BR122020015754B1

BR122020015754B1 - Métodos para aumentar a taxa de crescimento viral, para aumentar o tamanho da placa de uma cultura viral, para reduzir o tempo de latência do crescimento de uma cultura viral, e para a cultura de vírus para a produção e fabricação

Info

Publication number: BR122020015754B1
Application number: BR122020015754-2A
Authority: BR
Inventors: Dan T. Stinchcomb; Jill A. Livengood; O'Neil Wiggan; Richard Kinney; Jorge Osorio
Original assignee: Takeda Vaccines, Inc.
Priority date: 2008-12-05
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2021-03-23
Also published as: US8871487B2; IL238819A; TW201030148A; TWI461536B; CA2745962C; EP2366024A1; JP6174066B2; IL238819A0; NZ593415A; AU2009322175B2; TWI573874B; BRPI0922788A2; EP2366024A4; SG10201503671TA; KR20110127117A; CN105219734B; JP2012510822A; IL213389B; AR074483A1; CN105219734A

Abstract

as modalidades aqui reportam métodos, composições e usos para induzir e/ou acelerar o crescimento viral. em certas modalidades, os métodos, composições e usos geralmente relacionados a composições de copolímero para induzir o crescimento viral, reduzir o tempo de demora e/ou aumentar o tamanho da placa viral. em outras modalidades, métodos, composições e usos de composições de copolímero podem ser para induzir o crescimento flaviviral, reduzir a latência no crescimento e/ou aumentar o tamanho da placa.

Description

MÉTODOS PARA AUMENTAR A TAXA DE CRESCIMENTO VIRAL, PARA AUMENTAR O TAMANHO DA PLACA DE UMA CULTURA VIRAL, PARA REDUZIR O TEMPO DE LATÊNCIA DO CRESCIMENTO DE UMA CULTURA VIRAL, E PARA A CULTURA DE VÍRUS PARA A PRODUÇÃO E FABRICAÇÃO

Referência Cruzada a pedido Relacionado

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos Nº de Série. 61/120.262, depositado em 5 de dezembro de 2008 e o pedido provisório é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Campo

[002] As modalidades deste pedido de modo geral relatam os métodos, as composições e os usos para o crescimento viral acelerado ou intensificado. Em certas modalidades, este pedido relata os métodos, as composições e os usos das composições de copolímeros para a indução acelerada do crescimento viral e/ou aumento do tamanho de placa viral. Em outras modalidades, são relatados métodos, composições e usos das composições de copolímeros para a aceleração do crescimento flaviviral, redução do tempo de latência flaviviral e/ou aumento do tamanho de placa flaviviral.

Antecedentes

[003] As vacinas para a proteção contra doenças infecciosas têm sido usadas para melhorar a saúde humana e animal. Uma tecnologia bem-sucedida para as vacinas virais é para imunizar animais ou seres humanos com uma variedade enfraquecida ou atenuada do vírus (um "vírus atenuado, vivo"). Devido à replicação limitada após a imunização, a variedade atenuada não causa a doença. No entanto, a replicação viral limitada é suficiente para expressar o repertório completo dos antígenos virais e gera respostas imunes de longa duração e potentes para os vírus. Deste modo, na subsequente exposição a uma variedade do vírus patogênicos, o indivíduo imunizado está protegido de doenças.

[004] Recentes avanços técnicos, tais como reagrupamento, genéticas inversas e adaptação ao frio, têm levado a avanços de vírus atenuados, vivos para a influenza e o rotavírus. Certo número de vacinas virais vivas, desenvolvidas com tecnologias de DNA recombinante está em testes clínicos humanos, que incluem vacinas para a doença do Nilo Ocidental, febre de dengue, malária, tuberculose e HIV. Estas vacinas virais recombinantes dependem da manipulação de vacinas virais atenuadas bem caracterizadas, tais como o adenovírus, o vírus da vaccínia, o vírus da febre amarela 17 D ou da dengue, DEN-2 PDK-53. Em grupo, as vacinas virais atenuadas vivas estão entre as muitas intervenções médicas bem-sucedidas na história humana, ficando em segundo lugar somente para o advento de antibióticos e mantêm a promessa de melhorar a saúde pública por todo o mundo.

[005] Outras vacinas têm sido desenvolvidas por meio da inativação dos vírus após o crescimento na cultura de células. Estas vacinas de "vírus mortos" induzem as respostas imunes devido à presença de concentrações elevadas do antígeno presente. Os exemplos de vacinas virais mortas eficazes incluem, mas, sem limitação, a vacina para a raiva, influenza, hepatite A e poliovírus.

[006] Os Flavivírus causam certo número de doenças humanas e animais de impacto significativo. São vírus envolvidos com um genoma de RNA de aproximadamente 11.000 bases. A maior parte dos Flavivírus é transmitida por meio de vetor artrópode, geralmente mosquitos. Existem mais de 70 diferentes Flavivírus que são agrupados em três categorias mais importantes com base na sorologia: o grupo da dengue, o grupo da encefalite japonesa e o grupo da febre amarela. A urbanização em expansão, as viagens por todo o mundo e as mudanças ambientais (tais como o desflorestamento ou padrões de chuva) têm induzido a emergência de diversos Flavivírus como ameaças para a saúde pública humana. Tais vírus incluem, mas, sem limitação, febre amarela vírus, os vírus da dengue, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus da encefalite japonesa e o vírus da encefalite originado do carrapato.

[007] Têm sido desenvolvidas tanto vacinas virais atenuadas, vivas como vacinas dos vírus mortos que são seguras e protegem contra as doenças dos Flavivírus, por exemplo, febre amarela e encefalite japonesa.

