ES2305514T3 - Metodo para la amplificacion de un poxvirus en condiciones exentas de suero. - Google Patents
Metodo para la amplificacion de un poxvirus en condiciones exentas de suero. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2305514T3 ES2305514T3 ES03766057T ES03766057T ES2305514T3 ES 2305514 T3 ES2305514 T3 ES 2305514T3 ES 03766057 T ES03766057 T ES 03766057T ES 03766057 T ES03766057 T ES 03766057T ES 2305514 T3 ES2305514 T3 ES 2305514T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- medium
- virus
- serum
- poxvirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
- A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Método para la amplificación de un poxvirus que comprende los pasos siguientes: - cultivo de células primarias de ave en un medio exento de suero que comprende un factor seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y factores de fijación - infección de las células primarias de ave con el poxvirus - cultivo de las células infectadas en medio exento de suero hasta que se produce el poxvirus progenie, en donde las células primarias de ave son células que permiten la replicación productiva del poxvirus.
Description
Método para la amplificación de un poxvirus en
condiciones exentas de suero.
La presente invención se refiere a un método
para la amplificación de un poxvirus en el cual células primarias
de ave que permiten la replicación productiva del poxvirus se
cultivan en un medio exento de suero que comprende un factor
seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y
factores de fijación. Las células se infectan luego con el virus y
las células infectadas se cultivan en medio exento de suero hasta
que se produce el virus progenie.
La mayoría de las vacunas virales tales como
virus atenuados o recombinantes se fabrican a partir de sistemas de
cultivo de células. Las células utilizadas para la producción de
virus/vacunas pueden ser líneas de células, es decir células que se
cultivan continuamente in vivo, sea como cultivo de
suspensión de células simples en biorreactores o como una monocapa
sobre una superficie de soporte de células de matraces de cultivo de
tejidos o frascos rotativos. Algunos ejemplos de líneas de células
utilizadas para la producción de virus son: la línea de células de
pulmón fetal humano MRC-5 utilizada para la
fabricación de poliovirus y la línea de células de pulmón fetal
humano WI-38 utilizada para la fabricación de virus
del sarampión, virus de las paperas y virus de la rubéola (NMR II)
(Merk Sharp & Dohme).
No sólo líneas virus de la progenie de células
sino también células animales primarias se utilizan para la
fabricación de vacunas. Un ejemplo de células primarias que se
utilizan para producción de virus son fibroblastos de embrión de
pollo (células CEF). Estas células se utilizan para la producción de
virus del sarampión y de la encefalitis japonesa (Pasteur Merieux),
virus de las paperas (fabricado por Provaccine), virus de la rabia
(fabricado por Chiron Berhing GmbH & Co.), virus de la fiebre
amarilla (fabricado por Aprilvax), virus de la gripe (fabricado por
Wyeth Labs y SmithKline & Beecham) y virus Vaccinia modificado
Ankara (MVA).
Las células CEF se utilizan a menudo dado que
muchas vacunas de virus se fabrican por atenuación del virus
virulento causante de la enfermedad por sometimiento a pasos
seriados en células CEF. El virus atenuado no causa ya la
enfermedad pero es capaz sin embargo de estimular una inmunidad
protectora potente contra la forma virulenta del virus. Un ejemplo
de este tipo de virus es MVA. Este virus se ve severamente
restringido en su replicación en humanos y en la mayoría de los
animales. MVA está siendo desarrollado como un vector de vacuna
debido a que el mismo puede utilizarse para expresar antígenos
derivados de una diversidad de agentes que causan enfermedades en
humanos. Los virus atenuados, tales como MVA no se propagan
preferiblemente en células humanas dado que existe la preocupación
de que los virus pudieran de nuevo hacerse competentes en
replicación en células de origen humano. Sin embargo, los virus que
han recuperado la capacidad de replicarse en células humanas podían
presentar un alto riesgo si se administraran a humanos, en
particular si los individuos son inmunodeficientes. Por esta razón,
algunos virus atenuados, tales como MVA, se fabrican estrictamente a
partir de células CEF, si están destinados a uso humano.
Además, se utilizan células CEF para aquellos
virus que crecen únicamente sobre dichas células. Ejemplos de tales
virus son en particular virus de aves tales como virus avipox, en
particular el poxvirus de los canarios, ALVAC, el poxvirus Fowl y
NYVAC.
Las líneas de células y células primarias
desarrolladas en condiciones de cultivo in vitro requieren un
medio especial de crecimiento y mantenimiento que pueda soportar
(I) la replicación celular en la fase logarítmica y (II) el
mantenimiento celular una vez que las células ya no se están
dividiendo, es decir, cuando las células se encuentran en la fase
estacionaria. Los medios de cultivo de células utilizados comúnmente
comprenden una solución salina rica que contiene vitaminas,
aminoácidos, elementos traza esenciales y azúcares. Se añaden
usualmente hormonas de crecimiento, coenzimas y proteínas
biológicamente activas requeridas para soportar el crecimiento y
mantenimiento celular, como suplemento al medio en la forma de un
producto de suero derivado de sangre animal. Ejemplos de productos
de suero derivados de sangre animal son suero de ternero fetal,
suero de pollo, suero de caballo y suero de porcino. Estos sueros
se derivan de sangre fraccionada, de la cual se han eliminado los
glóbulos rojos y los glóbulos blancos. Las células primarias, tales
como células CEF son aún más dependientes de fuentes de suero
animales que otras líneas de células. Por ello, las células
primarias se cultivan usualmente en medios de cultivo de células
que comprenden 5 a 10% de suero, en la mayoría de los casos suero de
ternero fetal (FCS).
Los sueros animales no sólo comprenden los
factores que se requieren para el crecimiento de las células, sino
también factores que se requieren para células que crecen
naturalmente como células adherentes que se fijan a la superficie
de soporte celular del recipiente de cultivo. Así pues, es crítico
para las células adherentes que se añada suero suficiente al medio a
fin de permitir que las mismas crezcan y formen una monocapa.
Lamentablemente, el suero de bovino/ternero
fetal así como sueros de otros animales pueden contener agentes
patógenos adventicios tales como virus. Existe un riesgo potencial
de que estos agentes patógenos se transmitan al animal/humano a
tratar o a vacunar con la vacuna o cualquier otro producto
farmacéutico producido en cultivo de células. Esto es
particularmente importante si se administran productos de cultivo de
células a humanos inmunodeficientes. Uno de los muchos problemas
potenciales importantes asociados con el suplemento de suero de
bovino utilizado comúnmente es la posibilidad de transmitir el
agente causante de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) a los
animales/humanos que entran en contacto con los productos fabricados
a partir de dicho cultivo de células.
Teniendo en cuenta el posible riesgo asociado
con el uso de sueros animales en cultivo de células, ha quedado
claro que son sumamente deseables procesos de fabricación exentos
del uso de productos animales.
A este fin, medios específicos que no tienen que
suplementarse con sueros animales han sido desarrollados para
líneas de células que crecen continuamente y para la producción de
virus en líneas de células que se encuentran en crecimiento
continuo, respectivamente. Un ejemplo de un medio exento de suero de
este tipo que puede utilizarse para cultivar líneas de células es
VP-SFM, fabricado por Gibco BRL/Life Technologies.
De acuerdo con la información de los fabricantes,
VP-SFM está diseñado específicamente para el
crecimiento de VERO, COS-7, MDBK, Hep2,
BHK-21 y otras líneas de células importantes (Price,
P. y Evege, E. Focus 1997, 19:67-69) y para la
producción de virus en dichas líneas de células. No se dispone de
ninguna información concerniente al cultivo de células primarias en
dicho medio.
El documento US 5503582 describe el cultivo de
células CEF en un medio que comprende 4% de suero de ternero
seguido por la infección de las células con poxvirus Fowl en medio
exento de suero. Spataro, A.C. et al., J. Cell. Sci. 1976;
21. 407-413 describe que pueden mantenerse células
CEF en medio exento de suero durante 24 horas una vez que se ha
formado una monocapa. Así pues, de acuerdo con ambas publicaciones
los medios que se utilizan para el cultivo de las células después
de la siembra comprenden suero. Únicamente para el mantenimiento de
las células que están ya fijadas a la superficie y que han alcanzado
la fase estacionaria se utilizó medio exento de suero. Si la
siembra se realiza con medio convencional, tal como medio 199 o
RPMI-1640 sin suero no se forma monocapa alguna y
las células forman agregados no viables en el medio.
