーターの合成が
NOV放出開始後であって細胞溶解の24時間以上前の
、感染サイクルの遅い時期に行われると℃・うことであ
る。その結果、伝染性のウィルス産生はいずれの活性パ
ンセフジャー遺伝子産物てよっても損なわれることがな
い。長期間の細胞生存能力が達成サレ、このことはパラ
センジャータンパク質合成の間代謝機能が続行すること
を示唆している。
゛内にパノセノジャーDNAの大きなセグメントを包み
込む能力、および伝染性の非内蔵ウィルスの産生後に誘
発されるポリヘドリンおよび7、2 Kプロティンのプ
ロモーターのごとき強力なプロモーターの利用可能性が
含まれる。この位置に外来パラ七/ジャーDNAを配置
することの他の利点は、これらのプロモーターの合成が
NOV放出開始後であって細胞溶解の24時間以上前の
、感染サイクルの遅い時期に行われると℃・うことであ
る。その結果、伝染性のウィルス産生はいずれの活性パ
ンセフジャー遺伝子産物てよっても損なわれることがな
い。長期間の細胞生存能力が達成サレ、このことはパラ
センジャータンパク質合成の間代謝機能が続行すること
を示唆している。
AcNPVのゲノムは約s 200 o、 o o o
ゲルト/の二本鎖の、共有結合で閉環した環状DNA分
子である。これらの特徴には20キロ塩基以」−のパツ
セ/ジャDNAを収容しうる桿状カブンド、および伝染
性ウィルスの初期産生これに続く多数のプロモーターか
らのウィルス誘導タ/バク質の長期間合成をもたらすウ
ィルス遺伝子の段階的発現が含まれる。
ゲルト/の二本鎖の、共有結合で閉環した環状DNA分
子である。これらの特徴には20キロ塩基以」−のパツ
セ/ジャDNAを収容しうる桿状カブンド、および伝染
性ウィルスの初期産生これに続く多数のプロモーターか
らのウィルス誘導タ/バク質の長期間合成をもたらすウ
ィルス遺伝子の段階的発現が含まれる。
本発明の他の実施態様において、7.2 Kプロティン
の合成を制御するプロモーターもまた・ξソ七ノジャー
遺伝子発現のために利用できる。7.2Kプロティ/遺
伝子は第1図の88〜91図栄位に位置する。Adan
g およびMillerのJ、 ofVirolog
、y、44,782(1982)を参照されたい。この
開示は参照によりここに引用される。
の合成を制御するプロモーターもまた・ξソ七ノジャー
遺伝子発現のために利用できる。7.2Kプロティ/遺
伝子は第1図の88〜91図栄位に位置する。Adan
g およびMillerのJ、 ofVirolog
、y、44,782(1982)を参照されたい。この
開示は参照によりここに引用される。
7、2 Kプロティンをコート9するm RN A
の合成はHina m−QからHlndm−P ヘと
伸びる。72KプロティンをコードするDNAの大部分
を含むブラミトゝがクローン化されており(Adang
およびMillerの上記文献を参照された(・)、こ
れはパラセンジャー遺伝子挿入および7.2 Kプロテ
ィ/遺伝子内での対立遺伝子置換のために使用できるだ
ろう。
の合成はHina m−QからHlndm−P ヘと
伸びる。72KプロティンをコードするDNAの大部分
を含むブラミトゝがクローン化されており(Adang
およびMillerの上記文献を参照された(・)、こ
れはパラセンジャー遺伝子挿入および7.2 Kプロテ
ィ/遺伝子内での対立遺伝子置換のために使用できるだ
ろう。
本発明の他の実姉態様において、バクロウィルスプロモ
ーター以外の外来プロモーター、例えば他のウィルス、
細菌、真菌、昆虫、呻乳動物などのプロモーターの制御
下にノξソセンジャー遺伝子を導入することが可能であ
る。どの方法ではパラセンジャー遺伝子が外来プロモー
ターに結合され。
ーター以外の外来プロモーター、例えば他のウィルス、
細菌、真菌、昆虫、呻乳動物などのプロモーターの制御
下にノξソセンジャー遺伝子を導入することが可能であ
る。どの方法ではパラセンジャー遺伝子が外来プロモー
ターに結合され。
そして外来プロモーター−遺伝子の組合せが適当す”ト
ラ:/スプレイスメントベクター°゛内に挿入される。
ラ:/スプレイスメントベクター°゛内に挿入される。
このトランスプレイスメントベクターはウィルスDNA
の適切な領域の対立遺伝子置換を可能知するように構成
される。プラスミ)’pGP−B 6874 / 5a
1(第4図)はこの種のトランスプレイスメントベクタ
ーの1種である。このプラスミドはその本質的でない領
域内に1つのPst I部位を有する。外来プロモータ
ー遺伝子はこのPst; I部位へ挿入することができ
る。得られた組み換えプラスミドは野性型ウィルスDN
Aと同時トランスフェクトされ1組み換え体は適当な技
術によって選択される。pGP−B 6874 / S
al の場合に、このベクターは対立遺伝子置換から得
られた組み換えウィルスに青色が生ずるように作製され
る。外来プロモーターの1例は広く入手用能な家禽肉腫
ウィルスであるラウス肉腫ウィルス(Rous sar
coma virus)のロングターミナルリピートプ
ロモーター(long terminal repe
atpromoter)である。このプロモーター(R
3V−LTR)はAcN、PV内に挿入されて、大腸菌
のクロラムフエニコールアセチルトランスノエラーゼの
ような外来タンパク質の昆虫細胞内合成を誘発させるこ
とが立証された。この性角の外来プロモーターを使用す
ることの1つの利点は、そのプロモーターがウィルス複
製過程の後期だけでなく初期にも活性化されるというこ
とである。初期発現はバクロウィルスおよび/または昆
虫細胞の遺伝子操作のいくつかの用途、特に生物系殺虫
剤としてのバクロウィルスの使用において役立つかもし
れない。昆虫細胞を使用してポ、すRプチドを大規模生
産することが目的である場合、初期生産体は例えば生産
されたタンパク質が細胞の生存能力および生産能力に悪
影響を及ぼさない場合には有利であるだろう。
の適切な領域の対立遺伝子置換を可能知するように構成
される。プラスミ)’pGP−B 6874 / 5a
1(第4図)はこの種のトランスプレイスメントベクタ
ーの1種である。このプラスミドはその本質的でない領
域内に1つのPst I部位を有する。外来プロモータ
ー遺伝子はこのPst; I部位へ挿入することができ
る。得られた組み換えプラスミドは野性型ウィルスDN
Aと同時トランスフェクトされ1組み換え体は適当な技
術によって選択される。pGP−B 6874 / S
al の場合に、このベクターは対立遺伝子置換から得
られた組み換えウィルスに青色が生ずるように作製され
る。外来プロモーターの1例は広く入手用能な家禽肉腫
ウィルスであるラウス肉腫ウィルス(Rous sar
coma virus)のロングターミナルリピートプ
ロモーター(long terminal repe
atpromoter)である。このプロモーター(R
3V−LTR)はAcN、PV内に挿入されて、大腸菌
のクロラムフエニコールアセチルトランスノエラーゼの
ような外来タンパク質の昆虫細胞内合成を誘発させるこ
とが立証された。この性角の外来プロモーターを使用す
ることの1つの利点は、そのプロモーターがウィルス複
製過程の後期だけでなく初期にも活性化されるというこ
とである。初期発現はバクロウィルスおよび/または昆
虫細胞の遺伝子操作のいくつかの用途、特に生物系殺虫
剤としてのバクロウィルスの使用において役立つかもし
れない。昆虫細胞を使用してポ、すRプチドを大規模生
産することが目的である場合、初期生産体は例えば生産
されたタンパク質が細胞の生存能力および生産能力に悪
影響を及ぼさない場合には有利であるだろう。
次の実施例は今や本発明を実姉することが好適であるの
でその実殉態様を例示するために提供される。これらの
実施例は例示的なものであって、本発明は添付の特許請
求の範囲に示したものを除いてそれに限定が加えられる
べきでないと理解されるだろう。
でその実殉態様を例示するために提供される。これらの
実施例は例示的なものであって、本発明は添付の特許請
求の範囲に示したものを除いてそれに限定が加えられる
べきでないと理解されるだろう。
実捲例I
AcNPVはポリヘドリン遺伝子へ挿入された9、 2
KbパッセンジャーDNAを安定して増殖させること
により組み換えDNAはフタ−として都合よく使用する
ことができる。さらに、ポリヘドリンプロモーターは大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなパラセンジ
ャー遺伝子を高水準で発現させる。
KbパッセンジャーDNAを安定して増殖させること
により組み換えDNAはフタ−として都合よく使用する
ことができる。さらに、ポリヘドリンプロモーターは大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなパラセンジ
ャー遺伝子を高水準で発現させる。
プラスミド5pEXS 942 B6はAcNPVの
00〜87図単位領域を含むがBam F / C接合
