KR101753596B1 - 바이러스 대량 생산용 신규 세포주 및 이의 제작 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스 대량 생산용 신규 세포주 및 이의 제작 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, BHK-21 세포로부터 유래된, 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주 및 상기 세포주 제작 방법을 제공한다. 본 발명의 신규 세포주는, 부유 배양이 가능하므로 부착 세포주에 비해 배양이 용이할 뿐만 아니라, 고역가로 바이러스를 생산하여 바이러스 생산능도 좋은 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 세포주는 바이러스 대량 생산에 응용하여 백신 및 진단액 제조 등에 효율적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 바이러스 대량 생산용 신규 세포주 및 이의 제작 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 백신의 제조를 위해서 발육중인 계란, 마우스 뇌, 또는 닭 또는 원숭이와 같은 다양한 동물로부터의 1차 세포 또는 확립세포주가 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 이러한 통상적인 기술은 하기에 언급되는 다양한 문제점을 포함한다.
첫째, 발육중의 계란을 사용하는 것은 닭의 사육 관리, 백신 제조 스케줄에 따라 조정되는 수정란의 관리, 및 제조 시 계란 단백질로부터 유래된 성분을 완전히 제거하기 위한 추가의 정제를 포함하는 번거로운 과정을 필요로 한다. 또한 동물 보호 측면에서도 문제점을 갖고 있다.
또한, 확립세포주의 경우, 세포 증식 인자로서 우태아 혈청을 첨가하여야 한다. 그러나, 시판용 제품간의 품질이 다양할 수 있고 마이코플라스마, 바이러스, 또는 프리온과 같은 감염성 단백질에 의해 감염 위험성을 갖기 때문에 품질의 엄격한 관리가 요구된다. 즉, 고품질의 우태아 혈청을 사용할 필요가 있지만 이는 매우 고가이기 때문에 공업용 수준에서 제조를 위해서는 부적절하다.
또한, 다양한 종류의 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주 중 MDCK(Madin Carby Canine Kidney) 세포가 실험용 수준으로 광범위하게 사용되고 있으나(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 122, pp.931-935(1996)), MDCK 세포는 벽에 부착되는 성질이 강해서, 공업용의 대규모 배양을 위해 MDCK 세포를 사용할 때 대량의 배양배지, 광범위한 면적의 배양을 위한 배양 용기 또는 담체를 필요로 한다. 이로 인해 하기와 같은 단점이 발생한다: 1) 설비 또는 담체에 대한 비용이 막대하고; 2) 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하고 이로 의해 회수시 일부 세포의 손실이 발생하고; 3) 배양 조건에 따라 담체(비드)사이의 접촉에 의한 세포의 손상이 있다.
따라서, 대규모의 바이러스 생산을 위해서는 비용 설치 면에서 저렴하고, 매우 안전하며 안정적인 신규한 세포주를 개발하는 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 바이러스를 대량 생산 가능한 신규한 세포주를 확립하기 위하여 예의 노력하였고, 그 결과, 혈청 배지 또는 무혈청 배지의 부유 배양에서 증식할 수 있고 신규한 세포주를 확립하였다. 또한, 상기 세포주를 이용하여 구제역 바이러스를 고역가로 생산함으로서 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 BHK-21 세포로부터 유래된, 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주들을 제공하는 데 있다(수탁번호: KCTC 12581BP 및 KCTC 12582BP).
또한, 본 발명의 다른 목적은 바이러스 대량 생산용 세포주 제작 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 첨부된 청구범위 및 도면으로부터 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 BHK-21 세포로부터 유래된, 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주 2종을 제공한다(수탁번호: KCTC 12581BP 및 KCTC 12582BP).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포주는 바이러스 대량 생산 용도로 제작된 것이다.
