DE3889665T2

DE3889665T2 - Serumfreie wachstumsmedien für insektenzellen und expression von produkten damit.

Info

Publication number: DE3889665T2
Application number: DE3889665T
Authority: DE
Inventors: Duane Inlow; Brian Maiorella
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1987-07-24
Filing date: 1988-07-20
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2008-07-21
Also published as: US5024947A; AU2126688A; ATE105856T1; IL87196A0; EP0380495B1; DE3889665D1; CA1309679C; JPH03500602A; IL87196A; IE64262B1; WO1989001028A1; JP2898291B2; IE882264L; EP0380495A1

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Fermentation und der Züchtung von Insektenzellen. Die Erfindung betrifft insbesondere verbesserte Medien zur Züchtung und Fortpflanzung von Insektenzellen. Ferner betrifft diese Erfindung serumfreie Medien, die das Wachstum von Insektenzellen in großem Maßstab fördern. Diese Erfindung betrifft außerdem die Expression von großen Mengen an rekombinanten oder viralen Produkten durch Insektenzellen, die in diesen serumfreien Medien gezüchtet und jeweils entweder mit einem rekombinanten Baculovirus oder Wildtyp-Virus infiziert werden.
Insektenzellen sind erfolgreich zur Replikation von Baculoviren verwendet worden, um die Expression von in Baculoviren enthaltenen Fremdgenen zu fördern. [Smith et al. berichten in PNAS USA 82 (Dez. 1985), 8404-8408, von IL-2- Produktion in großen Mengen durch Zellen von Spodoptera frugiperda nach einer Infektion mit rekombinanten Nuclear- Polyhedrosis-Viren des Typs Autographa californica (AcNPV), die eine menschliches Il-2 codierende cDNA tragen, sowie in der Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung mit der Nr. 127 839 (veröffentlicht am 12. Dez. 1984), von Verfahren zur Produktion rekombinanter Baculoviren, die bestimmte Gene in Insekten-Wirtszellen exprimieren können. Vgl. auch Jeang et al., die in J. Virol. 61 (3) (März 1987), 708-713, die Produktion von funktionellem, menschlichem p40x-Protein des T-Zell-Leukämievirus vom Typ I (HTLV-I) durch Zellen von S. frugiperda (Sf9) nach einer Infektion mit einem rekombinanten AcNPV-Virus beschreiben.]
Insektenzellen sind zur Produktion von Insektenviren für eine Verwendung als biologische Insektizide gezüchtet worden. [Vaughn et al., In Vitro 13 (1977), 213-217, und Lynn et al., J. Invert. Pathol. 32 (1978), 1-5]. Derartige Viren sind beispielsweise Baculoviren und nicht-Baculoviren, beispielsweise das infektiöse Flacheriavirus (IFV) und das Cytoplasmatic-Polyhedrosis-Virus (CPV). Dazu gehören bestimmte Baculoviren, beispielsweise Nuclear-Polyhedrosis- Viren (NPV) und Granuloseviren (GV), die als Insektenschädlinge stark virulent sind. Einige der erfolgversprechendsten Viren sind in kommerziellem Maßstab als biologische, für landwirtschaftlich wichtige Insekten pathogene Pestizide entwickelt worden. [Burges (Hrsg.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases (London 1981), 1970-1980, Miltenburger et al., Bioinsecticides II: Baculoviridae Adv. Biotechnol. Processes 3 (1984), 291. Derartige NPV- und GV- Produkte als biologische Pestizide werden von Shieh et al. in "Production and Efficiency of Baculoviruses", Biotechnology and Bioengineering Bd. XXII (1980), 1357, sowie von Huber in "Use of Baculoviruses in Pest Management Programs", In Granados et al. (Hrsg.), The Biology of Baculoviruses: Practical Applications for Insect Control Bd. II (1986), 181- 202, diskutiert].
Baculoviren sind sehr stabil und können länger als andere Tierviren in der Umwelt bestehen. Die Ursache für diese auffällige biologische Stabilität ist eine ungewöhnliche Assoziation der infektiösen Viruspartikel und einer viralen Okklusion, die ein kristalliner Verband eines Virus-codierten, als Polyhedrin bezeichneten Strukturproteins ist. Spät in der viralen Replikation werden die Partikel des Baculovirus in eine aus dem Polyhedrinprotein bestehende Proteinokklusion eingeschlossen. Insekten erkranken am Baculovirus nach der Verdauung von Nahrung, die durch dieses okkludierte Virus (OV) kontaminiert ist. Die Polyhedrinmatrix schützt die Viruspartikel außerhalb des Insekts, aber auch während der Passage durch den Kopfdarm der Insekten. Im Mitteldarm des Insekts bewirkt der alkalische pH-Wert die Auflösung der kristallinen Polyhedrinmatrix, wobei zahlreiche Viren freigesetzt werden. Die Infektion wird durch Absorption des Virus durch die Epithelzellen des mittleren Darmabschnitts initiiert. Es gibt eine zweite infektiöse Form von Nuclear-Polyhedrosis-Viren (NPVs), die als extrazelluläre oder nicht okkludierte Virus (NOV)-Form bekannt ist und nach dem Durchtritt des viralen Nucleocapsids durch die Plasmamembran der infizierten Zellen erzeugt wird. NOVs verursachen die Verbreitung der sekundären Infektion über die Hämolymphe des Insekts.
Meistens werden Insektenlarven zur Produktion von Baculoviren verwendet. Dieses Verfahren ist jedoch für eine Produktion in großem Maßstab wenig geeignet. Eine Züchtung von Insektenzellen ist viel praktischer. [Vaughn, Adv. Cell. Cult. 1 (1981), 281-295; Stockton et al., In Burges (Hrsg.), a. a. O., S. 313-328]. Dazu gibt es Publikationen, in denen eine Batch- und eine semikontinuierliche Produktion von Spodoptera frugiperda- und Trichoplusia ni-Zellen, die das Nuclear-Polyhedrosis-Virus vom Typ Autographa californica replizieren können, beschrieben sind. [Vaughn, J. Invert. Path. 28 (1976), 233-237, und Hink, In Kurstak (Hrsg.), Microbial Viral Pesticides (1982), S. 493-506].
Wenn bei der Züchtung von Insektenzellen eine maximale Ausbeute bei einer minimalen Verdopplungszeit der Population erreicht werden soll, müssen die idealen ernährungsmäßigen, biologischen und biophysikalischen Wachstumsansprüche der Zellen berücksichtigt werden. Eine der wichtigsten Voraussetzungen dafür ist die Zusammensetzung der Kulturmedien für Insektenzellen. Der Grundbestandteil eines häufig verwendeten Mediums für Lepidopterenzellen war ein Medium, das von Wyatt, J. Gen. Physiol. 39 (1956), 841, entwickelt und von Grace, Nature (London) 195 (1962), 788, modifiziert worden war. Das Medium ähnelt der Hämolymphe und besteht im wesentlichen aus chemisch reinen Aminosäuren, Vitaminen, organischen Säuren und anorganischen Salzen, denen ursprünglich auch Insektenhämolymphe zugesetzt wurde. Später wurde die Hämolymphe dieser Formulierung gegen fötales Rinderserum, Rinderserumalbumin und ein Ultrafiltrat aus Eiern ausgetauscht.
[Weiss et al., The Biology of Baculoviruses (Bd. II) Kap. 3 (1986), 68, In Granados et al. (Hrsg.), ohne Zitate].
Die in vitro-Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab, die Infektion der Zellen entweder mit rekombinanten oder nicht-rekombinanten Viren und die Aufarbeitung des rekombinanten Produkts oder des Virusmaterials setzen voraus, daß ein geeignetes Kulturmedium vorhanden ist. Wie vorstehend beschrieben, enthalten übliche Kulturmedien neben anorganischen Salzen, Vitaminen, Aminosäuren, Zuckern und mehreren anderen, für die Zellphysiologie wesentlichen organischen Verbindungen, etwa 2 bis 25% (Gew./Vol.) Tierserum und/oder Tierserumalbumin. Tierserum ist ein Produktions-begrenzender Faktor, da es sehr kostspielig und nur in relativ geringen Mengen erhältlich ist und außerdem die Reinigung des Produkts erschwert. Die Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab zur industriellen Herstellung von pathogenen Insektenviren oder von rekombinanten Produkten setzt einen Austausch von Tierserum gegen einen in ausreichenden Mengen erhältlichen, kostengünstigeren Bestandteil voraus.
Es gibt zahlreiche Untersuchungen zur Entwicklung serumfreier Medien für die Züchtung von Insektenzellen, vor allem im Zusammenhang mit der Produktion von als biologische Pestizide verwendbaren NPV und GV, zu denen auch die folgenden Publikationen gehören: Goodwin et al., in Kurstak et al. (Hrsg.), Invertebrate Systems In Vitro, Kap. 45 (1980), 493- 509, Goodwin, In Vitro 12 (1976), 303-304, Hink et al., In Vitro 13 (1977), 177, Roder, US-Patent Nr. 4,454,227, Weiss et al., In Vitro 20 (1984), 271, Gardiner et al., J. Invert. Path. 25 (1970), 363-370, Wilkie et al., Develop. Biol. Standard. 46 (1980), 29-37, und Vail et al., J. Invert. Path. 28 (1976), 263-267.
Die Tabelle 1 zeigt mehrere Medien, in denen Serum gegen Proteinhydrolysate und unverarbeitete und definierte Lipide ausgetauscht ist. Derartige serumfreie Medien sollen die Produktion von Baculoviren in Insektenzellen (Lepidopteren) fördern, obwohl einige der Medien kein lebensfähiges, okkludiertes Virus produzierten. Tabelle 1 Serumfreie Züchtung von Lepidopteren Veröffentlichung Zellinie Medium Hink et al., In Vitro 13 (1977), 177 Trichoplusia ni Definiertes Medium + Bactotryptose Goodwin et al., In Vitro 12 (1976), 303 Porthetria dispar Definiertes Medium + Leberaufschluß, peptisches Pepton, Hefeextrakt, Lactalbuminhydrolysat Roder, Naturwissenschaften 69 (1982), 92 Spodoptera frugiperda Definiertes Medium + Peptone, Eigelb Weiss et al., In Vitro 20 (1984), 271 Heliothis zea RIL-2B-Medium + Sterole, Fettsäuren
Im Zusammenhang mit derartigen serumfreien Medien weisen Weiss et al. in The Biology of Baculoviruses, (CRC Press 1986) a. a. O., S. 68, darauf hin, daß:
"Forschungsergebnisse über Funktion und Verwendung von Aminosäuren, Mineralien, Hormonen, Mitogenen, Kohlehydraten, organischen Säuren, Fettsäuren, Zuckern, Lipiden und monovalenten und divalenten Kationen in gezüchteten Insektenzellen dazu führten, daß für einige Experimente serumfreie Medien für Insektenzellen verwendet wurden. Gegenwärtig unterstützen diese serumfreien Medien jedoch die Virusreplikation noch nicht ausreichend, da vermutlich nicht-definierte, häufig in Serumzusätzen vorhandene Proteine fehlen." [Ohne Zitate].
Brooks et al. in Kurstak et al. (Hrsg.), Invertebrate Systems In Vitro, Kap. 7 (1980), 67-77, beschreiben Cholesterin als einen Wachstumsfaktor für Insektenzellinien. Brooks et al. tauschten in einem zur Züchtung von Küchenschabenzellen verwendeten Medium fötales Rinderserum (FBS) gegen Cholesterin-Lecithin-Dispersionen aus. Das Grundmedium enthielt Lactalbuminhydrolysat und Hefeextrakt. Brooks et al. halten die Behandlung mit reinem Cholesterin zur Herstellung derartiger Medien für kritisch und beschreiben Verfahren, in denen:
- Cholesterin in kochendem Ethanol gelöst, das Volumen anschließend durch Kochen reduziert und destilliertes Wasser zugesetzt wird, worauf das Gemisch autoklaviert wird,
- Cholesterin kaltem wäßrigem Ethanol zugesetzt und autoklaviert wird,
- Cholesterin kaltem Wasser zugesetzt und autoklaviert wird,
- Cholesterin und Lecithin kaltem Wasser zugesetzt und mit Schall behandelt werden, wobei sich ein Sediment bildet.
- die Cholesterin-Lösung in Tween® emulgiert ist.
Die Zellen wurden in einem serumfreien, abgekochtes Cholesterin sowie Lecithin enthaltenden Medium gezüchtet. Keines der Medien, die Cholesterin in kaltem Ethanol oder Wasser enthielten, förderte das Zellwachstum unbegrenzt, selbst in Gegenwart von Lecithin, auch in Medien, die mit Schall behandeltes Cholesterin/Lecithin oder emulgiertes Cholesterin enthielten, wurde kein verbessertes Zellwachstum beobachtet.
Brookes et al. schließen daraus, daß Serum nur durch Cholesterin-Lecithin ersetzt werden kann, wenn das Cholesterin zuvor in Ethanol gekocht worden ist, und vermuten, daß das Ethanol "physikalisch-chemisch mit Cholesterin reagieren muß, damit es verwendbar ist".
Im Zusammenhang mit der Züchtung von Insektenzellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen über ein Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) stellen Miller et al. auf Seite 291 in [Setlow et al. (Hrsg.), "An Insect Baculovirus Host-Vector System for High-Level Expression of Foreign Genes", Genetic Engineering Principles and Methods Bd. 8 (1986), 277-298] fest: "Meistens enthält das Medium während des Wachstums der Zellen und Viren 10% fötales Kälberserum. Das im Serum enthaltene Protein kann eine Reinigung und gelegentlich eine Expression erschweren, wenn es bestimmte antagonistische Aktivitäten enthält. Obwohl in einigen Publikationen Insektenzellen beschrieben sind, die in serumfreien Medien wachsen, fördern derartige Medien das Virus- Wachstum nicht wesentlich." Miller et al. erwähnen anschließend, daß das US-Patent Nr. 4,454,227 von Roder, in dem emulgiertes Eigelb als Serumersatz verwendet wird, eine "interessante Ausnahme" ist, ohne daß jedoch "eine Lösung der Reinigungsprobleme erkennbar ist. Eine kurzzeitige Lösung beruht auf der Beobachtung, daß die Zellen nach einer Infektion in 10% Serum enthaltenden Medien in serumfreie Medien transferiert werden können und die Expression unvermindert andauert." Ein derartiger Transfer von einem serumhaltigen Medium auf ein serumfreies Medium, wie er von Miller et al. vorgeschlagen wird, ist jedoch keine praktische Lösung für eine industrielle Produktion in großem Maßstab.
