NO343489B1 - Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus under serumfrie betingelser. - Google Patents

Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus under serumfrie betingelser. Download PDF

Info

Publication number
NO343489B1
NO343489B1 NO20051175A NO20051175A NO343489B1 NO 343489 B1 NO343489 B1 NO 343489B1 NO 20051175 A NO20051175 A NO 20051175A NO 20051175 A NO20051175 A NO 20051175A NO 343489 B1 NO343489 B1 NO 343489B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
serum
virus
medium
procedure
Prior art date
Application number
NO20051175A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20051175L (no
Inventor
Karl Heller
Ingmar Räthe
Eva Felder
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31970216&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO343489(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of NO20051175L publication Critical patent/NO20051175L/no
Publication of NO343489B1 publication Critical patent/NO343489B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for amplifikasjon av en poxvira hvori de primære fugleceller som tillater produktiv replikasjon av poxvirus blir dyrket i et serumfritt medium som omfatter en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer. Cellene blir deretter infisert med vira og de infiserte celler blir dyrket i serumfritt medium inntil forløpervirus er produsert.
De fleste virale vaksiner så som svekkede eller rekombinante vira blir fremstilt fra cellekultursystemer. Cellene brukt for virus/vaksineproduksjon kan være cellelinjer, dvs. celler som vokser kontinuerlig in vitro, enten som enkeltcellesuspensjonskultur i bioreaktorer eller som et monolag på en celleunderstøttende overflate i vevskulturflasker eller rulleflasker. Noen eksempler på cellelinjer brukt til fremstilling av vira er: den humane føtale lungecellelinje MRC-5 brukt til fremstilling av poliovira og den humane føtale lungecellelinje WI-38 brukt til fremstilling av meslingvirus, kusmavirus og røde hunder virus (MMR II) (Merk Sharp & Dohme).
Ikke bare cellelinjer men også primære dyreceller blir brukt til fremstilling av vaksiner. Et eksempel på primære celler som blir brukt til virusproduksjon er hønseembryofibroblaster (CEF-celler). Disse cellene blir brukt til fremstilling av mesling- og japansk encefalittvirus (Pasteur Merieux), kusmavirus (fremstilt av provaksine), rabiesvirus (fremstilt av Chiron Behring GmbH & Co.), gulfebervirus (fremstilt av Aprilvax), influensavirus (fremstilt av Wyeth Labs and SmithKline & Beecham) og modifisert vacciniavirus Ankara (MVA).
CEF-celler blir ofte brukt siden mange virusvaksiner blir fremstilt ved svekking av den virulente sykdomsforårsakende virus ved seriepassasje i CEF-celler. Det svekkede virus forårsaker ikke lenger sykdommen men er fremdeles i stand til å stimulere en kraftig beskyttende immunitet mot den virulente formen av virus. Et eksempel på denne type virus er MVA. Denne virus er meget replikasjonsbegrenset hos mennesker og i de fleste dyr. MVA er utviklet som en vaksinevektor fordi den kan benyttes til å uttrykke antigener avledet fra et utvalg av midler som forårsaker sykdommer hos mennesker. Svekkede vira, så som MVA blir fortrinnsvis ikke formert på humane celler siden det er en bekymring for at virus igjen kan bli replikasjonkompetent i celler av human opprinnelse. Vira som imidlertid har gjenvunnet evnen til å repliseres i humane celler kunne være en helserisiko hvis den blir administrert til mennesker, særlig hvis individene er immunkompromitterte. Av denne grunn er noen svekkede vira, så som MVA strengt fremstilt fra CEF-celler, hvis de er ment for human anvendelse.
Videre blir CEF-celler brukt for de vira som bare vokser på nevnte celler.
Eksempler på slike vira er særlig fuglevira så som Avipoxvira, særlig kanaripoxvira, ALVAC, fjærfepoxvirus og NYVAC.
Cellelinjer og primære celler dyrket under in vitro dyrkingsbetingelser krever et spesielt vekst- og opprettholdelsesmedium som kan understøtte (I) cellereplikasjon i den logaritmiske fase og (II) celleopprettholdelse når cellene ikke lenger deler seg, dvs. når cellene er i den stasjonære fase. Det vanlig brukte celledyrkingsmediet omfatter en rik saltoppløsning som inneholder vitaminer, aminosyrer, essensielle sporelementer og sukker. Veksthormoner, enzymer og biologisk aktive proteiner nødvendig for å understøtte cellevekst og opprettholdelse blir vanligvis tilsatt som et supplement til mediet i form av et dyreblodavledet serumprodukt. Eksempler på dyreblodavledede serumprodukter er føtalt kalveserum, kyllingserum, hesteserum og svineserum. Disse sera er avledet fra fraksjonert blod, fra hvilke de røde og hvite blodceller er blitt fjernet. Primære celler så som CEF-celler er enda mer avhengig av dyreserumkilder enn andre cellelinjer. Således blir primære celler vanligvis dyrket i cellekulturmedia som inneholder 5-10 % serum, i de fleste tilfeller føtalt kalveserum (FCS).
Dyresera omfatter ikke bare faktorer som er nødvendig for vekst av celler men også faktorer som er nødvendig for celler som naturlig vokser i tilslutning til celler for å festes til celleunderstøttelsesoverflaten av dyrkingskaret. Således er det kritisk for tilstøtende celler at nok serum er tilsatt mediet for å gjøre det mulig at de vokser og danner et monolag.
Uheldigvis kan bovint/føtalt kalveserum så vel som sera fra andre dyr inneholde ytterligere patogene midler så som vira. Det er en potensiell risk at disse patogene midler blir overført til dyret/mennesket som skal behandles eller vaksineres med vaksinen eller ethvert annet farmasøytisk produkt produsert i cellekulturen. Dette er av spesiell relevanse hvis cellekulturproduktene blir administrert til immunkompromitterte mennesker. En av de mange potensielle viktige problemer assosiert med det vanlig brukte bovint serum supplement er muligheten til å overføre midlet som forårsaker bovint spongioform encefalopati (BSE) til dyrene/menneskene som kommer i kontakt med produktene produsert fra cellekulturen.
I lys av den mulige risiko assosiert med anvendelse av dyresera i cellekulturer er det blitt klart at fremstillingsprosesser som er fri for anvendelse av dyreprodukter er meget ønskelig.
Så langt har spesifikke media som ikke må supplementeres med dyresera blitt utviklet for kontinuerlig voksende cellelinjer og for fremstilling av vira i kontinuerlige voksende cellelinjer. Et eksempel på et slikt serumfritt medium som kan anvendes til å dyrke cellelinjer er VP-SFM fremstilt av Gibco BRL/Life Technologies. I henhold til informasjon fra produsentene er VP-SFM konstruert spesifikt for vekst av VERO, COS-7, MDBK, Hep2, BHK-21 og andre viktige cellelinjer (Price, P. og Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69) og for virusproduksjon i nevnte cellelinjer. Ingen informasjon er tilgjengelig med hensyn på dyrking av primære celler i nevnte medium.
US 5 503 582 beskriver dyrking av CEF-celler i medium som omfatter 4 % kalveserum etterfulgt av infeksjon av cellene med fjærfepoxvirus i serumfritt medium. Spataro, A.C. et al., J. Cell. Sci. 1976; 21, 407-413 beskriver at CEF-celler kan opprettholdes i serumfritt medium i 24 timer så fort et monolag er blitt dannet. Således i henhold til begge publikasjoner omfatter media som blir brukt for dyrking av cellene etter utsåing serum. Bare for opprettholdelse av celler som allerede er festet til overflaten og som har nådd den stasjonære fase ble serumfritt medium brukt. Hvis utsåing er gjort med konvensjonelt medium, så som medium 199 eller RPMI-1640 som mangler serum dannes inntil monolag og cellene danner ikkelevelige aggregater i media.