部でBamHI部位を欠き、こうしてこのプラスミドは
ポリヘドリン遺伝子内またはその近辺にBam HI部
位を1つだけ含む。
00〜87図単位領域を含むがBam F / C接合
部でBamHI部位を欠き、こうしてこのプラスミドは
ポリヘドリン遺伝子内またはその近辺にBam HI部
位を1つだけ含む。
pMC874プラスミドはβ−ガラクトシダーぜのポリ
ヘドリン遺伝子のBam、HI fps位と同じ読み取
り枠で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の第8コド
ンに1つのBamHI部位を有する。
ヘドリン遺伝子のBam、HI fps位と同じ読み取
り枠で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の第8コド
ンに1つのBamHI部位を有する。
Ca5adaban らのJ、 Bact、 、 L
43.971〜980(1980)を参照されたし・。
43.971〜980(1980)を参照されたし・。
β−ガラクト7ダーゼ遺伝子に加えて、c+2Kbのp
MC874プラスミドはlac Y 遺伝子、lac
A 遺伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝子の一部
、Co1E1複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子
を含む。
MC874プラスミドはlac Y 遺伝子、lac
A 遺伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝子の一部
、Co1E1複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子
を含む。
Bam HIで消化したpMC874とプラスミドpE
Xs942 B6 DNA トノインビトロ結合
による融合は25.2KbのプラスミドpGP−868
74(第5図参照)の形成をもたらし、これは以後プラ
スミドゝと呼ばれる。
Xs942 B6 DNA トノインビトロ結合
による融合は25.2KbのプラスミドpGP−868
74(第5図参照)の形成をもたらし、これは以後プラ
スミドゝと呼ばれる。
252Kbのプラスミド’pGP、B6874はpEX
S942 B6およびpMC874をBamHIで消化
し、続いて2分子融合の方を行わせるべく高DNA濃度
で結合させることによって作製された。
S942 B6およびpMC874をBamHIで消化
し、続いて2分子融合の方を行わせるべく高DNA濃度
で結合させることによって作製された。
ManiatieらのMo1ecuxar Cloni
ng、 Co1aS’pring Harbor研究所
(1’982)を参照されたい。この開示は参照により
ここに引用される。大腸菌HBIOIをその結合産物で
形質転換させた畝その融合プラスミドはアンピシリンお
よびカナマイシンに対するそれらの耐性により選択され
た。アンピシリン耐性遺伝子はpEXS942 B6
によってもたらされ、カナマイシン耐性遺伝子は’pM
C874〜くたらされる。アンビンリン、カナマイシン
およびX−gal (β−ガラクトシダーゼ酵素活性
のための発色指示薬)を含む平板上の青色コロニーが選
択された。
ng、 Co1aS’pring Harbor研究所
(1’982)を参照されたい。この開示は参照により
ここに引用される。大腸菌HBIOIをその結合産物で
形質転換させた畝その融合プラスミドはアンピシリンお
よびカナマイシンに対するそれらの耐性により選択され
た。アンピシリン耐性遺伝子はpEXS942 B6
によってもたらされ、カナマイシン耐性遺伝子は’pM
C874〜くたらされる。アンビンリン、カナマイシン
およびX−gal (β−ガラクトシダーゼ酵素活性
のための発色指示薬)を含む平板上の青色コロニーが選
択された。
青色形成を伴うプラーク検定法のために、鱗翅目単層細
胞のニュートラルレッド染色を伴うプラーク検定法に類
似した方法が応用された。LeeおよびMillerの
J、Virol、 27.754〜767(1978)
を参照されたい。青色形成に用も・られた方法は1
20 tt9/ytlのX −galをアガロース含有
培地の中に入れることを除けば同様であつた。ニュート
ラルレットゝ染色の代わりに、プラークはそれらの青色
によって視覚化され、青色は平板を37℃で4〜6時間
暖めるかまたは室温で一晩発色させること短より強めら
れる。これとは別に迅速に視覚化させるためには組織培
養皿を液体窒素中で5〜IO秒間凍結させ、室温で溶か
し、そして2〜3時間で重色発色を行わせる。伝染性ウ
ィルスはプラークから採取され、そして直接再プラーク
形成させるかまたはウィルス株へ増殖させた。
胞のニュートラルレッド染色を伴うプラーク検定法に類
似した方法が応用された。LeeおよびMillerの
J、Virol、 27.754〜767(1978)
を参照されたい。青色形成に用も・られた方法は1
20 tt9/ytlのX −galをアガロース含有
培地の中に入れることを除けば同様であつた。ニュート
ラルレットゝ染色の代わりに、プラークはそれらの青色
によって視覚化され、青色は平板を37℃で4〜6時間
暖めるかまたは室温で一晩発色させること短より強めら
れる。これとは別に迅速に視覚化させるためには組織培
養皿を液体窒素中で5〜IO秒間凍結させ、室温で溶か
し、そして2〜3時間で重色発色を行わせる。伝染性ウ
ィルスはプラークから採取され、そして直接再プラーク
形成させるかまたはウィルス株へ増殖させた。
ポリへ1・゛リンN−末端に融合したβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を有する融合プラスミドpC,P−B687
4 (第5図)を含む=+o=−は、 5alI、E
co RIおよびHind m 酵素を用いる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により立証された。これらの酵素
分析は融合されたプラスミドの2つの起こりうる配向を
識別する。
ーゼ遺伝子を有する融合プラスミドpC,P−B687
4 (第5図)を含む=+o=−は、 5alI、E
co RIおよびHind m 酵素を用いる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により立証された。これらの酵素
分析は融合されたプラスミドの2つの起こりうる配向を
識別する。
ポリヘドリン/ pMc874融合配列(融合プラスミ
ドpGP−B 6874で表わされる)をAcNPVD
NA ゲノムへ転移させるために、対立遺伝子置換また
は°°トランスプレイスメント°゛法が採用される。L
、に0M1ller のJ、 Virol、 、
39.973〜976(198,1)を参照されたい、
この開示はAcNPVおよび10倍モル過剰のpGP−
B6874DNA を用℃・て燐酸カルシウム共沈降法
により同時トランスフェクトされた。Potterおよ
びMi]、lerのJ、Invert、 Path、
、 36.43 ]〜432(1980)を参照された
℃・。この開示は参照によりここに引用される。β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現するウィルスはX −ga
l の存在下で青色プラークとして検出された。
ドpGP−B 6874で表わされる)をAcNPVD
NA ゲノムへ転移させるために、対立遺伝子置換また
は°°トランスプレイスメント°゛法が採用される。L
、に0M1ller のJ、 Virol、 、
39.973〜976(198,1)を参照されたい、
この開示はAcNPVおよび10倍モル過剰のpGP−
B6874DNA を用℃・て燐酸カルシウム共沈降法
により同時トランスフェクトされた。Potterおよ
びMi]、lerのJ、Invert、 Path、
、 36.43 ]〜432(1980)を参照された
℃・。この開示は参照によりここに引用される。β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現するウィルスはX −ga
l の存在下で青色プラークとして検出された。
プラスミドDNAはラピッド クリアー リゼイl゛(
rapid clear 1ysate)法により調整
された。HolmesおよびQuigley のAna
l、 Biochem、。
rapid clear 1ysate)法により調整
された。HolmesおよびQuigley のAna
l、 Biochem、。
114.193(1981)を参照されたい。AcNP
VDI喝Aは5℃で90分間90000XFで20%シ
ョ糖溶液中の遠心にかけることにより、感染培地から部
分的に精製された細胞外ウィルスより調製された。この
沈殿物は10 mM )’IJスーHCep)I76.
