MX2011005886A - Composiciones, métodos y usos para inducir el crecimiento viral. - Google Patents

Abstract

Las modalidades de la presente reportan métodos, composiciones y usos para inducir y/o acelerar el crecimiento viral. En ciertas modalidades, los métodos, composiciones y usos generalmente relacionados a composiciones de copolímero para inducir crecimiento viral, reducen el tiempo de retardo y/o incrementan el tamaño de la placa viral. En otras modalidades, los métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímero pueden ser para inducir el crecimiento flaviviral, reduciendo el retardo en el crecimiento y/o incrementando el tamaño de placa.

Description

COMPOSICIONES, MÉTODOS Y USOS PARA, INDUCIR EL CRECIMIENTO VIRAL Referencia cruzada a solicitud relacionada La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. de serie 61/120.262, presentada el 5 de diciembre de 2008, la cual se incorpora a la presente a modo dé referencia en sus totalidad a todos los efectos.

Campo Las realizaciones de la presente solicitud en general describen métodos, composiciones y usos el para crecimiento viral acelerado o mejorado. En ciertas realizaciones, la presente solicitud describe métodos, composiciones y usos de composiciones de c.opolímeros para inducir el crecimiento viral acelerado y/o aumentar el tamaño de la placa viral. En otras realizaciones, los métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímeros se describen para acelerar el crecimiento flaviviral, reducir el tiempo de retraso flaviviral y/o aumentar el tamaño de placa flaviviral.

Antecedentes La vacunas para la protección contra enfermedades infecciosas se han usado para mejorar la salud humana y animal. Una tecnología exitosa para las vacunas virales es inmunizar a los animales o humanos con una cepa del virus debilitada o atenuada (un "virus atenuado vivo"). Debido a la replicación limitada después de la inmunización, la cepa atenuada no provoca la enfermedad. Sin embargo, la replicación viral limitada es suficiente para expresar el repertorio completo de antígenos virales y genera respuestas inmunes potentes y duraderas al virus. Por consiguiente, tras la posterior exposición a una cepa patogénica del virus, el individuo inmunizado está protegido contra la enfermedad.

Los adelantos técnicos recientes, tales como reordenamiento, genética inversa y adaptación al frío, condujeron a adelantos en los virus atenuados vivos para influenza y rotavirus . Una cantidad de vacunas virales vivas desarrolladas con tecnologías de ADN recombinante se están analizando clínicamente en humanos, incluidas vacunas para la enfermedad del Nilo Occidental, dengue, malaria, tuberculosis y VIH. Estas vacunas virales recombinantes dependen de la manipulación de vacunas virales atenuadas bien caracterizadas, tales como adenovirus, virus vaccinia, fiebre amarilla 17D o virus del dengue, DEN-2 PDK-53. Como grupo, las vacunas virales atenuadas vivas están entre las intervenciones médicas más exitosas en la historia de la humanidad, solo superadas por la llegada de los antibióticos, y prometen mejorar la salud pública en todo el mundo.

Se han desarrollado otras vacunas desactivado los virus después del crecimiento en cultivos celulares. Estas vacunas de "virus muerto" inducen respuestas inmunes debido a la presencia de altas concentraciones de antígeno presente. Ejemplos de vacunas virales muertas efectivas incluyen, a modo no taxativo, vacuna para la rabia, influenza, hepatitis A y poliovirus.

Los flavivirus provocan distintas enfermedades humanas y animales de impacto considerable. Son virus encapsulados con un genoma de AR de aproximadamente 11.000 bases. La mayoría de los flavivirus se transmiten mediante un vector artrópodo, comúnmente mosquitos. Existen más de 70 flavivirus diferentes que se agrupan en tres categorías principales en base a la serología: el grupo del dengue, el grupo de la encefalitis japonesa y el grupo de la fiebre amarilla. La expansión de la urbanización, los viajes por todo el mundo y los cambios ambientales (tales como la deforestación o los patrones pluviales) han conducido a la aparición de diversos flavivirus como amenazas para la salud pública humana. Tales virus incluyen, a modo no taxativo, el virus de la fiebre amarilla, los virus del dengue, el virus del Nilo Occidental, el virus de la encefalitis japonesa y los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas.

Se han desarrollado vacunas virales atenuadas vivas y vacunas de virus muerto que son seguras y protegen contra las enfermedades por flavivirus, por ejemplo, la fiebre amarilla y la encefalitis japonesa.

Compendio Las realizaciones de la presente solicitud en general se refieren a métodos, composiciones y usos para inducir, mejorar o acelerar el crecimiento viral. En ciertas realizaciones, la presente solicitud describe métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímeros para inducir el crecimiento viral acelerado y/o aumentar el tamaño de la placa viral. En otras realizaciones, los métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímeros se describen para acelerar el crecimiento flaviviral, reducir el tiempo de retraso flaviviral y/o aumentar el tamaño de placa flaviviral .

Una limitación para la producción de vacunas ha sido la fabricación y el cultivo de los virus in vitro a gran escala para cumplir con la demanda de vacunas. Por consiguiente, una de las necesidades que existen en la técnica es mejorar y acelerar el crecimiento viral. Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a métodos y composiciones para mejorar y acelerar el crecimiento viral. Estas composiciones pueden usarse, por ejemplo, en la producción de vacunas virales y subproductos virales para uso en otras tecnologías, tales como fabricación de terapias génicas relacionadas con virus y otros productos virales. Adicionalmente, las realizaciones de la presente pueden usarse para mejorar o acelerar el crecimiento de cultivos virales para uso en vacunas de virus muertos .

