CH702874A2 - Entomopathogenes Virus-Präparat. - Google Patents

Abstract

Es wird für die effektive Kontrolle des Pfirsichwicklers eine neue Zusammensetzung vorgeschlagen. Die neue Zusammensetzung umfasst mindestens ein Granuloseviren-Isolat vom neuen Typ CpGV-AND und ist in ihrer Wirkung gegen die Larven des Apfelwicklers Cydia pomonella keine nennenswerten Reduktionen zeigen, gleichzeitig aber gegenüber dem bekannten Isolaten vom Typ CpCV-M eine um den Faktor 65.6 erhöhte Aktivität gegen die Larven des Pfirsichwicklers Grapholita molesta aufweist.

Description

Technisches Gebiet

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine entomopathogene Zusammensetzung, die zur biologischen Bekämpfung der Larven des Pfirsichwicklers Grapholita molesta geeignet ist und biologische Pflanzenschutzmittel welche diese Virus-Präparate oder Replikate von diesen Präparaten enthalten, sowie seine Verwendung bei der Bekämpfung von Schadinsekten.

[0002] Die neue Zusammensetzung umfasst ein neues anhin nicht isoliertes oder identifiziertes Virus-Präparat basierend auf insektenspezifischen Granuloseviren.

Technologischer Hintergrund und Stand der Technik

[0003] Der Pfirsichwickler Grapholita molesta (auch Cydia molesta, Pfirsichtriebbohrer oder Pfirsichtriebwickler) hat eine weltweite Verbreitung und ist der wichtigste Schädling im Pfirsich-Anbau, Auch bei Nektarinen, Aprikosen und Äpfeln verursachen die Larven des Pfirsichwicklers erhebliche Ernteeinbussen (Rothschild & Vickers, 1991). Die Bekämpfung des Schädlings mit synthetisch hergestellten Insektiziden ist insbesondere aufgrund der Rückstandproblematik bei Kernobst schwierig. Zudem sind beim Pfirsichwickler bereits Resistenzen gegen verschiedene synthetische Insektizide aufgetreten (Kanga et al., 1997).

[0004] Als Alternative zu den chemischen Insektiziden haben sich im biologischen wie auch im integrierten Obstanbau seit Jahren biologische Pflanzenschutzpräparate bewährt. Sie erlauben eine rückstandfreie Schädlingskontrolle und haben somit keinerlei schädliche Auswirkungen auf Mensch und Umwelt. Eine der wichtigen biologischen Bekämpfungsmethoden von Schmetterlingsschädlingen im Obstbau ist die Verwendung von Baculoviren, und insbesondere von Granuloseviren (GV), auch Granuloviren genannt, einer Untergruppe der Baculoviren. Diese natürlich vorkommenden Viren infizieren bestimmte Arten von Wirtsinsekten und führen innert weniger Tage zum Tod des Wirts. So sind zum Beispiel zur Bekämpfung des Apfelwicklers (Cydia pomonella) verschiedene biologische Präparate auf dem Markt erhältlich, welche das Apfelwickler-Granulovirus CpCV enthalten. Meist handelt es sich hier um das sogenannte CpCV-M («Mexican Strain»), ein Virus welches 1964 in Mexico aus infizierten Apfelwickler-Larven isoliert worden war, Sofern Apfelwickler-Larven das Virus nach dem Ausbringen des Präparates in ausreichender Menge mit der Nahrung aufnehmen, sterben sie innerhalb weniger Tage und verursachen somit keinen Schaden mehr.

