DE2638299C2

DE2638299C2 -

Info

Publication number: DE2638299C2
Application number: DE2638299A
Authority: DE
Inventors: Robin Anthony Taroona Tasmania Au Bedding
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1975-08-26
Filing date: 1976-08-25
Publication date: 1991-08-01
Also published as: US4334498A; JPS615377B2; JPS59130117A; JPS613453B2; DE2638299A1; JPS5241225A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Massenzüchtung von Nematoden.

Es wurde festgestellt, daß infizierende Larven von Neoaplectana carpocapsae unter Laboratoriumsbedingungen viele verschiedene Insektenschädlinge zerstören. Diese Fähigkeit wird der Pathogenität dieser Nematoden gegenüber diesen Insekten und ihrer Assoziierung mit den entomogenen Bakterien Achromobacter nematophilus zugeschrieben, die gewöhnlich im intestinalen Lumen der infizierenden Spezies angetroffen werden. Nach der Einverleibung durch ein Insekt durchdringt der Fadenwurm gewöhnlich die Darmwand, betritt das Haemocoel und setzt A. nematophilus frei, die sich vermehren und zum Tod des Wirtes durch Septicaemie führen. Oft erfolgt weiterhin die Vermehrung der Nematoden und damit die Bildung weiterer infizierender Organismen im toten Wirt.

Aufgrund der obigen Überlegungen sind seit der erstmaligen Untersuchung der Fadenwürmer viele Vorschläge zur Verwendung infizierender Larven von N. carpocapsae zur biologischen Bekämpfung von Insekten veröffentlicht worden.

Eine wichtige Schwierigkeit bei der Verwendung von Nematoden als Mittel zur biologischen Insektenbekämpfung besteht darin, Nematoden in großer Zahl zu züchten. In G. O. Poinar, "Entomogeneous Nematodes", Verlag E. J. Brill, Leiden 1975 sind auf den Seiten 22 bis 25 verschiedene Verfahren zur Züchtung von Nematoden beschrieben. Diese Verfahren sind jedoch nur für die Züchtung im Labormaßstab geeignet. In den meisten Fällen wird dabei eine einzelne, kleine Oberfläche eines Mediums in Petrischalen oder auf Platten verwendet, auf der die Nematoden in relativ kleiner Zahl gezüchtet werden können. Obgleich in kleinen Gefäßen, wie Petrischalen, die Wachstumsmedium enthalten, kleine Ansätze mit Erfolg gezüchtet werden können, steht bei Verwendung größerer Gefäße die Ausbeute in keinem Verhältnis zur Vergrößerung des Versuches. Dies beruht vermutlich darauf, daß große, kontinuierliche Massen an Wachstumsmedien leichter durch Fremdbakterien verunreinigt werden; weiterhin sind sie schwerer zu belüften, und die Nematoden sind schwieriger daraus zu ernten.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand demgemäß darin, ein wirksames Verfahren zur Massenzüchtung von Nematoden bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Die Ansprüche 2 bis 6 betreffen zweckmäßige Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden Nematoden in einer Anlage mit sterilisierten Wachstumsmedien gezüchtet, die großzügig mit untereinander verbundenen Zwischenräumen versehen sind, um eine freie Zirkulation fließbarer Materialien, nämlich Luft zum Belüften und Waschflüssigkeiten zum Ernten, zu erlauben.

Erfindungsgemäß kann eine wirksame Massenzüchtungsanlage auf verschiedene Weise, z. B. durch loses Stapeln von Tierorganen oder Stücken von Tierorganen sowie von Tiergewebe oder von inertem Material, das mit einem Tiergewebehomogenisat überzogen oder imprägniert ist, erfolgen. (Die hier verwendete Bezeichnung "Tier" umfaßt auch Vögel.) Kleine Stapel können selbsttragend sein; über einer bestimmten Größe kann es jedoch, abhängig vom verwendeten Material und den Anteilen der einzelnen Komponenten, notwendig sein, Träger in Form von Böden oder Gittern mit Abständen, hergestellt aus Kunststoff, rostfreiem Stahl, Holz oder einem anderen inerten Material, vorzusehen. Anstelle der Böden oder Gitter kann man Gebilde aus zellularem oder gewundenem Material verwenden, z. B. als Schichten mit dazwischenliegenden Schichten aus Stücken des Wachstumsmediums oder als praktisch kontinuierliches, mit Tiergewebehomogenisat imprägniertes Netzwerk.