Sumário

[008] As modalidades deste pedido referem-se de modo geral a métodos, composições e usos para a indução, intensificação e aceleração do crescimento viral. Em certas modalidades, este pedido relata métodos, composições e usos das composições de copolímeros para a indução acelerada do crescimento viral e/ou aumento do tamanho da placa viral. Em outras modalidades, os métodos, as composições e os usos das composições de copolímeros são relatados para a aceleração do crescimento flaviviral, a redução do tempo de latência flaviviral e/ou o aumento do tamanho da placa flaviviral.

[009] Uma limitação para a produção de vacinas tem sido a produção e o crescimento in vitro em grande escala dos vírus para suportar a demanda das vacinas. Deste modo, uma das necessidades que existem na técnica é intensificar e acelerar o crescimento viral. Certas modalidades da presente invenção dizem respeito a métodos e composições para a intensificação e aceleração do crescimento viral. Estas composições são de uso, por exemplo, na produção de vacinas virais e subprodutos virais de uso em outras tecnologias, tais como a produção de terapias de gene relacionadas a vírus e outros produtos virais. Além disso, as modalidades aqui podem ser de uso para intensificar ou acelerar o crescimento de culturas virais de uso nas vacinas do vírus morto.

[010] Certas composições aqui descritas podem incluir copolímeros sozinhos ou em combinação com outros agentes ou compostos para a intensificação e aceleração do crescimento viral. Outras modalidades aqui dizem respeito às combinações de excipientes que intensificam o crescimento dos vírus atenuados vivos. Os copolímeros de uso aqui incluem, mas, sem limitação, Pluronic F 127, Pluronic F68, Pluronic P123, Pluronic P85, outros copolímeros em bloco de óxido de polietileno-óxido de polipropileno (EO-PO) 5 maiores do que de 3.000 a 4.000 MW ou combinações destes.

[011] De acordo com estas modalidades, os vírus podem incluir, mas, sem limitação, Flavivírus, Togavírus, Coronavírus, Rabdovírus, Filovírus, Paramixovírus, Ortomixovírus, Buniavírus, Arenavírus, Retrovírus, Hepadnavírus, Pestivírus, Picornavírus, Calicivírus, Reovírus, Parvovírus, Papovavírus, Adenovírus, Vírus do herpes e Poxvírus. Algumas modalidades, dirigidas às composições de uso em culturas virais, podem incluir, mas, sem limitação, culturas tendo um ou mais vírus, tais como uma mistura de espécies virais ou uma espécie única, ou um ou mais vírus atenuados, vivos cultivados em uma ou mais composições de copolímero sozinhas ou em combinação com outros agentes.

[012] Em outras modalidades, as composições aqui contempladas podem aumentar o tamanho da placa num período de tempo similar ou reduzido de crescimento, em comparação com uma cultura de controle sem a composição descrita, para uso em titulação, produção ou medição da atividade das preparações de vírus. Em alguns aspectos da presente invenção, os títulos virais mais elevados podem ser obtidos em períodos de tempo reduzidos. Alternativamente, as composições aqui contempladas podem reduzir o tempo de latência ou acelerar o tempo de crescimento em até vários dias em comparação as culturas virais de controle não usando as composições aqui contempladas.

[013] Outras modalidades dizem respeito a populações de vírus para uso em formulações e métodos direcionados a formulações de vacina capazes de reduzir ou prevenir o início de uma condição médica causada por meio de um ou mais dos vírus aqui contemplados. De acordo com estas modalidades, as condições médicas podem incluir, mas, sem limitação, condições e/ou infecções que incluem o Nilo Ocidental, a febre por dengue, a encefalite japonesa, a doença da floresta de Kyasanur, a encefalite do Vale de Murray na Austrália e Nova Guiné, o vírus de Kunjin (um parente do Nilo Ocidental), a febre hemorrágica de Alkhurma, a encefalite de St. Louis, a infecção por vírus da hepatite C, a encefalite originada do carrapato, a febre amarela, os vírus de Yaonde, Usutu, Koutango na África e Cacipacore na América do Sul. Em certas modalidades, o tempo de produção para a geração das formulações de vacina pode ser reduzido por meio das composições aqui contempladas para acelerar a produção e fabricação do crescimento viral, a redução do tempo de latência e/ou o aumento do tamanho da placa das populações virais.

[014] Em certas modalidades, as culturas virais aqui contempladas para a produção podem ser usadas em composições que incluem, mas, sem limitação, formulações de vacina hidratadas ou parcial ou completamente desidratadas ou outras formulações virais.

[015] Em certas modalidades, um vírus atenuado vivo para uso em uma composição de vacina contemplada aqui pode incluir, mas, sem limitação, uma ou mais vacinas de Flavivírus atenuados, vivos, que incluem, mas, sem limitação, vírus atenuados da febre amarela (por exemplo, 17 D), vírus atenuado da encefalite japonesa, (por exemplo, SA 14-14-2), vírus atenuados da dengue (por exemplo, DEN-2/PDK-53 ou DEN-4∆30), vacinas quiméricas atenuadas do Nilo Ocidental ou flavivírus quiméricos recombinantes.

[016] Outras modalidades dizem respeito aos kits para o crescimento de culturas virais aqui contempladas. É tido em consideração que um kit pode incluir culturas virais parcial ou completamente desidratadas para uso na geração de populações vivas de vírus atenuados, para a produção de vacinas ou outros usos da composição viral. É, da mesma forma, considerado que um kit pode incluir uma ou mais composições de indução do crescimento aqui descritas.

Breve Descrição dos Desenhos

[017] Os desenhos que seguem fazem parte do presente Relatório Descritivo e estão incluídos para ainda demonstrar aqui certas modalidades. As modalidades podem ser melhor entendidas por referência a um ou mais destes desenhos sozinhos ou em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas.