10mMEDTAおよび0.25%SDSの200μe
中にゼ)懸濁した。ブロテイナーぜKを0.5m?/駐
の最終濃度になるまで添加し、そしてこの混合物を30
℃で30分間インキュベートし、次いでD N Aを沈
降させる前に2回フェノール抽出した。
VDI喝Aは5℃で90分間90000XFで20%シ
ョ糖溶液中の遠心にかけることにより、感染培地から部
分的に精製された細胞外ウィルスより調製された。この
沈殿物は10 mM )’IJスーHCep)I76.
10mMEDTAおよび0.25%SDSの200μe
中にゼ)懸濁した。ブロテイナーぜKを0.5m?/駐
の最終濃度になるまで添加し、そしてこの混合物を30
℃で30分間インキュベートし、次いでD N Aを沈
降させる前に2回フェノール抽出した。
組み換えD N A作製に使用した野性型ウィルスは先
に示したA c NPVのL−1変異株であり、この変
異株は単離され、 LeeおよびMj、]lerのJ。
に示したA c NPVのL−1変異株であり、この変
異株は単離され、 LeeおよびMj、]lerのJ。
Virol。、27,754〜767(1978)
に記載されており、この開示は参照によりここに引用さ
ラインは0.26%トリプトースブロス、10%ウシ胎
児血清、2mML−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤(Gibco)を補足したTC−100培地(微生物
学協会)で増殖させた。
に記載されており、この開示は参照によりここに引用さ
ラインは0.26%トリプトースブロス、10%ウシ胎
児血清、2mML−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤(Gibco)を補足したTC−100培地(微生物
学協会)で増殖させた。
ニュートラルレッドで染色した単層とX −galで染
色した単層との比較は、1000のプラーク巾約1つの
プラークがAcNPV とβ−ガラクトンダーゼ゛を
発現させたpGP −86874との同時トランスフェ
クトヨ/から生じたことを示した。いくつかの青色プラ
ークが選択され、それらは直接S、フルギベルダ細胞の
単層上で再度プラーク形成させた。
色した単層との比較は、1000のプラーク巾約1つの
プラークがAcNPV とβ−ガラクトンダーゼ゛を
発現させたpGP −86874との同時トランスフェ
クトヨ/から生じたことを示した。いくつかの青色プラ
ークが選択され、それらは直接S、フルギベルダ細胞の
単層上で再度プラーク形成させた。
トランスフェクトョ/はグリセロール促進工程を除く燐
酸カルソウム沈降法を使用して、 Potterおよび
Mi]lerの」二記文献記載の方法で行われた。
酸カルソウム沈降法を使用して、 Potterおよび
Mi]lerの」二記文献記載の方法で行われた。
DNA沈殿物を20分間インキュベートシた後、S、フ
ルギ投ルグ細胞は2〜3時間液体培地で穆われ、その後
この覆いはプラーク発現のために新しい液体培地または
アガロース含有培地と取り替えられた。トランスプレイ
スメ/トの実験にはウィルスDNA1分子あたりプラス
ミドゝD N A IQQ分子が慣例的に使用された。
ルギ投ルグ細胞は2〜3時間液体培地で穆われ、その後
この覆いはプラーク発現のために新しい液体培地または
アガロース含有培地と取り替えられた。トランスプレイ
スメ/トの実験にはウィルスDNA1分子あたりプラス
ミドゝD N A IQQ分子が慣例的に使用された。
トランスフェクンヨ/法に用゛いられるDNAはトリス
−EDTA溶液よりむしろ水の中に貯蔵された。
−EDTA溶液よりむしろ水の中に貯蔵された。
青色プラーク(内蔵体を含まな℃・)は採取され。
ウィルス株へと増殖させて制限エンビヌクレアーゼ分析
により性状決定がなされた。これらのウィルスの1つで
あるAcNPV L ]、 G P −gal 3
のPst I およびB−a、mHIパターンを第6
図に示す。
により性状決定がなされた。これらのウィルスの1つで
あるAcNPV L ]、 G P −gal 3
のPst I およびB−a、mHIパターンを第6
図に示す。
LIGP−ga、13 ではPst−D が欠けて
おり、2つの新しく・断片が存在している。新しい断片
の一方はP#t−CおよびD の間に見出され、他方は
Pet −F 以下に見出される。後渚の断片はPM
C874のApS 領域がらAcNPVのEcoRI
−0領域までのpGP−B6874のPst I断片と
一緒に泳動する。Pet G とPst D の間
の新しいPst断片はAcNPV(11のEcoRニー
BがらEcoRI−王におけるPstI−0/N接合部
および犬腸酌β−gal、 lac Yおよびlac
A 領域に相当する。
おり、2つの新しく・断片が存在している。新しい断片
の一方はP#t−CおよびD の間に見出され、他方は
Pet −F 以下に見出される。後渚の断片はPM
C874のApS 領域がらAcNPVのEcoRI
−0領域までのpGP−B6874のPst I断片と
一緒に泳動する。Pet G とPst D の間
の新しいPst断片はAcNPV(11のEcoRニー
BがらEcoRI−王におけるPstI−0/N接合部
および犬腸酌β−gal、 lac Yおよびlac
A 領域に相当する。
BamHI 、2ターンもまた全PMC874がAc
NPV内に適切に挿入されたことを示している。野性株
AcNPVからのBamHI断片はどれもLIGP−g
al3 K存在しなl、−が、pMC874と−緒に泳
動する新しい9.2キロ塩基の断片が見出される。
NPV内に適切に挿入されたことを示している。野性株
AcNPVからのBamHI断片はどれもLIGP−g
al3 K存在しなl、−が、pMC874と−緒に泳
動する新しい9.2キロ塩基の断片が見出される。
Bam F゛もまたLIGP−gal3 ウィルスに
観察され、AcN P V とpGP−B6874と
(7)間の相同的組み換えがpMc1374 およびE
co RI−I(s)接合部の近辺でおこったことを示
した。こうして。
観察され、AcN P V とpGP−B6874と
(7)間の相同的組み換えがpMc1374 およびE
co RI−I(s)接合部の近辺でおこったことを示
した。こうして。
ウィルy、ACNPV LIGP−gal 3はβ−
ガラクトシダーゼ活性を発現し、pMC874由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子がこのウィルス内に組み入れ
られたことを示す。
ガラクトシダーゼ活性を発現し、pMC874由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子がこのウィルス内に組み入れ
られたことを示す。
β−ガラクトシダT−ぜ活性の発現調節β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の発現がポリヘドリン遺伝子の発現と同じ
時間的調節のもとにあるかどうかを決定するために、S
、フルギRルダ細胞の単層に野性型AcNPVまたはA
cNPV LIGP−gal 3を細胞あたり20プラ
一ク形成単位(PFU )の感染の多重度で感染させた
。感染後いろいろな時間に、感染細胞はβ−ガラクトシ
ダーゼ活性および全タン・ξり質含有量について検定さ
れた。β−ガラクト7ダーゼ活性は最初18〜24時間
の間にあられれ、その後感染の48時間後まで劇的に増
加する。
ダーゼ遺伝子の発現がポリヘドリン遺伝子の発現と同じ
時間的調節のもとにあるかどうかを決定するために、S
、フルギRルダ細胞の単層に野性型AcNPVまたはA
cNPV LIGP−gal 3を細胞あたり20プラ
一ク形成単位(PFU )の感染の多重度で感染させた
。感染後いろいろな時間に、感染細胞はβ−ガラクトシ
ダーゼ活性および全タン・ξり質含有量について検定さ
れた。β−ガラクト7ダーゼ活性は最初18〜24時間