Ciertas composiciones divulgadas en la presente pueden incluir copolímeros solos o en combinación con otros agentes o compuestos para mejorar o acelerar el crecimiento viral. Otras realizaciones de la presente se refieren a combinaciones de excipientes que mejoran el crecimiento de virus atenuados vivos. Los copolímeros de uso en la presente incluyen, a modo no taxativo, Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P123, Pluronic P85, otros copolímeros en bloques de óxido de polietileno-óxido de polipropileno (OE-OP) mayores a 3.000-4.000 MW o combinaciones de los mismos.

De acuerdo con estas realizaciones, los virus pueden incluir, a modo no taxativo, Flavivirus, Togavirus, Coronavirus, Rabdovirus, Filovirus, Paramixovirus , Ortomixovirus , Bunyavirus, Arenavirus, Retrovirus, Hepadnavirus , Pestivirus, Picornavirus , Calicivirus, Reovirus, Parvovirus, Papovavirus, Adenovirus, virus del Herpes y Poxvirus. Algunas realizaciones, dirigidas a composiciones para uso en cultivos virales, pueden incluir, a modo no taxativo, cultivos que tienen uno o más virus, tales como una mezcla de especies virales o una sola especie, o uno o más virus atenuados vivos cultivados en una o más composiciones de copolimeros solas o en combinación con otros agentes .

En otras realizaciones, las composiciones contempladas en la presente pueden aumentar el tamaño de la placa en un período de tiempo de crecimiento reducido o similar en comparación con un cultivo testigo sin la composición divulgada, lo que puede usarse para la titulación, fabricación y medición de la actividad de las preparaciones virales. En algunos aspectos de la presente invención, pueden obtenerse títulos virales más altos en períodos de tiempo reducidos . De forma alternativa, las composiciones contempladas en la presente pueden reducir el tiempo de retraso o acelerar el tiempo final del crecimiento varios días en comparación con los cultivos virales testigo que no usan las composiciones contempladas en la presente.

Otras realizaciones se refieren a poblaciones virales para uso en formulaciones y métodos dirigidos a formulaciones para vacunas capaces de reducir o evitar el inicio de una afección médica provocada por uno o más de los virus contemplados en la presente. De acuerdo con estas realizaciones, las afecciones médicas pueden incluir, a modo no taxativo, afecciones y/o infecciones incluyendo el virus del Nilo Occidental, dengue, encefalitis japonesa, enfermedad del bosque de Kyasanur, encefalitis del valle de Murray en Australia y Nueva Guinea, virus Kunjin (pariente del virus del Nilo Occidental) , fiebre emorrágica de Alkhurma, encefalitis de San Luis, infección por el virus de la hepatitis C, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre amarilla, los virus Usutu, outango y Yaonde en África y Cacipacore en América del Sur. En ciertas realizaciones, el tiempo de producción para generar formulaciones para vacunas puede reducirse usando composiciones contempladas en la presente para acelerar la producción y fabricación en el crecimiento viral, reduciendo el tiempo de retraso y/o aumentando el tamaño de placa de las poblaciones virales .

En ciertas realizaciones, los cultivos virales contemplados para la producción en la presente pueden usarse en composiciones que incluyen, a modo no taxativo, formulaciones para vacunas u otras formulaciones virales parcialmente o completamente deshidratadas o hidratadas.

En ciertas realizaciones, un virus atenuado vivo para uso en una composición para vacuna contemplado en la presente puede incluir, a modo no taxativo, una o más vacunas para flavivirus atenuados vivos, incluyendo a modo no taxativo, virus de la fiebre amarilla atenuados (por ejemplo, 17D) , virus de la encefalitis japonesa atenuados (por ejemplo, SA 14-14-2), virus del dengue atenuados (por ejemplo, DEN-2/PDK-53 o DEN-4D30) , vacunas del Nilo Occidental quiméricas atenuadas o flavivirus quiméricos recombinantes .

Otras realizaciones se refieren a kits para cultivar cultivos virales contemplados en la presente. Se contempla que un kit puede incluir cultivos virales parcialmente o completamente deshidratados para uso en la generación de poblaciones de virus atenuados vivos para la producción de vacunas u otros usos de composiciones virales. También se contempla que un kit puede incluir uno o más composiciones que inducen el crecimiento divulgadas en la presente.

Breve descripción de los dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para mostrar adicionalmente ciertas realizaciones en la presente. La realizaciones pueden comprenderse mejor en referencia a uno o más de estos dibujos solos o en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas.

La Fig. 1 representa un gráfica ejemplar de los efectos de plurónicos sobre el crecimiento viral después de la infección celular y la introducción de un agente de control o una composición de copolímero durante la adsorción viral. La Fig. 2 representa una gráfica ejemplar que ilustra el crecimiento de cultivos virales en presencia de un • copolímero durante la adsorción y/o el crecimiento viral. La Fig. 3 representa una gráfica ejemplar que ilustra el crecimiento de cultivos virales en presencia de cantidades crecientes de una composición que contiene copolímero durante la adsorción y el crecimiento viral.

La Fig. 4 representa una gráfica ejemplar que ilustra el crecimiento de cultivos virales en presencia o ausencia de un copolímero específico agregado durante la adsorción viral .

La Fig. 5 representa una tabla ejemplar que ilustra el cambio en el tamaño de placa para cultivos virales ejemplares en presencia o ausencia de varias concentraciones de copolímero.

Definiciones Tal como se usa en la presente, "un" o "una", pueden significar uno o más de uno de un elemento.

Tal como se usa en la presente, recipiente puede incluir, a modo no taxativo, tubo de ensayo, tubo para mini o microcentrífuga, placa, matraz de cultivo de tejidos, fábrica de células, canal, vial, placa de microtitulación o recipiente.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "sujeto" o "sujetos" puede incluir, a modo no taxativo, mamíferos tales como humanos o mamíferos, domesticados o salvajes, por ejemplo perros, gatos, hurones, conejos, caballos, ganado o animales de zoológico.

