PL215169B1 - Sposób amplifikacji wirusów, kompozycja zawierajaca pokswirusa uzyskanego tym sposobem oraz jego zastosowanie do otrzymywania szczepionki - Google Patents

Sposób amplifikacji wirusów, kompozycja zawierajaca pokswirusa uzyskanego tym sposobem oraz jego zastosowanie do otrzymywania szczepionki

Info

Publication number
PL215169B1
PL215169B1 PL373992A PL37399203A PL215169B1 PL 215169 B1 PL215169 B1 PL 215169B1 PL 373992 A PL373992 A PL 373992A PL 37399203 A PL37399203 A PL 37399203A PL 215169 B1 PL215169 B1 PL 215169B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
virus
serum
medium
extract
Prior art date
Application number
PL373992A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373992A1 (pl
Inventor
Ingmar Räthe
Eva Felder
Karl Heller
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31970216&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL215169(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of PL373992A1 publication Critical patent/PL373992A1/pl
Publication of PL215169B1 publication Critical patent/PL215169B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu amplifikacji wirusów. Komórki podstawowe hodowane są w podłożu bez surowicy, zawierającym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania. Hodowla komórek podstawowych stanowi etap sposobu amplifikacji wirusów, takich jak pokswirusy (wirusy ospy). Zgodnie ze wspomnianym sposobem, komórki podstawowe hodowane są w podłożu bez surowicy, zawierającym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania. Następnie, komórki infekowane są wirusem, zainfekowane komórki hodowane w podłożu niezawierającym surowicy, do momentu otrzymania potomstwa wirusa.
Tło wynalazku
Większość szczepionek wirusowych, zawierających atenuowane lub rekombinowane wirusy, otrzymywana jest z systemów kultur komórkowych. Komórki wykorzystywane do produkcji wirusa/szczepionki mogą być liniami komórkowymi, tj., komórkami rosnącymi w sposób ciągły in vitro, w postaci jednokomórkowej zawiesiny hodowlanej w bioreaktorach lub w formie pojedynczej warstwy na powierzchni nośników dla komórek, naczyń do hodowli tkankowych lub okrągłych butelek. Przykładem linii komórkowych stosowanych w produkcji wirusów jest: linia komórkowa płuca płodu ludzkiego MRC-5, używana do otrzymywania wirusów polio i linia komórkowa płuca płodu ludzkiego WI-38, stosowana do otrzymywania wirusa odry, wirusa świnki i wirusa różyczki (MMR II) (Merk Sharp & Dohme).
Do produkowania szczepionek stosowane są nie tylko linie komórkowe, lecz również komórki podstawowe pochodzenia zwierzęcego. Przykładem komórek podstawowych, znajdujących zastosowanie w produkcji wirusa są fibroblasty embrionów kurcząt (komórki CEF). Komórki te używane są do uzyskiwania wirusa odry i wirusa japońskiego zapalenia mózgu (Pasteur Merieux), wirusa świnki (produkowanego przez Provaccine), wirusa wścieklizny (produkowanego przez Chiron Berhing GmbH & Co.), wirusa żółtej febry (produkowanego przez Aprilvax), wirusa grypy (produkowanego przez Wyeth Labs i SmithKline & Beecham) i zmodyfikowanego wirusa kro wianki Ankara (MVA).
Komórki CEF znajdują często zastosowanie w produkcji wirusów, istnieje wiele szczepionek wirusowych produkowanych w wyniku atenuacji wirulentnego wirusa wywołującego chorobę, a następnie jego seryjnego pasażowania w komórkach CEF. Atenuowany wirus nie jest już w stanie wywołać choroby, utrzymuje jednak nadal zdolność do stymulacji silnej ochrony immunologicznej przeciwko wirulentnym formom wirusa. Przykładem takiego typu wirusa jest MVA. Wirus jest silnie ograniczony replikacyjnie u ludzi i większości zwierząt. MVA jest stosowany jako wektor szczepionkowy, ponieważ może być użyty do ekspresji antygenów pochodzących z różnych czynników powodujących choroby u ludzi. Wirusy atenuowane, takie jak MVA, korzystnie nie są propagowane w komórkach ludzkich, ze względu na to, że istnieje obawa, że wirusy te mogłyby stać się replikacyjnie kompetentne w komórkach pochodzenia ludzkiego. Wirusy o nabytej ponownie zdolności replikacji w komórkach ludzkich mogłyby stanowić ryzyko dla zdrowia, w przypadku, gdy podawane ludziom, w szczególności osobom o niedoborze odporności. Z tego powodu, pewne atenuowane wirusy, takie jak MVA, jeżeli mają być podawane ludziom, otrzymywane są jedynie z komórek CEF.
Ponadto, komórki CEF stosowane są w przypadku wirusów rosnących tylko we wspomnianych komórkach. Przykładami takich wirusów są w szczególności wirusy ptasie, takie jak wirusy ospy ptaków (avipox), w szczególności wirus ospy kanarków, ALVAC, wirus ospy drobiu i NYVAC.
Linie komórkowe i komórki podstawowe wzrastając w warunkach hodowli in vitro wymagają specjalnego podłoża dla wzrostu i utrzymania, które może podtrzymać (I) replikację komórek w fazie logarytmicznej oraz (II) utrzymać komórki, gdy nie ulegają już dłużej podziałom, tj., gdy komórki znajdują się w fazie stacjonarnej. Powszechnie stosowane podłoża do hodowli komórek obejmują bogaty w sole roztwór zawierający witaminy, aminokwasy, istotne pierwiastki śladowe i cukry. Hormony wzrostu, enzymy i aktywne biologicznie białka wymagane do podtrzymania wzrostu komórkowego i utrzymania komórek, są zazwyczaj dodawane do podłoża jako substancje uzupełniające w postaci produktów pochodzących z surowicy krwi zwierzęcej. Przykładami produktów pochodzących z surowicy krwi zwierzęcej są płodowa surowica cielęca, surowica kurcząt, surowica końska i surowica wieprzowa. Surowice te pochodzą z frakcjonowanej krwi, z której zostały usunięte komórki czerwonych krwinek i białych krwinek krwi. Komórki podstawowe, takie jak komórki CEF są uzależnione od źródła surowicy zwierzęcej nawet bardziej, niż linie komórkowe. Zatem, komórki podstawowe są zazwyczaj hodowane w podłożach do hodowli komórek zawierających od 5 do 10% surowicy, w większości wypadków surowicy cielęcej (FCS).
PL 215 169 B1
Surowice zwierzęce oprócz czynników wymaganych do wzrostu komórek, zawierają również czynniki dla komórek, naturalnie wzrastających jako komórki adherentne. Czynniki te są wymagane do przyczepienia komórki do nośnikowej powierzchni naczynia hodowlanego. Zatem, w przypadku komórek adherentnych istotne jest dodanie wystarczającej ilości surowicy do podłoża, umożliwiającej im wzrost i utworzenie pojedynczej warstwy komórek.
Niestety, surowica wołowa/płodowa cielęca, jak również surowice pochodzące od innych zwierząt mogą zawierać nieprzewidziane czynniki patogenne, takie jak wirusy. Przeniesienie wspomnianych czynników patogennych do organizmu zwierząt/ludzi traktowanych lub szczepionych szczepionką lub jakimkolwiek innym produktem farmaceutycznym, wyprodukowanym w kulturze komórkowej, stanowi potencjalne niebezpieczeństwo. Ma to szczególne znaczenie, w przypadku, gdy produkty hodowli komórkowej podawane są ludziom z niedoborem odporności. Jednym z głównych problemów związanych z powszechnie stosowanym dodatkiem surowicy wołowej jest możliwość przeniesienia czynnika infekcyjnego gąbczastego zapalenia mózgu (BSE) do organizmu zwierząt/ludzi, mających kontakt z produktami uzyskanymi z hodowli komórkowej.
W obliczu prawdopodobnego ryzyka, jakie niesie użycie surowicy zwierzęcej w hodowli komórkowej, wysoko pożądane stały się procesy, w których nie są wykorzystywane produkty zwierzęce.
W tym celu, opracowywano specyficzne podłoża, które nie musiały być uzupełniane surowicą zwierzęcą, odpowiednio, dla hodowli ciągłego wzrostu linii komórkowych i dla produkcji wirusów w takich liniach komórkowych. Przykładem wspomnianego podłoża nie zawierającego surowicy, które może być zastosowane do hodowli linii komórkowych, jest VP-SFM produkowane przez Gibco BRL/Life Technologies. Zgodnie z informacją producenta, VP-SFM jest specyficznie przeznaczone dla wzrostu VERO, COS-7, MDBK, Hep2, BHK-21 i innych ważnych linii komórkowych (Price, P. i Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69) i do produkcji wirusa we wspomnianych liniach komórkowych. Nie zamieszczono żadnej informacji o hodowli komórek podstawowych we opisywanym podłożu.
W US 5,503,582 ujawniono sposób hodowli komórek CEF w podłożu zawierającym 4% surowicy cielęcej, po której następowała infekcja komórek wirusem ospy drobiu w podłożu bez surowicy. Spataro, A.C. i wsp., J.Cell.Sci. 1976; 21, 407-413 ujawnia, że komórki CEF mogą być utrzymane w podłożu bez surowicy przez 24 godziny po utworzeniu monowarstwy. Zatem, w obu tych publikacjach, podłoża, które zastosowano do hodowli komórek po zaszczepieniu obejmują surowicę. Jedynie dla utrzymania komórek, które już są przyczepione do powierzchni, i które osiągnęły fazę stacjonarną, użyto podłoża bez surowicy. W wypadku, gdy zaszczepienia dokonano w konwencjonalnym podłożu, takim jak podłoże 199 lub RPMI-1640 bez surowicy, nie odnotowano powstania żadnej monowarstwy a komórki tworzyły niezdolne do przeżycia agregaty w podłożu.
