JPH09154571A - ウイルス製造用無血清培地 - Google Patents
ウイルス製造用無血清培地Info
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- JPH09154571A JPH09154571A JP7316709A JP31670995A JPH09154571A JP H09154571 A JPH09154571 A JP H09154571A JP 7316709 A JP7316709 A JP 7316709A JP 31670995 A JP31670995 A JP 31670995A JP H09154571 A JPH09154571 A JP H09154571A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 無血清条件下でウイルス製造に用いる動物細
胞を培養し得る無血清培地を提供する。 【解決手段】 動物細胞培養用基礎培地へ塩基性繊維芽
細胞成長因子およびインシュリンを必須成分として含
む、ウイルス増殖に用いられる動物細胞培養用の無血清
培地を提供する。
胞を培養し得る無血清培地を提供する。 【解決手段】 動物細胞培養用基礎培地へ塩基性繊維芽
細胞成長因子およびインシュリンを必須成分として含
む、ウイルス増殖に用いられる動物細胞培養用の無血清
培地を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はウイルス増殖に用い
られる動物細胞培養用の無血清培地に関する。
られる動物細胞培養用の無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年ウイルス製造は一部のウイルスを除
いて実験動物や発育鶏卵を用いる方法から動物由来の初
代培養細胞や、株化細胞を用いる方法が主流となってい
る。細胞培養による方法では、増殖させた細胞にウイル
スを感染させ、これをインビトロでさらに増殖させる。
一般に動物細胞をインビトロで培養する際には、アミノ
酸、ビタミン、糖、無機塩類からなる基礎培地に細胞増
殖因子として１０〜２０％の血清を添加した培地が用い
られる。しかしながら、血清は大量生産ができず非常に
高価である上に、その組成は個体差（ロット差）が大き
い。１ロットの量が限られているため、ロット変更のた
び毎にロットチェック、培養条件の調整や管理等の煩雑
な操作が必要となる。さらに血清は、血液細胞や血管内
皮細胞の産生した生理活性物質を含む混合物であり、未
知の成分が得られるウイルスへ混入する、マイコプラズ
マウイルス感染の危険がある等の問題があり、ウイルス
の品質が安定して保持できなくなる。厳重な品質管理が
必要とされるウイルスの製造においては、これらは非常
に重大な問題である。そこで、ウイルス製造用動物細胞
の培養のために、血清を含有しない培地の開発が望まれ
ている。しかしながら、無血清条件下における培養では
血清添加時と同程度の細胞の増殖を得ることは困難であ
る。ウイルスを製造後に精製するため、添加する成分は
なるべく少なくした方がよい。また、無血清条件下にて
増殖された細胞が良好なウイルス増殖能を維持している
必要もある。
いて実験動物や発育鶏卵を用いる方法から動物由来の初
代培養細胞や、株化細胞を用いる方法が主流となってい
る。細胞培養による方法では、増殖させた細胞にウイル
スを感染させ、これをインビトロでさらに増殖させる。
一般に動物細胞をインビトロで培養する際には、アミノ
酸、ビタミン、糖、無機塩類からなる基礎培地に細胞増
殖因子として１０〜２０％の血清を添加した培地が用い
られる。しかしながら、血清は大量生産ができず非常に
高価である上に、その組成は個体差（ロット差）が大き
い。１ロットの量が限られているため、ロット変更のた
び毎にロットチェック、培養条件の調整や管理等の煩雑
な操作が必要となる。さらに血清は、血液細胞や血管内
皮細胞の産生した生理活性物質を含む混合物であり、未
知の成分が得られるウイルスへ混入する、マイコプラズ
マウイルス感染の危険がある等の問題があり、ウイルス
の品質が安定して保持できなくなる。厳重な品質管理が
必要とされるウイルスの製造においては、これらは非常
に重大な問題である。そこで、ウイルス製造用動物細胞
の培養のために、血清を含有しない培地の開発が望まれ
ている。しかしながら、無血清条件下における培養では
血清添加時と同程度の細胞の増殖を得ることは困難であ
る。ウイルスを製造後に精製するため、添加する成分は
なるべく少なくした方がよい。また、無血清条件下にて
増殖された細胞が良好なウイルス増殖能を維持している
必要もある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、無血清条
件下でウイルス製造に用いる動物細胞を培養し得る無血
清培地を提供することを目的とする。
件下でウイルス製造に用いる動物細胞を培養し得る無血
清培地を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本願発明は、動物細胞培
養用基礎培地へ塩基性繊維芽細胞成長因子（以下、「ｂ
ＦＧＦ」という）およびインシュリンを必須成分として
含む、ウイルス増殖に用いられる動物細胞培養用の無血
清培地を提供する。本願発明の培地にはｂＦＧＦを０．
５〜２０ｎｇ／ｍｌ、インシュリンを０．１〜２０μｇ
／ｍｌ添加する。本願発明の培地はウイルス製造用の様
々な細胞に用いられるが、ハムスター肺細胞および鶏胚
細胞を培養してウイルスを製造する際に特に好適に用い
られる。
養用基礎培地へ塩基性繊維芽細胞成長因子（以下、「ｂ