Tal como se usa en la presente, "aproximadamente" puede significar más menos diez por ciento.

Tal como se usa en la presente, "tensioactivos de alto peso molecular" puede significar una molécula anfifílica tensioactiva con un peso molecular mayor a 1500.

Tal como se usa en la presente, "copolímero en bloque de OE-OP" puede significar un copolímero que consiste en bloques de óxido de polietileno y óxido de polipropileno. Adicionalmente, tal como se usa en la presente, "Plurónico" puede significar copolímeros en bogue de OE-OP en OEx-OPy-OEx. Esta configuración del copolímero en bloque de OE-OP también se denomina "Poloxámero" o "Synperonic" .

Tal como se usa en la presente, "virus atenuado" puede significar una virus que muestra signos clínicos reducidos o nulos de enfermedad relacionada con el virus cuando se administra a un sujeto tal como un mamífero (por ejemplo, un humano o un animal) .

Tal como se usa en la presente, "acelerar" puede significar disminuir el tiempo de retraso antes que comience la producción viral o aumentar la tasa de producción viral de modo que las concentraciones más altas, de virus se produzcan en un tiempo más corto o de modo que el tamaño de placa aumente con respecto a un testigo en algunas realizaciones. Tal como se usa en la presente, "vacuna de virus muerto" puede significar una vacuna preparada mediante desactivación de un virus a través de cualquiera de los medios físicos o químicos conocidos en la técnica.

Descripción En las siguientes secciones se describen diversas composiciones y métodos ejemplares para detallar diversas realizaciones. Será evidente para un experto en la técnica que poner en práctica las diversas realizaciones no requiere el empleo de todos o incluso de algunos de los detalles explicados en la presente, sino que las concentraciones, tiempos y otros detalles pueden modificarse por medio de la experimentación habitual. En algunos casos no se incluyeron en la descripción métodos o componentes conocidos .

Las realizaciones en la presente se refieren al uso de diversas composiciones para mejorar la tasa de crecimiento o reducir el tiempo de retraso del crecimiento viral en un cultivo. De acuerdo con estas realizaciones, las composiciones pueden incluir agentes de copolímeros. Las realizaciones de la presente solicitud en general se refieren a métodos, composiciones y usos para inducir y acelerar el crecimiento viral. En ciertas realizaciones, la presente solicitud se refiere en general a métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímeros para acelerar el crecimiento viral y/o aumentar el tamaño de la placa viral. En otras realizaciones se describen métodos, composiciones y usos de composiciones de copolímeros para acelerar el crecimiento flaviviral, reducir la latencia en el crecimiento y/o aumentar el tamaño de placa. Ciertas composiciones de copolímeros contempladas en la presente incluyen, a modo no taxativo, Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, otros copolímeros en bloques de OE-OP mayores a 3.000-4.000 MW o combinaciones de los mismos.

Copolímeros En ciertas realizaciones, las composiciones pueden incluir copolímeros, por ejemplo, Pluronic F127. Pluronic F127 (también denominado en la presente F127) es un copolímero de polioxietileno-polioxipropileno no iónico. Los copolímeros en bloques Pluronic se conocen con su denominación común como poloxámeros . Inicialmente se desarrollaron para uso como tensioactivos . Estos compuestos consisten en bloques de óxido de etileno hidrófilo (OE) y óxido de propileno hidrófilo (OP) . Los copolímeros en bloques de OE-OP pueden incluir bloques de óxido de polietileno (-CH2CH20- designado OE) y óxido de polipropileno (-CH2CHCH30- designado OP) . El bloque de OP puede estar flanqueado por dos bloques de OE en una disposición OEx-OPy-OEx. Ya que el componente OP es hidrófilo y el componente OE es hidrófobo, la hidrofilicidad general, el peso molecular y las propiedades de tensioactivo pueden ajustarse variando x e y en la estructura de bloque OEx-OPy-OEx. De acuerdo con el fabricante (por ejemplo, BASF, Lutrol®Fl27) F127 puede usarse como un agente espesante y coemulsionante en cremas y emulsiones líquidas. F127 experimenta un proceso conocido como termogelificación inversa, ya que experimenta una fase de transición de líquido a un gel al alcanzar temperaturas fisiológicas . Las temperaturas más altas promueven la deshidratación de una unidad de óxido de alquileno del polímero en bloques y esto puede resultar en solubilidad reducida. Específicamente, a concentraciones altas (por ejemplo: aproximadamente 10% p/v) ciertos tipos de los copolímeros en bloques de OE-OP de peso molecular más alto experimentarán gelificación inversa, formando un gel a medida que la temperatura aumenta. Adicionalmente, cuando estos copolímeros en bloques residen por encima de la concentración micelar crítica (CMC) , se autoagrupan en icelas. En soluciones acuosas, los copolímeros en bloques de OE-OP se autoagruparán en micelas con un núcleo de OP y una corona de grupos de OE hidrófilos. En ciertos estudios, las formulaciones de copolímeros en bloques de OE-OP se han investigado como potenciales agentes de administración de fármacos para una diversidad de fármacos hidrófobos y para vacunas proteicas, de ADN o inactivadas .

El mecanismo de actividad de estos copolímeros en bloques plurónicos actualmente se desconoce. Sin embargo, Pluronic F127 se ha estudiado como un componente de liberación sostenida de un sistema de administración de vacuna en combinación con quitosán. La vacunación de ratones con toxoide de tétano que contenía F127 aumentó la respuesta de anticuerpos en antígenos de tétano administrados intranasalmente y administrados sistémicamente . En ciertos métodos, se mostró que los plurónicos inducen cambios en la microviscosidad y fluidez de las membranas celulares, lo que puede contribuir a su versatilidad.