[018] A Figura 1 representa um gráfico exemplificativo de efeitos plurônicos sobre o crescimento viral após a introdução e infecção celular de um agente de controle ou composição de copolímero durante a adsorção viral.

[019] A Figura 2 representa um gráfico exemplificativo que ilustra o crescimento de culturas virais na presença de um copolímero durante a adsorção viral e/ou crescimento.

[020] A Figura 3 representa um gráfico exemplificativo que ilustra o crescimento de culturas virais na presença de quantidades crescentes de uma composição que contém o copolímero durante a adsorção viral e o crescimento.

[021] A Figura 4 representa um gráfico exemplificativo que ilustra o crescimento de culturas virais na presença ou ausência de um copolímero específico adicionado durante a adsorção viral.

[022] A Figura 5 representa uma tabela exemplificativa que ilustra a mudança no tamanho da placa exemplificativa de culturas virais na presença ou ausência de várias concentrações do copolímero.

Definições

[023] Como usado aqui, "um" ou "uma" pode significar um ou mais do que um de um item.

[024] Como usado aqui, recipiente pode incluir, mas, sem limitação, tubo para teste, tubo de mini ou microcentrífuga, placa, frasco para cultura de tecido, fábrica de célula, canal, frasco, placa de microtítulo ou recipiente.

[025] Como usado aqui no Relatório Descritivo, "indivíduo" ou "indivíduos" pode incluir, mas sem limitação, mamíferos, tais como seres humanos ou mamíferos, domesticados ou selvagens, por exemplo, cachorros, gatos, furões, coelhos, porcos, cavalos, gado ou animais de jardim zoológico.

[026] Como usado aqui, "cerca de" pode significar mais ou menos de dez por cento.

[027] Como usado aqui, "tensoativos de alto peso molecular" podem significar uma molécula anfifílica de superfície ativa maior do que um peso molecular de 1.500.

[028] [0028]Como usado aqui, "copolímero em bloco de EO-PO" pode significar um copolímero que consiste em blocos de poli(etileno óxido) e óxido de poli(propileno). Além disso, como usado aqui, "Pluronic" pode significar os copolímeros em bloco de EO-PO no EOxPOy-EOx. Esta configuração de copolímero em bloco de EO-PO é da mesma forma referida como "Poloxamer" ou "Synperonic".

[029] Como usado aqui, "vírus atenuado" pode significar um vírus que não demonstra sinais clínicos ou sinais reduzidos de doença relacionada a vírus, quando administrado a um indivíduo, tal como um mamífero (por exemplo, uma pessoa humana ou um animal).

[030] Como usado aqui, "acelerar" pode significar a diminuição do tempo de latência antes da produção do vírus começar ou o aumento da taxa de produção viral de modo que sejam produzidas concentrações mais elevadas de vírus em uma quantidade de tempo mais curta ou de modo que o tamanho da placa seja aumentado em algumas modalidades relativas a um controle.

[031] Como usado aqui, "vacina de vírus morto" pode significar uma vacina preparada por meio da inativação de um vírus por qualquer um dentre um número de meios físicos ou químicos conhecidos na técnica.

Descrição

[032] Nas seções que seguem, são descritos vários métodos e composições exemplificativos a fim de detalhar várias modalidades. Deve ser óbvio para alguém versado na técnica que a prática das várias modalidades não exige o uso de todo ou até mesmo alguns dos detalhes aqui delineados, mas de preferência que as concentrações, tempos e outros detalhes possam ser modificados através da experimentação da rotina, Em alguns casos, os componentes ou métodos bem conhecidos não foram incluídos na descrição.

[033] As modalidades aqui dizem respeito ao uso de várias composições para intensificar a taxa de crescimento ou a redução do tempo de latência do crescimento viral em uma cultura. De acordo com estas modalidades, as composições podem incluir agentes de copolímero. As modalidades deste pedido referem-se de modo geral a métodos, composições e usos para a indução e a aceleração do crescimento viral. Em certas modalidades, este pedido se refere de modo geral a métodos, composições e usos das composições de copolímeros para a aceleração do crescimento viral e/ou aumento do tamanho de placa viral. Em outras modalidades, os métodos, as composições e os usos das composições de copolímeros para a aceleração do crescimento flaviviral, redução do latência no crescimento e/ou aumento do tamanho da placa. Certas composições de copolímeros contempladas aqui incluem, mas, sem limitação, Pluronic ¥121, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, outros copolímeros em bloco de EO-PO maiores do que de 3.000 a 4.000 MW ou combinações destes.

Copolímeros

[034] Em certas modalidades, as composições podem incluir copolímeros, por exemplo, pluronic F127. O Pluronic F127 (da mesma forma, aqui referido como F127) é um copolímero polioxietilenopoloxipropileno não iônico. Os copolímeros de bloco plurônico são conhecidos sob seu nome não proprietário como poloxâmeros. Eles foram inicialmente desenvolvidos para uso como tensoativos. Estes compostos consistem em blocos de óxido de etileno hidrofilico (EO) e óxido de propileno hidrofóbico (PO). Os copolímeros em bloco de EOPO podem incluir blocos de óxido de polietileno (-CH2CH2Ochamados de EO) e óxido de polipropileno (-CH2CHCH3O-chamados de PO).O bloco de PO pode ser flanqueado por dois blocos de EO em uma disposição de EOx-POy-EOx. Uma vez que o componente de PO é hidrofílico e o componente de EO é hidrofóbico, a hidrofilicidade completa, o peso molecular e as propriedades do tensoativo podem ser ajustadas por meio da variação x e y na estrutura de bloco EOx-POyEOx. De acordo com o fabricante, (por exemplo, BASF, Lutrol®F127) o F127 pode ser usado como um agente espessante e co-emulsificante em cremes e emulsões líquidas.