の間にあられれ、その後感染の48時間後まで劇的に増
加する。
β−ガラクトシダーゼの量はMillerによるSpr
ing Harbor 6p究所、ニューヨーク(19
72)に記載のオルト−ニトロフェニルガラクト/ト9
(ONPC)検定法を使用して測定した。試験用昆虫細
胞に20PFU/1a胞の感染の多重度でウィルスを感
染させた。ウィルスは穏やかにゆすりながら室温で1時
間吸着させた。接種物を取り除いて適当な培地とおきか
え、そしてインキュベーションを指示時間の間27℃で
実施した。細胞は燐酸緩衝化塩化す) l)ラム水溶液
(LeeおよびMillerの上記文献参照)で洗浄し
、細胞を平板からかき取って200X、9で5分間遠心
沈殿させた。上澄みを捨て、細胞沈殿物は液体窒素中で
凍結して検定まで一70℃で貯蔵した。細胞を蒸留水に
再び懸濁し、次いで2緩衝液中に適当に(1:1〜1:
1OOO)希釈し、こうすると0NPG添加後15分な
いし1時間の間に薄い黄色があられれた。
ing Harbor 6p究所、ニューヨーク(19
72)に記載のオルト−ニトロフェニルガラクト/ト9
(ONPC)検定法を使用して測定した。試験用昆虫細
胞に20PFU/1a胞の感染の多重度でウィルスを感
染させた。ウィルスは穏やかにゆすりながら室温で1時
間吸着させた。接種物を取り除いて適当な培地とおきか
え、そしてインキュベーションを指示時間の間27℃で
実施した。細胞は燐酸緩衝化塩化す) l)ラム水溶液
(LeeおよびMillerの上記文献参照)で洗浄し
、細胞を平板からかき取って200X、9で5分間遠心
沈殿させた。上澄みを捨て、細胞沈殿物は液体窒素中で
凍結して検定まで一70℃で貯蔵した。細胞を蒸留水に
再び懸濁し、次いで2緩衝液中に適当に(1:1〜1:
1OOO)希釈し、こうすると0NPG添加後15分な
いし1時間の間に薄い黄色があられれた。
細胞はMiller(1972年)により推せんされた
クロロホルムおよびO1%S D 、Sを用いて破壊し
た。比活性はnモル(分解されたO N P G/分/
mg(タンパク質)として定義された。
クロロホルムおよびO1%S D 、Sを用いて破壊し
た。比活性はnモル(分解されたO N P G/分/
mg(タンパク質)として定義された。
感染後48時間に観察された比活性は800゜n モ/
l/ (分解0NPG)、%/at (タンパク質)で
あり、これはβ−ガラクトシダーゼ活性が約900倍高
めらねたことを表わす、、8000という比活性は純粋
なβ−ガラクト7ダーゼが3×105単位/ myの比
活性を有するので全細胞タンパク質の少なくとも3%が
β−ガラクトンダ〜ゼであるということを意味する。感
染後72時間で、比活性は細胞溶解が始まるために大抵
降下する。
l/ (分解0NPG)、%/at (タンパク質)で
あり、これはβ−ガラクトシダーゼ活性が約900倍高
めらねたことを表わす、、8000という比活性は純粋
なβ−ガラクト7ダーゼが3×105単位/ myの比
活性を有するので全細胞タンパク質の少なくとも3%が
β−ガラクトンダ〜ゼであるということを意味する。感
染後72時間で、比活性は細胞溶解が始まるために大抵
降下する。
ポリヘドリン/β−ガラクトノダーゼ遺伝子発現の調節
はまた感染後いろいろな時間に353メチオニノで感染
細胞をパルス標識することにより分析された。353で
標識されたタンパク質は5DS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析される。
はまた感染後いろいろな時間に353メチオニノで感染
細胞をパルス標識することにより分析された。353で
標識されたタンパク質は5DS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析される。
タンハク質ノクーマシーブル−(Coomassie
blue)染色は感染の初期に野性型またはLICP−
gal 3のプロフィールに有意な差がないことを示す
。感染の18〜72時間後、33000ダルトノのポリ
ヘドリン遺伝子ξり質が野性型を感染させた細胞で合成
され、LIGP−gal3 を感染させた細胞では合
成されない。
blue)染色は感染の初期に野性型またはLICP−
gal 3のプロフィールに有意な差がないことを示す
。感染の18〜72時間後、33000ダルトノのポリ
ヘドリン遺伝子ξり質が野性型を感染させた細胞で合成
され、LIGP−gal3 を感染させた細胞では合
成されない。
LIGP−gal3のプロフィールは感染の約18時間
後に野性型感染細胞には見られない約120000グル
トンの新しいタンパク質および95000ダルトン範囲
の数種の小さなタンパク質を示す。最も大きなタン/ξ
り質はポリへドリフ/β−ガラクトシダーゼ融合ポリ投
ブチドに妥当な大きさである。120000ダルトン領
域のクーマン−ブルー染色の強さは活性β−ガラクトシ
ダーゼが感染48時間後に全細胞タン/8り質の少な(
とも3%を占めるという比活性の推定を確かなものとす
る。
後に野性型感染細胞には見られない約120000グル
トンの新しいタンパク質および95000ダルトン範囲
の数種の小さなタンパク質を示す。最も大きなタン/ξ
り質はポリへドリフ/β−ガラクトシダーゼ融合ポリ投
ブチドに妥当な大きさである。120000ダルトン領
域のクーマン−ブルー染色の強さは活性β−ガラクトシ
ダーゼが感染48時間後に全細胞タン/8り質の少な(
とも3%を占めるという比活性の推定を確かなものとす
る。
クーマノ−ブルー染色はまたポリヘドリノ/β−ガラク
ト/ダーゼ融合タンパク質の量が感染後72時間で減少
することも反映する。
ト/ダーゼ融合タンパク質の量が感染後72時間で減少
することも反映する。
Millerらの1983年の上記文献記載の方法は感
染したS、フルギにルダ細胞におけるウィルス誘導タン
パク質の分析に使用されるが、ただし平板35叫あたり
細胞1×106個が用いられ。
染したS、フルギにルダ細胞におけるウィルス誘導タン
パク質の分析に使用されるが、ただし平板35叫あたり
細胞1×106個が用いられ。
また細胞は低速度で遠心沈殿させた後媒体で洗浄された
。
。
ポリヘトす/抗体を用いての免疫沈降
野性型およびLIGP−gal3 を感染させた細胞
内で感染の48時間後に産生されたホリハブチドの性質
をさらに調べるために、感染48時間後の358−標識
タン・ぐり質を精製ポリヘドリノを抗原として得られた
抗血清で沈降させた。、D I7ヘドリン抗血清を用℃
・る免疫沈降はKessler のImmunO]、
Ogy、117.1482〜1490(’1976)に
記載の方法をわずかに変更することによって行われた。
内で感染の48時間後に産生されたホリハブチドの性質
をさらに調べるために、感染48時間後の358−標識
タン・ぐり質を精製ポリヘドリノを抗原として得られた
抗血清で沈降させた。、D I7ヘドリン抗血清を用℃
・る免疫沈降はKessler のImmunO]、
Ogy、117.1482〜1490(’1976)に
記載の方法をわずかに変更することによって行われた。
感染48時間後の353−標識夕7・ξり仰41μeを
ポリヘドリン抗血清41μeと室温で1時間イノキュベ
ートし、次いで沈降緩衝液(0,15MNaCe、5m
MEDTA、5QmM )リス−HCe。002%N
aN3.0.05%NP4Qおよび01%BSA)
中の黄色ブドウ球菌(Staphylo −coccu
e aureus、 Sigma)の2%懸濁液160
tieを加えた。この混合物を室温で20分間インキ
ュイードし、生じた沈殿物を1soooxyで1分間遠
心にかけて集めた。上澄みを捨て、沈殿物は沈降緩衝液
0.5m(+で洗浄した。その後、この沈殿物を可溶化
緩衝液(1%SDS、’0.5%β−メルカプトエタノ
ールおよび0.5M尿素)中に渦を発生させながら再懸
濁し、100℃で5分間加熱した。破壊片を15000