Pluronic F127 se ha usado en una variedad de aplicaciones farmacéuticas en humanos incluidos fármacos dentales, orales y laxantes . Las formulaciones para vacunas también han usado tensioactivos como estabilizantes para evitar la pérdida de material. Estudios de administración de vacunas de ADN con ciertas concentraciones de F127 (0,01% p/v) han mostrado administración de fármaco aumentada, posiblemente potenciando la captación celular y el reclutamiento de células dendríticas maduras. La formación de gel a temperaturas corporales permite el uso de los geles de copolímero en bloque de OE-OP para actuar como un depósito de fármaco en vacunas y aplicaciones de administración de fármacos .

Ciertas composiciones divulgadas en la presente pueden incluir copolímeros solos o en combinación con otros agentes o compuestos. Adicionalmente, las composiciones divulgadas en la presente pueden incluir una composición de medio que tiene uno o más agentes de copolímeros agregados al medio además de otros complementos de medio. Los medios para uso en composiciones divulgadas en la presente pueden incluir cualquier medio conocido en la técnica para cultivar organismos virales contemplados en la presente o un medio específico para un organismo en particular. Otras realizaciones de la presente se refieren a combinaciones de excipientes que mejoran considerablemente el crecimiento de virus vivos (por ejemplo, virus atenuados) . Otras composiciones y métodos en la presente se dirigen a reducir el tiempo de retraso relacionado con el crecimiento de organismos virales. Algunas realizaciones se refieren a modular el tamaño de placa de organismos virales . Los copolímeros para uso en la presente incluyen, a modo no taxativo, Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, otros copolímeros en bloques de OE-OP mayores a 3.000-4.000 M o combinaciones de los mismos.

Las composiciones contempladas en la presente pueden usarse solas o en combinación con medio antes, durante y/o después de que se han introducido los cultivos ' virales en el medio de cultivo de células huésped de composiciones divulgadas en la presente que pueden ser líquidas, sólidas o líquidas semisólidas. En ciertas realizaciones pueden agregarse composiciones complementarias durante períodos enteros de crecimiento viral para monitorear, ajustar o estimular los procesos de crecimiento viral. En otras realizaciones, una o más composiciones de copolímeros complementarias pueden agregarse para reducir el tiempo de retraso, acelerar el crecimiento viral y/o aumentar el tamaño de placa viral. Las composiciones contempladas en la presente pueden usarse solas, en combinación con otros complementos (por ejemplo, vitaminas, iones metálicos y aminoácidos), o como un complemento de medio cuando el medio se agrega a los cultivos .

Otras realizaciones incluyen soluciones concentradas para cultivar cultivos virales tales como virus vivos atenuados incluyendo, a modo no taxativo, Picornavirus (por ejemplo, poliovirus, virus de la fiebre aftosa) , Calicivirus (por ejemplo, virus del SARS, virus de la peritonitis infecciosa felina) , Togavirus (por ejemplo, virus sindbis, los virus de la encefalitis equina, el virus chikungunya, virus de rubéola, virus del Río Ross, virus de la diarrea bovina, virus del cólera porcino) , Flavivirus (por ejemplo, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas), Coronavirus (por ejemplo, los coronavirus humanos (resfriados comunes) , virus de la gastroenteritis porcina), Rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular) , Filovirus (por ejemplo, virus de Marburg, virus del Ébola) , Paramixovirus (por e emplo, virus del sarampión, virus del moquillo canino, virus de las paperas, virus parainfluenza, virus respiratorio sincitial, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la peste bovina) , Ortomixovirus (por ejemplo, virus de la influenza humana, virus de la influenza aviar, virus de la influenza equina), Bunyavirus (por ejemplo, hantavirus, virus LaCrosse, virus · de la fiebre del valle de Rift) , Arenavirus (por ejemplo, virus de Lassa, virus Machupo) , Reovirus (por ejemplo, reovirus humanos, rotavirus humano), Birnavirus (por ejemplo, virus infeccioso de la bolsa, virus de la necrosis pancreática en peces), Retrovirus (por ejemplo, VIH 1, VIH 2, HTLV-1, HTLV-2 , virus de la leucemia bovina, virus de la inmunodeficiencia felina, virus del sarcoma felino, virus del tumor mamario murino) , Hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B) , Parvovirus (parvovirus humano B, parvovirus canino, virus de la panleucopenia felina) Papovavirus (por ejemplo, papilomavirus humanos, SV40, papilomavirus bovinos), Adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino, adenovirus bovino, adenovirus porcino) , virus del Herpes (por ejemplo, virus del herpes simple, virus de la varicela-zóster , virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina, citomegalovirus humano, herpesvirus humano 6) y Poxvirus (por ejemplo, vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela de los mapaches , virus de la viruela de la mofeta, virus de la viruela de monos, virus de la viruela vacuna, virus del molusco contagioso) .

De acuerdo con estas realizaciones, ciertos virus atenuados vivos incluyen, a modo no taxativo, flavivirus atenuados vivos. Algunas realizaciones, dirigidas a composiciones, pueden incluir, a modo no taxativo, uno o más virus atenuados vivos, tales como uno o más flavivirus atenuados vivos cultivados en una o más composiciones de copolímeros solas o en combinación con otros agentes . De acuerdo con estas realizaciones, un flavivirus puede incluir, a modo no taxativo, el virus del dengue, el virus del Nilo Occidental, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Luis, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas u otros flavivirus conocidos.

