KR20050037551A - 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법 - Google Patents

무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일차세포의 배양방법에 관한 것이다. 일차세포는 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 배양된다. 일차세포의 배양방법은 폭스 바이러스와 같은 바이러스의 증폭방법에서 한 단계일 수 있다. 후자의 방법에 따르면 일차세포는 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 배양되었다. 이어 바이러스에 의해 세포를 감염시키고 감염된 세포는 후대 바이러스가 생성될 때까지 무혈청 배지에서 배양한다.

Description

무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법{METHOD FOR THE CULTIVATION OF PRIMARY CELLS AND FOR THE AMPLIFICATION OF VIRUSES UNDER SERUM FREE CONDITIONS}
본 발명은 일차세포의 배양방법에 관한 것이다. 일차세포는 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 배양된다. 일차세포의 배양방법은 폭스바이러스(poxvirus)와 같은 바이러스 증식방법중의 한 단계일 수 있다. 후자의 방법에 따르면, 일차세포는 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 배양된다. 상기 세포는 이어 바이러스에 의해 감염되며, 감염된 세포는 후대 바이러스가 생성될 때까지 무혈청 배지에서 배양된다.
독성 약화된 또는 재조합 바이러스와 같은 대부분의 바이러스 백신은 세포배양 시스템으로부터 제조된다. 바이러스/백신 제조에 사용되는 세포는 세포주, 즉 바이오리액터(bioreactor)내의 단일-세포 현탁 배양액으로서 또는 조직배양 플라스크 또는 롤러병의 세포 지지표면상의 단일층으로서 시험관내에서 지속적으로 성장하는 세포일 수 있다. 바이러스 생성에 사용되는 세포주의 일부 예로는 소아마비 바이러스의 제조에 사용되는 사람 태아 폐 세포주 MRC-5 및 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스 및 풍진 바이러스(MMR II)(Merk Sharp & Dohme)의 제조에 사용되는 사람 태아 폐 세포주 WI-38이다.
세포주뿐만 아니라 동물의 일차세포도 백신의 제조에 사용된다. 바이러스 생성에 사용되는 일차세포의 예로는 닭 배아 섬유아세포(CEF 세포)이다. 이들 세포는 홍역 및 일본뇌염 바이러스(Pasteur Merieux), 이하선염 바이러스(Provaccine에 의해 제조), 광견병 바이러스(Chiron Berhing GmbH & Co.에 의해 제조), 황열 바이러스(Aprilvax에 의해 제조), 인플루엔자 바이러스(Wyeth Labs 및 SmithKline & Beecham에 의해 제조됨) 및 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 생성에 사용된다.
CEF 세포가 종종 사용되는데 이는 CEF 세포를 연속적으로 통과함으로써 치명적인 질환을 유발하는 바이러스를 독성약화시켜 많은 바이러스 백신이 만들어지기 때문이다. 독성약화된 바이러스는 더 이상 질환을 유발하지 않으나, 독성형태의 바이러스에 대해 강한 보호 면역을 여전히 자극할 수 있다. 이러한 유형의 바이러스 예는 MVA이다. 이 바이러스는 사람 및 대부분의 동물에서 복제가 매우 제한된다. 사람에서 질병을 유발하는 다양한 물질로부터 유도된 항원을 발현시키는데 MVA가 사용될 수 있기 때문에, MVA는 백신 벡터로서 개발되어졌다. MVA와 같은 독성약화된 바이러스는 사람 세포상에서 증식되지 않기 때문에 상기 바이러스가 사람세포에서 다시 복제될 수 있을지에 대해 관심이 모아졌다. 그러나, 사람 세포에서 복제능력이 회복된 바이러스를 사람에게 투여한다면, 특히 개체가 면역력이 손상되었다면 건강을 위협할 수 있다. 이러한 이유로, 사람에게 사용하고자 할 경우 MVA와 같이 독성약화된 일부 바이러스는 CEF 세포로부터 엄격하게 제조된다.
또한, CEF 세포는 상기 세포상에서만 성장하는 바이러스에도 사용된다. 그러한 바이러스의 예는 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 특히 카나리아 폭스 바이러스, ALVAC, 계두 바이러스(fowl poxvirus) 및 NYVAC와 같은 조류 바이러스이다.
시험관내 배양조건하에서 성장한 세포주 및 일차세포는 (I) 로그상의 세포복제 및 (II) 세포가 더 이상 분열되지 않는, 즉 세포가 정지상일 때 세포유지를 지지할 수 있는 특별한 성장배지 및 유지배지를 필요로 한다. 일반적으로 사용되는 세포배양 배지는 비타민, 아미노산, 필수 미량원소 및 설탕을 함유하는 염이 풍부한 용액을 포함한다. 세포성장 및 유지에 필요한 성장 호르몬, 효소 및 생물학적 활성 단백질은 동물 혈액 유도된 혈청 생성물 형태로 보충제로서 배지에 일반적으로 부가된다. 동물 혈액 유도된 혈청 생성물의 예는 태아 송아지 혈청, 닭 혈청, 말 혈청 및 돼지 혈청이다. 이들 혈청은 적혈구 및 백혈구가 제거된 분획화된 혈액으로부터 유도된다. CEF 세포와 같은 일차세포는 세포주보다 동물 혈청 공급원에 더 의존한다. 따라서, 일차세포는 5 내지 10% 혈청, 대부분의 경우 태아 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 세포배양 배지에서 일반적으로 배양된다.
동물 혈청은 세포성장에 필요한 인자뿐만 아니라 부착세포로서 천연적으로 성장하는 세포가 배양용기의 세포지지 표면에 부착되게 하는데 필요한 인자도 포함한다. 따라서, 배지에 충분한 혈청을 부가하여 부착세포를 성장시켜 단일층을 형성하게 하는 것은 매우 중요하다.
불행하게도, 다른 동물 혈청과 마찬가지로 소/태아 송아지 혈청은 바이러스와 같은 우발적인 병원성 물질을 함유할 수 있다. 이들 병원성 물질은 세포배양물로 제조된 백신 또는 다른 약제학적 생성물에 의해 치료 또는 백신접종될 동물/사람에게 전달될 잠재적 위험이 있다. 이는 세포 배양 생성물을 면역력이 손상된 사람에게 투여할 때 특히 관련성이 있다. 일반적으로 사용되는 소 혈청 보충제와 관련된 무수히 많은 잠재된 주요 문제중의 하나는 세포배양으로부터 생성된 생성물과 접촉하는 동물/사람에게 우해면양뇌증(BSE, 일명 광우병)을 유발하는 물질을 전달할 가능성이 있다는 것이다.
세포배양에서 동물혈청의 사용과 관련하여 발생할 수 있는 위험을 고려할 때, 동물 생성물의 사용이 없는 제조방법이 매우 바람직하다는 것이 명확해졌다.