WO 98/15614 betegner et spesifikt serumfritt medium for in vitro dyrking av dyreceller. Cellene kan dyrkes i mediet som beskrevet i WO 98/15614 er de av dyreopprinnelse, inkludert celler oppnådd fra pattedyr, fugler, insekter eller fisk. Pattedyrcellene kan være primære celler fra human opprinnelse. Ingen referanse er gitt med hensyn på primære fugleceller.
US 5 405 772 beskriver et serumfritt medium for proliferering og utvikling av celler. Cellene er fortrinnsvis hematopoetiske celler og benmargstromaceller.
Primære fugleceller er ikke nevnt.
WO 98/04680 beskriver et serumfritt medium for vekst av forankringsavhengige pattedyrceller, så som cellelinjene BHK, Vero eller MRC-5. WO 98/04680 refererer seg verken til primære celler eller til fugleceller.
NO20040158 beskriver en fremgangsmåte til å produsere poxvirus, særlig Chordopoxvirus, hvori poxvirus er dyrket ved temperatur under 37<o>C.
WO9522978 beskriver multipotente paramuniserende induktorer som er basert på kombinasjoner av poxviruskomponenter.
Det er hensikten med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte som tillater dyrking av primære fugleceller i serumfritt medium, hvori fremgangsmåten tillater (I) dyrking av cellene i den logaritmiske fase og (II) opprettholdelse av cellene i den stasjonære fase. Videre hvis cellene er tilstøtende celler kan mediet fortrinnsvis tillate (III) tilfesting av de tilstøtende cellene til overflaten av celledyrkingskaret. Det er en ytterligere side ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus ved å bruke fugleprimære celler under serumfrie betingelser.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for amplifisering av en poxvirus inneholdende dyrking av primære fugleceller som tillater den produktive replikasjon av poxviruset i et serumfritt medium som omfatter en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer. Deretter, blir de primære fuglecellene infisert med poxviruset og dyrket i serumfritt medium inntil poxvirusavkom er produsert.
Primære fugleceller som naturlig vokser som tilstøtende celler tilfestet overflaten av celledyrkingskaret etter utsåing og vekst i en logaritmisk fase inntil et monolag er dannet og de hvilende celler opprettholdes i mediet brukt under tilfesting og logaritmisk vekst av cellene.
Fremgangsmåten beskrevet heri er ikke begrenset til celler som danner monolag. I henhold til en alternativ utforming kan fremgangsmåten anvendes for alle andre typer av primære fugleceller, så som celler som naturlig vokser i suspensjonskultur (dvs. lymfocytter eller andre typer av blodceller) eller celler som naturlig vokser tilstøtende celler men som er blitt tilpasset vekst i suspensjonskultur.
Som vist nedenfor kan også de primære fuglecellene anvendes for serumfri amplifikasjon av poxvira som kan være nyttige som vaksiner.
Det var uventet at primære fugleceller som naturlig vokser som tilstøtende celler (I) effektivt kan festes til overflaten av cellekulturkaret uten å danne uakseptable mengder av aggregater og (II) kan dyrkes i den logaritmiske fase i fravær av serum siden det er generelt ment at primære fugleceller er avhengig av et flertall av forskjellige faktorer og komponenter omfattet i serum. Videre var det ment at tilstøtende celler danner ikke-levelige aggregater som ikke festes til overflaten av cellekulturkaret, når de dyrkes i serumfritt medium. Således var det uventet at det er tilstrekkelig å tilsette et serumfritt medium en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer for å oppnå tilfesting og vekst av tilstøtende primære fugleceller. Videre var det også uventet at primære fugleceller dyrket i suspensjonskultur kan dyrkes med media brukt i fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse. Videre var det overraskende at primære fugleceller, så som fjærfeembryofibroblaster (CEF) kan dyrkes slik at de festes til overflaten av et cellekulturkar uten å danne uakseptable menger av aggregater i et serumfritt medium som omfatter en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer, siden fugleceller er kjent for å vokse ekstremt dårlig i serumfritt medium som ikke omfatter vekstfaktorene eller tilfestingsfaktorer, dvs. det var uventet at de dårlige vekstegenskapene til primære fugleceller skulle forbedres signifikant ved å tilsette en faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer til serumfritt medium.
Betegnelsen ”primære celler” som brukt i foreliggende oppfinnelse er velkjent for en person med kunnskap på området. Uten å være begrenset til den følgende definisjon betegner betegnelsen ”primære celler” generelt celler som er blitt ferskt isolert fra et dyre- eller menneskevev, organ eller organisme, hvori cellene ikke er i stand til kontinuerlig og uendelig replikeres og deles. Vanligvis deler primære celler seg i cellekultur mindre enn hundre ganger, ofte mindre enn femti ganger, ofte mindre enn tjuefem ganger. Således har primære celler ikke gjennomgått en immortaliseringshendelse. Eksempler på primære celler er navlestrengblodlymfocytter og humane eller dyrefibroblaster. Foretrukne eksempler som illustrerer oppfinnelsen er fuglefibroblaster, mest fortrinnsvis fjærfeembryofibroblaster (CEF-celler).
Fremgangsmåter er velkjent for en person med kunnskap på området på hvordan primære celler kan isoleres. Generelt blir primære cellekulturer direkte avledet fra vev, organer eller embryo. Vevene, organene eller embryoene blir utsatt for proteasebehandling for å oppnå enkle celler. De primære fuglecellene blir deretter dyrket i henhold til fremgangsmåten som angitt i foreliggende oppfinnelse under in vitro dyrkingsbetingelser.
Mer spesifikt blir CEF-celler oppnådd fra proteasefordøyd fjærfeembryo. CEF-celler vokser best som tilstøtende celler festet til en fast celleunderstøttende overflate. Cellene starter replikasjon og etablerer et monolag. Hvis CEF-celler (etter embryofordøyelse) blir dyrket in vitro med et standard dyrkingsmedium uten dyreserum vil cellene av og til festes til den faste celleunderstøttelsesoverflaten, men vil ikke replikeres for å danne et konfluent monolag av celler og vil med tid langsomt løsne fra den faste dyrkingsunderstøttelsesoverflaten. I kontrast, hvis CEF-cellene er dyrket i henhold til fremgangsmåten angitt i foreliggende oppfinnelse fester cellene til den faste understøttelse, vokser i den logaritmiske fase inntil et monolag er dannet og kan opprettholdes i den stasjonære fase i flere dager.
Betegnelsen ”dyrking av celler” i et serumfritt medium i sammenheng med tilstøtende primære celler refererer seg til såing av cellene i kulturkaret i et serumfritt medium, til dyrking av cellene i et serumfritt medium i den logaritmiske fase inntil et monolag er dannet og/eller opprettholdelse av cellene i serumfritt medium så snart monolaget er dannet. Mer fortrinnsvis betegner betegnelsen ”dyrking av celler” i et serumfritt medium en fremgangsmåte hvori alle av de ovennevnte trinn blir utført med serumfritt medium, slik at intet dyreserumprodukt er tilstede under hele dyrkingsprosessen til cellene. Således mer generelt refererer betegnelsen ”dyrking av celler i et serumfritt medium” til det faktum at alle media som fører til dannelsen av et monolag er serumfrie media. Media brukt i alle ovennevnte trinn kan omfatte en faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer. Det kan imidlertid være tilstrekkelig å tilsette en slik faktor bare til media brukt for tilfesting av cellene og/eller dyrking av cellene under logaritmiske betingelser.
Betegnelsen ”dyrking av celler” i et serumfritt medium i sammenheng med celledyrking i suspensjonskulturer refererer seg til utsåing av cellene i kulturkaret i et serumfritt medium, vekst av cellene i et serumfritt medium i den logaritmiske fase og/eller opprettholdelse av cellene i serumfritt medium så snart metningstettheten ved hvilken ingen ytterligere replikasjon skjer er oppnådd. Mer fortrinnsvis refererer betegnelsen ”dyrking av celler” i et serumfritt medium seg til en fremgangsmåte hvori alle de ovennevnte trekk blir utført med serumfritt medium, slik at ingen dyreserumprodukter er tilstede under hele dyrkingen av cellene. Media brukt i alle de ovennevnte trinn kan fortrinnsvis omfatte en faktor valgt fra gruppen vekstfaktorer. Det kan imidlertid være tilstrekkelig å tilsette en slik faktor bare i media brukt for såing av cellene og/eller dyrking av cellene under logaritmiske betingelser. Som forklart nedenfor i mer detalj kan det også være mulig å dyrke cellene som normalt ville vokse som tilstøtende celler også som suspensjonskulturceller hvis egnede inkubasjonsbetingelser er valgt (f.eks. ved å anvende ”bølger” inkubasjon). Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse angår også denne type inkubasjon.