X;で5分間遠心沈殿させ、上澄みは5DS−yl+)
アクリルアミビゲル亀気泳動で分析した。
ポリヘドリン抗血清41μeと室温で1時間イノキュベ
ートし、次いで沈降緩衝液(0,15MNaCe、5m
MEDTA、5QmM )リス−HCe。002%N
aN3.0.05%NP4Qおよび01%BSA)
中の黄色ブドウ球菌(Staphylo −coccu
e aureus、 Sigma)の2%懸濁液160
tieを加えた。この混合物を室温で20分間インキ
ュイードし、生じた沈殿物を1soooxyで1分間遠
心にかけて集めた。上澄みを捨て、沈殿物は沈降緩衝液
0.5m(+で洗浄した。その後、この沈殿物を可溶化
緩衝液(1%SDS、’0.5%β−メルカプトエタノ
ールおよび0.5M尿素)中に渦を発生させながら再懸
濁し、100℃で5分間加熱した。破壊片を15000
X;で5分間遠心沈殿させ、上澄みは5DS−yl+)
アクリルアミビゲル亀気泳動で分析した。
、f +)ヘドリノ抗血清は野性型感染細胞から330
00ダルトノのHソリヘトリンタンパクηおよび200
00〜25000ダルトノ領域の数種のポリ2プチド類
を沈降させた。この大きさのポリ2プチド類はLIGP
−gal3 感染細胞ではポリヘト9リノ抗血清で沈
降されなかった。その代わり、120000ダルト/の
タンパク質が主な沈殿物であって、先に示した9500
0ダルトン領域ノ一連のポリペプチド類および4100
0〜950’ OOダルトノの目立たない大きさの数種
の別の小さなポリ2プチド類も沈降された。こうして、
120000ダルトンのタンパク質はポリヘドリン融合
産物であり、より小さな、Q リ6ブチド類はその融合
産物の別の形体を表わしている。
00ダルトノのHソリヘトリンタンパクηおよび200
00〜25000ダルトノ領域の数種のポリ2プチド類
を沈降させた。この大きさのポリ2プチド類はLIGP
−gal3 感染細胞ではポリヘト9リノ抗血清で沈
降されなかった。その代わり、120000ダルト/の
タンパク質が主な沈殿物であって、先に示した9500
0ダルトン領域ノ一連のポリペプチド類および4100
0〜950’ OOダルトノの目立たない大きさの数種
の別の小さなポリ2プチド類も沈降された。こうして、
120000ダルトンのタンパク質はポリヘドリン融合
産物であり、より小さな、Q リ6ブチド類はその融合
産物の別の形体を表わしている。
L]GP−gal3 感染細胞におけるβ−ガラクトン
ダーゼの比活性は例外的て高い。酵母において報告され
た最も高い比活性は、感染48時間後のLlGP−ga
l3 感染細胞において観察された比活性の半分であ
る。野性型感染細胞内知見用された33000ダルトノ
のタン・ξり質はLIGP−gal 3 感染細胞内
で約120000ダルドアのポリヘト9リノ/β−ガラ
クトシダーゼ融合タン・ξり質およびより小さな分子量
の一連の他のタン・ξり質類と置き換えられる。より小
さなタンパク角は個々に120000ダルトンのタンパ
ク質よりも少量であり、120000ダルトノの融合タ
ンパク質の加水分解産物でありうる。
ダーゼの比活性は例外的て高い。酵母において報告され
た最も高い比活性は、感染48時間後のLlGP−ga
l3 感染細胞において観察された比活性の半分であ
る。野性型感染細胞内知見用された33000ダルトノ
のタン・ξり質はLIGP−gal 3 感染細胞内
で約120000ダルドアのポリヘト9リノ/β−ガラ
クトシダーゼ融合タン・ξり質およびより小さな分子量
の一連の他のタン・ξり質類と置き換えられる。より小
さなタンパク角は個々に120000ダルトンのタンパ
ク質よりも少量であり、120000ダルトノの融合タ
ンパク質の加水分解産物でありうる。
実姉例2
ポリヘトす//β−ガラクト/ダーゼ融合タン・ぞり質
はまたAcNPV複製を許容する他の昆虫細胞によって
も発現される。例えば、鱗翅目ヤガ科のTrichop
lusia ni、 TN−368から誘導された細胞
ラインは0.26%トリプトースブロス、10%ウソ胎
児血清、2mML−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤(Gibco)を補足したTO−100培地(微生物
学協会)中で増殖させた。この細胞ラインの単層は・組
み換えウィルスLIGP−gal 3 の種々の希釈
物で感染させ、そして120μ&/rneのβ−ガラク
トシダーゼ用発色指示薬X−galを含有するアガロー
ス−培地で覆った。この単層は27℃で4日間インキュ
ベートし、次いで平板を37℃に4〜6時間暖めること
によって発色させた。ポリヘトゝリン/β−ガラクトシ
ダーゼ融合タン・ξり質の発現は′r、n1単層上の鮮
明な青色プラークにより確認された。この滴定濃度は組
み換えウィルスがS、フルギにルグ単層と大体同程度に
T、ni単層にも伝染性であることを示した。
はまたAcNPV複製を許容する他の昆虫細胞によって
も発現される。例えば、鱗翅目ヤガ科のTrichop
lusia ni、 TN−368から誘導された細胞
ラインは0.26%トリプトースブロス、10%ウソ胎
児血清、2mML−グルタミンおよび抗生−抗真菌性製
剤(Gibco)を補足したTO−100培地(微生物
学協会)中で増殖させた。この細胞ラインの単層は・組
み換えウィルスLIGP−gal 3 の種々の希釈
物で感染させ、そして120μ&/rneのβ−ガラク
トシダーゼ用発色指示薬X−galを含有するアガロー
ス−培地で覆った。この単層は27℃で4日間インキュ
ベートし、次いで平板を37℃に4〜6時間暖めること
によって発色させた。ポリヘトゝリン/β−ガラクトシ
ダーゼ融合タン・ξり質の発現は′r、n1単層上の鮮
明な青色プラークにより確認された。この滴定濃度は組
み換えウィルスがS、フルギにルグ単層と大体同程度に
T、ni単層にも伝染性であることを示した。
実施例3
遺伝子操作の適用のい(つかの型にとって、パラセンジ
ャー遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下にベク
ター内に挿入することが有利であるだろう。1つのこの
種の適用において、トランスプレイスメ/トベクター
プラスミドゝ pGP−B6874/Sa、] が作
られた。このプラスミドは大腸菌HBIOI 内に挿
入され、このす/プルはthe American T
ype Cu1ture Co11ecti、On K
ATCC番号3t/rqoとして寄託された。このズク
ターは・ξツセノジャーDNAをそれ自体のプロモータ
ーまたは他の外来プロモーターの制御下に挿入するため
の1つのPst I部位を提供し、そしてこの組み換え
プラスミドはAcNPV内に挿入され、組み換えウィル
スを選択するための手段としては゛青色゛プラークが使
用される。
ャー遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下にベク
ター内に挿入することが有利であるだろう。1つのこの
種の適用において、トランスプレイスメ/トベクター
プラスミドゝ pGP−B6874/Sa、] が作
られた。このプラスミドは大腸菌HBIOI 内に挿
入され、このす/プルはthe American T
ype Cu1ture Co11ecti、On K
ATCC番号3t/rqoとして寄託された。このズク
ターは・ξツセノジャーDNAをそれ自体のプロモータ
ーまたは他の外来プロモーターの制御下に挿入するため
の1つのPst I部位を提供し、そしてこの組み換え
プラスミドはAcNPV内に挿入され、組み換えウィル
スを選択するための手段としては゛青色゛プラークが使
用される。
第4図ニ示すれるpGP−B6874/Sal プラ
スミドゝはpGP−’B6B74 を制限エツトヌク
レアーゼSal■ で部分消化し、そして低いDNA
濃度で再結合させることによって作製された。大腸菌H
BIOI の形質転換後、青色コロニーがカナマイシ