El documento WO 98/15614 hace referencia a un
medio específico exento de suero para el cultivo in vitro de
células animales. Las células que pueden cultivarse en medio que se
describe en WO 98/15614 son las de origen animal, con inclusión de
células obtenidas de mamíferos, aves, insectos o peces. Las células
de mamífero pueden ser células primarias de origen humano. No se
hace referencia alguna a células primarias de ave.
El documento US 5405772 describe un medio exento
de suero para la proliferación y desarrollo de células. Las células
son preferiblemente células hematopoyéticas y células estromáticas
de médula ósea. No se mencionan células primarias de ave.
WO 98/04680 describe un medio exento de suero
para el crecimiento de células de mamífero dependientes de anclaje,
tales como las líneas de células BHK, Vero o MRC-5.
WO 98/04680 no se refiere a células primarias ni a células de
ave.
Pietrzkowski et al. Folia Histochemica et
Cytobiologica 1988, 26:123-132 describe que el
dextrano T-500 mejora la supervivencia y
propagación de células de embrión de pollo en medio exento de suero.
Sin embargo, Pietrzkowski et al. no hace referencia a la
amplificación de virus.
US 4072565 describe el crecimiento de células en
cultivo de tejidos y la producción de vacunas de virus en cultivo
de tejidos en ausencia de suero. Sin embargo, US 4072565 guarda
silencio en cuanto a la amplificación de poxvirus.
Es el objeto de la presente invención
proporcionar un método que permite el cultivo de células primarias
de ave en medio exento de suero, en donde el método permite (I) el
crecimiento de las células durante la fase logarítmica y (II) el
mantenimiento de las células en la fase estacionaria. Además, si las
células son células adherentes, el medio puede permitir
preferiblemente (III) la fijación de las células adherentes a la
superficie del recipiente de cultivo de las células. Es un objeto
adicional de la presente invención proporcionar un método para la
amplificación de poxvirus utilizando células primarias de ave en
condiciones exentas de suero.
La presente invención proporciona un método para
la amplificación de un poxvirus que comprende el cultivo de células
primarias de ave, que permiten la replicación productiva del
poxvirus, en un medio exento de suero que comprende un factor
seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y
factores de fijación. Subsiguientemente, las células se infectan
con el poxvirus y se cultivan en medio exento de suero hasta que se
produce el virus progenie. Células primarias de ave que crecen
naturalmente como células adherentes se fijan a la superficie del
recipiente del cultivo de células después de la siembra y crecen en
una fase logarítmica hasta que se forma una monocapa y las células
en reposo pueden mantenerse en el medio utilizado durante la
fijación y el crecimiento logarítmico de las células.
El método descrito no está restringido a células
que forman monocapas. De acuerdo con una realización alternativa,
el método puede utilizarse para todos los restantes tipos de células
primarias de ave, tales como células que crecen naturalmente en
cultivo de suspensión (v.g. linfocitos u otros tipos de células de
la sangre) o células que se desarrollarían naturalmente como
células adherentes pero que se han adaptado a crecimiento en cultivo
de suspensión.
Como se demuestra más adelante, las células
primarias de ave pueden utilizarse también para la amplificación
exenta de suero de poxvirus que podrían ser útiles como vacunas.
Resultó inesperado que células primarias de ave
que crecen naturalmente como células adherentes (I) pueden fijarse
eficazmente a la superficie del recipiente de cultivo de células sin
formar cantidades inaceptables de agregados y (II) pueden
desarrollarse en la fase logarítmica en ausencia de suero, dado que
se creía generalmente que las células primarias de ave son
dependientes de una multitud de factores y componentes diferentes
comprendidos en el suero. Además, se creía que las células
adherentes forman agregados no viables que no se fijan a la
superficie del recipiente de cultivo de células, cuando se cultivan
en medio exento de suero. Así pues, resultó inesperado que sea
suficiente añadir a un medio exento de suero un factor seleccionado
del grupo constituido por factores de crecimiento y factores de
fijación a fin de conseguir la fijación y el crecimiento de células
de ave primarias adherentes. Además, fue también inesperado que las
células primarias de ave cultivadas en cultivo de suspensión pueden
desarrollarse con el medio utilizado en el método de acuerdo con la
presente invención. Adicionalmente, fue sorprendente que las
células primarias de ave, tales como Fibroblastos de Embrión de
Pollo (CEF) pueden cultivarse para fijarse a la superficie de una
recipiente de cultivo de células sin formar cantidades inaceptables
de agregados en un medio exento de suero que comprende un factor
seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y
factores de fijación, dado que se sabía que las células de ave
crecen extremadamente mal en medio exento de suero que no comprende
factores de crecimiento o factores de fijación, es decir, fue
inesperado que las deficientes propiedades de crecimiento de las
células primarias de ave podían mejorarse significativamente por
adición de un factor seleccionado de factores de crecimiento y
factores de fijación a un medio exento de suero.
El término "células primarias" como se
utiliza en la presente descripción, es bien conocido para las
personas expertas en la técnica. Sin restringirse a la definición
siguiente, el término "células primarias" se refiere
generalmente a células que han sido aisladas recientemente de un
tejido, órgano u organismo animal o humano, en donde las células no
son capaces de replicarse continua e indefinidamente y dividirse.
Usualmente, las células primarias se dividen en cultivo menos de
100 veces, a menudo menos de 50 veces, y con frecuencia menos de 25
veces. Así pues, las células primarias no se han sometido a un
suceso de inmortalización. Ejemplo de células primarias son los
linfocitos de cordón umbilical y fibroblastos humanos o animales.
Ejemplos preferidos que ilustran la invención son fibroblastos de
ave, muy preferiblemente Fibroblastos de Embrión de Pollo (CEF).
Las personas expertas en la técnica son bien
conocedoras de métodos indicativos del modo en que pueden aislarse
células primarias. Generalmente, los cultivos de células primarias
se derivan directamente de tejidos, órganos o embriones. Los
tejidos, órganos o embriones se someten a tratamiento con proteasas
para obtener células simples. Las células primarias de ave se
cultivan luego de acuerdo con el método conforme a la presente
invención en condiciones de cultivo in vitro.
Más específicamente, las células CEF se obtienen
a partir de embriones de pollo digeridos con proteasas. Las células
CEF se desarrollan óptimamente como células adherentes fijadas a una
superficie sólida de soporte de células. Las células inician la
replicación y establecen una monocapa. Si las células CEF (después
de la digestión del embrión) se cultivan in vitro con un
medio de cultivo estándar sin suero animal, las células se fijarán
ocasionalmente a la superficie sólida de soporte de las células,
pero no se replicarán para formar una monocapa de células
confluente y con el tiempo se desprenderán lentamente de la
superficie sólida de soporte del cultivo. En contraste, si las
células CEF se cultivan de acuerdo con el método de la presente
invención, las células se fijan al soporte sólido, crecen en la
fase logarítmica hasta que se forma una monocapa y pueden mantenerse
en la fase estacionaria durante varios días.
El término "cultivo de células" en un medio
exento de suero en el contexto de células primarias adherentes hace
referencia a la siembra de las células en el recipiente de cultivo
en un medio exento de suero, al crecimiento de las células en un
medio exento de suero en la fase logarítmica hasta que se forma una
monocapa y/o al mantenimiento de las células en un medio exento de
suero tan pronto como se forma la monocapa. Más preferiblemente, el
término "cultivo de células" en un medio exento de suero hace
referencia a un método en el cual la totalidad de los pasos arriba
mencionados se realizan con medio exento de suero, de tal manera que
no está presente ningún producto de suero animal durante el proceso
completo de cultivo de las células. Así pues, en un significado más
general, el término "cultivo de células en un medio exento de
suero" hace referencia al hecho de que todos los medios que
conducen a la formación de una monocapa son medios exentos de suero.
Los medios utilizados en la totalidad de los pasos anteriores
pueden comprender un factor seleccionado de factores de crecimiento
y factores de fijación. No obstante, podría ser suficiente añadir un
factor de este tipo únicamente a los medios utilizados para la
fijación de las células y/o el crecimiento de las células en
condiciones logarítmicas.