ＦＧＦ」という）およびインシュリンを必須成分として
含む、ウイルス増殖に用いられる動物細胞培養用の無血
清培地を提供する。本願発明の培地にはｂＦＧＦを０．
５〜２０ｎｇ／ｍｌ、インシュリンを０．１〜２０μｇ
／ｍｌ添加する。本願発明の培地はウイルス製造用の様
々な細胞に用いられるが、ハムスター肺細胞および鶏胚
細胞を培養してウイルスを製造する際に特に好適に用い
られる。
【０００５】本願発明の無血清培地を用いてウイルスを
製造するには、ウイルス培養に適した細胞を本願発明の
培地にて適当に増殖させたところへ、ウイルスを接種
し、さらに通常の細胞培養条件にて培養を続ければよ
い。ウイルスによる細胞障害効果が認められた時点でウ
イルスを含有する培養上清を分取し、必要に応じて希
釈、精製して用いればよい。
製造するには、ウイルス培養に適した細胞を本願発明の
培地にて適当に増殖させたところへ、ウイルスを接種
し、さらに通常の細胞培養条件にて培養を続ければよ
い。ウイルスによる細胞障害効果が認められた時点でウ
イルスを含有する培養上清を分取し、必要に応じて希
釈、精製して用いればよい。
【０００６】
【発明の実施の形態】ｂ−ＦＧＦ（ｂａｓｉｃ−ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、広
範囲な細胞（間葉系の細胞、神経系外胚葉細胞、内皮細
胞など）の増殖を促進するタンパク質である。本発明の
培地に添加するｂＦＧＦとしては、市販されているもの
を用いればよく、例えばペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅ
ｃｈ）社製のヒト型ｂＦＧＦが好適に用いられる。ｂＦ
ＧＦの培地への添加量は０．５〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ま
しくは２〜１０ｎｇ／ｍｌである。２０ｎｇ／ｍｌを越
える量を添加しても同様の効果は得られるが、経済的観
点から１０ｎｇ／ｍｌで十分である。
ｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、広
範囲な細胞（間葉系の細胞、神経系外胚葉細胞、内皮細
胞など）の増殖を促進するタンパク質である。本発明の
培地に添加するｂＦＧＦとしては、市販されているもの
を用いればよく、例えばペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅ
ｃｈ）社製のヒト型ｂＦＧＦが好適に用いられる。ｂＦ
ＧＦの培地への添加量は０．５〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ま
しくは２〜１０ｎｇ／ｍｌである。２０ｎｇ／ｍｌを越
える量を添加しても同様の効果は得られるが、経済的観
点から１０ｎｇ／ｍｌで十分である。
【０００７】本発明の培地に添加するインシュリンとし
ては、市販されているものを用いればよく、例えば和光
純薬工業（株）製ウシ膵臓由来のインシュリンが好適に
用いられる。インシュリンの培地への添加量は０．１〜
２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／
ｍｌである。２０μｇ／ｍｌを越える量を添加しても同
様の効果は得られるが、経済的観点から１０μｇ／ｍｌ
で十分である。
ては、市販されているものを用いればよく、例えば和光
純薬工業（株）製ウシ膵臓由来のインシュリンが好適に
用いられる。インシュリンの培地への添加量は０．１〜
２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／
ｍｌである。２０μｇ／ｍｌを越える量を添加しても同
様の効果は得られるが、経済的観点から１０μｇ／ｍｌ
で十分である。
【０００８】本願発明において用いる基礎培地としては
糖類、アミノ酸類、ビタミン類、塩類等を含有する、通
常動物細胞の培養に用いられるものいずれであってもよ
く、ウイルス製造に使用する細胞に応じて適宜選択すれ
ばよい。かかる基礎培地の例としては、イーグルＭＥＭ
培地、培養する細胞に適するように、イーグルＭＥＭ培
地のアミノ酸、ビタミン、無機塩等を新しく加えるかあ
るいは増減したイーグルＭＥＭ改変培地、ダルベッコ改
変イーグル培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ１６４０培
地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ１０５
培地、ＭＣＤＢ１０７培地、ＭＣＤＢ１１０培地、ＭＣ
ＤＢ１３１培地、ＭＣＤＢ１５１培地、ＭＣＤＢ１５２
培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＣＤＢ２０１培地、ＭＣ
ＤＢ３０２培地、ＭＥＤＩＵＭ１９９等が挙げられる。
糖類、アミノ酸類、ビタミン類、塩類等を含有する、通
常動物細胞の培養に用いられるものいずれであってもよ
く、ウイルス製造に使用する細胞に応じて適宜選択すれ
ばよい。かかる基礎培地の例としては、イーグルＭＥＭ
培地、培養する細胞に適するように、イーグルＭＥＭ培
地のアミノ酸、ビタミン、無機塩等を新しく加えるかあ
るいは増減したイーグルＭＥＭ改変培地、ダルベッコ改
変イーグル培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ１６４０培
地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ１０５
培地、ＭＣＤＢ１０７培地、ＭＣＤＢ１１０培地、ＭＣ