Betegnelsen ”serumfritt” medium refererer seg til ethvert cellekulturmedium som ikke inneholder sera fra dyre- eller menneskelig opprinnelse. Egnede cellekulturmedia er kjent for en person med kunnskap på området. Disse media omfatter salter, vitaminer, buffere, energikilder, aminosyrer og andre stoffer. Et eksempel på et medium som er egnet for den serumfrie dyrking av CEF-celler er medium 199 (Morgan, Morton og Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; som kan oppnås blant annet fra Life Technologies).
Media brukt i henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, særlig media brukt for tilstøtende celler så som CEF-celler inneholder en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer. Et eksempel på en tilfestingsfaktor er fibronektin.
For celler som naturlig vil vokse som tilstøtende celler, men som imidlertid ikke desto mindre er dyrket i suspensjonskultur (som er mulig f.eks. for CEF-celler), er det særlig foretrukket å bruke en faktor valgt fra gruppen vekstfaktorer. Eksempler på vekstfaktorer nyttig for denne type dyrking er rekombinant bovin, mus, høns eller human epidermal vekstfaktor (EGF). Mest foretrukket er rekombinant human EGF (rh-EGF) (Chemicon Int., katalog nr. GF001).
For celler som naturlig vokser i suspensjonskultur kan mediet fortrinnsvis omfatte en faktor valgt fra gruppen vekstfaktorer inkludert EGF. Mest fortrinnsvis er vekstfaktorene for denne type celler faktorer som er spesifikke for ikke tilstøtende celler. Eksempler på disse vekstfaktorer er interleukiner, GM-CSF, G-CSF og andre. En person med kunnskap på området kan lett bestemme ved rutineeksperimentering hvilken type faktor er egnet for hvilken type celler.
Hvis faktoren tilsatt serumfritt medium er EGF, særlig rh-RGF er det fortrinnsvis tilsatt mediet i en konsentrasjon på 1-50 ng/ml, mer fortrinnsvis 5-20ng/ml.
Personen med kunnskap på området vil imidlertid være klar over det faktum at forskjellige celletyper kan kreve en noe forskjellig konsentrasjon av EGF i serum for optimale resultater.
Hvis tilfestingsfaktoren tilsatt det serumfrie medium er fibronektin (f.eks.
Chemicon Int.; humant plasma fibronektin; katalog nr. FC010), er det fortrinnsvis tilsatt mediet i en konsentrasjon på 1-50, mer fortrinnsvis 1-10 µg/cm<2>overflate av cellekulturkaret. Personen med kunnskap på området vil imidlertid være klar over det faktum at forskjellige celletyper kan kreve noe forskjellig konsentrasjon av fibronektin i serum for optimale resultater.
I henhold til foreliggende oppfinnelse er det tilstrekkelig å tilsette bare én faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer til mediet, særlig hvis cellene er tilstøtende celler. Det er imidlertid også mulig å tilsette to eller flere faktorer valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer til mediet. Mediet kan fortrinnsvis omfatte EGF og fibronektin, fortrinnsvis i de konsentrasjonsområdene som er definert ovenfor, særlig hvis de primære celler er tilstøtende celler så som CEF-celler.
Mediet kan ytterligere omfatte én eller flere tilsetninger valgt fra mikrobielt ekstrakt, planteekstrakt og ekstrakt fra ikke-dyr. Det mikrobielle ekstrakt er fortrinnsvis gjærekstrakt eller gjærstolat ultrafiltrat. Planteekstraktet er fortrinnsvis risekstrakt eller soyaekstrakt. Ekstraktet fra ikke-pattedyr er fortrinnsvis fiskeekstrakt.
Asparagin kan tilsettes det kommersielt tilgjengelige serumfrie medium til hvilke en faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer var blitt tilsatt. Mer fortrinnsvis blir asparagin tilsatt til mediet, dvs. anvendt under infeksjon med virus (se nedenfor). Kommersielt serumfritt media omfatter vanligvis asparaginsyre i et konsentrasjonsområde på 0,3-1,0 mM. Foretrukne mengder av asparagin for å supplementere mediet er i området 0,5-1,5 mM. Mest foretrukket er et 1 mM asparaginsupplement. Den totale konsentrasjonen av asparagin i mediet er fortrinnsvis mindre enn 2 mM og mer fortrinnsvis i området fra 0,8-1,8 mM. Den mest foretrukne konsentrasjon av asparagin i mediet er 1,3 mM.
Videre kan glutamin fortrinnsvis bli tilsatt mediet. Mer fortrinnsvis blir glutamin tilsatt mediet som blir brukt under infeksjon med virus (se nedenfor). Foretrukne mengder av glutamin til å supplementere mediet er et område fra 1-5 mM, mer fortrinnsvis i et område fra 2-4 mM. De angitte områdene korresponderer også til de foretrukne totale konsentrasjonene i mediet siden de fleste kommersielt tilgjengelige media ikke inneholder glutamin.
Oppfinnelsen inneholder en fremgangsmåte til å amplifisere en poxvirus som omfatter følgende trinn: i det første trinnet blir primære fugleceller dyrket i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor, dvs. primære fugleceller blir dyrket i et serumfritt medium som omfatter en faktor valgt fra gruppen som består av vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer, avhengig av celletype. Alle betingelser, definisjoner og foretrukne utforminger og også rekkefølgen fra foretrukket til mest foretrukne utforminger gitt for beskrivelsen i henhold til fremgangsmåten for dyrking av primære fugleceller ovenfor kan anvendes for definisjonen av det første trinn av fremgangsmåten for amplifikasjon av poxvirus i henhold til foreliggende oppfinnelse. I et andre trinn blir de primære fuglecellene infisert med poxvirus. I et tredje trinn blir de infiserte cellene inkubert i serumfritt medium inntil avkommervirus blir produsert.
Betegnelsen ”amplifikasjon av en poxvirus” blir brukt til å gjøre det klart at fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis brukt for å øke mengden av virus som skyldes en produktiv virusreplikasjon av virus i de infiserte cellene. Med andre ord bør forholdet mellom virus ut til virus inn være over 1. Således i henhold til foreliggende oppfinnelse er de primære fuglecellene valgt for en spesifikk poxvirus hvori virus er i stand til å repliseres produktivt.
Betegnelsen ”produktiv replikasjon” refererer seg til det faktum at det spesifikke virus replikerer i den spesifikke primære fuglecelle i en slik grad at infeksiøs avkommervirus blir produsert, hvori forholdet mellom virus ut til virus inn er over 1.
En person med kunnskap på området vet hvilke virus som kan produktivt repliseres i hvilken type av primære celler. Generelt kan de primære celler være humane forhudfibroblaster viss virus som skal amplifisere er det humane cytomegalovirus; de primære cellene kan være CEF-celler viss virus som skal amplifiseres er meslingvirus, kusmavirus, rabiesvirus, japansk encefalittvirus, gulfebervirus, influensavirus eller ifølge oppfinnelsen en poxvirus så som vacciniavirus, særlig den modifiserte vacciniavirus Ankara (MVA).
Infisering av primære fugleceller i henhold til et andre trinn i foreliggende oppfinnelse er kjent for en person med kunnskap på området. Ved hjelp av eksempel kan virus ganske enkelt tilsettes mediet. Alternativt kan mediet fjernes og virus kan tilsettes ferskt medium, som i sin tur blir tilsatt cellene. For å oppnå en effektiv infeksjon bør mengden av virus/mediumsuspensjon være så lav som mulig for å ha en høy viruskonsentrasjon. Etter tilfesting av virus kan ytterligere medium tilsettes.