El término "cultivo de células" en un medio
exento de suero en el contexto de las células que crecen en cultivo
de suspensión hace referencia a la siembra de las células en el
recipiente de cultivo en un medio exento de suero, el crecimiento
de las células en un medio exento de suero en la fase logarítmica
y/o el mantenimiento de las células en medio exento de suero tan
pronto como se alcanza la densidad de saturación a la cual ya no se
produce replicación alguna. Más preferiblemente, el término
"cultivo de células" en un medio exento de suero se refiere a
un método en el cual la totalidad de los pasos arriba mencionados se
realizan con medio exento de suero, de tal manera que no está
presente producto de suero animal alguno durante el cultivo completo
de las células. Los medios utilizados en la totalidad de los pasos
anteriores pueden comprender preferiblemente un factor seleccionado
del grupo de factores de crecimiento. Sin embargo, podría ser
suficiente añadir un factor de este tipo únicamente a los medios
utilizados para la siembra de las células y/o el crecimiento de las
células en condiciones logarítmicas. Como se explica más adelante
con mayor detalle, podía ser posible también cultivar células que
crecen normalmente como células fijadas asimismo como células de
cultivo en suspensión si se seleccionan condiciones de incubación
apropiadas (v.g. por aplicación de incubación "por olas"). El
método de acuerdo con la presente invención se aplica también para
este tipo de incubación.
El término medio "exento de suero" hace
referencia a cualquier medio de cultivo de células que no contiene
sueros de origen animal o humano. Medios de cultivo de células
adecuados son conocidos por las personas expertas en la técnica.
Estos medios comprenden sales, vitaminas, tampones, fuentes de
energía, aminoácidos y otras sustancias. Un ejemplo de un medio
adecuado para el cultivo exento de suero de células CEF es el medio
199 (Morgan, Morton y Parker, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73,
1; obtenible, inter alia, de Life Technologies).
Los medios utilizados de acuerdo con el método
de la presente invención, en particular los medios utilizados para
células adherentes tales como células CEF, contienen un factor
seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y
factores de fijación. Un ejemplo de un factor de fijación es
fibronectina.
Para células que crecerían naturalmente como
células adherentes, y que, sin embargo, se cultivan no obstante en
cultivo de suspensión (lo cual es posible, v.g. para las células
CEF), es particularmente preferido utilizar un factor seleccionado
del grupo de factores de crecimiento. Ejemplos de factores de
crecimiento útiles para este tipo de cultivo son factor de
crecimiento recombinante epidérmico (EGF) de bovino, ratón, pollo o
humano. Es muy preferido el EGF recombinante humano
(rh-EGF) (Chemicon Inc., número de catálogo:
GF001).
Para células que crecen naturalmente en cultivo
de suspensión, el medio puede comprender preferiblemente un factor
seleccionado del grupo de factores de crecimiento que incluyen EGF.
Muy preferiblemente, los factores de crecimiento para este tipo de
células son factores específicos para células no adherentes.
Ejemplos de tales factores de crecimiento son interleuquinas,
GM-CSF, G-CSF y otros. Las personas
expertas en la técnica pueden determinar fácilmente, por
experimentación rutinaria, qué tipo de factor es adecuado para cada
tipo de células.
Si el factor añadido al medio exento de suero es
EGF, en particular rh-EGF, el mismo se añade
preferiblemente al medio en una concentración de 1 a 50 ng/ml, más
preferiblemente 5 a 20 ng/ml. Sin embargo, las personas expertas en
la técnica son sabedoras del hecho de que tipos diferentes de
células pueden requerir una concentración algo diferente de EGF en
el suero para resultados óptimos.
Si el factor de fijación añadido al medio exento
de suero es fibronectina: (v.g. Chemicon Int.; fibronectina de
plasma humano; número de catálogo FC010), el mismo se añade
preferiblemente al medio en una concentración de 1 a 50, más
preferiblemente 1 a 10 \mug/cm^{2} de superficie del recipiente
de cultivo de células. No obstante, las personas expertas en la
técnica son sabedoras del hecho de que diferentes tipos de células
pueden requerir una concentración un tanto diferente de fibronectina
en el suero para resultados óptimos.
De acuerdo con la presente invención, es
suficiente añadir un solo factor seleccionado de factores de
crecimiento y factores de fijación al medio, en particular si las
células son células adherentes. No obstante, es también posible
añadir dos o más factores seleccionados de factores de crecimiento y
factores de fijación al medio. El medio puede comprender
preferiblemente EGF y fibronectina, preferiblemente en los
intervalos de concentración arriba definidos, en particular si las
células primarias son células adherentes tales como células CEF.
El medio puede comprender además uno o más
aditivos seleccionados de extracto microbiano, extracto de plantas
y extracto de un animal no mamífero. El extracto microbiano es
preferiblemente extracto de levadura o ultrafiltrado
"yeastolate". El extracto de plantas es preferiblemente
extracto de arroz o extracto de soja. El extracto de animal no
mamífero es preferiblemente extracto de peces.
Puede añadirse asparagina al medio exento de
suero disponible comercialmente al que se ha añadido un factor
seleccionado de factores de crecimiento y factores de fijación. Más
preferiblemente, se añade asparagina al medio que se utiliza
durante la infección con virus (véase más adelante). Los medios
comerciales exentos de suero comprenden usualmente asparagina en un
intervalo de concentración de 0,3 a 1,0 mM. Cantidades preferidas
de asparagina para suplementar el medio están comprendidas en el
intervalo de 0,5 a 1,5 mM. Es muy preferido un suplemento de
asparagina 1 mM. La concentración total de asparagina en el medio es
preferiblemente menor que 2 mM, y más preferiblemente está
comprendida en un intervalo de 0,8 a 1,8 mM. La concentración más
preferida de asparagina en el medio es 1,3 mM.
Además, puede añadirse preferiblemente glutamina
al medio. Más preferiblemente, se añade glutamina al medio que se
utiliza durante la infección con virus (véase más adelante).
Cantidades preferidas de glutamina para suplementar el medio están
comprendidas en un intervalo de 1 a 5 mM, más preferiblemente en un
intervalo de 2 a 4 mM. Los intervalos indicados corresponden
también a las concentraciones totales preferidas en el medio, dado
que la mayoría de los medios disponibles comercialmente no contienen
glutamina.
La invención se refiere a un método para la
amplificación de un poxvirus que comprende los pasos siguientes: en
el primer paso, se cultivan células primarias de ave de acuerdo con
el método arriba descrito, es decir se cultivan células primarias
de ave en un medio exento de suero que comprende un factor
seleccionado del grupo constituido por factores de crecimiento y
factores de fijación, dependiendo del tipo de células. Todas las
condiciones, definiciones, realizaciones preferidas y también el
orden de realizaciones preferidas a muy preferidas dadas
anteriormente para la descripción del método para el cultivo de
células primarias de ave, se aplican para la definición del primer
paso del método para la amplificación de poxvirus de acuerdo con la
presente invención. En un segundo paso, las células primarias de ave
se infectan con el poxvirus. En el tercer paso, las células
infectadas se incuban en medio exento de suero hasta que se produce
el virus progenie.
El término "amplificación de un poxvirus"
se utiliza para dejar claro que el método de acuerdo con la presente
invención se utiliza preferiblemente para aumentar la cantidad de
virus debida a una replicación viral productiva del virus en las
células infectadas. Dicho de otro modo, la relación de virus de
salida a virus de entrada debe ser preferiblemente superior a 1.
Así pues, de acuerdo con la presente invención, dichas células
primarias de ave se seleccionan para un poxvirus específico, en el
cual el virus es capaz de replicarse productivamente. El término
"replicación reproductiva" hace referencia al hecho de que el
virus específico se replica en la célula primaria de ave específica
en tal grado que se produce virus infeccioso progenie, en donde la
relación de virus de salida a virus de entrada es superior a 1.
Las personas expertas en la técnica saben qué
virus pueden replicarse productivamente en cada tipo de células
primarias. Generalmente, las células primarias pueden ser
fibroblastos de prepucio humano si el virus a amplificar es el
citomegalovirus humano; las células primarias pueden ser células CEF
si el virus a amplificar es el virus del sarampión, virus de las
paperas, virus de la rabia, virus de la encefalitis japonesa, virus
de la fiebre amarilla, virus de la gripe o, de acuerdo con la
invención, un poxvirus tal como el virus Vaccinia, en particular el
virus Vaccinia modificado Ankara (MVA).
La infección de células primarias de ave de
acuerdo con el segundo paso de la presente invención es conocida
por las personas expertas en la técnica. A modo de ejemplo, el virus
puede añadirse simplemente al medio. Alternativamente, el medio
puede eliminarse y el virus puede añadirse a medio nuevo, el cual se
añade a su vez a las células. Para obtener una infección eficiente,
la cantidad de la suspensión virus/medio debería ser lo más baja
posible a fin de obtener una alta concentración de virus. Después de
la fijación del virus, puede añadirse medio adicional.