WO 98/15614 dotyczy specyficznego podłoża bez surowicy do hodowli in vitro komórek zwierzęcych. Komórki, które mogą być hodowane w opisanym podłożu, ujawnionym w WO 98/15614, są pochodzenia zwierzęcego, włączając komórki uzyskane od ssaków, ptaków, owadów lub ryb. Komórki ssacze mogą być komórkami podstawowymi ludzkiego pochodzenia. Nie ma żadnego odniesienia do komórek podstawowych ptaków.
W US 5,405,772 ujawniono podłoże bez surowicy, służące do proliferacji i rozwoju komórek. Komórki są korzystnie komórkami hematopoetycznymi i komórkami zrębowymi szpiku kostnego. Nie wspomina się o podstawowych komórkach ptaków.
W WO 98/04680 ujawniono podłoże bez surowicy do wzrostu zależnych od obecności nośnika komórek ssaczych, takich jak linia komórek BHK, Vero lub MRC-5. WO 98/04680 nie dotyczy ani komórek podstawowych ani komórek ptasich.
Cel wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobu umożliwiającego hodowlę komórek podstawowych, w szczególności podstawowych komórek ptaków w podłożu bez surowicy, przy czym sposób ten pozwala na (I) wzrost komórek w logarytmicznej fazie wzrostu i (II) utrzymanie komórek w fazie stacjonarnej. Ponadto, jeżeli komórki są komórkami adherentnymi, podłoże może korzystnie pozwalać na (III) przyczepienie komórek adherentnych do powierzchni naczynia do hodowli komórkowej. Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobu produkcji wirusa poprzez wykorzystanie komórek podstawowych w warunkach braku surowicy.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób amplifikacji wirusa charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
PL 215 169 B1
- hodowlę podstawowych komórek ptasich w pozbawionym surowicy podłożu zawierającym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania,
- infekcję podstawowych komórek ptaków pokswirusem,
- hodowlę zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu, aż do uzyskania potomstwa wirusa, przy czym podstawowe komórki ptaków są komórkami pozwalającymi na produktywną replikację pokswirusa.
Korzystnie, podstawowymi komórkami ptaków są fibroblasty embrionów kurcząt (CEF).
Korzystnie, czynnikiem wzrostu jest czynnik wzrostu naskórka (EGF), w szczególności rekombinowany-ludzki EGF.
Korzystnie, stężenie EGF mieści się w zakresie od 5 do 20 ng/ml podłoża.
Korzystnie, czynnikiem przyłączania jest fibronektyna.
2
Korzystnie, stężenie fibronektyny mieści się w zakresie od 1 do 10 μg/cm powierzchni naczynia hodowli komórkowej.
Korzystnie, podłoże zawiera dwa lub więcej czynników wybranych z czynników wzrostu i czynników przyłączania.
Korzystnie, podłoże zawiera EGF i fibronektynę w zakresie stężeń zdefiniowanym powyżej.
Korzystnie, podłoże zawiera ponadto jedną lub więcej substancję dodatkową, wybraną spośród ekstraktu mikrobiologicznego, ekstraktu roślinnego i ekstraktu z innych niż ssaki zwierząt.
Korzystnie, ekstrakt mikrobiologiczny jest ekstraktem drożdżowym lub ultrafiltratem drożdżowym.
Korzystnie, ekstraktem roślinnym jest ekstrakt ryżowy lub ekstrakt sojowy.
Korzystnie, ekstrakt z różnego od ssaka zwierzęcia jest ekstraktem rybnym.
Korzystnie, pokswirusem jest ortopokswirus, szczególnie korzystnie ortopokswirusem jest wirus krowianki, a najkorzystniej wirusem krowianki jest zmodyfikowany wirus krowianki Ankara.
Korzystnie, pokswirusem jest wirus atenuowany lub wirus rekombinowany.
Korzystnie, podłoże niezawierające surowicy stosowane w jednym lub obu etapach:
- infekcji komórek podstawowych wirusem i
- hodowli zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu aż do uzyskania potomstwa wirusa nie obejmuje czynników wybranych spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania.
Korzystnie, po etapie hodowli zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu, aż do uzyskania potomstwa wirusa, następuje jeden lub więcej etapów oczyszczania.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera pokswirusa uzyskanego sposobem według wynalazku zdefiniowanym powyżej.
Korzystnie, jest ona wolna od jakichkolwiek produktów i/lub czynników zakaźnych zawartych w surowicach zwierzęcych.
Korzystnie jest ona lekiem lub szczepionką.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji według wynalazku, zdefiniowanej powyżej, do otrzymywania szczepionki.
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek związany jest ze sposobem hodowli komórek podstawowych, charakteryzującym się tym, że komórki hodowane są w podłożu bez surowicy, zawierającym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, komórki podstawowe, które naturalnie wzrastają jako komórki adherentne, po zaszczepieniu, ulegają przyczepieniu do powierzchni naczynia do hodowli komórkowej i wzrastają w logarytmicznej fazie, aż do utworzenia monowarstwy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, komórki w fazie spoczynku mogą być utrzymane w podłożu stosowanym podczas procesu przyczepiania i logarytmicznego wzrostu komórek.
Sposób według niniejszego wynalazku nie jest ograniczony do komórek, które tworzą pojedynczą warstwę. Zgodnie z alternatywną realizacją, sposób według niniejszego wynalazku może być zastosowany dla wszystkich typów komórek podstawowych, takich jak komórki naturalnie wzrastające w postaci zawiesiny hodowlanej (np., limfocyty lub inne typy komórek krwi) lub komórki, które naturalnie mogą wzrastać jako komórki adherentne, lecz, które uległy przystosowaniu do wzrostu w zawiesinie hodowlanej.
PL 215 169 B1
Jak wykazano poniżej, komórki mogą być również zastosowane do amplifikacji, w podłożu bez surowicy, wirusów, które mogą być użyteczne jako szczepionki.
Ogólnie, dotychczas uważano, że komórki podstawowe uzależnione są od wielu różnych czynników i składników zawartych w surowicy. Dlatego też nieoczekiwanym było odnotowanie w warunkach braku surowicy, obecności komórek podstawowych naturalnie rosnących jako komórki adherentne (I), które mogą efektywnie przyczepiać się do powierzchni naczynia do hodowli komórkowej, bez tworzenia niedopuszczalnych ilości agregatów i (II) mogących wzrastać w fazie logarytmicznej. Ponadto, uważano, że komórki adherentne, w przypadku, gdy hodowane w podłożu bez surowicy, tworzą niezdolne do życia agregaty, które nie ulegają przyczepieniu do powierzchni naczynia do hodowli komórkowej. Zatem, stwierdzono nieoczekiwanie, że aby osiągnąć stan przyczepienia komórek i wzrost adherentnych komórek podstawowych, wystarczy dodać do podłoża niezawierającego surowicy, czynnik wybranego z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania. Ponadto, również nieoczekiwanie, komórki podstawowe hodowane w zawiesinie mogą wzrastać w podłożu zastosowanym w sposobie według niniejszego wynalazku. Dodatkowo, podstawowe komórki ptaków, takie jak fibroblasty embrionów kurcząt (CEF) mogą być hodowane do przyczepienia na powierzchni naczynia hodowlanego, bez tworzenia niepożądanych ilości agregatów w podłożu nie zawierającym surowicy i obejmującym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania. Komórki ptaków znane są z niezwykle słabego wzrostu w podłożu bez surowicy, nie zawierającym czynników wzrostu lub czynników przyłączania. Nieoczekiwanie stwierdzono, że właściwości słabego wzrostu podstawowych komórek ptasich mogą być znacznie polepszone poprzez dodanie do podłoża nie zawierającego surowicy, czynnika wybranego z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania.
Termin „komórki podstawowe” stosowany w niniejszym wynalazku jest dobrze znany specjalistom w dziedzinie. Bez ograniczania się do poniższej definicji, termin „komórki podstawowe” dotyczy komórek świeżo wyizolowanych z tkanki, narządu lub organizmu zwierzęcego lub człowieka, przy czym komórki te nie są zdolne do ciągłych i nieskończonych replikacji i podziałów. Zazwyczaj, komórki podstawowe ulegają podziałom mniej niż 100 razy w hodowli komórkowej, często mniej niż 50 razy, a nawet, często niż 25 razy. Zatem, komórki podstawowe nie podlegają unieśmiertelnieniu. Przykładami komórek podstawowych są limfocyty szpiku i ludzkie lub zwierzęce fibroblasty. Korzystnymi przykładami zwierzęcych fibroblastów są fibroblasty ptaków, najkorzystniejszymi fibroblasty embrionów kurcząt (komórki CEF). Korzystnym przykładem podstawowych fibroblastów ludzkich są ludzkie fibroblasty napletka.
Sposoby izolacji komórek podstawowych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Ogólnie, hodowle komórek pierwszorzędowych pochodzą bezpośrednio z tkanek, narządów lub embrionów. Tkanki, narządy lub embriony poddawane są działaniu proteazy, co pozwala na uzyskanie pojedynczych komórek. Komórki te są następnie hodowane według sposobu niniejszego wynalazku w warunkach hodowli in vitro.