[035] O F127 sofre um processo conhecido como termogelificação reversa, quando sofre uma transição de fase do líquido para gel ao atingir temperaturas fisiológicas. As temperaturas mais elevadas promovem a desidratação de uma unidade de óxido alquileno do polímero em bloco e isto pode resultar na solubilidade diminuída. Especificamente, nas concentrações elevadas (por exemplo: cerca de IO % em peso / volume) certos tipos dos copolímeros em bloco de EOPO de peso molecular mais elevado devem sofrer a gelificação reversa, que forma um gel quando a temperatura aumenta. Adicionalmente, quando estes copolímeros em bloco residem acima da concentração crítica de micelas (CMC), eles se reúnem em micelas. Em soluções aquosas, os copolímeros em bloco de EO-PO devem se reunir em micelas com um núcleo de PO e uma coroa dos grupos de EO hidrofílicos. Em certos estudos, as formulações de copolímero em bloco de EO-PO têm sido investigadas como agentes potenciais de liberação de fármaco para uma 25 variedade de fármacos hidrofóbicos e para proteínas, DNA ou vacinas inativadas.

[036] O mecanismo de atividade destes copolímeros em bloco plurônico é atualmente desconhecido. Se bem que o Pluronic F127 tenha sido estudado como um componente de liberação sustentado de um sistema de liberação de vacina em combinação com a quitosana. A vacinação dos camundongos com toxoide de Tetanus que contém F127 aumentou a resposta de anticorpos em antígenos de tétano intranasal e sistemicamente liberados. Em certos métodos, os plurônicos têm sido mostrados induzirem mudanças na microviscosidade e fluidez das membranas da célula, o que pode contribuir para a sua versatilidade.

[037] O Pluronic F127 tem sido usado numa variedade de aplicações farmacêuticas humanas que incluem produtos farmacêuticos dentais, orais e laxativos. As formulações de vacina têm usado também tensoativos como estabilizantes para impedir a perda de material. Os estudos para a liberação da vacina de DNA com certas concentrações de F127 (O 0,01 % em peso / volume) têm mostrado liberação aumentada de fármacos, possivelmente por potencialização da captação celular e captura de células dendríticas maduras. A formação em gel às temperaturas corporais permite o uso dos géis do copolímero em bloco de EO-PO para agir como depósito de fármacos nas aplicações de liberação de fármacos e vacinas.

[038] Certas composições aqui descritas podem incluir os copolímeros sozinhos ou em combinação com outros agentes ou compostos. Além disso, as composições aqui descritas podem incluir uma composição média tendo um ou mais agente(s) de copolímero adicionado(s) ao meio além de outros suplementos de meios. Os meios de uso nas composições aqui descritas podem incluir qualquer meio conhecido na técnica conhecida para aumentar os organismos virais considerados aqui ou um meio específico para um organismo viral particular. Outras modalidades aqui dizem respeito às combinações de excipientes que intensificam grandemente o crescimento dos vírus vivos (por exemplo, vírus atenuados). Ainda outras composições e métodos aqui são direcionados à redução do tempo de latência relacionado ao crescimento de organismos virais. Algumas modalidades dizem respeito à modulação do tamanho da placa dos organismos virais. Os copolímeros de uso aqui incluem, mas, sem limitação, Pluronic F127, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic P123, outros copolímeros em bloco de EO-PO maiores do que 3.000 a 4.000 MW ou combinações destes.

[039] As composições aqui consideradas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com meios antes, durante e/ou após culturas virais terem sido introduzidas no meio celular da cultura hospedeira das composições aqui descritas podem ser líquidas, sólidas ou líquidos semissólidos. Em certas modalidades, as composições suplementares podem ser adicionadas durante os períodos do crescimento viral a fim de monitorar, ajustar ou estimular os processos do crescimento viral. Em outras modalidades, uma ou mais composições de copolímeros suplementares podem ser adicionadas para reduzir o tempo de latência, acelerar o crescimento viral e/ou aumentar o tamanho de placa viral. As composições aqui consideradas podem ser usadas sozinhas, em combinação com outros suplementos (por exemplo, vitaminas, íons de metal e aminoácidos) ou como um suplemento de meio, quando o meio é adicionado às culturas.