본 발명은 혈청 배지에서 부유 배양(suspension culture)할 수 있는 BHK-21 세포 유래 세포주(수탁번호: KCTC 12581BP) 및 무혈청 배지에서 부유 배양(suspension culture) 할 수 있는 BHK-21 세포 유래 세포주(수탁번호: KCTC 12582BP)를 제공하는 것이며, 상기 세포주들은 세포 성장에 문제가 없고 다양한 바이러스에 대해 높고 고른 생산성을 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 상기 세포주 2 종을 각각 BHI-QV34 및 BHI-QVS42로 명명하고, 2014년 4월 29일 한국생명공학연구소에 각각 수탁번호 KCTC 12581BP 및 KCTC 12582BP로 기탁하였다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포주는 담체를 필요로 하지 않는다. 상기 담체는 부착을 위한 것(예컨대, 비드)으로서, 담체에 대한 비용이 막대하며 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하여, 이로 인해 세포의 손실 및 손상이 발생한다.
따라서, 상기 제작된 부유세포주는 부착세포에 비하여 그 용적 및 배양이 용이하여 바이러스를 대량 생산 하기에 용이하므로, 대량의 바이러스를 생산하는데 보다 효율적인 응용이 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 토가비리다에 (Togaviridae), 허피스비리다에 (Herpesviridae), 랍도비리다에(Rhobdoviridae), 레트로비리다에 (Retroviridae), 레오비리다에 (Reoviridae), 플라비비리다에 (Flaviviridae), 아데노비리다에 (Adenoviridae), 피코나비리다에 (Picornaviridae), 아레나비리다에 (Arenaviridae) 및 폭스비리다에 (Poxviridae)로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMD), 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병 바이러스, RS 바이러스, 레오바이러스 3형, 황열 바이러스, 일본뇌염바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 폴리오바이러스, 라사(Lassa) 바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMD)이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 바이러스 대량 생산용 세포주 제작 방법을 제공한다:
(a) BHK-21 세포를 혈청 배양 배지에서 부유 배양에 적용시켜, 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하고; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 무혈청 배양 배지에 순화시켜 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하는 단계.
본 명세서에서 배양 배지를 언급하면서 사용되는 용어 "무혈청" 및 표현 "혈청을 필요로 하지 않는"은 동물(예컨대, 소) 유래 혈청을 포함하지 않는 배양 배지를 의미한다.
상기 배지는 GMEM(Glasgow modified Eagle medium), BME(basal Eagle Medium), MEM(minimum Eagle Medium), 배지 199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's medium), MacCoy's 5A 배지 및 RPMI 1640로 구성된 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 GMEM(Glasgow modified Eagle medium)이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 BHK-21 유래 부유 세포주(수탁번호 KCTC 12581BP)는, 부착성 BHK-21 세포를 5% 우태아혈청(FBS)이 포함된 GMEM(Glasgow modified Eagle medium) 배지에서 배양하는 단계; 상기 수득한 세포를 부착 상태로 계대 배양시키는 단계; 및 상기 수득한 세포를 5% CO2 배양기에서 120 내지 130rpm으로 교반하는 방식으로 부유 배양에 적응시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된다.
또한, 본 발명의 BHK-21 유래 부유 세포주(수탁번호 KCTC 12582BP)는, 부착성 BHK-21 세포를 5% 우태아혈청(FBS)이 포함된 GMEM(Glasgow modified Eagle medium) 배지에서 배양하는 단계; 상기 수득한 세포를 부착 상태로 계대 배양시키는 단계; 상기 수득한 세포를 5% CO2 배양기에서 120 내지 130rpm으로 교반하는 방식으로 부유 배양에 적응시키는 단계; 상기 수득한 세포를 무혈청 배지(5% 우태아혈청이 함유되지 않은 GMEM)로 교체하여 배양에 적응시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된다.
상기 제작 방법에 따라 제작된 BHK-21 유래 부유 세포주는 장기 배양하여도 높은 세포 성장율 및 생존율을 나타낸다. 또한, 상기 세포주는 탁월한 바이러스 생산능을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 BHK-21 유래 부유 세포주는 바이러스를 대량 증식시키는 데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 세포주를 제작하는 방법이므로, 본 발명의 세포주와 관련된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 신규 세포주는, 부유 배양이 가능하므로 부착 세포주에 비해 배양이 용이할 뿐만 아니라, 고역가로 바이러스를 생산하여 바이러스 생산능도 좋은 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 세포주는 바이러스 대량 생산에 응용하여 백신 및 진단액 제조 등에 효율적으로 사용될 수 있다.