ＤＢ１３１培地、ＭＣＤＢ１５１培地、ＭＣＤＢ１５２
培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＣＤＢ２０１培地、ＭＣ
ＤＢ３０２培地、ＭＥＤＩＵＭ１９９等が挙げられる。
【０００９】本願の無血清培地にはインシュリンおよび
ｂＦＧＦの他に通常細胞培養に用いられる添加剤、例え
ば抗生物質、抗かび剤、緩衝剤、色素剤等の他の因子を
添加してもよい。
ｂＦＧＦの他に通常細胞培養に用いられる添加剤、例え
ば抗生物質、抗かび剤、緩衝剤、色素剤等の他の因子を
添加してもよい。
【００１０】本願発明の無血清培地は、ウイルス製造の
ために用いられる細胞であれば、いずれの細胞を培養す
る場合にでも用いることができるが、特に株化された樹
立系の動物細胞を培養するのに有用である。例えば、ハ
ムスター肺細胞、鶏胚細胞等が特に好適に培養される。
その他本発明の無血清培地によって培養し得るウイルス
製造に用いられる細胞としては、株化細胞として、Ｈｅ
Ｌａ細胞（ヒト）、ＦＬ細胞（ヒト）、ＫＢ細胞（ヒ
ト）、ＨＥｐ−２細胞（ヒト）、ＷＩ−３８細胞（ヒ
ト）、ＭＡ１０４細胞（サル）、ＢＳＣ−１細胞（サ
ル）、Ｖｅｒｏ細胞（サル）、ＣＶ−１細胞（サル）、
ＢＨＫ−２１細胞（ハムスター）、Ｌ細胞（マウス）等
がある。初代培養細胞として、羊膜由来細胞（ヒト）、
胎児腎由来細胞（ヒト）、胎児肺由来細胞（ヒト）、血
管内皮細胞（ヒト）、血管平滑筋細胞（ヒト）、皮膚由
来線維芽細胞（ヒト）等が挙げられる。
ために用いられる細胞であれば、いずれの細胞を培養す
る場合にでも用いることができるが、特に株化された樹
立系の動物細胞を培養するのに有用である。例えば、ハ
ムスター肺細胞、鶏胚細胞等が特に好適に培養される。
その他本発明の無血清培地によって培養し得るウイルス
製造に用いられる細胞としては、株化細胞として、Ｈｅ
Ｌａ細胞（ヒト）、ＦＬ細胞（ヒト）、ＫＢ細胞（ヒ
ト）、ＨＥｐ−２細胞（ヒト）、ＷＩ−３８細胞（ヒ
ト）、ＭＡ１０４細胞（サル）、ＢＳＣ−１細胞（サ
ル）、Ｖｅｒｏ細胞（サル）、ＣＶ−１細胞（サル）、
ＢＨＫ−２１細胞（ハムスター）、Ｌ細胞（マウス）等
がある。初代培養細胞として、羊膜由来細胞（ヒト）、
胎児腎由来細胞（ヒト）、胎児肺由来細胞（ヒト）、血
管内皮細胞（ヒト）、血管平滑筋細胞（ヒト）、皮膚由
来線維芽細胞（ヒト）等が挙げられる。
【００１１】本発明の無血清培地によって好適に製造し
得るウイルスとしては、ファブリキウス嚢ウイルス、ヘ
ルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍ
ｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、ヴァリセラ・ゾスターウイル
ス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕ
ｓ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏ ｖｉｒｕ
ｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）、サ
イトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕ
ｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）、
ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕ
ｓ）、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、オルトミキソウ
イルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓ）、パラミキ
ソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓ）、レオウ
イルス（ｒｅｏ ｖｉｒｕｓ）、リノウイルス（ｒｈｉ
ｎｏ ｖｉｒｕｓ）、痘瘡ウイルス、トガウイルス（ｔ
ｏｇａ ｖｉｒｕｓ）、コックスサッキーウイルス（ｃ
ｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）、レスピレトリーシン
シティアルウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎ
ｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、シミアンアデ
ノウイルス（ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）
等が例示される。
得るウイルスとしては、ファブリキウス嚢ウイルス、ヘ
ルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍ
ｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、ヴァリセラ・ゾスターウイル
ス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕ
ｓ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏ ｖｉｒｕ
ｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）、サ
イトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕ
ｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）、
ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕ
ｓ）、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、オルトミキソウ
イルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓ）、パラミキ
ソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓ）、レオウ
イルス（ｒｅｏ ｖｉｒｕｓ）、リノウイルス（ｒｈｉ
ｎｏ ｖｉｒｕｓ）、痘瘡ウイルス、トガウイルス（ｔ
ｏｇａ ｖｉｒｕｓ）、コックスサッキーウイルス（ｃ
ｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）、レスピレトリーシン
シティアルウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎ
ｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、シミアンアデ
ノウイルス（ｓｉｍｉａｎ ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）
等が例示される。
【００１２】
【実施例】本願発明を以下の実施例により、さらに詳細
に説明する。 実施例 １ ハムスター肺細胞を基礎培地に様々な増殖因子を添加し
た培地にて培養し、細胞の増殖能に対する各因子の寄与
を調べた。 細胞：ハムスター肺細胞（ＨＬ細胞）はハムスター肺由
来の株化細胞を用いた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ（Ｅ.ＭＥＭ）（ＮａＨＣＯ3０．０７％、ＰＳＫ（抗
生物質）０.１％添加）を用いた。イーグルＭＥＭの組
成は以下の通りである。
に説明する。 実施例 １ ハムスター肺細胞を基礎培地に様々な増殖因子を添加し
た培地にて培養し、細胞の増殖能に対する各因子の寄与
を調べた。 細胞：ハムスター肺細胞（ＨＬ細胞）はハムスター肺由
来の株化細胞を用いた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ（Ｅ.ＭＥＭ）（ＮａＨＣＯ3０．０７％、ＰＳＫ（抗
生物質）０.１％添加）を用いた。イーグルＭＥＭの組
成は以下の通りである。
【００１３】
【表１】
【００１４】培養用培地：基礎培地に以下のＩ−Ｖに示
した増殖因子を添加した培地を用いた。 Ｉ． ｂＦＧＦ １ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ
／ｍｌ添加 II． ウシ脳抽出液 ０.２％、上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ） ０.１ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ／ｍ
ｌ、ハイドロコルチゾン ０.５μｇ／ｍｌ添加 III． ＥＧＦ ０.５ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２ｎｇ／
ｍｌ、インシュリン ５μｇ／ｍｌ添加 IＶ． ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２ｎｇ／ｍ
ｌ、デキサメサゾン ０.３９μｇ／ｍｌ添加 Ｖ． ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ５ｎｇ／ｍ
ｌ、ハイドロコルチゾン１μｇ／ｍｌ、ヘパリン １０
μｇ／ｍｌ添加 対照培地：牛胎児血清（ＦＢＳ）５％添加基礎培地およ
び非添加基礎培地を対照として用いた。
した増殖因子を添加した培地を用いた。 Ｉ． ｂＦＧＦ １ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ
／ｍｌ添加 II． ウシ脳抽出液 ０.２％、上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ） ０.１ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ／ｍ
ｌ、ハイドロコルチゾン ０.５μｇ／ｍｌ添加 III． ＥＧＦ ０.５ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２ｎｇ／
ｍｌ、インシュリン ５μｇ／ｍｌ添加 IＶ． ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２ｎｇ／ｍ
ｌ、デキサメサゾン ０.３９μｇ／ｍｌ添加 Ｖ． ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ５ｎｇ／ｍ
ｌ、ハイドロコルチゾン１μｇ／ｍｌ、ヘパリン １０
μｇ／ｍｌ添加 対照培地：牛胎児血清（ＦＢＳ）５％添加基礎培地およ
び非添加基礎培地を対照として用いた。
【００１５】細胞培養：ＨＬ細胞の１０％トリスリン酸
緩衝液含有イーグルＭＥＭ中の浮遊液を、１２００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離し、上清を除き、Ｉ〜Ｖおよび対照
の各培地へそれぞれ２．６×１０5細胞／ｍｌとなるよ
うに懸濁した。この細胞懸濁液をプラスチック製２５ｃ