En el tercer paso de la invención, las células
se cultivan en medio exento de suero hasta que se produce el virus
progenie.
El medio exento de suero que se utiliza en el
segundo y el tercer pasos del método para la amplificación de un
poxvirus de acuerdo con las reivindicaciones, puede ser el mismo
medio que se ha utilizado ya anteriormente, es decir un medio
exento de suero que comprende un factor seleccionado de factores de
crecimiento y factores de fijación, dependiendo del tipo de
células. No obstante, para ahorrar costes, es también posible
utilizar en uno o ambos de los pasos segundo y tercero un medio
exento de suero que no contiene un factor seleccionado de factores
de crecimiento y factores de fijación.
Durante todas las etapas, el medio puede
complementarse con asparagina y/o glutamina como se ha expuesto
anteriormente, siendo la concentración total de asparagina en el
medio preferiblemente como se ha definido arriba.
El virus progenie puede concentrarse y
purificarse de acuerdo con métodos conocidos por las personas
expertas en la técnica.
Resultó inesperado que pueden amplificarse
poxvirus en células cultivadas en condiciones exentas de suero,
dado que las células crecen muy deficientemente con el medio exento
de suero conocido. Así pues, era de esperar que el estrés adicional
asociado con una infección de poxvirus podría matar las células ya
estresadas antes que se alcanzara una amplificación significativa
del poxvirus.
El poxvirus es preferiblemente un ortopoxvirus.
Ejemplos de ortopoxvirus son poxvirus de aves y virus Vaccinia.
El termino "poxvirus de aves" hace
referencia a cualquier poxvirus de ave, tal como el poxvirus Fowl,
poxvirus de los canarios, un copoxvirus, poxvirus Mynah, poxvirus
de paloma, poxvirus de la psitacosis, poxvirus de codorniz,
poxvirus de pavo real, poxvirus de pingüino, poxvirus de gorrión,
poxvirus de estornino y poxvirus de pavo común. Poxvirus de ave
preferidos son el poxvirus de los canarios y el poxvirus Fowl.
Un ejemplo de un poxvirus de canario es la cepa
Rentschler. Una cepa de poxvirus de canario purificada en placas,
denominada ALVAC, documento US 5766598) fue depositada de acuerdo
con los términos del tratado de Budapest en la American Type
Culture Collection (ATCC), número de acceso VR-2547.
Otra cepa de poxvirus de canario es la cepa de la vacuna de
poxvirus de canario comercial designada LF2 CEP 525 24 10 75,
disponible del Institute Merieux, Inc.
Ejemplos de un poxvirus Fowl son las cepas
FP-1, FP-5 y TROVAC (US 5766598).
FP-1 es una cepa Duvette modificada para ser
utilizada como vacuna en pollos de un solo día. La cepa es una cepa
de vacuna del poxvirus Fowl comercial designada 0 DCEP
25/CEP67/2309 octubre 1980, y está disponible del Institute Merieux,
Inc. FP-5 es una cepa de vacuna de poxvirus Fowl
comercial procedente de embrión de pollo, disponible de American
Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison,
Wisconsin, licencia veterinaria de los Estados Unidos No. 165, No.
de serie 30.321.
Ejemplos de cepas de virus Vaccinia son las
cepas Temple of Heaven, Copenhaguen, París, Budapest, Dairén, Gam,
MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Berna, Patwadangar, BIEM,
B-15, Lister, EM-63, New York City
Board of Health, Elstree, Ikeda y WR. La invención se lleva a cabo
preferiblemente con el virus Vaccinia modificado Ankara (MVA)
(Sutter, G. et al. Vaccine 12:1032-40). Una
cepa típica de MVA es MVA 575, que ha sido depositada en la
European Collection of Animal Cell Cultures bajo el número de
depósito ECACC V00120707. Es muy preferida MVA-BN o
un derivado de la misma, que ha sido descrito en la solicitud PCT
PCT/EP01/13628 presentada en la Oficina Europea de Patentes en
fecha 22 de noviembre de 2001, titulada "Modified Vaccinia Ankara
Virus Variant". MVA-BN ha sido depositada en la
Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número de
depósito ECACC V00083008. Las características de
MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que
permiten evaluar si un MVA es MVA-BN o un derivado
del mismo y métodos que permiten obtener MVA-BN o un
derivado del mismo se describen en la Solicitud PCT a que se ha
hecho referencia arriba.
El virus a amplificar de acuerdo con el método
de la presente invención puede ser un virus de tipo salvaje, un
virus atenuado o un virus recombinante.
El término "virus recombinante" hace
referencia a cualquier virus que tenga insertado en el genoma viral
un gen heterólogo que no forma parte naturalmente del genoma viral.
Un gen heterólogo puede ser un gen terapéutico; un gen que codifica
un péptido que comprende al menos un epítope para inducir una
respuesta inmunológica, una casete de expresión antisentido o un
gen de ribozima. Métodos para construir virus recombinantes son
conocidos por las personas expertas en la técnica. El vector de
poxvirus más preferido es MVA, en particular MVA 575 y
MVA-BN (véase arriba).
Un "virus atenuado" es un virus originario
de un virus patógeno pero que, después de la infección del organismo
hospedador, conduce a una mortalidad y/o morbilidad menores
comparado con el virus parental no atenuado. Ejemplos de poxvirus
atenuados son conocidos por las personas expertas en la técnica. Un
ejemplo de un virus Vaccinia atenuado es la cepa MVA, en particular
la cepa que ha sido depositada en la ECACC con el número de depósito
V00083008 (véase arriba).
Como se ha indicado anteriormente, para poxvirus
las células primarias de ave pueden ser preferiblemente células CEF
o fibroblastos primarios de embrión de pato. De nuevo, las personas
expertas en la técnica son sabedoras de qué células primarias de
ave son adecuadas para la amplificación de cualesquiera poxvirus.
Las células CEF son particularmente preferidas para la
amplificación de MVA. Para amplificación de MVA en células CEF, una
realización preferida consiste en seleccionar uno o dos de los
factores seleccionados de EGF y fibronectina.
Si el método de acuerdo con la presente
invención se utiliza para la amplificación de MVA en células CEF,
se prefiere que el pH inicial del medio esté comprendido en el
intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5. Es
particularmente preferido un pH inicial de 7,0.
De acuerdo con el método de la presente
invención, los poxvirus, en particular los virus Vaccinia, muy
preferiblemente cepas MVA tales como MVA-BN, se
obtienen en condiciones exentas de suero.
Debido al método de amplificación del virus, las
composiciones que comprenden el poxvirus están exentas de
cualesquiera productos y/o agentes infecciosos comprendidos en
sueros animales. En contraste, las composiciones que comprenden
virus producidos de acuerdo con los métodos convencionales
comprenden compuestos residuales derivados de suero animal. Éste es
especialmente el caso para las composiciones que comprenden poxvirus
tales como cepas de virus Vaccinia, en particular cepas de MVA tales
como MVA-BN.
Si el poxvirus es un virus de tipo salvaje o un
virus atenuado, el poxvirus puede utilizarse para la vacunación
contra el virus como tal. Para este propósito son particularmente
preferidos los virus atenuados. Si el virus es un virus
recombinante que expresa proteínas expresadas por genes heterólogos
al genoma viral, es posible vacunar contra el virus como tal y/o
contra la proteína heteróloga expresada. Si el virus recombinante
expresa un gen terapéutico tal como un RNA antisentido o una
ribozima, el virus puede utilizarse como medicamento.
\vskip1.000000\baselineskip
Si no se indica otra cosa en los ejemplos que
siguen, el medio exento de suero es medio 199 (Life Technologies).