ン平板上で選択され、次いでア/ピノリノに対する感受
性について試験された。Am p8* ’ Ka n
Rhf色コロニーのプラスミドゝは制限エンド9ヌクレ
アービ分析によってその性状が確認された。pcp −
B6874/Sa] プラスミドはEcoRニー I(
S) (7)Sal I 部位に1.acZ(β−ガ
ラクトノダーゼ遺伝子、 ” Z ” ) lac
y、 (”y”)を含むβ−gal 。
スミドゝはpGP−’B6B74 を制限エツトヌク
レアーゼSal■ で部分消化し、そして低いDNA
濃度で再結合させることによって作製された。大腸菌H
BIOI の形質転換後、青色コロニーがカナマイシ
ン平板上で選択され、次いでア/ピノリノに対する感受
性について試験された。Am p8* ’ Ka n
Rhf色コロニーのプラスミドゝは制限エンド9ヌクレ
アービ分析によってその性状が確認された。pcp −
B6874/Sa] プラスミドはEcoRニー I(
S) (7)Sal I 部位に1.acZ(β−ガ
ラクトノダーゼ遺伝子、 ” Z ” ) lac
y、 (”y”)を含むβ−gal 。
Rep およびKanR遺伝子の各鎮域を含むことが
ワカッタ。])]GP−B6874/Salプラスミド
は本質的にpGP−86874の場合のようK J +
)ヘドリノ遺伝子のN末端およびC末端に結合されたp
McB74 である。Pst I 部位はβ−ガラ
ク]・シダーゼ発現または大腸菌内での複製にとって本
質的でない。pGP−、B 6874 /Salを含有
する大腸菌はX −gal平板とで青色であり、またM
aconkey平板とで赤色である。
ワカッタ。])]GP−B6874/Salプラスミド
は本質的にpGP−86874の場合のようK J +
)ヘドリノ遺伝子のN末端およびC末端に結合されたp
McB74 である。Pst I 部位はβ−ガラ
ク]・シダーゼ発現または大腸菌内での複製にとって本
質的でない。pGP−、B 6874 /Salを含有
する大腸菌はX −gal平板とで青色であり、またM
aconkey平板とで赤色である。
こうして、トランスプレイスメノトブラスミト51)G
P−B6874/Salが作うtt、ソL−icコレは
、eクセ/ジャー遺伝子(それら自体のプロモーターの
制御下にある)をもつ組み換えウィルスの挿入および選
択を容易にするために使用することができる。パラ七/
ジャー遺伝子はこのプラスミドの大腸菌複製遺伝子に一
番近い特異なPst I 部位に挿入され、そして大
腸菌内でクローン化される。
P−B6874/Salが作うtt、ソL−icコレは
、eクセ/ジャー遺伝子(それら自体のプロモーターの
制御下にある)をもつ組み換えウィルスの挿入および選
択を容易にするために使用することができる。パラ七/
ジャー遺伝子はこのプラスミドの大腸菌複製遺伝子に一
番近い特異なPst I 部位に挿入され、そして大
腸菌内でクローン化される。
得られたプラスミドと野性型AcN P Vとの同時ト
ランスフェクンヨンおよびその後の青色ウィルスの選択
は組み換えウィルスの選択を容易にするだろう。
ランスフェクンヨンおよびその後の青色ウィルスの選択
は組み換えウィルスの選択を容易にするだろう。
pGP−B6874/Sal のトランスプレイスメ
ノトベクターとしての利用性を立証しかつ外来プロモー
ターの有益な使用を立証するために、外来プロモーター
R8V−LTRに結合したクロラムフエニコールアセチ
ルトラノスフエラ−t(CAT)をコードする大腸菌遺
伝子をpGP−B6874/Sal内に挿入した。この
作製のための略図を第7図に示す。プラスミド’pR3
V−CAT (GormanらのProc、 Natl
。Acad、 5CI−e 79,6777(1982
) を参照)はPst I およびBam HIで
消化した。トランスプレイスメノトプラスミドpcp−
B 6874 / Sad、はPst I で消化し
、’BamHIで部分的に消化した。2つの制限エツト
ヌクレアーゼ−消化プラスミドを混合して結合させた。
ノトベクターとしての利用性を立証しかつ外来プロモー
ターの有益な使用を立証するために、外来プロモーター
R8V−LTRに結合したクロラムフエニコールアセチ
ルトラノスフエラ−t(CAT)をコードする大腸菌遺
伝子をpGP−B6874/Sal内に挿入した。この
作製のための略図を第7図に示す。プラスミド’pR3
V−CAT (GormanらのProc、 Natl
。Acad、 5CI−e 79,6777(1982
) を参照)はPst I およびBam HIで
消化した。トランスプレイスメノトプラスミドpcp−
B 6874 / Sad、はPst I で消化し
、’BamHIで部分的に消化した。2つの制限エツト
ヌクレアーゼ−消化プラスミドを混合して結合させた。
得られた組み換えプラスミドを形質転換によって大腸菌
に導入し、1aC+コロニーを最少培地」二で選択した
。プラスミ)pL+c−1(第7図参照)が単離されて
、その構造は制限エノビヌクレアーゼ分析で確かめられ
た。
に導入し、1aC+コロニーを最少培地」二で選択した
。プラスミ)pL+c−1(第7図参照)が単離されて
、その構造は制限エノビヌクレアーゼ分析で確かめられ
た。
S、フルギベルダ細胞の単層はAcNPV L−ID
NAおよびpLC−j DNA の1:100混合物
を用いてトランスフェクトされた。青色プラークを形成
させかつ○Vを欠くウィルスが選択された。
NAおよびpLC−j DNA の1:100混合物
を用いてトランスフェクトされた。青色プラークを形成
させかつ○Vを欠くウィルスが選択された。
ウィルス AcNPV Ll−R8V−CAT が
単p9.され、そして制限エツトヌクレアーゼ分析によ
ってlac Z 、 lac Y、 への少Yr
くとも一部、(”A”)。
単p9.され、そして制限エツトヌクレアーゼ分析によ
ってlac Z 、 lac Y、 への少Yr
くとも一部、(”A”)。
Ori (複製開始点、時々” r e p ”と呼ば
れる)およびR3V−LTR−CATのpLC−x遺伝
子を含むことが見出された。
れる)およびR3V−LTR−CATのpLC−x遺伝
子を含むことが見出された。
AcNPV−Ll−R3V−CAT ライ/L、 ス
ハGormanらの上記文献記載の方法でCAT活性を
検定することによって示されるごと(、感染後2時間゛
という早い時期KCAT遺伝子を発現させた。
ハGormanらの上記文献記載の方法でCAT活性を
検定することによって示されるごと(、感染後2時間゛
という早い時期KCAT遺伝子を発現させた。
活性は感染の2時間後に初めて観察され、そして感染後
6〜12時間の間増加し続けた。こうして、外来プロモ
ーターR8V−LTRは昆虫細胞内で外来遺伝子を発現
させるのに使用することができる。その」二、外来プロ
モータは感染の初期に外来遺伝子を発現させるのに使用
することができる。
6〜12時間の間増加し続けた。こうして、外来プロモ
ーターR8V−LTRは昆虫細胞内で外来遺伝子を発現
させるのに使用することができる。その」二、外来プロ
モータは感染の初期に外来遺伝子を発現させるのに使用
することができる。
AcN P Vの多くの特徴はこのウィルスを後生動物
環境内での・ξツ七/ジャー遺伝子の増殖ならびに発現
のための優れた宿主/ベクターとさせる。
環境内での・ξツ七/ジャー遺伝子の増殖ならびに発現
のための優れた宿主/ベクターとさせる。
桿状カプシドは大きく広がって追加のDNA配列を収容
し、そしてベクターの収容能力は100キロ塩基を超え
ることができる。細胞外ウィルスは細胞培養において伝
染性形体であるので、内蔵のための遺伝子は必要でない
。、f リヘドリノまたは7.2Kゾロテイノをコード
化する遺伝子は、それらが感染後18〜72時間の間に
豊富に発現されるので、・ξツセノジャー遺伝子挿入の
ための理想的な部位である。感染後期には、これらのタ
ノ・ξり質は感染細胞の全タノパク質の20%またはそ