Bardziej szczegółowo, komórki CEF uzyskane są z trawionych proteazą embrionów kurcząt. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, komórki CEF rosną najlepiej jako komórki adherentne, przyczepione do powierzchni stałego nośnika komórek. Komórki rozpoczynają replikację i tworzą pojedynczą warstwę komórek. Jeżeli komórki CEF (po trawieniu embrionu) hodowane są in vitro w standardowych podłożach hodowlanych bez surowicy zwierzęcej, komórki bardzo rzadko będą ulegać przyczepieniu do powierzchni stałego nośnika komórek, nie będą replikować z utworzeniem konfluentnej, pojedynczej warstwy komórek i, z czasem, będą wolno oddzielać od powierzchni stałego nośnika hodowli. Natomiast, jeżeli komórki CEF hodowane są według sposobu niniejszego wynalazku, komórki przyłączają się do stałego nośnika, wzrastają w logarytmicznej fazie wzrostu aż do utworzenia monowarstwy i możliwe jest utrzymanie ich w fazie stacjonarnej przez kilka dni.
Termin „hodowla komórek” w podłożu bez surowicy w odniesieniu do adherentnych komórek podstawowych dotyczy zaszczepienia komórek w naczyniu hodowlanym z podłożem bez surowicy, hodowli komórek w podłożu bez surowicy w fazie logarytmicznej aż do utworzenia monowarstwy i/lub utrzymania komórek w podłożu bez surowicy, gdy tylko uformowana zostanie pojedyncza warstwa komórek. Korzystniej, termin „hodowla komórek” w podłożu bez surowicy dotyczy sposobu, w którym wszystkie wyżej wymienione etapy przebiegają w podłożu bez surowicy, co sprawia, że cały proces hodowli komórek przebiega przy braku produktów surowicy zwierzęcej. Zatem, w bardziej ogólnym znaczeniu, termin „hodowla komórek w podłożu bez surowicy” odnosi się do faktu, że wszystkie podłoża prowadzące do uformowania monowarstwy są podłożami bez surowicy. Podłoża stosowane we wszystkich powyższych etapach mogą zawierać czynnik wybrany spośród czynników wzrostu i czyn6
PL 215 169 B1 ników przyłączania. Jednakże, może okazać się wystarczającym dodanie takiego czynnika tylko do podłoża zastosowanego podczas przyłączania komórek i/lub wzrostu komórek w warunkach logarytmicznego wzrostu.
Termin „hodowla komórek” w podłożu bez surowicy w odniesieniu do komórek wzrastających w zawiesinie hodowlanej, dotyczy zaszczepienia komórek w naczyniu hodowlanym w podłożu bez surowicy, hodowli komórek w podłożu bez surowicy w fazie logarytmicznej i/lub utrzymania komórek w podłożu bez surowicy po uzyskaniu gęstości nasycenia, przy której nie zachodzi już dalsza replikacja. Korzystniej, termin „hodowla komórek” w podłożu bez surowicy dotyczy sposobu, w którym wszystkie wyżej wymienione etapy przebiegają w podłożu bez surowicy, tak, że żaden produkt surowicy zwierzęcej nie jest obecny podczas całego procesu hodowli komórkowej. Podłoża zastosowane we wszystkich powyższych etapach mogą korzystnie zawierać czynnik wybrany z grupy czynników wzrostu. Jednakże, może okazać się wystarczające dodanie takiego czynnika jedynie do podłoża zastosowanego do zaszczepienia komórek i/lub hodowli komórek w warunkach logarytmicznego wzrostu. Jak wyjaśniono bardziej szczegółowo poniżej, możliwa jest także hodowla komórek naturalnie wzrastających jako komórki adherentne, czy w postaci zawiesiny komórkowej, jeżeli zostaną wybrane odpowiednie warunki inkubacji (np., poprzez zastosowanie „falowej” inkubacji). Sposób według niniejszego wynalazku dotyczy również tego typu inkubacji.
Termin podłoże „bez surowicy” odnosi się do jakiegokolwiek podłoża przeznaczonego do hodowli komórkowej, które nie zawiera surowicy pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego. Specjalistom w dziedzinie znane są odpowiednie podłoża do hodowli komórkowej. Podłoża te zawierają sole, witaminy, bufory, źródła energii, aminokwasy i inne substancje. Przykładem podłoża bez surowicy, odpowiedniego do hodowli komórek CEF jest podłoże 199 (Morgan, Morton i Parker; Proc. Soc. Exp. Biol.Med.1950, 73, 1; uzyskane m.in. z Life Technologies).
Podłoża zastosowane według sposobu według niniejszego wynalazku, w szczególności podłoża stosowane dla komórek adherentnych, takich jak komórki CEF, zawierają czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączenia. Przykładem czynnika przyłączenia jest fibronektyna.
Dla komórek, które naturalnie mogą wzrastać jako komórki adherentne, które, są jednak hodowane w postaci zawiesiny komórkowej (co jest możliwe np., dla komórek CEF), szczególnie korzystne jest zastosowanie czynnika wybranego z grupy czynników wzrostu. Przykładem czynnika wzrostu, użytecznego w tego typu hodowlach, jest rekombinowany, wołowy, myszy, kurcząt lub ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGF). Najkorzystniejszym jest rekombinowany, ludzki EGF (rh-EGF) (Chemicon Int., numer kat.: GF001).
Dla komórek naturalnie wzrastających w zawiesinie hodowlanej, podłoże może korzystnie zawierać czynnik wybrany z grupy czynników wzrostu, włączając EGF. Korzystniej, czynniki wzrostu dla tego typu komórek są czynnikami swoistymi wobec komórek nieadherentnych. Przykładami takich czynników wzrostu są interleukiny, GM-CSF, G-CSF i inne. Specjalista w dziedzinie może łatwo określić drogą zwyczajowych eksperymentów, którego typu czynnik jest odpowiedni dla danego typu komórek.
W przypadku, gdy czynnikiem dodanym do podłoża bez surowicy jest EGF, w szczególności rh-EGF, czynnik ten jest korzystnie dodany do podłoża w stężeniu od 1 do 50 ng/ml, korzystniej od 5 do 20 ng/ml. Jednakże, specjalista powinien wziąć pod uwagę, że dla osiągnięcia optymalnych wyników, różne typy komórek mogą wymagać nieco odmiennych stężeń EGF w surowicy.
W przypadku, gdy czynnikiem dodanym do podłoża bez surowicy jest fibronektyna: (np., Chemicon Int.; Human plasma fibronectin; numer kat. FC010), dodawana jest ona do podłoża korzystnie 2 w stężeniu od 1 do 50, bardziej korzystnie 1 do 10 μg/cm powierzchni naczynia do hodowli komórkowej. Jednakże, specjalista w dziedzinie powinien wziąć pod uwagę, że dla osiągnięcia optymalnych wyników, różne typy komórek mogą wymagać nieco odmiennych stężeń fibronektyny w surowicy.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wystarczającym jest dodanie tylko jednego czynnika wybranego spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania, w szczególności, jeżeli komórki są komórkami adherentnymi. Jednakże, możliwe jest również, dodanie do podłoża dwóch lub więcej czynników wybranych spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania. Podłoże może korzystnie zawierać EGF i fibronektynę, korzystnie w zdefiniowanym powyżej zakresie stężeń, w szczególności, jeżeli komórki podstawowe są komórkami adherentnymi, takimi jak komórki CEF.
Podłoże może ponadto zawierać jeden lub więcej dodatków wybranych spośród ekstraktu mikrobiologicznego, ekstraktu roślinnego i ekstraktu z innych niż ssaki zwierząt. Ekstrakt mikrobiologiczPL 215 169 B1 ny jest korzystnie ekstraktem drożdżowym lub ultrafiltratem drożdżowym. Ekstraktem roślinnym jest korzystnie ekstrakt ryżowy lub ekstrakt sojowy. Ekstraktem z innych niż ssaki zwierząt jest korzystnie ekstrakt z ryb.
Zgodnie z korzystną realizacją niniejszego wynalazku, asparagina może być dodana do handlowo dostępnych podłóż bez surowicy, do których został dodany czynnik wybrany spośród czynników wzrostu i czynników przyłączenia. Korzystniej, asparagina dodana jest do podłoża, które stosowane jest podczas infekcji wirusem (patrz poniżej). Dostępne na rynku podłoża bez surowicy zawierają asparaginę zazwyczaj w stężeniu od 0.3 do 1.0 mM. Korzystne ilości asparaginy, jako dodatku do podłoża, mieszczą się w zakresie od 0.5 do 1.5 mM. Najkorzystniejszy jest dodatek 1 mM asparaginy. Całkowite stężenie asparaginy w podłożu wynosi korzystnie mniej niż 2 mM i, korzystniej, mieści się w przedziale 0.8 do 1.8 mM. Najkorzystniejsze stężenie asparaginy w podłożu wynosi 1.3 mM.
Ponadto, glutamina może być korzystnie dodana do podłoża. Korzystniej, glutamina jest dodana do podłoża, użytego podczas infekcji wirusem (patrz poniżej). Korzystne ilości glutaminy, jako dodatku do podłoża, mieszczą się w zakresie 1 do 5 mM, korzystniej, w zakresie 2 do 4 mM. Ze względu na to, że większość handlowo dostępnych podłóż nie zawiera glutaminy, wskazane przedziały odpowiadają również jej korzystnym, całkowitym stężeniom w podłożu.