I det tredje trinn ifølge oppfinnelsen blir cellene dyrket i serumfritt medium inntil poxavkomvirus er fremstilt.
Det serumfrie mediet som blir brukt i det andre og tredje trinn i fremgangsmåten for amplifikasjon av en poxvirus kan være det samme medium som allerede er blitt brukt før, dvs. et serumfritt medium som omfatter en faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer, avhengig av celletypen. For å spare omkostninger er det imidlertid også mulig å anvende i én eller begge av det andre eller tredje trinn et serumfritt medium som ikke inneholder en faktor valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer.
Under alle trinnene kan mediet supplementeres med asparagin og/eller glutamin som angitt ovenfor, hvori den totale konsentrasjon av asparagin i mediet er fortrinnsvis som definert ovenfor.
Avkompoxvirus kan konsentreres og renses i henhold til fremgangsmåter kjent for en person med kunnskap på området.
Det var uventet at poxvira kan amplifiseres på celler dyrket under serumfrie betingelser siden cellene vokser meget dårlig med det kjente serumfrie mediet.
Således var det forventet at ytterligere stress assosiert med en poxvirusinfeksjon ville drepe de allerede stressede celler før en signifikant amplifikasjon av poxvirus skjedde.
Poxviruset er fortrinnsvis et ortopoxvirus. Eksempler på ortopoxvira er avipoxvira og vacciniavira.
Betegnelsen ”avipoxvira” refererer seg til ethvert avipoxvirus, så som Fjærkrepoxvirus, Kanaripexvirus, Unkopoxvirus, Mynahpoxvirus, Duepoxvirus, Psittacinpoxvirus, Vaktelpoxvirus, Påfuglpoxvirus, Pingvinpoxvirus, Spurvepoxvirus, Stærpoxvirus og Kalkunpoxvirus. Foretrukne avipoxvira er Kanaripoxvirus og Fjærkrepoxvirus.
Som et eksempel på en kanaripoxvirus er stamme Rentschler. Et plakk renset kanaripoxvirus betegnet ALVAC (US 5 766 598) ble deponert under betingelsene til Budapest-avtalen ved the American Type Culture Collection (ATCC), aksesjonsnummer VR-2547. En annen kanaripoxstamme er den kommersielle kanaripox-vaksinestamme, designert LF2 CEP 524 24 10 75, tilgjengelig fra Institute Merieux, Inc.
Eksempler på fjærkrepoxvirus er stammene FP-1, FP-5 og TROVAC (US
5 766 598). FP-1 er en Duvette-stamme modifisert til å anvendes som en vaksine i 1 dager gamle kyllinger. Stammen er en kommersiell fjærkrepoxvirusvaksinestamme designert O DCEP 25/CEP67/2309 oktober 1980 og er tilgjengelig fra Institute Merieux, Inc. FP-5 er en kommersiell fjærkrepoxvirusvaksinestamme fra kyllingembryoopprinnelse tilgjengelig fra American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary License Nr. 165, serienr. 30321.
Eksempel på vacciniavirusstamme er stammene “Temple of Heaven”, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda og WR. Oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført med modifisert vacciniavirus Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40). En typisk MVA-stamme er MVA 575 som er blitt deponert ved the European Collection of Animal Cell Cultures under deponeringsnummeret ECACC V00120707. Mest foretrukket er MVA-BN eller et derivat derav, som er blitt beskrevet i PCT-søknad PCT/EP01/13628 innlevert ved det europeiske patentkontoret 22. november 2001 med tittelen ”modifisert vaccinia Ankara virusvariant”. MVA-BN er blitt deponert ved the European Collection of Animal Cell Cultures med deponeringsnummeret ECACC V00083008. Trekkene til MVA-BN, beskrivelsen av biologiske assay som gjør det mulig å evaluere om en MVA er MVA-BN eller et derivat derav, og fremgangsmåter som tillater en å oppnå MVA-BN eller et derivat derav er beskreve i ovennevnte refererte PCT-søknad.
Virus som skal amplifiseres i henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse kan være en villtypevirus, en svekket virus eller en rekombinant virus.
Betegnelsen ”rekombinant virus” refererer seg til enhver virus som har innskutt i det virale genom et heterologt gen som ikke er naturlig del av det virale genom. Et heterologt gen kan være et terapeutisk gen, et gen som koder for et peptid som omfatter minst én epitop for å indusere en immunrespons, en antisens ekspresjonskassett eller et ribozymgen. Fremgangsmåter til å konstruere rekombinante vira er kjent for en person med kunnskap på området. Den mest foretrukne poxvirusvektor er MVA, særlig MVA 575 og MVA-BN (se ovenfor).
En ”svekket virus” er en virus med opprinnelse i en patogen virus men som ved infeksjon av vertsorganismen fører til en lavere mortalitet og/eller morbiditet sammenlignet med den ikke-svekkede foreldrevirus. Eksempler på svekkede poxvira er kjent for en person med kunnskap på området. Et eksempel på en svekket vacciniavirus er stamme MVA, særlig stammen som er blitt deponert ved ECACC med depineringsnummeret V00083008 (se ovenfor).
Som påpekt ovenfor kan for poxvira de primære fuglecellene fortrinnsvis være CEF-celler eller primære andeembryofibroblaster. Igjen er en person med kunnskap på området i stand til å kjenne hvilke fugleprimære celler som er egnet for amplifikasjon av hvilken poxvirus. CEF-celler er særlig foretrukket for amplifikasjon av MVA. For MVA-amplifikasjon i CEF-celler er det en foretrukket utforming å velge én eller to av faktorene valgt fra EGF og fibronektin.
Hvis fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse blir brukt for amplifikasjon av MVA i CEF-celler er det foretrukket at utgangs pH-verdien til mediet er i området fra ca. 7,0 til ca. 8,5. Særlig foretrukket er en utgangs pH på 7,0.
Ifølge fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelsen blir særlig vacciniavirus, mest fortrinnsvis en MVA-stamme så som MVA-BN fremstilt under serumfrie betingelser.
På grunn av fremgangsmåten for amplifikasjon av virus er sammensetningen inneholdende poxvirus fri for ethvert produkt og/eller infeksiøst middel omfattet i dyresera. I kontrast omfatter sammensetninger som omfatter vira produsert i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter restforbindelser avledet fra dyreserum. Dette er spesielt tilfelle for sammensetningen som omfatter poxvira så som vacciniavirastammer.
Hvis poxvirus er en villtypevirus eller en svekket poxvirus kan virus anvendes for vaksinasjon mot virus som sådan. Med denne hensikt er svekkede vira spesielt foretrukne. Hvis virus er en rekombinant virus som uttrykker proteinene uttrykt fra gener heterologe til det virale genom, er det mulig å vaksinere mot virus som sådan og/eller mot det uttrykte heterologe protein. Hvis det rekombinante virus uttrykker et terapeutisk gen så som et antisens RNA eller et ribozym kan viruset benyttes som et legemiddel.
Eksempler
Hvis ikke noe annet er angitt i de følgende eksempler er det serumfrie mediet medium 199 (Life Technologies). Det tilsatte EGF er vanligvis rekombinant humant EGF oppnådd fra Chemicon. Fibronektin (FN) ble oppnådd fra Chemicon.
Eksempel 1: Fremstilling av hønseembryofibroblast (CEF) celler.
Spesifikke patogenfrie (SPF) fertiliserte egg ble lagret ikke lengre enn 12 dager ved 4<o>C. Eggene ble plassert i en inkubator og inkubert i 10-12 dager ved 37,8<o>C 8<o>C. En petriskål pr. maksimum 11 egg ble fremstilt med 10-20 ml PBS. Eggene ble plassert i en dedikert eggekartong og behandlet i utstrakt grad med Bacillol for å sterilisere yttersiden av eggskallene. Etter tørking ble det laget et hull i eggene og skallet ble fjernet forsiktig. Den korioalantoiske membran ble tatt til side.