[040] Outras modalidades incluem estoques para a cultura de culturas virais, tais como o vírus atenuado vivo que inclui, mas, sem limitação, Picornavírus (por exemplo, poliovírus, vírus da doença do pé e boca), Calicivírus (por exemplo, vírus SARS, vírus da peritonite infecciosa felina), Togavírus (por exemplo, vírus sindbis, o vírus da encefalite equina, o vírus chikungunya, o vírus da rubéola, o vírus de Ross River, o vírus da diarreia bovina, o vírus da cólera suína), o Flavivírus (por exemplo, o vírus da dengue, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da encefalite de St. Louis, o vírus da encefalite originada do carrapato), o Coronavírus (por exemplo, o coronavírus humano (resfriado comum), o vírus da gastroenterite suína), o Rabdovírus (por exemplo, o vírus da raiva, o vírus da estomatite vesicular), o Filovírus (por exemplo, o vírus de Marburg, o vírus Ebola), o Paramixovírus (por exemplo, o vírus do sarampo, vírus da cinomose canina, o vírus da caxumba, o vírus da parainfluenza, o vírus sincicial respiratório, o vírus da doença de Newcastle, o vírus rinderpest), o Ortomixovírus (por exemplo, o vírus da influenza humana, o vírus da influenza aviária, o vírus da influenza equina), o Buniavírus (por exemplo, o hantavírus, o vírus de LaCrosse, o vírus da febre do Vale Rift), o Arenavírus (por exemplo, o vírus de Lassa, o vírus de Machupo), o Reovírus (por exemplo, preovírus humano, o rotavírus humano), o Birna-vírus (por exemplo, o vírus bursal infeccioso, o vírus da necrose pancreática do peixe), o Retrovírus (por exemplo, HIV 1, HIV 2, HTLV-I, HTLV-2, o vírus da leucemia bovina, o vírus da imunodeficiência felina, o vírus do sarcoma felino, o vírus do tumor mamário do camundongo), o Hepadnavírus (por exemplo, o vírus da hepatite B.) , o Parvovírus (o parvovírus B humano, o parvovírus canino, o vírus da panleucopenia felina) o Papovavírus (por exemplo, o papilomavírus humano, o SV40, o papilomavírus bovino), o Adenovírus (por exemplo, o adenovírus humano, o adenovírus canino, o adenovírus bovino, o adenovírus porcino), o vírus do herpes (por exemplo, o vírus do herpes simples, o vírus da varicela-zóster, o vírus da rinotraqueíte bovina infecciosa, o citomegalovírus humano, o herpesvírus 6 humano) e o Poxvírus (por exemplo, a vaccínia, o vírus do epitelioma contagioso, o poxvírus de raccoon, o vírus da varíola do gambá, o vírus da varíola do macaco, o vírus da vaccínia, o vírus do musculum contagioso).

[041] De acordo com estas modalidades, certos vírus atenuados vivos incluem, mas, sem limitação, o Flavivírus atenuado, vivo. Algumas modalidades, dirigidas a composições, podem incluir, mas, sem limitação, um ou mais vírus atenuados, vivos, tal como um ou mais Flavivírus atenuado, vivo, cultivado numa ou mais composições de copolímeros sozinhas ou em combinação com outros agentes. De acordo com estas modalidades, um Flavivírus pode incluir, mas, sem limitação, o vírus da dengue, o vírus do Nilo Ocidental, o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da encefalite de St. Louis, o vírus da encefalite originado do carrapato ou outro Flavivírus conhecido.

[042] Em outras modalidades, as composições aqui consideradas podem aumentar o tamanho da placa em períodos de tempo reduzidos ou similares de crescimento, em comparação com os controles das composições não desenvolvidas aqui descritas, para uso na avaliação da atividade viral ou titulação das preparações virais. Alternativamente, as composições aqui consideradas podem reduzir o tempo de latência ou acelerar o tempo de crescimento durante até diversos dias mais cedo do que o controle das culturas virais que não empregam as composições aqui consideradas. Em certas modalidades, os títulos virais predeterminados podem ocorrer diversas horas, uma metade de uma dia, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias ou até mesmo até 10 dias mais cedo do que as preparações de vírus desenvolvida em outro meio conhecido na técnica ou composições suplementares fornecidas às culturas não tendo o copolímero. O título viral ótimo de algumas modalidades pode ser de cerca de 1x106 pfu/mL a cerca de 1x108 pfu/mL. Em certas modalidades, um título flaviviral pode alcançar concentrações de cerca de 1x107 pfu/mL em cerca de 4 dias no meio que contém F127, quando em comparação as culturas desenvolvidas no meio sem F127 o que leva cerca de 6 dias.

[043] Algumas das modalidades aqui dizem respeito a composições e métodos para o tempo de modulação para o crescimento de uma cultura viral para alcançar uma concentração predeterminada. De acordo com estas modalidades, o tempo para o crescimento pode ser reduzido para cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40% e mais. Em várias modalidades, uma densidade de cultura viral predeterminada pode ser finalizada em cerca de 80%, ou em cerca de 70% ou em cerca de 60% de tempo usando as composições aqui descritas em comparação com as outras composições conhecidas na técnica.

[044] Em certas modalidades, as culturas virais consideradas para a produção aqui podem ser usadas nas composições que incluem, mas, sem limitação, formulações de vacina hidratadas ou desidratadas parcial ou completamente. Em outras modalidades, as culturas virais aqui consideradas para a produção das formulações de vacina podem ser cultivadas a custos e tempo reduzidos. Além disso, a produção destas formulações de vacina pode ser reduzida em trabalho, tempo e custos, por exemplo, nos tempos em que ocorre uma epidemia ou explosão de doenças flavivirais associadas e as formulações de vacina são exigidas num curto período de tempo.

[045] Em algumas modalidades, um vírus atenuado vivo para uso em uma composição de vacina aqui considerada pode incluir, mas, sem limitação, uma ou mais vacinas de Flavivírus atenuados, vivos, que incluem, mas, sem limitação, vírus atenuados da febre amarela (tal como 17D), vírus atenuado da encefalite japonesa, (tal como SA 14-14- 2), vírus atenuados da dengue (tal como DEN-2/PDK-53 ou DEN-4∆30), vírus do Nilo Ocidental quimérico atenuado ou Flavivírus quimérico recombinante, Em certas modalidades, as culturas flavivirais de uso em uma composição para vacina podem ser desenvolvidas no meio da composição tendo um ou mais copolímeros aqui descritos.