이를 위해, 지속적으로 성장하는 세포배지용 및 지속적으로 성장하는 세포주에서 바이러스 생성용으로 동물 혈청이 보충될 필요가 없는 특정 배지를 개발하였다. 세포주를 배양하는데 사용될 수 있는 무혈청 배지의 예는 Gibco BRL/Life Technologies에 의해 제조된 VP-SFM이다. 제조자 정보에 따르면, VP-SFM은 VERO, COS-7, MDBK, Hep2, BHK-21 및 다른 중요한 세포주(Price, P. 및 Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69)의 성장 및 상기 세포주에서 바이러스 생성에 대하여 특이적으로 고안되었다. 상기 배지에서 일차세포의 배양에 관한 이용가능한 정보는 없다.
미국특허 제5,503,582호는 무혈청 배지에서 계두 바이러스로 세포를 감염시킨 후 4% 송아지 혈청을 포함하는 배지에서 CEF 세포의 배양을 개시하였다. Spataro, A. C 외., J. Cell. Sci. 1976; 21, 407-413는 CEF 세포는 일단 단일층이 형성되면 24시간동안 무혈청 배지에서 유지될 수 있음을 개시하였다. 따라서, 상기 2개 문헌에 따르면, 살포 후 세포의 배양에 사용된 배지는 혈청을 포함한다. 표면에 이미 부착되어 정지상에 이른 세포의 유지만을 위해, 무혈청 배지가 사용되었다. 무혈청 배지 199 또는 RPMI-1640과 같은 전통적인 배지를 사용하여 살포 된다면, 단일층은 형성되지 않으며 상기 세포는 배지에 생존할 수 없는 응집체를 형성한다.
WO 제98/15614호는 시험관내에서 동물세포의 배양을 위한 특정한 무혈청 배지에 관한 것이다. WO 제98/15614호에 개시된 바와 같이, 배지에서 배양될 수 있는 세포는 포유류, 새, 곤충 또는 물고기로부터 수득한 세포를 비롯하여 동물 기원의 세포이다. 포유류 세포는 사람 기원의 일차세포일 수 있다. 조류 일차세포에 관한 언급은 되어 있지 않다.
미국특허 제5,405,772호는 세포증식 및 발달용의 무혈청 배지를 개시한다. 이들 세포는 바람직하게는 조혈세포 및 골수기질세포이다. 조류의 일차세포는 언급되어 있지 않다.
WO 제98/04680호는 세포주 BHK, Vero 또는 MRC-5와 같은 부착성(anchorage-dependent) 포유류 세포 성장용의 무혈청 배지를 개시하였다. WO 제98/04680호는 일차세포 및 조류세포에 관하여 전혀 언급하고 있지 않다..
발명의 목적
본 발명의 목적은 (I) 로그상 동안의 세포의 성장 및 (II) 정지상에서 세포의 유지를 허용하는 일차세포의 배양방법, 특히 무혈청 배지에서 조류 일차세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 세포가 부착세포일 경우, 배지는 (III) 세포 배양용기의 표면에 부착세포의 부착을 허용할 수 있다. 본 발명의 다른 목적은 무혈청 조건하에서 일차세포를 사용하는 것에 의한 바이러스의 생성방법을 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 성장인자 및 부착인자로 구성된 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 일차세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 일차세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 부착세포로 천연적으로 성장하는 일차세포는 살포 후, 세포배양 용기의 표면에 부착되며 단일층이 형성될 때까지 로그상으로 성장한다. 본 발명에 따르면, 증식하지 않은 세포는 세포의 부착 및 로그 성장중에 사용된 배지내에 유지될 수 있다.
본 발명의 방법은 단층을 형성하는 세포에 국한되지 않는다. 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은 현탁 배양으로 천연적으로 성장하는 세포(림프구 또는 다른 형태의 혈액세포) 또는 부착세포로서 천연적으로 성장하지만 현탁배양으로 성장하도록 개조된 세포와 같이 모든 다른 형태의 일차세포에 대해 사용될 수 있다.
하기에서 나타난 바와 같이, 상기 세포는 백신으로서 유용한 바이러스의 무혈청 증식에도 또한 사용될 수 있다.
일차세포가 다수의 상이한 인자 및 혈청내에 포함된 성분에 의존하는 것으로 일반적으로 여겨졌기 때문에, 천연적으로 부착세포로 성장하는 일차세포가 (I) 수용불가능한 양의 응집체를 형성함없이 세포배양 용기의 표면에 효과적으로 부착할 수 있으며, (II) 혈청 부재하에서 로그상으로 성장할 수 있다는 것은 뜻밖이었다. 또한, 무혈청 배지에서 배양될 때 부착세포는 세포배양 용기의 표면에 부착하지 않는 생존불가능한 응집체를 형성하는 것으로 여겨졌다. 따라서, 부착성 일차세포를 부착하고 성장시키기 위해서, 성장인자 및 부착인자로 구성된 그룹으로부터 선택된 인자를 무혈청 배지에 부가하는 것으로 충분하다는 것은 뜻밖이었다. 또한, 현탁배양으로 배양된 일차세포가 본 발명에 따른 방법에 사용된 배지에서 성장할 수 있다는 것 역시 뜻밖이었다. 또한, 조류세포가 성장인자 또는 부착인자를 포함하지 않는 무혈청 배지에서 성장이 극도로 나쁘다는 것으로 공지되었기 때문에, 닭 배아 섬유아세포(CEF)와 같은 조류 일차세포가 성장인자 및 부착인자로 구성된 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 수용불가능한 양의 응집체를 형성함없이 세포배양 용기의 표면에 부착하도록 배양될 수 있다는 것 또한 놀라운 것인 바, 즉 조류 일차세포의 빈약한 성장특성은 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 무혈청 배지에 부가함으로써 상당히 향상될 수 있다는 것은 뜻밖이었다.
본원에 사용된 용어“일차세포”는 당업자에게 잘 알려져 있다. 하기의 정의에 제한됨없이, 용어“일차세포”는 동물 또는 사람의 조직, 기관 또는 유기체로부터 새롭게 분리된 세포에 관한 것으로, 상기 세포는 연속적, 무기한으로 복제 및 분열 할 수 없다. 일반적으로, 일차세포는 세포배양에서 100배 미만, 종종 50배 미만, 종종 25배 미만으로 분열한다. 따라서, 일차세포는 영속처리되지 않는 것이다. 일차세포의 예는 제대혈 림프구 및 사람 또는 동물 섬유아세포이다. 동물 섬유아세포의 바람직한 예는 조류 섬유아세포, 가장 바람직하게는 닭 배아 섬유아세포(CEF 세포)이다. 사람 일차 섬유아세포의 예는 바람직한 예는 사람 표피 섬유아세포이다.
일차세포가 어떻게 분리될 수 있는 지는 당업자에게 매우 잘 알려진 방법이다. 일반적으로, 일차세포 배양액은 조직, 기관 또는 배아로부터 직접적으로 유도된다. 단일세포를 얻기위해 조직, 기관 또는 배아는 프로테아제 처리된다. 상기 세포는 이어 본 발명의 방법에 따라 시험관내 배양 조건하에서 배양된다.