Embryoene ble løftet opp etter føttene og deres hoder ble kuttet av. Embryoene ble deretter overført til de preparerte petriskålene. Etter å ha fjernet føttene ble kroppene vasket igjen med PBS. Maksimalt 11 kropper ble plassert i en 20 ml plastsprøyte og presset inn i en Erlenmeyerflaske. 5 ml av forvarmet (37<o>C) Trypsin/EDTA-oppløsning pr. kropp ble tilsatt og oppløsningen ble omrørt i 15 min. med serumfritt medium ved romtemperatur ved å bruke en magnetisk rører.
Trypsiniserte celler ble helt gjennom et lag av netting inn i et beger. Alle cellene ble overført til et 225 ml sentrifugerør og sentrifugert ned ved 20<o>C, 470xg i 7 min. på en bordsentrifuge. Etter å ha kastet supernatanten ble pelletten resuspendert i 1 ml fersk prevarmet (37<o>C) serumfri vekstmedium som omfatter 10 ng/ml EGF pr.
kropp ved å pipetere opp og ned grundig. Fersk forvarmet (37<o>C) serumfritt vekstmedium som omfatter 10 ng/ml EGF ble tilsatt til et totalt volum på 150 ml. Sentrifugeringstrinnet ble gjentatt. Supernatanten ble fjernet og pelletten ble resuspendert som beskrevet ovenfor. Fersk prevarmet (37<o>C) serumfritt vekstmedium som omfatter 10 ng/ml EGF ble tilsatt et totalt volum på 100 ml. Cellene ble talt som beskrevet i følgende avsnitt. De nødvendige mengder av celler ble sådd i rulleflasker med serumfritt vekstmedium som omfatter 10 ng/ml EGF og inkubert ved 37<o>C. Cellene var klare for virusinfeksjon på dag 4 etter såing.
Eksempel 2: Telling av celletetthet
En prøve av cellesuspensjonen (se avsnitt CEF-preparering) ble tatt og blandet med ett volum Trypan blue, som resulterte i et endelig celletall på 20-100 celler pr. 16 små firkanter i et hemocytometer levert av Fuchs-Rosenthal under navnet Hemocytometer Fast Read 102 (1:2 - 1:10 fortynning). Prøven ble tatt øyeblikkelig etter resuspensjon av cellene for å forhindre reaggregering/sedimentering av cellene. Etter noen minutters inkubasjonstid med Trypan blue for å få fargen skikkelig inn i døde celler, ble 10 µl av cellesuspensjonen tilsatt hemocytometer. Bare hvite levende celler ble telt under et lysmikroskop ved å bruke et 10x objektiv. Totalt ble tre representative store firkanter som bestod av 3x16 små telt. Fra hver stor firkant ble bare to grenser i L-form inkludert i tellingen. Gjennomsnittet av telte celler ble tatt og den endelige cellekonsentrasjonen ble beregnet ved å bruke følgende formler: gjennomsnittelig celleantall x fortynning x 10<4>= celler/ml.
Endelig ble cellesuspensjonen fortynnet til den ønskede arbeidskonsentrasjonen.
Eksempel 3: Virkning av tilsetting av en faktor valgt fra vekstfaktorer og fibronektin til et serumfritt kulturmedium på dannelsen av CEF-monolag I preliminære eksperimenter har oppfinnerne vist at CEF-celler ikke festes til overflaten på celledyrkingskarene viss medium 199 blir brukt som ikke omfatter FCS. Videre ble ingen monolag dannet. Normal monolagdannelse blir observert hvis medium 199 som inneholder 7 % FCS blir brukt. Det ble analysert om tilfesting av vekt av CEF-celler i serumfritt medium 199 kan oppnås hvis tilsetninger blir tilsatt mediet.
De testede tilsetningene omfatter rekombinant epidermal vekstfaktor (r-hEGF) og fibronektin (FN).
For eksperimentene ble CEF-celler dyrket i medium 199 med de forskjellige tilsetninger alene eller i kombinasjon. Celler dyrket i medium 199 uten noen tilsetning var negative kontroller. Celler dyrket i medium 199 som omfatter 7 % FCS tjente som en positiv kontroll. Alle eksperimentene ble utført i 6-brønners celledyrkingsplater med 3 ml medium. Tilsettingen ble behandlet i henhold til dataarkene fra fabrikanten før de ble brukt for celledyrking. Fibronektin ble tillatt og adsorberes til overflaten av celledyrkingsplatene i 25 min. før anvendelse.
Fibronektin ble brukt i en konsentrasjon på 3 µg/cm<2>og EGF ble brukt i en konsentrasjon på 10 ng/ml. Før tilsetting av noen celler ble cellekulturplatene bragt i kontakt med fibronektinholdig medium i 25 min.
Hvert kulturmedium pluss tilsetninger som skal testes ble dyrket i duplikat. De 6-brønners cellekulturplater ble inkubert i 4 dager ved 37<o>C. Fra dag 1-4 ble tilfesting og vekst av cellene evaluert ved å bruke et mikroskop.
For den positive kontroll har en normal tilfesting og vekst av CEF-celler blitt observert. For medium 199 uten tilsettinger kunne nesten ingen tilfesting av CEF-celler observeres. En avgjørende forbedring ved dannelsen av et monolag ble sett ved anvendelsen av EGF tilsatt medium 199 sammenlignet med medium 199 uten tilsetninger. Det ble funnet at cellene festet seg og dannet den typiske fibroblastmorfologien. Videre kunne en kontinuerlig vekst observeres over hele perioden på 4 dager.
En forbedring av celletilfesting ble også oppnådd ved å tilsette fibronektin til kulturmediet. Tilsetting av både EGF og fibronektin resulterte i en liten forbedring sammenlignet med tilsetting av EGF alene og fibronektin alene.
I oppsummering må det konkluderes at monolagdannelse av CEF-celler i serumfritt medium 199 kan understøttes ved anvendelse av tilsettingene EGF og fibronektin.
Videre, i parallelle sett av eksperimenter ble 1 x 10<7>CEF-celler sådd i medium som omfattet 10 % FCS, medium som ikke omfattet FCS og medium som ikke omfattet FCS men som omfattet EGF. Celletallet ble telt to dager etter såing. Antall celler var henholdsvis 42 %, 6 % og 44 % av celleantallet brukt for såing. Således var resultatet for cellene sådd i serumfritt medium som omfattet EGS så gode som resultatene oppnådd med mediet som omfattet FCS og signifikant bedre enn medium som verken inneholdt serum eller EGF.
I tillegg ble mediet som omfattet EGF sammenlignet med forskjellige standard serumfri media, så som DMEM, Opti-Mem eller 293-SFM. I denne forbindelse ble 1 x 10<7>CEF-celler sådd i de forskjellige serumfrie media og dyrket i 4 dager. Antall celler dyrket i medium som omfattet EGF var 24, 5 og 12 ganger høyere enn antall celler dyrket i henholdsvis serumfritt DMEM, Opti.Mem og 293-SFM.
Eksempel 4: Infeksjon av CEF-celler med MVA
CEF-celler ble infisert fire dager etter utsåing i rulleflasker. På det tidspunkt hadde cellene vokst til et adekvat monolag. Cellene ble infisert med en MOI av 1 eller 0,1 MVA. For infeksjonen ble vekstmediet fjernet fra flaskene. Den ønskede mengde av virus pr. rulleflaske ble fortynnet i 20 ml i det egnede infeksjonsmedium uten serum. På dette trinn kan det serumfrie mediet omfatte eller ikke omfatte en faktor valgt fra vekstfaktorer og fibronektin. Celler ble inkubert med virus i 1 time ved 37<o>C ved 0,3-0,5 rpm i en rulleflaskeinkubator. Etter 1 time ble rulleflaskene fylt med egnet serumfritt vekstmedium til et totalt volum på 200 ml pr. rulleflaske. På dette trinn kan det serumfrie mediet eller kan ikke omfatte en faktor valgt fra vekstfaktorer og fibronektin. Virusreplikasjonen ble stoppet etter 48 eller 72 timer ved å fryse rulleflaskene til -20<o>C.