[0005] Die larvizide Aktvität eines bestimmten Granulovirus ist in der Regel auf eine klar definierte Schmetterlingsgruppe beschränkt (z.B. CpCV auf Apfelwickler-Larven). Eine gewisse Wirkung kann zwar auch auf andere (selbst nah verwandte) Wirtsinsekten vorhanden sein, meist ist sie aber zu gering für eine effiziente Bekämpfung. Es ist im Stand der Techink beschrieben, dass das die bekannten CpGVs nicht nur auf die Larven des Apfelwicklers, sondern auch auf die Larven des Pfirsichwicklers eine larvizide Wirkung haben (Lacey et al., 2005). Diese Aktivität bekannter CpCV gegen Pfirsichwickler ist jedoch 557 bis 589 mal tiefer als gegen Apfelwickler. Für den Fachmann ist die larvizide Wirkung der aktuell erhältlichen CpGV Präparate und der in der Literatur beschriebenen CpCV Stämme und Isolate eindeutig zu gering für eine kommerziellen Verwendung gegen den Pfirsichwickler.

Aufgabe der Erfindung

[0006] Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein biologisches Präparat zur Bekämpfung des Pfirsichwicklers zur Verfügung zu stellen.

[0007] Diese und andere Aufgaben werden gelöst durch eine erfindungsgemässe Zusammensetzung gemäss dem unabhängigen Anspruch. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Darstellung der Erfindung

[0008] Für die effektive Kontrolle des Pfirsichwicklers wird eine neue Zusammensetzung vorgeschlagen, die mindestens einen Granulovirus-Stamm umfasst der des bekannten CpCV auf den Pfirsichwickler ausgeweitet werden können.

[0009] In vorteilhaften Ausführungsformen der erfindungsgemässen Zusammensetzung umfasst diese ein Isolat oder ein Isolat-Gemisch vom neuen Typ CpCV-AND, das in seinem Bau bei relativ grossen Übereinstimmung analysierbare kennzeichnende Unterschiede mit dem bekannten Isolat CpCV-M und ein signifikant erweitertes Wirkspektrum aufweist. Vorteilhaft ist, dass diese neue Zusammensetzungen in ihrer Wirkung gegen die Larven des Apfelwicklers keine nennenswerten Reduktionen zeigen, gleichzeitig aber eine - gegenüber dem bekannten CpCV-M eine um den Faktor 65.6 erhöhte Aktivität gegen die Larven des Pfirsichwicklers aufweisen.

[0010] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung umfassend das neue Virus-Isolat kann verwendet werden als Aktivsubstanz in einem formulierten, spritzbaren Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung des Pfirsichwicklers, des Apfelwicklers oder anderer Schmetterlingsschädlinge, auf welche das erfindungsgemässe Virus-Isolat larvizide Wirkung hat. Optional können der Zusammensetzung weitere Zusatzstoffe beigemengt werden.

Charakterisierung der Isolate

[0011] Ein Baculovirus-Isolat muss immer als eine Mischung von verschiedenen Genotypen betrachtet werden. Diese Genotypen können zahlreiche Unterschiede aufweisen, welche durch Insertionen oder Deletionen von DNS-Sequenzen zustande gekommen sind. Je nach Anzahl verschiedener Genotypen, die in einem Isolat vorhanden sind, kann das Isolat als sehr homogen oder eher heterogen bezeichnet werden. Man kann jedenfalls davon ausgehen, dass die Genotypen-Zusammensetzung eines Isolats die Virulenz und das Wirtsspektrum des Isolats entscheidend mitbestimmt.

[0012] Baculovirus-Isolate werden normalerweise mittels Restriktionsenzymanalyse analysiert und charakterisiert (OECD, 2002). Dabei wird die DNS durch Restriktionsenzyme bei bestimmten Erkennungssequenzen geschnitten und es entsteht ein charakteristisches Muster mit DNS-Fragmenten verschiedener Länge. Vergleicht man die Restriktionsfragmentmuster zweier Isolate, können selbst kleine Unterschiede in der Genotypen-Zusammensetzung festgestellt werden.