Das Ernteergebnis einer gegebenen Anlage steht in Beziehung zu der vorhandenen Oberfläche des Wachstumsmediums. Während ein Stapel aus Stücken von Tiermaterial relativ einfach zu konstruieren ist und ohne Zusammensacken oder Auseinanderfallen während wiederholter Erntezyklen zusammenhalten sollte, ist er vom Standpunkt des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen relativ ungünstig. Erfindungsgemäß kann ein Stapel mit hohem Oberflächen/Volumen-Verhältnis und entsprechend guter Anfangsernte aus einem Material (wie z. B. Holzwolle) hergestellt werden, das mit einem geeigneten Tiergewebe- oder Sojabohnenhomogenisat überzogen ist. Geeignete Materialien zur Erhöhung der Oberfläche eines Stapels sind z. B. Holzspäne, Stroh, Koks, Schnitzel von Kunststoffschläuchen oder Teile gefalteter Aluminiumfolien. Ein sehr wirksames Homogenisat erhält man aus den folgenden Komponenten:

Selbstverständlich liefern auch andere Kombinationen und ähnliche Materialien ebenso wirksame Wachstumsmedien für Nematoden. Als weitere Homogenisatformulierungen können genannt werden:

Beim oben beschriebenen Stapelbilden werden Inoculae der Nematoden und symbiotische (entomogene) Bakterien zu einem in feuchtem belüftetem Zustand gehaltenen, sterilisierten Stapel zugefügt und nach einer für eine geeignete Vermehrung entsprechenden Zeit werden die Nematoden z. B. durch Waschen mit sterilem Wasser geerntet. Die Nematoden können darauf z. B. vom Waschwasser abfiltriert werden und der Nematodenfilterkuchen kann mit Öl oder Öl und Wachs zur Bildung von Präparaten für die Lagerung oder Verwendung gemischt werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung. Dabei beziehen sich Angaben in Teilen auf Gewichtsteile.

Beispiel 1

Hier wurden die Nematoden Neoaplectana carpocapsae, Stamm Agriotos, verwendet. Die Nematoden wurden in monoxenischer Kultur zusammen mit ihrem symbiotischen Bakterium A. nematophilus zur Bildung eines Inoculums aus etwa 1 Million Individuen durch Kultur in kleinem Ansatz gezüchtet. Es wurde ein Medienstapel aus ganzen Hühnerherzen mit alternierenden Schichten aus Holzspänen gebildet und in Abständen durch vertikal übereinander angebrachte Maschendrahtböden in einer verschließbaren Trommel mit Einlaß und Auslaß für sterile Luft an jedem Ende unterstützt. Dann wurde das Trommelinnere und sein gesamter Inhalt durch Hindurchführen von Wasserdampf wärmesterilisiert. Die Inocula aus Nematoden und Bakterien wurden mit sterilem destilliertem Wasser gemischt und zum Dispergieren der Mikroorganismen über die Schichten des Mediums einfach in die sterile Trommel gegossen. Diese wurde dann etwa 3 Wochen bei etwa 25°C zur Bildung infizierender Nematoden bebrütet. Die Nematoden wanderten auf der Oberfläche der Hühnerherzen und auf die Holzspäne, von wo sie leicht mit sterilem Wasser abgespült werden konnten. Es wurden jedoch genügend Nematoden und Bakterien zur Produktion einer zweiten Generation in der Trommel belassen, die in derselben Weise bebrütet und geerntet wurde. Auf diese Weise erzielte man wiederholte Ernten, da der Stapel aus Hühnerherzen und Holzspänen nicht zusammenfiel, wobei die Hühnerherzen nur in der Größe schrumpften, jedoch ihre Kohärenz und Individualität behielten.

