NL8800198A - Baculovirus voor de bestrijding van insekten. - Google Patents

Description

U.0. 348S3 %

Baculovirus voor de bestrijding van insekten.

De uitvinding heeft betrekking op een baculovirus met verbeterde insektendodende eigenschappen.

5 De bestrijding van insekten met chemische middelen (gifstoffen) heeft als nadelen een geringe specificiteit, het ontstaan van resistentie tegen de gifstoffen bij de te bestrijden insekten, milieubederf en gevaren voor de gezondheid van mens en dier. Insektenbestrijding met biologische middelen (roofvijanden, parasieten, micro-organismen zoals ÏO bacteriën, virussen en fungi) heeft deze nadelen in veel mindere mate, maar wordt daarentegen gehinderd door problemen als een geringe beschikbaarheid of geringe effektiviteit van bestrijdende organismen, hoge kosten en dergelijke, waardoor toch vaak de oplossing moet worden gezocht in een combinatie met chemische middelen. Er is dus behoefte aan een 15 verbeterde methode van biologische insektenbestrijding.

Van de virussen zijn voor de insektenbestrijding de baculovirussen aantrekkelijk, omdat zij in de natuur voorkomen, slechts infectieus zijn voor insekten en dus onschadelijk voor gewervelde dieren.

In de Europese octrooiaanvragen 127.839 en 155.476 worden vectoren 20 beschreven die een exogeen gensegment bevatten dat in insektencellen leidt tot expressie van het genprodukt, zoals een eiwit, waarvoor het gensegment codeert. Als vector wordt een baculovirus, in het bijzonder het kernpolyedervirus van Autographa californica, gebruikt. Baculovirussen hebben een aantal unieke eigenschappen waardoor zij interessant zijn 25 als eukaryotische expressievectoren. In met baculovirus besmette cellen ontstaan op min of meer vaste tijdstippen twee infectleuze vormen van het virus. De extracellulaire virusvorm wordt spoedig na infectie geproduceerd en bestaat uit een enkelvoudig nucleocapside dat wordt omgeven door een omhulsel dat wordt verkregen via het celmembraan. Deze vorm is 30 verantwoordelijk voor de systemische verspreiding van cel tot cel in de larve en in celkweek. De tweede infectieuze vorm wordt laat na infectie in de vorm van polyeders gesynthetiseerd, waarbij virusdeeltjes zijn opgesloten in een omvangrijk insluitlichaam, de polyeder. Dit is de voor larven infectieuze vorm. Andere bijzondere eigenschappen zijn dat het 35 virale DNA-genoom ruimte biedt voor extra genetisch materiaal, dat de zeer laat tot expressie komende genen niet nodig zijn voor de replicatie van het extracellulaire virus en dat deze genen zeer sterk tot expressie worden gebracht.

Het genoom van het meervoudig omhulde kernpolyedervirus van Auto-40 grapha californica (AcMNPV) bestaat uit een dubbelstrengs, covalent ge- ,8800198 * 2 sloten circulair DNA met een lengte van ongeveer 130.000 base-paren (130 kbp) (J.M. Vlak en K.G. Odink, J.Gen.Virol. 44 (1979), 333-347). In een laat stadium van infectie van Spodoptera frugiperda-cellen door AcMNPV worden twee eiwitten overvloedig gesynthetiseerd, namelijk polyhedrine 5 (p33) en een eiwit met een molecuulmassa van ongeveer 10.000 (aangeduid als 10K of plO; vroeger ook als 7,2 K; zie J.M. Vlak, G.E. Smith, M.D. Summers, Journal of Virology 40, 762 (1981); 44, 199 (1982) en 45, 215 (1983)). Polyhedrine is het hoofdbestanddeel van de eiwitcapsules en wordt uitsluitend aangetroffen in de kern van met het virus geïnfecteer-10 de cellen.

Het is bekend (G.E. Smith et al., J.Virology 46, 584 (1983)) dat het polyhedrine-gen van AcMNPV niet essentieel is voor de replicatie van het virus. In verband met de sterke promoter van het polyhedrinegen is voorgesteld dit gen te gebruiken om er vreemde pro- en eukaryotische 15 genen in te bouwen en deze in insektencellen tot overvloedige expressie te laten komen (EP-A 155.476 en 127.839). Dat vreemde genprodukten ook worden geglycosyleerd en aldus functionele produkten opleveren vormt een verder voordeel van het expressievectorsysteem van baculovirussen.