ｍ2の組織培養用フラスコにそれぞれ５ｍｌ（１３０×
１０4細胞／フラスコ）植え込んだ。細胞は５％ ＣＯ2
インキュベーター内で、３７℃にて１０日間培養し、細
胞の増殖の様子を顕微鏡で観察した。細胞数は培養３日
目にフラスコ上清を捨て、ハンクス液で洗浄して細胞屑
等を除いた後、トリプシン処理によりシャーレから細胞
を剥離し、生細胞数をトリパンブルー染色にて計数して
求めた。結果を表２および表３に示す：
緩衝液含有イーグルＭＥＭ中の浮遊液を、１２００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離し、上清を除き、Ｉ〜Ｖおよび対照
の各培地へそれぞれ２．６×１０5細胞／ｍｌとなるよ
うに懸濁した。この細胞懸濁液をプラスチック製２５ｃ
ｍ2の組織培養用フラスコにそれぞれ５ｍｌ（１３０×
１０4細胞／フラスコ）植え込んだ。細胞は５％ ＣＯ2
インキュベーター内で、３７℃にて１０日間培養し、細
胞の増殖の様子を顕微鏡で観察した。細胞数は培養３日
目にフラスコ上清を捨て、ハンクス液で洗浄して細胞屑
等を除いた後、トリプシン処理によりシャーレから細胞
を剥離し、生細胞数をトリパンブルー染色にて計数して
求めた。結果を表２および表３に示す：
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】細胞数および細胞の増殖速度について、Ｉ
およびIIIの培地が良好な結果を示した。即ち、ｂ−Ｆ
ＧＦとインシュリンを同時に添加した培地を用いた場
合、無血清条件下でも良好な増殖能が認められた。
およびIIIの培地が良好な結果を示した。即ち、ｂ−Ｆ
ＧＦとインシュリンを同時に添加した培地を用いた場
合、無血清条件下でも良好な増殖能が認められた。
【００１９】実施例２ 鶏胚細胞の培養を、実施例１と同様の増殖因子を添加し
た培地を用いて行った。 細胞：鶏胚細胞（ＣＥ細胞）は、初代正常細胞であり、
ＳＰＦ（特定病原体非感染（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔ
ｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ））の鶏卵由来の８〜１０日令胚
を細分し、トリプシンで消化、洗浄後、適当な濃度にな
るように培地に浮遊された細胞を用いた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ培地（ＮaＨＣＯ3 ０．０７％、ＰＳＫ ０.１％、
ファンギゾン（抗かび剤） ０.２％添加） 培養用培地：基礎培地に実施例１のＩ〜Ｖの培地と同じ
増殖因子を添加した培地を用いた。 対照培地：ＦＢＳ５％添加基礎培地および無添加基礎培
地を用いた。
た培地を用いて行った。 細胞：鶏胚細胞（ＣＥ細胞）は、初代正常細胞であり、
ＳＰＦ（特定病原体非感染（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔ
ｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ））の鶏卵由来の８〜１０日令胚
を細分し、トリプシンで消化、洗浄後、適当な濃度にな
るように培地に浮遊された細胞を用いた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ培地（ＮaＨＣＯ3 ０．０７％、ＰＳＫ ０.１％、
ファンギゾン（抗かび剤） ０.２％添加） 培養用培地：基礎培地に実施例１のＩ〜Ｖの培地と同じ
増殖因子を添加した培地を用いた。 対照培地：ＦＢＳ５％添加基礎培地および無添加基礎培
地を用いた。
【００２０】細胞培養：ＣＥ細胞の懸濁液を基礎培地で
洗浄した後、各培養用培地および対照培地へそれぞれ８
×１０5細胞／ｍｌとなるように懸濁した。各細胞懸濁
液５ｍｌを細胞培養用シャーレ（プラスチック製１００
ｃｍ2組織培養用シャーレ）（４００×１０4細胞／シャ
ーレ）に植え付け、５％ＣＯ2インキュベーター内で３
７℃にて培養した。培養１日目から５日目まで増殖状況
を顕微鏡下で観察し、培養１日及び５日目の細胞数を計
測した。細胞数の測定は実施例１と同様にして行った。
結果を表４および５に示す。
洗浄した後、各培養用培地および対照培地へそれぞれ８
×１０5細胞／ｍｌとなるように懸濁した。各細胞懸濁
液５ｍｌを細胞培養用シャーレ（プラスチック製１００
ｃｍ2組織培養用シャーレ）（４００×１０4細胞／シャ
ーレ）に植え付け、５％ＣＯ2インキュベーター内で３
７℃にて培養した。培養１日目から５日目まで増殖状況
を顕微鏡下で観察し、培養１日及び５日目の細胞数を計
測した。細胞数の測定は実施例１と同様にして行った。
結果を表４および５に示す。
【００２１】
【表４】
【００２２】
【表５】
【００２３】ＣＥ細胞の場合においても、IおよびIIIの
培地、すなわちｂＦＧＦとインシュリンの組み合わせに
よって無血清条件下における高い増殖能が認められた。
培地、すなわちｂＦＧＦとインシュリンの組み合わせに
よって無血清条件下における高い増殖能が認められた。
【００２４】実施例３ ＣＥ細胞の培養において、インシュリンとｂＦＧＦの濃
度を変えて細胞の増殖に対する効果を調べた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ培地(ＮaＨＣＯ3 ０．０７％、ＰＳＫ ０.１％、フ
ァンギゾン（抗かび剤） ０.２％添加） 培養用培地：基礎培地へ以下の増殖因子を添加した培地
を用いて培養した。 Ａ ｂＦＧＦ １ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ／