Zgodnie z kolejną realizacją, wynalazek dotyczy sposobu amplifikacji wirusa, obejmującego następujące etapy: w pierwszym etapie komórki podstawowe hodowane są według sposobu opisanego powyżej, tj., komórki podstawowe hodowane są w podłożu bez surowicy, zawierającym, zależnie od typu komórki, czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączenia. Wszystkie warunki, definicje, korzystne realizacje i również pozostałe z korzystnych, do najbardziej korzystnych realizacji, podano w opisie sposobu hodowli komórek podstawowych powyżej, również odnośnie pierwszego etapu sposobu amplifikacji wirusa według niniejszej realizacji wynalazku. W drugim etapie komórki podstawowe infekowane są wirusem. W trzecim etapie, zainfekowane komórki inkubowane są w podłożu bez surowicy, aż do wyprodukowania potomstwa wirusa.
Termin „amplifikacja wirusa” wskazuje, że sposób według niniejszego wynalazku jest korzystnie stosowany w celu zwiększenia ilości wirusa drogą efektywnej replikacji wirusa w zainfekowanych komórkach. Innymi słowy, stosunek wkładu wirusa do uzyskanego wirusa powinien korzystnie być wyższy od 1. Zatem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dla określonego wirusa wybierane są takie komórki podstawowe, w których wirus ten zdolny jest do produktywnej replikacji. Termin „replikacja produktywna” dotyczy procesu, w którym specyficzny wirus ulega replikacji w specyficznych komórkach podstawowych, w takim zakresie, że produkowane jest infekcyjne potomstwo wirusa, przy czym stosunek wkładu wirusa do uzyskanego wirusa jest wyższy od 1.
Specjaliści w dziedzinie wiedzą, w jakiego typu komórkach podstawowych określone wirusy mogą ulegać wydajnej replikacji. Przykładowo, komórki podstawowe mogą być ludzkimi fibroblastami napletka, jeżeli wirus poddawany amplifikacji jest cytomegalowirusem; komórki podstawowe mogą być komórkami CEF, jeżeli wirus mający być amplifikowany jest wirusem odry, wirusem świnki, wirusem wścieklizny, wirusem Japońskiego zapalenia mózgu, wirusem żółtej febry, wirusem grypy lub pokswirusem, takim jak wirus krowianki, w szczególności zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA).
Specjalistom w dziedzinie znane są sposoby infekowania komórek podstawowych według drugiego etapu niniejszej realizacji. Przykładowo, wirus może być po prostu dodany do podłoża. Alternatywnie, podłoże może być usunięte i wirus dodany do świeżego podłoża, które jest z kolei dodane do komórek. W celu uzyskania wydajnej infekcji, ilość zawiesiny wirus/podłoże powinna być możliwie niska, tak, by osiągnąć wysokie stężenie wirusa. Po przyłączeniu wirusa, możliwe jest dodanie dodatkowego podłoża.
W trzecim etapie, komórki są inokulowane w podłożu bez surowicy, aż do wyprodukowania potomstwa wirusa.
Podłoże bez surowicy stosowane w drugim i trzecim etapie sposobu amplifikacji wirusa może być tym samym, które było już użyte wcześniej, tj., podłożem bez surowicy zawierającym, zależnie od typu komórki, czynnik wybrany spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania. Jednakże, w celu zmniejszenia kosztów, możliwe jest zastosowanie na jednym lub obu, drugim i trzecim etapie, podłoża bez surowicy, które nie zawiera czynnika wybranego spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania.
Jak już wspomniano, podczas wszystkich etapów, podłoże może być uzupełnione asparaginą i/lub glutaminą, przy czym całkowite stężenie asparaginy w podłożu jest korzystne zgodnie z definicją zamieszczoną powyżej.
PL 215 169 B1
Potomstwo wirusa może zostać zatężone i oczyszczone według metod znanych specjalistom w dziedzinie.
Zgodnie z korzystną realizacją, sposób amplifikacji wirusów stosowany jest do amplifikacji pokswirusów. Zatem, według tej korzystnej realizacji, wynalazek dotyczy sposobu amplifikacji pokswirusa, który obejmuje następujące etapy: (I) hodowlę komórek podstawowych według sposobu opisanego wyżej, tj., sposobu, w którym komórki podstawowe hodowane są w podłożu bez surowicy, zawierającym, zależnie od typu komórek, czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania, (II) infekcję komórek podstawowe pokswirusem oraz (III) hodowlę zainfekowanych komórek w podłożu bez surowicy, aż do wyprodukowania potomstwa wirusa.
Ze względu na to, że komórki źle rosną w znanych podłożach bez surowicy, nie przypuszczano, że pokswirusy będą mogły ulegać amplifikacji w komórkach hodowanych w warunkach braku surowicy. Oczekiwano, że dodatkowy stres związany z infekcją pokswirusową może zabić dodatkowo zestresowane komórki, jeszcze przed zajściem znaczącej amplifikacji pokswirusa.
Pokswirus jest korzystnie ortopokswirusem. Przykładami ortopokswirusów są wirusy avipoxvirus (ospy ptaków) i wirusy krowianki.
Termin „avipoxvirus” odnosi się do jakiegokolwiek wirusa ospy ptaków, takiego jak Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus i Turkeypoxvirus. Korzystnymi wirusami ospy ptaków są wirus ospy kanarków i wirus ospy drobiu.
Przykładem wirusa ospy kanarków jest szczep Rentschler. Oczyszczony techniką łysinek, szczep ospy kanarków, nazwany ALVAC (US 5,766,598) zdeponowano zgodnie z porozumieniem traktatu Budapesztańskiego w Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ATCC), pod numerem przyjęcia VR-2547. Innym szczepem ospy kanarków jest handlowa szczepionka szczepu ospy kanarków oznaczona LF2 CEF 524 24 10 75, możliwy do uzyskania z Instytutu Merieux, Inc.
Przykładami wirusa ospy drobiu (Fowlpox) są szczepy FP-1, FP-5 i TROVAC (US 5,766,598). FP-1 jest szczepem Duvette, zmodyfikowanym do zastosowania jako szczepionka jednodniowych kurcząt. Szczep ten jest handlowo dostępnym szczepem szczepionki wirusa ospy drobiu, oznaczonym symbolem O DCEP 25/CEP67/2309 październik 1980r. i jest możliwy do uzyskania z Instytutu Merieux, Inc. FP-5 jest handlowo dostępnym szczepem szczepionki wirusem ospy drobiu, pochodzącym z embrionów kurcząt, możliwym do uzyskania z American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary License No. 165, serial No. 30321.
Przykładami szczepów wirusa krowianki są szczepy Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda i WR. Wynalazek korzystnie wykonano z użyciem zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA) (Sutter, G. i wsp. [1994], Vaccine 12: 1032-40). Typowym szczepem MVA jest MVA 575, zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych, pod numerem depozytu ECACC V00120707. Bardziej korzystnym jest MVA-BN lub jego pochodne, opisane w zgłoszeniu PCT PCT/EP01/13628, złożonym w Europejskim Urzędzie Patentowym 22 listopada 200Ir., zatytułowanym „Modified Vaccinia Ankara Virus Variant” („Wariant zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara”). MVA-BN został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych, pod numerem depozytu ECACC V00083008. Właściwości MVABN, opis analizy biologicznej pozwalającej na ocenę, czy MVA jest MVA-BN lub jego pochodną, i sposoby umożliwiające otrzymanie MVA-BN lub jego pochodnych zawarto w powyżej wymienionym i załączonym tytułem referencji zgłoszeniu PCT.
Wirus poddany amplifikacji według sposobu niniejszego wynalazku może być wirusem dzikiego typu, wirusem atenuowanym lub wirusem rekombinowanym.
Termin „wirus rekombinowany” odnosi się do jakiegokolwiek wirusa posiadającego wstawiony do genomu wirusa heterologiczny gen, który nie stanowi naturalnej części genomu wirusa. Gen heterologiczny może być genem terapeutycznym, genem kodującym peptyd zawierający przynajmniej jeden epitop do indukowania odpowiedzi immunologicznej, antysensowną kasetę ekspresyjną lub gen rybozymu. Specjalistom w dziedzinie znane są sposoby otrzymywania rekombinowanych wirusów. Najkorzystniejszym wektorem wirusowym jest MVA, w szczególności MVA 575 i MVA-BN (patrz wyżej).
„Wirus atenuowany” jest wirusem pochodzącym z wirusa patogennego, lecz który podczas infekcji organizmu gospodarza prowadzi do niższej śmiertelności i/lub stanów chorobowych w porównaniu z nieatenuowanym wirusem rodzicielskim. Przykłady atenuowanych pokswirusów znane są spePL 215 169 B1 cjalistom w dziedzinie. Przykładem atenuowanego wirusa krowianki jest szczep MVA, w szczególności szczep zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008 (patrz wyżej).
Jak wspomniano wyżej, w przypadku pokswirusów, komórkami podstawowymi mogą być korzystnie podstawowe komórki ptaków, takie jak komórki CEF lub podstawowe fibroblasty embrionów kurcząt. Również w tym wypadku, specjalista w dziedzinie dysponuje wiedzą na temat doboru komórek podstawowych odpowiednich do amplifikacji określonych wirusów. Komórki CEF są szczególnie korzystne do amplifikacji MVA. Do amplifikacji MVA w komórkach CEF, korzystna realizacja obejmuje dodanie jednego lub dwóch z czynników wybranych z EGF i fibronektyny.