Het gen voor plO is gelokaliseerd op het fragment EcoRI-P van het 20 DNA van AcMNPV door middel van hybridisatie en selectie en jm vitro translatie van RNA geïnfecteerde cellen. De nucleotidenvolgorde van het plO gen en de aansluitende nucleotidensequentie aan het 5'-einde zijn bekend en de wijze van transcriptie is onderzocht. De sequentie van het plO-gen bleek een open leesraam van 279 base-paren te bevatten, dat co-25 deert voor een polypeptide van 93 aminozuurresten. Het promotergebied van het plO-gen bevat sterk geconserveerde sequenties die in alle andere late, in sterke mate overgeschreven polyhedrine- en plO-genen van het baculovirus waarvan de sequentie is vastgesteld, worden aangetroffen. [Zie onder meer J.M.Vlak en G.F.Fohrmann "The Nature of Polyhedrin" in 30 "Viral Pesticides for Biological Control" K.E. Sherman en K. Maramo-rosch, Editors; Academic Press, N.Y. (1985), biz. 489-542].

Gevonden werd nu, dat een baculovirus, waarvan het genoom zodanig is gemodificeerd dat bij de replicatie van het virus wel polyeders worden geproduceerd, doch een de polyeders omhullend membraan niet of niet 35 volledig wordt ontwikkeld, aanmerkelijk virulenter is dan een baculovirus, waarvan de polyeders in een membraan zijn opgesloten. Onder de term "polyeders" worden in deze beschrijving niet alleen polyedrische in-sluitlichamen van baculovirussen verstaan, doch ook insluitlichamen die een andere vorm bezitten, zoals granules. De uitvinding betreft in de 40 eerste plaats een dergelijk gemodificeerd baculovirus, dat geen poly- .8800198 3 edermembraan bevat. Een voordeel van dit baculovirus volgens de uitvin- * ding, ten opzichte van een baculovirus waarvan het voor de expressie van het p33-eiwit (polyhedrine) coderende gen is gedefunctionaliseerd, is dat de occlusielichamen (polyeders) van het virus intact zijn. Zoals be-5 kend kan het virus zich slechts verspreiden onder insekten, wanneer de polyeders, waarin de virionen zijn opgesloten, desintegreren. Dit geschiedt bijvoorbeeld in het alkalische milieu van het spijsverteringskanaal van insekten. Het polyedermembraan, dat bij baculovirussen van het wilde type aanwezig is, vormt een barrière voor volledige desintegratie.

10 De virussen volgens de uitvinding, waarvan de polyeders, die de virionen bevatten, niet door een membraan omhuld zijn, kunnen zich even gemakkelijk in een insektenpopulatie verspreiden als virussen van het wilde type.

Het is aannemelijk, dat verscheidene genen een rol spelen bij de 15 vorming van het membraan van de polyedercapsule. Het baculovirus volgens de uitvinding is dan ook gekenmerkt doordat in het genoom ten minste één van deze genen gedefunctionaliseerd is.

Verder werd gevonden, dat bij baculovirussen, waarvan het plO-gen gedefunctionaliseerd is, het membraan rondom de polyeders ontbreekt. Ba-20 culovirussen met een gedefunctionaliseerd plO-gen vormen dan ook een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding. Gebleken is, dat baculo virussen met gedefunctionaliseerd plO-gen ten minste tweemaal zo virulent zijn als het overeenkomstige natuurlijke virus.

Het baculovirus volgens de uitvinding, dat een gedefunctionaliseerd 25 polyedermembraangen bezit, is bij voorkeur een kernpolyedervirus, zoals een meervoudig omhuld kernpolyedervirus, hoewel ook andere baculovirussen, zoals granulavirussen in aanmerking komen. Bij voorkeur is het virus een gemodificeerd kernpolyedervirus van Autographa californica, in het bijzonder een dergelijk virus, waarvan het voor de expressie van het 30 plO-eiwit coderende gen is gedefunctionaliseerd.

Het bij de polyedermembraansynthese betrokken gen van de baculovirussen volgens de uitvinding kan op verschillende wijze gedefunctionaliseerd zijn. Het desbetreffende gen kan een deletie of een insertie bevatten, of ook geheel ontbreken of vervangen zijn door een andere nu-35 cleotidensequentie. De modificaties kunnen op bekende wijze in een dergelijk gen worden aangebracht. Zo kan men in het geval van het plO-gen eerst een transfervector construeren, die het plO-gen bevat. Het plO-gen bevat een unieke restrictieplaats voor BglII. De vector wordt met BglII geopend en er wordt op bekende wijze een insertie met een markergen, zo-40 als het LacZ-gen van j£. coli, ingevoegd. De constructie van deze vecto- . 8800198 ' 4 ren is toegelicht in fig. 1 en 2. De recombinanten die het markergen LacZ bevatten, kunnen gemakkelijk worden opgespoord omdat ze ^-galacto-sidase produceren. Deze gemerkte recombinanten worden hier recombinanten van type I genoemd.