ｍｌ添加 Ｂ ｂＦＧＦ ３ｎｇ／ｍｌ、インシュリン １０μｇ
／ｍｌ添加 Ｃ ｂＦＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、インシュリン １０μ
ｇ／ｍｌ添加 対照培地：ＦＢＳ５％添加基礎培地および非添加基礎培
地を対照として用いた。
度を変えて細胞の増殖に対する効果を調べた。 基礎培地：１０％トリスリン酸緩衝液含有イーグルＭＥ
Ｍ培地(ＮaＨＣＯ3 ０．０７％、ＰＳＫ ０.１％、フ
ァンギゾン（抗かび剤） ０.２％添加） 培養用培地：基礎培地へ以下の増殖因子を添加した培地
を用いて培養した。 Ａ ｂＦＧＦ １ｎｇ／ｍｌ、インシュリン ５μｇ／
ｍｌ添加 Ｂ ｂＦＧＦ ３ｎｇ／ｍｌ、インシュリン １０μｇ
／ｍｌ添加 Ｃ ｂＦＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、インシュリン １０μ
ｇ／ｍｌ添加 対照培地：ＦＢＳ５％添加基礎培地および非添加基礎培
地を対照として用いた。
【００２５】細胞培養：上記のＡ〜Ｃの培地および対照
培地へそれぞれ８×１０5細胞／ｍｌとなるようＣＥ細
胞を懸濁し、これを実施例２と同じ細胞培養用シャーレ
へ５ｍｌ（４００×１０4細胞／シャーレ）植え付け、
５％ ＣＯ2インキュベーター内にて３７℃で培養し
た。細胞培養開始後３日まで毎日顕微鏡で観察し増殖度
を調べ、培養１日目と培養３日目の細胞数を計数した。
結果を表６および表７に示した。
培地へそれぞれ８×１０5細胞／ｍｌとなるようＣＥ細
胞を懸濁し、これを実施例２と同じ細胞培養用シャーレ
へ５ｍｌ（４００×１０4細胞／シャーレ）植え付け、
５％ ＣＯ2インキュベーター内にて３７℃で培養し
た。細胞培養開始後３日まで毎日顕微鏡で観察し増殖度
を調べ、培養１日目と培養３日目の細胞数を計数した。
結果を表６および表７に示した。
【００２６】細胞継代培養：３日間培養してシャーレ一
杯に増殖した細胞の継代培養を行った。細胞の継代は培
養シャーレ内の培地を吸引して除いた後、非添加基礎培
地で洗浄し、トリプシン液で処理して細胞を剥がし、新
生児牛血清（ＮＢＳ）１０％を添加した基礎培地内に細
胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液を非添加基礎培地で
洗浄して血清分を除き、それぞれを７.５ｍｌの各培養
用培地へ再懸濁し、そのうち５ｍｌを再びシャーレに植
え込んだ。５％ ＣＯ2インキュベーター内で３７℃に
て静置培養を行った。細胞培養開始後６日目まで顕微鏡
で細胞の増殖度を観察し、０日目および培養開始後６日
目の細胞数を実施例１と同様にして計数した。結果を表
６および表７に示した。
杯に増殖した細胞の継代培養を行った。細胞の継代は培
養シャーレ内の培地を吸引して除いた後、非添加基礎培
地で洗浄し、トリプシン液で処理して細胞を剥がし、新
生児牛血清（ＮＢＳ）１０％を添加した基礎培地内に細
胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液を非添加基礎培地で
洗浄して血清分を除き、それぞれを７.５ｍｌの各培養
用培地へ再懸濁し、そのうち５ｍｌを再びシャーレに植
え込んだ。５％ ＣＯ2インキュベーター内で３７℃に
て静置培養を行った。細胞培養開始後６日目まで顕微鏡
で細胞の増殖度を観察し、０日目および培養開始後６日
目の細胞数を実施例１と同様にして計数した。結果を表
６および表７に示した。
【００２７】
【表６】
【００２８】
【表７】
【００２９】ｂ−ＦＧＦおよびインシュリン濃度が高い
ほど、細胞の増殖度が良好であった。
ほど、細胞の増殖度が良好であった。
【００３０】実施例４ 実施例３と同じＣＥ細胞を用いて、ファブリキウス嚢ウ
イルスの増殖度を調べた。 １）供試ウイルス：ファブリキウス嚢ウイルスは、市販
ファブリキウス嚢ウイルス生ワクチン（ひな用）の製造
用株（Ｋ株）を用いた。
イルスの増殖度を調べた。 １）供試ウイルス：ファブリキウス嚢ウイルスは、市販
ファブリキウス嚢ウイルス生ワクチン（ひな用）の製造
用株（Ｋ株）を用いた。
【００３１】２）ファブリキウス嚢ウイルスの培養：実
施例３の基礎培地へＡ〜Ｃを添加した培地、Ａ〜Ｃの１
／５量を添加した培地および対照としてＦＢＳ５％また
は１％を添加した培地もしくは非添加培地を用いて、実
施例３と同様にして１日培養したＣＥ細胞、および実施
例３と同様に継代した後１日培養したＣＥ細胞を用い
た。細胞培養シャーレ内の培地を吸引除去し、付着した
細胞を基礎培地にて洗浄した。ここへ、１０％トリスリ
ン酸緩衝液含有イーグルＭＥＭ培地で１０4ＴＣＩＤ50
／ｍｌの濃度に希釈したファブリキウス嚢ウイルスをシ
ャーレあたり０.２ｍｌずつ接種し、２０分毎にウイル
スと細胞とを均一に接触させるため、シャーレを斜めに
し、液が細胞表面をムラなく浸すようティルティングさ
せながら１時間、ＣＯ2５％、３７℃の条件下でウイル
スを細胞へ吸着させた。この時点をウイルス感染０日目
とする。実施例３の基礎培地へＡ〜Ｃを添加した培地、
Ａ〜Ｃの１／５量を添加した培地および対照としてＦＢ
Ｓ５％または１％を添加した培地もしくは非添加培地
を、ウイルスを感染させた各シャーレにそれぞれ５ｍｌ
添加し、ＣＯ2５％、３７℃の条件下で静置培養した。
顕微鏡下で経日観察を行い、細胞の増殖を調べた。
施例３の基礎培地へＡ〜Ｃを添加した培地、Ａ〜Ｃの１
／５量を添加した培地および対照としてＦＢＳ５％また
は１％を添加した培地もしくは非添加培地を用いて、実
施例３と同様にして１日培養したＣＥ細胞、および実施
例３と同様に継代した後１日培養したＣＥ細胞を用い