도 1은 부유화 세포를 제작한 뒤, 세포의 성장 곡선을 모식화한 것이다.
도 2는 부유화 세포 완성 후, 세포의 형태를 확인한 결과이다.
도 3은 세포 부착인자 발현 양상 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 부유화 세포 완성 후, 세포의 형태를 확인한 결과이다.
도 3은 세포 부착인자 발현 양상 확인 결과를 나타낸다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 부유 세포주 제작
부착 세포인 BHK-21 세포를 이용하여 34℃에서 120rpm으로 20대 이상 배양하여 부유배양에 적응시켰다. 이렇게 부유 배양된 세포는 계대 배양 4일이내에 세포수 10배이상 증가를 보였다. 부유배양용 배지로는 10% Tryptose Phosphate broth(29g/L in H2O, autoclave sterile), 2 내지 5% 우태아혈청(FBS, certified grade), 항생제(streptomycin-penicillin, amphotericin B 포함)을 포함하는 Glasgow's MEM(Invitrogen)을 사용하였다. 세포 보관 시에는 5% DMSO에 95% 우태아혈청을 섞어 ml당 106 세포수로 액체질소에 보관하거나, Cellbanker 1 serum type(Zenoaq)에 ml당 106 세포수로 -20℃에 보관하였다.
또한, 확보된 부유 세포를 무혈청배지(Serum free media, Opti-PRO SFM, Invitrogen)에 적응시켰으며, 3 종의 부유배양세포를 각각의 배지를 이용하여 확보하였다(표 1). 무혈청배지에 우태아혈청을 단계적으로 조절(10%, 5%, 2%, 0%)하며, 배양에 사용되었던 wasting media를 계대시 50%씩 혼합하는 방식으로 무혈청 배지에 적응시켰으며 표 2에 나타내었다. 배양 조건은 상술한 바와 같이 34℃에서 120rpm으로 유지하였고, 무혈청배지 적응 후 5 계대가 넘어서면서 안정화되었다. 상기 무혈청배지에 적응된 3 종의 세포주는 Cellbanker 2 serum free type(Zenoaq)에 ml당 106 세포수로 -20℃에 보관하였다.
| 배지조건 | 세포명 | 배지조건 | 세포명 |
| Glasgow's MEM (FBS 함유) |
BHK-QV34 | SFM (FBS 비-함유) |
BHK-QVS34 |
| BHK-QV42 | BHK-QVS42 | ||
| BHK-QV43 | BHK-QVS43 |
본 발명자들은 상기 세포주들 중 BHI-QV34 및 BHI-QVS42 2종을, 2014년 4월 29일 한국생명공학연구소에 각각 수탁번호 KCTC 12581BP 및 KCTC 12582BP로 기탁하였다.
[실시예 2] 부유 세포주의 특성 확인
부유 세포주의 성장, 형태 및 세포 부착 인자 발현 수준을 확인하여, 본 발명의 부유 세포주의 특성을 평가하였다.
세포주의 성장율 및 생존율은 자동세포계수기를 이용하여 24시간 간격으로 측정되었다. 본 발명에 이용된 생존율 측정은 trypan blue 염색을 통하여 사멸세포를 구분하였다.
세포의 형태 관찰은 부유배양 적응된 세포를 대상으로 부유배양 적응 후, 평판에 배양했을 때, 기존의 fibroblast 형태로 되돌아가는지 알아보기 위하여 TC 처리된 평판 세포배양 플레이트를 이용하여 수행되었다. 24시간 간격으로 현미경으로 경검하여 형태변화를 관찰하였다.