5 Vervolgens construeert men een vector die het plO-gen van het wilde type omvat en brengt in het plO-gen een defunctionaliserende modificatie aan. Deze modificatie kan een deletie of een insertie zijn of ook een vervanging (substitutie) van het geheel of een deel van de nucleotiden-sequentie van het gen. Het zo verkregen, gemodificeerde DNA-fragment 10 wordt dan uitgewisseld tegen het segment van de recombinant van type I, dat het /3-galactosidasegen omvat. Men verkrijgt dan een baculovirusre-combinant van type II, die van de virussen die geen recombinatie hebben ondergaan, kunnen worden onderscheiden doordat de recombinanten van type II geen /3-galactosidase produceren.

15 Het is uiteraard niet noodzakelijk de recombinanten van type II via de gemerkte recombinanten van type I te construeren. Men kan bijvoorbeeld ook transfervectoren gebruiken, waarin de volledige, voor plO coderende nucleotidensequentie is verwijderd en vervangen door een sequentie waarin één of meer kloneringsplaatsen aanwezig zijn. De hieruit re-20 sulterende recombinanten kunnen worden opgespoord op grond van de aanwezigheid van de ingevoerde unieke nucleotidensequentie, door toepassing van Southern Blot hybridisatie. Bovengenoemde transfervectoren met unieke kloneringsplaatsen kunnen bovendien gebruikt worden voor het overbrengen van "vreemde" genen in recombinanten, die met bekende immunolo-25 gische technieken, bijvoorbeeld Western Blotting, kunnen worden opgespoord.

De uitvinding betreft tevens transfervectoren, die geschikt zijn voor het construeren van een baculovirus volgens de uitvinding, welke vectoren een gedefunctionaliseerd baculovirusgen dat betrokken is bij de 30 opbouw van het polyedermembraan van het virus, omvat. Dit gen is in het bijzonder een gedefunctionaliseerd plO-gen en kan gedefunctionaliseerd zijn door een deletie of een insertie in, of door gehele of gedeeltelijke substitutie van de nucleotidensequentie van het gen.

Vectoren, waarin de zich in het oorspronkelijke gen tussen de 35 start- en stopcodons bevindende sequentie geheel is verwijderd of vervangen is door een andere sequentie, verdienen de voorkeur. Indien een vervangende sequentie aanwezig is, verdient het de voorkeur dat deze een restrictieplaats omvat, omdat herkenning van de met de vector geconstrueerde recombinanten dan gemakkelijker is. Een voorbeeld van een vervan-40 gende sequentie heeft de formule 5'-GATCC-3'. Een vector die deze se- .8800198 4 5 quentie omvat wordt geïllustreerd in fig. 7. Deze transfervector, die pJJ-1 genoemd is, wordt gekenmerkt door deletie van de volledig coderende nucleotidensequentie van het plO-gen, waarbij de start- en stopco-dons, ATG resp. TAA, behouden zijn gebleven en op deze plaats een her-5 kenningssequentie voor het resttictie-enzym BamHI (GATTC) is ontstaan.

Uiteraard kan bet startcodon van een polyedermembraangen ook geheel of gedeeltelijk gedeleteerd zijn. Door een dergelijke deletie wordt bet gen ook gedefunctionaliseerd. Een vector, waarin een op die wijze gedeleteerd gen aanwezig is en waarin tevens de volledige coderende nucleo-10 tidensequentie van het plO-gen is vervangen door een andere sequentie, die drie door restrictie-enzymen herkenbare unieke sequenties omvat, wordt geïllustreerd in fig. 8. Deze vector is pJJ-2 genoemd. Daarin is de nucleotidensequentie van het plO-gen, inclusief de start- en stopco-dons, vervangen door de sequentie met de formule 15 5'-AGGATCCCTGAACCCGGGAAGCTTTAA-3'.

Met deze vectoren kunnen recombinanten volgens de uitvinding worden geconstrueerd, die geen plö meer produceren. De in het genoom van de recombinanten geïntroduceerde unieke restrictieherkenningsplaatsen vergemakkelijken de herkenning daarvan.