En otras realizaciones, las composiciones contempladas en la presente pueden aumentar el tamaño de placa en períodos de tiempo de crecimiento reducidos o similares, en comparación con los testigos que no se cultivaron con composiciones divulgadas en la presente, para uso en la evaluación de la actividad o en preparaciones virales de titulación. De forma alternativa, las composiciones contempladas en la presente pueden reducir el tiempo de retraso o acelerar el tiempo del crecimiento hasta varios días antes que los cultivos virales testigo que no usan las composiciones contempladas en la presente. En ciertas realizaciones, los títulos virales predeterminados puede ocurrir varias horas, medio día, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días o incluso hasta 10 días antes que las preparaciones virales cultivadas en otro medio conocido en la técnica o en composiciones complementarias proporcionadas a los cultivos que no tienen copolímeros . El título viral óptimo de algunas realizaciones puede ser de aproximadamente lxlO6 pfu/mL a aproximadamente lxlO8 pfu/mL. En ciertas realizaciones, un título flaviviral puede alcanzar concentraciones de aproximadamente lxlO7 pfu/mL en aproximadamente 4 días en un medio que contiene F127, en comparación con cultivos cultivados en un medio sin F127 que requieren aproximadamente 6 días .

Algunas realizaciones de la presente se refieren a composiciones y métodos para modular el tiempo para el crecimiento de un cultivo viral para alcanzar una concentración predeterminada. De acuerdo con estas realizaciones, el tiempo para el crecimiento puede reducirse aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30% , aproximadamente 35%, aproximadamente 40% y más. En varias realizaciones, una densidad de cultivo viral predeterminada puede alcanzarse en aproximadamente 80% , o aproximadamente 70% , o aproximadamente 60% del tiempo usando composiciones divulgadas en la presente en comparación con otras composiciones conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, los cultivos virales contemplados para producción en la presente pueden usarse en composiciones que incluyen, a modo no taxativo, formulaciones para vacunas parcialmente o completamente deshidratadas o hidratadas . En otras realizaciones, los cultivos virales contemplados en la presente para producción de formulaciones para vacunas pueden cultivarse para reducir el tiempo y los costos. Adicionalmente, la producción de estas formulaciones para vacunas puede reducirse en mano de obra, tiempo y costos, por e emplo, en ocasiones cuando ocurre una epidemia o un brote de enfermedades asociadas con flavivirus y las formulaciones para vacunas son necesarias en períodos de tiempo cortos.

En ciertas realizaciones, un virus atenuado vivo para uso en una composición para vacuna contemplada en la presente puede incluir, a modo no taxativo, una o más vacunas para flavivirus atenuados vivos, incluyendo a modo no taxativo, virus de la fiebre amarilla atenuados (tales como 17D) , virus de la encefalitis japonesa atenuados, (tales como SA 14 -14 -2 ) , virus del dengue atenuados (tales como DEN-2/PDK-53 o DEN-4D30 ) , virus del Nilo Occidental quimérico atenuado o flavivirus quiméricos recombinantes . En ciertas realizaciones, los cultivos flavivirales para uso en una composición para vacuna pueden cultivarse en composiciones de medio que tienen uno o más copolímeros divulgados en la presente .

Otras realizaciones se refieren a poblaciones virales para uso en formulaciones y métodos dirigidos a formulaciones para vacunas capaces de reducir o evitar el inicio de una afección médica provocada por uno o más de los flavivirus contemplados en la presente. De acuerdo con estas realizaciones, las afecciones médicas puede incluir, a modo no taxativo, infección del Nilo Occidental, dengue, encefalitis japonesa, enfermedad del bosque de Kyasanur, encefalitis del valle de Murray, fiebre hemorrágica de Alkhurma, encefalitis de San Luis, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre amarilla e. infección con el virus de la hepatitis C. Por consiguiente, el tiempo de producción para generar estas formulaciones puede reducirse usando composiciones contempladas en la presente para aumentar el crecimiento, reducir el tiempo de retraso y/o aumentar el tamaño de placa de poblaciones virales usadas en las formulaciones divulgadas .

Otras realizaciones se refieren a composiciones virales para uso en aplicaciones terapéuticas. Tales usos pueden incluir, a modo no taxativo, aplicaciones de terapia génica. Los virus' usados para administrar genes a células en aplicaciones de terapia génica incluyen lentivirus, adenovirus, virus adeno asociados y herpesvirus . Otros usos de composiciones virales pueden incluir, a modo no taxativo, terapias del virus del cáncer (por ejemplo, virus "oncolíticos" ) o inmunoterapias del cáncer.

Se contempla en la presente que cualquier medio usado para el crecimiento de cultivos celulares (por ejemplo, células huésped) puede usarse en la presente. Por ejemplo, se contemplan medios usados comúnmente para cultivos celulares. De acuerdo con estas realizaciones, el medio puede incluir, a modo no taxativo, DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco, glucosa alta, con L-glutamina, con clorhidrato de piridoxina, sin piruvato sódico que contiene 3,7 g de bicarbonato de sodio por litro) , MEM, BSS/ YE-LAH, F-10 (Ham's), F-12, M-199, RPMI , Agares, caldo de cultivo LB, y medios en base a PBS . Adicionalmente, se contempla que las células pueden cultivarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las células puede cultivarse en capas confluentes, como suspensiones, en múltiples capas, en botellas rotatorias, en pocilios o en tubos.

En ciertas realizaciones, las células huésped pueden usarse para cultivar virus divulgados en la presente. Se contempla cualquier célula conocida que hospede virus divulgados en la presente. Algunas células huésped para uso en cultivos virales divulgados en la presente incluyen, a modo no taxativo, Vero (células Vero de mono verde africano) , células LLC-MK2, células de mosquito C6 /36 u otras células conocidas en la técnica.