특히, CEF 세포는 프로테아제 분해된 닭 배아로부터 수득된다. 본 발명에 따르면, CEF 세포는 고형의 세포지지 표면에 부착된 부착세포로서 잘 성장한다. 이들 세포는 복제를 개시하며 단일층을 형성한다. 동물 혈청없이 표준 배양 배지를 사용하여 시험관내에서 CEF 세포(배아 분해 후)가 배양될 경우, 상기 세포는 종종 고형의 세포지지 표면에 부착할 것이나, 세포의 콘플루언트 단일층을 형성할 정도로 복제되지 않을 것이며, 시간이 경과함에 따라 고형의 배양 지지 표면으로부터 서서히 분리된다. 반대로, 본 발명의 방법에 따라 CEF 세포가 배양될 경우, 상기 세포는 고형의 지지표면에 부착하여 단일층이 형성될 때까지 로그상으로 성장하며 수일간 정지상으로 유지될 수 있다.
부착성 일차세포와 관련하여, 무혈청 배지에서“세포배양”이라는 용어는 무혈청 배지중의 배양용기내로 세포를 살포하고, 단일층이 형성될때까지 무혈청 배지에서 로그상으로 세포를 성장시키며 및/또는 단일층이 형성되자마자 무혈청 배지에서 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 더 바람직하게 무혈청 배지에서“세포배양”이라는 용어는 무혈청 배지에서 상술한 모든 단계가 실시됨으로써 세포의 전체 배양과정중에 동물의 혈청 생성물이 전혀 존재하지 않는 방법을 지칭한다. 따라서, 좀 더 일반적인 의미에서 용어“무혈청 배지에서 세포배양”은 단일층을 형성하는 모든 배지가 무혈청 배지라는 사실을 의미한다. 상기의 모든 단계에 사용된 배지는 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 인자를 로그 조건하에서 세포의 부착 및/또는 세포의 성장에 사용된 배지에만 부가하는 것으로도 충분할 것이다.
현탁배양에서 성장하는 세포와의 관계에서 무혈청 배지에서“세포배양”이라는 용어는 무혈청 배지중의 배양용기내로 세포를 살포하고, 이들 세포를 무혈청 배지에서 로그상으로 성장시키며 및/또는 추가의 복제가 발생하지 않는 포화 농도를 수득하자마자 무혈청 배지에서 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 더 바람직하게는 무혈청 배지에서“세포배양”이라는 용어는 무혈청 배지에서 상술한 모든 단계가 실시됨으로써 세포의 전체 배양과정중에 동물의 혈청 생성물이 전혀 존재하지 않는 방법을 지칭한다. 상기의 모든 단계에 사용된 배지는 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 인자를 로그 조건하에서 세포의 살포 및/또는 세포의 성장에 사용된 배지에만 부가하는 것으로도 충분할 것이다. 하기에서 더 상세하게 설명한 바와 같이, 적절한 배양조건이 선택(예를들면,“파장”배양을 적용함으로써)된다면, 부착세포 및 현탁배양 세포와 같이 정상적으로 성장하는 세포를 배양하는 것이 또한 가능할 것이다. 본 발명에 따른 방법은 이 유형의 배양에도 적용된다.
용어 “무혈청”배지는 동물 또는 사람으로부터 유래된 혈청을 함유하지 않는 임의의 세포배양 배지를 의미한다. 적절한 세포배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함한다. CEF 세포를 무혈청 배지에서 배양하기에 적절한 배지의 예는 배지 199이다(Morgan, Morton 및 Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; obtainable inter alia from LifeTechnologies).
본 발명의 방법에 따라 사용된 배지, 특히 CEF 세포와 같은 부착세포에 사용된 배지는 성장인자 및 부착인자로 구성된 그룹으로부터 선택된 인자를 함유한다. 부착인자에 대한 예는 피브로넥틴이다.
부착세포로서 천연적으로 성장하는 세포는 현탁배양에서 결코 배양되지 않지만(CEF 세포는 가능하다), 성장인자의 그룹으로부터 선택된 인자를 사용하는 것은 특히 바람직하다. 이러한 유형의 배양에 유용한 성장인자의 예는 소, 마우스, 닭 또는 사람의 표피 성장인자(EGF)이다. 가장 바람직한 것은 재조합 사람 EGF(rh-EGF)이다(Chemicon Int., Cataloge number: GF001).
현탁배양으로 천연적으로 성장하는 세포에 있어서 배지는 바람직하게는 EGF를 비롯한 성장인자의 그룹으로부터 선택된 인자를 포함할 것이다. 가장 바람직하게는 이러한 유형의 세포의 성장인자는 비-부착세포에 대해 특이적인 인자이다. 이들 성장인자의 예로는 인터루킨, GM-CSF, G-CSF 및 기타이다. 당업자는 일반적인 실험에 의해 세포유형에 적절한 인자의 형태를 용이하게 측정할 수 있을 것이다.
만일 무혈청 배지에 부가되는 인자가 EGF, 특히 rh-EGF일 경우, 1 내지 50ng/ml의 농도로, 더 바람직하게는 5 내지 20ng/ml의 농도로 배지에 부가되는 것이 바람직하다. 그러나, 상이한 세포유형은 최적의 결과를 얻기 위해서 혈청에서 다소 상이한 EGF의 농도를 필요로 할 수 있다는 사실을 당업자는 알 것이다.
만일 무혈청 배지에 부가되는 인자가 피브로넥틴(예를들면, Chemicon Int: 사람 혈장 피브로넥틴; cataloge number FC010)일 경우, 1 내지 50, 더 바람직하게는 1 내지 10㎍/세포배양용기 표면 ㎠의 농도로 배지에 부가되는 것이 바람직하다. 그러나, 상이한 세포유형은 최적의 결과를 얻기 위해서 혈청에서 다소 상이한 피브로엑틴의 농도를 필요로 할 수 있다는 사실을 당업자는 알 것이다.
본 발명에 따르면, 특히 세포가 부착세포일 경우, 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 하나의 인자만을 배지에 부가하는 것은 충분하다. 그러나, 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 하나 이상의 인자를 배지에 부가하는 것 또한 가능하다. 상기 배지는, 특히 일차세포가 CEF 세포와 같이 부착세포일 경우 바람직하게는 상기 한정된 농도의 범위에서 EGF 및 피브로넥틴을 포함할 수 있다.