Summers et al. empfehlen in "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insekt Cell Culture Procedures" Texas Agricultural Experiment Bulletin Nr. 1555 (Texas A & M University; Mai 1987) auf Seite 32 bis 33 die Verwendung eines "Grace Antheraea-Mediums (eines relativ einfachen Gemisches aus Salzen, Kohlehydraten und Aminosäuren), . . . das für Kurzzeitinkubationen von Zellen (zum Waschen von Monolayern, für Impfkulturen von Zellen und zur Transfektion etc.) verwendet wird", und eines "TNM-FH, eines Gesamtmediums, das für Standardverfahren zur Monolayer- oder Suspensionskultur von Zellen geeignet ist . . . und aus dem Grace-Medium durch Zugabe von 3,3 g/l "Yeastolate" und 3,3 g/l Lactalbuminhydrolysat (beide von Difco) hergestellt wird." Summers et al. erwähnen auf Seite 33 weiter, daß zum Erhalt "eines kompletten Nährmediums, 10% fötales Rinderserum (steril, hitzeinaktiviert) zugesetzt werden sollte" und im Abschnitt über Verfahren auf Seite 9 und 11 fordern Summers et al., daß "TNM-FH-Medien + 10% FBS + Antibiotika" verwendet werden sollen. Auf Seite 10 stellen Summers et al. fest: "Es ist wünschenswert, daß die Zellen in ein serumfreies Medium geimpft werden, damit sie zur Durchführung von Plaque-Tests und Infektionen etc. schneller und fester haften. Die Zellen können allerdings erste Anzeichen von Stress zeigen, wenn sie mehr als 2 Stunden ohne Serum gehalten werden".
Die meisten Kulturmedien zur Züchtung von Insektenzellen enthalten Peptone und Serum und werden häufig zur Züchtung von Insektenzellen in einer schlecht belüfteten Kultur verwendet, wobei unter diesen Bedingungen das Zellwachstum und die Expression von rekombinanten Proteinen und lebensfähigen Viruspartikeln eingeschränkt ist. Obwohl serumfreie Medien entwickelt worden sind, die das Wachstum von Insektenzellen fördern, wurde nach einer Züchtung der Insektenzellen in derartigen serumfreien Medien und einer Infektion mit einem rekombinanten Baculovirus für keines dieser Medien eine Förderung der Produktion rekombinanter Proteine nachgewiesen, die mit den von Insektenzellen erhaltenen Mengen, die entsprechend infiziert und in etwa 10% Serum enthaltenden Medien gezüchtet werden, vergleichbar ist. Wie vorstehend beschrieben, konnte außerdem für kein Medium eine ausreichende Förderung der Virusreplikation in Insektenzellen nachgewiesen werden.
Versuche, fettartige Nährstoffe in Kulturmedien für Insektenzellen aufzunehmen, führten häufig zur Bildung von großen unlöslichen Fettpartikeln, deren Aufnahme durch die Zellen erschwert ist. Diese Erfindung löst dieses Problem.
Die hier beschriebene Untersuchung zeigt, daß einige Peptone und andere Bestandteile, die in die publizierten, Serum enthaltenden oder nicht enthaltenden Kulturmedien für Insektenzellen eingeschlossen sind, das Wachstum hemmen oder entbehrlich sind. Die Untersuchung zeigt ferner, daß Bestandteile der Peptonfraktionen mit hohem Molekulargewicht die Reinigung der von den gezüchteten Insektenzellen produzierten, rekombinanten oder viralen Produkte erschweren. Eine Ausführungsform dieser Erfindung betrifft die Entfernung derartiger Bestandteile.
Von großem Wert für den Stand der Technik wäre außerdem ein einzelnes serumfreies, wenig oder kein Protein enthaltendes Medium zur Züchtung von Insektenzellen und zur Produktion von rekombinanten Proteinen oder viralen Produkten, in dem die Expression mit einem Baculovirus-Vektorsystem (BEVS) bzw. eine Infektion mit einem Wildtyp-Virus erfolgt. Insektenzellen können in kleinem Maßstab in einem serumhaltigen Medium mit relativ großen Mengen Protein gezüchtet, anschließend aus einem derartigen Nährmedium gewonnen und in einem serumfreien Produktionsmedium zur Infektion und Expression von Produkten resuspendiert werden. Derartige Trennungs- und Resuspensionsverfahren sind für eine Züchtung in großem Maßstab nicht geeignet, da für derartige Verfahren eine aufwendige technische Ausstattung und komplexe Arbeitsschritte erforderlich sind. Es besteht im Stand der Technik ein Bedarf nach einem einzelnen serumfreien, wenig oder kein Protein enthaltenden Nähr- und Produktionsmedium, das die Fermentationsverfahren vereinfacht, die Kosten der in großem Maßstab durchgeführten Züchtung von Insektenzellen reduziert und die Reinigung der rekombinanten und viralen Produkte erleichtert. Diese Erfindung kommt diesem Bedarf entgegen.
Ein Grund für die häufig schlechte Belüftung von Insektenzellkulturen ist die "Fragilität von Insektenzellen". [Weiss et al. in The Biology of Baculoviruses, Bd. II (Kap. 3) (1986), Seite 80, (CRC Press), und in In Vitro 16 (1980), 222] . "Zwei Probleme haben anscheinend die uneingeschränkte Verwendung von Suspensionssystemen für die Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab verzögert: die Fragilität von Insektenzellen und zweitens der hohe Sauerstoffbedarf, besonders von Virus-infizierten Zellen." [Weiss et al., CRC Press, a.a.O., S. 80; ohne Zitate]. Tramper et al. weisen in Enzyme Microb. Technol. 8 (Januar 1986), 33-36, auf S. 33 darauf hin: "Ein Hauptproblem, das bei der Umstellung der Züchtungssysteme von [Insekten] -Zellen auf ein höheres Produktionsniveau auftritt, ist die ungewöhnliche Empfindlichkeit dieser Zellen aufgrund ihrer Größe (im Bereich von 20 um) und die fehlende Zellwand. Diese Empfindlichkeit kann die übliche, ausreichende Sauerstoffversorgung (z. B. durch Durchblasen) behindern. Tramper et al. fahren auf Seite 35 und 36 fort:
"Die mechanische Festigkeit von gezüchteten Insektenzellen ist gering. Daraus ergeben sich klare Konsequenzen für die Umstellung von Insektenzellkulturen auf ein höheres Produktionsniveau. Größere Volumina von Insektenzellkulturen benötigen einen effizienteren Sauerstofftransfer zur Lösung als durch ein Verströmen von Luft/Sauerstoff über die Flüssigkeitsoberfläche erreicht werden kann. Die Dispersion von Gas durch Rühren und Durchblasen von Luft durch die Zellsuspension zur ausreichenden Sauerstoffversorgung führt jedoch wahrscheinlich zu einem schnelleren Absterben und nicht zu einer erhöhten Wachstumsrate der Zellen."
Die vorliegende Erfindung kommt dem Bedarf nach Bereitstellung eines Mediums entgegen, in dem Insektenzellen nicht nur bei der in Kulturen sonst üblichen schwachen Belüftung, sondern auch bei guter Belüftung wachsen können, bei der die Insektenzellen bis zu einer hohen Zelldichte mit einer hohen Überlebensrate wachsen und bei einer Infektion mit rekombinanten Baculoviren Mengen von rekombinanten Produkten oder bei einer Infektion mit Wildtyp-Viren andere Virusprodukte produzieren können, die mit den in serumhaltigen Medien erreichbaren Mengen vergleichbar sind.
Die vorliegende Erfindung stellt serumfreie Medien, die wenig oder vorzugsweise kein Protein enthalten, für die Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab bereit, wobei eine hohe Zelldichte und Überlebensrate erzielt werden. Die erfindungsgemäßen Medien fördern das Wachstum von Insektenzellen bis zu einer Dichte, die der in Serum enthaltenden Medien mit einem viel höheren Proteingehalt äquivalent ist. Wenn die Insektenzellen in den erfindungsgemäßen Medien gezüchtet werden, ist die Expression von rekombinanten Produkten und die Produktion von anderen viralen Produkten, beispielsweise eines NPV und GV, der Expression und Produktion von in serumhaltigen Medien gezüchteten Insektenzellen äquivalent.
Diese Erfindung stellt außerdem serumfreie Medien bereit, die sowohl das Wachstum von Insektenzellen als auch die Produktion von rekombinanten Proteinen und anderen Virusprodukten fördern, sowie mit der Reinigung solcher rekombinanter Proteine und Virusprodukte verträglich sind.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein wahlweises Verfahren, in dem durch Ultrafiltration Bestandteile mit hohem Molekulargewicht und Rückstände von Proteasen und Endotoxinen aus der Peptonfraktion entfernt werden können, die während ihrer Herstellung nicht entfernt worden sind und die Reinigung von viralen und rekombinanten Produkten der Insektenzellen erschweren können. Erfindungsgemäße Ausführungsformen sind somit serumfreie Medien zur Züchtung von Insektenzellen, die im wesentlichen frei von Bestandteilen mit hohem Molekulargewicht und Protease- und Endotoxinrückständen sind.
Diese Erfindung stellt außerdem eine Lipidkomponente in Form einer Mikroemulsion in serumfreien Medien bereit. Eine derartige Lipidkomponente umfaßt ein Lösungsgemisch aus einem Lipid/organischen Lösungsmittel, das eine kleine Menge eines Emulgators oder eine Kombination von Emulgatoren enthält. Beispiele von bevorzugten Emulgatoren sind die Kombination eines Phospholipids, beispielsweise eines Lecithins, oder stärker bevorzugt eines nicht-toxischen, nicht-ionischen polymeren Detergens, beispielsweise Polysorbat 80, mit einem zweiten Emulgator, vorzugsweise einem nicht-ionischen polymeren Detergens, stärker bevorzugt einem "Pluronicpolyol", noch stärker bevorzugt Pluronic F68 oder F88.
Ferner umfassen die erfindungsgemäßen serumfreien Medien per se einen nicht-toxischen Schutzstoff, der eine Beschädigung und ein Absterben der Zellen aufgrund von Scherkräften in gerührten und/oder Luft-durchströmten Kulturen verhindert. Bevorzugte erfindungsgemäße, nicht-toxische, Schutzstoffe sind nicht-toxische, wasserlösliche Polymere, stärker bevorzugt nicht-toxische, nicht-ionische polymere Detergentien, "Pluronicpolyole", beispielsweise Pluronic F68 oder Pluronic F88, noch stärker bevorzugt Pluronic F68.
Die vorliegende Erfindung stellt ein serumfreies Medium bereit, das das Wachstum von Insektenzellen in großem Maßstab und die Produktion von rekombinanten und viralen Produkten in Mengen fördern kann, die mit den in serumhaltigen Medien erzielten vergleichbar sind, wobei das serumfreie Medium
ein Grundmedium,
eine Lipidmikroemulsion, die für das Insektenzellwachstum essentielle Lipide enthält,
eine Peptonkomponente, die teilweise hydrolysiertes Protein enthält, und
einen Schutzstoff, der aus nicht-toxischen, nicht-ionischen polymeren Detergentien, Hydroxyethylstärke, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Dextransulfat, Polyvinylpyrrolidon, Ficoll, Alginsäure und Polypropylenglykol ausgewählt ist, umfaßt.
Es wird außerdem ein Verfahren bereitgestellt, in dem zur Produktion von rekombinanten oder viralen Produkten Insektenzellen in einem Grundmedium gezüchtet und vermehrt werden, das außerdem durch die Zugabe einer Lipidmikroemulsion gekennzeichnet ist, die die für das Wachstum der Insektenzellen essentiellen Lipide enthält, und einer Peptonkomponente, die ein teilweise hydrolysiertes Protein enthält, wobei ein Zellwachstum in Abwesenheit von Serum erzielt werden kann. Dieser erfindungsgemäße Gesichtspunkt erfordert daher keinen nicht-toxischen Schutzstoff.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter oder viraler Produkte unter Verwendung von Insektenzellen, das die Züchtung von Insektenzellen in einem erfindungsgemäßen serumfreien Medium umfaßt.
Zur Erfindung gehört ferner die Verwendung einer Lipidmikroemulsion, die für das Insektenwachstum essentielle Lipide enthält, und einer Peptonkomponente, die teilweise hydrolysiertes Protein anstelle von Serum und/oder Serumalbumin enthält, in einem Kulturmedium für Insektenzellen, das ein Grundmedium enthält.
Fig. 1 ist eine anschauliche Darstellung des Zeitverlaufs der Produktion von rCSF-1 durch Sf9-Insektenzellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus AcM6 infiziert worden sind. Das obere Diagramm gibt die rCSF-1-Konzentration wieder, wie sie 0 bis 4 Tage nach der Infektion mittels RIA bestimmt wurde. Das mittlere Diagramm zeigt die Überlebensrate der Insektenzellen, wie sie über den gleichen Zeitraum durch Zellzählung unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlußverfahrens bestimmt wurde. Das untere Diagramm ist eine Western-Blot-Analyse des produzierten rCSF-1.
In den erfindungsgemäßen serumfreien Medien, die wenig oder vorzugsweise kein Protein enthalten, sollen Insektenzellen in großem Maßstab gezüchtet werden. Die erfindungsgemäßen Medien stellen ein gutes nährstoffhaltiges Milieu für das Wachstum von Insektenzellen bereit, wenn gerührt und/oder Luft durchgeblasen und vorzugsweise gut belüftet wird. Insektenzellen, "insbesondere Virus-infizierte Zellen, besitzen einen hohen Sauerstoffbedarf". [Weiss et al., CRC Press, a.a.O., S. 80]. Daher sollen die erfindungsgemäßen Medien das Zellwachstum und die Produktion von viralen und rekombinanten Produkten von Insektenzellen fördern und die Zellen vor einer Beschädigung oder einem Absterben bei guter Belüftung schützen, bei der höhere physische Ansprüche als in statischen oder anderen üblichen, schlechter belüfteten Kulturen gestellt werden.
Der Begriff "gut belüftet" betrifft hier Bedingungen, unter denen ein Sauerstoffmangel ausgeschlossen ist, wie sie durch Schütteln, beispielsweise in Spinner- oder Roller- Flaschen, und in gerührten oder geschüttelten Flaschen, oder durch Verströmen von Luft, beispielsweise in belüfteten Fermentern, bestehen.