Eksempel 5: Fremstilling av virale ekstrakter fra infiserte CEF-celler og titrering av MVA
De frosne rulleflaskene ble tint ved romtemperatur. Under tiningsprosessen løsner cellene fra overflaten av rulleflaskene og kan mekanisk fjernes ved å riste flaskene. Virus/cellesuspensjon ble høstet og porsjonert til mindre volum. For å frigjøre virus fra de infiserte celler ble virus/cellesuspensjonene frosset/tint tre ganger. De frosne/tinte virusprøvene ble brukt til titrering.
Titrering ble utført på første passasje CEF-celler i 96-brønners plater, ved å bruke 10 ganger fortynninger av viral suspensjon og 8 replikater pr. fortynning. Etter infeksjonen ble de infiserte celler visualisert med et anti-vacciniavirus antistoff og en egnet fargeoppløsning.
I detalj på dag null i assayet ble primære CEF-celler (se seksjonen ”fremstilling av hønseembryofibroblast (CEF) celler”) trypsinisert og telt som beskrevet i avsnittet ”telling av celletetthet”. Cellene ble fortynnet til 1 x 10<5>celler/ml i RPMI-medium ved 7 % FCS. Etter denne fortynning ble 100 µl sådd i hver brønn på 96-brønners platene ved å bruke en multikanalpipette. Cellene ble inkubert natten over ved 37<o>C og 5 % CO2. Virusprøvene som skulle titreres (se avsnitt ”fremstilling av virale ekstrakter fra infiserte CEF-celler”) ble seriefortynnet i 10 gangers trinn fra 10<-1>til 10<-12>ved å bruke RPMI uten serum. Denne seriefortynningen ble utført ved å tilsette 900 µl RPMI til alle brønnene på en 96-dyp-brønnplate. 100 µl av virusprøve ble tilsatt alle brønnene i den første rekken og blandet. Deretter ble 100 µl av hver prøve overført til neste rekke av brønner ved å bruke en multikanalspipette. De 96-dype-brønnplatene ble holdt på is ved utføring av fortynningene. Platene ble inkubert i 5 dager ved 37<o>C og 5 % CO2for å tillate at infeksjonen utviklet seg. Etter 5 dager ble celler immunohistokjemisk farget med et vacciniavirusspesifikt antistoff. For farging ble kulturmediet fjernet ved å snu 96-brønners platen opp-ned over et samlekar. Celler ble fiksert med 100 µl/brønn metanol/aceton (1:1) blanding i 10 min. ved romtemperatur. Fikseringsoppløsningen ble fjernet og platene ble lufttørket. Etter tørking ble cellene vasket én gang med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med anti-vacciniavirus antistoffet (anti-vacciniavirus antistoff, kanin, polyklonal, IgG-fraksjon (Quartett, Berlin, Tyskland nr. 9503-2057) fortynnet til 1:1000 i PBS med 3 % FCS. Etter å ha fjernet antistoffet ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med HRP-koplet (pepperrotperoksidasekoplet) anti-kanin antistoff (anti-kanin IgG-antistoff, HRP-koplet geit polyklonal (Promega, Mannheim, Tyskland, nr. W4011) fortynnet til 1:1000 i PBS med 3 % FCS. Igjen ble cellene vasket med PBS og farget enten med o-Dianisidin eller TMB. For å bruke o-Dianisidinfargingsmetoden ble cellene inkubert med 100 µl/brønn fargeoppløsning som bestod av 5 mg o-Dianisidin og 180 µl 30 % H2O2pr. 60 ml av 50 mM fosfatsitratbuffer. Cellene ble inkubert ved romtemperatur inntil de farget brunt. Infiserte celler var klart synlig etter 1-3 timer. Ved å bruke TMB-fargemetoden ble cellene inkubert med 30 µl/brønn 1,2 mM TMB (Seramun Diagnostica GmbH). Etter 15 min. inkubasjonstid ble TMB-oppløsningen fjernet og cellene ble vasket én gang med PBS. Infiserte celler synes mørkeblå. Platene ble skåret for infiserte celler. Virustiter ble beregnet ved å bruke formelen til Spearman og Kaerber. For beregning av TCID50ble hver brønn som viste brune eller blå celler markert positive. Fordi assayparametere blir holdt konstant ble den følgende forenklede formel brukt:
Virustiter [TCID50/ml] = 10<[a+1,5+xa/8+xb/8+xc/8]>
a = fortynningsfaktor for siste kolonne, hvori alle åtte brønnene er positive xa= antall positive brønner i kolonne a+1
xb= antall positive brønner i kolonne a+2
xc= antall positive brønner i kolonne a+3
Eksempel 6: Optimal såingstetthet for CEF-celler i serumfritt medium og optimal mengde av MVA for infeksjon av CEF-celler
En optimal såingscelletetthet på 7,5 x 10<7>celler/850 cm<2>(overflate av én rulleflaske) ble bestemt for serumfri CEF-vekst. Cellene var i stand til å bygge et godt monolag uten å danne store klumper på dag 4 etter utsåing og kunne infiseres ved dette tidspunkt.
Eksperimenter ble utført for å bestemme det beste nivå for viral inokulering og lengden av infeksjonen for maksimal produksjon av MVA fra CEF-celler dyrket i en serumfri prosess. CEF-celler ble sådd med en tetthet på 7,5 x 10<7>celler/850 cm<2>i mediumet i henhold til foreliggende oppfinnelse. På dag 4 etter utsåing ble cellene infisert med forskjellige mengder av MVA i området fra 0,05-1,0 TCID50/celler fra MVA. Dette resultat ble oppnådd med 0,1 TCID50-celle av MVA.
Eksempel 7: Optimal pH for serumfritt medium for dyrking og infeksjon med MVA
MVA og andre poxvirusinfeksjoner er følsomme for pH under 7,0. Poxvira er ikke stabile ved sur pH og det er anbefalt at renset poxvira lagres i en bufret oppløsning over pH 7,0 for å sikre stabilitet og virusintegritet etter lagring som et flytende viruspreparat. Eksperimenter ble utført for å bestemme virkningen på virusutbyttet ved utføring av infeksjon på forskjellige start pH-verdier. Rulleflasker ble sådd med CEF-celler på vanlig måte i serumfritt medium som omfatter 10 ng/ml EGF pluss 4 mM L-glutamin og dyrket i fire dager. Cellene ble infisert med MVA ved 0,1 TCID50/celle i serumfritt medium som omfattet 10 ng/ml EGF pluss L-glutamid og 1 mM asparagin ved forskjellige pH-verdier fra 6,5-9,0. Ved 72 timer etter infeksjonen ble pH i mediet målt og virusutbyttet ble bestemt ved å titrere celleekstrakter på vanlig måte. Resultatene er presentert i følgende tabell, som viser virkningen av initiell pH på mediet ved starten av infeksjonen på virusutbyttet.
For infeksjoner utført i serumfritt medium som omfatter 10 ng/ml EGF supplementert med L-glutamin og asparagin var virusproduksjonen relativt konstant ved en start pH fra 7,0-8,5 men virusproduksjoner var lave ved start pH på 6,5 og 9,0. Best utbytte ble oppnådd ved start pH på 9,0. Kommersielt tilgjengelige standard serumfri media har vanligvis en pH på 7,4. Derfor ved å justere pH i det serumfrie mediet til 7,0 kan hjelpe til å forbedre virusutbyttet.