상기 배지는 미생물 추출물, 식물 추출물 및 비포유류 동물의 추출물로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 미생물 추출물은 바람직하게는 효모 추출물 또는 이스트올레이트 한외여과액이다. 식물 추출물은 바람직하게는 쌀 추출물 또는 콩 추출물이다. 비포유류 동물로부터의 추출물은 바람직하게는 생선 추출물이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자가 부가된 상업적으로 시판되는 무혈청 배지에 아스파라긴이 부가될 수 있다. 더 바람직하게는, 아스파라긴은 바이러스(하기 참조)에 의한 감염중에 사용된 배지에 부가된다. 상업적으로 시판되는 무혈청 배지는 0.3 내지 1.0mM 밀도 범위의 아스파라긴을 일반적으로 포함한다. 배지에 부가되는 아스파라긴의 바람직한 양은 0.5 내지 1.5mM의 범위이다. 가장 바람직한 것은 1mM의 아스파라긴을 부가하는 것이다. 배지내의 아스파라긴의 총 밀도는 바람직하게는 2mM 미만 및 더 바람직하게는 0.8 내지 1.8mM의 범위내이다. 가장 바람직하게는 배지내의 아스파라긴의 밀도는 1.3mM이다.
또한, 바람직하게는 글루타민이 배지에 부가될 수 있다. 더 바람직하게는 바이러스(하기 참조)의 감염중에 사용된 배지에 글루타민이 부가된다. 배지에 부가되는 글루타민의 바람직한 양은 1 내지 5nM, 더 바람직하게는 2 내지 4mM의 범위이다. 상업적으로 시판되는 대부분의 배지는 글루타민을 함유하지 않기 때문에 상기 범위는 배지내의 바람직한 총 농도에 또한 대응한다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 바이러스의 증폭방법에 관한 것이다: 첫번째 단계는 본 발명에 따라 일차세포를 배양, 즉 세포유형에 따라 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 일차세포를 배양하는 것이다. 모든 조건, 정의, 바람직한 구체예 및 상기 일차세포의 배양방법을 개시하기 위한 가장 바람직한 구체예에 대한 바람직한 순서 또한 본 발명의 구체예에 따른 바이러스의 증폭방법의 첫번째 단계에 대한 정의에 적용된다. 두번째 단계로, 일차세포를 바이러스로 감염시킨다. 세번째 단계에서, 감염된 세포는 후대 바이러스를 생성할 때까지 무혈청 배지에서 배양된다.
본 발명에 따른 방법을 명확하게 하기 위해 사용된 용어“바이러스의 증폭”은 감염된 세포에서 바이러스의 다산적인 복제에 기인한 바이러스 양을 증가시키는데 사용된다. 즉, 생산된 바이러스 대 투입된 바이러스의 비율은 바람직하게는 1이상이어야 한다. 따라서, 본 발명에 따라 이들 일차세포는 바이러스가 많이 복제를 할 수 있는 특이적 바이러스를 선택한다. 용어“다산적인 복제”는 특정 일차세포에서 특정 바이러스가 감염성 후대 바이러스가 생성될 정도로 복제한다는 사실에 관한 것으로, 생산된 바이러스 대 투입된 바이러스의 비율은 1이상이다.
당업자는 바이러스가 일차세포의 유형에서 다산적으로 복제할 수 있다는 것을 알고 있다. 일례로서, 증폭될 바이러스가 사람의 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)일 경우 일차세포는 사람 표피 섬유아세포일 것이다; 증폭될 바이러스가 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 백시니아 바이러스 특히, 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)와 같은 폭스 바이러스일 경우 일차세포는 CEF 세포일 것이다.
본 발명 구체예의 두번째 단계에 따라 일차세포를 감염시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일례로서, 상기 바이러스를 배지에 단순히 부가할 수 있다. 다르게는, 상기 배지를 제거하고 바이러스를 새로운 배지에 부가한 다음 이것을 다시 상기 세포에 후에 세포에 부가할 수 있다. 효과적으로 감염시키기 위해, 바이러스/배지 현탁액의 양은 높은 바이러스 밀도를 갖기 위해 가능한 한 적어야 한다. 바이러스의 부착 후 추가 배지가 부여될 수 있다.
세번째 단계로, 세포는 후대 바이러스가 생성될 때까지 무혈청 배지에서 접종된다.
바이러스를 증폭시키기 위해 두번째 및 세번째 단계에서 사용된 무혈청 배지는 전에 이미 사용된 배지, 즉 세포유형에 따라 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지와 동일할 수 있다. 그러나, 비용절감을 위해 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 함유하지 않는 두번째 및 세번째 단계의 하나 또는 둘 모두에서 무혈청 배지를 사용하는 것이 또한 가능하다.
모든 단계에서 배지는 위에서 강조한 바와 같이 아스파라긴 및/또는 글루타민이 부가될 수 있는 바, 배지에서 아스파라긴의 총 농도는 바람직하게는 상기에서 정의한 바와 같다.
당업자에게 공지된 방법에 따라 후대 바이러스는 농축되어 정제될 것이다.
본 발명의 구체예에 따른 바이러스의 증폭방법은 폭스 바이러스의 증폭에 사용된다. 따라서, 이 바람직한 구체예에 따라 본 발명은 하기 단계를 포함하는 폭스 바이러스의 증폭방법에 관한 것이다: (I) 상술한 바와 같은 방법에 따른 일차세포의 배양, 즉 세포유형에 따라 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 일차세포를 배양하는 단계, (II) 일차세포를 폭스 바이러스로 감염시키는 단계 및 (III) 후대 바이러스가 생성될 때까지 무혈청 배지에서 감염된 세포를 배양하는 단계.
공지된 무혈청 배지에서 세포의 성장은 매우 나쁘기 때문에 무혈청 조건하에서 배양된 세포상에서 폭스 바이러스가 증폭할 수 있다는 것은 예상치 못한 것이었다. 따라서, 폭스 바이러스 감염과 관련된 추가적인 스트레스는 폭스 바이러스의 상당한 증폭이 발생하기 전에 이미 스트레스 받은 세포를 치사시킬 것이라는 것이 예견되었다.
폭스 바이러스는 바람직하게는 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus)이다. 오르쏘폭스바이러스의 예는 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 및 백시니아 바이러스이다.
용어“아비폭스바이러스(avipoxvirus)”는 계두 바이러스, 카나리아 폭스 바이러스, 운코 폭스 바이러스(Uncopoxvirus), 구관조 폭스 바이러스, 비둘기 폭스 바이러스, 앵무새 폭스 바이러스, 메추리 폭스 바이러스, 공작 폭스 바이러스, 펭귄 폭스 바이러스, 참새 폭스 바이러스, 찌르레기 폭스 바이러스 및 칠면조 폭스 바이러스와 같은 임의의 아비폭스바이러스를 의미한다.
카나리아 폭스 바이러스의 예는 Rentschler 균주이다. ALVAC로 불리는 정제된 카나리아 폭스 균주 플라크(미국 5,766,598)는 부다페스트 조약의 요구 조건에 맞게 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁번호 VR-2547로 수탁되었다. 다른 카나리아 균주는 LF2 CEF 524 24 10 75로 지정되어 판매되는 카나리아 폭스 백신 균주이며, Institute Merieux, Inc로부터 입수할 수 있다.