20 Tenslotte betreft de uitvinding de toepassing van de baculovirussen volgens de uitvinding voor de bestrijding van insekten. Deze bestrijding geschiedt op bekende wijze, in het algemeen door de virussen aan te brengen op de te beschermen planten, zodanig dat het virus door de insekten, bijvoorbeeld via bladvraat, kan worden opgenomen. Ook betreft de 25 uitvinding preparaten die geschikt zijn voor de bestrijding van insekten en die een baculovirus volgens de uitvinding bevatten. De bereiding van dergelijke preparaten kan op op zichzelf bekende wijze plaatsvinden.

Voorbeeld I

30 Opbouw van het transferplasmide pAcR159Z en isolatie van AcMNPV/plOZ- recombinanten___

Het plasmide pAcRl59, een gekloonde kopie van het fragment EcoRX-P van AcMNPV waarop het plO-gen is gelokaliseerd, en dat 1950 baseparen (bp) bevat, werd verkregen volgens G.E. Smith et al.,J. Virology 45, 215 35 (1983). Dit plasmide heeft een enkele restrictieplaats voor het restric- tie-enzym BglII (zie figuur 1). Deze plaats bevindt zich op 153 bp voorbij het ATG-startcodon van het pJO-gen. Het gelineariseerde plasmide werd stomp gemaakt met behulp van het Klenow-fragment van E.coli polymerase I en werd met T4 ligase geligeerd aan het stomp gemaakte BamHI-40 fragment van 3050 bp van pMC1871, dat de voor LacZ (/3-galactosidase) 8800198 6 coderende sequentie bevat. Hieruit ontstond de transfervector pAcRl59Z (figuur 1). De juiste oriëntatie van het LacZ-gen ten opzichte van de plO-promoter werd gecontroleerd aan de hand van de asymmetrische Sstl-plaats in het LacZ-gen. Als gevolg van de ligatie werden de 51 N-termi-5 nale aminozuren van plO eindigend met lie (ATC), gevolgd door Asp (GAT) en Pro (CCC) van de BglIl/BamHI-ligatie met stomp uiteinde, in fase gekoppeld aan 1015 aminozuren van het LacZ-eiwit dat begint met Val (GTC) (zie figuur 2). Het LacZ-gen bevat drie translatie-stopcodons en wordt gevolgd door afgeknotte C-terminale einden van het plO-gen dat onver-10 taald blijft.

Het plO-LacZ-fusiegen werd overgebracht op AcMNPV door co-transfec-tie van S^. frugiperda-cellen (cellijn IPLB-Sf-21) met AcMNPV-DNA van het wilde type en de trans fervector pAcRl59Z. Vijf /ug van het plasmide en 0,1 /ug AcMNPV-DNA werden toegevoegd aan 2x10-* frugiperda-cellen 3 5 in Petrischalen van 35 mm. Na 1 uur incubatie werden de cellen bedekt met vloeibaar medium. Na 3 dagen bij 27'C werd het extracellulaire virus bij geschikte verdunningen getitreerd zodat in een conventionele plaque-bepaling gescheiden plaques werden verkregen. Na 4 dagen bij 27°C werd de agar bedekt met 200 /ul TNMF-medium dat 2 mg per ml van de /3-ga-20 lactosidase-indicator 5-broom-4-chloor-3-indolyl-/^ -d-galactopyranoside (X-gal) bevatte. Plaques van recombinanten werden herkend aan de blauwe kleur en geselecteerd. De recombinanten, aangeduid als AcMNPV/plOZ, werden driemaal via plaques gezuiverd, zodat genetische homogeniteit werd verkregen, en gekweekt tot virusvoorraden met hoge titer (2x10^ 25 TCID5o-eenheden per ml). De titers van extracellulair virus van de recombinanten en die van het virus van het wilde type waren van dezelfde orde van grootte, hetgeen erop wijst dat het plO-gen niet essentieel is voor de replicatie van extracellulair virus.

Als controle werden recombinanten die in plaats van het polyhedrine-gen 30 een polyhedrine-LacZ-fusiegen bevatten, gebruikt (AcMNPV/p33Z).

Virusinfectie werd uitgevoerd op S_. frugiperda-cellen met een infectie-multipliciteit van 10 TCIDjg-eenheden per cel.