[0013] Mittels Restriktionsenzymanalyse wurde die Virus-DNS des erfindungsgemässen Isolats mit einem bekannten CpGV-M Isolat verglichen (Referenzisolat). Hierfür wurden die Viren im neuen Isolat mittels Zentrifugation aufgereinigt. Aus dieser aufgereinigten Virus-Suspension und dem Referenz-Isolat wurde anschliessend die Virus-DNS isoliert. Die virale DNS wurde dann mit den vier Restriktionsenzymen BamHI, EcoRl, Sali und EcoRV verdaut bzw. geschnitten. Diese Restriktionsenzyme haben sich bei früheren Untersuchungen von CpCV Isolaten als sehr geeignet erwiesen.

[0014] Für die Restriktionsenzymanalyse wurden 17 µl der isolierten Virus-DNS mit 2 µl Puffer und 1 µl Enzym-Lösung bei 37 °C während 3 h inkubiert. Ein Zehntel jeder Probe wurde verwendet um zu prüfen, ob der Verdauungsvorgang erfolgreich war und um den DNS Gehalt zu vergleichen. Anschliessend wurden 6 bis 14 µl Probematerial auf ein Elektrophorese-Gel (0.8% Agarose) geladen und die DNS-Fragmente über Nacht mit einem TAE Puffer-System nach ihrer Länge aufgetrennt.

[0015] Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Gelelektrophorese (0.8% Agarose) mit gereinigter Virus-DNA vom (1) Referenzisolat CpCV-M, und (2) erfindungsgemässen Virus-Isolat vom Typ CpGV-AND. Die Buchstaben bezeichnen die Restriktionsfragmente in zunehmender Fragmentlänge. Die Kolonnen ganz links und ganz rechts zeigen Referenzbanden mit bekannter Fragmentlänge (angegebene Zahlen).

[0016] Die resultierenden Restriktionsfragmentmuster des neuen Isolats vom Typ CpCV-AND und des Referenzisolats sind in Fig. 1 dargestellt. Für die vier verwendeten Restriktionsenzyme ergaben sich folgende Resultate:

Verdau mit BamHI:

[0017] Alle Restriktionsfragmente des neuen Isolats stimmen mit denjenigen des Referenzisolats überein. Das neue Isolat zeigt keine fehlenden oder zusätzlichen Banden.

Verdau mit EcoRI:

[0018] Alle Banden des Referenzisoltas finden sich auch beim neuen Isolat an den entsprechenden Positionen. Das neue Isolat weist aber eine zusätzliche Bande auf bei 5.8 kb (mit Pfeil gekennzeichnet in Fig. 1).

Verdau mit EcoRV:

[0019] Alle Banden des Referenzisoltas finden sich auch beim neuen Isolat an den entsprechenden Positionen. Das neue Isolat weist aber zwei zusätzliche Banden bei 13 kb und bei 6.5 kb (mit Pfeilen gekennzeichnet in Fig. 1).

Verdau mit Sali:

[0020] Alle Restriktionsfragmente des neuen Isolats stimmen mit denjenigen des Referenzisolats überein. Das neue Isolat zeigt keine fehlenden oder zusätzlichen Banden.

[0021] Das Restriktionsfragmentmuster des neuen Virus-Isolats stimmt zu einem grossen Teil mit demjenigen des Referenzisolats überein. Die drei charakteristischen zusätzlichen Banden beim neuen Isolat nach dem Verdau mit den Enzymen EcoRI und EcoRV zeigen jedoch, dass im Vergleich zum Referenzisolat beim neuen Isolat Virus DNS eines zusätzlichen Genotyps vorhanden ist. Das neue Isolat, das im Folgenden mit CpGV-AND bezeichnet ist, lässt sich anhand des Restriktionsfragmentmusters zuverlässig charakterisieren und es weist eine signifikant höhere Wirkung gegen Pfirsichwickler auf.

Aktivität des Isolats im Biotest

[0022] Die Aktivität eines Baculovirus-Isolats bzw. seine Virulenz gegenüber den Larven eines bestimmten Schmetterlingsschädlings kann daran gemessen werden, wie viele Viren von den Larven aufgenommen (d.h. gefressen) werden müssen, um eine bestimmte Wirkung zu erzielen. Der LD50 bezeichnet beispielsweise die mittlere letale Dosis, bei welcher 50% der Versuchstiere sterben. Je tiefer diese letale Dosis (d.h. die verabreichte Viren-Dosis), desto höher ist die Virulenz des Virus-Isolats im Vergleich zu einem Referenzisolat.