계두 바이러스의 예는 FP-1, FP-5 및 TROVAC(미국 5,766,598) 균주 이다. FP-1은 한때 백신으로서 닭에 사용되도록 변형된 Duvette 균주이다. 상기 균주는 1980년 10월에 O DCEP 25/CEP67/2309로 지정되어 판매되는 계두 바이러스이며, Institute Merieux, Inc로부터 시판된다. 수의과 면허 제.165, 일련번호 제.30321의 미국 위스콘신 주 메디슨에 위치한 American Scientific Laboratories(Division of Schering Corp)로부터 시판되는 FP-5는 닭 배아로부터 유래된 계두 바이러스 백신 균주이다.
백시니아 바이러스 균주의 예는 템플 오브 헤븐(Temple of Heaven), 코펜하겐(Copenhagen), 파리(Paris), 부다페스트(Budapest), 다이렌(Dairen), 괌(Gam), MRIVP, 페르(Per), 타슈켄트(Tashkent), TBK, 톰(Tom), 베른(Bern), 패트와단거(Patwadangar), BIEM, B-15, 리스터(Lister), EM-63, 뉴욕시 건강위원회(New York City Board of Health), 엘스트리(Elstree), 이케다(Ikeda) 및 WR이다. 본 발명은 바람직하게는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)를 사용하여 실시한다(Sutter, G. 외.[1994], Vaccine 12: 1032-40). 전형적인 MVA 균주는 European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)에 V00120707로 기탁된 MVA575이다. 가장 바람직한 것은, 2001년 11월 22일자로 발명의 명칭 “변형된 백시니아 안카라 바이러스 변이체”로 유럽특허청에 출원된 PCT 출원번호 PCT/EP01/13628에 개시되어 있는 MVA-BN 또는 그 유도체이다. MVA-BN은 European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)에 기탁번호 ECACC V00120707호로 기탁되었다. MVA-BN의 특징, MVA가 MVA-BN 또는 그 유도체인지를 평가하는 생물학적 에세이에 관한 기술 및 MVA-BN 또는 그 유도체를 수득하기 위한 방법은 본원에서 참고문헌으로 포함한 상기 PCT 출원에 개시되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 증폭된 바이러스는 야생형 바이러스, 독성약화된 바이러스 또는 재조합 바이러스이다.
용어 “재조합 바이러스”는 천연적으로 바이러스 게놈의 일부분이 아닌 임의의 이종 유전자가 바이러스 게놈내로 삽입된 임의의 바이러스에 관한 것이다. 이종 유전자는 면역반응, 안티센스 발현 카세트 또는 리보자임 유전자를 유도하는 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드를 코딩하는 유전자인 치료적 유전자일 수 있다. 재조합 바이러스를 작제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 가장 바람직한 폭스 바이러스 벡터는 MVA, 특히 MVA 575 및 MVA-BN이다(상기 참조).
“독성약화된 바이러스”는 병원성 바이러스로부터 유래된 바이러스이나, 독성약화되지 않은 부모 바이러스와 비교할 때 숙주 유기체의 감염시 낮은 치사율 및/또는 발병율을 초래한다. 독성약화된 폭스 바이러스의 예는 당업자에게 공지되어 있다. 독성약화된 백시니아 바이러스의 예는 MVA 균주, 특히 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁된 균주이다(상기 참조).
상기에서 지적한 바와 같이, 폭스 바이러스 일차세포는 바람직하게는 CEF 세포 또는 오리 일차 배아 섬유아세포와 같은 조류 일차세포일 수 있다. 또한, 당업자는 폭스 바이러스의 증폭에 적절한 일차세포를 알 것이다. CEF 세포는 MVA의 증폭에 특히 바람직하다. CEF 세포내의 MVA 증폭에 있어서, EGF 및 피브로넥틴으로부터 선택된 하나 또는 두개의 인자를 선택하는 것은 바람직한 구체예이다.
본 발명에 따른 방법이 CEF 세포에서 MVA를 증폭하는데 사용된다면, 배지의 개시 pH는 약 7.0 내지 약 8.5의 범위인 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 개시 pH가 7.0이다.
본 발명은 또한 바이러스, 특히 상술한 방법에 의해 수득한 폭스 바이러스에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 따르면, 상기 폭스 바이러스는 백시니아 바이러스, 가장 바람직하게는 MVA-BN과 같은 MVA 균주이다.
본 발명은 또한 바이러스, 특히 본 발명의 방법에 의해 생성된 폭스 바이러스를 포함한 조성물에 관한 것이다. 상기에서 지적한 바와 같이, 폭스 바이러스는 백시니아 바이러스, 가장 바람직하게는 MVA-BN과 같은 MVA 균주이다. 바이러스의 증폭방법때문에, 상기 조성물은 동물 혈청에 포함된 임의의 생성물 및/또는 감염성 물질이 없다. 반대로, 전통적인 방법에 따라 제조된 바이러스를 포함하는 조성물은 동물 혈청으로부터 유도된 잔류 화합물을 포함한다. 백시니아 바이러스 균주, 특히 MVA-BN과 같은 MVA 균주와 같은 폭스 바이러스를 포함하는 조성물의 경우에서 특히 그러하다.
본 발명은 또한 바이러스, 특히 의약 또는 백신으로 상기에서 정의된 바와 같은 바이러스에 관한 것이다. 상기 바이러스가 야생형 바이러스 또는 독성약화된 바이러스일 경우, 상기 바이러스는 그러한 바이러스에 대해 백신접종용으로 사용될 수 있다. 이러한 목적으로 독성약화된 바이러스가 특히 바람직하다. 상기 바이러스가 바이러스 게놈에 이종인 유전자로부터 발현된 단백질을 발현하는 재조합 바이러스일 경우, 바이러스 그 자체 및/또는 발현된 이종 단백질에 대해 백신접종하는 것이 가능하다. 상기 제조합 바이러스가 안티센스 RNA 또는 리보자임과 같은 치료적 유전자를 발현한다면, 상기 바이러스는 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바이러스 또는 백신을 제조하기 위한 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술한 바이러스 또는 조성물을 동물 또는 사람의 신체에 투여하는 것을 포함하는 사람을 비롯한 동물의 치료 또는 백신접종 방법에 관한 것이다.
하기 실시예에서 달리 표시되지 않는다면, 무혈청 배지는 배지 199이다(Life Technologies). 부가된 EGF는 케미콘(Chemicon)으로부터 수득한 재조합 사람 EGF이다. 피브로넥틴(FN)은 케미콘(Chemicon)으로부터 수득하였다.