[046] Outras modalidades dizem respeito às populações de vírus de uso em formulações e métodos direcionados às formulações da vacina capazes de reduzir ou prevenir o início de uma condição médica causada por meio de um ou mais dos Flavivírus considerados aqui. De acordo com estas modalidades, as condições médicas podem incluir, mas, sem limitação, a infecção de Nilo Ocidental, a febre por dengue, a encefalite japonesa, a doença da floresta de Kyasanur, a encefalite do vale de Murray, a febre hemorrágica de Alkhurma, a encefalite de St. Louis, a encefalite originada do carrapato, a febre amarela e a infecção por vírus da hepatite C. Deste modo, o tempo de produção para a geração destas formulações pode ser reduzido usando as composições aqui consideradas para aumento do crescimento, redução do tempo de latência e/ou aumento do tamanho da placa das populações virais usadas nas formulações descritas.

[047] Outras modalidades dizem respeito a composições de vírus de uso nas aplicações terapêuticas. Tais usos podem incluir, mas, sem limitação, aplicações de terapia de gene. Os vírus usados para liberar os genes para as células nas aplicações de terapia do gene incluem lentivírus, adenovírus, vírus adenoassociados e vírus do herpes. Outros usos de composições de vírus podem incluir, mas, sem limitação, terapias do vírus do câncer (por exemplo, vírus "oncolíticas") ou imunoterapias do câncer.

[048] É considerado aqui que qualquer meio usado para o crescimento das culturas de células (por exemplo, células hospedeiras) pode ser de uso aqui. Por exemplo, são tidos em consideração meios geralmente usados para as culturas de células. De acordo com estas modalidades, o meio pode incluir, mas, sem limitação, DMEM (Meio de Eagle modificado de Dulbecco, glicose elevada, com L-glutamina, cloridrato de piridoxina, sem piruvato de sódio que contém 3,7 g de bicarbonato de sódio por litro), MEM, BSS/YE-LAH, F-10 (Ham's), F-12, M-199, RPMI, Agars, LB Broth e meios com base em PBS. Além disso, é considerado que as células podem ser cultivadas por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, as células podem ser desenvolvidas nas camadas confluentes, como suspensões, nas múltiplas camadas, nas garrafas rolantes, nas cavidades ou nos tubos.

[049] Em certas modalidades, as células hospedeiras podem ser usadas para a cultura dos vírus aqui descritos. Qualquer célula conhecida que hospede vírus aqui descritos é considerada. Algumas células hospedeiras de uso para o aumento dos vírus aqui descritos incluem, mas, sem limitação, Vera (células Vero do macaco verde de África), células de LLCMK2, células do mosquito C6/36 ou outras células conhecidas na técnica.

[050] Algumas modalidades da presente invenção relatam as composições tendo um ou mais tensoativos de alto peso molecular ou compostos de copolímero de uso nos métodos para cultura das várias culturas virais em que algumas composições aqui descritas são capazes de modular vários aspectos do crescimento viral (por exemplo, maior tamanho de placa, fase de latência reduzida) para cerca de 10 %, para cerca de 15%, para cerca de 20%, para cerca de 25%, para cerca de 30%, para cerca de 35%, para cerca de 40%, para cerca de 45%, para cerca de 50 % ou mais, em comparação com as composições que não têm uma composição de copolímero.

Kits

[051] Outras modalidades dizem respeito aos kits de uso para métodos e composições aqui descritos. As composições que incluem, mas, sem limitação, composições de copolímeros e formulações de vírus vivo podem ser fornecidas num kit. Os kits podem incluir, da mesma forma, mas, sem limitação, um recipiente adequado, composições de copolímeros, composições de vírus vivos detalhadas aqui e, opcionalmente, um ou mais agentes adicionais, tais como outros agentes antivirais, agentes antifúngicos ou agentes antibacterianos, por exemplo, para modular o crescimento da espécie indesejável.

[052] Os kits podem ainda incluir uma composição de copolímero adequadamente aliquotado de uso para as culturas virais. Além disso, as composições aqui podem ser células hospedeiras e/ou culturas virais aquosas ou parcial ou completamente desidratadas para a propagação dos vírus assim como meios parcial ou completamente desidratados ou líquidos. Os kits considerados aqui podem ser armazenados a temperaturas ambientes, geladas ou a temperaturas refrigeradas como aqui descrito, dependendo dos componentes e das formulações específicas.

[053] Os meios recipientes dos kits devem de modo geral incluir pelo menos um frasco, um tubo para teste, um frasco, uma garrafa, uma seringa ou outros meios recipientes, em que uma composição pode ser colocada, e de preferência, adequadamente aliquotada. Quando é provido um componente adicional, o kit conterá também de modo geral um ou mais recipientes adicionais em que este agente ou componente pode ser colocado. Os kits aqui incluirão da mesma forma tipicamente um meio para conter o agente, a composição e quaisquer outros recipientes reagentes em confinamento fechado para venda comercial. Esses recipientes podem incluir recipientes plásticos de injeção ou moldados por sopro em que os frascos desejados são retidos.

[054] Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar certas modalidades aqui apresentadas. Deve ser observado por aqueles especialistas na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam as técnicas descritas como funcionando bem nas práticas aqui descritas e, deste modo, podem ser consideradas para a sua prática. De qualquer modo, aquelas pessoas de competência na técnica devem, à luz da presente descrição, observar que muitas mudanças podem ser preparadas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um tipo ou resultado similar sem o afastamento do espírito e do escopo aqui.

Exemplos Exemplo 1

[055] Em um método exemplificativo, representado na Figura 1, os efeitos plurônicos no crescimento do Flavivírus foram examinados em uma linhagem celular exemplificativa, as células Vero (células Vero do macaco verde da África). As células Vero foram crescidas até a confluência, por exemplo, nos frascos T-75 cm2 , 2 dias antes da infecção com Flavivírus (como indicado) em um MOI de 0,001. A adsorção do vírus durante 180 minutos foi avaliada em 2 mL de PBS na presença ou ausência do plurônico (P123 ou F127). As amostras de controle continham adsorção viral em PBS sem copolímero. O meio de crescimento (18 mL de DMEM isento de soro) foi adicionado após a adsorção. As alíquotas foram tomadas diariamente e tituladas sobre monocamadas de células Vero. Os títulos virais foram avaliados como ilustrado na Figura 1.