El EGF añadido es usualmente EGF humano recombinante obtenido de
Chemicon. La fibronectina (FN) se obtuvo de Chemicon.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvieron huevos fertilizados exentos de
patógenos específicos (SPF) no más de 12 días a 4ºC. Los huevos se
pusieron en una incubadora y se incubaron durante
10-12 días a 37,8ºC \pm 8ºC. Se preparó una
cápsula Petri para un máximo de 11 huevos con 10-20
ml de PBS. Los huevos se pusieron en una caja de huevos exclusiva y
se trataron extensamente con Bacillol para esterilizar el exterior
de la cáscara del huevo. Después del secado, se practicó un
orificio en los huevos y se eliminó cuidadosamente la cáscara. Se
puso aparte la membrana corioalantoica. Los embriones se levantaron
por las patas y se cortaron sus cabezas. Los embriones se
transfirieron luego a las cápsulas de Petri preparadas. Después de
separar las patas, los troncos se lavaron de nuevo con PBS. Se
pusieron un máximo de 11 troncos en una jeringuilla de plástico de
20 ml y se exprimieron en un matraz Erlenmeyer. Se añadieron 5 ml
de solución Tripsina/EDTA precalentada (37ºC) por tronco y la
solución se agitó durante 15 minutos con medio exento de suero a la
temperatura ambiente utilizando un agitador magnético. Las células
tripsinizadas se vertieron a través de una capa de tela metálica en
un vaso de precipitados. Se transfirieron todas las células a un
solo tubo de centrífuga de 225 ml y se centrifugaron a 20ºC, 470 x g
durante 7 minutos en una centrífuga de sobremesa. Después de
desechar el sobrenadante, se resuspendió el sedimento en 1 ml de
medio de crecimiento nuevo precalentado (37ºC) exento de suero que
comprendía 10 ng/ml de EGF por tronco mediante pipeteo hacia arriba
y hacia abajo concienzudamente. Se añadió medio de crecimiento nuevo
precalentado (37ºC) exento de suero que comprendía 10 ng/ml de EGF
a un volumen total de 150 ml. Se repitió el paso de centrifugación.
Se retiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió como se ha
descrito arriba. Se añadió medio de crecimiento nuevo precalentado
(37ºC) exento de suero que comprendía 10 ng/ml de EGF hasta un
volumen total de 100 ml. Se sometieron a recuento las células como
se describe en la sección siguiente. Las cantidades requeridas de
células se sembraron en frascos rotativos con medio de crecimiento
exento de suero que comprendía 10 ng/ml de EGF y se incubaron a
37ºC. Las células estaban listas para la infección de virus el día 4
después de la siembra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomó una muestra de la suspensión de células
(véase la sección preparación de CEF) y se mezcló con un volumen de
azul Tripán, dando como resultado un recuento final de células de 20
a 100 células por 16 cuadrados pequeños de un hemocitómetro
suministrado por Fuchs-Rosenthal bajo el nombre de
Hemocitómetro Fast Read 102 (dilución 1:2-1:10). La
muestra se tomó inmediatamente después de la resuspensión de las
células a fin de impedir la reagregación/sedimentación de las
células. Después de unos cuantos minutos de tiempo de incubación con
azul Tripán a fin de obtener el tinte adecuadamente en las células
muertas, se añadieron 10 \mul de la suspensión de células al
hemocitómetro. Únicamente se contaron las células vivas blancas bajo
un microscopio óptico utilizando un objetivo 10x. En total, se
contaron 3 cuadrados grandes representativos constituidos por 3 x 16
cuadrados pequeños. De cada cuadrado grande se incluyeron en el
recuento únicamente 2 bordes en forma de L. Se tomó el promedio de
células contadas y se calculó la concentración final de células
utilizando la fórmula siguiente: Número medio de células x dilución
x 10^{4} = células/ml. Finalmente, se diluyó la suspensión de
células a la concentración de trabajo
deseada.
deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
En experimentos preliminares, los inventores han
demostrado que las células CEF no se fijan a la superficie de
recipientes de cultivo de células si se utiliza medio 199 que no
comprende FCS. Además, no se forma monocapa alguna. Se observa la
formación de monocapas normales si se utiliza medio 199 que contiene
7% de FCS. Se investigó si se puede lograr la fijación y el
crecimiento de las células CEF en medio exento de suero 199 si se
añaden aditivos al medio.
Los aditivos sometidos al test comprenden Factor
de Crecimiento Epidérmico Recombinante (r-hEGF) y
fibronectina (FN).
Para los experimentos, se cultivaron células CEF
en medio 199 con los diferentes aditivos solos o en combinación.
Como control negativo sirvieron células que crecían en medio 199 sin
aditivo alguno. Como control positivo sirvieron células cultivadas
en medio 199 que comprendía 7% de FCS. Todos los experimentos se
condujeron en placas de cultivo de células de 6 pocillos con 3 ml
de medio. Los aditivos se trataron de acuerdo con las hojas de
datos del suministrador antes de ser utilizados para el cultivo de
células. Se dejó que se adsorbiera la fibronectina a la superficie
de las placas de cultivo de células durante 25 minutos antes de su
utilización. Se utilizó fibronectina en una concentración de 3
\mug/cm^{2} y se utilizó EGF en una concentración de 10 ng/ml.
Antes de añadir cualesquiera células, las placas de cultivo de
células se pusieron en contacto con el medio que contenía
fibronectina durante 25 minutos.
Cada medio de cultivo más los aditivos a someter
al test se cultivó por duplicado. Las placas de cultivo de células
de 6 pocillos se incubaron durante 4 días a 37ºC. Desde el día 1 al
4, se evaluó la fijación y el crecimiento de las células utilizando
un microscopio.
Para el control positivo, se ha observado una
fijación y crecimiento normales de las células CEF. Para el medio
199 sin aditivos no pudo observarse prácticamente fijación alguna de
las células CEF.
Se observó una mejora crucial en la formación de
una monocapa por el uso de EGF añadido a medio 199 comparado con
medio 199 sin aditivos. Se encontró que las células se fijaban y
formaban la morfología típica de los fibroblastos. Adicionalmente,
pudo observarse un crecimiento continuo a lo largo de todo el
periodo de 4 días.
\newpage
Se logró también una mejora de fijación de las
células por adición de fibronectina al medio de cultivo. La adición
de ambos, EGF y fibronectina dio como resultado una leve mejora
comparada con la adición de EGF sólo y fibronectina sólo.
En suma, debe deducirse que la formación de
monocapas de células CEF en el medio 199 exento de suero puede ser
soporta por el uso de los aditivos EGF y fibronectina.
Además, en series de experimentos paralelas se
sembraron 1 x 10^{7} células CEF en medio que comprendía 10% de
FCS, medio que no comprendía FCS pero comprendía EGF. El número de
células se contó dos días después de la siembra. El número de
células ascendía a 42%, 6% y 44%, respectivamente, del número de
células utilizado para la siembra. Así pues, los resultados para
las células sembradas en medio exento de suero que comprendía EGS
eran tan satisfactorios como los resultados obtenidos con medio FCS
y significativamente mejores que con medio que no contenía suero ni
EGF. Adicionalmente, el medio que comprendía EGF se comparó con
diversos medios estándar exentos de suero, tales como DMEM,
Opti-Mem o 293-SFM. A este fin, se
sembraron 1 x 10^{7} células CEF en los diversos medios exentos
de suero y se cultivaron durante 4 días. El número de células
cultivadas en el medio que comprendía EGF era 24, 5 y 12 veces
mayor que el número de células cultivadas en DMEM, Opti.Mem y
293-SFM exentos de suero, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron células CEF cuatro días después de
la siembra en frascos rotativos. En dicho momento, las células han
crecido hasta una monocapa adecuada. Las células se infectaron con
una MOI de 1 ó 0,1 MVA. Para la infección, el medio de crecimiento
se retiró de los frascos. La cantidad deseada de virus por frasco
rotativo se diluyó en 20 ml del medio de infección apropiado sin
suero. En esta etapa, el medio exento de suero puede comprender o
no un factor seleccionado de factores de crecimiento y fibronectina.
Se incubaron las células con el virus durante 1 hora a 37ºC a
0,3-0,5 rpm en una incubadora de frascos rotativos.
Después de una hora, las frascos rotativos se llenaron con el medio
de crecimiento exento de suero apropiado hasta un volumen total de
200 ml por frasco rotativo. En esta etapa, el medio exento de suero
puede comprender o no un factor seleccionador de factores de
crecimiento y fibronectina. La replicación del virus cesó después de
48 ó 72 horas por congelación de las frascos rotativos a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las frascos rotativos congeladas se
descongelaron a la temperatura ambiente. Durante el proceso de
descongelación, las células se desprenden de la superficie de las
frascos rotativos y pueden retirarse mecánicamente por agitación de
los frascos mediante sacudidas. La suspensión virus/células se
recogió y se dividió en partes alícuotas a volúmenes menores. Para
liberar el virus de las células infectadas, las suspensiones
virus/células se congelaron/descongelaron 3 veces. Las muestras de
virus procedentes de la congelación/descongelación se utilizaron
para la titulación.