세포부착발현인자는 Cell Biolabs Inc.에서 시판되고있는 CytoSelectTM Cell Adhesion Assay kit (CBA-070)를 사용하여 발현 수준을 확인하였다. 상기 키트는 세포 부착에 관여하는 것으로 알려진 5개의 인자(Fibronectin, Collagen I, Collagen IV, Laminin I, Fibrinogen)에 대한 발현 정도를 알 수 있도록 고안되어 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 부유 세포주의 성장율 및 생존율을 확인한 결과, 동등한 수준의 세포 성장율(왼쪽) 및 약 85% 이상의 높은 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 부유 세포주의 형태 관찰을 한 결과, 형태가 완연한 구형인 것을 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포부착에 관여하는 인자의 발현 수준을 비교한 결과, 부유배양세포가 부착세포에 비해 Collagen IV가 현저히 낮게 발현되는 것이 확인되었고, 무혈청배지를 사용한 군에서 Laminin I 및 Fibrinogen이 낮게 발현되는 것이 확인되었다.
[실시예 3] 부유 세포주의 바이러스 생산능 평가
구제역 바이러스를 이용하여 본 발명의 세포주의 바이러스 생산능을 평가하였다.
기존의 부착 세포와 발명된 부유세포를 이용하여 바이러스 감염실험을 수행하였다. 동일한 세포수와 배지용량으로 시작하여 국내 구제역바이러스 분리주인 FMD O Andong strain을 동일한 양을 감염시켰다. 감염 24시간 후 배양상층액에서 바이러스를 수거하였다. 수거된 바이러스를 이용하여 바이러스 역가를 산출하여, 대조군인 부착 세포 BHK-21과 부유 세포주 6 종들의 바이러스 생산능 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| Cells | TCID50/ml | Media | average | |||
| P1 | P2 | P3 | Log값 | 변환 | ||
| BHK-21 | 7 | 6.8 | 7.3 | 2% FBS GMEM | 7.0 | 10,797,752 |
| BHK-QV34 | 7.6 | 8 | 8 | 7.9 | 73,564,225 | |
| BHK-QV42 | 8.5 | 7.5 | 8.3 | 8.1 | 125,892,541 | |
| BHK-QV43 | 8.2 | 7.3 | 8 | 7.8 | 68,129,207 | |
| BHK-QVS34 | 7.9 | - | - | SFM | 7.9 | 79,432,823 |
| BHK-QVS42 | 7.4 | - | - | 7.4 | 25,118,864 | |
| BHK-QVS43 | 5.4 | - | - | 5.4 | 251,189 | |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 부유 세포주 중 BHK-QV34와 BHK-QVS34는 약 108의 TCID50/ml 값을 나타내어 107의 TCID50/ml 값을 나타낸 대조군에 비하여, 약 10 배에 해당하는 차이를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 부유 세포주는 부착 세포주에 비하여 탁월한 바이러스 생산능을 나타내므로 바이러스 대량 생산에 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.
Claims (10)
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- 다음 단계를 포함하는 구제역 바이러스(Foot and mouth disease virus, FMD) 대량 생산 방법:
(a) BHK-21 세포를 혈청-함유 GMEM(Glasgow modified Eagle medium) 배양 배지에서 부유 배양에 적용시켜, 부유 배양에서 증식할 수 있는 BHK-21 세포-유래 BHK-QV34 세포주(수탁번호: KCTC 12581BP)를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 부유 배양에서 증식할 수 있는 BHK-21 세포-유래 BHK-QV34 세포주(수탁번호: KCTC 12581BP)를 무혈청 GMEM(Glasgow modified Eagle medium) 배양 배지에 순화시켜 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 BHK-21 세포-유래 BHK-QVS42 세포주(수탁번호: KCTC 12582BP)를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 BHK-21 세포-유래 BHK-QVS42 세포주(수탁번호: KCTC 12582BP)에 구제역 바이러스를 감염시켜 대량 생산하는 단계. - 제 7 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 구제역 바이러스는 국내 분리주인 FMD O Andong인 것을 특징으로 하는 방법.
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