Der Begriff "Protein" wird hier so definiert, daß er den Begriff "Pepton" ausschließt. Die erfindungsgemäßen serumfreien Medien enthalten vorzugsweise sehr geringe Proteinkonzentrationen, d. h., weniger als etwa 1 000 ug/ml, stärker bevorzugt weniger als etwa 50 ug/ml, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 5 ug/ml und am stärksten bevorzugt kein Protein.
Der Begriff "Pepton" wird hier als ein Gemisch von Spaltprodukten definiert, die durch eine partielle Hydrolyse eines nativen Proteins entweder durch eine Säure oder ein Enzym produziert werden. Die in den erfindungsgemäßen serumfreien Medien verwendeten Peptone weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als etwa 15 000 und stärker bevorzugt ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10 000 auf.
Ein "Grundmedium" ist hier als ein Nährstoffgemisch definiert, das anorganische Salze, Zucker, Aminosäuren und gegebenenfalls auch Vitamine, organische Säuren und/oder Puffer enthält. Die Grundmedien zusammen mit Zusätzen stellen die Nährstoffe bereit, die zur Förderung des Lebens, des Wachstums und der Vermehrung der Zellen erforderlich sind. Die bevorzugten Grundmedien, die als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen serumfreien Medien verwendet werden, enthalten weder Serum, noch Proteine und vorzugsweise auch keine Peptone. Die Wahl des Grundmediums zur Herstellung der erfindungsgemäßen Medien ist nicht kritisch. Das Grundmedium kann auch als optional in der Hinsicht angesehen werden, daß geeignete Pepton- und Lipidbestandteile gewählt werden können, die solche erforderlichen Nährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine bereitstellen, die zur Unterstützung des Lebens, des Wachstums und der Vermehrung der Zellen erforderlich sind.
Es gibt zahlreiche im Handel erhältliche Grundmedien, die in den erfindungsgemäßen Medien verwendet werden können. Ein Beispiel für solche im Handel erhältlichen Grundmedien ist die TC10-Brühe ohne Tryptose [im Handel von Microbiological Associates erhältlich; vgl. Gardiner et al., J. Invert. Pathol. 25 (1975), 363], Grace's Antheraea-Medium [Vaughn et al., TCA Manual 3(1) (1976); Yunker et al., Science 155 (1967), 1565-1566], M20-Medium von Mark's [Vaughn et al., TCA Manual 3(1) (1976); Marks, In Kruse et al. (Hrsg.), Tissue Culture Methods and Applications (1973), 153- 156], Goodwin's IPL-52-Medium [Goodwin, In Vitro 11 (1975), 369-378], Goodwin's IPL-Medium [Goodwin et al., In Kurstak et al. (Hrsg.), Invertebrate Systems In Vitro (1980)], Goodwin's IPL-76-Pepton-Medium [Goodwin et al., id.; Goodwin et al., In Vitro 14 (1978), 485-494], Hink's TMH-FH-Medium (überarbeitet) [Hink, Nature (London) 226 (1970), 466-467], Medium S- 301 von Hansen [Hansen, In Maramorosch (Hrsg.), Invertebrate Tissue Culture Research Applications (1976), S. 75-99; Vaughn et al., TCA Manual 3(1) (1976)] und IPL-41-Medium [Weiss et al., In Vitro 17(6) (1981), 495-502], in dem IPL-41 ein bevorzugtes Grundmedium ist.
IPL-41 ist, wie vorstehend beschrieben, ein bevorzugtes Grundmedium zur Herstellung der erfindungsgemäßen Medien. Das Grundmedium IPL-41 ist aus unterschiedlichen Quellen im Handel erhältlich und wird von Weiss et al. in In Vitro 17(6) (Juni 1981), 495-502, und in CRC Press, a.a.O., (1986), S. 70-72, beschrieben. Die von Weiss et al. in In Vitro auf Seite 496 angegebene Tabelle 1 und die in CRC Press auf den Seiten 71 bis 72 dargestellte Tabelle 3 geben die Zusammensetzung von IPL-41 und die Konzentrationen der Bestandteile in mg/l wieder. Diese Tabellen sind hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen. Weiss et al. beschreiben in In Vitro auf Seite 497 die Herstellung des kompletten IPL-41-Mediums, dem Tryptosephosphatbrühe (TPB) und fötales Rinderserum (FBS) zugesetzt werden. Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen serumfreien Medien verwendete Grundmedium IPL-41 enthält weder Tryptosephosphatbrühe (TPB) noch fötales Rinderserum (FBS).
Einige erfindungsgemäße Gesichtspunkte betreffen die Verwendung eines Schutzstoffs. Ein Schutzstoff ist erforderlich, um eine Beschädigung und ein Absterben der Zellen bei guter Belüftung, wie sie in gut gerührten und Luft-durchströmten Kulturen vorgefunden wird, zu verhindern. Der Schutzstoff verhindert das Phänomen des Zerfalls/der Verklumpung von Insektenzellen, die in Schüttelflaschen gezüchtet werden, und das Haften der Zellen an den Gefäßwänden. Der Schutzstoff verringert außerdem die Menge der Zelltrümmer in einer Schüttelflaschenkultur, wodurch eine reduzierte Zellysis aufgrund der Gegenwart des Schutzstoffs angezeigt wird. Der Schutzstoff wirkt ferner vorzugsweise als Entschäumer, der den Verlust von Zellen aus der freien Suspension in eine Schaumschicht verhindert, und kann als die Oberflächenspannung von Blasen verringernder Stoff und/oder als ein Zelloberflächen stabilisierender Stoff und/oder als ein Viskositäts-steigernder Stoff wirken.
Schutzstoffe sind hier als nicht-toxische, wasserlösliche Verbindungen definiert, die funktionell den Schutz von Insektenzellen vor Beschädigung und Absterben in einer gerührten und Luft-durchströmten Insektenzellkultur bewirken. Die erfindungsgemäßen Schutzstoffe sind vorzugsweise nichttoxische, wasserlösliche Polymere. Ein geeigneter Schutzstoff kann gewählt werden, indem man sich zunächst davon überzeugt, daß er nicht toxisch für Insektenzellen ist, die durch Verfahren, die dem Fachmann für die Züchtung von Insektenzellen bekannt sind, gezüchtet werden, beispielsweise durch seine Zugabe zu einer Suspension oder einem Monolayer der zur Züchtung gewählten Insektenzellen, und indem das Wachstums der Kultur mit einer Kontrolle verglichen wird. Anschließend können die gewählten nicht-toxischen Schutzstoffe auf ihre Schutzwirkung in kleinem Maßstab getestet werden, indem der gewählte Stoff einer gerührten oder Luft-durchströmten Kultur der gewählten Insektenzellen zugesetzt wird und die Überlebens- und Wachstumsrate nach einem geeigneten Zeitraum beobachtet wird und die Überlebens- und Wachstumsrate der Zellen dieser Kultur mit der Überlebens- und Wachstumsrate der Zellen in einer Kontrollkultur verglichen werden.
Die Schutzstoffe sind vorzugsweise Stoffe, die Zelloberflächen stabilisieren und/oder die Viskosität steigern und/oder die Oberflächenspannung von Blasen reduzieren. Beispiele für bevorzugte Schutzstoffe sind Hydroxyethylstärke, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose (beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose), Dextransulfat, Polyvinylpyrrolidon, Ficoll, Alginsäure, Polypropylenglycol und nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergentien. Ein Schutzstoff, der aus diesen bevorzugten Schutzstoffen ausgewählt ist, ist in die erfindungsgemäßen, serumfreien Medien per se eingeschlossen.
Nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergentien werden in den erfindungsgemäßen Medien als Schutzstoffe bevorzugt. Ausgaben von McCutcheon "Emulsifiers & Detergents" (publiziert von der McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glenn Rock, NJ, USA) sind Beispiele für Quellen, in denen potentielle, nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergentien als Schutzstoffe für die erfindungsgemäßen Medien gefunden werden können, die auf eine fehlende Toxizität und eine Schutzwirkung, wie vorstehend beschrieben, getestet werden können. Bevorzugte nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergentien sind Blockcopolymere von Propylenoxid und Ethylenoxid (Polyoxypropylen- Polyoxyethylen-Kondensate), vorzugsweise "Pluronicpolyole", beispielsweise Pluronic F68, F77, F88 und F108, vorzugsweise F68 und F88, stärker bevorzugt F68. Die "Pluronicpolyole" sind im Handel von der BASF-Wyandotte Corp. (101 Cherry Hill road, P. O. Box 181, Parsippany, NJ 07054, USA) erhältlich.
Der Schutzstoff ist im erfindungsgemäßen Medium vorzugsweise in einer Konzentration vorhanden, die die Insektenzellen am wirksamsten vor einer Beschädigung schützt, ohne jedoch das Zellwachstum und die Vermehrung zu hemmen. Die polymeren "Pluronicpolyol"-Schutzstoffe sind in den erfindungsgemäßen Medien vorzugsweise in einer Konzentration (Gewicht/Volumen) von etwa 0,01 bis etwa 1%, stärker bevorzugt von etwa 0,05% bis etwa 0,5% und am stärksten bevorzugt von etwa 0,1% vorhanden.
Es wird weiter ein Schutzstoff, vorzugsweise ein polymerer Schutzstoff, vorgezogen, der auch als Emulgator des Lipidbestandteils der erfindungsgemäßen Medien wirkt. "Pluronicpolyole", vorzugsweise Pluronic F68 oder F88 und stärker bevorzugt Pluronic F68, sind Schutzstoffe/Emulgatoren der erfindungsgemäßen Medien, die zusammen mit (einem) Emulgator(en) wirken, der (die) in der Lösung aus einem Lipid/organischen Lösungsmittel bereits vorhanden ist (sind), das den Lipidbestandteil der erfindungsgemäßen Medien, wie nachstehend beschrieben, ausmacht. Der Schutzstoff der erfindungsgemäßen Medien muß jedoch kein Emulgator sein, um hier als Schutzstoffin die Definition eingeschlossen zu sein.
Wenn der Schutzstoff nicht gleichzeitig als Emulgator wirkt, enthalten die erfindungsgemäßen Medien zusätzlich einen Emulgator, der den Lipidbestandteil zusammen mit einem anderen Emulgator, der in geringer Konzentration im Lipidbestandteil selbst, wie nachstehend beschrieben, enthalten ist, emulgiert. Ein derartiger Emulgator als Alternative zu einem Schutzstoff/Emulgator ist vorzugsweise ein Detergens, vorzugsweise nicht-ionisch, das für die Züchtung von Insektenzellen in den Konzentrationen, die für die Emulgierung des Lipidbestandteils erforderlich sind, nichttoxisch ist.
Die Einführung der Lipidkomponente als Mikroemulsion fördert die Aufnahme der in den Medien enthaltenen Lipide durch die Zellen. Die Lipidkomponente kann beispielsweise durch ein duales Emulgatorsystem emulgiert werden, in dem, wie vorstehend beschrieben, der Schutzstoff sowohl ein Emulgator als auch ein Schutzstoff ist und zusammen mit einem Emulgator oder einer Kombination von Emulgatoren wirken kann, die in der Lösung aus Lipid/organischem Lösungsmittel vorhanden sind, aus dem die Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien besteht. Die Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien kann außerdem durch ein System emulgiert werden, in dem der Schutzstoff nicht stark emulgierend wirkt, in dem aber ein oder mehrere zusätzliche Emulgatoren in einer wäßrigen Lösung vorhanden sind, die zur Lipidkomponente der organischen Lösung zugesetzt wird und zusammen mit den darin vorhandenen Emulgatoren die Bildung einer Mikroemulsion bewirkt.
Ob ein Emulgator, ein schutzstoff/Emulgator, eine Kombination von Emulgatoren oder eine Kombination eines Schutzstoffs/Emulgators und eines oder mehrerer Emulgatoren die Lipidkomponente wirksam emulgieren können, kann, wie nachstehend beschrieben, einfach überprüft werden. Zunächst muß in der vorstehend beschriebenen Weise nachgewiesen werden, daß der gewählte Emulgator oder die Kombination von Emulgatoren für die gewählten Insektenzellen nicht-toxisch sind. Anschließend wird das Emulgierungsvermögen der (des) gewählten Emulgator(s)en bei den ermittelten nicht-toxischen Konzentrationen getestet. Die Lipide werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in einem Alkohol (C&sub1;-C&sub3;), stärker bevorzugt in Ethanol, gelöst. Der gewählte Emulgator oder jede der Emulgatorkombinationen wird anschließend mit dem Lipid in der organischen Lösung oder gesondert in einer wäßrigen Lösung kombiniert, je nachdem in welcher Lösung, d. h., der organischen oder wäßrigen, der gewählte Emulgator leichter kombinierbar ist. Anschließend wird die wäßrige Lösung dem Lipid in der organischen Lösung zugesetzt und heftig gerührt, beispielsweise mit Hilfe eines "Vortex"- Geräts. Nach dem Schütteln bildet sich nach einer erfolgreichen Emulgierung der Lipidkomponente eine klare bis leicht durchscheinende Mikroemulsion.
Beispiele für bevorzugte Emulgatoren, die der Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien zugesetzt werden, sind Phospholipide, vorzugsweise Lecithin, und nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergentien, vorzugsweise eine Polysorbatverbindung mit der Formel:
in der R eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,
t eine ganze Zahl von 10 bis 30 und u eine ganze Zahl von 10 bis 20 ist.
Am stärksten bevorzugt ist das (der) nicht-toxische, nicht-ionische, polymere Detergens/Emulgator Polyoxyethylen (20)-Sorbitanmonooleat, auch als Polysorbat 80 bekannt. Ein derartiges nicht-toxisches, nicht-ionisches polymeres Detergens kann als Tween 80 von ICI Americas Inc. (New Murphy Road & Concord Pike, Wilmington, DE 19897, USA) bezogen werden. Ein weiteres Polysorbat 80 kann als Durfax 80 von Durkee Industrial Foods Group/SCM Corp. (900 Union Commerce Bldg., Cleveland, Ohio 44115, USA) bezogen werden. Weitere verwendbare Emulgatoren aus nicht-toxischen, nicht-ionischen polymeren Detergentien sind in den Publikationen von McCutcheon "Emulsifiers and Detergents", a.a.O., beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Medien enthalten ein(en) derartige(s)n nicht-ionische(s)n, nicht-toxische(s)n polymere(s)n Detergens/Emulgator, wie Polysorbat 80, in einer Konzentration von etwa 5 mg/l bis etwa 75 mg/l, stärker bevorzugt von etwa 20 mg/l bis etwa 30 mg/l und am stärksten bevorzugt von etwa 25 mg/l.