W przypadku, gdy sposób według niniejszego wynalazku zastosowany jest do amplifikacji MVA w komórkach CEF, korzystnie, wyjściowe pH podłoża mieści się w zakresie od około 7.0 do około 8.5. Szczególnie korzystne jest wyjściowe pH 7.0.
Wynalazek dotyczy także wirusów, w szczególności pokswirusów otrzymanych w wyniku zastosowania opisanego powyżej sposobu. Zgodnie z korzystną realizacją, pokswirusem jest wirus krowianki, korzystniej szczepem MVA, takim jak MVA-BN.
Wynalazek związany jest ponadto z kompozycją zawierającą wirus, w szczególności pokswirus otrzymany metodą według wynalazku. Jak wspomniano powyżej, pokswirusem jest korzystnie wirus krowianki, korzystniej szczep MVA, taki jak MVA-BN. Ze względu na sposób amplifikacji wirusa, kompozycja jest wolna od jakichkolwiek produktów i/lub czynników infekcyjnych zawartych w surowicy zwierząt. W przypadku kompozycji zawierających wirusy produkowane konwencjonalnymi metodami, zawierają one resztkowe składniki pochodzące z surowicy zwierząt. Ma to miejsce szczególnie w przypadku kompozycji zawierających pokswirusy, takie jak szczepy wirusa krowianki, w szczególności szczepy MVA, takie jak MVA-BN.
Wynalazek dotyczy wirusa, w szczególności zdefiniowanych wyżej wirusów, jako leku lub szczepionki. Jeżeli wirus jest dzikim typem wirusa lub atenuowanym wirusem, wirus może być zastosowany w szczepieniu przeciwko wirusowi jako takiemu. W tym celu, szczególnie korzystne są wirusy atenuowane. W wypadku, gdy wirus jest wirusem rekombinowanym, ekspresjonującym białka ekspresjonowane z genów heterologicznych dla genomu wirusa, możliwe jest szczepienie przeciwko wirusowi jako takiemu i/lub przeciwko ekspresjonowanym białkom heterologicznym. Gdy rekombinowany wirus ekspresjonuje gen terapeutyczny, taki jak antysensowny RNA lub rybozym, możliwe jest zastosowanie wirusa jako leku.
Wynalazek związany jest również z zastosowaniem zdefiniowanego wyżej wirusa, lub kompozycji zdefiniowanej powyżej do produkcji szczepionki.
Wynalazek ponadto dotyczy sposobu leczenia lub szczepienia zwierząt, w tym ludzi, w razie takiej potrzeby, obejmujący podawanie zwierzętom lub ludziom wirusa według powyższej definicji lub zdefiniowanej wyżej kompozycji.
P r z y k ł a d y
Jeśli nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach podłożem bez surowicy jest podłoże 199 (Life Technologies). Dodawanym EGF jest zazwyczaj rekombinowany ludzki EGF, uzyskany z Chemicon. Fibronektynę (FN) otrzymano z Chemicon.
P r z y k ł a d 1: Otrzymywanie komórek fibroblastów embrionów kurcząt (CEF)
Zapłodnione jaja, wolne od patogenu (SPF) przechowywano nie dłużej niż 12 dni w 4°C. Jaja umieszczono w inkubatorze i inkubowano przez 10-12 dni w 37.8°C ± 8°C. Jedna płytka Petriego przypadała na maksymalnie 11 jaj, płytkę przygotowywano z 10-20 ml PBS. Jaja umieszczano w odpowiednim pudełku kartonowym i traktowano intensywnie Bacillol w celu sterylizacji zewnętrznej strony skorupki jajka. Po wysuszeniu, sporządzano otwór w jajach i usuwano ostrożnie skorupkę. Odsunięto błonę. Embriony unoszono za kończynę, a następnie odcinano im głowy. Następnie, embriony przenoszono na przygotowane płytki Petriego. Po usunięciu stóp, korpusy przemywano ponownie PBS. Maksymalnie 11 korpusów umieszczano w 20 ml plastikowej strzykawce i wyciskano do kolby Erlenmeyer'a. Dodano 5 ml ogrzewanego wcześniej (37°C) roztworu trypsyna/EDTA na korpus. Roztwór mieszano wraz z podłożem niezawierającym surowicy w temperaturze pokojowej, przy użyciu mieszadła magnetycznego przez 15 minut. Tryptynizowane komórki przelano przez warstwę sita do zlewki. Wszystkie komórki przeniesiono do jednej, 225 ml probówki do wirowania i odwirowano w 20°C, 470xg przez 7 minut w wirówce laboratoryjnej. Po odlaniu supernatantu, osad zawieszano pipetując ponownie w 1 ml świeżo ogrzanego wcześniej (37°C) podłoża do wzrostu, niezawierającego surowicy, zawierającego 10 ng/ml EGF na korpus. Świeżo ogrzane (37°C) podłoże do wzrostu, niezawierające surowicy, zawierające 10 ng/ml EGF dodano do całkowitej objętości 150 ml. Powtórzono
PL 215 169 B1 etap wirowania. Supernatant usunięto a osad zawieszono ponownie jak opisano wyżej. Świeżo ogrzane (37°C) podłoże do wzrostu niezawierające surowicy, zawierające 10 ng/ml EGF dodano do całkowitej objętości 100 ml. Komórki zliczano zgodnie z opisem w dalszej części opisu. Odpowiednią ilość komórek zaszczepiano w okrągłych butelkach wraz z podłożem do wzrostu niezawierającym surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF i inkubowano w 37°C. Komórki były gotowe na infekcję wirusową czwartego po zaszczepieniu.
P r z y k ł a d 2: Pomiar gęstości komórkowej
Próbkę zawiesiny komórkowej (patrz fragment przygotowania CEF) pobierano i mieszano z jedną objętością Tryptanu blue, otrzymując w ostatecznym zliczaniu do 100 komórek na 16 małych kwadracików hemocytometru zakupionego od Fuchs-Rosenthal, o nazwie Hemocytometer Fast Read 102 (rozcieńczenie 1:2-1:10). Próbkę pobierano natychmiast po ponownym zawieszeniu komórek w celu zapobiegnięcia ponownemu zgrupowaniu/osadzaniu komórek. Po kilku minutach inkubacji z Tryptonem blue umożliwiającej uzyskanie odpowiedniego zabarwienia martwych komórek, 10 μΐ zawiesiny komórkowej pobrano do hemocytometru. Jedynie białe, żywe komórki zliczano w świetle mikroskopu przy użyciu obiektywu 10x. W sumie, zliczano, 3 reprezentatywne duże kwadraty zawierające 3x16 małych kwadratów. Z każdego dużego kwadratu objęto liczeniem jedynie 2 boki w kształcie L. Wyciągnięto średnią zliczanych komórek i obliczono końcowe stężenie komórek stosując następujący wzór: średnia ilość komórek x rozcieńczenie x104 = komórki/ml. Ostatecznie, zawiesinę komórkową rozcieńczano do pożądanego stężenia roboczego.
P r z y k ł a d 3: Wpływ dodania czynnika wybranego spośród czynników wzrostu i fibronektyny do podłoża wzrostowego niezawierającego surowicy, na powstawanie pojedynczej warstwy CEF
We wstępnych eksperymentach twórcy wykazali, że jeżeli stosowano podłoże 199 niezawierające FCS, komórki CEF nie ulegały przyklejaniu do powierzchni naczynia do hodowli komórek. Analizowano czy, po dodaniu innych substancji dodatkowych do podłoża, możliwe jest osiągnięcie przyczepienia i wzrostu komórek CEF w podłożu 199 niezawierającym surowicy.
Badane substancje dodatkowe obejmowały rekombinowany czynnik wzrostu naskórka (r-hEGF) oraz fibronektynę (FN).
Podczas doświadczeń prowadzono hodowlę komórek CEF w podłożu 199 z różnymi dodatkami, pojedynczo lub w kombinacji. Wzrost komórek w podłożu 199 bez żadnych substancji dodatkowych służył jako kontrola negatywna. Komórki hodowane w podłożu 199 zawierającym 7% FCS służyły jako kontrola pozytywna. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na 6-studzienkowych płytkach do hodowli komórek z 3 ml podłoża. Dodatki przygotowywano zgodnie ze wskazaniami producenta przed użyciem w hodowli komórkowej. Fibronektynę pozostawiano do zaadsorbowania na powierzchni płytki 2 do hodowli komórek przez minut przed użyciem. Fibronektyna użyta była w stężeniu 3 μg/cm a EGF w stężeniu 10 ng/ml. Przed dodaniem jakichkolwiek komórek, płytki z hodowlą komórkową poddawano kontaktowi z podłożem zawierającym fibronektynę przez 25 minut.
Każde testowane podłoże wzrostowe wraz z dodatkami hodowano dwukrotnie. 6-studzienkowe płytki do hodowli komórek inkubowano przez 4 dni w 37°C. Od 1 do 4 dnia oceniano pod mikroskopem przyczepność i wzrost komórek.
W przypadku kontroli pozytywnej odnotowano normalną przyczepność i wzrost komórek CEF. Dla podłoża 199 bez dodatków niemal wcale nie zaobserwowano przyczepności i wzrostu.
Kluczowe polepszenie, w porównaniu z podłożem 199 bez dodatków, tworzenia pojedynczej warstwy osiągnięto poprzez zastosowanie EGF dodanego do podłoża 199. Stwierdzono, że komórki ulegały przyczepieniu i posiadały typową morfologię fibroblastów. Ponadto, możliwe było obserwowanie ciągłego wzrostu przez cały okres czterech dni.