Eksempel 8: Virkning av tilsatt asparagin til det serumfrie mediet
Preliminære eksperimenter har vist at mengden av asparagin kan være begrensende ved dyrking av CEF-celler og infeksjon av CEF-celler med MVA. For å overvinne utarming av asparagin i serumfritt medie under dyrking- og infeksjonsprosessen, ble ekstra asparagin tilsatt mediet som et supplement før infeksjon av CEF-celler. For å bestemme den optimale mengden av asparagin til å supplere mediet med ble rulleflasker sådd med CEF-celler (7,5 x 10<7>celler/850 cm<2>) i serumfritt medium som omfatter 10 ng/ml EGF pluss 4 mM L-glutamin. Fire dager etter utsåing ble cellene infisert med MVA ved 0,1 TCID50/celle i serumfritt medium som omfatter 10 ng/ml EGF pluss 4 mM L-glutamin supplementert med forskjellige asparaginkonsentrasjoner (0,5, 1,0 og 1,5 mM). Virusreplikasjon ble stoppet ved 72 timer etter infeksjonen og virustiterer ble bestemt. Resultatene er vist i følgende tabell som viser produksjon av MVA fra CEF-celler supplementert med forskjellige nivåer av asparagin for infeksjonstrinnet. Titrene representerer gjennomsnitt av tre rulleflasker pr. asparaginsupplement.
Resultatene viser at supplementering av serumfritt medium som omfatter 10 ng/ml EGF-medium med asparagin kunne forbedre virusproduksjon og at supplementering til 1 mM var optimal for infeksjonsproessen.

Claims (17)

PATENTKRAV
1. Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter følgende trinn:
(a) dyrking av primære fugleceller i et serumfritt medium;
(b) infeksjon av de primære fuglecellene med poxviruset;
(c) dyrking av de infiserte celler i serumfritt medium inntil poxvirusavkom er produsert, hvori de primære fuglecellene er celler som tillater den produktive replikasjon av poxviruset, og hvori det serumfrie medium i trinn (a) til (c) omfatter epidermal vekstfaktor (EGF).
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
k a r a k t e r i s e r t v e d at de primære fugleceller er hønseembryofibroblaster (CEF).
3. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at EGF er rekombinant human EGF.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,
k a r a k t e r i s e r t v e d at konsentrasjonen av EGF er i området fra 5-20 ng/ml medium.
5. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-4,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det serumfrie medium i trinn (a) til (c) ytterligere omfatter en tilfestingsfaktor, fortrinnsvis fibronektin.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at konsentrasjonen av fibronektin er i området fra1-10 μg/cm<2>overflate av celledyrkingskaret.
7. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 5,
k a r a k t e r i s e r t v e d at mediet omfatter to eller flere faktorer valgt fra vekstfaktorer og tilfestingsfaktorer.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7,
k a r a k t e r i s e r t v e d at mediet omfatter EGF og fibronektin i konsentrasjonsområder som angitt i kravene 4 og 6.
9. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-8,
k a r a k t e r i s e r t v e d at mediet ytterligere omfatter én eller flere tilsetninger valgt fra mikrobielt ekstrakt, planteekstrakt og ekstrakt fra et ikke-pattedyr.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det mikrobielle ekstraktet er gjærekstrakt eller gjærolatultrafiltrat.
11. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,
k a r a k t e r i s e r t v e d at planteekstraktet er risekstrakt eller soyaekstrakt.
12. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,
k a r a k t e r i s e r t v e d at ekstraktet fra ikke-pattedyr er fiskeekstrakt.
13. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-12,
k a r a k t e r i s e r t v e d at poxvirus er en ortopoxvirus.
14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13,
k a r a k t e r i s e r t v e d at ortopoxvirus er en Vacciniavirus.
15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14,
k a r a k t e r i s e r t v e d at Vacciniavirus er modifisert vacciniavirus Ankara.
16. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 13-15,
k a r a k t e r i s e r t v e d at poxvirus er en svekket virus eller en rekombinant virus.
17. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-16,
k a r a k t e r i s e r t v e d at etter dyrkingstrinnet for de infiserte celler i serumfritt medium inntil virusavkom blir fremstilt er ett eller flere rensetrinn foretatt.
NO20051175A 2002-09-05 2005-03-04 Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus under serumfrie betingelser. NO343489B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200201302 2002-09-05
PCT/EP2003/009704 WO2004022729A1 (en) 2002-09-05 2003-09-01 Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20051175L NO20051175L (no) 2005-03-04
NO343489B1 true NO343489B1 (no) 2019-03-25

Family

ID=31970216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20051175A NO343489B1 (no) 2002-09-05 2005-03-04 Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus under serumfrie betingelser.

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7695939B2 (no)
EP (1) EP1434858B2 (no)
JP (2) JP2005537793A (no)
KR (1) KR101044538B1 (no)
CN (1) CN1692156B (no)
AT (1) ATE393212T2 (no)
AU (1) AU2003264144C1 (no)
BR (1) BRPI0313559B8 (no)
CA (1) CA2494379C (no)
CY (1) CY1114598T1 (no)
DE (1) DE60320520T3 (no)
DK (1) DK1434858T4 (no)
EA (1) EA009008B1 (no)
ES (1) ES2305514T5 (no)
HK (1) HK1080507B (no)
MX (1) MXPA04012966A (no)
NO (1) NO343489B1 (no)
NZ (1) NZ538575A (no)
PL (1) PL215169B1 (no)
PT (1) PT1434858E (no)
SI (1) SI1434858T2 (no)
UA (1) UA85543C2 (no)
WO (1) WO2004022729A1 (no)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EE05680B1 (et) * 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
WO2004022729A1 (en) 2002-09-05 2004-03-18 Bavarian Nordic A/S Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
AU2006218115B2 (en) 2005-02-23 2012-08-02 Bavarian Nordic A/S Use of a modified poxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
RU2551982C2 (ru) 2006-06-20 2015-06-10 Трансжене С.А. Способ получения поксвирусов и композиции поксвирусов
AU2010275764A1 (en) * 2009-07-21 2012-03-15 Transgene Sa Enzymatic composition for the digestion of chicken embryos
US20130164329A1 (en) * 2010-02-17 2013-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cell-based methods and reagents
JP2013523175A (ja) 2010-04-14 2013-06-17 イーエムディー・ミリポア・コーポレーション 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法
CA2802430C (en) * 2010-07-20 2021-07-20 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting poxvirus
KR101504159B1 (ko) * 2012-04-20 2015-03-19 한국생명공학연구원 미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도
MX2016015785A (es) * 2014-06-18 2017-04-25 Medimmune Llc Metodos y medios de cultivo celular que comprenden n-acetilcisteina.
KR101677231B1 (ko) 2014-12-18 2016-11-30 제주대학교 산학협력단 무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법
CN105462911B (zh) * 2015-12-22 2018-04-13 肇庆大华农生物药品有限公司 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法
CN107129963A (zh) * 2017-04-24 2017-09-05 浙江美保龙生物技术有限公司 一种df‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
EP3624851A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2020033510A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Method for improved poxvirus yields
US20210187100A1 (en) 2018-09-06 2021-06-24 Bavarian Nordic A/S Storage Improved Poxvirus Compositions
KR20220153587A (ko) 2020-03-12 2022-11-18 버베리안 노딕 에이/에스 폭스바이러스 안정성을 개선하는 조성물
CN113355297A (zh) * 2021-06-23 2021-09-07 吉林冠界生物技术有限公司 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
CN116656628A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种痘病毒载体疫苗的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
WO1995022978A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-31 Anton Mayr Paramunity inducer based on combinations of poxvirus components, process to prepare it and its use as medicament
NO20040158L (no) * 2001-07-18 2004-01-13 Bavarian Nordic As Fremgangsmåte til å amplifisere et Chordopoxvirus.