Es wird in den erfindungsgemäßen Medien beispielsweise ein duales Emulgatorsystem bevorzugt, in dem ein Schutzstoff/Emulgator, vorzugsweise ein "Pluronicpolyol", stärker bevorzugt Pluronic F68 oder Pluronic F88 und noch stärker bevorzugt Pluronic F68, zusammen mit einem nicht-toxischen, nicht-ionischen polymeren Detergens, vorzugsweise einer Polysorbatverbindung und stärker bevorzugt mit Polysorbat 80 verwendet wird.
Die Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien enthält neben einem oder mehreren Emulgatoren auch Lipide, die für das Zellwachstum essentiell sind. Derartige Lipide werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Fettsäuren, Steroiden und lipidlöslichen Vitaminen besteht. Derartige Fettsäuren sind vorzugsweise Fettsäureester, stärker bevorzugt mehrfachungesättigte Fettsäureester und noch stärker bevorzugt mehrfachungesättigte Fettsäuremethylester. Ein bevorzugtes Gemisch mehrfachungesättigter Fettsäuremethylester für die erfindungsgemäßen Medien ist Fisch (vorzugsweise Dorsch) - Lebertran, der außerdem Vitamin A enthält. Die Steroide sind vorzugsweise Sterole und stärker bevorzugt Cholesterin. Zu den lipidlöslichen Vitaminen gehören Vitamin E (alpha- Tocopherol) sowie Vitamin A.
Die Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien besteht ferner aus einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol mit ein bis drei Kohlenstoffatomen und stärker bevorzugt aus Ethanol.
Ein Gemisch mehrfachungesättigter Fettsäuremethylester, wie beispielsweise Fisch (vorzugsweise Dorsch) - Lebertran, ist in den Medien vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 mg/l bis etwa 50 mg/l, stärker bevorzugt von etwa 5 mg/l bis etwa 15 mg/l und am stärksten bevorzugt etwa 10 mg/l, enthalten. Bei diesen Konzentrationen für Dorsch-Lebertran sind die bevorzugten Konzentrationen des fettlöslichen Vitamins A ebenfalls vorhanden. Die Konzentration von Sterol, vorzugsweise Cholesterin, ist etwa 2 mg/l bis etwa 7 mg/l, stärker bevorzugt etwa 3 mg/l bis etwa 5 mg/l und am stärksten bevorzugt etwa 4,5 mg/l. Die Konzentration des Alkohols, vorzugsweise Ethanol, ist etwa 0,5 ml/l bis etwa 5 ml/l, stärker bevorzugt etwa 1 ml/l. Die Konzentration des alpha-Tocopherols der Lipidkomponente ist etwa 0,5 mg/l bis etwa 4 mg/l, stärker bevorzugt etwa 2 mg/l.
Die Lipidkomponente wird als Mikroemulsion dem Hauptteil der erfindungsgemäßen Medien zugesetzt. Eine Mikroemulsion der Lipidkomponente bietet den Vorteil, daß sie durch die Insektenzellen besser verwertet sowie die gesonderte Sterilfiltration der Lipidkomponente und des restlichen Mediums gegebenenfalls vermieden werden kann. Die Lipidkomponente kann als Mikroemulsion ohne vorherige Sterilfiltration den Medien zugesetzt werden, und das Gesamtmedium kann anschließend sterilfiltriert werden, ohne daß Probleme auftreten, weil beispielsweise globuläre Lipide während der Sterilfiltration verloren gehen. Für eine Produktion in großem Maßstab ist dies ein signifikanter Vorteil.
Die Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien wird hergestellt, indem das Lipidgemisch, vorzugsweise als Gemisch von mehrfachungesättigten Fettsäuren, alpha-Tocopherol und Cholesterin, und ein oder mehrere Emulgatoren in der richtigen Dosierung in einer geeigneten Menge des organischen Lösungsmittels, vorzugsweise in einem C&sub1;-C&sub3;-Alkohol, unter Auflösung vermischt werden. Anschließend kann eine wäßrige Lösung, die einen Emulgator (oder Schutzstoff/Emulgator) enthält, ein etwa zehnfach größeres Volumen als die Lösung der Lipidkomponente aufweist und gegebenenfalls sterilfiltriert ist, langsam, gegebenenfalls steril, und unter Schütteln, beispielsweise mit Hilfe eines "Vortex"-Geräts, der Lösung der Lipidkomponente zugesetzt werden. So entsteht die Mikroemulsion der Lipidkomponente. Das Lipid wird den Medien als Mikroemulsion zugesetzt. Anschließend kann die Lipidkomponente gegebenenfalls leicht filtriert und sterilisiert oder das Gesamtmedium nach Zugabe aller Zusätze sterilfiltriert werden.
Ein Beispiel einer Lipidkomponente der erfindungsgemäßen Medien enthält pro Liter Medium:
10 mg Dorsch-Lebertran,
25 mg Tween 80,
4,5 mg Cholesterin,
2 mg alpha-Tocopherol und
1 ml Ethanol.
Der gegebenenfalls filtrierten/sterilisierten Lösung der Lipidkomponente (1 ml) werden dann in den nachstehend beschriebenen Beispielen 10 ml 10% wäßriges Pluronic F68 (gegebenenfalls filtriert/sterilisiert) langsam unter Schütteln, beispielsweise mit Hilfe eines "Vortex"-Geräts, zugesetzt.
Die Peptonkomponente der erfindungsgemäßen serumfreien Medien kann aus zahlreichen hydrolysierten Proteinprodukten, entweder allein oder in Kombination, ausgewählt werden, wobei ohne Einschränkung Ochsenleber-Aufschlußprodukte, beispielsweise "Panmede" (Paines & Byrnes Ltd., Greenford, England), Hefeextrakt, beispielsweise "Yeastolate" (vorzugsweise TC "Yeastolate" von Difco, USA), Casein-Aufschlußprodukte, beispielsweise "Bactocasitone" (Difco USA), Tryptosephosphatbrühe (TPB) mit Tryptose als Pepton, Lactalbuminhydrolysat (LH) (Difco USA), Gelatinepepton, Glycerin-Gelatinepepton und Rinderpepton neben vielen anderen proteolytischen Protein- Aufschlußprodukten eingeschlossen sind.
Die Peptonkomponente besteht vorzugsweise aus einer oder mehreren Peptonfraktionen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die TPB, ein Caseinabbauprodukt, vorzugsweise "Bactocasitone", Ochsenleberaufschlußprodukt, vorzugsweise "Panmede", Hefeextrakt, vorzugsweise "Yeastolate" und Lactalbuminhydrolysat (LH) umfaßt. Die Peptonkomponente umfaßt, stärker bevorzugt, entweder LH oder "Yeastolate", einzeln oder zusammen. Die Peptonkomponente umfaßt, noch stärker bevorzugt, entweder eine Kombination von LH und "Yeastolate" oder "Yeastolate" allein.
Die in den erfindungsgemäßen Medien vorhandene Pepton- Gesamtkonzentration kann so hoch wie die Summe der Maximalkonzentrationen der einzelnen Peptonfraktionen sein, wobei diese Maximalkonzentration für jede Peptonfraktion nicht-toxisch und nicht-hemmend für das Zellwachstum und die Pepton-Gesamtkonzentration dieser nicht-toxischen, nicht-hemmenden Maximalkonzentrationen der Peptonfraktionen für das Zellwachstum in ähnlicher Weise nicht-toxisch und nicht-hemmend sein muß. Die maximalen Peptonkonzentrationen ändern sich nicht nur mit den jeweils verwendeten Peptonfraktionen, sondern auch mit der gewählten Insektenzellinie. Üblicherweise ist die bevorzugte Pepton-Gesamtkonzentration in den erfindungsgemäßen Medien im Bereich von etwa 1 g/l bis etwa 12 g/l, stärker bevorzugt von etwa 2 g/l bis etwa 8 g/l und am stärksten bevorzugt von etwa 3 g/l bis etwa 5 g/l.
Ein Beispiel einer verwendbaren Peptonkomponente der erfindungsgemäßen Medien, die für die Spodoptera frugiperda-Sf9-Zellinie verwendet wird, ist ein Gemisch von TPB (von etwa 0 g/l bis etwa 5 g/l, vorzugsweise etwa 2,5 g/l), "Bactocasitone" und "Panmede", wobei die letzten beiden Peptone jeweils eine Konzentration von etwa 0 g/l bis etwa 5 g/l, vorzugsweise jeweils eine Konzentration von etwa 1 g/l, einen Hefeextrakt, vorzugsweise "Yeastolate", in einer Konzentration von etwa 1 g/l bis etwa 6 g/l, vorzugsweise von etwa 2 g/l bis etwa 5 g/l, und LH in einer Konzentration von etwa 0 g/l bis etwa 6 g/l, vorzugsweise etwa 1 g/l bis etwa 4 g/l, aufweisen. TPB fehlt vorzugsweise in dieser Peptonkomponente. Stärker bevorzugt fehlen auch TPB, das Casein- Aufschlußprodukt ("Bactocasitone"), und das Ochsenleberaufschlußprodukt ("Panmede") in der Peptonkomponente, und die Peptonkomponenten sind Hefeextrakt, vorzugsweise "Yeastolate", als einzigen Bestandteil in einer Konzentration von etwa 2 g/l bis etwa 5 g/l, stärker bevorzugt von etwa 4 g/l, oder eine Kombination von "Yeastolate" und LH, jeweils in Konzentrationen von etwa 0,5 g/l bis etwa 4 g/l, wobei die Pepton-Gesamtkonzentration etwa 3 g/l bis etwa 5 g/l, vorzugsweise etwa 4 g/l, ist, und "Yeastolate" und LH stärker bevorzugt jeweils Konzentrationen von etwa 2 g/l aufweisen.
Ein weiteres bevorzugtes Beispiel einer Peptonkomponente der erfindungsgemäßen serumfreien Medien umfaßt "Yeastolate" und LH in einer Konzentration von jeweils etwa 0,5 g/l bis etwa 6 g/l, vorzugsweise von etwa 1 g/l bis etwa 4 g/l und stärker bevorzugt in einer Konzentration von jeweils etwa 2 g/l. Wie vorstehend beschrieben, ist das "Yeastolate"/LH-Verhältnis ausgeglichen, so daß die Pepton- Gesamtkonzentration der Medien innerhalb des angegebenen Bereichs, und am stärksten bevorzugt bei etwa 4 g/l, liegt.
Vorzugsweise werden die Peptone, aus denen die Peptonkomponente der erfindungsgemäßen serumfreien Medien besteht, zuvor durch Ultrafiltration gereinigt, um (1) alle noch verbliebenen Proteasen, die während der Produktion des Peptonprodukts verwendet werden, (2) sämtliche Endotoxine und (3) alle Bestandteile mit hohem Molekulargewicht zu entfernen, die die Reinigung der rekombinanten Produkte, die durch die Wirts-Insektenzellen nach einer Infektion mit einem rekombinanten Baculovirus exprimiert werden, oder viraler Produkte, die durch Insektenzellen nach einer Infektion mit Wildtyp-Viren produziert werden, behindern könnten. Verbliebene Proteasen könnten die durch die Insektenzellen produzierten rekombinanten Proteine oder viralen Produkte abbauen (beispielsweise durch einen Abbau der Proteinhülle der Viruspartikel), und daher wird die Ultrafiltration der Peptonfraktionen als ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Medien angesehen. Die Peptonfraktion(en) wird (werden) zunächst vorzugsweise vorfiltriert und anschließend durch eine Membran ultrafiltriert, wobei zur Erleichterung einer späteren Reinigung eine Ausschlußgrenze für Molekulargewichte gewählt wird, die unterhalb des Molekulargewichts des rekombinanten oder viralen Produkts liegt, vorzugsweise eine Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 2 bis 15 000, stärker bevorzugt eine Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 2 bis 10 000 und noch stärker bevorzugt eine Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 000, beispielsweise eine PM10-Membran (Amicon). Ein derartiges Ultrafiltrationsverfahren wird vorzugsweise in einer Querstrom- Filtrierapparatur durchgeführt, beispielsweise zur Produktion in kleinem Maßstab in einem Rührdruckbehälter oder zur Herstellung in großem Maßstab in einer Hohlfaserpatrone oder einem Rahmenfilter. Das Ultrafiltrat wird anschließend vor der Zugabe zum Grundmedium, dem die anderen Bestandteile der erfindungsgemäßen Medien ebenfalls zugesetzt werden, gegebenenfalls sterilfiltriert.
Eine bevorzugte Peptonkomponente der erfindungsgemäßen serumfreien Medien wird, wie nachstehend beschrieben, hergestellt:
Eine 10% Stammlösung von TC-"Yeastolate" (Difco) wird durch einen 0,45 Micron-Filter vorfiltriert. Das Filtrat wird anschließend durch eine Membran (Amicon PM10) mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 000 ultrafiltriert. Das Ultrafiltrat wird anschließend sterilfiltriert und 20 ml davon einem Liter Grundmedium zugesetzt, das vorzugsweise bereits die vorstehend beschriebene Lipidemulsion enthält. Eine 10% LH-Stammlösung wird vorfiltriert, ultrafiltriert und anschließend, wie für die "Yeastolate"-Fraktion beschrieben, sterilfiltriert, und davon werden dem Medium ebenfalls 20 ml zugesetzt.
Die erfindungsgemäßen serumfreien Medien können gegebenenfalls weitere wasserlösliche Bestandteile enthalten, beispielsweise α-Glycerinphosphat (in einer Konzentration von etwa 0,25 g/l bis etwa 4 g/l, vorzugsweise von etwa 0,5 g/l bis etwa 2 g/l und stärker bevorzugt etwa 1 g/l), Glycerin (in einer Konzentration von etwa 0,5 g/l bis etwa 5 g/l, vorzugsweise von etwa 1 g/l bis etwa 3 g/l und stärker bevorzugt etwa 2 g/l), Folsäure (in einer Konzentration von etwa 1 mg/l bis etwa 7 mg/l, vorzugsweise von etwa 2 mg/l bis etwa 5 mg/l und stärker bevorzugt etwa 3,5 mg/l) und Inosit (in einer Konzentration von etwa 2 mg/l bis etwa 20 mg/l, vorzugsweise von etwa 5 mg/l bis etwa 15 mg/l und stärker bevorzugt etwa 10 mg/l). Weitere wasserlösliche Bestandteile können gegebenenfalls auch Peroxid abbauende Enzyme, beispielsweise eine Katalase, in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/l bis etwa 10 mg/l, vorzugsweise von etwa 1 mg/l bis etwa 5 mg/l und stärker bevorzugt etwa 3 mg/l, sein.
Wie nachstehend in Beispiel 6 beschrieben, wurden jedoch derartige zusätzliche, wasserlösliche Bestandteile aus den erfindungsgemäßen Medien entfernt, um zu untersuchen, welche Wirkung dies hat und wie das Medium vereinfacht und potentielle Inhibitoren des Zellwachstums vollständig entfernt werden können. Voruntersuchungen zeigten, daß die Entfernung der kostspieligsten, zusätzlichen, wasserlöslichen Bestandteile, der α-Glycerinphosphate, für das Zellwachstum vorteilhaft sein würde. Weitere Untersuchungen, in denen sämtliche zusätzlichen wasserlöslichen Bestandteile aus dem Medium eliminiert wurden, zeigten, daß sich die Länge der Lag-Phase verkürzte und sich die jeweilige Wachstumsrate erhöhte. Daher enthalten die bevorzugten, erfindungsgemäßen, serumfreien Medien keine derartigen zusätzlichen wasserlöslichen Bestandteile.