실시예 1: 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 제조
특정 병원체가 없는(SPF) 수정된 알을 4℃에서 12일 미만동안 저장하였다. 상기 알을 부화기에 넣고 37.8℃±8℃에서 10-12일동안 배양하였다. 최대 11개의 알에 대하여 10-20ml PBS가 들어있는 1개 페트리 접시를 준비하였다. 상기 알을 알전용 상자에 넣고 바시롤(Bacillol)로 광범위하게 처리하여 알껍질의 바깥부분을 멸균시켰다. 건조 후, 알에 구멍을 뚫어 껍질을 조심스럽게 제거하였다. 융모요막을 모아두었다. 배아를 발을 사용하여 들어올리고 이어 이들의 머리를 제거하였다. 상기 배아를 이어 준비된 페트리 접시로 옮겼다. 상기 발을 제거한 후, 몸통은 PBS로 다시 세척하였다. 최대 11개의 몸통을 20ml 플라스크 주사기에 넣고 Erlenmeyer 플라스크내로 짜냈다. 몸통 1개에 미리가온된(37℃) 5ml의 트립신/EDTA-용액을 부가하고 상기 용액을 무혈청 배지와 함께 실온에서 자석 교반기를 사용하여 15분동안 교반시켰다. 트립신처리된 세포를 그물층을 통하여 비커내로 부었다. 모든 세포를 1개의 225ml-원심분리기 튜브로 옮기고 20℃에서, 470xg으로 7분동안 상층원심분리기에서 원심분리시켰다. 상층액을 버린 후, 몸통당 10ng/ml EGF를 포함하는 1ml의 미리가온된(37℃) 새로운 무혈청 성장배지에 펠렛을 상하로 세게 피펫으로 옮김으로써 재현탁시켰다. 10ng/ml EGF를 포함하는 미리가온된(37℃) 새로운 무혈청 성장배지를 총부피 150ml로 부가하였다. 상기 원심분리단계를 반복하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 상술한 바와 같이 재현탁시켰다. 10ng/ml EGF를 포함하는 미리가온된(37℃) 새로운 무혈청 성장배지를 총부피 100ml로 부가하였다. 하기 부분에서 개시한 바와 같이 세포수를 세었다. 필요한 세포의 양을 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 성장배지가 든 롤러병에 살포하고 37℃에서 배양시켰다. 살포한지 4일째되는 날, 바이러스 감염을 위해 세포를 준비시켰다.
실시예 2: 세포밀도 계산
세포 현탁액 샘플(CEF 제조부분 참조)을 취하여 트리판 블루 1부피와 혼합시켜 최종 세포 수는 Hemocytometer Fast Read 102(1:2-1:10 희석액)라는 명칭으로 Fuchs-Rosenthal에 의해 제공된 혈구 계산기의 16 소평방당 20 내지 100개를 얻었다. 세포의 재응집/침강을 방지하기 위해 세포를 재현탁시킨 후 즉시 상기 샘플을 옮겼다. 죽은 세포를 알맞게 염색시키기 위해 트리판 블루를 사용하여 수분간 배양시킨 후, 10㎕ 세포 현탁액을 혈구 계산기에 부가하였다. 10x 대물렌즈를 사용한 광현미경하에서 흰색의 살아있는 세포만을 계산하였다. 전체로서, 3x16 소평방으로 구성되는 3개의 대표적인 큰 평방을 계산하였다. L-From에서 매 큰 평방으로부터 두개 가장자리만을 계산에 포함시켰다. 계산된 세포의 평균을 구하고 최종 세포밀도는 하기 공식을 사용하여 계산하였다: 평균 세포수 X 희석액 x 104 = 세포/ml. 마지막으로, 소망하는 밀도를 얻기 위해 세포 현탁액을 희석시켰다.
실시예 3: 성장인자로부터 선택된 인자 및 피브로넥틴을 무혈청 배지에 부가하는 것에 의한 CEF-단층 형성에 대한 효과
예비실험에서 발명자들은 FCS를 포함하지 않은 배지 199를 사용할 경우 CEF 세포는 세포배양 용기의 표면에 부착하지 않는다는 것을 보여주었다. 또한, 어떠한 단층도 형성되지 않았다. 정상적인 단층형성은 7% FCS를 함유한 배지 199를 사용했을 때 관찰되었다. 첨가제가 배지에 부가될 경우, 무혈청 배지 199에서 CEF 세포의 부착 및 성장이 이루어지는지에 대해 분석하였다. 실험된 첨가제는 재조합 표피 성장인자(r-hEGF) 및 피브로넥틴(FN)을 포함한다.
실험에 있어서, 상이한 첨가제만을 사용하거나 또는 조합하여 CEF 세포를 배지 199에서 성장시켰다. 임의의 첨가제 없이 배지 199에서 성장한 세포는 음성 대조용으로 하였다. 7% FCS를 포함한 배지 199에서 배양된 세포는 양성 대조용으로 하였다. 모든 실험은 3ml 배지를 사용하여 6-웰 세포배양 플레이트에서 실시하였다. 첨가제는 세포배양에 사용되기 전에 공급자의 데이터 시트에 따라 처리하였다. 피브로넥틴은 사용전에 25분동안 세포배양 플레이트의 표면에 흡수되게 하였다. 피브로넥틴은 3㎍/㎠의 농도로, EGF는 10ng/ml의 농도로 사용하였다. 임의의 세포를 부가하기 전에 세포배양 플레이트는 배지를 함유하는 피브로넥틴과 25분동안 접촉시켰다.
첨가제외에 실험될 모든 배양 배지는 이중으로 복제하였다. 상기 6-웰 세포배양 플레이트는 37℃에서 4일동안 배양하였다. 1일부터 4일까지 현미경을 사용하여 세포의 부착 및 성장을 평가하였다.
양성 대조군에 있어서, CEF 세포의 정상적인 부착 및 성장이 관찰되었다. 첨가제가 없는 배지 199에서는 CEF 세포의 부착이 거의 관찰되지 않았다. 단층의 형성에 있어서 결정적인 향상은, 첨가제가 없는 배지 199와 비교할 때 배지에 부가된 EGF의 사용에 의해 나타났다. 상기 세포는 부착하여 전형적인 섬유아세포 단층을 형성한다는 것을 발견하였다. 또한, 지속적인 성장은 4일동안의 전기간에 걸쳐서 관찰할 수 있었다.
세포부착의 향상은 배양 배지에 피브로넥틴을 부가함으로써 또한 달성될 수 있다. EGF 및 피브로넥틴 두가지의 부가는 EGF만의 부가 및 피브로넥틴만의 부가와 비교할 때 약간 향상되었다.
요약하면, 무혈청 배지 199에서 CEF 세포의 단일층의 형성은 첨가제 EGF 및 피브로넥틴의 사용에 의해 입증될 수 있다는 결론을 내렸다.
또한, 유사한 세트의 실험에서 10% FCS를 포함하는 배지, FCS를 포함하지 않는 배지 및 FCS를 포함하지 않고 EGF를 포함하는 배지에 1 x 107 CEF 세포를 살포하였다. 살포 후 이틀동안 상기 세포수를 계산하였다. 세포수는 살포에 사용된 세포수의 각각 42%, 6% 및 44%에 달했다. 따라서, EGF를 포함하는 무혈청 배지에 살포된 세포에 대한 결과는 FCS를 포함하는 배지에서 수득한 결과만큼 좋았으며 혈청도 EGF도 포함하지 않는 배지보다 휠씬 나았다. 또한, EGF를 포함하는 배지를 DMEM, Opti-Mem 또는 293-SFM과 같은 다양한 표준의 무혈청 배지와 비교하였다. 이를 위해, 1 x 107 CEF 세포를 다양한 무혈청 배지에 살포하고 4일동안 배양시켰다. EGF를 포함하는 배지에서 배양된 세포수는 24.5이며, 무혈청 DMEM, Opti-Mem 및 293-SFM에서 각각 배양된 세포수보다 12배나 높았다.