DNA-analyse van AcMNPV/plOZ-recombinanten 35 Extracellulair virus werd uit celkweekvloeistof verkregen door fil tratie met filters van 0,45 /um en centrifugering (45 min.,100.000 x g 4°C). Het neergeslagen virus werd gesuspendeerd in TE-buffer (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), behandeld met proteinase K en SDS, tweemaal geëxtraheerd met fenol verzadigd met TE, eenmaal met fenol/cbloro-40 form/isoamylalcohol(25:24:1) en eenmaal met chloroform/isoamylalcohol .8800198 7 (24:1). Het DNA werd zorgvuldig tegen TE gedialyseerd en gebruikt voor DNA-analyse en transfectie.

Het DNA van de recombinanten die het LacZ-gen tot expressie brengen werd behandeld met EcoRI (restrictie-enzym van BRL Ine.) en door analyse in 5 0,7 Z agarosegel vergeleken met op dezelfde wijze behandeld DNA van

AcMNPV van het wilde type en het stamplasmide pAcR159 en pAcR159Z (figuur 3). In de recombinanten (sporen b en d) was het fragment EcoRI-P dat het plO-gen bevat afwezig (zie spoor c). In plaats daarvan verschenen er twee nieuwe EcoRI-fragmenten van 1,5 en 3,5 kbp die qua grootte 10 gelijk waren aan de fragmenten van pAcRl59Z die samen de volledige inlas in het plasmide uitmaakten (spoor a). De aard van deze twee fragmenten werd bevestigd door middel van Southern Blot-hybridisatie met met LacZ ingelast DNA. Uit de analyse bleek dat het piO-LacZ-fusiegen op de juiste wijze in de plO-locus van het AcMNPV-genoom was ingevoegd.

15

Eiwitsynthese in met AcMNPV/plOZ geïnfecteerde S. frugiperda-cellen.

Cellen van J5. frugiperda werden met recombinant of natuurlijk AcMNPV geïnfecteerd en de 72 uur na de infectie in de cellen aanwezige eiwitten met behulp van PAGE geanalyseerd (fig. 4). Hierbij werden de 20 cellen driemaal met PBS (zoute fosfaatbuffer) gewassen, gekookt in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 Z (m/v) SDS, 10 Z (v/v) glycerol, 5 Z (v/v) 2-mercaptoethanol en 0,001 Z (m/v) broomfenolblauw, en geanalyseerd met SDS-PAGE op 12,5 % gel volgens Laemmli (Nature, London, 227, 680 (1970)). De gelen werden gekleurd met Coomassie-briljantblauw.

25 In met AcMNPV van het wilde type geïnfecteerde cellen (spoor b) was plO overvloedig aanwezig, maar in de met recombinant AcMNPV/plOZ-2 geïnfecteerde cellen (spoor c) ontbrak het. In plaats daarvan werd in deze cellen een nieuw eiwit van ongeveer 120.000 Dalton (120K) in grote hoeveelheden waargenomen. Dit eiwit is waarschijnlijk het fusie-eiwit dat 30 het N-uiteinde van plO (5000 Dalton) en LacZ (116.000 Dalton) bevat, aangezien het iets groter was dan het polyhedrine-LacZ-fusie-eiwit (116K) dat werd gevormd in met de recombinant AcMNPV/p33Z geïnfecteerde cellen (spoor d). Dit werd bevestigd door middel van Western blotting met antiserum tegen plO en /3-galactosidase. In de laatstgenoemde recom-35 binant drijft de polyhedrinepromoter de expressie van LacZ. In met AcMNPV/plOZ-2 geïnfecteerde cellen vertoonde de synthese van de andere virus-specifieke eiwitten, zoals polyhedrine, geen waarneembare verschillen met die van eiwitten in met AcMNPV geïnfecteerde cellen. Het eiwitpatroon van met AcMNPV/plOZ-Ι geïnfecteerde cellen was niet te on-40 derscheiden van dat van met AcMNPV/plOZ-2 geïnfecteerde cellen.

.8800198 ‘ 8

Elektronenmicroscopie van geïnfecteerde cellen van S. frugiperda.

S. frugiperda-cellen werden geïnfecteerd, enerzijds met AcMNPV van het wilde type en anderzijds met recombinant AcMNPV/plOZ-2 door enten in weefselkweekflessen met een aanvangsmultipliciteit van infectie van 20 5 TCn>50-eenheden per cel en 48 uren incuberen. Vervolgens werden de cellen onder de elektronenmicroscoop onderzocht (figuur 5). In de kern van de met het recombinante virus geïnfecteerde cellen (fig. 5b) werden de grote blokvormige insluitlichamen, aangeduid als polyeders, in dezelfde hoeveelheid en omvang waargenomen als in met AcMNPV van het wilde 10 type geïnfecteerde cellen (fig. 5a). Ook het aantal ingesloten virionen per kerngedeelte was in de twee soorten geïnfecteerde cellen ongeveer gelijk.