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2004402A (en) * 1934-04-07 1935-06-11 Conklin John Edward Atomizer
US3887430A (en) 1972-02-24 1975-06-03 Dow Chemical Co Culture medium for tissue culture techniques
US4072565A (en) 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
US3914408A (en) 1973-10-12 1975-10-21 Univ Nebraska Vaccine for neonatal calf diarrhea
DE2714665A1 (de) 1977-04-01 1978-10-05 Mayr Anton Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5155020A (en) 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
AU613583B2 (en) 1986-08-22 1991-08-08 Transgene S.A. Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6248333B1 (en) 1990-04-04 2001-06-19 Health Research Inc. Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD)
AT393277B (de) 1990-01-04 1991-09-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen
EP0550638A4 (en) * 1990-09-25 1993-12-08 Smithkline Beecham Corporation Medium for culture of mammalian cells
US5766598A (en) 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
KR100242671B1 (ko) 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
IL102929A (en) 1992-08-24 1996-11-14 Interpharm Lab Ltd Serum-free medium for mammalian cells
US5403582A (en) 1993-01-21 1995-04-04 Nippon Zeon Co., Ltd. Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus
US5768598A (en) 1993-09-13 1998-06-16 Intel Corporation Method and apparatus for sharing hardward resources in a computer system
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US6190655B1 (en) 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
DK0758397T3 (da) 1994-04-29 2005-10-10 Baxter Healthcare Sa Rekombinante poxvira med fremmede polynucleotider i essentielle regioner
WO1996015231A2 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Immuno Aktiengesellschaft Method for producing biologicals in protein-free culture
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US5753489A (en) * 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
US5756341A (en) * 1994-11-10 1998-05-26 Immuno Ag Method for controlling the infectivity of viruses
US5503582A (en) 1994-11-18 1996-04-02 Micron Display Technology, Inc. Method for forming spacers for display devices employing reduced pressures
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
JPH09154571A (ja) * 1995-12-05 1997-06-17 Kurabo Ind Ltd ウイルス製造用無血清培地
AU726623B2 (en) 1996-02-21 2000-11-16 Julianna Lisziewicz Methods and compositions for protective and therapeutic genetic immunization
WO1998004680A1 (en) 1996-07-26 1998-02-05 University Of Manitoba Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells
US6869793B2 (en) 1996-09-24 2005-03-22 Bavarian Nordic Research Institute Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6103529A (en) 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
WO1998017283A1 (en) 1996-10-25 1998-04-30 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Method of vaccinating infants against infections
US6204250B1 (en) 1996-11-22 2001-03-20 The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York Immunization of infants
GB0023203D0 (en) 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
GB9711957D0 (en) 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
WO1999007869A1 (en) 1997-08-05 1999-02-18 University Of Florida Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating virus
US6605456B1 (en) * 1998-08-04 2003-08-12 Immunex Corporation Nucleic acids encoding IKR-2, a protein kinase related to the I kappa B kinases
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
CA2350207C (en) 1998-11-10 2011-02-08 University Of Rochester T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon
GB2370573A (en) 1998-11-18 2002-07-03 Oxford Biomedica Ltd Poxviral vectors
EP2042598A1 (en) 1998-11-18 2009-04-01 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
DE19935351A1 (de) 1999-07-29 2001-02-01 Abb Daimler Benz Transp Verfahren zur Energieoptimierung bei einem Fahrzeug/Zug mit arbeitspunktabhängigem Wirkungsgrad
US6682743B2 (en) 2000-03-14 2004-01-27 Bavarian Nordic A/S Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (MVA)
KR20030036194A (ko) 2000-05-24 2003-05-09 메리알 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ) 재조합아비폭스바이러스 백신
EP1303286B1 (de) 2000-07-11 2006-04-26 Bayer HealthCare AG Verwendung von stämmen des parapoxvirus ovis zur herstellung von antiviralen arzneimitteln und arzneimitteln gegen krebs
AU2002223560B2 (en) * 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
WO2004022729A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Bavarian Nordic A/S Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions
EE05680B1 (et) * 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
US7097842B2 (en) 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
EP1456230A2 (en) 2001-12-04 2004-09-15 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
US6951752B2 (en) 2001-12-10 2005-10-04 Bexter Healthcare S.A. Method for large scale production of virus antigen
IL161590A0 (en) 2001-12-10 2004-09-27 Bavarian Nordic As Poxvirus containing formulations and process for preparing stable poxvirus containing compositions
SI1407006T1 (sl) 2001-12-20 2006-04-30 Bavarian Nordic As Postopek za ponovno pridobivanje in ciscenje poksvirusov iz inficiranih celic
FR2836924B1 (fr) * 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
AU2003219057A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine
JP4895505B2 (ja) 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
BR0310020A (pt) 2002-05-16 2005-02-15 Bavarian Nordic As Expressão de genes no vìrus da vacìnia modificado ancara por uso do promotor de ati de vacìnia
EP1646715B1 (en) * 2003-07-22 2010-05-12 Vivalis Production of poxviruses with adherent or non adherent avian cell lines
US6915752B2 (en) * 2003-09-30 2005-07-12 Lockheed Martin Corporation Utility service protection strip
US6976752B2 (en) 2003-10-28 2005-12-20 Lexmark International, Inc. Ink jet printer with resistance compensation circuit

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
WO1995022978A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-31 Anton Mayr Paramunity inducer based on combinations of poxvirus components, process to prepare it and its use as medicament
NO20040158L (no) * 2001-07-18 2004-01-13 Bavarian Nordic As Fremgangsmåte til å amplifisere et Chordopoxvirus.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2305514T3 (es) 2008-11-01
EA200500448A1 (ru) 2005-08-25
HK1080507B (zh) 2011-10-07
EP1434858A1 (en) 2004-07-07
PL215169B1 (pl) 2013-10-31
ATE393212T2 (de) 2008-05-15
US20050214324A1 (en) 2005-09-29
AU2003264144B2 (en) 2009-05-14
ES2305514T5 (es) 2019-06-14
NZ538575A (en) 2007-03-30
CA2494379C (en) 2012-11-06
DK1434858T3 (da) 2008-08-11
NO20051175L (no) 2005-03-04
BRPI0313559B8 (pt) 2021-05-25
SI1434858T2 (sl) 2019-05-31
BRPI0313559B1 (pt) 2019-02-26
WO2004022729A8 (en) 2005-03-17
PL373992A1 (en) 2005-09-19
AU2003264144A1 (en) 2004-03-29
CN1692156B (zh) 2011-05-11
EP1434858B2 (en) 2018-12-19
DE60320520T2 (de) 2008-12-11
JP2010148522A (ja) 2010-07-08
BR0313559A (pt) 2005-07-12
DK1434858T4 (en) 2019-04-01
US20110217749A1 (en) 2011-09-08
SI1434858T1 (sl) 2008-10-31
JP5612338B2 (ja) 2014-10-22
JP2005537793A (ja) 2005-12-15
WO2004022729A1 (en) 2004-03-18
DE60320520D1 (de) 2008-06-05
US7695939B2 (en) 2010-04-13
EA009008B1 (ru) 2007-10-26
US8673318B2 (en) 2014-03-18
MXPA04012966A (es) 2005-05-16
HK1080507A1 (en) 2006-04-28
AU2003264144A2 (en) 2004-03-29
DE60320520T3 (de) 2019-05-09
CY1114598T1 (el) 2016-10-05
PT1434858E (pt) 2008-07-28
US20130089913A1 (en) 2013-04-11
US7964397B2 (en) 2011-06-21
AU2003264144C1 (en) 2009-12-17
UA85543C2 (ru) 2009-02-10
EP1434858B1 (en) 2008-04-23
KR20050037551A (ko) 2005-04-22
US20090029459A1 (en) 2009-01-29
CN1692156A (zh) 2005-11-02
CA2494379A1 (en) 2004-03-18
US8329466B2 (en) 2012-12-11
KR101044538B1 (ko) 2011-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO343489B1 (no) Fremgangsmåte til amplifisering av en poxvirus under serumfrie betingelser.
ES2345820T3 (es) Produccion de poxvirus con estirpes de celulas aviares adherentes o no adherentes.
KR20100017340A (ko) 바이러스 백신의 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포주
RU2819260C2 (ru) Бессывороточная среда для производства птичьей вакцины и ее использование
EP3911731A1 (en) Serum-free medium for avian vaccine production and uses thereof
Hasoon et al. Use of primary quail embryo fibroblast cells for propagation and assay of avian viruses
US20160152956A1 (en) Method for selecting a permissive cell line for replicating avian viruses

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired