BRPI0313559B1

BRPI0313559B1 - Método para o cultivo de células primárias e para a amplificação de vírus sob condições isentas de soro

Info

Publication number: BRPI0313559B1
Application number: BRPI0313559-4A
Authority: BR
Inventors: Ingmar Räther; Eva Felder; Karl Heller
Original assignee: Bavarian Nordic A/S
Priority date: 2002-09-05
Filing date: 2003-09-01
Publication date: 2019-02-26
Also published as: CA2494379A1; HK1080507B; EP1434858A1; JP2005537793A; PL373992A1; CY1114598T1; PT1434858E; US8329466B2; ES2305514T5; US20050214324A1; EP1434858B1; WO2004022729A8; US8673318B2; ES2305514T3; AU2003264144A2; AU2003264144A1; AU2003264144C1; DE60320520T2; SI1434858T2; EA009008B1

Abstract

"método para o cultivo de células primárias e para a amplificação de vírus sob condições isentas de soro". a presente invenção refere-se a um método para o cultivo de células primárias. as células primárias são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão. o processo para o cultivo de células primárias pode ser uma etapa em um método para a amplificação de vírus, tais como os poxvírus. de acordo com este último método, as células primárias são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão. as células são então infectadas com o vírus e as células infectadas são cultivadas em um meio isento de soro até que uma progênie viral seja produzida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO

PARA O CULTIVO DE CÉLULAS PRIMÁRIAS E PARA A AMPLIFICAÇÃO DE VÍRUS SOB CONDIÇÕES ISENTAS DE SORO.

A presente invenção refere-se a um método para o cultivo de células primárias. As células primárias são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão. O método para o cultivo de células primárias pode ser uma etapa em um método para a amplificação de vírus, tais como poxvírus. De acordo com este último método, as células

primárias são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão. As células são então infectadas com o vírus e as células infectadas são cultivadas em meio isento de soro até que seja produzida uma progênie viral.

. - 15 Antecedentes da Invenção

A maior parte das vacinas virais como vírus atenuados ou recombinantes é produzida partindo de sistemas de cultura de células. As células utilizadas para a produção de vírus/vacina podem ser linhagens de células, isto é, células que crescem continuamente in vitro, na forma de uma cultura em suspensão de uma célula isolada em biorreatores ou na forma de

uma monocamada de uma superfície de suporte de célula de frascos de cultura de tecido ou garrafas giratórias. Alguns exemplos para as linhagens de células utilizadas para a produção de vírus são: a linhagem de células pulmonares fetais humanas MRC-5 utilizada para a produção de vírus da pólio e a linhagem de células pulmonares fetais humanas WI-38 utilizada para a produção do vírus do sarampo, do vírus da caxumba e do vírus da rubéola (MMR II) (Merk Sharp & Dohme).

Não somente as linhagens de células, mas também as células animais primárias são utilizadas para a produção de vacinas. Um exemplo de células primárias que são utilizadas para a produção viral são os fibroblastos embrionários de frango (células CEF). Estas células são utilizadas para a produção do vírus do sarampo e da encefalite Japonesa (Pasteur Me2

rieux), do vírus da caxumba (produzido pela Provaccine), do vírus da raiva (produzido pela Chiron Berhing GmbH & Co.), do vírus da febre amarela (produzido pela Aprilvax), do vírus influenza (produzido pela Wyeth Labs e Smithkline & Beecham) e do vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA).

As células CEF são utilizadas freqüentemente, uma vez que muitas vacinas virais são produzidas através da atenuação do vírus virulento causador da doença, através da passagem em série em células CEF. O vírus atenuado não causa mais a doença, mas ainda é capaz de estimular uma imunidade protetora potente contra a forma virulenta do vírus. Um

exemplo deste tipo de vírus é o MVA. Este vírus possui uma replicação gravemente restrita em seres humanos e na maioria dos animais. O MVA está sendo desenvolvido como um vetor para vacina porque pode ser utilizado para expressar antígenos derivados de uma variedade de agentes causadores de doenças em seres humanos. Os vírus atenuados, tal como o MVA, são preferencialmente não propagados em células humanas uma vez que há uma preocupação de que o vírus possa novamente se tornar competente em relação à replicação em células de origem humana. Entretanto, os vírus que recuperaram a capacidade de se replicarem em células humanas poderíam ser um risco para a saúde se administrados a seres humanos, em particular 20 se os indivíduos tiverem a imunidade comprometida. Por esta razão, alguns

vírus atenuados, tal como o MVA, são estritamente produzidos partindo de células CEF, se forem pretendidos para uso em seres humanos.

Além disso, as células CEF são utilizadas para os vírus que podem crescer somente nas ditas células. Os exemplos de tais vírus são em particular os vírus de aves tais como os avipoxvírus, em particular o poxvírus de canários, ALVAC, poxvírus de aves domésticas e NYVAC.

As linhagens de células e as células primárias crescidas cultivadas sob condições de cultura in vitro requerem um meio de crescimento e de manutenção especial que pode sustentar (I) a replicação celular na fase lo30 garítmica e (II) a manutenção celular uma vez que as células não se dividem mais, isto é, quando as células estão na fase estacionária. Os meios de cultura de células comumente utilizados compreendem uma solução rica em

• · • ·	• ·	• •	• 4 « •	9 99	99 9 9	99 9 9	99 9 9	9 9	•
• ·	♦ ·	•	•	9	9	99	9 9	*	•


		•	9	99 9	9	9	9	• ·

sais contendo vitaminas, aminoácidos, elementos traços essenciais e açúcares. Hormônios de crescimento, enzimas e proteínas biológicas ativas necessários para sustentar o crescimento e a manutenção das células são geralmente adicionados como um suplemento ao meio na forma de um produto 5 do soro derivado do sangue de animais. Os exemplos para produtos do soro derivados do sangue de animais são o soro fetal de bezerro, o soro de frango, o soro de cavalo e o soro suíno. Estes soros são derivados do sangue fracionado, do qual as células sanguíneas vermelhas e as sangüíneas brancas foram removidas. As células primárias, tais como as células CEF são

ainda mais dependentes de fontes de soros de animais que as linhagens de células. Assim, as células primárias são geralmente cultivadas em meios de cultura que compreendem 5 até 10% de soro, na maioria dos casos soro fetal de bezerro (FCS).

Os soros de animais não compreendem somente fatores que são necessários para o crescimento das células, mas também fatores que são necessários para as células que crescem naturalmente como células aderentes para a adesão à superfície de suporte de células do recipiente de cultura. Assim, é crítico para as células aderentes que seja adicionado soro suficiente ao meio para possibilitar que as mesmas cresçam e formem uma monocamada.

Infelizmente, o soro bovino/fetal de bezerro, assim como os outros soros provenientes de outros animais, podem conter agentes patogênicos adventícios tais como vírus. Há um risco potencial de que estes agentes patogênicos sejam transmitidos ao animal/ser humano que será tratado ou vacinado com a vacina ou outro produto farmacêutico produzido na cultura de células. Isto tem relevância particular se os produtos da cultura de células forem administrados a seres humanos com comprometimento imunológico. Um dos muitos problemas principais potenciais associados ao suplemento de soro bovino utilizado comumente é a possibilidade de transmitir o agente causador da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) aos animais/seres humanos que entram em contato com os produtos produzidos da cultura de células.

Em vista do risco possível associado ao uso de soros de animais em cultura de células, tomou-se evidente que processos de produção isentos do uso de produtos animais são altamente desejáveis.

Para este fim, foram desenvolvidos meios específicos que não têm que ser suplementados com soros de animais para cultivar continuamente linhagens de células e para a produção de vírus em linhagens de células continuamente em cultivo, respectivamente. Um exemplo de tal meio isento de soro que pode ser utilizado para cultivar linhagens de células é o

VP-SFM produzido pela Gibco BRL/Life Technologies. De acordo com a in-

formação dos fabricantes, o VP-SFM é planejado especificamente para o cultivo de VERO, COS-7, MDBK, Hep2, BHK-21 e outras linhagens de células importantes (Price, P. e Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69) e para a produção viral nas ditas linhagens de células. Não há qualquer informação disponível em relação ao cultivo de células primárias no dito meio.

A U.S. 5.503.582 descreve o cultivo de células CEF em meio que compreende 4% de soro de bezerro seguido pela infecção das células com poxvírus de aves domésticas no meio isento de soro. Spataro, A. C. e outros, J. Cell. Sei. 1976; 21,407-413 descrevem que as células CEF podem ser mantidas em meio isento de soro durante 24 horas uma vez que uma monocamada foi formada. Assim, de acordo com ambas as publicações, os

meios que são utilizados para o cultivo das células após o inóculo compreendem soro. Somente para a manutenção das células que já estão aderidas à superfície e que atingiram a fase estacionária foi utilizado o meio isento de soro. Se o inóculo foi feito com meio convencional, tal como o meio 199 ou

RPMI-1640 que não possui soro, não é formada a monocamada e as células formam agregados não viáveis nos meios.

O WO 98/15614 refere-se a um meio específico isento de soro para o cultivo in vitro de células de animais. As células que podem ser cultivadas no meio que é descrito no WO 98/15614 são as de origem animal, 30 incluindo as células obtidas de mamíferos, aves, insetos ou peixes. As células de mamíferos podem ser células primárias de origem humana. Não há referência a células primárias de aves.

A U.S. 5.405.772 descreve um meio isento de soro para a proli-

feração e o desenvolvimento de células. As células são preferencialmente células hematopoiéticas e células do estroma da medula óssea. As células primárias de aves não são mencionadas.

O WO 98/04680 descreve um meio isento de soro para o cultivo de células de mamíferos dependentes da adesão, tais como as linhagens de células BHK, Vero ou MRC-5. O WO 98/04680 não refere-se a células primárias nem a células de aves.

Objetivo da Invenção

É o objetivo da presente invenção fornecer um método que permita o cultivo de células primárias, em particular células primárias de aves em meio isento de soro, em que o método permite (I) o cultivo das células durante a fase logarítmica e (II) a manutenção das células na fase estacionária. Além disso, se as células forem células aderentes, o meio pode prefe15 rencialmente permitir (III) a adesão das células aderentes à superfície do recipiente de cultura de célula. É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um método para a produção de vírus através do uso de células primárias sob condições isentas de soro.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece um método para o cultivo de célu-

las primárias, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão.

De acordo com a presente invenção, as células primárias que crescem naturalmente na forma de células aderentes se aderem à superfície do recipiente para cultura de células após o inóculo e crescem em uma fase logarítmica até que uma monocamada seja formada. De acordo com a presente invenção, as células em repouso podem ser mantidas no meio utilizado durante a adesão e o crescimento logarítmico das células.

O método da presente invenção não se restringe às células que formam monocamadas. De acordo com uma modalidade alternativa, o método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para todos os outros tipos de células primárias, tais como as células que crescem naturalmente em cultura em suspensão (por exemplo, linfócitos ou outros tipos de células sanguíneas) ou células que cresceríam naturalmente na forma de células aderentes, mas que foram adaptadas para crescerem em cultura em 5 suspensão.

Como mostrado abaixo, as células também podem ser utilizadas para a amplificação de vírus isenta de soro que poderíam ser úteis como vacinas.

Era inesperado que células primárias que crescem naturalmente

como células aderentes (I) podem se aderir de forma eficiente à superfície do recipiente de cultura de células sem formar quantidades inaceitáveis de agregados e (II) podem ser cultivadas na fase logarítmica na ausência de soro uma vez que se acredita de forma geral, que as células primárias eram dependentes de um grande número de fatores e componentes diferentes compreendidos no soro. Além disso, acreditava-se que as células aderentes formassem agregados não viáveis que não se aderiam à superfície do recipiente de cultura de células, quando cultivadas em meio isento de soro. Assim, era inesperado que fosse suficiente adicionar a um meio isento de soro um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e fatores de adesão com a finalidade de se obter adesão e crescimento de

células primárias aderentes. Além disso, era ainda inesperado que células primárias cultivadas na cultura em suspensão pudessem crescer com os meios utilizados no método de acordo com a presente invenção. Além disso, é surpreendente que as células primárias de aves, tais com células de Fi25 broblastos Embrionários de Frango (CEF), possam ser cultivadas para se aderirem à superfície de um recipiente de cultura de células sem formar quantidades inaceitáveis de agregados em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e de fatores de adesão uma vez que era conhecido que as cé30 lulas de aves cresciam de forma extremamente ruim em meio isento de soro que não compreendia fatores de crescimento ou fatores de adesão, isto é, era inesperado que as fracas propriedades de crescimento de células primá7

rias de aves pudessem ser melhoradas significativamente através da adição de um fator selecionado dos fatores de crescimento e dos fatores de adesão no meio isento de soro.

O termo células primárias como utilizado na presente descrição é bem-conhecido por um versado na técnica. Sem estar restrito à definição a seguir, o termo células primárias refere-se a células que foram recémisoladas de um tecido, órgão ou organismo animal ou humano, em que as células não são capazes de se replicar e de se dividir continuamente e indefinidamente. Geralmente, as células primárias se dividem em cultura de cé-

lulas menos que 100 vezes, freqüentemente menos que 50 vezes, freqüentemente menos que 25 vezes. Assim, as células primárias não sofreram um evento de imortalização. Os exemplos de células primárias são linfócitos sanguíneos do cordão e fibroblastos humanos ou animais. Os exemplos preferidos para os fibroblastos animais são fibroblastos de aves, mais prefe15 rencialmente os Fibroblastos Embrionários de Frango (células CEF). Um exemplo preferido para os fibroblastos primários humanos são os fibroblastos do prepúcio humano.

São bem-conhecidos pelo versado na técnica os métodos de como as células primárias podem ser isoladas. Geralmente, as culturas de células primárias são derivadas diretamente de tecidos, órgãos ou embriões.

Os tecidos, órgãos ou embriões são submetidos ao tratamento com protease para a obtenção de células isoladas. As células são então cultivadas de acordo com o método de acordo com a presente invenção sob condições de cultura in vitro.

Mais especificamente, as células CEF são obtidas de embriões de frango digeridos com protease. De acordo com a presente invenção, as células CEF crescem melhor que as células aderentes aderidas em uma superfície de suporte sólido para células. As células começam a replicação e estabelecem uma monocamada. Se as células CEF (após a digestão do embrião) forem cultivadas in vitro com um meio de cultivo padronizado sem soro animal, as células ocasionalmente se aderirão à superfície de suporte sólido para células, mas não se replicarão até formarem uma monocamada

confluente de células e irão com o tempo se descolar da superfície de suporte de cultura sólido para células. Em contraste, se as células CEF forem cultivadas de acordo com o método da presente invenção, as células se aderem ao suporte sólido, crescem na fase logarítmica até uma monocamada 5 ser formada e podem ser mantidas na fase estacionária durante vários dias.

O termo cultivo de células em um meio isento de soro no contexto de células primárias aderentes refere-se ao inóculo das células no recipiente de cultura em um meio isento de soro, para o crescimento das células em um meio isento de soro na fase logarítmica até que uma monoca-

mada seja formada e/ou para a manutenção das células em meio isento de soro assim que a monocamada for formada. Mais preferencialmente, o termo cultivo de células em um meio isento de soro refere-se a um método em que todas as etapas mencionadas anteriormente são realizadas com meio isento de soro, de forma que nenhum produto do soro animal esteja presente 15 durante todo o processo de cultivo das células. Assim, em um significado mais geral, o termo cultivo de células em um meio isento de soro refere-se ao fato de que todos os meios que levam à formação de uma monocamada são meios isentos de soro. Os meios utilizados em todas as etapas anteriores podem compreender um fator selecionado dos fatores de crescimento e dos fatores de adesão. Entretanto, podería ser suficiente adicionar tal fator

somente aos meios utilizados para a adesão das células e/ou o cultivo das células sob condições logarítmicas.

O termo cultivo de células em um meio isento de soro no contexto de células que crescem em cultura em suspensão refere-se ao inóculo das células no recipiente de cultura em um meio isento de soro, ao cultivo das células em um meio isento de soro na fase logarítmica e/ou à manutenção das células em meio isento de soro assim que a densidade de saturação em que não ocorre qualquer replicação adicional é obtida. Mais preferencialmente, o termo cultivo de células em um meio isento de soro refere-se a um método em que todas as etapas mencionadas anteriormente são realizadas com meio isento de soro, de forma que nenhum produto do soro animal esteja presente durante todo o cultivo das células. Os meios utilizados em todas as etapas anteriores podem compreender preferencialmente um fator selecionado do grupo de fatores de crescimento. Entretanto, podería ser suficiente adicionar tal fator somente aos meios utilizados para o inóculo das células e/ou o crescimento das células sob condições logarítmicas.

Como explicado abaixo em maiores detalhes, podería ser ainda possível cultivar células que cresceríam normalmente na forma de células aderidas também na forma de células de cultura em suspensão se forem escolhidas con-

dições apropriadas de incubação (por exemplo, através da aplicação da incubação em ondas). O método de acordo com a presente invenção tam10 bém se aplica para este tipo de incubação.

O termo meio isento de soro refere-se a qualquer meio de cultura de células que não contém soros de origem animal ou humana. Os meios de cultura de células adequados são conhecidos pelo versado na técnica. Estes meios compreendem sais, vitaminas, tampões, fontes de energia, 15 aminoácidos e outras substâncias. Um exemplo de um meio adequado para o cultivo isento de soro de células CEF é o meio 199 (Morgan, Morton e Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; que pode ser obtido inter alia na Life Technologies).

Os meios utilizados de acordo com o método da presente inven20 ção, em particular, os meios utilizados para células aderentes tais como cé-

lulas CEF, contêm um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão. Um exemplo para um fator de adesão é a fibronectina.

Para as células que cresceríam naturalmente na forma de célu25 Ias aderentes, que, entretanto, são de forma não obstante cultivadas em cultura em suspensão (que é possível, por exemplo, para as células CEF), é particularmente preferido utilizar um fator selecionado do grupo de fatores de crescimento. Os exemplos para os fatores de crescimento úteis para este tipo de cultivo são o fator de crescimento epidérmico recombinante bovino, murino, de frango ou humano (EGF). É mais preferido o EGF recombinante humano (rh-EGF) (Chemicon Int., Número de catálogo: GF001).

Para as células que crescem naturalmente na cultura em sus-

• · · ·· • · • ··

pensão, o meio pode preferencialmente compreender um fator selecionado do grupo de fatores de crescimento incluindo o EGF. Mais preferencialmente, os fatores de crescimento para este tipo de células são fatores específicos para células não aderentes. Os exemplos para estes fatores de cresci5 mento são as interleucinas, o GM-CSF, o G-CSF e outros. O versado na técnica pode facilmente determinar através de experimentos de rotina, que tipo de fator é adequado para cada tipo de células.

Se o fator adicionado ao meio isento de soro for o EGF, em particular, o rh-EGF, este é preferencialmente adicionado ao meio em uma con10 centração de 1 até 50 ng/mL, mais preferencialmente 5 até 20 ng/ml_. Entretanto, o versado na técnica estará ciente do fato de que tipos celulares diferentes podem requerer uma concentração um pouco diferente de EGF no soro para resultados ótimos.

Se o fator de adesão adicionado ao meio isento de soro for a fibronectina: (por exemplo, Chemicon Int.; Human plasma fibronectin; número de catálogo FC010), esta é preferencialmente adicionada ao meio em uma concentração de 1 até 50, mais preferencialmente de 1 até 10 pg/cm²de superfície do recipiente de cultura de células. Entretanto, o versado na técnica estará ciente do fato de que tipos celulares diferentes podem reque20 rer uma concentração de fibronectina um pouco diferente no soro para re-

sultados ótimos.

De acordo com a presente invenção, é suficiente adicionar somente um fator selecionado dos fatores de crescimento e dos fatores de adesão ao meio, em particular se as células forem células aderentes. Entre25 tanto, é ainda possível adicionar dois ou mais fatores selecionados dos fatores de crescimento e dos fatores de adesão ao meio. O meio pode preferencialmente compreender o EGF e a fibronectina, preferencialmente nas faixas de concentração definidas anteriormente, em particular se as células primárias forem células aderentes tais como as células CEF.

O meio pode compreender ainda um ou mais aditivos selecionados de extrato microbiano, de extrato vegetal e de extrato de um animal não mamífero. O extrato microbiano é preferencialmente o extrato de levedura ou um extrato de levedura ultrafiltrado. O extrato vegetal é preferencialmente o extrato de arroz ou o extrato de Soja. O extrato de um animal não mamífero é preferencialmente um extrato de peixe.

De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a Asparagina pode ser adicionada ao meio isento de soro disponível comercialmente ao qual um fator selecionado de fatores de crescimento e de fatores de adesão foi adicionado. Mais preferencialmente, a asparagina é adicionada ao meio que é utilizado durante a infecção com o vírus (ver abaixo). Os meios isentos de soro comerciais compreendem geralmente asparagina

em uma faixa de concentração de 0,3 até 1,0 mM. As quantidades preferidas de asparagina para suplementar o meio estão na faixa de 0,5 até 1,5 mM. É mais preferido um suplemento de asparagina de 1 mM. A concentração total de asparagina no meio é preferencialmente menor que 2 mM e mais preferencialmente em uma faixa de 0,8 até 1,8 mM. A concentração mais preferi15 da de asparagina no meio é de 1,3 mM.

Além disso, a glutamina pode ser preferencialmente adicionada ao meio. Mais preferencialmente, a glutamina é adicionada ao meio que é utilizado durante a infecção com o vírus (ver abaixo). Quantidades preferidas de glutamina que serão suplementadas ao meio estão em uma faixa de 1 até

5 mM, mais preferencialmente em uma faixa de 2 até 4 mM. As faixas indi-

cadas correspondem ainda às concentrações totais preferidas no meio uma vez que a maior parte dos meios disponíveis comercialmente não contém glutamina.

De acordo com uma modalidade adicional, a invenção refere-se a um método para a amplificação de um vírus que compreende as etapas a seguir: na primeira etapa, as células primárias são cultivadas de acordo com o método descrito anteriormente, isto é, as células primárias são cultivadas em um meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e em fatores de adesão, dependen30 do do tipo celular. Todas as condições, definições, modalidades preferidas e ainda a ordem de preferência às modalidades mais preferidas fornecidas para a descrição do método para o cultivo de células primárias acima, tam12

bém se aplicam para a definição da primeira etapa do método para a amplificação do vírus de acordo com esta modalidade da presente invenção. Em uma segunda etapa, as células primárias são infectadas com o vírus. Na terceira etapa, as células infectadas são incubadas em meio isento de soro até que a progênie viral seja produzida.

O termo amplificação de um vírus é utilizado para deixar claro que o método de acordo com a presente invenção é preferencialmente utilizado para aumentar a quantidade de vírus por causa de uma replicação viral produtiva do vírus nas células infectadas. Em outras palavras, a proporção de saída de vírus em relação à entrada de vírus deve ser preferencialmente maior que 1. Assim, de acordo com a presente invenção estas células primárias são escolhidas para um vírus específico, em que o vírus é capaz de se replicar produtivamente. O termo replicação reprodutiva refere-se ao fato de que o vírus específico se replica na célula primária específica até uma extensão em que a progênie viral infecciosa é produzida, em que a proporção de saída de vírus em relação à entrada de vírus é maior que 1.

O versado na técnica sabe, quais vírus podem ser replicados produtivamente em que tipo de células primárias. Para fim de exemplo, as células primárias podem ser fibroblastos de prepúcio humano se o vírus que será amplificado for o Citomegalovírus humano; as células primárias podem ser células CEF se o vírus que será amplificado for o vírus do sarampo, o vírus da caxumba, o vírus da raiva, o vírus da encefalite Japonesa, o vírus da febre amarela, o vírus influenza ou um poxvírus tal como o vaccinia, em particular o vírus vaccinia Ankara modificado (MVA).

Os métodos para infectar células primárias de acordo com a segunda etapa da presente modalidade são conhecidos pelos peritos na arte. Com a finalidade de exemplo, o vírus pode simplesmente ser adicionado ao meio. Altemativamente, o meio pode ser removido e o vírus pode ser adicionado ao meio fresco, que por sua vez é adicionado às células. Para a obtenção de uma infecção eficiente, a quantidade de vírus/suspensão de meio deve ser a menor possível para possuir uma alta concentração de vírus.

Após a adesão do vírus, pode ser adicionado um meio adicional.

Na terceira etapa, as células são inoculadas em meio isento de soro até que uma progênie viral seja produzida.

O meio isento de soro que é utilizado na segunda e na terceira etapas do método para a amplificação de um vírus pode ser o mesmo meio que já havia sido utilizado anteriormente, isto é, um meio isento de soro que compreende um fator selecionado dos fatores de crescimento e dos fatores de adesão, dependendo do tipo celular. Entretanto, para economia, é possível utilizar na primeira ou tanto na segunda quanto na terceira etapas um meio isento de soro que não contenha um fator selecionado dos fatores de

crescimento e dos fatores de adesão.

Durante todos os estágios, o meio pode ser suplementado com asparagina e/ou glutamina como citado anteriormente, em que a concentração total de asparagina no meio é preferencialmente como definido acima.

A progênie viral pode ser concentrada e purificada de acordo com os métodos conhecidos pelo versado na técnica.

De acordo com uma modalidade preferida, o método para a amplificação de vírus é utilizado para a amplificação de poxvírus. Assim, de acordo com esta modalidade preferida, a invenção refere-se a um método para a amplificação de um poxvírus que compreende as etapas a seguir: (I) 20 o cultivo de células primárias de acordo com o método que é descrito anteri-

ormente, isto é, um método em que as células primárias são cultivadas em meio isento de soro que compreende um fator selecionado do grupo que consiste em fatores de crescimento e fatores de adesão, dependendo do tipo celular, (II) a infecção das células primárias com o poxvírus e (III) o cultivo das células infectadas em meio isento de soro até que a progênie viral seja produzida.

Era inesperado que os poxvírus pudessem ser amplificados em células cultivadas sob condições isentas de soro uma vez que as células crescem muito mal com o meio isento de soro conhecido. Assim, era espe30 rado que o estresse adicional associado a uma infecção de poxvírus matasse as células já estressadas antes que ocorresse uma amplificação significativa do poxvírus.

Ο poxvírus é preferencialmente um orthopoxvirus. Os exemplos <ρ>:

de orthopoxvirus são avipoxvírus e vírus vaccinia.

O termo avipoxvírus refere-se a qualquer avipoxvírus, tal como o poxvírus de aves domésticas (Fowlpoxvirus), o poxvírus de canário, o Un5 copoxvirus, o Mynahpoxvirus, o poxvírus de pombos, o poxvírus de psitacídeos, o poxvírus de codorniz, o poxvírus de pavão, o poxvírus de pingüim, o poxvírus de pardal, o poxvírus de estorninho e o poxvírus de peru. Os avipoxvírus preferidos são o poxvírus de canário e o poxvírus de aves domésticas.

Um exemplo de um poxvírus de canário (Fowlpoxvirus) é a cepa

Rentschler. Uma cepa de poxvírus de canário purificada por placas denominada ALVAC (U.S. 5.766.598) foi depositada sob os termos do Tratado de

Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), número de acesso

VR-2547. Uma outra cepa de poxvírus de canário é a cepa de vacina de poxvírus de canário comercial denominada LF2 CEP 524 24 10 75, disponível no Institute Merieux, Inc.

Os exemplos de um poxvírus de aves domésticas são as cepas

FP-1, FP-5 e TROVAC (U.S. 5.766.598). A FP-1 é uma cepa de Duvette modificada para ser utilizada como uma vacina em frangos de um dia de idade. A cepa é uma cepa vacinai de poxvírus de ave doméstica comercial 20 denominada O DCEP 25/CEP67/2309 outubro de 1980 e está disponível no

Institute Merieux, Inc. A FP-5 é uma cepa vacinai de poxvírus de ave doméstica comercial de origem embrionária de frango disponível na American

Scientific Laboratories (Divisão da Schering Corp.) Madison, Wisconsin, Licença Veterinária dos Estados Unidos N° 165, N^s de série 30321.

Os exemplos de cepas de vírus vaccinia são as cepas Temple of

Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per,

Tashkent, TBK, Tom, Bem, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda e WR. A invenção é preferencialmente realizada com o vírus vaccinia Ankara modificado (MVA) (Sutter, G. e outros [1994], Vaccine 12: 1032-40). Uma cepa de MVA típica é a MVA 575 que foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures sob o número de depósito ECACC V00120707. A mais preferida é a MVA-BN ou um deri-

·· · • · • · ·· vado da mesma, que foi descrita no pedido de patente PCT PCT/EP01/13628 depositada no European Patent Office em 22 de novembro de 2001, intitulada, Modified Vaccinia Ankara Virus Variant. A MVA-BN foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures com o número de depósito 5 ECACC V00083008. As características da MVA-BN, a descrição dos ensaios biológicos que permitem avaliar se uma MVA é uma MVA-BN ou um derivado da mesma e os métodos que permitem a obtenção da MVA-BN ou um descritos da mesma, são divulgados no pedido de patente PCT referenciado acima que é incorporado aqui como referência.

O vírus que será amplificado de acordo com o método da presente invenção pode ser um vírus do tipo selvagem, um vírus atenuado ou um vírus recombinante.

O termo vírus recombinante refere-se a qualquer vírus que possua inserido em seu genoma viral um gene heterólogo que não faz parte 15 naturalmente do genoma viral. Um gene heterólogo pode ser um gene terapêutico, um gene que codifica um peptídeo que compreende pelo menos um epítopo para induzir uma resposta imunológica, um cassete de expressão antisenso ou um gene de ribozima. Os métodos constructos de um vírus recombinante são conhecidos por um versado na técnica. O vetor de poxvírus 20 mais preferido é o MVA, em particular o MVA 575 e o MVA-BN (ver acima).

Um vírus atenuado é um vírus que se origina de um vírus patogênico, mas que após a infecção do organismo hospedeiro leva a uma menor mortalidade e/ou morbidez comparadas com as do vírus original não atenuado. Os exemplos de poxvírus atenuados são conhecidos pelo versado 25 na técnica. Um exemplo para um vírus Vaccinia atenuado é a cepa MVA, em particular a cepa que foi depositada na ECACC com o número de depósito V00083008 (ver acima).

Como citado anteriormente, para os poxvírus as células primárias podem ser preferencialmente células primárias de aves tais como as cé30 lulas CEF ou fibroblastos primários embrionários de pato. Novamente, o versado na técnica está ciente de quais células primárias são adequadas para a amplificação de qual poxvírus. As células CEF são particularmente preferi preferidas para a amplificação do MVA. Para a amplificação do MVA em células CEF é uma modalidade preferida selecionar um ou dois dos fatores selecionados do EGF e da fibronectina.

Se o método de acordo com a presente invenção for utilizado para a amplificação do MVA em células CEF, é preferido que o pH inicial do meio esteja em uma faixa de aproximadamente 7,0 até aproximadamente 8,5. É particularmente preferido um pH inicial de 7,0.

A invenção refere-se ainda aos vírus, em particular aos poxvírus obtidos pelo método descrito acima. De acordo com uma modalidade prefe10 rida, o poxvírus é um vírus vaccinia, mais preferencialmente uma cepa MVA tal como a MVA-BN.

A invenção refere-se ainda a uma composição que compreende um vírus, em particular um poxvírus produzido pelo método de acordo com a presente invenção. Como citado anteriormente, o poxvírus é preferencial15 mente um vírus vaccinia, mais preferencialmente uma cepa MVA tal como a MVA-BN. Por causa do método para a amplificação do vírus, a composição é isenta de quaisquer produtos e/ou agentes infecciosos compreendidos nos soros animais. Em contraste, as composições que compreendem os vírus produzidos de acordo com os métodos convencionais compreendem com-

postos residuais derivados do soro animal. Isto é especialmente o caso para as composições que compreendem poxvírus tais como as cepas de vírus vaccinia.

A invenção refere-se ainda a um vírus, em particular aos vírus que são definidos acima como um medicamento ou vacina. Se o vírus for um 25 vírus do tipo selvagem ou um vírus atenuado, o vírus pode ser utilizado para a vacinação contra o vírus como tal. Para esta finalidade, os vírus atenuados são particularmente preferidos. Se o vírus for um vírus recombinante que expressa proteínas expressas de genes heterólogos em relação ao genoma viral, é possível vacinar contra o vírus como tal e/ou contra a proteína hete30 róloga expressa. Se o vírus recombinante expressar um gene terapêutico, tal como um RNA antisenso ou uma ribozima, o vírus pode ser utilizado como um medicamento.

A invenção refere-se ainda ao uso de um vírus como definido

	anteriormente ou a uma composição como definido anteriormente para a produção de uma vacina. A invenção refere-se ainda a um método para o tratamento ou
5	para a vacinação de um animal incluindo um ser humano, que necessita da mesma, que compreende a administração de um vírus como definido acima ou de uma composição como definido acima ao animal ou ao corpo humano. Exemplos Se não for indicado de outra forma, nos exemplos a seguir, o
	meio isento de soro é o meio 199 (Life Technologies). O EGF adicionado é geralmente o EGF humano recombinante obtido na Chemicon. A fibronectina (FN) foi obtida na Chemicon. Exemplo 1: Preparação de células de fibroblastos de Embrião de Frango (CEF)
15	Os ovos fertilizados isentos de agentes patogênicos específicos (SPF) foram armazenados durante não mais que 12 dias a 4°C. Os ovos foram colocados em uma incubadora e foram incubados durante 10-12 dias a

37,8°C + 8°C. Uma placa de petri para no máximo 11 ovos foi preparada com 10-20 mL de PBS. Os ovos foram colocados em uma caixa de papelão dedicada aos ovos e tratados extensivamente com Bacilol para esterilizar a

parte externa da casca dos ovos. Após a secagem, foi feito um orifício nos ovos e a casca foi removida cuidadosamente. A membrana corioalantóica foi retirada. Os embriões foram levantados pelos pés e então suas cabeças foram cortadas. Os embriões foram então transferidos para placas de petri 25 preparadas. Após a remoção dos pés, os troncos foram lavados novamente com PBS. 11 troncos no máximo foram colocados em uma seringa plástica de 20 mL e espremidos para dentro de um frasco Erlenmeyer. 5 mL de solução de Tripsina/EDTA preaquecida (37°C) por tronco foram adicionadas e a solução foi agitada durante 15 minutos com meio isento de soro à tempera30 tura ambiente utilizando um agitador magnético. As células submetidas ao tratamento com tripsina foram vertidas através de uma camada de rede em um béquer. Todas as células foram transferidas para um tubo de centrífuga

•	•	*♦·	•	• · ·	• · ·	• · ·	»
• ·	• ·	•	• ·	•	•	«	• «
*	• ·	•	•	•	··	• 9	• ·
•	• ·	•	•	•	•	•	* ·
	• ·	• ·	•	• ·	• ·	• ·	•
•	•	•	·· ·	•	•	•	··

de 225 mL e centrifugadas a 20°C, 470xg durante 7 minutos em uma centrífuga de superfície de bancada. Após o descarte do sobrenadante, a pélete foi ressuspensa em 1 mL de meio de crescimento isento de soro fresco preaquecido (37°C) compreendendo 10 ng/mL de EGF por tronco através da 5 pipetagem vigorosa para cima e para baixo. O meio de crescimento isento de soro fresco preaquecido (37°C) compreendendo 10 ng/mL de EGF foi adicionado a um volume total de 150 mL. A etapa de centrifugação foi repetida. O sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspenso como descrito

anteriormente. O meio de crescimento isento de soro fresco preaquecido (37°C) compreendendo 10 ng/mL de EGF foi adicionado a um volume total de 100 mL. As células foram contadas como descrito na seção a seguir. As quantidades necessárias de células foram inoculadas em garrafas giratórias com meio de crescimento isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF e incubadas a 37°C. As células estavam prontas para a infecção viral no 15 quarto dia após o inóculo.

Exemplo 2: Contagem da Densidade Celular

Uma amostra da suspensão celular (ver a seção de preparação de CEF) foi tirada e misturada com um volume de azul de Tripano, resultando em uma contagem de células final de 20 até 100 células por 16 quadra dos pequenos de um hemocitômetro fornecido pela Fuchs-Rosenthal sob o

nome de Hemocytometer Fast Read 102 (diluição de 1:2 - T.10). A amostra foi tirada imediatamente após a ressuspensão das células com a finalidade de prevenir a reagregação/sedimentação das células. Após alguns minutos do tempo de incubação com o azul de Tripano com a finalidade de adquirir a coloração apropriadamente nas células mortas, 10 pL da suspensão celular foram adicionados ao hematocitômetro. Somente as células vivas brancas foram contadas sob um microscópio luminoso utilizando uma objetiva de 10x. No total, 3 quadrados grandes representativos consistindo em 3x16 pequenos foram contados. De cada quadrado grande, somente duas bordas na 30 Forma de L foram incluídas na contagem. A média de células contadas foi tirada e a concentração final de célula foi calculada utilizando a fórmula a seguir: Número médio de células x diluição x 10⁴ = células/mL. Finalmente, a

• ·	•	• ··	• ···	·» ·	···	•
w	V	• ·	•	··	•	•	•	• ·
•	•	• ·	•	•	•	··	• ·	• ·
	•	• ·	•	•	•	•	•	• ·
	•	• ·	• ·	•	• ·	• ·	• ·	•
	•	•	•	·· ·	•	•	•	··

suspensão de células foi diluída até a concentração de trabalho desejada. Exemplo 3: Efeito da adição de um fator selecionado de fatores de crescimento e fibronectina a um meio de cultura isento de soro na formação de uma monocamada de CEF

Em experimentos preliminares, os inventores mostraram que as células CEF não se aderem à superfície de recipientes de cultura de células se for utilizado o meio 199 que não compreende FCS. Além disso, nenhuma monocamada é formada. A formação de monocamadas normais é observa da se for utilizado o meio 199 contendo 7% de FCS. Foi analisado se a ade-

são e o crescimento das células CEF no meio 199 isento de soro poderíam ser conseguidos se fossem adicionados aditivos ao meio.

Os aditivos testados compreendem o Fator de Crescimento Epidérmico recombinante (r-hEGF) e a Fibronectina (FN).

Para os experimentos, as células CEF foram cultivadas em meio

199 com os aditivos diferentes isoladamente ou em combinação. As células crescidas em meio 199 sem quaisquer aditivos serviam como o controle negativo. As células cultivadas em meio 199 que compreende 7% de FCS serviam como o controle positivo. Todos os experimentos foram realizados em placas de cultura de células de 6 cavidades com 3 mL de meio. Os aditivos 20 foram tratados de acordo com os folhetos de dados do fornecedor antes de

serem utilizados para a cultura de células. Foi permitido que a fibronectina fosse absorvida pela superfície das placas da cultura de células durante 25 minutos antes do uso. A fibronectina foi utilizada em uma concentração de 3 pg/cm² e o EGF foi utilizado em uma concentração de 10 ng/mL. Antes de 25 adicionar quaisquer células, as placas de culturas de células foram colocadas em contato com o meio contendo fibronectina durante 25 minutos.

Cada meio de cultura mais os aditivos que serão testados foi cultivado em duplicatas. As placas de cultura de células de 6 cavidades foram incubadas durante 4 dias a 37°C. Do 1^s até o 4^S dias, a adesão e o 30 crescimento das células foram avaliados utilizando um microscópio.

Para o controle positivo, foi observado uma adesão e um crescimento normais das células CEF. Para o Meio 199 sem aditivos, quase ne20 dl

nhuma adesão de células CEF podia ser observada.

Um aumento crucial na formação de uma monocamada foi observado através do uso de EGF adicionado ao Meio 199 comparado com o Meio 199 sem aditivos. Foi descoberto que as células se aderiram e formaram a morfologia típica de fibroblastos. Além disso, podia ser observado um crescimento contínuo ao longo de todo o período de 4 dias.

Um aumento da adesão das células foi também atingido através da adição da fibronectina ao meio de cultura. A adição de ambos, o EGF e a Fibronectina resultou em um ligeiro aumento comparado com a adição de somente o EGF e de somente a Fibronectina.

Em resumo, foi concluído que a formação da monocamada de células CEF no Meio 199 isento de soro pode ser sustentada pelo uso dos aditivos EGF e Fibronectina.

Além disso, em conjuntos paralelos de experimentos, 1 x 10⁷células de CEF foram inoculadas no meio compreendendo 10% de FCS, no meio não compreendendo FCS e no meio não compreendendo FCS, mas compreendendo EGF. O número de células foi contado 2 dias após o inóculo. O número de células equivalia a 42%, 6% e 44%, respectivamente, do número de células utilizado para o inóculo. Assim, os resultados para as células inoculadas em meio isento de soro compreendendo EGS eram tão bons quanto os resultados obtidos com meio compreendendo FCS e significativamente melhores que os com o meio não contendo soro nem EGF.

Em adição, o meio compreendendo EGF foi comparado com vários meios padronizados isentos de soro, tal como o DMEM, o Opti-Mem ou o 293-SFM. Para esta finalidade, 1 x 10⁷ células CEF foram inoculadas nos vários meios isentos de soro e cultivados durante 4 dias. O número de células cultivadas em meio compreendendo EGF era 24,5 e 12 vezes maior que o número de células cultivadas em DMEM, Opti.Mem e 293-SFM isentos de soro, respectivamente.

Exemplo 4: Infecção de células CEF com MVA

As células CEF foram infectadas quatro dias após o inóculo em garrafas giratórias. Em tal ponto de tempo, as células tinham crescido até

-	uma monocamada adequada. As células foram infectadas com uma MOI de 1 ou de 0,1 de MVA. Para a infecção, o meio de cultura foi removido dos frascos. A quantidade desejada de vírus por garrafa giratória foi diluída em 20 mL do meio de infecção apropriado sem soro. Neste estágio, o meio
5	isento de soro pode ou não compreender um fator selecionado dos fatores de crescimento e da fibronectina. As células foram incubadas com o vírus durante 1 hora a 37°C a 0,3-0,5 rpm em uma incubadora de garrafa giratória. Após 1 hora, as garrafas giratórias foram preenchidas com o meio de crescimento isento de soro apropriado em um volume final de 200 mL por garrafa
¹⁰	giratória. Neste estágio, o meio isento de soro pode ou não compreender um fator selecionado dos fatores de crescimento e da fibronectina. A replicação viral foi interrompida após 48 ou 72 horas através do congelamento das garrafas giratórias até -20°C. Exemplo 5: Preparação de Extratos Virais partindo de Células CEF infecta-
. * 15	das e Titulação do MVA As garrafas giratórias congeladas foram descongeladas à temperatura ambiente. Durante o processo de descongelamento, as células se descolaram da superfície das garrafas giratórias e puderam ser mecanicamente removidas através da agitação dos frascos. A suspensão viral/celular
20 e	foi coletada e aliquotada em volumes menores. Para a liberação do vírus das células infectadas, as suspensões de vírus/células foram congeladas/descongeladas 3 vezes. As amostras de vírus congeladas/descongeladas foram utilizadas para a titulação. As titulações foram realizadas na 1- passagem de células CEF
25	em placas de 96 cavidades, utilizando diluições de 10 vezes da suspensão viral e 8 réplicas por diluição. Após a infecção, as células infectadas foram visualizadas com um anticorpo antivírus vaccinia e uma solução de coloração apropriada. Em detalhes, no dia zero do ensaio, as células CEF primárias
30	(ver a seção preparação de células de Fibroblastos Embrionários de Frango (CEF)) foram submetidas ao tratamento com tripsina e contadas como descrito na seção contagem da densidade celular. As células foram diluídas

até 1x10⁵ células/mL em meio RPMI com 7% de FCS. Após esta diluição, 100 gL foram inoculados em cada cavidade das placas de 96 cavidades utilizando uma pipeta multicanal. As células foram incubadas durante a noite a

37°C e 5% de CO2. As amostras de vírus a ser tituladas (ver a seção prepa5 ração de extratos virais provenientes de células CEF infectadas) foram diluídas em série em etapas de 10 vezes de 10'¹ - 10¹² utilizando RPMI sem soro. Esta diluição em série é realizada através da adição de 900 μΙ_ de

RPMI em todos os cavidades de uma placa de 96 cavidades fundos. 100 μΙ_ da amostra viral foram adicionados a todos os cavidades da primeira fileira e 10 foram misturados. Depois disso, 100 μΙ_ de cada amostra foram transferidos para a próxima fileira de cavidades utilizando uma pipeta multicanal. As placas de 96 cavidades fundos foram mantidas em gelo enquanto as diluições eram realizadas. As placas foram incubadas durante 5 dias a 37°C e 5% de

CO2 para permitir que a infecção continuasse. Após 5 dias, as células foram coradas de forma imunohistoquímica com um anticorpo específico para o vírus vaccinia. Para a coloração, o meio de cultura foi removido virando a placa de 96 cavidades de cabeça para baixo sobre um receptor. As células foram fixadas com 100 pL/cavidade de metanol/acetona mistura de (1:1) durante 10 minutos à temperatura ambiente. A solução de fixação foi removida e as placas foram secas ao ar. Após a secagem, as células foram lavadas uma vez com PBS e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com o anticorpo antivírus vaccinia (fração IgG policlonal de coelho do anticorpo antivírus Vaccinia (Quartett, Berlim, Alemanha n° 9503-2057) diluído em

1:1000 em PBS com 3% de FCS. Após a remoção do anticorpo, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo anticoelho acoplado com HRP (acoplamento com a Peroxidase da Raiz Forte) (anticorpo IgG anticoelho, policlonal de cabra acoplado com HRP (Promega, Mannheim, Alemanha n^e W4011) diluído em 1:1000 em PBS com 3% de FCS. Novamente, as células foram lavadas com PBS e coradas com o-Dianisidina ou TMB. Para a utilização do método de coloração com a o-Dianisidina, as células foram incubadas com 100 μL/cavidade de solução de coloração consistindo em 5 mg de o-Dianisidina

-	e 180 μί de H2O2 a 30% por 60 mL de tampão de fosfato-citrato a 50 mM. As células foram incubadas à temperatura ambiente até ficarem coradas de marrom. As células infectadas eram claramente visíveis após 1-3 horas. Utilizando 0 método de coloração com TMB, as células foram incubadas com
5	30 pL/cavidade de 1,2 mM de TMB (Seramun Diagnostica GmbH). Após 15 minutos do tempo de incubação, a solução de TMB foi removida e as células foram lavadas uma vez com PBS. As células infectadas apareciam como azul-escuro. As placas foram classificadas em relação às células infectadas. O título viral foi calculado utilizando a fórmula de Spearman and Kaerber.
10 •	Para 0 cálculo da TCID50, cada cavidade exibindo células marrons ou azuis foi marcado como positivo. Devido ao fato de que os parâmetros do ensaio são mantidos constantes, foi utilizada a fórmula simplificada a seguir: Título viral [TCIDso/mL] = 1₀ ^[a+1-^{5+xa/8+xb/8+xc/8]} a = fator de diluição da última coluna, em que todos os oito cavi-
15	dades são positivos x_a = número de cavidades positivos na coluna a+1 Xb = número de cavidades positivos na coluna a+2 x_c = número de cavidades positivos na coluna a+3 Exemplo 6: Densidade ótima de inóculo para as células CEF em meio
20	isento de soro e quantidade ótima de MVA para a infecção de células CEF
è	Uma densidade celular ótima para inóculo de 7,5x10⁷ células/850 cm² (superfície de um frasco giratório) foi determinada para 0 crescimento de CEF isento de soro. As células eram capazes de construir uma boa monocamada sem formar grandes grumos no quarto dia após 0 inóculo
25	e podiam ser infectadas neste ponto de tempo. Os experimentos foram realizados para determinar 0 melhor nível de inoculação viral e 0 período da infecção para a produção máxima de MVA partindo de células CEF cultivadas em um processo isento de soro. As células CEF foram inoculadas a uma densidade de 7,5x10⁷ células/850 cm²
30	em meio de acordo com a presente invenção. No 4^S dia após 0 inóculo, as células foram infectadas com quantidades diferentes de MVA na faixa de 0,05 até 1,0 TCIDso/célula de MVA. Os melhores resultados foram obtidos

• ··· • · • · com 0,1 TCID₅₀/célula de MVA.

Exemplo 7: pH ótimo do meio isento de soro para o cultivo e a infecção com

MVA

As infecções pelo MVA e outros poxvírus são sensíveis ao pH menor que 7,0. Os poxvírus não são estáveis em pH ácido e é recomendado que os poxvírus purificados sejam armazenados em uma solução tamponada com pH maior que 7,0 para garantir a estabilidade e a integridade viral após o armazenamento na forma de uma preparação viral líquida. Os experimentos foram realizados para determinar o efeito sobre o rendimento de

vírus quando se realiza uma infecção em um pH inicial diferente. As garrafas giratórias foram inoculadas com células CEF da forma usual em meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF mais 4 mM de L-Glutamina e cultivadas durante 4 dias. As células foram infectadas com MVA a 0,1

TCID₅₀/célula em meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF 15 mais L-Glutamina e 1 mM de Asparagina em pHs diferentes variando de 6,5 até 9,0. 72 horas após a infecção, o pH do meio foi medido e os rendimentos virais foram determinados através da titulação dos extratos celulares da maneira usual. Os resultados são apresentados na tabela a seguir, que mostra o efeito do pH inicial do meio no início da infecção sobre o rendimento viral.

pH Inicial.

	meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF
pH Inicial	pH 72 h p.i.	Título [TCID5o/mL]
6,5	7,05	0,56 X 10⁷
7,0	7,34	10,0 X10⁷
7,5	7,3	5,60X10⁷
8,0	7,68	8,60 X10⁷
8,5	7,75	7,80 X 10⁷
9,0	8,03	0,65 X 10⁷

Para as infecções realizadas em meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF suplementado com L-Glutamina e Asparagina, a produção viral era relativamente constante com o pH inicial de 7,0 até 8,5, mas as produções virais eram baixas nos pHs iniciais de 6,5 e de 9,0. O

melhor rendimento foi obtido no pH inicial de 7,0. Os meios isentos de soro padronizados disponíveis comercialmente possuem geralmente um pH de 7,4. Portanto, o ajuste do pH do meio isento de soro para 7,0 pode ajudar a aumentar o rendimento viral.

Efeito 8: Efeito da Asparagina adicionada ao meio isento de soro

Os experimentos preliminares revelaram que a quantidade de asparagina pode ser limitante durante o cultivo de células CEF e a infecção de células CEF com MVA. Para superar a eliminação da Asparagina nos meios isentos de soro durante o processo de cultivo e de infecção, foi adicionada Asparagina extra ao meio como um suplemento antes da infecção com células CEF. Para determinar a quantidade ótima da Asparagina para suplementar o meio, as garrafas giratórias foram inoculadas com células CEF (7,5x10⁷ células/850 cm²) em meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de EGF mais 4 mM de L-Glutamina. Quatro dias após o inóculo, as células foram infectadas com MVA a 0,1 TCID₅₀/célula em meio isento de soro que compreende 10 ng/mL de EGF mais 4 mM de L-Glutamina suplementado com concentrações diferentes de Asparagina (0,5, 1,0 e 1,5 mM). A replicação viral foi interrompida 72 horas após a infecção e os títulos virais foram determinados. Os resultados são mostrados na tabela a seguir que exibe a produção do MVA partindo de células CEF suplementadas com níveis diferentes de Asparagina para o estágio de infecção. Os títulos representam as médias de 3 garrafas giratórias por suplementação com Asparagina.

Suplemento de Asparagina	Títulos virais após 72 horas de infecção [TCIDso/mL]
0,0 mM	1,8X10®
0,5 mM	1,3X10®
1,0 mM	6,8X10®
1,5 mM	1,0X10®

Os resultados demonstram que a suplementação do meio isento de soro compreendendo 10 ng/mL de meio com EGF e Asparagina podia aumentar a produção viral e que a suplementação em 1 mM para o processo de infecção era ótima.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a amplificação de um poxvírus caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(a) cultivar fibroblastos embrionários de frango (CEF) em um meio isento de soro;

(b) infectar fibroblastos embrionários de frango (CEF) com o poxvírus; e (c) cultivar as células infectadas em meio isento de soro até a progenie de poxvírus seja produzida, em que os fibroblastos embrionários de frango (CEF) são células que permitem a replicação produtiva do poxvírus, e em que o meio isento de soro das etapas (a) a (c) compreende fator de crescimento epidérmico (EGF).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o EGF é EGF recombinante- humano. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2,

caracterizado pelo fato de que a concentração de EGF se situa numa faixa de 5 a 20 ng / ml de meio.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido meio isento de soro das etapas (a) a (c) compreende ainda um fator de adesão, de preferência, fibronectina.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração de fibronectina se situa na faixa de 1 a 10 pg / cm² de superfície do recipiente de cultura celular.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o meio compreende dois ou mais fatores selecionados de fatores de crescimento e fatores de

Petição 870170049703, de 17/07/2017, pág. 14/16
2/3 adesão .

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio compreende EGF e fibronectina em faixas de concentração como definido nas reivindicações 4 e 6.

8. Método, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio compreende ainda um ou mais aditivos selecionados a partir de extrato microbiano, extrato vegetal e extrato de um animal não mamífero.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o extrato microbiano é um extrato de levedura ou um extrato de levedura ultrafiltrado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o extrato vegetal é um extrato de arroz ou extrato de so ja. 11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o extrato de um animal não mamífero é um extrato de peixe. 12. Método, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o poxvírus é um ortopoxvirus.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ortopoxvirus é um vírus Vaccinia.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que de o vírus Vaccinia é vírus Vaccinia Ankara Modificado.

15. Método, de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o poxvírus é um vírus atenuado ou um vírus recombinante.

Petição 870170049703, de 17/07/2017, pág. 15/16
3/3

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que subsequente à etapa de cultivo das células infectadas em meio isento de soro são feitas uma ou mais etapas de purificação até à produção de progênie de poxvirus seja produzida.