Beispiel 2

Eine Mischung aus 4 Teilen Hühnerherzen und 3 Teilen Wasser wurde etwa 3 Minuten in einem Haushaltsmixer homogenisiert. Das Homogenisat wurde von Hand mit trockener, grober Aspen- Holzwolle gemischt. Die Holzwolle wurde so geknetet und bearbeitet, daß jeder Strang diskret blieb, jedoch gründlich mit einer gleichmäßigen Schicht aus Hühnerherzhomogenisat überzogen war. Dann wurde die überzogene Holzwolle in 2-l-Aspiratoren aus Pyrex-Glas (etwa 320 g Homogenisat pro Aspirator) gegeben; deren obere Öffnung wurde mit nicht absorbierenden Wattepfropfen verschlossen, während der Bodeneinlaß vor der 1stündigen Autoklavenbehandlung an ein Luftfilterrohr angeschlossen wurde. Durch die obere Öffnung jedes Aspirators wurde ein monoxenisches Inoculum aus etwa 1 Million Neoaplectana eingeführt, und bei 100% relativer Feuchtigkeit wurde Luft durch das am Aspiratorboden eintretende Filterrohr eingeleitet, die oben wieder austrat. Aspirator und Inhalt wurden 3 Wochen bei 23°C bebrütet. Die erste Ernte (mit steriler Salzlösung) lieferte mehr als 5×10⁷ infizierende Nematoden, eine ähnliche Zahl wurde nach weiteren 3 Wochen geerntet.

Obgleich die vorliegende Erfindung mit Bezug auf eine besondere Nematodenspezies beschrieben ist, ist sie nicht auf diese beschränkt.

Weiterhin ist nicht nur die Schädlingsbekämpfung eine Einsatzmöglichkeit für das erfindungsgemäße Verfahren zur Massenproduktion von Nematoden. So sind z. B. lebende Nematoden ein sehr beliebtes Futter für viele Fischarten, und Nematodenkulturen sind im Handel für Liebhaber tropischer Fische zwecks Beschaffung von lebendem Futter für ihre Aquarien erhältlich. Ein ähnlicher Markt ergäbe sich auch für die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren produzierten lebenden, erwachsenen Nematoden, insbesondere bei Verpackung in wasserdichten, luftdurchlässigen Behältern, die zur gekühlten Lagerung geeignet sind.

Claims

1. Verfahren zur Massenzüchtung von Nematoden, wobei die Nematoden auf einem sterilisierten Wachstumsmedium in Gegenwart symbiotischer Bakterien der entsprechenden Nematoden-Art inkubiert und anschließend aus diesem Medium geerntet werden, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bilden von selbsttragenden oder durch Träger in Form von in Abständen zueinander angeordneten Böden oder Gittern aus inertem Material oder von Gebilden aus zellularem oder gewundenem Material getragenen Stapeln von gegebenenfalls mit inertem Material vermischten Tierorganen, Stücken von Tierorganen oder Tiergewebe oder von inertem Material, das mit Tiergewebe- oder Sojabohnen-Homogenisat überzogen oder imprägniert ist,
b) Sterilisieren der Stapel und des Wachstumsmediums,
c) Dispergieren der symbiotischen Bakterien der Nematoden über das sterilisierte Wachstumsmedium,
d) Dispergieren von Nematoden über das sterilisierte Wachstumsmedium,
e) Inkubieren der Kombination aus Wachstumsmediums- Stapel, Nematoden und symbiotische Bakterien, und
f) Ernten der Nematoden aus dem inkubierten Wachstumsmedium.

2. Verfahren zur Züchtung von Nematoden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nematoden und die symbiotischen Bakterien zusammengemischt werden und die Verfahrensschritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt werden, wobei die Mischung aus Nematoden und symbiotischen Bakterien über das sterilisierte Wachstumsmedium dispergiert werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sterilisation des Stapels und des Wachstumsmediums entweder durch Autoklavieren des Stapels und des Wachstumsmediums oder durch Hindurchführen von Wasserdampf durch den Stapel und das Wachstumsmedium erzielt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Homogenisat aus einer Mischung aus Hühnerherz, Schweineniere, Wasser und Cholesterin besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Homogenisat 3 Teile Hühnerherz, 3 Teile Schweineniere, 2 Teile Wasser und 0,05 Gewichts-% Cholesterin beinhaltet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Material des Stapels aus Holzwolle, Holzspäne, Stroh, Aluminiumfolienteilchen oder Schnitzeln von Kunststoffschläuchen oder Koks ausgewählt wird.