[0023] In Laborversuchen (Biotests) mit Pfirsichwickler-Larven aus der firmeneigenen Laborzucht der Anmelderin wurde der LD50 für neue Virus-Isolate vom Typ CpGV-AND bestimmt und ihn mit demjenigen für ein bekanntes CpGV Isolat (CpCV-M) verglichen. Dabei konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass das neue Isolat vom Typ CpGV-AND eine signifikant höhere Wirkung gegen Pfirsichwicklerlarven hat als das vorbekannte CpCV-M.

Vorbereiten des Biotest:

[0024] Im Biotest wurde ein künstlich hergestelltes Nährmedium verwendet (Stonefly Heliothis Diet, Artikel-Nr. 38V0600, erhältlich von Wards Natural Science, NY). Das trockene Nährmedium muss mit Wasser vermischt werden. Hierzu wurden jeweils 12.5 g trockenes Nährmedium in einen kleinen Plastikbeutel gegeben. Anschliessend wurde eine definierte Menge wässrige Virus-Lösung zugegeben und das Nährmedium im Beutel von Hand gut durchgeknetet, sodass eine homogene, feuchte Masse entsteht.

[0025] Pro Virus-Isolat (neues Isolat CpGV-AND und Referenzisolat CpGV-M) wurden fünf verschiedene Viruskonzentrationen getestet; beim neuen Isolat von 648 bis 52 480 Viren pro Gramm Nährmedium und beim Referenzisolat von 19 753 bis 16 000 000 Viren pro Gramm Nährmedium (Tabelle 1). Die Menge wässriger Virus-Lösung mit bekannter Viruskonzentration wurde so gewählt, dass die gewünschte Viruskonzentration im fertigen Nährmedium erzielt werden konnte (Tabelle 1). Zusätzlich zu den Behandlungen mit Virus-Lösung wurden zur Kontrolle auch Biotest-Zuchteinheiten ohne Viren angesetzt (nur Wasser im Nährmedium). Eine Biotest-Zuchteinheit bestand aus einer Kunststoff-Dose (140×70×20 mm, PS glasklar, bestehend aus Boden, Deckel und Gittereinsatz 50-fach).

Ansetzen des Biotest:

[0026] Die Biotests wurden unter sterilen Bedingungen angesetzt. Der Inhalt eines gekneteten Plastikbeutels wurde gleichmässig auf dem Boden der Biotest-Zuchteinheit verteilt. Danach wurde das Gitterraster durch das Nährmedium auf den Boden der Schale gedrückt, sodass 50 gleichgrosse Kompartimente mit gleich viel Medium entstanden. Mit einem feinen Pinsel wurden anschliessend die frisch geschlüpften Larven (1. Larvalstadium, auch mit L1 bezeichnet) vorsichtig auf die Oberfläche des Nährmedium transferiert. Pro Kompartiment wurde eine Larve angesetzt. Sobald alle Kompartimente besetzt waren, wurde das Gitterraster mit Frischhaltefolie abgedeckt und mit dem umgekehrten Deckel beschwert. Der Deckel wurde mit Gummibändern befestigt (Fig. 2). Anschliessend wurden die Biotest-Zuchteinheiten in einem Klimaschrank inkubiert (25 °C, rLf 60-80%).

[0027] Fig. 2 zeigt die fertig verschlossene Biotest-Zuchteinheit.

Auswerten des Biotest:

[0028] Nach 14 Tagen Inkubation wurde die Überlebensrate der Tiere bestimmt. Hierzu wurden die Zuchteinheiten geöffnet, jedes Kompartiment genau untersucht und die Anzahl der noch lebenden (d.h. sich bewegenden) Larven notiert. Die Resultate sind in Tabelle 1 dargestellt.

[0029] Mit Hilfe der Probit-Analyse (Finney, 1971) wurden für das neue Virus-Isolat und das Referenzisolat die Dosis-Effekt-Kurve (Fig. 3) und die LD50 (Tabelle 2) errechnet. Tabelle 2 zeigt zudem die Aktivität des neuen Virus-Isolats auf Pfirsichwicklerlarven im Verhältnis zum Effekt, den das Referenzisolat CpCV-M auf diesen Larven erzielt.

[0030] Tabelle 1. Übersicht zum Aufbau und den Resultaten des Biotests mit dem neuen Virus-Isolat und dem Referenzisolat. <tb><sep>ID<sep>Menge trockenes Nährmedium<sep>Viruskonz, in wässriger Viruslösung [OB/ml]<sep>Menge verwendeter Viruslösung<sep>Zugefügte Menge Wasser<sep>Viren/g Nährmedium<sep>Anzahl lebende Larven nach 14 Tagen <tb>Referenzisolat CpGV-M<sep>Konz. 1<sep>12.5 g<sep>4.00E+07<sep>0.025 ml<sep>37.5 g<sep>19 753<sep>43 <tb><sep>Konz. 2<sep>12.5 g<sep>4.00E+07<sep>0.074 ml<sep>37.4 g<sep>59 259<sep>30 <tb><sep>Konz. 3<sep>12.5 g<sep>4.00E+07<sep>0.222 ml<sep>37.3 g<sep>177 778<sep>21 <tb><sep>Konz. 4<sep>12.5 g<sep>4.00E+07<sep>0.667 ml<sep>36.8 g<sep>533 333<sep>6 <tb><sep>Konz. 5<sep>12.5 g<sep>4.00E+07<sep>2.000 ml<sep>35.5 g<sep>1 600 000<sep>0 <tb>Neues Isolat<sep>Konz. 1<sep>12.5 g<sep>1.31E+06<sep>0.025 ml<sep>37.5 g<sep>648<sep>35 <tb><sep>Konz. 2<sep>12.5 g<sep>1.31E+06<sep>0.074 ml<sep>37.4 g<sep>1 944<sep>25 <tb><sep>Konz. 3<sep>12.5 g<sep>1.31E+06<sep>0.222 ml<sep>37.3 g<sep>5 831<sep>6 <tb><sep>Konz. 4<sep>12.5 g<sep>1.31E+06<sep>0.667 ml<sep>36.8 g<sep>17 493<sep>3 <tb><sep>Konz. 5<sep>12.5 g<sep>1.31 E+06<sep>2.000 ml<sep>35.5 g<sep>52 480<sep>0

[0031] Tabelle 2. LD50 Werte für das neue Virus-Isolat CpGV-AND und das Referenzisolat CpGV-M mit unterem und oberem Limit des 95% Konfidenzintervalls. Die relative Aktivität des Referenzisolats wurde gleich 1 gesetzt. <tb><sep>LD 50 (v/g)<sep>95%<sep>95%<sep>Relative Aktivität<sep>95% (unteres Limit)<sep>95% (oberes Limit) <tb>CpCV-M<sep>121 600<sep>91 080<sep>160 250<sep>1.0<sep>0.7<sep>1.5 <tb>Neues Virus-Isolat<sep>1852<sep>1372<sep>2454<sep>65.6<sep>44.2<sep>98.1

[0032] Fig. 3 zeigt linearisierte Dosis-Effekt-Kurven (Transformation der Probit-Einheiten) für das neue Virus-Isolat CpGV-AND und das Referenzisolat CpGV-M. Die gestrichelten Linien zeigen die 95%-Konfidenzgrenzen für jede mittlere effektive Dosis.