Zu den Insektenzellen, die in den erfindungsgemäßen serumfreien Medien erfolgreich gezüchtet werden und nach einer Infektion mit Wildtyp-Viren bzw. rekombinanten Baculoviren virale Produkte oder rekombinante Proteine produzieren können, gehören die, die nachweislich in einem serumhaltigen Medium wachsen und sich vermehren können und rekombinante und/oder virale Produkte exprimieren können. Daher können in serumhaltigen Medien kultivierbare Insektenzellen in den erfindungsgemäßen Medien gezüchtet werden, in denen das Serum der üblichen Medien gegen die vorzugsweise ultrafiltrierte Lipid- und Peptonkomponente und gegebenenfalls gegen einen hier beschriebenen Schutzstoff ausgetauscht ist,vorzugsweise, wenn die Kultur gut belüftet werden soll.
Insektenzellen, die in dem etwa 10% Serum enthaltenden Grundmedium IPL-41 kultivierbar sind, können auch in einem erfindungsgemäßen serumfreien Medium gezüchtet werden. Insektenzellinien von Bombyx mori, Lymantria dispar, Trichoplusia ni und Spodoptera frugiperda sind Beispiele für Insektenzellen, die erfolgreich in etwa 10% Serum enthaltenden Grundmedien, wie IPL-41, gezüchtet werden konnten. [Vgl. auch Granados et al. (Hrsg.), The Biology of Baculoviruses (CRC Press 1986), Vaughn, Adv. Cell. Cult. 1 (1981), 281, Vaughn J. Invert. Pathol. 28 (1976), 233, Vaughn, In Maramorosch (Hrsg.), Invert. Tissue Culture: Research Applics. (1976), S. 295, und Vaughn, In, Barigozzi (Hrsg.), Proceedings of Internatl. Colloq. Invert. Tissue Culture (2nd, Tremezzo, 1967), (1968), S. 119].
Die in den erfindungsgemäßen Medien kultivierbaren Insektenzellen können außerdem zu jeder Ordnung der Klasse Insekten gehören, die als Wirte für ein Baculovirus- Expressionsvektorsystem oder andere Wildtyp-Viren verwendet werden können, sie gehören jedoch vorzugsweise zur Ordnung der Dipteren oder Lepidopteren. Etwa 300 Insektenarten wurden beschrieben, die am Nuclear-Polyhedrosis-Virus (NPV) erkranken, wobei die Mehrzahl (243) von Lepidopteren isoliert wurde. [Weiss et al., "Cell Culture Methods for Large-Scale Propagation of Baculoviruses", In Granados et al. (Hrsg.), The Biology of Baculoviruses: Bd. II Practical Application for Insect Control (1986), auf S. 64 der Seite 63 bis 87].
Geeignete Insektenzellinien stammen beispielsweise von den nachstehend aufgeführten Insekten: Carpocapsa pomonella (vorzugsweise die Zellinie CP-128), Trichoplusia ni (vorzugsweise die Zellinie TN-368), Autographa californica, Spodoptera frugiperda (vorzugsweise die Zellinie Sf9), Lymantria dispar, Mamestra brassicae, Aedes albopictus, Orgyia pseudotsugata, Neodiprion sertifer, Aedes aegypti, Antheraea eucalypti, Gnorimoschema opercullela, Galleria mellonella, Spodoptera littolaris, Blatella germanica, Drosophila melanogaster, Heliothis zea, Spodoptera exigua, Rachiplusia ou, Plodia interpunctella, Amsaeta moorei, Agrotis c-nigrum, Adoxophyes orana, Agrotis segetum, Bombyx mori, Hyponomeuta malinellus, Colias eurytheme, Anticarsia germmetalia, Apanteles melanoscelus, Arctia caja und Porthetria dispar . . Bevorzugt sind Insektenzellinien von Spodoptera frugiperda, und besonders bevorzugt ist die Zellinie Sf9. Die hier in den Beispielen verwendete Zellinie Sf9 wurde von Max D. Summers (Texas A & M University, College Station, TX 77843 USA) erhalten. Weitere Zellinien von S. frugiperda, beispielsweise IPL-Sf-21AE III, sind in Vaughn et al., In Vitro 13 (1977), 213-217, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Insektenzellinien können zur Reproduktion von zahlreichen für Insekten pathogenen Viren verwendet werden, beispielsweise für Parvoviren, Pockenviren, Baculoviren und Rhabdoviren, von denen die Nuclear- Polyhedrosis-Viren (NPV) und Granulosis-Viren (GV) von der Gruppe der Baculoviren vorgezogen werden. Ferner sind NPV- Viren bevorzugt, beispielsweise von Autographa spp., Spodoptera spp., Trichoplusia spp., Rachiplusia spp., Galleria spp. und Lymantria spp . . Stärker bevorzugt sind die Baculovirus- Stämme Autographa californica NPV (AcNPV), Rachiplusia ou NPV, Galleria mellonella NPV und alle Plaque-gereinigten Stämme von AcNPV, beispielsweise E2, R9, S1 und M3, die von Smith et al., in J. Virol. 30 (1979), 828-838, J. Virol. 33 (1980), 311-319, sowie Virol. 89 (1978), 517-527, charakterisiert und beschrieben sind.
Die europäische Patentanmeldung 127 839 (am 12. Dezember 1984 veröffentlicht) von Smith et al. offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus- Expressionsvektors, der ein gewähltes Gen in einer Insekten- Wirtszelle exprimieren kann. Diese europäische Anmeldung ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen. Der rekombinante Baculovirus-Expressionsvektor wird gemeinsam mit Wildtyp- Baculovirus-DNA in eine Insekten-Wirtszelle, in der die Rekombination erfolgt, transfiziert. Die rekombinanten Baculoviren werden anschließend gemäß den Verfahren, die in EP 127 839 und bei Summers et al. in "A Manual and Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", a. a. O., beschrieben sind, nachgewiesen und isoliert. Das erhaltene rekombinante Baculovirus wird anschließend zur Infektion von gezüchteten Insektenzellen verwendet und das Proteinprodukt des jeweiligen aufgenommenen Gens durch die Insektenzellen exprimiert und in das Medium sezerniert. Es wird die Produktion von rekombinantem β-Interferon, Interleukin-2 und der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) durch Züchtung von S. frugiperda-Zellen erläutert, die mit einem rekombinanten AcNPV-Expressionsvektor infiziert sind, in dessen Genom das geeignete Gen inseriert worden ist. Für weitere Informationen, die ein derartiges rekombinantes Baculovirus-Expressionssystem und seine Verwendung zur Expression rekombinanter Proteine betreffen, vgl. Summers et al., id . .
Die EP-Veröffentlichung Nr. 127 839 offenbart Verfahren zur Herstellung rekombinanter Baculovirus-Transfervektoren und rekombinanter Baculoviren und zur Verwendung des rekombinanten Baculovirus-Expressionssystems zur Expression rekombinanter Proteine in Insekten-Wirtszellen.
Entsprechend den erfindungsgemäßen Beispielen wird das rekombinante CSF-1 durch die erfindungsgemäß gezüchteten Insektenwirtszellen produziert. Der Fachmann, für den diese Beschreibung, sowie die vorstehenden, hier durch Bezugnahme eingeschlossenen Anmeldungen von Vorteil sind, wird erkennen, daß außerdem auch viele andere rekombinante Proteine durch die erfindungsgemäß mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten Insektenzellen produziert werden können. Weitere heterologe Proteine, die mittels BEVS in Insektenzellen exprimiert worden sind, werden von Summers et al. in Banbury Report: Genetically Altered Viruses in the Environment 22 (1985), 319-329, beschrieben. Dazu gehören beispielsweise auch uneingeschränkt die rekombinanten Proteine der gleichzeitig anhängigen Anmeldungen desselben Anmelders (Cetus Verzeichnis-Nrn. 2347, 2382 und 2883), wie Kolonie-stimulierende Faktoren [beispielsweise die lange und kurze Form von CSF-1 oder M-CSF (nachstehend beschrieben), G-CSF, GM-CSF, Interleukin-3 etc.], modifizierte Pro-Urokinase oder Urokinase, der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA), TPA-Urokinasehybride, toxische Proteine, beispielsweise das vollständige Ricintoxin, die Ricin A-Kette, Produkte, die Ricin A enthalten, sowie Interf erone (α, β und γ und deren Hybride), Interleukine, der Tumornekrose-Faktor, Erythropoietin und weitere hämopoetische Wachstumsfaktoren, das menschliche Wachstumshormon, sowie Schweine- und Rinderwachstumshormone etc., der epidermale Wachstumsfaktor, Insulin, der Hepatitis B-Impfstoff, die Superoxid-Dismutase, der Faktor VIII, Faktor VIII C, atriale natriuretische Faktor, Katzen-Leukämievirus- Impfstoffe, beispielsweise gp70-Polypeptide, Lectine, beispielsweise Ricin communis-Agglutinin (RCA), das Diptherie- Toxin, Gelonin, Exotoxin von Pseudomonas aeruginosa, toxische Proteine von Phytolacca americana (PAPI, PAPII und PAP-S), insektizide Proteine von Bacillus thuringiensis, viele Enzyme, beispielsweise CAT, sowie zahllose weitere Hybridproteine.
Der Begriff "Kolonie-stimulierender Faktor (CSF-1)" bezeichnet ein Protein, das das im Stand der Technik für CSF- 1 bekannte Aktivitätsspektrum zeigt, d. h., bei einer in vitro-Verwendung im Standard-Koloniestimulierungstest von Metcalf, J. Cell Physiol. 76 (1970), 89, bewirkt es primär die Bildung von Macrophagen-Kolonien. Natives CSF-1 ist ein glycosyliertes Dimer. Die Dimerbildung ist möglicherweise für die Aktivität erforderlich. Der Begriff CSF-1 bezeichnet hier sowohl dimere als auch monomere Formen.
Menschliches CSF-1 wirkt sowohl auf menschliche Knochenmarkszellen als auch auf Knochenmarkszellen von Mäusen, während Maus-CSF-1 bei menschlichen Zellen keine Aktivität zeigt. Daher müßte menschliches CSF-1 im spezifischen Maus-Radiorezeptortest von Das et al., Blood 58 (1981), 630, positiv sein. Die biologische Aktivität des Proteins wird zudem durch menschliches Urin-CSF-1 neutralisierendes Antiserum gehemmt. Das et al., id . .
CSF-1 kann die Sekretion von Prostaglandinen der Reihe E, Interleukin-1 und Interferon von reifen Makrophagen stimulieren. Moore et al., Science 223 (1984), 178. Die Fähigkeit des Proteins zur Stimulierung der Bildung von Monocyten/Makrophagen-Kolonien unter Verwendung von Knochenmarkszellen (Knochenmarkstest) und seine Empfindlichkeit gegen eine Hemmung durch ein neutralisierendes Antiserum gegen gereinigtes menschliches Urin-CSF-1 sowie eine positive Antwort im Radiorezeptortest (RRA) oder im üblichen Radioimmuntest (RIA) können zur Identifizierung von durch Insektenzellen mittels eines rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektorsystems (BEVS) produzierten CSF-1 verwendet werden.
Die in den erfindungsgemäßen serumfreien Medien gezüchteten Insektenzellen werden in einem Temperaturbereich und unter Bedingungen gezüchtet, die für die gewählte Zellinie geeignet sind. Beispielsweise werden Spodoptera frugiperda-Zellen, vorzugsweise Sf9-Zellen, in einem Temperaturbereich von etwa 25ºC bis etwa 32ºC, vorzugsweise von etwa 27ºC bis etwa 28ºC, gezüchtet, wobei der pH-Wert des Kulturmediums vorzugsweise in einem Bereich von etwa 6 bis etwa 7, stärker bevorzugt von etwa 6,2 bis etwa 6,4, gehalten wird.
Es ist gezeigt worden, daß der Zeitpunkt der Infektion der Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus für eine erhöhte spezifische Produktivität kritisch ist. Es wurde festgestellt, daß die jeweilige Produktion des rekombinanten Proteins während der exponentiellen Phase des Zellwachstums unter Bedingungen, unter denen kein Sauerstoffmangel herrscht, konstant ist. Feine späte Infektion bei nicht-exponentiellen Wachstumsbedingungen führte zu einer jeweils geringeren Produktivität und einem niedrigeren Endtiter. Es wird vorgezogen, die exponentielle Wachstumsphase bis zu den, höchst möglichen Zelldichten auszudehnen, um die höchste Gesamtproduktivität für das rekombinante Proteinprodukt zu erreichen. Eine Infektion der Insekten-Wirtszellen unter Bedingungen, die das Wachstum einschränken, beispielsweise in der stationären Phase des Zellwachstums, führt jeweils zu einer reduzierten Produktivität für das rekombinante Proteinprodukt.
Die jeweilige Produktivität für das rekombinante Proteinprodukt ist relativ unabhängig von der Zelldichte zum Zeitpunkt der Infektion, wenn die Kultur sich in exponentiellem Wachstum befindet.
Der Zeitpunkt der Ernte des rekombinanten Proteinprodukts ist kritisch, da vermieden werden muß, daß das rekombinante Protein durch Virus- und Zellysisproteine verunreinigt wird, und um die anschließende Reinigung des rekombinanten Produkts zu erleichtern. Unter Berücksichtigung der Stabilität des Produkts wird es vorgezogen, das rekombinante Produkt vor Eintritt einer signifikanten Zellysis zu ernten. Ferner muß jedes rekombinante Protein oder virale Produkt, das durch die erfindungsgemäßen Verfahren und in den erfindungsgemäßen Medien produziert werden soll, daraufhin überprüft werden, ob es während des Fermentierungsverfahrens stabil bleibt oder abgebaut wird. Durch eine derartiges Vorgehen kann der optimale Erntezeitpunkt festgelegt werden.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben die erfindungsgemäßen serumfreien Medien, die Züchtung von Insektenzellen in derartigen Medien unter Bedingungen, unter denen kein Sauerstoffmangel herrscht, und die Produktion von rekombinanten Proteinprodukten durch derartige Insektenzellen mittels eines rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektorsystems. Diese Beispiele sollen den schutzbereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.

Beispiel 1

Entwicklung eines serumfreien Wachstumsmediums

Dieses Beispiel skizziert die Entwicklung eines serumfreien Mediums zur Züchtung von Insektenzellen. Die Ergebnisse der Züchtung von Spodoptera frugiperda-Zellen (Sf9) in serumhaltigen Medien wurden mit denen der Züchtung von Insektenzellen in zwei verwendbaren serumfreien Medien verglichen.
Als Kontrollmedium wurde das komplette IPL-41-Medium verwendet, wie in Weiss et al., In Vitro 17 (6) (Juni 1981), 495-502, beschrieben, das hergestellt wird, indem dem IPL-41- Grundmedium 2% (Vol./Vol.) Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 10% (Vol./Vol.) fötales Rinderserum (FBS) zugesetzt werden. Ein derartiges komplexes Kontrollmedium enthält Serum und Proteinhydrolysate in einer Protein-Gesamtkonzentration von etwa 7 g/l.
Das verwendete serumfreie Medium #1 (SFM #1) wurde hergestellt, indem dem IPL-41-Grundmedium, das heißt, dem kompletten IPL-41-Medium, dem die TPB und das FBS fehlen, folgendes zugesetzt wurde:
Tryptosephosphatbrühe 2,6 g/l
Rinderserumalbumin (ohne Fettsäuren) 1,0 g/l
Glycerin 2,0 g/l
"Pluronicpolyol" (F68) 1,0 g/l
Alpha-Glycerinphosphat 1,0 g/l
Folsäure 3,6 mg/l
Dorsch-Lebertran 10,0 mg/l
Tween 80 25,0 mg/l
Cholesterin 4,5 mg/l
α-Tocopherolacetat 2,0 mg/l.
Das verwendete serumfreie Medium #2 (SFM #2) wurde in ähnlicher Weise hergestellt, indem dem IPL-41-Grundmedium folgendes zugesetzt wurde:
Tryptosephosphatbrühe 2,6 g/l
Hefeextrakt 1,0 g/l
"Bactocasitone" 1,1,0 g/l
"Panmede" 1,0 g/l
Rinderserumalbumin (ohne Fettsäuren) 1,0 g/l
Glycerin 2,0 g/l
Alpha-Glycerinphosphat 1,0 g/l
"Pluronicpolyol" (F68) 1,0 g/l
Inosit 10,0 mg/l
Catalase 3,0 mg/l
Folsäure 3,6 mg/l
Dorsch- Lebertran 10,0 mg/l
Tween 80 25,0 mg/l
Cholesterin 4,5 mg/l
α-Tocopherolacetat 2,0 mg/l.
Nach ein-, zwei- und dreimaligem Passagieren zeigten die Sf9-Zellen in SFM #1 ein Wachstum, das im Vergleich zu den Zellen in serumhaltigen Kontrollmedien im Hinblick auf Geschwindigkeit und die letztendliche Zelldichte signifikant reduziert war. Weiteres Passagieren in dem Medium führte zu einer weiteren Verringerung des Wachstums.
Nach einmaligem Passagieren zeigten die in SFM #2 gezüchteten Sf9-Zellen eine lange Lag-Phase, wonach die Sf9- Zellen bis zu einer Dichte wuchsen, die für ein 10% Serum enthaltendes Medium zu erwarten ist. Nach zweimaligem Passagieren hatten sich die Zellen an das SFM #2 adaptiert und zeigten keine lange Lag-Phase mehr. Die Wachstumsrate und letztendliche Zelldichte waren wieder der von 10% FBS enthaltenden Kulturen vergleichbar. Es wurde gezeigt, daß SFM #2 auch nach siebenmaligem Passagieren das Wachstum von Sf9- Zellen förderte.

Beispiel 2

Modifiziertes SFM #2 fördert das Wachstum von Sf9-Zellen und die Expression von CSF-1

Dieses Beispiel zeigt, daß eine modifizierte Version des in Beispiel 1 beschriebenen SFM #2 sowohl das Wachstum der S. frugiperda-Zellen als auch die Produktion von rekombinantem CSF-1 (kurze Form) fördert, wenn die Sf9-Zellen mit dem rekombinanten Baculovirus AcM4 infiziert worden sind, das als Insertion innerhalb seines Genoms eine cDNA-Sequenz aufweist, die ein biologisch aktives Kolonie-stimulierendes Faktor 1 (CSF-1)-Protein codiert. Sowohl die modifizierte SFM #2-Kultur als auch die 10% Serum enthaltende Kontrollkultur der Sf9-Zellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert waren, produzierten etwa 300 000 E/ml rekombinanten CSF-1.
50 ml-Kulturen von Sf9-Zellen wurden in 250 ml Schüttelflaschen gezüchtet, die bei 27ºC bei einem Kreisradius von einem halben Zoll mit 150 Upm geschüttelt wurden. Die Gesamt-Zellzahl wurde mit einem Coulter-Zähler bestimmt und die Überlebensrate der Zellen durch Trypanblau- Ausschluß getestet. Die Zellen wurden entweder in einem kompletten IPL-41-Medium gehalten, wie vorstehend beschrieben, mit 2% TPB und 10% durch Erhitzen inaktiviertem FBS sowie 0,1% "Pluronicpolyol" (F68) oder in modifiziertem SFM #2 (SFM2M), wie unmittelbar anschließend beschrieben.
Das SFM #2 von Beispiel 1 enthält 1 g/l Rinderserumalbumin (BSA). Der andere Hauptersatzstoff für Serum ist eine Kombination von drei Peptonen, Hefeextrakt, "Bactocasitone" und "Panmede", von denen jeweils 1 g/l zugesetzt wird. Eine Modifizierung des Peptongehalts von SFM #2 zur Vereinfachung der späteren Reinigung des rekombinanten Proteinprodukts wurde getestet. Neben den 3 g/l an Peptonen enthält das SFM #2 außerdem 2,6 g/l Tryptosephosphatbrühe (2 g/l Tryptose wie das komplette IPL-41-Medium). Es wurde festgestellt, daß die Peptonkonzentration kritisch war, wenn bei einer TPB-Konzentration von 2,6 g/l die Peptonkonzentration auf 1,5 g/l, 0,6 g/l, 0,3 g/l bzw. 0 g/l reduziert und die Wachstumskurven mit denen von Kulturen verglichen wurden, die bei 3 g/l an Peptonen gezüchtet worden waren. Das SFM #2- Medium mit einem Peptongehalt von 3 g/l ermöglichte eine zufriedenstellende Zellwachstumsrate, d. h., eine Verdopplungszeit (Td) der Population von 24 Stunden, verglichen mit 17 Stunden für eine übliche, 10% Serum enthaltende Kultur, und maximale, den 10% Serum enthaltenden Kulturen entsprechenden Zelldichten von 4 bis 5 · 10&sup6; Zellen/ml. Wenn jedoch die Peptonkonzentration von 3 g/l auf 0 g/l verringert wurde, reduzierte sich die maximal erreichbare Zelldichte signifikant.
Die Peptone wurden zur Entfernung (1) aller Bestandteile mit hohem Molekulargewicht, die die Produktreinigung behindern könnten, (2) eines potentiellen Proteasenrückstands aus dem Peptonproduktionsverfahren und (3) der Endotoxine ultrafiltriert. Die Peptone mit Ausnahme des TPB wurden in einem Rührdruckbehälter durch eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 (Amicon PM10) vor der Zugabe zum serumfreien Medium ultrafiltriert. Es wurde festgestellt, daß das Wachstum der Sf9-Zellen im serumfreien, das Peptonfiltrat enthaltenden Medium, dem Wachstum auf einem Gesamtpepton enthaltenden Medium vergleichbar war. Der Rückstand der ultrafiltrierten Peptone wurde 20 mal gegen Wasser diafiltriert. Es konnte nachgewiesen werden, daß er das Wachstum von Sf9-Zellen im Vergleich zu einer serumfreien Kultur, der kein zusätzliches Pepton zugesetzt wurde, nicht signifikant förderte.
Es wurde festgestellt, daß TPB die Reinigung des rekombinanten CSF-1 erschwert. Daher wurde TPB vor der Zugabe zum serumfreien Medium, wie vorstehend für die drei Peptone beschrieben, durch eine PM10-Membran ultrafiltriert. Wenn sowohl die PM10-filtrierte TPB als auch die drei Peptone, die ebenfalls PM10-Filtrate waren, vereinigt wurden, wuchsen die Sf9-Zellen zu einer maximalen Zelldichte, die mit der in 10% Serum enthaltenden Medien und der in nicht filtriertem SFM #2 vergleichbar war.
Daher enthält die neue, serumfreie, als SFM2M bezeichnete Version des Mediums, sämtliche Peptone einschließlich TPB, die zuvor ultrafiltriert wurden. Die Zellen wuchsen in einem 10% Serum enthaltenden Medium schneller als in SFM2M.
Die Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Baculovirus AcM4 durch eine gemeinsame Transfektion von Insektenzellen mit pAcM4 und Wildtyp-Baculovirus-DNA und durch anschließenden Nachweis und Reinigung des rekombinanten Baculovirus wurden im wesentlichen gemäß der US-Patentanmeldung durchgeführt. [Vgl. auch die europäische Patentanmeldung Nr. 127 839 und Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", a. a. O.].
Die Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus wurde bei einer relativ geringen Zelldichte (1 bis 1,5 · 10&sup6; Zellen/ml) mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 durchgeführt. Sowohl das SFM2M als auch die 10% Serum enthaltende Kontrollkultur produzierten 300 000 E/ml rekombinanten CSF-1. Die CSF-1-Mengen wurden im RIA ermittelt.
Der größte Teil des CSF-1 wurde innerhalb 48 Stunden nach der Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus und vor der Lyse der Zellen produziert. Zur Vermeidung einer Verunreinigung des Kulturüberstandes aufgrund einer Lyse der Zellen ist es wünschenswert, das rekombinante Proteinprodukt vor der Lyse der Zellen zu ernten.
Es wurde festgestellt, daß während der exponentiellen Wachstumsphase von den mit dem rekombinanten Baculovirus AcM4 infizierten Sf9-Zellen in SFM2M 106 E des rekombinanten CSF- 1/ml produziert werden konnten. Die jeweilige Produktion (E/Zelle) des rekombinanten CSF-1 schien während der exponentiellen Wachstumsphase unter Bedingungen, unter denen kein Sauerstoffmangel herrscht, konstant zu sein. Eine Infektion mit AcM4 bei einer Zelldichte von 2,7 · 10&sup6; Zellen/ml produzierte 1,2 · 10&sup6; E rCSF-1/ml im RIA und 2,5 · 10&sup6; E rCSF-1/ml im Biotest mit Knochenmark. [Die Knochenmarks- Proliferationstests werden gemäß Moore et al., J. Immunol. 131 (1983), 2374, und Prystowsky et al., Am. J. Pathol. 114 (1984), 149, durchgeführt]. Wenig abweichende Werte für rCSF- 1 (kurzer Clon) wurden durch Western-Analyse von den an den Tagen 1 bis 4 nach der Infektion genommenen Proben ermittelt. Eine späte Infektion unter nicht-exponentiellen Wachstumsbedingungen führte zu einer geringeren spezifischen Produktivität und einem geringeren Endtiter. Dies ließ den Schluß zu, daß eine Infektion bei einer höheren Zelldichte (allerdings noch in der exponentiellen Wachstumsphase) die rCSF-1-Produktion erhöht.

Beispiel 3

Ausschluß von BSA aus SFM2M

Dieses Beispiel zeigt, daß für Sf9-Zellen in 1 g/l Rinderserumalbumin (BSA) enthaltendem SFM2M ein vergleichbares Wachstum wie in BSA-defizientem SFM2M festgestellt wurde. Dementsprechend wurden in einem solchen, im wesentlichen proteinfreien Medium (BSA-defizientes SFM2M) die gleichen Mengen rCSF-1 wie in BSA enthaltendem SFM2M produziert.
50 ml-Kulturen von Sf9-Zellen wurden sowohl in SFM2M als auch in BSA-defizientem SFM2M in 250 ml-Schüttelflaschen, die mit 100 bis 150 Upm (mit einem Kreisradius von einem halben Zoll) bei 27ºC geschüttelt wurden, gezüchtet. Das rekombinante Baculovirus AcM4 wurde zur Infektion von exponentiell wachsenden Kulturen bei einer MOI von 1 verwendet. Ein Vergleich zwischen BSA-defizienten und BSA enthaltenden Kulturen zeigte eine geringe bzw. keine Wirkung auf die Wachstumsrate oder maximale Zelldichte.
Einige weitere, BSA-defiziente SFM2M-Kulturen von Sf9- Zellen wurden in Schüttelflaschen gezüchtet und mit AcM4 infiziert. Kulturvolumina von 25 bis 250 ml in 125 bis 1000 ml- Flaschen produzierten 4 oder 5 Tage nach der Infektion wiederholt 10&sup6; E rCSF-1/ml.
Eine Immunpräzipitation mit einer anschließenden SDS- PAGE und eine Westernanalyse zeigten, daß der rCSF-1 (kurzer Clon) in der Nährlösung dieses im wesentlichen proteinfreien Mediums, daß heißt, in BSA-defizientem SFM2M, nicht abgebaut wird.
Das BSA-defiziente SFM2M enthält noch 3 mg/l Katalase und 5 g/l eines Peptongemisches mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000. Die Zusammensetzung von BSA-defizientem SFM2M ist nachstehend beschrieben:

IPL-41-Grundmedium

Ultrafiltrierte Peptone

Tryptosephosphatbrühe 2,6 g/l
"Bactocasitone" (Caseinaufschlußprodukt) 1 g/l
"Panmede" (Ochsenleberaufschlußprodukt) 1 g/l
"Yeastolate" (Hefeextrakt) 1 g/l

Zusätzliche wasserlösliche Bestandteile

α- Glycerinphosphat 1 g/l
Glycerin 2 g/l
Folsäure 3,6 mg/l
Inosit 10 mg/l
Katalase 3 mg/l

"Pluronicpolyol"-Lipidemulsion

"Pluronicpolyol" F68 1 g/l
Dorsch- Lebertran 10 mg/l
Tween 80 25 mg/l
Cholesterin 4,5 mg/l
α-Tocopherolacetat 2 mg/l

Beispiel 4

Bedeutung von physikalischen Schutzstoffen

Obwohl BSA für das Wachstum von Sf9-Zellen oder eine Produktion des rekombinanten Proteinprodukts nicht erforderlich ist, wurde festgestellt, daß bei einer Züchtung in Schüttelflaschen die Entfernung des "Pluronicpolyols" (F68) aus dem Medium selbst in Gegenwart von 10% Serum zum Zelltod führt. "Pluronicpolyol" ist als physikalischer Schutzstoff in Schüttelflaschen von Bedeutung und wird auch zur Emulgierung von Lipiden verwendet.