Algunas realizaciones de la presente invención describen composiciones que tienen uno o más tensioactivos de alto peso molecular o compuestos de copolimero para uso en métodos para cultivar varios cultivos virales donde algunas composiciones divulgadas en la presente son capaces de modular varios aspectos del crecimiento viral (por ejemplo, tamaño de placa más grande, fase de latencia reducida) en aproximadamente 10% , en aproximadamente 15% , en aproximadamente 20 % , en aproximadamente 25% , en aproximadamente 30% , en aproximadamente 35% , en aproximadamente 40% , en aproximadamente 45% , en aproximadamente 50% o más, en comparación con composiciones que no tienen una composición de copolimero. its Realizaciones adicionales se refieren a kits para uso para métodos y composiciones descritas en la presente. Las composiciones que incluyen, a modo no taxativo, • composiciones de copolímeros y formulaciones de virus vivos puede proporcionarse en un kit . Los kits también pueden incluir, a modo no taxativo, un recipiente adecuado, composiciones de copolimero, composiciones de virus vivos detalladas en la presente y opcionalmente, uno o más agentes adicionales tales como otros agentes antivirales, agentes antifúngicos o agentes antibacterianos, por ejemplo, para modular el crecimiento de especies no deseadas .

Los kits pueden incluir adicionalmente una composición de copol mero distribuida en alícuotas adecuadamente para uso en cultivos virales. Adicionalmente, las composiciones en la presente puede ser cultivos virales parcialmente o completamente deshidratados o acuosos y/o células huésped para propagar los virus así como también medios líquidos o parcialmente o completamente deshidratados. Los kits contemplados en la presente pueden almacenarse a temperaturas ambiente, congelados o a temperaturas refrigeradas tal como se divulga en la presente dependiendo de las formulaciones y componentes en particular.

El medio recipiente de los kits generalmente incluirá al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio recipiente, en el que puede colocarse una composición, y preferiblemente distribuirse en alícuotas adecuadamente. Cuando se proporciona un componente adicional, el kit también contendrá generalmente uno o más recipientes adicionales en los que pueden colocarse este agente o componente. Los kits en la presente también incluirán típicamente un medio para contener el agente, composición y cualquier otro recipiente de reactivo cerrado para venta en el mercado. Tales recipientes pueden incluir recipientes moldeados por inyección o por soplado en los que se retienen los viales deseados.

Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar ciertas realizaciones presentadas en la presente. Será evidente para los expertos en la técnica que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas para funcionar adecuadamente en las prácticas divulgadas en la presente, y por consiguiente pueden considerarse para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y obtener un resultado parecido o similar ' sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1 En un método ejemplar, representado en la Fig. 1, los efectos plurónicos sobre el crecimiento de flavivirus se examinaron en una línea celular ejemplar, células Vero (células Vero de mono verde africano) . Las células Vero se cultivaron hasta confluencia por ejemplo, en matraces T-75 cm2 2 días antes de la infección con flavivirus (tal como se indicó) a un MOI de 0,001. La adsorción de virus durante 180 minutos se evaluó en 2 mL de PBS en presencia o ausencia de plurónico (P123 o F127) . Las muestras testigo contenían adsorción viral en PBS sin un copolímero. Se agregó medio de crecimiento (18 mL de DMEM sin suero) después de la adsorción. Se tomaron alícuotas a diario y se titularon . sobre monocapas de células Vero. Los títulos virales se midieron tal como se ilustra en la Fig. 1.

En otro ejemplo, ilustrado en la Fig. 2, se examinó el crecimiento de flavivirus quimérico DEN-2/4 en células Vero, sin o con concentraciones variables de copolímero, Pluronic F127. Las células Vero se cultivaron hasta confluencia por ejemplo, en matraces T-75 cm2 2 días antes de la infección con DEN-2/4 a un MOI de 0,001. El virus adsorbió durante 120 minutos en 2 mL de DMEM con o sin F127. Los inóculos virales se enjuagaron de la monocapa celular con PBS seguido de la adición de 25 mL de medio de crecimiento indicado que contenía 5% de FBS con o sin F127 y se cultivaron durante 14 días. Se tomaron alícuotas a diario y se titularon sobre monocapas de células vero. Los títulos virales se midieron tal como se ilustra en la Fig. 2.

Ejemplo 2 En otro método ejemplar, se examinó el crecimiento de la quimera DEN 2/4 (Dengue 2/4) en células Vero que contenían cantidades crecientes de F127 durante la adsorción y el crecimiento (ver por ejemplo, Fig. 3). Una monocapa confluente de células Vero cultivadas en matraces T75cm2 en 25 mL de medio DMEM que contenía 10% de FBS y testigo o concentraciones crecientes de F127. Las concentraciones de F127 ejemplares usadas en este experimento incluyeron 0,063%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1,0% y 2,0% de F127. La células se infectaron con DEN2/4 a MOI = 0,001. Los parámetros incluyeron adsorción durante 1,5 horas en lmL de DMEM/F127. Se tomaron alícuotas cada dos días y se titularon sobre monocapas de células Vero. Los títulos virales se midieron tal como se ilustra en la Fig. 3.

Adicionalmente, otro experimento analizó los efectos del copolímero F127 durante la adsorción viral del flavivirus quimérico DEN2/1. En este ejemplo, se adsorbió DEN2/1 en un matraz confluente de células Vero a un MOI de 0,001 durante 90 minutos. La adsorción se llevó a cabo en 1 mL de medio de crecimiento (BA-1) con o sin 1% de F127. Después de la adsorción viral, se agregaron 20 mL de DMEM que contenía 2% de FBS y no se agregó F127 a los cultivos. Se tomaron alícuotas cada dos días y se titularon sobre monocapas de células Vero. Los títulos virales pueden medirse tal como se ilustra en la Fig. 4.