Polepszenie przyczepności komórek uzyskano również poprzez dodanie fibronektyny do podłoża hodowlanego. Dodanie zarówno EGF, jak i fibronektyny dawało w wyniku nieznaczne polepszenie, w porównaniu z dodaniem tylko EGF i tylko fibronektyny.
Podsumowując, stwierdzono, że powstawanie pojedynczej warstwy komórek CEF w podłożu 199 niezawierającym surowicy może być wzmocnione poprzez zastosowanie dodatków EGF i fibronektyny.
Ponadto, w równoległej serii eksperymentów 1x107 komórek CEF zaszczepiano w podłożu zawierającym 10% FCS, podłożu niezawierającym FCS i niezawierającym FCS, lecz zawierającym EGF. Ilość komórek zliczano 2 dni po zaszczepieniu. Ilość ta wynosiła odpowiednio 42%, 6% i 44% liczby komórek użytych do zaszczepienia. Zatem, wyniki uzyskane dla komórek zaszczepionych w podłożu
PL 215 169 B1 niezawierającym surowicy, lecz z EGF, były tak dobre, jak wyniki otrzymane dla podłoża zawierającego FCS i znacznie lepsze, niż w przypadku podłoża niezawierającego ani surowicy ani EGF.
Ponadto, podłoże zawierające EGF porównano z różnymi standardowymi podłożami niezawierającymi surowicy, takimi jak DMEM, Opti-Mem lub 293-SFM. W tym celu, 1x107 komórek CEF zaszczepiano w różnych podłożach bez dodatku surowicy i hodowano przez 4 dni. Ilość komórek hodowanych w podłożu zawierającym EGF była 24, 5 i 12 razy wyższa, niż ilość komórek hodowanych odpowiednio w DMEM bez surowicy, Opti.Mem i 293-SFM.
P r z y k ł a d 4: Infekcja komórek CEF wirusem MVA
Komórki CEF infekowano cztery dni po zaszczepieniu w hodowli w okrągłych butelkach. W tym czasie komórki osiągały wzrost w postaci odpowiedniej pojedynczej warstwy. Komórki infekowano MOI 1 lub 0.1 wirusa MVA. W celu infekcji, podłoże wzrostowe usuwano z butelek. Pożądaną ilość wirusa na butelkę rozcieńczano w 20 ml odpowiedniego podłoża infekcyjnego niezawierającego surowicy. Na tym etapie podłoże niezawierające surowicy może zawierać lub nie zawierać czynnik wybrany spośród czynników wzrostu i fibronektyny. Komórki inkubowano wraz z wirusem przez 1 godzinę w 37°C, przy 0.3-0.5 obr. na min. (rpm) w inkubatorze okrągłych butelek. Po godzinie okrągłe butelki napełniano odpowiednim podłożem wzrostowym bez surowicy, do uzyskania całkowitej objętości 200 ml na okrągłą butelkę. Na tym etapie podłoże niezawierające surowicy może zawierać lub nie czynnik wybrany spośród czynników wzrostu i fibronektyny. Replikację wirusa zatrzymywano po 48 lub 72 godzinach poprzez zamrożenie butelek w -20°C.
P r z y k ł a d 5: Otrzymywanie ekstraktów wirusowych z zainfekowanych komórek CEF i miareczkowanie MVA
Zamrożone okrągłe butelki rozmrażano w temperaturze pokojowej. Podczas procesu rozmrażania komórki oddzielały się od powierzchni okrągłych komórek i mogły być mechanicznie usunięte poprzez wstrząśnięcie butelkami. Zawiesina wirus/komórki była gromadzona i rozdzielana na równe, mniejsze objętości. W celu uwolnienia wirusa z zainfekowanych komórek, zawiesiny wirus/komórki były 3 razy zamrażane/rozmrażane. Próby zamrożonego/rozmrożonego wirusa poddano miareczkowaniu.
Miareczkowanie wykonano wobec 1-go pasażu komórek CEF na 96 studzienkowej płytce, stosując 10 krotne rozcieńczenia zawiesiny wirusa i 8 powtórzeń rozcieńczenia. Po infekcji, zainfekowane komórki uwidaczniano stosując przeciwciało przeciwko wirusowi krowianki i odpowiedni roztwór barwiący.
Szczegółowo, w dniu 0 analizy podstawowe komórki CEF (patrz rozdział „otrzymywanie komórek fibroblastów embrionów kurcząt (CEF)”) poddawano trypsynizacji i zliczano zgodnie z opisem 5 w części „zliczanie gęstości komórkowej”. Komórki rozcieńczano do 1x105 komórek/ml w podłożu
RPMI z 7% FCS. Po uzyskaniu rozcieńczenia, dodawano przy użyciu wielokanałowej pipety, 100 μΙ do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki. Komórki inkubowano przez noc w 37°C i 5% CO2. Próby wirusa do miareczkowania (patrz, rozdział „otrzymywanie ekstraktów wirusowych z zainfekowanych -1 -12 komórek CEF”) rozcieńczano seryjnie w 10 etapach od 10-1 - 10-12, stosując RPMI bez surowicy. Seryjne rozcieńczenie uzyskano poprzez dodanie 900 μΐ RPMI do wszystkich studzienek na 96-studzienkowej płytce. 100 μΐ próby wirusa dodano do wszystkich studzienek w pierwszym rzędzie i wymieszano. Następnie, stosując pipetę wielokanałową, 100 μΐ każdej próby przenoszono do następnego rzędu studzienek. 96-studzienkowe płytki przechowywano na lodzie podczas dokonywania rozcieńczeń. Płytki inkubowano przez 5 dni w 37°C i 5% CO2 co pozwoliło na zajście infekcji. Po 5 dniach, komórki barwiono immunohistochemicznie przy użyciu swoistego wobec wirusa krowianki przeciwciała. W celu barwienia, podłoże hodowlane usuwano poprzez odwrócenie pojemnika 96-studzienkowej płytki do góry dnem. Komórki utrwalano 100 μΙ/studzienkę mieszaniną metanol/aceton (1:1) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór utrwalający usunięto i suszono powietrzem płytki. Po wysuszeniu, komórki przemywano jednokrotnie PBS i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej z przeciwciałem specyficznym wobec wirusa krowianki (frakcja IgG, poliklonalne królicze, przeciwciało wobec wirusa Vaccinia (Quartett, Berlin, Niemcy #9503-2057) rozcieńczone do 1:1000 w PBS z 3% FCS. Po usunięciu przeciwciała, komórki dwukrotnie przemywano PBS i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej wraz ze sprzężonym z HRP (sprzężonym z peroksydazą chrzanową) przeciwciałem swoistym wobec króliczego (przeciwciało przeciwkrólicze IgG, sprzężone z HRP poliklonalne, kozie (Promega, Mannheim, Niemcy # W4011) rozcieńczonym do 1:1000 w PBS z 3% FCS. Ponownie, komórki przemywano PBS i barwiono o-Dianizydyną lub TMB. W celu zastosowania metody barwienia o-Dianizydyną, komórki inkubowano wraz z 100 μΙ/studzienkę
PL 215 169 B1 roztworu barwiącego zawierającego 5 mg o-Dianizydyny i 180 μΐ 30% H2O2 na 60 ml 50 mM buforu fosforano-cytrynowego. Komórki inkubowano w temperaturze pokojowej aż do uzyskania zabarwienia brązowego. Zainfekowane komórki były wyraźnie widoczne po 1-3 godzinach. Stosując metodę barwienia TMB, komórki inkubowano wraz z 30 μΐ/studzienkę 1.2 mM TMB (Seramun Diagnostica GmbH). Po 15 minutach inkubacji, usuwano roztwór TMB i przemywano jednokrotnie PBS. Zainfekowane komórki stały się ciemnoniebieskie. Zliczano zainfekowane komórki widoczne na płytkach. Miano wirusa obliczano stosując wzór Spearman'a i Kaerber'a. W celu obliczenia TCID50, każdą studzienkę wykazującą brązowe lub niebieskie zabarwione komórki zaznaczano jako pozytywną. Ze względu na to, że parametry analizy pozostawały stałe, zastosowano następujący wzór w uproszczonej postaci:
Miano wirusa [TCID50/ml] = 10 [a+1,5+xa/8+xb/8+xc/8] a = czynnik rozcieńczenia ostatniej kolumny, w której wszystkich osiem studzienek jest pozytywnych xa = ilość pozytywnych studzienek w kolumnie a+1 xb = ilość pozytywnych studzienek w kolumnie a+2 xc = ilość pozytywnych studzienek w kolumnie a+3
P r z y k ł a d 6: Optymalna gęstość roztworu wyjściowego komórek CEF w podłożu bez surowicy i optymalna ilość MVA do infekcji komórek CEF
Określano optymalną gęstość roztworu wyjściowego komórek 7.5x107 kom./850 cm2 (powierzchnia jednej okrągłej kolby) dla podłoża bez surowicy do wzrostu CEF. Komórki wykazywały zdolność tworzenia odpowiedniej monowarstwy, bez formowania dużych skupisk, w czwartym dniu po zaszczepieniu i w tym momencie mogły zostać zainfekowane.
Eksperymenty przeprowadzono w celu określenia najlepszego poziomu zaszczepienia wirusem i długości infekcji pod kątem maksymalnej produkcji MVA przez komórki CEF hodowane w procesie 2 bez surowicy. Komórki CEF zaszczepiano przy gęstości 7.5x10 kom./850 cm2 w podłożu według wynalazku. W 4 dniu po zaszczepieniu, komórki infekowano różnymi ilościami MVA w zakresie od 0.05 do 1.0 TCID50/kom. MVA. Najlepsze wyniki osiągnięto dla 0.1 TCID50/kom. MVA.