Beispiel 5

Veränderung der Peptonzusammensetzung des BSA-defizienten SFM2M

Beispiel 3 beschreibt die Zusammensetzung von BSA-defizientem SFM2M. In diesem Beispiel werden weiter vereinfachte Medien beschrieben, in denen der Peptonbestandteil von BSA-defizientem SFM2M modifiziert ist.
Die Pepton-Gesamtkonzentration von BSA-defizientem SFM2M ist 5 g/l. Die Wachstumsrate von Sf9-Zellen in einem solchen Medium war nach mehrmaligem Passagieren (10 bis 20) mit einer Verdopplungszeit (Td) von 30 bis 45 Stunden gering, während die Verdopplungszeit (Td) von Sf9-Zellen in einem 10 % Serum enthaltenden Medium bei etwa 17 bis 24 Stunden liegt. Die Peptonzusammensetzung von BSA-defizientem SFM2M wurde modifiziert, um eine höhere Wachstumsrate und dadurch eine effizientere Produktion von rekombinanten Proteinen durch Sf9- Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, zu erreichen. Außerdem erleichtert eine zahlenmäßige Verringerung der Peptone die Herstellung der Medien und eine spätere Reinigung des rekombinanten Proteinprodukts.
Die Peptonzusammensetzung von BSA-defizientem SFM2M wurde modifiziert, wobei den 2,6 g/l TPB enthaltenden Medien die nachstehend beschriebenen Peptone zugesetzt wurden:
(1) 3 g/l "Yeastolate" oder
(2) 3 g/l "Bactocasitone" oder
(3) 3 g/l "Panmede".
Ferner wurden zwei Medien hergestellt, in denen Tryptose (als TPB) mit einer Konzentration von 2 g/l bzw. 5 g/l der einzige Peptonbestandteil war. Nach mehr als fünfzehnmaligem Passagieren (etwa 50+ Generationen) in BSA-defizientem SFM2M wurden die Sf9-Zellen in die Medien inokkuliert. 50 bis 100 ml der Sf9-Kulturen wurden bei 27ºC in 250 ml-Schüttelflaschen mit 100 bis 150 Upm geschüttelt. Die Zelldichte wurde mit einem Coulter-Zähler gemessen. Die übliche Überlebensrate der Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase lag bei 99 bis 100%, wie durch Trypanblau- Ausschluß ermittelt wurde.
Das geringste Wachstum wurde in dem Medium festgestellt, daß lediglich TPB (sowohl 2 als auch 5 g/l Tryptose) als Peptonbestandteil enthielt. Die Zugabe der anderen Peptone zum Medium förderte das Wachstum signifikant. Das stärkste Wachstum wurde in dem Medium festgestellt, das neben TPB auch "Yeastolate" enthielt, obwohl eine ausgedehnte Lag- Phase (zwei bis drei Tage vor Beginn des exponentiellen Wachstums) festgestellt wurde.
Da das TPB anscheinend das Zellwachstum behinderte, wurde die Peptonzusammensetzung in BSA-defizienten SFM2M- Medien durch die Entfernung von TPB modifiziert. "Panmede" als einziger Peptonbestandteil des modifizierten BSA-defizienten SFM2M hemmte anscheinend in einer Konzentration von 5 g/l das Wachstum. 5 g/l "Bactocasitone" als einziger Peptonbestandteil förderten das Wachstum bis zu einer geringen Zelldichte und bei langsamem exponentiellem Wachstum. Kulturen in entweder 5 g/l "Tripepton" ("Yeastolate", "Panmede" und "Bactocasitone") oder nur in 5 g/l "Yeastolate" zeigten ein gutes Wachstum. Die "Yeastolate-Kultur" zeigte jedoch wiederum die höchste exponentielle Wachstumsrate, allerdings eine ausgedehnte Lag-Phase.
Experimente mit "Yeastolate" als einzigem Peptonbestandteil in einer Konzentration von 2, 4, 6, 8 bzw. 10 g/l zeigten, daß bei Konzentrationen von 4 g/l oder oberhalb davon ausgedehntere Lag-Phasen oder eine Hemmung des exponentiellen Wachstums zu beobachten waren. Es gab eine kurze
Lag-Phase in Kulturen, die 2 g/l "Yeastolate" enthielten. Obwohl die 4 g/l "Yeastolate" enthaltende Kultur eine ausgedehnte Lag-Phase hatte, zeigte sie das stärkste Wachstum und erreichte geringfügig höhere maximale Zelldichten.
Zur Verkürzung der Lag-Phase derartiger Kulturen, die als Peptonbestandteil der Medien "Yeastolate" enthielten, wurde "Yeastolate" in geringer Konzentration (2 g/l) mit 0, 2 bzw. 4 g/l ultrafiltriertem Lactalbuminhydrolysat (LH) vermischt, da Voruntersuchungen zeigten, daß LH eine schnelle Wachstumsrate ohne Lag-Phase förderte. Das LH verkürzte offensichtlich die Lag-Phase der 2 g/l "Yeastolate" enthaltenden Kultur und erhöhte die maximale Zelldichte. Eine 4 g/l "Yeastolate" enthaltende, LH-defiziente Kultur zeigte jedoch eine relativ kurze Lag-Phase, wodurch angezeigt wurde, daß sich die Sf9-Zellen, die zur Züchtung mehrmals in einem 4 g/l "Yeastolate" enthaltenden Medium passagiert worden waren, anscheinend an die Hemmwirkungen anpaßten.
Dieses Beispiel zeigt demnach, daß die Peptonzusammensetzung von BSA-defizientem SFM2M vorteilhaft modifiziert werden konnte, wobei lediglich 4 g/l "Yeastolate" oder "Yeastolate" zusammen mit LH (jeweils 2 g/l) als Peptonbestandteil enthalten sind.

Beispiel 6

Entfernung von wasserlöslichen Bestandteilen: ISFM-3 und ISFM-4

Parallel zu den in Beispiel 5 beschriebenen Studien über die Modifizierung von Peptonen wurde untersucht, welche Funktion die übrigen Bestandteile von BSA-defizientem SFM2M besitzen. Wie in Beispiel 3 beschrieben, enthält BSA-defizientes SFM2M die nachstehenden, definierten, wasserlöslichen Bestandteile: α-Glycerinphosphat (1 g/l), Glycerin (2 g/l), Folsäure (3,6 g/l), Inosit (10 mg/l) und Katalase (3 mg/l). Die ersten vier dieser Bestandteile wurden aufgrund der Wachstums-stimulierenden Wirkungen, die für eine andere Lepidopteren-Insektenzellinie publiziert worden waren, den serumfreien Medien zugesetzt [Goodwin et al., Invertebrate Systems (1980), a. a. O.] . Die Katalase war als Schutzstoff gegen eine Beschädigung durch Peroxide zugesetzt worden, die in den stark belüfteten Sf9-Zellkulturen in Schüttelflaschen zu erwarten war.
Es wurde festgestellt, daß die Entfernung dieser wasserlöslichen Bestandteile aus dem BSA-defizienten SFM2M- Medium vorteilhaft für das Zellwachstum war, die Lag-Phase verkürzte und die jeweilige Wachstumsrate erhöhte, während die maximale Zelldichte beibehalten wurde. Daher wurde das serumfreie Medium vereinfacht, mit der folgenden Zusammensetzung: (1) Grundmedium (IPL-41), (2) "Pluronicpolyol"- Lipidemulsion und (3) Pepton(e) nach Wahl.
SFM2M, das kein BSA und keine wasserlöslichen Bestandteile enthielt, erhielt die Bezeichnung ISFM-3, wenn die Peptonkomponente 2 g/l "Yeastolate" und 2 g/l LH umfaßte, und die Bezeichnung ISFM-4, wenn die Peptonkomponente 4 g/l "Yeastolate" umfaßte. Sowohl die ISFM-3- als auch die ISFM-4- Kulturen zeigten ein gutes Wachstum, es wurde jedoch nachgewiesen, daß die ISFM-4-Kultur eine längere Lag-Phase aufwies. ISFM-3 und ISFM-4 weisen daher die nachstehend beschriebenen Zusammensetzungen auf:
IPL-41-Grundmedium Ultrafiltrierte Peptone 4 g/l
Pluronicpolyol"-Lipidemulsion
"Pluronicpolyol" F68 1 g/l
Dorsch- Lebertran 10 mg/l
Tween 80 25 mg/l
Cholesterin 4,5 mg/l
α-Tocopherolacetat 2 mg/l
wobei die ultrafiltrierten Peptone in ISFM-3 2 g/l Lactalbuminhydrolysat (LH) und 2 g/l "Yeastolate" und in ISFM-4 4 g/l "Yeastolate" umfassen.
Zur Überwindung des Problems der ISFM-4-Lag-Phase wurde eine "Yeastolate"-Fed-batch-Kultur getestet. In einem ISFM-Medium, das 2 g/l "Yeastolate" (keine weiteren Peptone und keine zusätzlichen wasserlöslichen Bestandteile) enthielt, wurden Sf9-Zellen bis zu einer Dichte von 1,2 · 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet. Dann wurde der Kultur noch 1 g/l "Yeastolate" zugesetzt. Die Kultur wurde anschließend bis zu einer Dichte von 2,6 · 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet und weitere 2 g/l "Yeastolate" zugesetzt. Die Vorgehensweise hatte eine verkürzte Lag-Phase (15 Stunden), ein schnelles Zellwachstum (das mit 10% Serum enthaltenden Kulturen vergleichbar war) und höhere maximale Zelldichten (bis zu 6 bis 7 · 10&sup6; Zellen/ml) in Kulturen mit höheren Mengen "Yeastolate" zur Folge.
Die ausgedehnte Lag-Phase der nicht gemäß dem "Yeastolate"-Fed-Batch-Verfahren gezüchteten ISFM-4-Kultur wurde nach wiederholtem Passagieren von Sf9 in dem Medium, wahrscheinlich aufgrund einer Adaption an das "Yeastolate", unproblematischer. Die Kulturen zeigten nach dreimaligem Passagieren in ISFM-3 und ISFM-4 ein gleich starkes Wachstum mit kurzen Lag-Phasen. Tabelle 2 stellt die durchschnittlichen Wachstumscharakteristika in diesen beiden Medien nach achtmaligem Passagieren dar. Diese Medien liefern Wachstumsraten (Td = 17 bis 24 Stunden) und maximale Zelldichten (5 · 10&sup6; Zellen/ml), die mit den Dichten in 10% Serum enthaltenden Medien vergleichbar sind. Tabelle 2 Lag-Phase* (Stunden) Populationsverdopplungszeit (Stunden) Maximale Zelldichte (106 Zellen/ml)
* Die Lag-Phase wurde berechnet, indem die Kurve der exponentiellen Phase (halb-logarithmisch) zur anfänglichen Zelldichte (1 · 10&sup5; Zellen/ml) zurück extrapoliert wurde. Der Schnittpunkt mit der Abszisse (Inkubationszeit der Kultur in Stunden) entspricht der Lag-Phase.

Beispiel 7

Produktion von rekombinantem CSF-1 durch Insektenzellen, die in serumfreien Medien gezüchtet wurden und mit dem rekombinanten Baculovirus AcM4 infiziert sind

Sf9-Zellen, die zur Züchtung 25 bis 30 Mal (75 bis 120 Generationen) in den erfindungsgemäßen serumfreien Medien passagiert worden waren, wurden nach einer Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus AcM4 auf eine Produktion von rCSF-1 überprüft. Tabelle 3 stellt derartige Sf9-Kulturen dar, die während vergleichbarer exponentieller Wachstumsphasen mit AcM4 infiziert worden waren. Derartige Kulturen wurden gemäß den in den vorstehend beschriebenen Beispielen skizzierten Verfahren gezüchtet. Tabelle 3 rCSF-1-Mengen, die 5 Tage nach einer Infektion mit AcM4 von in verschiedenen Medien gezüchteten Sf9-Zellen produziert wurden Medien Zelldichte bei der Infektion (106 Zellen/ml) 5 Tage nach der Infektion produziertes rCSF-1 (105 RIA E/ml) 10% Serum* SFM2M ohne BSA * 10% Serum ist das komplette IPL-41-Medium mit TPB und FBS.
Wie in Tabelle 3 dargestellt, produzierten sämtliche Kulturen vergleichbare Mengen rCSF-1, etwa 10&sup6; E/ml, wie im RIA ermittelt wurde. Die Produktion von rCSF-1 wurde durch die geringere exponentielle Wachstumrate im BSA-defizienten SFM2M-Medium nicht beeinflußt.

Beispiel 8

Adaption von Sf9-Zellen an BSA-defizientes SFM2M ISFM-3 und ISFM-4

Es wurde festgestellt, daß sich die ursprünglichen, in einem 10% Serum enthaltenden Medium (komplettes IPL-41- Medium) gezüchteten Sf9-Zellen nach ein- und zweimaligem Passagieren leicht an BSA-defizientes SFM2M, ISFM-3 und ISFM- 4 adaptierten. Erneutes Passagieren und anschließende Infektionen mit dem rekombinanten Baculovirus AcM4 bestätigten die vorstehend beschriebenen Ergebnisse und zeigen, daß BSA-defizientes SFM2M, ISFM-3 und ISFM-4 geeignete Medien zur Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab und zur Produktion von rekombinanten Proteinprodukten sind, wobei ein rekombinantes Baculovirus-Expressionsvektorsystem verwendet wird.

Beispiel 9

Produktion von rekombinantem CSF-1 durch Insektenzellen, die in ISFM-4 gezüchtet und mit dem rekombinanten Baculovirus AcM6 infiziert worden sind

50 ml-Kulturen von Sf9-Insektenzellen wurden in 250 ml-Schüttelflaschen gezüchtet, die bei 27ºC in ISFM-4 mit 100 bis 150 Upm (mit einem Kreisradius von einem halben Zoll) geschüttelt wurden. Das rekombinante Baculovirus AcM6 wurde zur Infektion einer exponentiell wachsenden Kultur bei einer MOI (Multiplizität der Infektion) von 1 verwendet.
Zur Ermittlung der besten Erntezeit für rCSF-1 wurden der Kultur nach der Infektion mit dem rekombinanten Baculovirus täglich Proben entnommen, diese zentrifugiert und die Überstände sofort eingefroren. Diese Proben wurden unter Verwendung eines Western-Blots, RIAs und eines Knochenmarktests auf rCSF-1 untersucht. Mit den Proben, die 600 RIA- Einheiten rCSF-1 enthielten, das in 0,1 M Na&sub3;PO&sub4; (pH 6,8) diafiltriert und mit β-Mercaptoethanol reduziert worden war, wurde für eine Western-Analyse eine SDS-PAGE durchgeführt. Kaninchen-Antiserum gegen denaturiertes, monomeres 18K-A rCSF-1 (158 Aminosäuren) von E. coli wurden als primäre Antikörper zum Nachweis von rCSF-1 verwendet. Die Blots wurden unter Verwendung von Ziegen-anti-Kaninchen-IgG entwickelt, woran sich eine Iodinierung mit ¹²&sup5;I-Protein A zur Sichtbarmachung der Proteine durch Autoradiographie anschloß.
Fig. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der: rCSF-1- Konzentration im Kulturmedium (oberes Diagramm), Überlebensrate von Insektenzellen (mittleres Diagramm) und Homogenität von rCSF-1 in einer Western-Analyse. Am Tag der Infektion mit dem Baculovirus wurde sezerniertes rCSF-1 im RIA (oberes Diagramm, Tag 0) nur spurenweise nachgewiesen. Die rCSF-1- Konzentration (im RIA) erhöhte sich bis zum Tag 4 und erreichte einen Peak von 8 · 10&sup5; E/ml. Knochenmarktests bestätigten die Ergebnisse des RIA.
Eine Western-Blot-Analyse (unteres Diagramm) von 600 RIA-Einheiten von jeder der täglich entnommenen Proben des Kulturüberstandes zeigt, daß rCSF-1 am Tag 1 bis 3 nach der Infektion aus einer Triplettbande von etwa 40 K und einer einzigen 70 K-Bande bestand. Die relative Intensität der 70 K-Bande verringerte sich am Tag 3. Am Tag 4 erschien ein neues Muster aus 4 rCSF-1-Banden mit den relativen Größen 45 K, 35 K, 25 K und 20 K. Diese starke Veränderung des rCSF-1 am Tag 4 stand im Zusammenhang mit dem schnellen Ende des Infektions- /Produktionsvorgangs (oberes Diagramm) durch das Absterben der Zellen. Obwohl die biologische Aktivität des rCSF-1 erhalten blieb (wie durch den Knochenmarktest bestätigt wurde), veränderten sich Größe und Heterogenität des Proteins. Dies läßt vermuten, daß die Erntezeit dieses AcM4- rCSF-1 optimiert werden kann, um das am stärksten bevorzugte rCSF-1-Produkt zu erhalten.
Im Gegensatz zur Labilität des durch Infektion der Insektenzellen mit AcM6 produzierten rCSF-1 veränderte sich die Größe oder Heterogenität des rCSF-1, das von gemäß dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 mit AcM4 infizierten Insektenzellen produziert wurde, während der Absterbe-Phase der Zellen und bis zu 5 Tage nach der Infektion nicht wesentlich.