Ejemplo 3 Otro método ejemplar analizó si el tamaño de placa aumentaba o no en presencia de un copolímero ejemplar, F127. La Fig. 5 representa un tabla ejemplar, la Tabla 1. Este experimento mostró que el tamaño de placa de flavivirus aumenta en presencia de concentraciones crecientes del plurónico F127 durante el crecimiento. Aquí la monocapa confluente de células Vero se cultivó en un matraz T75cm2 en 20 mL de medio DMEM, 2% de FBS en presencia o ausencia de F127 cuando las células Vero se infectaron con DEN2/4 a MOI = 0,001. La adsorción llevó 1,5 horas y ImL de DMEM en presencia (0,1% o 1,0%) o ausencia de F127. Las placas (por ejemplo, 8) se visualizaron en un caja de iluminación y se midió su diámetro. La Tabla 1 representa los resultados en modo ANOVA del tamaño de placa (mm) y las diferencias en el crecimiento de DENVax 2/4 en ausencia de F127 o en presencia de concentraciones crecientes de F127.

Materiales y métodos : Se contempla que cualquier método conocido en la técnica puede usarse para cualquier composición, método y/o usos descritos en la presente. En ciertas realizaciones, se contempla que ciertos métodos serán más adecuados para el cultivo viral, por ejemplo materiales y métodos para uso en cultivos flavivirales , que otros métodos. En otras realizaciones, se contempla que ciertos métodos serán más adecuados para el cultivo de Dengue, que para otros flavivirus. A continuación se proporciona una breve descripción de métodos para cultivar una vacuna de Dengue quimérico de título alto o cualquier flavivirus atenuado vivo en presencia de F127. Usando un matraz T-75cm2, por ejemplo, se sembraron células Vero 2 días antes de la infección/adsorción viral a una densidad de 5 x 10?6 células por matraz. Este cultivo viral puede "aumentarse proporcionalmente" para incluir recipientes de cultivo de tejidos que varían de T-25cm2 hasta centros de producción de 10 pilas. El virus de adsorbe en una monocapa confluente de células Vero 2 días después del sembrado de las células en lmL de DMEM que contiene F127 (0,1%). Los recipientes de cultivo se incuban durante 1,5 horas a 37°C con agitación del recipiente cada 10 minutos . Después de la adsorción viral, las monocapas celulares se lavan tres veces con lOmL de PBS. A continuación se agrega el medio de cultivo (10 mL de DMEM pH=7,2, que contienen 3,7 g/L de NaHC03 y 0,1% de F127 sin FBS) a las monocapas y se incuban con o sin aireación a 37°C durante 4 días. En 4S día de cultivo viral, el medio de cultivo se reemplaza tal como se hizo después de la adsorción viral. A partir del 62 día y hasta el 12s día, el medio infeccioso se retira completamente de la cámara de cultivo y se centrifuga para clarificación. El cultivo viral se estabiliza y se almacena a -80°C hasta que su titulo puede examinarse mediante ensayo de placa sobre las monocapas de células Vero. Después de cosechas diarias, el medio de cultivo se reemplaza en los recipientes de cultivo de tejidos tal como se hizo en el 4S día. Las cosechas diarias continúan hasta el día 12. Las cosechas diarias se titulan individualmente sobre células Vero, y las cosechas con títulos altos pueden agruparse para obtener una muestra homogénea. A menudo, el primer día de cosecha (día 6) no se incluye para evitar niveles altos de ADN de las células huésped (Vero) .

Tabla 1. Ejemplo de DMEM - F12 : Mezcla de nutrientes F-12 (Ham) , polvo (21700) con L-glutamina. Aditivos cada 10 L: 11,76 g de bicarbonato de sodio, 100 mi de penicilina estreptomicina Ajustar el pH hasta 7,2 Peso Conc . olaridad COMPONENTES molar (mg/L) (mm) SALES INORGANICAS: Cloruro de calcio 111 33,22 0,299 (Anhidro) Sulfato de cobre (CuS04- 250 0,0025 0,00001 5H20) Sulfato de hiero (FeS04- 278 0,834 0,003 7H20) Cloruro de potasio (KC1) 75 223,60 2,98 cloruro de magnesio 95 57,22 0,60 (Anhidro) Cloruro de sodio (NaCl) 58 7599,00 131,00 Bicarbonato de sodio 84 1176,00 14,00 (NaHC03) Fosfato de sodio, dibase . 142 142,00 1,00 (Anhidro) Sulfato de zinc (ZnS04- 288 0,863 0,003 7H20) OTROS COMPUESTOS: D-Glucosa 180 1802,00 · 1,00 Hipoxantina Na 159 4,77 0,03 Ácido linoleico 280 0,084 0,0003 Ácido Lipoico 206 0,21 0,000971 Rojo fenol 398 1,20 0,003 Putrescina-2HC1 161 0,161 0, 001 Piruvato sódico 110 110,00 1, 00 Timidina 242 0,70 0, 003 AMINOACIDOS : L-Alanina 89 8,90 0,100 Clorhidrato de 211 211,00 1,00 Arginina L-Asparagina-H20 150 15,01 0,100 Ácido L-Aspártico 133 13,30 0,100 L-Cisteína-HCl-H20 176 35,12 0,200 Ácido L-Glutámico , 147 14,70 0,100 L-Glutamina 146 146,00 1,00 Glicina 75 7,50 0,100 L-Histidina-HCl-H20 210 21,00 0,0998 L-Isoleucina 131 4,00 0,030 L-Leucina 131 13,10 0,100 Clorhidrato de L-Lisina 183 36,50 0,199 L-Metionma 149 4,50 0,030 L-Fenilalanina 165 5, 00 0, 030 L-Prolina 115 34, 50 0,300 L-Serina 105 10, 50 0, 100 L-Treonma 119 11,90 0,100 L-Triptófano 204 2,04 0,010 L-Tirosina 2Na 2H20 225 7, 81 0,03 L-Valina 117 11,70 0,100 VITAMINAS : Biotma 244 0,0073 0,00003 Pantotenato del D-Calcio 477 0,50 0,001 Cloruro de colina 140 14, 00 0,0997 Ácido fólico 441 1,30 0, 0029 i-Inositol 180 18,00 0,100 Niacinamida 122 0,036 0, 0003 Clorhidrato de 206 0,06 0,0003 piridoxina Riboflavina 376 0,037 0,000101 Clorhidrato de tiamina 337 0,30 0,001 Vitamina B12 1.355 1,40 0,001 **************************** Todas las COMPOSICIONES y MÉTODOS divulgados y reivindicados en la presente pueden hacerse y llevarse a cabo sin experimentación excesiva a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos se han descrito en términos de las realizaciones preferidas, es evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las COMPOSICIONES y MÉTODOS y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la presente. Más específicamente, ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituirse por los agentes descritos en la presente en tanto se obtienen los mismos resultados o similares. Todos dichos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance ty concepto tales como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : Lo que se reivindica es :