P r z y k ł a d 7: Optymalne pH podłoża bez surowicy do hodowli i infekcji MVA
MVA i inne infekcje pokswirusami są wrażliwe na pH poniżej 7.0. Pokswirusy nie są stabilne w kwaśnym pH i w celu zapewnienia stabilności i integralności wirusa podczas przechowywania w postaci ciekłego preparatu wirusowego, zalecane jest by oczyszczone pokswirusy przechowywane były w buforowanym roztworze o pH powyżej 7.0. Eksperymenty przeprowadzono w celu określenia wpływu pH na wydajność wirusa podczas infekcji przebiegających w różnych wyjściowych pH. Okrągłe kolby zaszczepiano komórkami CEF w zwykły sposób, w podłożu bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-Glutaminy i hodowano przez 4 dni. Komórki infekowano MVA o 0.1 TCID50/kom. w podłożu bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-Glutaminy oraz 1 mM Asparaginy w różnych pH, w zakresie od 6.5 do 9.0. Po 72 godz. po infekcji, mierzono pH podłoża i określano wydajność wirusa poprzez zwyczajowe miareczkowanie ekstraktów komórkowych. Wyniki zaprezentowano w poniższej tabeli, obrazując wpływ wyjściowego pH podłoża na początku infekcji na wydajność wirusa.
Podłoże bez surowicy, zawierające 10 ng/ml EGF
pH wyjściowe pH po 72 godz. po infekcji Miano [TCID50/ml]
6.5 7.05 0.56 x 107
7.0 7.34 10.0 x 107
7.5 7.53 5.60 x 107
8.0 7.68 8.60 x 107
8.5 7.75 7.80 x 107
9.0 8.03 0.65 x 107
W przypadku infekcji przebiegających w podłożu bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF, uzupełnionym L-Glutaminą oraz Asparaginą, dla pH wyjściowego od 7.0 do 8.5, produkcja wirusa utrzymywała się na względnie stałym poziomie, jednak dla wyjściowego pH 6.5 i 9.0 produkcja wirusa była niska. Najlepszą wydajność uzyskano dla wyjściowego pH 7.0. Dostępne na rynku standardowe
PL 215 169 B1 podłoże bez surowicy zazwyczaj posiada pH 7.4. Zatem, doprowadzenie pH podłoża bez surowicy do 7.0 może wpłynąć na zwiększenie wydajności wirusa.
P r z y k ł a d 8: Wpływ dodania asparaginy do podłoża bez surowicy
Wstępne eksperymenty wykazały, że ilość asparaginy może być czynnikiem ograniczającym podczas hodowli komórek CEF i infekcji komórek CEF wirusem MVA. W celu uniknięcia wyczerpania asparaginy w podłożu bez surowicy, podczas hodowli i procesu infekcji, przed infekcją komórek CEF dodano dodatkową ilość asparaginy do podłoża. W celu określenia optymalnej ilości asparaginy do72 danej do podłoża, okrągłe kolby zaszczepiano komórkami CEF (7.5x107 kom./850 cm2) w podłożu bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-glutaminy. Cztery dni po zaszczepieniu, komórki infekowano MVA przy 0.1 TCID50/kom. w podłożu bez surowicy, zawierającym 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-glutaminy uzupełnionej różnymi stężeniami asparaginy (0.5, 1.0 i 1.5 mM). Replikację wirusa zatrzymywano po 72 godz. po infekcji i określano miano wirusa. Wyniki zamieszczono w poniższej tabeli, przedstawiając produkcję MVA z komórek CEF, w podłożu uzupełnionym na etapie infekcji różną ilością asparaginy. Miana określają średnią z 3 okrągłych kolb z danym dodatkiem asparaginy.
Dodatek asparaginy Miano wirusowe po 72 godz. infekcji [TCID50/ml]
0.0 mM 1.8 x 108
0.5 mM 1.3 x 108
1.0 mM 6.8 x 108
1.5 mM 1.0 x 108
Wyniki wskazują, że uzupełnienie asparaginą podłoża bez surowicy, zawierającego 10 ng/ml podłoża EGF, może polepszyć produkcję wirusa, i że uzupełnienie ilości asparaginy do 1 mM okazało się optymalne dla procesu infekcji.

Claims (22)

1. Sposób amplifikacji wirusa, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
- hodowlę podstawowych komórek ptasich w pozbawionym surowicy podłożu zawierającym czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki wzrostu i czynniki przyłączania,
- infekcję podstawowych komórek ptaków pokswirusem,
- hodowlę zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu, aż do uzyskania potomstwa wirusa, przy czym podstawowe komórki ptaków są komórkami pozwalającymi na produktywną replikację pokswirusa.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podstawowymi komórkami ptaków są fibroblasty embrionów kurcząt (CEF).
3. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 2, znamienny tym, że czynnikiem wzrostu jest czynnik wzrostu naskórka (EGF), w szczególności rekombinowany-ludzki EGF.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stężenie EGF mieści się w zakresie od 5 do 20 ng/ml podłoża.
5. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że czynnikiem przyłączania jest fibronektyna.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stężenie fibronektyny mieści się w zakresie 2 od 1 do 10 μg/cm powierzchni naczynia hodowli komórkowej.
7. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 2, znamienny tym, że podłoże zawiera dwa lub więcej czynników wybranych z czynników wzrostu i czynników przyłączania.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że podłoże zawiera EGF i fibronektynę w zakresie stężeń zdefiniowanym w zastrz. 4 i 6.
9. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że podłoże zawiera ponadto jedną lub więcej substancję dodatkową, wybraną spośród ekstraktu mikrobiologicznego, ekstraktu roślinnego i ekstraktu z innych niż ssaki zwierząt.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ekstrakt mikrobiologiczny jest ekstraktem drożdżowym lub ultrafiltratem drożdżowym.
PL 215 169 B1
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ekstraktem roślinnym jest ekstrakt ryżowy lub ekstrakt sojowy.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ekstrakt z różnego od ssaka zwierzęcia jest ekstraktem rybnym.
13. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 12, znamienny tym, że pokswirusem jest ortopokswirus.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że ortopokswirusem jest wirus krowianki.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wirusem krowianki jest zmodyfikowany wirus krowianki Ankara.
16. Sposób według jednego z zastrz. od 13 do 15, znamienny tym, że pokswirusem jest wirus atenuowany lub wirus rekombinowany.
17. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 16, znamienny tym, że podłoże niezawierające surowicy w jednym lub obu etapach
- infekcji komórek podstawowych wirusem i
- hodowli zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu aż do uzyskania potomstwa wirusa nie obejmuje czynników wybranych spośród czynników wzrostu i czynników przyłączania.
18. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 17, znamienny tym, że po etapie hodowli zainfekowanych komórek w niezawierającym surowicy podłożu, aż do uzyskania potomstwa wirusa, następuje jeden lub więcej etapów oczyszczania.
19. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera pokswirusa, uzyskanego sposobem według jednego z zastrz. od 1 do 18.
20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jest wolna od jakichkolwiek produktów i/lub czynników zakaźnych zawartych w surowicach zwierzęcych.