[0033] Das neue Virus-Isolat vom Typ CpGV-AND hat mit einem LD50 von 1852 Viren pro Gramm Nährmedium eine 65.6 mal höhere Aktivität gegen Larven des Apfelwicklers als das Referenzisolat CpGV-M. Ein solcher Aktivitätsunterschied liegt weit ausserhalb des üblichen Unschärfebereichs solcher Biotests und wurde bisher noch nie mit einem Baculovirus auf Pfirsichwicklerlarven erreicht. Der LD50, den das neue Virus-Isolat hier auf Pfirsichwicklerlarven erzielte, entspricht ziemlich genau einem LD50, wie er üblicherweise mit CpGV-M auf dem Zielorganismus Apfelwickler beobachtet wird. Dies bedeutet, dass der Pfirsichwickler mit dem neuen Virus-Isolat CpGV-AND im Feld ebenso effizient bekämpft werden kann, wie der Apfelwickler mit dem CpGV-M Isolat.

[0034] Dieses neue Virus-Isolat CpGV-AND mit signifikanter Wirkungssteigerung gegenüber den bekannten Virus-Isolaten vom Typ CpGV-M liess sich durch gezielte mehrstufige Virusselektion isolieren, ohne dass gentechnologischen Methoden angewendet werden.

Zitierte Literatur

[0035] Finney D. 1, 1971. Probit Analysis, 3rd edition, Cambridge University Press, Cambridge.

[0036] Lacey LA., Arthurs S.P., Headrick H., 2005. Comparative activity of the codling moth granulovirus against Grapholita molesta and Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae). J. Entomol. Soc. Brit. Columbia 102: 79-80.

[0037] OECD 2002. Consensus Document on Information used in the Assessment of Environmental Applications involving Baculovirus (Monographie). Series on Harmonization of Regulatory Oversight in Biotechnology, No. 20, OECD Environment, Health and Safety Publications.

[0038] Rothschild C.H.L, Vickers RA, 1991. Biology, Ecology and Control of the Oriental fruit moth. In: van der Geest L.P.S., Evenhuis H.H., editors. Tortricid pests, their biology, natural enemies, and control. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier Science Publishers. pp. 389-412.

[0039] Kanga L.H.B., Pree DJ., van Lier IL, Whitty K.J., 1997. Mechanisms of resistance to organophosphorous and carbamate insecticides in Oriental fruit moth populations, Grapholita molesta (Busck). Pesticide Biochemistry and Physiology. 59:11-23.

Claims (6)

1. Zusammensetzung, die eine Wirksamkeit gegen Schadinsekten besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein Granuloseviren-lsolat vom Typ CpGV-AND umfasst, wobei sich der Typ CpGV-AND in der Restriktionsenzymanalyse mit den vier Restriktionsenzymen BamHI, EcoRl, Sall und EcoRVvon einem bekannten CpGV-M Referenzisolat beim Verdau mit BamHI und mit Sall nicht unterscheidet, beim Verdau mit EcoRl alle Banden des Referenzisolats und zusätzlich eine Bande auf bei 5.8kb aufweist und beim Verdau mit EcoRV alle Banden des Referenzisolats und zusätzlich zwei zusätzliche Banden bei 6.5 kb und bei 5.8 kb aufweist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur effektiven Kontrolle der Larven des Pfirsichwicklers Grapholita molesta geeignet ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur effektiven Kontrolle der Larven des Apfelwicklers Cydia pomonella oder anderer Schmetterlingsschädlinge geeignet ist.

4. Formuliertes, spritzbares Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung des Pfirsichwicklers, des Apfelwicklers oder anderer Schmetterlingsschädlinge, dadurch gekennzeichnet, dass es als aktiven Bestandteil eine Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst die wirksam ist zur Bekämpfung der Schädlinge.

5. Verfahren zur Bekämpfung der Larven des Pfirsichwicklers, des Apfelwicklers oder anderer Schmetterlingsschädlinge, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bekämpfenden Schädlinge einer wirksamen Dosis der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 ausgesetzt werden.

6. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäss der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Virus-Isolat vom Typ CpGV-AND durch gezielte mehrstufige Virusselektion isoliert und zur Herstellung der Zusammensetzung zur Verfügung gestellt wird.