1. Una composición para cultivar cultivos virales que comprende : uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros ; y opcionalmente, un medio, en donde los tensioactivos o copol mero de alto peso molecular aceleran el crecimiento de cultivos virales .

2. La composición de la reivindicación 1, en donde los tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros comprenden Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, otros copolímeros en bloques de OE-OP mayores de 3.000-4.000 MW o una combinación de los mismos .

3. La composición de la reivindicación 1, en donde los cultivos virales se seleccionan del grupo que consiste en Flavivirus, Togavirus, Coronavirus, Rabdovirus, Filovirus, Paramixovirus , Ortomixovirus , Bunyavirus , Arenavirus , Retrovirus, Hepadnavirus , Pestivirus, Picornavirus , Calicivirus, Reovirus, Parvovirus, Papovavirus, Adenovirus, virus del Herpes y Poxvirus .

4. La composición de la reivindicación 1, en donde los cultivos virales son cultivos de Flavivirus.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde los cultivos virales son cultivos de Poxvirus .

6. La composición de la reivindicación 1, en donde los tensioactivos de alto peso molecular comprenden copol mero en bloque de OE-OP Pluronic F127, Pluronic P123 o una combinación de los mismos .

7. La composición de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular tiene un peso molecular de 1500 o mayor.

8. La composición de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular comprende adicionalmente uno o más copolímeros y en donde el peso molecular de dicho agente tensioactivo de alto peso molecular es 3000 o mayor.

9. La composición de la reivindicación 1, en donde la concentración de al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular es aproximadamente 0,001% a aproximadamente 3,0%.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular comprende Pluronic F127 y el medio comprende Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) .

11. Un método para aumentar la tasa de crecimiento viral que comprende administrar a un cultivo de células huésped infectadas con un virus, una composición qué comprende uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros en donde la composición aumenta la tasa de crecimiento viral.

12. Un método para aumentar la tasa de crecimiento viral que comprende administrar una composición que comprende uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros a un cultivo de células huésped antes, durante o después de la infección viral del cultivo de células huésped.

13. Un método para aumentar el tamaño de placa de un cultivo viral . que comprende administrar a un cultivo de células huésped infectado con un virus, una composición que comprende uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros en donde la composición aumenta el tamaño de placa viral en comparación con un cultivo viral testigo sin administración de uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros.

14. Un método para reducir el tiempo de retraso de crecimiento de un cultivo viral que comprende administrar a un cultivo de células huésped infectado con un virus, una composición que comprende uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros en donde la composición reduce el tiempo de retraso de los cultivos virales en comparación con un cultivo viral testigo sin administración de uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros.

15. El método de la reivindicación 14, en donde los cultivos virales se seleccionan de cultivos flavivirales .

16. El método de la reivindicación 14, en donde los cultivos virales comprenden cultivos virales para generar vacunas virales atenuadas vivas .

17. El método de la reivindicación 14, en donde la reducción del tiempo de retraso comprende al menos una reducción del 10 por ciento del tiempo de retraso en comparación con cultivos virales sin uno o más tensioactivos de alto peso molecular o copolímeros .

18. El método de la reivindicación 14, en donde al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular comprende Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123 , otros copolímeros en bloques de OE-OP mayores de 3.000-4.000 MW o una combinación de los mismos .

19. Un kit para cultivar virus que comprende; al menos un recipiente; una composición que comprende uno o más tensioactivos de alto peso molecular; y opcionalmente, uno o más cultivos virales.

20. El kit de la reivindicación 19, en donde al menos uno de los tensioactivos de alto peso molecular comprende Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, otros copolímeros en bloques de OE-OP mayores de 3.000-4.000 MW o una combinación de los mismos.

21. El kit de la reivindicación 19, en donde la concentración del copolímero en bloque de OE-OP Pluronic F127 es de 0,001% a aproximadamente 3,0%.

22. El kit de la reivindicación 19, en donde el cultivo viral comprende uno o más Flavivirus .

23. El kit de la reivindicación 19, que comprende además un medio.

24. El kit de la reivindicación 19, que comprende además un cultivo madre de células huésped.