Daarentegen waren in de kern van de met het recombinante virus geïnfecteerde cellen de vezelachtige structuren en de bijbehorende elek-15 tronendichte "spacers" afwezig. Bovendien hadden de polyeders in deze kernen geen membraan (zie ook fig. 6b en 6c). In plaats daarvan werden grote korrelvormige structuren in de kern waargenomen die waren geassocieerd aan de polyeders, op dezelfde plaats als de vezelachtige structuren in cellen die met natuurlijk AcMNPV zijn geïnfecteerd. Noch deze 20 korrelvormige structuren, noch de vezelachtige structuren werden in het cytoplasms waargenomen. Dit wijst er op dat de manipulatie van het plO-gen gevolgen heeft voor de vorming van de vezelachtige structuren en het laatste stadium van de polyeder-morfogenese, nl. de vorming van het membraan, belemmert.

25

Immunogoud-merking van geïnfecteerde cellen van S. frugiperda.

Ter verificatie van de waarnemingen met de elektronenmicroscoop werden ultradunne secties van enerzijds met AcMNPV van het wilde type en anderzijds met AcMNPV/plOZ-2 geïnfecteerde cellen behandeld met antise-30 rum tegen plO of LacZ. Gebonden antilichamen werden gedetecteerd met proteïne A-goud (figuur 6). Na behandeling van met AcMNPV van het wilde type geïnfecteerde cellen (fig. 6a) met plO-antiserum werd de goudmer-king vrijwel uitsluitend in de vezelstructuur teruggevonden. In de roet het recombinante virus geïnfecteerde cellen werd bij gebruik van plO-an-35 tiserum slechts een geringe hoeveelheid van het goud geassocieerd met de korrelstructuren waargenomen (fig. 6b). Wanneer deze secties op dezelfde wijze werden behandeld met antiserum tegen LacZ, werden daarentegen hoge concentraties van de goudmerking in samenhang met de korrelstructuren in de kern gevonden (fig. 6c). Een klein gedeelte van de gouddeeltjes werd 40 ook verspreid in het nucleoplasma en in samenhang met virionen in de po- .8800198 9 lyeders waargenomen.

Biologische aktiviteit van de AcMNPV/plOZ-recombinanten

De biologische aktiviteit van AcMNPV van het wilde type en van de 5 recombinanten werd bepaald met behulp van de microdruppelbepaling, in wezen zoals beschreven door Hughes en Wood, J.Invertebrate Pathology 37, 154 (1981). Larven van Spodoptera exigua werden gedurende een nacht nuchter gehouden waarna een hoeveelheid vloeistof die een bekende dosis virus bevatte in korte tijd werd toegediend. Na opneming van het virus 10 werden de larven 10 dagen verder gekweekt op een semisynthetisch dieet. Daarna werd het sterftepercentage voor een reeks bekende virusconcentraties bepaald. De mediaan van de letale concentratie (LC50) werd berekend uit probit-sterftegrafieken. De mediaan van de letale dosis (LD50) uitgedrukt in het aantal polyeders, werd herleid uit het be-15 kende opgenomen volume van de larven van het tweede stadium van J5. exigua (0,33 jl· 0,13 /ul) en de LC50 (in polyeders per ml). De LT50 werd bepaald uit een tijd-sterftegrafiek bij een LD-waarde van meer dan 95.

Beide AcMNPV/plOZ-recombinanten bleken infectieus voor larven van 20 S_. exigua en leidden tot overeenkomstige opbrengsten van polyeders per larve (ongeveer 10^ zoals bepaald aan de hand van de telling van polyeders). De biologische aktiviteit van AcMNPV/plOZ-2 werd verder onderzocht en vergeleken met AcMNPV van het wilde type (zie tabel A). De LD5Q-waarde voor recombinant AcMNPV/plOZ-2 (4,2 polyeders) verschil-25 de significant van die voor het virus van het wilde type 01,2 polyeders). De regressielijnen voor dosis-sterfte van de twee typen virus waren parallel (met een gemeenschappelijke helling van 1,44) maar niet homogeen. De LT5o~waarden voor twee typen virus waren vrijwel dezelfde, nl. ongeveer 105 uur, hetgeen er op wijst dat het fusie-eiwit 30 niet giftig is voor de insekten. Uit tabel A blijkt dat AcMNPV-virus met een gedefunctionaliseerd plO-gen ten minste tweemaal zo virulent is als AcMNPV van het wilde type.