실시예 4: MVA에 의한 CEF 세포의 감염
롤러병에 살포한 지 4일 후 CEF 세포를 감염시켰다. 그때 세포는 적합한 단일층으로 성장하였다. 세포를 1 내지 0.1 MVA의 MOI로 감염시켰다. 감염을 위해, 성장 배지를 플라스크로부터 제거하였다. 롤러병에 바람직한 바이러스의 양을 혈청없이 적절하게 감염된 20ml의 배지에서 희석시켰다. 이 단계에서 무혈청 배지는 성장인자 및 피브로넥틴으로부터 선택된 인자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바이러스와 함께 세포를 롤러병 부화기에서 0.3-0.5rpm으로 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 1시간 후, 상기 롤러병을 무혈청 적절한 성장배지로 채워 롤러병 당 총 부피가 200ml가 되게 하였다. 이 단계에서 무혈청 배지는 성장인자 및 피브로넥틴으로부터 선택된 인자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 48 시간 또는 72시간 후 롤러병을 20℃로 냉각시킴으로써 바이러스 복제를 정지시켰다.
실시예 5: 감염된 CEF 세포로부터 바이러스 추출물의 제조 및 MVA의 적정
냉각된 롤러병을 실온에서 해동시켰다. 해동과정 동안 상기 세포는 롤러병 표면으로부터 분리되며, 플라스크를 교반시킴으로써 기계적으로 제거될 수 있다. 바이러스/세포 현탁액을 채취하고 더 작은 부피로 동분량하였다. 감염된 세포로부터 바이러스를 분리하기 위해, 바이러스/세포 현탁액을 3차례 냉각/해동시켰다. 냉각/해동된 상기 바이러스 샘플을 적정에 사용하였다.
적정은 바이러스 현탁액의 10배 희석액을 사용하여 96-웰 플레이트에서 첫번째 패세지 CEF 세포에 대해 실시하였으며 희석당 8회 반복하였다. 감염 후, 감염된 세포는 항-백시니아 바이러스 항체 및 적절한 염색용액을 사용하여 시각화하였다. 상세하게, 당일 에세이에서 일차 CEF 세포(“닭 배아 섬유아세포(CEF)의 제조”참조)를 트립신처리하고“세포밀도의 측정”부분에서 개시한 바와 같이 계산하였다. 상기 세포를 7% FCS가 부가된 RPMI 배지에서 1x105 세포/ml로 희석하였다. 상기 희석 후, 다중채널 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 100㎕를 살포하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤동안 배양시켰다. 적정될 바이러스 샘플(“감염된 CEF 세포로부터 바이러스 추출물의 제조”참조)은 혈청없이 RPMI를 사용하여 10-1-10-12로부터 10배 단계에서 연속적으로 희석하였다. 상기 연속적인 희석은 96-딥-웰 플레이트의 모든 웰에 900㎕ RPMI를 부가함으로써 실시하였다. 100㎕의 바이러스 샘플을 첫번째 줄의 모든 웰에 부가하고 혼합시켰다. 그 다음에, 100㎕의 각각의 샘플을 다중채널 피펫을 사용하여 다음줄의 웰로 옮겼다. 희석을 실시할 때 96-딥-웰 플레이트는 얼음상에 유지시켰다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 배양시켜 감염이 진행되게 하였다. 5일 후, 백시니아 바이러스 특정 항체를 사용하여 세포를 면역조직화학적으로 염색하였다. 염색을 위해, 배양 배지는 용기에 걸쳐서 96-웰 플레이트를 거꾸로 뒤집음으로써 제거하였다. 세포를 100㎕/웰 메탄올/아세톤(1:1) 혼합물을 사용하여 실온에서 10분동안 응고시켰다. 상기 응고용액을 제거하고 플레이트를 공기중에 건조시켰다. 건조 후, 세포를 PBS로 한번 세척시키고 3% FCS가 부가된 PBS에서 1:1000으로 희석된 항-백시니아 바이러스 항체(항-백시니아 바이러스 항체, 토끼 다클론성항체, IgG 분획(Quartett, Berlin, Germany #9503-2057)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 항체를 제거한 후, 세포를 PBS로 두번 세척하고, 3% FCS를 사용하여 PBS에서 1:1000으로 희석된 HRP-결합(호오스 레데쉬 페리독시다아제 결합)된 항-토끼 항체(항-토끼 IgG 항체, HRP-결합된 염소 다클론성항체(Promega, Mannheim, Germany # W4011)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 다시 세포를 PBS로 세척시키고 o-디아니시딘 또는 TMB로 염색하였다. o-디아니시딘 염색방법을 사용함에 있어서, 세포는 5mg o-디아니시딘 및 50mM 구연산인 완충액의 60ml당 180㎕ 30% H2O2로 구성되는 100㎕/웰 염색용액을 사용하여 배양시켰다. 세포가 갈색으로 염색될때까지 실온에서 세포를 배양시켰다. 13시간 후, 감염된 세포는 명확하게 보였다. TMB 염색방법을 사용함에 있어서, 세포는 30㎕/웰 1.2mM TMB(Seramun Diagnostica GmbH)를 사용하여 배양하였다. 배양 시간 15분 후, 상기 TMB 용액을 제거하고 세포를 PBS로 한번 세척하였다. 감염된 세포는 검푸르게 나타난다. 플레이트는 감염된 세포에 대해 평가하였다. 바이러스 적정은 Spearman 및 Kaerber 공식을 사용하여 계산하였다. TCID50의 계산에 있어서, 갈색 또는 푸른 세포를 나타내는 모든 웰은 양성으로 표시하였다. 에세이 매개변수가 일정하기 때문에, 하기의 간단한 공식을 사용하였다:
바이러스 적정[TCID50/ml] = 10[a+1.5+xa/8+xb/8+xc/8]
a = 최종 칼럼의 희석인자로, 상기에서 8개의 모든 웰은 양성임
xa = 칼럼 a +1에서 양성 웰의 수
xb = 칼럼 a +2에서 양성 웰의 수
xc = 칼럼 a +3에서 양성 웰의 수
실시예 6: 무혈청 배지에서 CEF 세포의 최적 살포 밀도 및 CEF 세포 감염을 위한 MVA의 최적 밀도
7.5x 107 세포/850㎠(1개 롤러 플라스크의 표면)의 최적 살포 세포밀도는 무혈청 CEF 성장에 대해 측정하였다. 살포 후 4일째에 세포는 큰 응집을 형성하지 않고 우수한 단일층을 만들 수 있으며 이 시점에서 감염될 수 있다.