21. Kompozycja według jednego z zastrz. od 20 do 21, znamienna tym, że jest lekiem lub szczepionką.
22. Zastosowanie kompozycji według jednego z zastrz. od 19 do 21 do otrzymywania szczepionki.
PL373992A 2002-09-05 2003-09-01 Sposób amplifikacji wirusów, kompozycja zawierajaca pokswirusa uzyskanego tym sposobem oraz jego zastosowanie do otrzymywania szczepionki PL215169B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200201302 2002-09-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373992A1 PL373992A1 (pl) 2005-09-19
PL215169B1 true PL215169B1 (pl) 2013-10-31

Family

ID=31970216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373992A PL215169B1 (pl) 2002-09-05 2003-09-01 Sposób amplifikacji wirusów, kompozycja zawierajaca pokswirusa uzyskanego tym sposobem oraz jego zastosowanie do otrzymywania szczepionki

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7695939B2 (pl)
EP (1) EP1434858B2 (pl)
JP (2) JP2005537793A (pl)
KR (1) KR101044538B1 (pl)
CN (1) CN1692156B (pl)
AT (1) ATE393212T2 (pl)
AU (1) AU2003264144C1 (pl)
BR (1) BRPI0313559B8 (pl)
CA (1) CA2494379C (pl)
CY (1) CY1114598T1 (pl)
DE (1) DE60320520T3 (pl)
DK (1) DK1434858T4 (pl)
EA (1) EA009008B1 (pl)
ES (1) ES2305514T5 (pl)
HK (1) HK1080507B (pl)
MX (1) MXPA04012966A (pl)
NO (1) NO343489B1 (pl)
NZ (1) NZ538575A (pl)
PL (1) PL215169B1 (pl)
PT (1) PT1434858E (pl)
SI (1) SI1434858T2 (pl)
UA (1) UA85543C2 (pl)
WO (1) WO2004022729A1 (pl)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
KR101044538B1 (ko) * 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
BRPI0608310A2 (pt) 2005-02-23 2009-12-08 Bavarian Nordic As uso de um poxvìrus modificado para a indução rápida de imunidade contra um poxvìrus ou outros agentes infecciosos
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
DK2029756T3 (en) * 2006-06-20 2017-02-13 Transgene Sa PROCEDURE FOR PREPARING POXVIRA AND POXVIRUS COMPOSITIONS
EP2456461A1 (en) * 2009-07-21 2012-05-30 Transgene SA Enzymatic composition for the digestion of chicken embryos
WO2011103137A1 (en) * 2010-02-17 2011-08-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cell-based methods and reagents
CN102985536B (zh) 2010-04-14 2017-12-05 Emd密理博公司 生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法
US10087423B2 (en) * 2010-07-20 2018-10-02 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
KR101504159B1 (ko) * 2012-04-20 2015-03-19 한국생명공학연구원 미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도
CA2952241A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Medimmune, Llc Cell culture methods and media comprising n-acetylcysteine
KR101677231B1 (ko) 2014-12-18 2016-11-30 제주대학교 산학협력단 무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법
CN105462911B (zh) * 2015-12-22 2018-04-13 肇庆大华农生物药品有限公司 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法
CN107129963A (zh) * 2017-04-24 2017-09-05 浙江美保龙生物技术有限公司 一种df‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
US11306292B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
KR20210042135A (ko) * 2018-08-08 2021-04-16 아리조나 보드 오브 리젠츠 온 비하프 오브 아리조나 스테이트 유니버시티 개선된 폭스바이러스 수율을 위한 방법
AU2019336940A1 (en) 2018-09-06 2021-03-11 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
WO2021180943A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Bavarian Nordic A/S Compositions improving poxvirus stability
CN113355297A (zh) * 2021-06-23 2021-09-07 吉林冠界生物技术有限公司 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
CN116656628A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种痘病毒载体疫苗的制备方法

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2004402A (en) * 1934-04-07 1935-06-11 Conklin John Edward Atomizer
US3887430A (en) * 1972-02-24 1975-06-03 Dow Chemical Co Culture medium for tissue culture techniques
US4072565A (en) 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
US3914408A (en) * 1973-10-12 1975-10-21 Univ Nebraska Vaccine for neonatal calf diarrhea
DE2714665A1 (de) * 1977-04-01 1978-10-05 Mayr Anton Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5155020A (en) * 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
AU613583B2 (en) * 1986-08-22 1991-08-08 Transgene S.A. Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6248333B1 (en) 1990-04-04 2001-06-19 Health Research Inc. Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD)
AT393277B (de) * 1990-01-04 1991-09-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen
EP0550638A4 (en) * 1990-09-25 1993-12-08 Smithkline Beecham Corporation Medium for culture of mammalian cells
US5843456A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
EP0575491B1 (en) * 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US5766598A (en) 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
IL102929A (en) 1992-08-24 1996-11-14 Interpharm Lab Ltd Serum-free medium for mammalian cells
US5403582A (en) * 1993-01-21 1995-04-04 Nippon Zeon Co., Ltd. Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus
US5405772A (en) 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5768598A (en) 1993-09-13 1998-06-16 Intel Corporation Method and apparatus for sharing hardward resources in a computer system
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US6190655B1 (en) * 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
WO1995030018A2 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
US5756341A (en) * 1994-11-10 1998-05-26 Immuno Ag Method for controlling the infectivity of viruses
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
JP3158157B2 (ja) 1994-11-10 2001-04-23 バクスター・アクチエンゲゼルシャフト 無蛋白培養における生物製剤の製造法
US5753489A (en) * 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
US5503582A (en) 1994-11-18 1996-04-02 Micron Display Technology, Inc. Method for forming spacers for display devices employing reduced pressures
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
JPH09154571A (ja) * 1995-12-05 1997-06-17 Kurabo Ind Ltd ウイルス製造用無血清培地
JP2000517290A (ja) 1996-02-21 2000-12-26 リスジーウィックス，ジュリアナ 保護的及び治療的な遺伝子免疫化のための方法及び組成物
WO1998004680A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 University Of Manitoba Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells
AU4556597A (en) 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
DE69738806D1 (de) 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
WO1998017283A1 (en) 1996-10-25 1998-04-30 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Method of vaccinating infants against infections
US6204250B1 (en) * 1996-11-22 2001-03-20 The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York Immunization of infants
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB0023203D0 (en) 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
WO1999007869A1 (en) 1997-08-05 1999-02-18 University Of Florida Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating virus
JP2002524047A (ja) * 1998-08-04 2002-08-06 イミュネックス・コーポレーション Ｉカッパｂキナーゼに関連するｉｋｒ−１及びｉｋｒ−２タンパク質キナーゼ
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
EP1137769B1 (en) 1998-11-10 2008-09-03 University Of Rochester Methods for the generation of dna libraries
KR20010084935A (ko) 1998-11-18 2001-09-07 찰스 굿맨 폴리펩티드
GB2370572B (en) 1998-11-18 2003-05-07 Oxford Biomedica Ltd Use of a professional antigen presenting cell
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
DE19935351A1 (de) 1999-07-29 2001-02-01 Abb Daimler Benz Transp Verfahren zur Energieoptimierung bei einem Fahrzeug/Zug mit arbeitspunktabhängigem Wirkungsgrad
WO2001068820A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Anton Mayr Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)
KR20030036194A (ko) 2000-05-24 2003-05-09 메리알 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ) 재조합아비폭스바이러스 백신
AU2001270631B2 (en) * 2000-07-11 2005-07-07 Bayer Aktiengesellschaft Use of strains of the parapox ovis virus for producing antiviral pharmaceuticals and anticancer pharmaceuticals
KR20030061810A (ko) * 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7097842B2 (en) * 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
UA82466C2 (uk) * 2001-07-18 2008-04-25 Бавариан Нордика А/С Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу
CA2466413C (en) * 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
NZ533302A (en) 2001-12-10 2005-11-25 Bavarian Nordic As Poxvirus containing formulations and process for preparing stable, poxvirus containing compositions containing a disaaccharide and a pharmaceutically acceptable polymer i.e. dextran or polyvinylpyrrolidon (PVP)
US6951752B2 (en) 2001-12-10 2005-10-04 Bexter Healthcare S.A. Method for large scale production of virus antigen
NZ533586A (en) * 2001-12-20 2005-02-25 Bavarian Nordic As Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells using high pressure homogenisation
FR2836924B1 (fr) * 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
AU2003219057A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine
EA007811B1 (ru) * 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA009525B1 (ru) * 2002-05-16 2008-02-28 Бавариан Нордик А/С Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора
KR101044538B1 (ko) * 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
PL1646715T3 (pl) * 2003-07-22 2010-10-29 Valneva Wytwarzanie pokswirusów za pomocą linii adherentnych lub nieadherentnych komórek ptasich
US6915752B2 (en) * 2003-09-30 2005-07-12 Lockheed Martin Corporation Utility service protection strip
US6976752B2 (en) * 2003-10-28 2005-12-20 Lexmark International, Inc. Ink jet printer with resistance compensation circuit

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004022729A8 (en) 2005-03-17
US7964397B2 (en) 2011-06-21
PL373992A1 (pl) 2005-09-19
US20050214324A1 (en) 2005-09-29
DE60320520T3 (de) 2019-05-09
BRPI0313559B8 (pt) 2021-05-25
WO2004022729A1 (en) 2004-03-18
EA009008B1 (ru) 2007-10-26
MXPA04012966A (es) 2005-05-16
KR20050037551A (ko) 2005-04-22
EP1434858B2 (en) 2018-12-19
NZ538575A (en) 2007-03-30
SI1434858T2 (sl) 2019-05-31
EA200500448A1 (ru) 2005-08-25
UA85543C2 (ru) 2009-02-10
AU2003264144A1 (en) 2004-03-29
DK1434858T4 (en) 2019-04-01
NO343489B1 (no) 2019-03-25
JP5612338B2 (ja) 2014-10-22
AU2003264144A2 (en) 2004-03-29
US20110217749A1 (en) 2011-09-08
US8673318B2 (en) 2014-03-18
CA2494379C (en) 2012-11-06
BRPI0313559B1 (pt) 2019-02-26
HK1080507B (zh) 2011-10-07
ES2305514T3 (es) 2008-11-01
JP2010148522A (ja) 2010-07-08
CA2494379A1 (en) 2004-03-18
US8329466B2 (en) 2012-12-11
EP1434858B1 (en) 2008-04-23
CN1692156A (zh) 2005-11-02
DE60320520T2 (de) 2008-12-11
HK1080507A1 (en) 2006-04-28
BR0313559A (pt) 2005-07-12
AU2003264144C1 (en) 2009-12-17
US20130089913A1 (en) 2013-04-11
AU2003264144B2 (en) 2009-05-14
PT1434858E (pt) 2008-07-28
CN1692156B (zh) 2011-05-11
SI1434858T1 (sl) 2008-10-31
JP2005537793A (ja) 2005-12-15
DE60320520D1 (de) 2008-06-05
ES2305514T5 (es) 2019-06-14
NO20051175L (no) 2005-03-04
DK1434858T3 (da) 2008-08-11
ATE393212T2 (de) 2008-05-15
CY1114598T1 (el) 2016-10-05
KR101044538B1 (ko) 2011-06-27
US7695939B2 (en) 2010-04-13
US20090029459A1 (en) 2009-01-29
EP1434858A1 (en) 2004-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5612338B2 (ja) 無血清条件下で初代細胞を培養する方法及びウイルスを増幅させる方法
US9382513B2 (en) Method of making an avian cell line
US7432101B2 (en) Production of poxviruses with adherent or non adherent avian cell lines