[056] Em outro exemplo, ilustrado na Figura 2, foi examinado o crescimento do Flavivírus DEN-2/4 quimérico nas células Vero, sem ou com as concentrações de variação do copolímero, o Pluoronic F127. As células Vero foram crescidas até a confluência, por exemplo, nos frascos T-75 cm2 , 2 dias antes da infecção com DEN-2/4 em um MOI de 0,001. O vírus foi adsorvido durante 120 minutos em 2 mL de DMEM com ou sem F127. Inóculos virais foram enxaguados a partir da monocamada da célula com PBS seguido pela adição de 25 mL do meio de crescimento indicado que contém 5 % de FBS com ou sem F127 e cultivados durante 14 dias. As alíquotas foram tomadas diariamente e tituladas nas monocamadas das células Vero. Os títulos virais foram avaliados como ilustrado na Figura 2.

Exemplo 2

[057] Em outro método exemplificativo, foi examinado o crescimento da quimera DEN 2/4 (Dengue 2/4) nas células Vero que contêm quantidades aumentadas de F127 durante a adsorção e o crescimento (ver, por exemplo, a Figura 3). Uma monocamada confluente das células Vero cultivadas nos frascos T75 cm2 em 25 mL do meio de DMEM que contém 10% de FBS e controle ou concentrações aumentadas do F127. As concentrações exemplificativas de F127 usadas neste experimento incluem 0,063 0/0, 0,125%, 0,25%, 0,5%, % e 2,0% de F127. As células foram infectadas com DEN2/4 em MOI = 0,001. Os parâmetros incluem a adsorção durante 1,5 hora em 1 mL de DMEM/F127. As alíquotas foram tomadas dia sim, dia não e tituladas nas monocamadas das células Vero. Os títulos virais foram avaliados como ilustrado na Figura 3.

[058] Além disso, outro experimento analisou os efeitos do copolímero F127 durante a adsorção viral do Flavivírus DEN2/1 quimérico. Neste exemplo, o DEN2/1 foi adsorvido em um frasco confluente das células Vero em um MOI de 0,001 durante 90 minutos. A adsorção foi realizada em 1 mL do meio crescimento (BA-I) com ou sem 1 % de F127. Após a adsorção viral, 20 mL de DMEM que contém 2 % de FBS e nenhum F127 foi adicionado às culturas. As alíquotas foram tomadas dia sim, dia não e tituladas nas monocamadas das células Vero. Os títulos virais podem ser avaliados como ilustrado na Figura 4.

Exemplo 3

[059] Outro método exemplificativo analisou se sim ou não o tamanho da placa aumentou na presença de um copolímero exemplificativo, F127. A Figura 5 representa uma tabela exemplificativa, a Tabela 1. Este experimento demonstrou que o tamanho da placa do Flavivírus aumenta na presença de concentrações crescentes de pluronic F127 durante o crescimento. Neste ponto, a monocamada confluente das células Vero foi cultivada no frasco T75cm2 em 20 mL de DMEM, 2% de meio de FBS na presença ou ausência de F127 em que as células Vero foram infectadas com DEN2/4 em MOI = 0,001, A adsorção foi de 1,5 hora e 1 mL de DMEM na presença (0,1% ou 1,0%) ou ausência de F127. As placas (por exemplo, 8) foram visualizadas numa caixa de luz e o seu diâmetro foi avaliado. A Tabela 1 representa o resultado de um meio ANOVA das diferenças do tamanho da placa (mm) em crescimento de DENVax 2/4 na ausência de F127 ou presença das concentrações aumentadas de F127.

Materiais e Métodos:

[060] É tido em consideração que qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para qualquer composição, método e/ou usos descritos aqui. Em certas modalidades, é considerado que certos métodos devem ser mais adequados para o crescimento viral, por exemplo, materiais e métodos de uso para o crescimento flaviviral, do que outros métodos. Em outras modalidades, é considerado que certos métodos devem ser mais adequados para o crescimento da Dengue, do que adequados para outros Flavivírus. A seguir é proporcionada uma breve descrição quanto aos métodos para a cultura de uma vacina quimérica da Dengue de título elevado ou qualquer Flavivírus atenuado vivo na presença de F127. Usando o frasco T-75 cm2 , por exemplo, as células Vero foram semeadas 2 dias antes da infecção/adsorção viral a uma densidade de 5 x 106 células por frasco. Este crescimento viral pode ser "escalonado" para incluir recipientes de cultura de tecido variando de T-25 cm2 até fábricas de células de 10 camadas. O vírus é adsorvido sobre uma monocamada confluente das células Vero, 2 dias após a semeadura da célula em 1 mL de DMEM que contém F127 (0,1 %). Os recipientes para cultura são incubados durante 1,5 hora a 37°C com agitação do recipiente a cada 10 minutos. Após a adsorção viral, as monocamadas da célula foram lavadas três vezes com 10 mL de PBS. O meio de crescimento (10 ml, de DMEM pH=7,2 que contém 3,7 g/L de NaHCO3 e 0,1% de F127 com nenhum FBS) é, então, adicionado às monocamadas e incubado com ou sem aeração a 37 °C durante 4 dias. No 4° dia do crescimento viral, o meio de crescimento é substituído, como feito após a adsorção viral. Iniciando no dia 6 e até o dia 12, o meio infeccioso é completamente removido da câmara de crescimento e centrifugado para clarificação. Este crescimento viral é estabilizado e armazenado a -80°C até que o seu título possa ser examinado pelo teste da placa sobre as monocamadas das células Vero. Após as coletas diárias, o meio crescimento é substituído nos recipientes para cultura do tecido como feito no dia 4. As coletas diárias continuam até o dia 12. As coletas diárias são tituladas individualmente sobre as células Vero e as coletas de título elevado podem ser misturadas para se obter uma amostra homogênea. Muitas vezes, o primeiro dia de coleta (dia 6) não é incluído, para evitar os elevados níveis de DNA das células hospedeiras(Vero).