Las titulaciones se realizaron sobre células CEF
procedentes de la primera pasada en placas de 96 pocillos,
utilizando diluciones de 10 veces de la suspensión viral y 8
réplicas por dilución. Después de la infección, las células
infectadas se visualizaron con un anticuerpo
anti-virus Vaccinia y una solución de tinción
apropiada.
En detalle, el día cero del ensayo, las células
CEF primarias (véase la sección "preparación de células
Fibroblasto de Embrión de Pollo (ECF)") se tripsinizaron y se
contaron como se describe en la sección "recuento de la densidad
de células". Las células se diluyeron a 1 x 10^{5} células/ml
en medio RPMI con 7% FCS. Después de esta dilución, se sembraron
100 \mul en cada pocillo de las placas de 96 pocillos utilizando
una pipeta multicanal. Las células se incubaron durante una noche a
37ºC y 5% de CO_{2}. Las muestras de virus a titular (véase la
sección "preparación de extractos virales a partir de células CEF
infectadas") se diluyeron serialmente en pasos de 10 veces de
10^{-1}-10^{-12} utilizando RPMI sin suero. Esta
dilución seriada se lleva a cabo añadiendo 900 \mul de RPMI a
todos los pocillos de una placa de 96 pocillos profundos. Se
añadieron 100 \mul de la muestra de virus a todos los pocillos de
la primera fila y se mezclaron. Después de ello, se transfirieron
100 \mul de cada muestra a la fila siguiente de pocillos
utilizando una pipeta multicanal. Las placas de 96 pocillos
profundos se mantuvieron en hielo mientras se realizaban las
diluciones. Las placas se incubaron durante 5 días a 37ºC y 5%
CO_{2} para permitir el progreso de la infección. Después de 5
días, se tiñeron inmunohistoquímicamente las células con un
anticuerpo específico del virus Vaccinia. Para la tinción, se
retiró se retiró el medio de cultivo volcando la placa de 96
pocillos sobre un recipiente. Las células se fijaron con 100
\mul/pocillo de mezcla metanol/acetona (1:1) durante 10 minutos a
la temperatura ambiente. La solución de fijación se retiró y se
secaron las placas al aire. Después del secado, se lavaron las
células una sola vez con PBS y se incubaron durante una hora a la
temperatura ambiente con el anticuerpo del virus Vaccinia
(anticuerpo Anti- virus Vaccinia, policlonal de conejo, fracción IgG
(Quartett, Berlín, Alemania #9503-2057) diluido a
1:1000 en PBS con 3% de FCS. Después de retirar el anticuerpo, las
células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 1 hora
a temperatura ambiente con anticuerpo anti-conejo
acoplado a HRP (par de Peroxidasa de Rábano Picante) (anticuerpo
anti-IgG de conejo, policlonal de cabra acoplado a
HRP (Promega, Mannheim, Alemania #W4011) diluido hasta 1:1000 en PBS
con 3% FCS. Una vez más, se lavaron las placas con PBS y se tiñeron
con o-dianisidina o TMB. Para utilización del método
de tinción con o-dianisidina, las células se
incubaron con 100 \mul/pocillo de solución de tinción constituida
por 5 mg de o-dianisidina y 180 \mul de
H_{2}O_{2} al 30% por 60 ml de tampón
fosfato-citrato 50 mM. Las células se incubaron a
la temperatura ambiente hasta que se tiñeron de color pardo. Las
células infectadas eran claramente visibles al cabo de
1-3 horas. Utilizando el método de tinción con TMB,
se incubaron las células con 30 \mul/pocillo de TMB 1,2 mM
(Seramun Diagnostica GmbH). Después de 15 minutos de tiempo de
incubación, la solución de TMB se retiró y las células se lavaron
una sola vez con PBS. Las células infectadas aparecen de color azul
oscuro. Se registraron las placas respecto a células infectadas. Se
calculó el título de virus utilizando la fórmula de Spearman y
Kaerber. Para el cálculo del valor TCID_{50}, cada pocillo que
contenía células pardas o azules se marcó como positivo. Dado que
los parámetros de ensayo se mantienen constantes, se utilizó la
fórmula simplificada siguiente:
a = factor de dilución de la última
columna, en
la
cual la totalidad de los 8 pocillos son
positivos
X_{a} = número de pocillos positivos en la
columna a+1
X_{b} = número de pocillos positivos en la
columna a+2
X_{c} = número de pocillos positivos en la
columna a+3
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó una densidad óptima de siembra de
células de 7,5 x 10^{7} células/850 cm^{2} (superficie de una
frasco rotativo) para el crecimiento de CEF exentas de suero. Las
células eran capaces de construir una monocapa satisfactoria sin
que se formaran grumos de gran tamaño el día 4 después de la siembra
y podían infectarse en este momento.
Se realizaron experimentos para determinar el
nivel óptimo de inoculación viral y el grado de la infección para
la producción máxima de MVA a partir de células CEF cultivadas en un
proceso exento de suero. Las células CEF se sembraron a una
densidad de 7,5 x 10^{7} células/850 cm^{2} en medio de acuerdo
con la presente invención. El día 4 después de la siembra, se
infectaron las células con cantidades diferentes de MVA en el
intervalo de 0,05 a 1,0 TCID_{50}/célula de MVA. Los resultados
óptimos se obtuvieron con 0,1 TCID_{50}/célula de MVA.
\vskip1.000000\baselineskip
MVA y otras infecciones de poxvirus son
sensibles a pH inferior a 7,0. Los poxvirus no son estables en pH
ácido y se recomienda que los poxvirus purificados se guarden en una
solución tamponada por encima de pH 7,0 para asegurar la
estabilidad e integridad viral durante el almacenamiento como una
preparación viral líquida. Se realizaron experimentos para
determinar el efecto sobre la producción de virus cuando se realizó
la infección a pH inicial diferente. Se sembraron frascos rotativos
con células CEF de la manera usual en medio exento de suero que
comprendía 10 ng/ml de EGF más L-glutamina 4 mM y se
cultivaron durante 4 días. Las células se infectaron con MVA a 0,1
TCID_{50}/célula en medio exento de suero que comprendía 10 ng/ml
de EGF más L-glutamina y asparagina 1 mM a valores
de pH diferentes comprendidos entre 6,5 y 9,0. A las 72 horas
después de la infección, se midió el pH del medio y se determinaron
los rendimientos de virus por titulación de extractos de células de
la manera usual. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente,
que muestra el efecto del pH inicial del medio al comienzo de la
infección sobre la producción de virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las infecciones realizadas en medio exento
de suero que comprendía 10 ng/ml de EGF suplementado con
L-glutamina y asparagina, la producción viral era
relativamente constante con un pH inicial de 7,0 a 8,5, pero las
producciones virales eran bajas al pH inicial de 6,5 y 9,0. El
rendimiento óptimo se obtuvo a pH inicial de 7,0. Los medios
estándar exentos de suero disponibles comercialmente tienen por lo
general un pH de 7,4. Por tanto, el ajuste del pH del medio exento
de suero a 7,0 puede contribuir a mejorar la producción de
virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimentos preliminares han revelado que la
cantidad de asparagina puede limitarse durante el cultivo de
células CEF y la infección de las células CEF con MVA. Para resolver
el empobrecimiento de asparagina en medio exento de suero durante
el proceso de cultivo e infección, se añadió asparagina adicional al
medio como suplemento antes de infectar las células CEF. Para
determinar la cantidad óptima de asparagina a fin de suplementar el
medio con la misma, se sembraron frascos rotativos con células CEF
(7,5 x 10^{7} células/850 cm^{2}) en medio exento de suero que
comprendía 10 ng/ml de EGF más L-glutamina 4 mM.
Cuatro días después de la siembra, se infectaron las células con
MVA a 0,1 TCID_{50}/célula en medio exento de suero que comprendía
10 ng/ml de EGF más L-glutamina 4 mM suplementado
con concentraciones diferentes de asparagina (0,5, 1,0 y 1,5 mM).
La replicación viral se paró a las 72 horas después de la infección
y se determinaron los títulos de virus. Los resultados se muestran
en la tabla siguiente que demuestra la producción de MVA a partir de
células CEF suplementadas con niveles diferentes de asparagina
durante la etapa de infección. Los títulos representan los valores
medios de 3 frascos rotativos para cada suplementación de
asparagina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados demuestran que la suplementación
del medio exento de suero que comprendía 10 ng/ml de medio EGF con
asparagina podía aumentar la producción de virus y que la
suplementación hasta 1 mM durante el proceso de infección era
óptima.