Schlußfolgerung

Es kann zusammenfassend festgestellt werden, daß die erfindungsgemäßen serumfreien Medien vereinfachte, kostengünstige Medien zur Züchtung von Insektenzellen in großem Maßstab liefern, wobei geschüttelt und/oder Luft durchgeperlt, vorzugsweise gut belüftet wird, und zur Herstellung von rekombinanten Proteinen daraus mittels eines rekombinanten Wildtyp-Baculovirus-Expressionsvektorsystems oder anderer Virusprodukte durch eine Infektion mit Viren. Derartige Medien vereinfachen die Reinigung des rekombinanten Proteins und der viralen Produkte, da sie wenig oder im wesentlichen kein Protein und kein Serum enthalten und die Peptonbestandteile davon ultrafiltriert wurden.

Hinterlegung

Wie vorstehend beschrieben, sind die rekombinanten Baculovirus-Transfervektoren pAcM4 und pAcM6 in E. coli/MM294 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12001 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (USA) am 12. Juni 1987 unter den ATCC-Nrn. 67429 bzw. 67428 hinterlegt worden.
Diese Hinterlegungen wurden gemäß einer Vereinbarung zwischen der ATCC und dem Anmelder, der Cetus Corporation, vorgenommen. Die Vereinbarung mit der ATCC stellt die ständige Zugänglichkeit dieser Stämme und deren Nachkommenschaft für die Öffentlichkeit sicher, nach Erteilung eines sich auf diese Anmeldung beziehenden US-Patentes, das die Hinterlegungen beschreibt und identifiziert, oder nach der Veröffentlichung oder Offenlegung für die Öffentlichkeit jeder US- oder Auslands-Patentanmeldung, ungeachtet der zeitlichen Reihenfolge, und die Zugänglichkeit der Stämme und deren Nachkommenschaft gegenüber dem, der durch Bestimmung des Präsidenten des US-Patentamts dazu berechtigt ist, nach 35 USC Paragraph 122 und den dazu gehörigen Vorschriften des Präsidenten (einschließlich 37 CFR Paragraph 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638). Der Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß, falls die hinterlegten Kulturen absterben oder verloren gehen oder vernichtet werden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wurden, sie nach Kenntnisnahme sofort mit einer lebensfähigen Kultur des gleichen Stamms ersetzt werden.
Die Hinterlegungen nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages stellen sicher, daß diese hinterlegten Kulturen in einem lebensfähigen und nicht verunreinigten Zustand über einen Zeitraum von mindestens fünf Jahren nach dem Erhalt der letzten Anfrage nach einer Lieferung einer Probe des hinterlegten Mikroorganismus durch die ATCC, jedoch mindestens über einen Zeitraum von 30 Jahren nach dem Hinterlegungsdatum gehalten werden.
Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme soll nicht ausgelegt werden als eine Ermächtigung zur Durchführung der Erfindung unter Verletzung der Rechte, die im Hoheitsbereich einer jeden Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen garantiert sind.
Die vorliegende Erfindung soll außerdem nicht so ausgelegt werden, daß ihr Schutzbereich durch die hinterlegten rekombinanten Transfervektoren eingeschränkt ist, da die hinterlegten Vektoren lediglich bestimmte erfindungsgemäße Gesichtspunkte erläutern sollen. Jeder rekombinante Baculovirus-Transfervektor, der zur Produktion von rekombinanten Baculoviren verwendet werden kann, die eine Infektion einer Insekten-Wirtszelle bewirken können, wobei ein rekombinantes Proteinprodukt produziert wird, liegt innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Ferner wird davon ausgegangen, daß verschiedene erfindungsgemäße Modifikationen neben den hier dargestellten und beschriebenen, die für den Fachmann aufgrund der vorstehenden Beschreibung offensichtlich sind, ebenfalls im Schutzbereich der angefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Serumfreies Medium, das das Wachstum von Insektenzellen in großem Maßstab und die Produktion von rekombinanten und viralen Produkten in Mengen fördern kann, die vergleichbar sind mit denen, die in serumhaltigen Medien erzielt werden, wobei das serumfreie Medium umfaßt:

ein Grundmedium,

eine Lipidmikroemulsion, die für das Insektenzellwachstum essentielle Lipide enthält,

eine Peptonkomponente, die teilweise hydrolysiertes Protein enthält, und

einen Schutzstoff, ausgewählt aus nicht-toxischen, nicht-ionischen polymeren Detergentien, Hydroxyethylstärke, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Dextransulfat, Polyvinylpyrrolidon, Ficoll, Alginsäure und Polypropylenglykol.

2. serumfreies Medium nach Anspruch 1, wobei das Grundmedium ein Nährstoffgemisch aus anorganischen Salzen, Zuckern, Aminosäuren, gegebenenfalls auch Vitaminen, organischen Säuren und/oder Puffern ist.

3. Serumfreies Medium nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem einen Emulgator der Lipidmikroemulsion enthält.

4. Serumfreies Medium nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medium einen Emulgator der Lipidmikroemulsion enthält, wenn der ausgewählte Schutzstoff keine emulgierenden Eigenschaften hat,

ein Phospholipiid und/oder ein nicht-toxisches, nichtionisches polymeres Detergens als Emulgator der Lipidmikroemulsion bereitgestellt wird,

ein organisches Lösungsmittel bereitgestellt wird, das ein Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist,

die Lipide der Lipidmikroemulsion ausgewählt sind aus Fettsäuren, Steroiden und lipidlöslichen Vitaminen, und die Peptonkomponente eine Gesamtkonzentration von etwa 1 g/l bis etwa 12 g/l hat.

5. Serumfreies Medium nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Emulgator Polysorbat 80 umfaßt.

6. Serumfreies Medium nach Anspruch 4, wobei der Schutzstoff ein nicht-toxisches, nicht ionisches polymeres Detergens ist,

der Emulgator der Lipidmikroemulsion Lecithin, Polysorbat 80 und/oder eine Polysorbatverbindung mit der folgenden Formel ist

wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,

wobei t eine ganze Zahl von 10 bis 30 ist, u eine ganze Zahl von 10 bis 20 ist,

das organische Lösungsmittel Ethanol ist,

die Lipide der Lipidmikroemulsion ausgewählt sind aus Fettsäureestern, Sterolen, Vitamin A und α-Tocopherol; und

die Peptone der Peptonkomponente ausgewählt sind aus Caseinabbauprodukten, Ochsenleberabbauprodukten, Hefeextrakt, Tryptosephosphatbrühe (TPB) und Lactalbuminhydrolysat (LH).

7. Serumfreies Medium nach Anspruch 6, wobei das nicht-toxische, nicht-ionische polymere Detergens ein Blockcopolymer aus Propylenoxid und Ethylenoxid ist, die Lipide der Lipidmikroemulsion ausgewählt sind aus polyungesättigten Fettsäureestern, Sterolen, Vitamin A und α-Tocopherol, und

die Peptone der Peptonkomponente ausgewählt sind aus PanMeade, TPB, Hefeextrakt, Bactocasiton und Lactalbuminhydrolysat (LH).

8. Serumfreies Medium nach Anspruch 7, wobei das nicht-toxische, nicht-ionische polymere Detergens Pluronicpolyol ist;

der Emulgator der Lipidmikroelumsion Lecithin und/oder Polysorbat 80 ist,

die Lipide der Lipidmikroemulsion ausgewählt sind aus einem Gemisch von polyungesättigten Fettsäuremethylestern, Sterolen, Vitamin A und α-Tocopherol, und die Peptonkomponente ausgewählt ist aus TPB in einer Konzentration von etwa 0 g/l bis etwa 5 g/l, Bactocasiton und PanMeade, wobei die letzteren zwei Peptone jeweils in einer Konzentration von etwa 0 g/l bis etwa 5 g/l vorliegen, und Hefeextrakt in einer Konzentration von etwa 1 g/l bis etwa 6 g/l und LH in einer Konzentration von etwa 0 g/l bis etwa 6 g/l.

9. Serumfreies Medium nach Anspruch 8, wobei das Grundmedium IPL-41 ist,

das Pluronicpolyol ausgewählt ist aus Pluronic F68, F77, F88 und F108,

die Lipide der Lipidmikroemulsion ausgewählt sind aus Fisch (gegebenenfalls Dorsch)-Lebertran, Cholesterin und α-Tocopherol, und

die Peptone ausgewählt sind aus Hefeextrakt, gegebenenfalls Yeastolate und LH.

10. Serumfreies Medium nach Anspruch 9, wobei das Pluronicpolyol ausgewählt ist aus Pluronic F68 und Pluronic F88,

die Peptone ausgewählt sind aus Yeastolate und LH' und wobei entweder:

(a) die Lipidmikroemulsion Lebertran in einer Konzentration von etwa 1 mg/l bis etwa 50 mg/l, Cholesterin in einer Konzentration von etwa 2 mg/l bis etwa 7 mg/l, Ethanol in einer Konzentration von etwa 0,5 ml/l bis etwa 5 ml/l, Polysorbat 80 in einer Konzentration von etwa 20 mg/l bis etwa 30 mg/l und α-Tocopherol in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/l bis etwa 4 mg/l umfaßt, und

die Peptonkomponente eine Gesamtkonzentration von etwa 3 g/l bis etwa 5 g/l aufweist, oder

(b) das pluronicpolyol Pluronic F68 in einer Konzentration von etwa 0,05% bis etwa 0,5% ist, und

die Lipidmikroemulsion Lebertran in einer Konzentration von etwa 5 mg/l bis etwa 15 mg/l, Cholesterin in einer Konzentration von etwa 3 mg/l bis etwa 5 mg/l, Ethanol in einer Konzentration von etwa 1 ml/l, Polysorbat 80 in einer Konzentration von etwa 25 mg/l und α-Tocopherol in einer Konzentration von etwa 2 mg/l umfaßt, in dem gegebenenfalls

das Pluronic F68 in einer Konzentration von etwa 0,1 %,

der Lebertran in einer Konzentration von etwa 10 mg/l,

das Cholesterin in einer Konzentration von etwa 4,5 mg/l vorliegt, und

die Peptonkomponente, Leastolate in einer Konzentration von etwa 2 g/l bis etwa 5 g/l und LH in einer Konzentration von etwa 1 g/l bis etwa 4 g/l umfaßt, vorzugsweise die Peptonkomponente ultrafiltriert ist und eine Kombination aus, Leastolate und Lactalbuminhydrolysat umfaßt, wobei jedes in einer Konzentration von etwa 0,5 g/l bis etwa 4 g/l vorliegt.

11. Serumfreies Medium mit der folgenden Zusammensetzung:

IPL-41 Grundmedium ultrafiltrierte Peptone 4 g/l

Pluronic Polvol-Lipidmikroemulsion Pluronic Polyol F68 1 g/l

Lebertran 10 mg/l

Tween 80 25 mg/l

Cholesterin 4,5 mg/l

α-Tocopherolacetat 2 mg/l

wobei die ultrafiltrierten Peptone 2 g/l Lactalbuminhydrolysat (LH) und 2 g/l Yeastolate umfassen, oder wobei die ultrafiltrierten Peptone 4 g/l Yeastolate umfassen.

12. Verfahren, umfassend die Züchtung und Vermehrung von Insektenzellen für deren Produktion von rekombinanten oder viralen Produkten in einem Grundmedium, gekennzeichnet durch die Zugabe zu dem Grundmedium einer Lipidmikroemulsion, die für das Insektenwachstum essentielle Lipide enthält, und einer Peptonkomponente, die teilweise hydrolysiertes Protein enthält, wobei Zellwachstum in Abwesenheit von Serum erzielt werden kann.

13. Verfahren zur Produktion rekombinanter oder viraler Produkte unter Verwendung von Insektenzellen, umfassend die Züchtung von Insektenzellen in einem serumfreien Medium gemäß der Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das rekombinante Produkt ein koloniestimulierender Faktor, ein Interferon, ein Interleukin, Tumornekrosefaktor, Erythropoietin, menschliches, Schweine- oder Rinderwachstumshormon, epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin, Faktor VIII, modifizierte Prourokinase, Urokinase, Gewebeplasminogenaktivator (TPA), ein TpA-urokinase-Hybridprotein, Hepatitis B Impfstoff-Protein, Katzenleukämievirusimpfstoff-Protein, Superoxiddismutase, atrialer natriuretischer Faktor, das vollständige Ricintoxin, Ricin A-Kette, Ricin A-Hybridprotein, ein Lectin, Diphtherietoxin, Gelonin, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin, PAPI, PAPII, PAP-S, CAT oder ein Bacillus thuringiensis- Toxinprotein ist.

15. Verwendung in einem Insektenzellkulturmedium, das ein Grundmedium enthält, einer Lipidmikroemulsion, die für das Insektenwachstum essentielle Lipide enthält, und einer Peptonkomponente, die teilweise hydrolysiertes Protein enthält, anstelle von Serum und/oder Serumalbumin, wobei das Kulturmedium gegebenenfalls wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert ist.