れ以上を構成しうる。ポリヘドリンおよび7.2 Kプ
ロティン遺伝子のAcNPV物理地図」二の位置および
転写の方向は知られている。12キロ塩基のポリヘドリ
ン メノセノジャーRNAの合成は一時的に制御されて
、感染12時間後に初めて検出される。ポリヘトす/プ
ロモーターからの遅い発現(感染の18時間後)は細胞
毒の遺伝子産物を発現させる際疋特に都合がよい。
し、そしてベクターの収容能力は100キロ塩基を超え
ることができる。細胞外ウィルスは細胞培養において伝
染性形体であるので、内蔵のための遺伝子は必要でない
。、f リヘドリノまたは7.2Kゾロテイノをコード
化する遺伝子は、それらが感染後18〜72時間の間に
豊富に発現されるので、・ξツセノジャー遺伝子挿入の
ための理想的な部位である。感染後期には、これらのタ
ノ・ξり質は感染細胞の全タノパク質の20%またはそ
れ以上を構成しうる。ポリヘドリンおよび7.2 Kプ
ロティン遺伝子のAcNPV物理地図」二の位置および
転写の方向は知られている。12キロ塩基のポリヘドリ
ン メノセノジャーRNAの合成は一時的に制御されて
、感染12時間後に初めて検出される。ポリヘトす/プ
ロモーターからの遅い発現(感染の18時間後)は細胞
毒の遺伝子産物を発現させる際疋特に都合がよい。
上記実施例はAcN P Vが上首尾で遺伝子操作され
かつ組み換えDNAベクターとして用いることができる
ことを証明する。実施例はまたポリヘドリノプロモータ
ーおよび他のプロモーターが大腸菌のβ−ガラクトノダ
ーゼのごときパラセンジャ−DNAを高水準で発現させ
つることを立証する。
かつ組み換えDNAベクターとして用いることができる
ことを証明する。実施例はまたポリヘドリノプロモータ
ーおよび他のプロモーターが大腸菌のβ−ガラクトノダ
ーゼのごときパラセンジャ−DNAを高水準で発現させ
つることを立証する。
得られたβ−ガラクトノダーゼの比活性は、出願人の知
る限りでは、原核細胞または真核細胞の他の発現系にお
いて以前報告されたもののどれよりも著しく高い。
る限りでは、原核細胞または真核細胞の他の発現系にお
いて以前報告されたもののどれよりも著しく高い。
この他の利点および修飾は本発明の上記開示または実施
例を考察することにより当業者にとって容易に推察でき
ることであり、本発明は添けの特許請求の範囲にのみ限
定されるものである。
例を考察することにより当業者にとって容易に推察でき
ることであり、本発明は添けの特許請求の範囲にのみ限
定されるものである。
第1図はバクロウィルス AcN P Vの物理地図お
よび遺伝子構成を示す図である。 ゛第2図はAcN
PVのL−1変異株の環状DN’Aにおける制限エツト
ヌクレアーゼ認識部位を線状に表示した図である。 第3図はpEXs942 プラスミドDNAの物理地
図である。 第4図はpGP −B 6874 / Sal プラ
スミドDNAの物理地図である。 第5図はpGP−B6874 プラス<ドDNAの物
理地図である。 第6図はAcNPV LIGP−gal 3 のPs
t IおよびBamHIパター7を示す写真である。 第7図は!・ランスグレイスメノj・ベクタートシて使
用されるpcP−B6874/Sal (7)作製図
を表わし、ここでトランスプレイスメ/トベクターの外
来パラセンジャーDN、Aはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを発現しかつラウス肉腫ウィル
スから得られてこの中に組み込まれた外来プロモーター
R8V−LTRの制御下にある。 (外5名) 狗fl坩m Acl#IPV−LI ON^FIG、2
%す“ツムcoRI −)翻R p R つ 4.8 図面の浄書(内容に変更なし〕 Pstl BamHI 第6図 手続補正書(方式) 昭和乙O年隼ケ 願第 /22ρ2 号3補正をする
者 事件との関係 出 願 人 住所 4、代理人 五゛ん (7)1貼′:fに1船坏P/!r−’;)5゜トイ
−L〜 =4只ρ
よび遺伝子構成を示す図である。 ゛第2図はAcN
PVのL−1変異株の環状DN’Aにおける制限エツト
ヌクレアーゼ認識部位を線状に表示した図である。 第3図はpEXs942 プラスミドDNAの物理地
図である。 第4図はpGP −B 6874 / Sal プラ
スミドDNAの物理地図である。 第5図はpGP−B6874 プラス<ドDNAの物
理地図である。 第6図はAcNPV LIGP−gal 3 のPs
t IおよびBamHIパター7を示す写真である。 第7図は!・ランスグレイスメノj・ベクタートシて使
用されるpcP−B6874/Sal (7)作製図
を表わし、ここでトランスプレイスメ/トベクターの外
来パラセンジャーDN、Aはクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼを発現しかつラウス肉腫ウィル
スから得られてこの中に組み込まれた外来プロモーター
R8V−LTRの制御下にある。 (外5名) 狗fl坩m Acl#IPV−LI ON^FIG、2
%す“ツムcoRI −)翻R p R つ 4.8 図面の浄書(内容に変更なし〕 Pstl BamHI 第6図 手続補正書(方式) 昭和乙O年隼ケ 願第 /22ρ2 号3補正をする
者 事件との関係 出 願 人 住所 4、代理人 五゛ん (7)1貼′:fに1船坏P/!r−’;)5゜トイ
−L〜 =4只ρ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)昆虫細胞による遺伝子産物の産生に使用するベク
ターであって、遺伝子産物の発現をコードしかつ昆虫細
胞による遺伝子産物の発現を開始させるプロモーターの
制御下にある外来遺伝子セグメントを含むベクター。 (2)該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲第
1項記載のベクター。 (3)該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求の
範囲第2項記載のベクター。 (4)該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシス
ウイルスからなる特許請求の範囲第3項記載のベクター
。 (5)該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは¥アウ
トグラファ¥ ¥カリフォルニカ¥(¥Autogra
phacalifornica¥)ヌクレア−ポリヘド
ローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請求の
範囲第4項記載のベクター。 (6)該プロモーターはウイルスのプロモーターからな
る特許請求の範囲第1項記載のベクター。 (7)該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期に
活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させるプロモー
ターである、特許請求の範囲第6項記載のベクター。 (8)該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモー
ターからなる特許請求の範囲第7項記載のベクター。 (9)該ウイルスプロモーターは7.2Kプロモーター
からなる特許請求の範囲第7項記載のベクタ(10)該
プロモーターはウイルス生長の初期に活性化されてウイ
ルス遺伝子産物を産生させるプロモーターである、特許
請求の範囲第1項記載のベクター。 (11)該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターからなる特許請求の範囲第1項記載のベ
クター。 (12)該外来セグメントは容易に検出できる遺伝子産
物の発現をコードする遺伝子セグメントからなる、特許