Claims (18)
1. Método para la amplificación de un poxvirus
que comprende los pasos siguientes:
- cultivo de células primarias de ave en un
medio exento de suero que comprende un factor seleccionado del grupo
constituido por factores de crecimiento y factores de fijación
- infección de las células primarias de ave con
el poxvirus
- cultivo de las células infectadas en medio
exento de suero hasta que se produce el poxvirus progenie,
en donde las células primarias de ave son
células que permiten la replicación productiva del poxvirus.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde las células primarias de ave son fibroblastos de embrión de
pollo (CEF).
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde el factor de crecimiento es un
factor de crecimiento epidérmico (EGF) en particular EGF
recombinante humano.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en
donde la concentración de EGF está comprendida en un intervalo de 5
a 20 ng/ml de medio.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el factor de fijación es
fibronectina.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en
donde la concentración de fibronectina está comprendida en el
intervalo de 1 a 10 \mug/cm^{2} de superficie del recipiente de
cultivo de células.
7. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde el medio comprende dos o más
factores seleccionados de factores de crecimiento y factores de
fijación.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en
donde el medio comprende EGF y fibronectina en los intervalos de
concentración que se definen en las reivindicaciones 4 y 6.
9. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde el medio comprende adicionalmente
uno o más aditivos seleccionados de extracto microbiano, extracto de
plantas y extracto de un animal no mamífero.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
en donde el extracto microbiano es extracto de levadura o
ultrafiltrado "yeastolate".
11. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
en donde el extracto de plantas es extracto de arroz o extracto de
soja.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
en donde el extracto de animal no mamífero es extracto de peces.
13. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en donde el poxvirus es un
ortopoxvirus.
14. Método de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde el ortopoxvirus es un virus Vaccinia.
15. Método de acuerdo con la reivindicación 14,
en donde el virus Vaccinia es virus Vaccinia modificado Ankara.
16. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en donde el poxvirus es un virus atenuado
o un virus recombinante.
17. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde el medio exento de suero en uno o
ambos de los pasos de
- infección de las células primarias de ave con
el poxvirus y
- cultivo de las células infectadas en medio
exento de suero hasta que se produce el virus progenie
carece de los factores seleccionados de factores
de crecimiento y factores de fijación.
18. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde a continuación del paso de cultivo
de las células infectadas en medio exento de suero hasta que se
produce el virus progenie, se realizan uno o más pasos de
purificación.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK200201302 | 2002-09-05 | ||
| DKPA200201302 | 2002-09-05 | ||
| PCT/EP2003/009704 WO2004022729A1 (en) | 2002-09-05 | 2003-09-01 | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2305514T3 true ES2305514T3 (es) | 2008-11-01 |
| ES2305514T5 ES2305514T5 (es) | 2019-06-14 |
Family
ID=31970216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03766057T Expired - Lifetime ES2305514T5 (es) | 2002-09-05 | 2003-09-01 | Método para la amplificación de un poxvirus en condiciones exentas de suero |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7695939B2 (es) |
| EP (1) | EP1434858B2 (es) |
| JP (2) | JP2005537793A (es) |
| KR (1) | KR101044538B1 (es) |
| CN (1) | CN1692156B (es) |
| AT (1) | ATE393212T2 (es) |
| AU (1) | AU2003264144C1 (es) |
| BR (1) | BRPI0313559B8 (es) |
| CA (1) | CA2494379C (es) |
| CY (1) | CY1114598T1 (es) |
| DE (1) | DE60320520T3 (es) |
| DK (1) | DK1434858T4 (es) |
| EA (1) | EA009008B1 (es) |
| ES (1) | ES2305514T5 (es) |
| HK (1) | HK1080507B (es) |
| MX (1) | MXPA04012966A (es) |
| NO (1) | NO343489B1 (es) |
| NZ (1) | NZ538575A (es) |
| PL (1) | PL215169B1 (es) |
| PT (1) | PT1434858E (es) |
| SI (1) | SI1434858T2 (es) |
| UA (1) | UA85543C2 (es) |
| WO (1) | WO2004022729A1 (es) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100537773C (zh) * | 2000-11-23 | 2009-09-09 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改良安卡拉痘苗病毒变体 |
| US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| ATE393212T2 (de) * | 2002-09-05 | 2008-05-15 | Bavarian Nordic As | Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen |
| EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| CA2593532C (en) | 2005-02-23 | 2017-05-02 | Bavarian Nordic A/S | Use of a modified poxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents |
| FR2884255B1 (fr) * | 2005-04-11 | 2010-11-05 | Vivalis | Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe |
| RU2489486C2 (ru) | 2006-06-20 | 2013-08-10 | Трансжене С.А. | Процесс получения поксвирусов и композиции поксвирусов |
| SG178090A1 (en) | 2009-07-21 | 2012-03-29 | Transgene Sa | Enzymatic composition for the digestion of chicken embryos |
| WO2011103137A1 (en) * | 2010-02-17 | 2011-08-25 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cell-based methods and reagents |
| BR112012026095A2 (pt) | 2010-04-14 | 2015-09-15 | Emd Millipore Corp | métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos. |
| AU2011281982B2 (en) * | 2010-07-20 | 2015-12-17 | Bavarian Nordic A/S | Method for harvesting expression products |
| KR101504159B1 (ko) * | 2012-04-20 | 2015-03-19 | 한국생명공학연구원 | 미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도 |
| WO2015195758A1 (en) * | 2014-06-18 | 2015-12-23 | Medimmune, Llc | Cell culture methods and media comprising n-acetylcysteine |
| KR101677231B1 (ko) | 2014-12-18 | 2016-11-30 | 제주대학교 산학협력단 | 무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법 |
| CN105462911B (zh) * | 2015-12-22 | 2018-04-13 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法 |
| CN107129963A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-09-05 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 一种df‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法 |
| CA3061678A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| CA3062549A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| US20210301263A1 (en) * | 2018-08-08 | 2021-09-30 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods for improved poxvirus yields |
| WO2020049151A1 (en) | 2018-09-06 | 2020-03-12 | Bavarian Nordic A/S | Storage improved poxvirus compositions |
| BR112022017438A2 (pt) | 2020-03-12 | 2022-10-18 | Bavarian Nordic As | Composições que melhoram a estabilidade do poxvírus |
| CN113355297A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-07 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法 |
| WO2024003238A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Epstein-barr-virus vaccine |
| WO2024003239A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN |
| CN116656628A (zh) * | 2023-07-31 | 2023-08-29 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 一种痘病毒载体疫苗的制备方法 |
Family Cites Families (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2004402A (en) * | 1934-04-07 | 1935-06-11 | Conklin John Edward | Atomizer |
| US3887430A (en) * | 1972-02-24 | 1975-06-03 | Dow Chemical Co | Culture medium for tissue culture techniques |
| US4072565A (en) * | 1974-11-04 | 1978-02-07 | The Dow Chemical Company | Production of viruses in tissue culture without use of serum |
| US3914408A (en) * | 1973-10-12 | 1975-10-21 | Univ Nebraska | Vaccine for neonatal calf diarrhea |
| DE2714665A1 (de) * | 1977-04-01 | 1978-10-05 | Mayr Anton | Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung |
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| US5155020A (en) * | 1989-03-08 | 1992-10-13 | Health Research Inc. | Recombinant poxvirus host range selection system |
| US5833975A (en) * | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| AU613583B2 (en) * | 1986-08-22 | 1991-08-08 | Transgene S.A. | Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity |
| US5024947A (en) * | 1987-07-24 | 1991-06-18 | Cetus Corporation | Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby |
| CA1341245C (en) * | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US6248333B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-06-19 | Health Research Inc. | Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD) |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| CA2091443A1 (en) * | 1990-09-25 | 1992-03-26 | Luciano Ramos | Medium for culture of mammalian cells |
| WO1992015672A1 (en) * | 1991-03-07 | 1992-09-17 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| US5843456A (en) * | 1991-03-07 | 1998-12-01 | Virogenetics Corporation | Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses |
| US5766598A (en) | 1991-03-07 | 1998-06-16 | Virogenetics Corporation | Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products |
| IL102929A (en) | 1992-08-24 | 1996-11-14 | Interpharm Lab Ltd | Serum-free medium for mammalian cells |
| US5403582A (en) * | 1993-01-21 | 1995-04-04 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus |
| US5405772A (en) | 1993-06-18 | 1995-04-11 | Amgen Inc. | Medium for long-term proliferation and development of cells |
| US5768598A (en) | 1993-09-13 | 1998-06-16 | Intel Corporation | Method and apparatus for sharing hardward resources in a computer system |
| US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US6190655B1 (en) * | 1993-12-03 | 2001-02-20 | Immunex Corporation | Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer |
| DE4405841C1 (de) * | 1994-02-23 | 1995-01-05 | Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr | Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel |
| EP0758397B1 (en) * | 1994-04-29 | 2005-06-22 | Baxter Healthcare S.A. | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| US5756341A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| DK0791055T3 (da) | 1994-11-10 | 2012-04-16 | Baxter Healthcare Sa | Fremgangsmåde til fremstilling af biologiske produkter i proteinfri kultur |
| US5503582A (en) | 1994-11-18 | 1996-04-02 | Micron Display Technology, Inc. | Method for forming spacers for display devices employing reduced pressures |
| UA68327C2 (en) | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| JPH09154571A (ja) * | 1995-12-05 | 1997-06-17 | Kurabo Ind Ltd | ウイルス製造用無血清培地 |
| EP0882134B8 (en) | 1996-02-21 | 2009-09-02 | Genetic Immunity kft. | Methods and compositions for protective and therapeutic genetic immunization |
| AU3813597A (en) | 1996-07-26 | 1998-02-20 | University Of Manitoba | Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells |
| ID19548A (id) | 1996-09-24 | 1998-07-23 | Bavarian Nordic Res Inst As | Virus mva rekombinan yang mengekspresikan antigen-antigen virus demam dan penggunaan daripadanya dalam vaksin-vaksin |
| AU4751697A (en) | 1996-10-10 | 1998-05-05 | Douglas Danner | Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients |
| WO1998017283A1 (en) | 1996-10-25 | 1998-04-30 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Method of vaccinating infants against infections |
| US6204250B1 (en) * | 1996-11-22 | 2001-03-20 | The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York | Immunization of infants |
| US20030138454A1 (en) * | 1997-06-09 | 2003-07-24 | Oxxon Pharmaccines, Ltd. | Vaccination method |
| GB9711957D0 (en) | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Isis Innovation | Methods and reagents for vaccination |
| GB0023203D0 (en) | 2000-09-21 | 2000-11-01 | Isis Innovation | Vaccination method |
| AT407255B (de) * | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
| AU3910097A (en) | 1997-08-05 | 1999-03-01 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating vir us |
| WO2000008179A1 (en) * | 1998-08-04 | 2000-02-17 | Immunex Corporation | Ikr-1 and ikr-2, protein kinases which are related to the i kappa b kinases |
| US6667176B1 (en) * | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| DE69839970D1 (de) | 1998-11-10 | 2008-10-16 | Univ Rochester | Methoden zu herstellung von genbanken |
| EP1160323A1 (en) | 1998-11-18 | 2001-12-05 | Oxford Biomedica (UK) Limited | 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy |
| GB2370571B (en) | 1998-11-18 | 2003-05-07 | Oxford Biomedica Ltd | A modified 5t4 antigen |
| US6497883B1 (en) * | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| DE19935351A1 (de) | 1999-07-29 | 2001-02-01 | Abb Daimler Benz Transp | Verfahren zur Energieoptimierung bei einem Fahrzeug/Zug mit arbeitspunktabhängigem Wirkungsgrad |
| DK1263936T3 (da) * | 2000-03-14 | 2006-02-13 | Bavarian Nordic As | andret stamme af den modificerede Vacciniavirus Ankara (MVA) |
| EP1283718A2 (en) | 2000-05-24 | 2003-02-19 | Merial | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) recombinant avipoxvirus vaccine |
| PL366397A1 (en) * | 2000-07-11 | 2005-01-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of strains of the parapox ovis virus for producing antiviral pharmaceuticals and anticancer pharmaceuticals |
| DK1358319T3 (da) * | 2000-09-25 | 2009-10-05 | Polymun Scient Immunbio Forsch | Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf |
| US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| CN100537773C (zh) | 2000-11-23 | 2009-09-09 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改良安卡拉痘苗病毒变体 |
| US7097842B2 (en) * | 2000-11-23 | 2006-08-29 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| UA82466C2 (uk) * | 2001-07-18 | 2008-04-25 | Бавариан Нордика А/С | Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу |
| KR101042458B1 (ko) * | 2001-12-04 | 2011-06-16 | 벤처 테크놀로지스 에스디엔 비에이치디 | 플라비바이러스 ｎｓ1 서브유닛 백신 |
| US6951752B2 (en) | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
| BR0214822A (pt) | 2001-12-10 | 2004-12-14 | Bavarian Nordic As | Formulações contendo poxvìrus e processo para preparar composições contendo poxvìrus estáveis |
| UA77735C2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-01-15 | Bavarian Nordic As | Method for recovery of poxviruses from infected cells |
| FR2836924B1 (fr) | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
| AU2003219057A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Baxter Healthcare S.A. | Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine |
| JP4895505B2 (ja) * | 2002-05-16 | 2012-03-14 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域 |
| KR20040108804A (ko) * | 2002-05-16 | 2004-12-24 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 우두 ａｔｉ 프로모터를 사용하는 것에 의한 변형백시니아 바이러스 안카라에서 유전자의 발현 |
| ATE393212T2 (de) | 2002-09-05 | 2008-05-15 | Bavarian Nordic As | Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen |
| ATE467678T1 (de) | 2003-07-22 | 2010-05-15 | Vivalis | Produktion von poxviren mit adhärenten oder nicht adhärenten vogelzellinien |
| US6915752B2 (en) * | 2003-09-30 | 2005-07-12 | Lockheed Martin Corporation | Utility service protection strip |
| US6976752B2 (en) * | 2003-10-28 | 2005-12-20 | Lexmark International, Inc. | Ink jet printer with resistance compensation circuit |
-
2003
- 2003-09-01 AT AT03766057T patent/ATE393212T2/de active
- 2003-09-01 UA UAA200502041A patent/UA85543C2/ru unknown
- 2003-09-01 DE DE60320520.8T patent/DE60320520T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-01 PT PT03766057T patent/PT1434858E/pt unknown
- 2003-09-01 ES ES03766057T patent/ES2305514T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-01 BR BRPI0313559A patent/BRPI0313559B8/pt active IP Right Grant
- 2003-09-01 EA EA200500448A patent/EA009008B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-09-01 CA CA2494379A patent/CA2494379C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-01 WO PCT/EP2003/009704 patent/WO2004022729A1/en active IP Right Grant
- 2003-09-01 DK DK03766057.8T patent/DK1434858T4/en active
- 2003-09-01 CN CN038188694A patent/CN1692156B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-01 JP JP2004533438A patent/JP2005537793A/ja active Pending
- 2003-09-01 NZ NZ538575A patent/NZ538575A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-09-01 PL PL373992A patent/PL215169B1/pl unknown
- 2003-09-01 SI SI200331281T patent/SI1434858T2/sl unknown
- 2003-09-01 KR KR1020057000155A patent/KR101044538B1/ko active IP Right Grant
- 2003-09-01 EP EP03766057.8A patent/EP1434858B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-01 MX MXPA04012966A patent/MXPA04012966A/es active IP Right Grant
- 2003-09-01 AU AU2003264144A patent/AU2003264144C1/en not_active Expired
-
2005
- 2005-03-03 US US11/071,814 patent/US7695939B2/en active Active
- 2005-03-04 NO NO20051175A patent/NO343489B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-05 HK HK06100219.9A patent/HK1080507B/zh not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-23 CY CY20081100766T patent/CY1114598T1/el unknown
- 2008-10-01 US US12/243,332 patent/US7964397B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-03-12 JP JP2010055602A patent/JP5612338B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-12 US US13/106,026 patent/US8329466B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-11-29 US US13/688,473 patent/US8673318B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2305514T3 (es) | Metodo para la amplificacion de un poxvirus en condiciones exentas de suero. | |
| ES2345820T3 (es) | Produccion de poxvirus con estirpes de celulas aviares adherentes o no adherentes. | |
| RU2694318C2 (ru) | Иммортализованные фибробласты эмбриона цыпленка | |
| JP5154632B2 (ja) | ウイルス増殖法 | |
| EP3911731A1 (en) | Serum-free medium for avian vaccine production and uses thereof | |
| Mehrabanpour et al. | Plaque formation of lasota strain of newcastle disease virus adapted in chick embryo fibroblast cells |