8900198 ]0

CS

N

O

-p m 00 eu o o i-i n >

Ph * Z # ^

X OU

ci m3 < H 3 ,3 w es cs P \ C r— co cd o» 02 p o oo • P ps 11 ^ P r^· & B ^

O CM

υ X

<U

M 00 »—i

LTj CO

<D 00 * Ό p3 r—i i—( • ‘i-l P Cd i-l «3 >-· P· ω ai •Η ,P*

p X

ai cu

P

CU CU

o, cd ca

^ P

P P (U

cd μ

Pp 00 Ό co

1-1 β Ό P

•P 3 ·Ρ P 00 1-1 & ·Ρ <D > " Ί tJ 33 0 CO r- P Cd μ 33 1—1 <C cu p cd 3: co cd τη 31

cu P <U S

32 cd ip 3

cd > P O

Η P PP

> S P CU

βπ P CU 'P '—1 *—1

Z X2 (U

% P P 02 CS

UP 6Ό CU

<33 32 m PP oi cd cd i> > pp p P a) hi p p 3 CO s-l p u O μ μ •μ cd m p co cs p > rS O Ό » " p

•p |3 P n *>d* CO

p P ps I-1

,Μ .p I-S P

PO A! P< "“i

Q) P 'P

33 Τ' o μ co 3 • P /-N 3

ÖC rS W

o E 2

IS ^ o· <J- P

o co o o •p *j< μ i—r »—* μ pq OP * * 02 o

UI Ό 1—1 O 02 O

PP Sf CS U P

p >1 1 1 hP -

rS CO t—1 "O

0 ·ΐ“) μ pj -pp

2/ PP

OO

Ό ·ρ ι-t μ cd μ \ cd o

> > CS PU

co Ps PI PP

3 Z P Z N P 00

μ g > g O

•p U U i-i * > < <; p. * -j< ,8800198 11

Verklaring bij de figuren

Figuur 1

Opbouw van recombinant plasmide pAcR!59Z (transfervector). Het BamHI fragment van het plasmide pMC1871 met daarin het LacZ-gen werd ge-5 ligeerd op de Bglïlplaats van het EcoRI-fragment P (kaarteenheden 0,887 tot 0,896 op AcMNPV DNA) van het plasmide pACR159 dat het plO-gen bevat, onder vorming van een 11 kbp transfervector pAcR159Z. Het zwarte gedeelte geeft het plO-gen aan, het gestreepte gedeelte geeft de plO-gense-quenties op EcoRI-P aan en de gestippelde gebieden geven de LacZ-sequen-10 ties aan. ATG en TAA duiden respectievelijk op het startsignaal van plO-gen en het stopsignaal van het LacZ-gen.

Figuur 2

Nucleotidesequenties ter hoogte van de verbindingen tussen het plO-15 gen en het LacZ-gen.

Figuur 3

Restrictie-enzym-analyse van DNA van AcMNPV van het wilde type, stamplasmiden en AcMNPV/pJOZ-recombinanten met EcoRI. Spoor a: pAcRl59Z; 20 spoor b: AcMNPV/plOZ-2; spoor c: AcMNPV wild type; spoor d:

AcMNPVplOZ-l; spoor e: pAcR159. De pijl wijst naar pBR325. De fragmenten EcoRI-P (P) en EcoRI-J (j) zijn aangegeven. De twee inlasfragmenten van EcoRI (zie ook fig. 1) zijn aangegeven in kbp.

25 Figuur 4 SDS-polyacrylamide-gelelektroforese van eiwitten aanwezig in cellen van S. frugiperda die zijn geïnfecteerd met AcMNPV van het wilde type, AcMNPV recombinanten en schijn-geïnfecteerde cellen. Extracten van 4x10^ cellen werden in 12,5 % polyacrylamidegel geanalyseerd. Spoor a: 30 schijn-geïnfecteerde cellen; spoor b: cellen geïnfecteerd met AcMNPV van het wilde type; spoor c: cellen geïnfecteerd met AcMNPV/plOZ-2; spoor d: cellen geïnfecteerd met AcMNPV/p33Z. Polyhedrine (33K), plO (10K) en het polyhedrine-LacZ-fusie-eiwit (I16K) zijn aangegeven.

35 Figuur 5

Elektronenmicroscopische opnamen van S_. frugiperda-cellen geïnfecteerd met AcMNPV van het wilde type (a) en ACMNPV/pl0Z-2 (b), 48 uur na infectie. Aangeduid zijn polyeders (P), virogeen stroma (VS), vezel-structuren (FS), korrelstructuren (G), elektronendichte "spacers" (SP), 40 kern (N) en cytoplasms (C). De streepjes stellen 2 /um voor.

.8800198 1 2 * Figuur 6

Doorsneden van cellen van £. frugiperda geïnfecteerd met AcMNPV wilde type (a) en AcMNPV/plOZ-2 (b en c), behandeld met antiserum tegen plO (a en b) of LacZ (c) en vervolgens gecomplexeerd met proteïne A-5 goud. De verschillende structuren zijn aangeduid als in fig. 5 met daarnaast het polyedermembraan (M). De streepjes stellen 0,2 /um voor.

Figuur 7

Opbouw van recombinant plasmide pJJ-1.

]0 Het fragment EcoRI-P' van AcMNPV-DNA is gekloneerd in de unieke EcoRI-herkenningsplaats van het bacteriëel plasmide pUC-4 (2,7 kb). Het fragment EcoRI-P, oorspronkelijk 1,9 kb, heeft een volledige deletie van het plO-gen (0,3 kb), zodat EcoRI-P' ontstaat, en een insertie van -GATCC-, zodat de herkenningsplaats van het restrictie-enzym BamHI ontstaat 15 (GGATCC).

Figuur 8

Opbouw van recombinant plasmide pJJ-2.

Het fragment EcoBI-P' van AcMNPV-DNA is gekloneerd in de unieke EcoRI-20 herkenningsplaats van het bacteriëel plasmide pUC-4 (2,7 kb). Het fragment EcoRI-P, oorspronkelijk 1,9 kb, heeft een volledige deletie van het plO-gen (0,3 kb), zodat EcoRI-P' ontstaat, en een insertie van -GGATCCCTGAACCCGGGAAGCTT-, zodat de herkenningsplaatsen van de restrιοί ie-enzymen BamHI, Smal en HindlII ontstaan.

,8800198

Claims (14)

1. Baculovirus, in het genoom waarvan een gen dat betrokken is bij de opbouw van het polyedermembraan is gedefunctionaliseerd.

2. Baculovirus volgens conclusie 1, waarvan het voor de expressie van het plO-eiwit coderende gen is gedefunctionaliseerd.

3. Baculovirus volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het een kernpolyedervirus is.

4. Baculovirus volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het een kernpolyedervirus van Autographa californica is.

5. Baculovirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen 10 dat betrokken is bij de opbouw van het polyedermembraan gedefunctionaliseerd is door een deletie of insertie in de nucleotidensequentie van het gen.

6. Baculovirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen dat betrokken is bij de opbouw van het polyedermembraan gedefunctionali- 15 seerd is door verwijdering van de gehele nucleotidensequentie van het gen of door vervanging daarvan door een andere sequentie.

7. Toepassing van het baculovirus volgens één der conclusies 1-6 voor de bestrijding van insekten.

8. Preparaat voor het bestrijden van insekten, dat een baculovirus 20 volgens één der conclusies 1-6 omvat.

9. Transfervector, die geschikt is voor het construeren van een baculovirus volgens conclusies 1-6, met het kenmerk, dat de vector een gedefunctionaliseerd baculovirusgen dat betrokken is bij de opbouw van het polyedermembraan van het virus, omvat.

10. Vector volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het baculovi rusgen een plO-gen is,

11. Vector volgens conclusie 9 of 10, met het kenmerk, dat het gen gedefunctionaliseerd is door een deletie of insertie in, of door gehele of gedeeltelijke substitutie van de nucleotidensequentie.

12. Vector volgens conclusies 9-11, met het kenmerk, dat de in het oorspronkelijke gen zich tussen de start- en stopcodons bevindende nucleotidensequentie geheel afwezig is of vervangen is door een andere sequentie.

13. Vector volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de vervangen-35 de nucleotidensequentie een restrictieplaats omvat.

14. Vector volgens conclusies 12 of 13, met het kenmerk, dat de sequentie tussen het start- en stopcodon de formule S'-GATCC-S' heeft. .8800138