た。細胞培養シャーレ内の培地を吸引除去し、付着した
細胞を基礎培地にて洗浄した。ここへ、１０％トリスリ
ン酸緩衝液含有イーグルＭＥＭ培地で１０4ＴＣＩＤ50
／ｍｌの濃度に希釈したファブリキウス嚢ウイルスをシ
ャーレあたり０.２ｍｌずつ接種し、２０分毎にウイル
スと細胞とを均一に接触させるため、シャーレを斜めに
し、液が細胞表面をムラなく浸すようティルティングさ
せながら１時間、ＣＯ2５％、３７℃の条件下でウイル
スを細胞へ吸着させた。この時点をウイルス感染０日目
とする。実施例３の基礎培地へＡ〜Ｃを添加した培地、
Ａ〜Ｃの１／５量を添加した培地および対照としてＦＢ
Ｓ５％または１％を添加した培地もしくは非添加培地
を、ウイルスを感染させた各シャーレにそれぞれ５ｍｌ
添加し、ＣＯ2５％、３７℃の条件下で静置培養した。
顕微鏡下で経日観察を行い、細胞の増殖を調べた。
【００３２】ＣＰＥが出現したところで培養上清を採取
し、遠心分離（３０００ｒｐｍ，２０分）により細胞屑
等を除いた後の培養上清を−８０℃で保存し、その後の
感染価試験に供した。また、培養３日目の細胞の状態を
顕微鏡で観察し、ＣＰＥ出現度を調べた。結果を表８及
び表９へ示す。ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆ
ｅｃｔ）とは細胞がウイルスに感染すると正常な細胞に
比べて、細胞の崩壊、断片化が起こるためその部位の様
子が変化することをいう。
し、遠心分離（３０００ｒｐｍ，２０分）により細胞屑
等を除いた後の培養上清を−８０℃で保存し、その後の
感染価試験に供した。また、培養３日目の細胞の状態を
顕微鏡で観察し、ＣＰＥ出現度を調べた。結果を表８及
び表９へ示す。ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆ
ｅｃｔ）とは細胞がウイルスに感染すると正常な細胞に
比べて、細胞の崩壊、断片化が起こるためその部位の様
子が変化することをいう。
【００３３】３）ウイルス感染価試験： 細胞：ＣＥ細胞 増殖用培地： 実施例３の基礎培地へＦＢＳを５％添加
した培地 維持培地：実施例３の基礎培地へＦＢＳ１％を添加した
培地 増殖用培地へＣＥ細胞を浮遊させ、１ウエルあたり６×
１０4個となるよう、細胞培養用９６穴平底プレート
（ヌンク（Ｎｕｎｋ）社製）へ分注した。細胞を５％
ＣＯ2インキュベーターで３７℃にて静置培養した。培
養１日後のシート状に増殖した細胞を用いてウイルスの
感染価を調べた。
した培地 維持培地：実施例３の基礎培地へＦＢＳ１％を添加した
培地 増殖用培地へＣＥ細胞を浮遊させ、１ウエルあたり６×
１０4個となるよう、細胞培養用９６穴平底プレート
（ヌンク（Ｎｕｎｋ）社製）へ分注した。細胞を５％
ＣＯ2インキュベーターで３７℃にて静置培養した。培
養１日後のシート状に増殖した細胞を用いてウイルスの
感染価を調べた。
【００３４】上清を除いた各ウエル内へ、２）で得られ
た各培地のウイルス含有培養上清を１０％トリスリン酸
緩衝液含有イーグルＭＥＭの培地で１０-1〜１０-8に希
釈したものを０.０５ｍｌ／ウエル添加した。５％ Ｃ
Ｏ2インキュベーター内で３７℃にて１時間、ウイルス
を吸着させた後、維持培地を０．１５ｍｌ／ウエル添加
し、５％ ＣＯ2インキュベーター内で３７℃にて静置
培養を行った。培養７日目までに細胞にＣＰＥの出現が
認められたものを陽性とし、リード・ミンチ（Ｒｅｅｄ
＆ Ｍｕｅｎｃｈ）の方法で培養組織の５０％を感染
させるウイルス希釈度（ＴＣＩＤ50）を測定し、ウイル
ス感染価を評価した。結果を表９へ示す。
た各培地のウイルス含有培養上清を１０％トリスリン酸
緩衝液含有イーグルＭＥＭの培地で１０-1〜１０-8に希
釈したものを０.０５ｍｌ／ウエル添加した。５％ Ｃ
Ｏ2インキュベーター内で３７℃にて１時間、ウイルス
を吸着させた後、維持培地を０．１５ｍｌ／ウエル添加
し、５％ ＣＯ2インキュベーター内で３７℃にて静置
培養を行った。培養７日目までに細胞にＣＰＥの出現が
認められたものを陽性とし、リード・ミンチ（Ｒｅｅｄ
＆ Ｍｕｅｎｃｈ）の方法で培養組織の５０％を感染
させるウイルス希釈度（ＴＣＩＤ50）を測定し、ウイル
ス感染価を評価した。結果を表９へ示す。
【００３５】
【表８】
【００３６】
【表９】
【００３７】
【発明の効果】本願発明の無血清培地は無血清条件下に
おいて細胞のウイルス増殖能を維持しつつ良好な細胞増
殖を示し、ウイルスの製造に好適に用いられる。本願発
明の無血清培地を用いてウイルスを製造すれば、血清の
品質に左右されない、安定した品質のウイルスが得られ
る。また、得られるウイルスには血清由来の成分を含ま
ないため、汚染やマイコプラズマウイルスによる感染等
の危険が大幅に減少し、繁雑な精製操作が不要になる。
本願発明の無血清培地を用いて製造されるウイルスは、
ワクチンの製造やウイルスの活性や毒性の発現調節等の
研究において好適に用いられる。
おいて細胞のウイルス増殖能を維持しつつ良好な細胞増
殖を示し、ウイルスの製造に好適に用いられる。本願発
明の無血清培地を用いてウイルスを製造すれば、血清の
品質に左右されない、安定した品質のウイルスが得られ
る。また、得られるウイルスには血清由来の成分を含ま
ないため、汚染やマイコプラズマウイルスによる感染等
の危険が大幅に減少し、繁雑な精製操作が不要になる。
本願発明の無血清培地を用いて製造されるウイルスは、
ワクチンの製造やウイルスの活性や毒性の発現調節等の
研究において好適に用いられる。
フロントページの続き (72)発明者 宮原 徳治 熊本県菊池郡菊陽町津久礼3566−22 県営 住宅13棟５号