請求の範囲第1項記載のベクター。 (13)容易に検出できる該遺伝子産物は抗生物質に対
して耐性を示すタンパク質または指示薬と反応して検出
可能な物理的変化をもたらすタンパク質からなる、特許
請求の範囲第12項記載のベクター。 (14)該ベクターはプラスミドpGTP−B6874
からなる特許請求の範囲第1項記載のベクター。 (15)該ベクターはプラスミドpGP−B6874/
SALからなる特許請求の範囲第1項記載のベクター。 (16)該ベクターはプラスミドpLC−1からなる特
許請求の範囲第1項記載のベクター。 (17)外来遺伝子セグメントをDNAセグメントに挿
入してベクターを形成させることからなる昆虫細胞内で
の使用に適する発現ベクターの調製方法であって、上記
の挿入が昆虫細胞による遺伝子産物の発現を開始させる
プロモーターにより制御されるDNAセグメントの領域
内で行われることを特徴とする上記ベクターの調製方法
。 (18)該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第17項記載の方法。 (19)該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第18項記載の方法。 (20)該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第19項記載の方法
。 (21)該DNAセグメントは昆虫細胞内で複製するウ
イルスから誘導されかつ遺伝子領域およびその遺伝子領
域によってコードされる遺伝子産物の発現を制御するプ
ロモーター領域を含み、その挿入が該DNAセグメント
を含むプラスミドを準備し、該DNAセグメントの遺伝
子領域に外来遺伝子セグメントを挿入して組み換えプラ
スミドベクターを形成させることにより行われる、特許
請求の範囲第17項記載の方法。 (22)該ウイルスベクターは、組み換えプラスミドベ
クターと昆虫細胞内で複製するウイルスとを接触させ、
外来遺伝子セグメントによってコードされる遺伝子産物
を発現する目的のウイルスを選択することにより形成さ
れる、特許請求の範囲第21項記載の方法。 (23)該ウイルスはバクロウイルスであり、該DNA
セグメントはポリヘドリンプロモーターおよび少なくと
もポリヘドリン遺伝子の一部を含み、挿入がポリヘドリ
ン遺伝子領域内の部位でおこる、特許請求の範囲第22
項記載の方法。 (24)該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第23項記載の方法
。 (25)該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは¥ア
ウトグラファ¥ ¥カリフォルニカ¥ ヌクレア−ポリ
ヘドローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請
求の範囲第24項記載の方法。 (26)該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第18項記載の方法。 (27)該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させる、特許
請求の範囲第26項記載の方法。 (28)該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第27項記載の方法。 (29)該ウイルスプロモーターは7.2Kプロモータ
ーである特許請求の範囲第27項記載の方法。 (30)該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されるウイルスプロモーターである特許請求の範囲第1
8項記載の方法。 (31)該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第18項記載の方
法。 (32)昆虫細胞内に、遺伝子産物の発現をコードしか
つ昆虫細胞内での遺伝子産物の発現を開始させるプロモ
ーターの制御下にある外来遺伝子セグメントを含むベク
ターを挿入し、該昆虫細胞を遺伝子産物の発現に好適な
条件下培養し、そして発現された遺伝子産物を回収する
ことからなる遺伝子産物の産生方法。 (33)該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第32項記載の方法。 (34)該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第33項記載の方法。 (35)該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第34項記載の方法
。 (36)該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは¥ア
ウトグラファ¥ ¥カリフォルニカ¥ ヌクレア−ポリ
ヘドローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請
求の範囲第35項記載の方法。 (37)該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第33項記載の方法。 (38)該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルス遺伝子産物を産生させるプロモ
ーターである、特許請求の範囲第37項記載の方法。 (39)該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第38項記載の方法。 (41)該プロモーターは7.2Kプロモーターである
特許請求の範囲第38項記載の方法。 (41)該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されてウイルス遺伝子産物を産生させるウイルスプロモ
ーターである特許請求の範囲第33項記載の方法。 (42)該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第33項記載の方
法。 (43)特許請求の範囲第33項記載の方法により産生
された遺伝子産物。 (44)遺伝子産物の発現をコードしかつ昆虫細胞内で
の遺伝子産物の発現を開始させるプロモーターの制御下
にある外来遺伝子セグメントを含むベクターを挿入させ
た昆虫宿主細胞からなる遺伝子産物源。 (45)該ベクターはウイルスからなる特許請求の範囲
第44項記載の遺伝子産物源。 (46)該ウイルスはバクロウイルスからなる特許請求
の範囲第45項記載の遺伝子産物源。 (47)該バクロウイルスはヌクレア−ポリヘドローシ
スウイルスからなる特許請求の範囲第46項記載の遺伝
子産物源。 (48)該ヌクレア−ポリヘドローシスウイルスは¥ア
ウトグラファ カリフォルニカ¥ ヌクレア−ポリヘド
ローシスウイルスまたはその変異株からなる特許請求の
範囲第47項記載の遺伝子産物源。 (49)該プロモーターはウイルスプロモーターからな
る特許請求の範囲第45項記載の遺伝子産物源。 (50)該ウイルスプロモーターはウイルス生長の後期
に活性化されてウイルスポリペプチドを産生させるプロ
モーターである特許請求の範囲第49項記載の遺伝子産
物源。 (51)該ウイルスプロモーターはポリヘドリンプロモ
ーターである特許請求の範囲第50項記載の遺伝子産物
源。 (52)該ウイルスプロモーターは7.2Kプロモータ
ーである特許請求の範囲第50項記載の遺伝子産物源。 (53)該プロモーターはウイルス生長の初期に活性化
されてウイルス遺伝子産物を産生させるウイルスプロモ
ーターである特許請求の範囲第45項記載の遺伝子産物
源。 (54)該プロモーターは昆虫細胞内で活性化される外
来プロモーターである特許請求の範囲第45項記載の遺
伝子産物源。
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