Tabela 1

[061] Exemplo de DMEM - F12 : Mistura do Nutriente F-12 (Ham), pó (21700) com L-glutamina. Aditivos por 10 L: 11,76 g de Bicarbonato de Sódio, 100 ml de Estreptomicina de Penicilina, Ajuste do pH para 7,2

[062] Todas as Composições e Métodos aqui descritos e reivindicados podem ser preparados e realizados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Ao mesmo tempo em que as composições e os métodos foram descritos nos termos das modalidades preferidas, é evidente para aqueles de competência na técnica que podem ser aplicadas variações nas Composições e Métodos e nas etapas ou na sequência das etapas dos métodos descritos aqui sem afastamento do conceito, espírito e escopo aqui. Mais especificamente, certos agentes que são tanto química como fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes aqui descritos, ao mesmo tempo em que os mesmos resultados ou similares seriam obtidos. Todos esses substituintes e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são julgados estarem dentro do espírito, escopo e conceito como definido pelas Reivindicações anexas.

Claims

Método para aumentar a taxa de crescimento viral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a uma cultura de células hospedeiras infectada com um vírus, de uma composição compreendendo um ou mais copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno (EO-PO), em que o um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO compreendem poloxâmero 407, poloxâmero 403 ou uma combinação dos mesmos, em que a concentração do copolímero em bloco de EO-PO é de 0,001% a 3,0% (p/v), e em que a composição aumenta a taxa de crescimento viral.
Método para aumentar a taxa de crescimento viral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um ou mais copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno (EO-PO) a uma cultura de células hospedeiras antes, durante ou após a infecção viral da cultura de células hospedeiras, em que o um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO compreendem poloxâmero 407, poloxâmero 403 ou uma combinação dos mesmos, em que a concentração do copolímero em bloco de EO-PO é de 0,001% a 3,0% (p/v).
Método para aumentar o tamanho da placa de uma cultura viral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a uma cultura de células hospedeiras infectadas com um vírus, de uma composição compreendendo um ou mais copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno (EOPO), em que os um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO compreendem poloxâmero 407, poloxâmero 403 ou uma combinação dos mesmos, em que a concentração do copolímero em bloco de EOPO é de 0,001% a 3,0% (p/v), e em que a composição aumenta o tamanho da placa viral comparado a uma cultura viral de controle sem administração de um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO.
Método para reduzir o tempo de latência do crescimento de uma cultura viral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a uma cultura de células hospedeiras infectadas com um vírus, de uma composição compreendendo um ou mais copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno (EOPO), em que os um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO compreendem poloxâmero 407, poloxâmero 403 ou uma combinação dos mesmos, em que a concentração do copolímero em bloco de EOPO é de 0,001% a 3,0% (p/v), e em que a composição reduz o tempo de latência das culturas virais em comparação com uma cultura viral de controle sem administração de um ou mais copolímeros em bloco de EO-PO.
Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as culturas virais são culturas de Flavivírus.
Método para aumentar a taxa de crescimento viral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um ou mais copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno (EO-PO) a uma cultura de célula Vero, antes, durante ou após a absorção do vírus na cultura de células Vero, em que o método compreende
- (i) semear células Vero em recipientes de cultura de tecidos que variam de frascos de T-25 cm2 a fábricas de células de 10 camadas,
- (ii) absorver vírus em uma monocamada confluente de células Vero obtidas a partir das células da etapa (i) e incubação dos recipientes de cultura a 37°C,
- (iii) lavar a monocamada celular da etapa (ii),
- (iv) incubar as células da etapa (iii) em um meio livre de soro a 37°C,
- (v) coletar o meio entre os dias 6 e 12 após a infecção (p.i.) e substituir o meio por meio fresco,
- (vi) clarificar o meio coletado,
- (vii) estabilizar os vírus clarificados e armazenar os vírus estabilizados a -80°C.
Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (i) as células Vero são semeadas em um ou mais frascos de T-75cm2 a uma densidade de 5x106 células por frasco.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que entre as etapas (iv) e (v) o meio isento de soro é removido e substituído por meio isento de soro fresco.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que nas etapas (i), (ii), (iv) e (v) o meio utilizado é o Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM).
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que em uma ou mais das etapas (i), (ii), (iv) ou (v) o meio utilizado contém 0,1% (p/v) de copolímero em bloco de EO-PO.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que em uma ou mais das etapas (i) (ii), (iv) ou (v) o meio utilizado é DMEM e contém 0,1% (p/v) de poloxâmero 407.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que nas etapas (ii), (iv) e (v) o meio utilizado é DMEM e contém 0,1% (p/v) de poloxâmero 407.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (ii) a absorção pelo vírus é realizada 2 dias após a semeadura.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (ii) as células e vírus são incubados por 90 minutos.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (iii) a lavagem é feita pelo menos três vezes com tampão fosfato salino (PBS).
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (v) o meio é removido diariamente a partir do dia 6 p.i. e até o dia 12 p.i.
Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato na etapa (vi) a clarificação é feita por centrifugação.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na etapa (vi) a clarificação é realizada por filtração.