바이러스 접종의 최상 수준 및 무혈청 과정에서 배양된 CEF 세포로부터 MVA의 최대 생성을 위한 감염 정도를 측정하기 위해 실험을 실시하였다. CEF 세포는 본 발명에 따른 배지에서 7.5x 107 세포/850㎠의 밀도에서 살포하였다. 살포 후 4일째에, 세포를 MVA의 0.05 내지 1.0 TCID50/세포 범위에서 MVA의 상이한 양으로 감염시켰다. 최상의 결과는 MVA의 0.1 TCID50/세포를 사용하여 수득하였다.
실시예 7: 배양을 위한 무혈청 배지의 최적 pH 및 MVA에 의한 감염
MVA 및 다른 폭스 바이러스 감염은 pH 7.0이하에서 민감하다. 폭스 바이러스는 산성 pH에서 안정적이지 않으므로, 액체 바이러스 제제로서 저장시에 안정성 및 바이러스 보전을 확보하기 위해 정제된 폭스 바이러스를 pH 7.0이상의 완충 용액에서 저장할 것을 권한다. 상이한 개시 pH에서 감염시킬 때 바이러스 수율에 대한 효과를 측정하기 위해 실험을 실시하였다. 로울러 병에든 4mM L-글루타민외에 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에 통상적인 방법으로 CEF 세포를 살포하고 4일동안 배양시켰다. L-글루타민 및 1mM 아스파라긴외에 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에 6.5 내지 9.0의 상이한 pH범위에서 0.1 TCID50/세포의 MVA로 세포를 감염시켰다. 감염 72시간후에, 배지의 pH를 측정하고 바이러스 수율은 통상적인 방법으로 세포 추출물을 적정함으로써 측정하였다. 감염초기에 배지의 최초 pH가 바이러스 수율에 미치는 효과를 나타내는 상기 결과를 다음의 표로 나타낸다.
L-글루타민 및 1mM 아스파라긴이 부가된 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에서 실시하는 감염에 있어서, 7.0 내지 8.5의 개시 pH에서의 바이러스 생성은 상대적으로 일정하였지만 6.5 내지 9.0의 개시 pH에서의 바이러스 생성은 낮았다. 최상의 수율은 개시 pH 7.0에서 수득하였다. 상업적으로 시판되는 표준의 무혈청 배지는 통상적으로 7.4의 pH를 갖는다. 따라서, 무혈청 배지의 pH를 7.0으로 조절하는 것은 바이러스 수율을 향상시키는데 도움이 될 것이다.
실시예 8: 무혈청 배지에 아스파라긴 부가의 효과
CEF 세포의 배양 및 MVA에 의한 CEF 세포감염중에 아스파라긴의 양이 제한될 수 있음을 예비실험에서 밝혀졌다. 상기 배양 및 감염과정중에 무혈청 배지에서 아스파라긴의 고갈을 극복하기 위해, 여분의 아스파라긴을 CEF 세포감염 전에 보조제로서 배지에 부가하였다. 배지에 부가하는 아스파라긴의 최적양을 측정하기 위해, 로울러 병에든 4mM L-글루타민외에 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에 CEF 세포(7.5x 107 세포/850㎠)를 살포하였다. 살포 4일 후, L-글루타민외에 상이한 아스파라긴 밀도(0.5, 1.0 및 1.5mM)가 부가된 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에서 0.1 TCID50/세포의 MVA로 세포를 감염시켰다. 바이러스 복제는 감염 72시간후에 정지시키고 바이러스 적정을 측정하였다. 감염단계에서 상이한 밀도의 아스파라긴이 부가된 CEF 세포로부터의 MVA 생성을 나타내는 상기 결과를 다음의 표로 나타낸다. 상기 적정은 아스파라긴 부가당 평균 3개 롤러병을 나타낸다.
부가된 아스파라긴 감염 72시간후 바이러스 적정[TCID50/ml]
0.0mM 1.8 x 108
0.5mM 1.3 x 108
1.0mM 6.8 x 108
1.5mM 1.0 x 108
상기 결과는 10ng/ml EGF를 포함하는 무혈청 배지에 아스파라긴의 부가는 바이러스 생성을 향상시킬 수 있으며 감염과정에 1mM의 부가가 최적이라는 것을 입증하였다.

Claims (26)

  1. 성장인자 및 부착인자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 인자를 포함하는 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조류 일차세포의 배양방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조류 일차세포는 닭 배아 섬유아세포(CEF)인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 성장인자는 표피 성장 인자(EGF), 특히 재조합-사람 EGF인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 EGF의 농도는 5 내지 20 ng/ml 배지 범위인 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 부착인자는 피브로넥틴인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 피브로넥틴의 농도는 1 내지 10㎍/세포배양 용기 표면 ㎠ 범위인 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 배지는 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 두개 이상의 인자를 포함하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 배지는 제 4항 및 제 6항에서 정의한 바와 같은 농도범위의 EGF 및 피브로넥틴을 포함하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 미생물 추출물, 식물 추출물 및 비포유류 동물 추출물로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 더 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 미생물 추출물은 효모 추출물 또는 이스트올레이트 한외여과액인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 식물 추출물은 쌀 추출물 또는 콩 추출물인 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 비포유류 동물 추출물은 생선 추출물인 방법.
  13. (i) 제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항에 정의한 바와 같은 방법에 따라 조류 일차세포를 배양하는 단계,
    (ii) 상기 조류 일차세포를 바이러스로 감염시키는 단계, 및
    (iii) 상기 감염된 세포를 무혈청 배지에서 후대 바이러스가 생성될 때까지 배양하는 단계를 포함하며, 상기 조류 일차세포는 바이러스의 다산적인 복제를 허용하는 것을 특징으로 하는 바이러스의 증폭방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 조류 일차세포는 닭 배아 섬유아세포(CEF)인 방법.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 바이러스는 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 광견병 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 폭스 바이러스로부터 선택된 바이러스인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus)인 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 오르쏘폭스바이러스는 백시니아 바이러스인 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 안카라인 방법.
  19. 제 15항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 독성약화된 바이러스 또는 재조합 바이러스인 방법
  20. 제 13항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, (ii) 및 (iii)단계 중 한 단계 또는 두 단계에서 상기 무혈청 배지는 성장인자 및 부착인자로부터 선택된 인자를 갖지 않는 방법.
  21. 제 13항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, (iii)단계 후에 하나 이상의 정제 단계를 실시하는 방법.
  22. 제 13항 내지 제 21항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득한 폭스 바이러스.
  23. 제 13항 내지 제 21항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 폭스 바이러스를 포함하는 조성물.
  24. 의약 및 백신으로서 제 22항에 따른 폭스 바이러스 또는 제 23항에 따른 조성물.
  25. 백신제조를 위한 제 22항에 따른 폭스 바이러스 또는 제 23항에 따른 조성물의 용도.
  26. 제 22항에서 정의한 바와 같은 폭스 바이러스 또는 제 23항에서 정의한 바와 같은 조성물을 동물 또는 사람에게 투여하는 것을 포함하는 사람을 비롯한 동물의 치료 또는 백신접종 방법.
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