Claims (5)
- 【請求項１】 動物細胞培養用基礎培地に塩基性繊維芽
細胞成長因子およびインシュリンを必須成分として含
む、ウイルス増殖に用いられる動物細胞用の無血清培
地。 - 【請求項２】 塩基性繊維芽細胞成長因子を０．５〜２
０ｎｇ／ｍｌ、インシュリンを０．１〜２０μｇ／ｍｌ
含有する請求項１記載の無血清培地。 - 【請求項３】 ウイルス増殖に用いられる動物細胞がハ
ムスター肺細胞である請求項１記載の無血清培地。 - 【請求項４】 ウイルス増殖に用いられる動物細胞が鶏
胚細胞である、請求項１記載の無血清培地。 - 【請求項５】 動物培養用基礎培地がイーグルＭＥＭ培
地又はその改変培地である、請求項１記載の無血清培
地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7316709A JPH09154571A (ja) | 1995-12-05 | 1995-12-05 | ウイルス製造用無血清培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7316709A JPH09154571A (ja) | 1995-12-05 | 1995-12-05 | ウイルス製造用無血清培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09154571A true JPH09154571A (ja) | 1997-06-17 |
Family
ID=18080034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7316709A Pending JPH09154571A (ja) | 1995-12-05 | 1995-12-05 | ウイルス製造用無血清培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09154571A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005537793A (ja) * | 2002-09-05 | 2005-12-15 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 無血清条件下で初代細胞を培養する方法及びウイルスを増幅させる方法 |
| US7964395B2 (en) | 2000-11-23 | 2011-06-21 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant and cultivation method |
-
1995
- 1995-12-05 JP JP7316709A patent/JPH09154571A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7964395B2 (en) | 2000-11-23 | 2011-06-21 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant and cultivation method |
| US7964398B2 (en) | 2000-11-23 | 2011-06-21 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant and cultivation method |
| US7964396B2 (en) * | 2000-11-23 | 2011-06-21 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant and cultivation method |
| US8236560B2 (en) | 2000-11-23 | 2012-08-07 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| US8470598B2 (en) | 2000-11-23 | 2013-06-25 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| JP2005537793A (ja) * | 2002-09-05 | 2005-12-15 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 無血清条件下で初代細胞を培養する方法及びウイルスを増幅させる方法 |
| JP2010148522A (ja) * | 2002-09-05 | 2010-07-08 | Bavarian Nordic As | 無血清条件下で初代細胞を培養する方法及びウイルスを増幅させる方法 |
| US7964397B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-06-21 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| US8329466B2 (en) | 2002-09-05 | 2012-12-11 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| US8673318B2 (en) | 2002-09-05 | 2014-03-18 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
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