TWI573874B - 用於誘導病毒生長之組成物、方法及用途 - Google Patents

用於誘導病毒生長之組成物、方法及用途 Download PDF

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Description

用於誘導病毒生長之組成物、方法及用途 相關申請案的交互參照
此專利申請案聲稱擁有2008年12月5日提出之美國專利臨時申請案號61/120,262標題為“用於加速病毒生長之組成物、方法及用途”的權利，藉由引述將其完整併入於此以供作為各方面的用途。
發明領域
此申請案的具體實施例一般係關於用於加速或增強病毒生長的方法、組成物及用途。在某些具體實施例中，此申請案係關於用於誘導加速病毒生長及/或增加病毒斑面積之共聚物組成物的方法、組成物及用途。在其他具體實施例中，係有關用於加速黃病毒生長、縮短黃病毒遲滯時間(lag time)及/或增加黃病毒斑面積的方法、組成物及用途。
發明背景
對抗感染性疾病的疫苗已被用於改善人類和動 物的健康。一種用於病毒疫苗的成功技術為以病毒的弱或減毒株(一種“減毒活病毒”)免疫動物或人類。由於限制接種後的複製，因此該減毒株不會導致疾病。然而，該限制病毒的複製足以表現病毒抗原的全部細胞庫及對病毒產生強而長效的免疫反應。因此，當隨後暴露於病毒的病原株時該經免疫個體可產生對抗疾病的保護作用。
目前技術的進展，例如基因重分類、反向基因和冷適應技術已導致活毒、減毒之流感和輪狀病毒的進步。許多以重組DNA科技所發展出的活病毒疫苗已被用於人體臨床試驗，包括用於西尼羅河病、登革熱、瘧疾、結核病和HIV的疫苗。這些重組病毒疫苗依賴明確定性之減毒疫苗例如腺病毒、牛痘病毒、黃熱17D或登革熱病毒、DEN-2 PDK-53的處理。總的來說，減毒活病毒疫苗為人類歷史中僅次於抗生素的最成功醫療干預法以及有希望被用於改善全球的公共衛生。
其他疫苗的發展可藉由不活化生長於細胞培養內的病毒。這些“死毒”疫苗由於存在高濃度的抗原而可誘導免疫反應。有效死毒疫苗的實施例包括，但不侷限於用於狂犬病、流感、A型肝炎和小兒麻痺病毒的疫苗。
黃病毒造成許多重大影響的人類和動物疾病。其係為一種具有約11,000個鹼基對之RNA基因組的包膜病毒。大部分的黃病毒係藉由通常為蚊子之節肢動物病媒而傳播。根據血清學其可被分成登革熱、日本腦炎和黃熱病三大類超過70種的不同黃病毒。由於城市的擴張、環球旅 行和環境的變遷(例如森林砍伐或雨帶類型)而出現數種威脅人類公共衛生的黃病毒。此類病毒包括，但不侷限於黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒，及蜱媒介腦炎病毒。
已發展出安全及可對抗黃病毒病例如黃熱病和日本腦炎的減毒活病毒疫苗及死毒疫苗。
發明概要
此申請案的具體實施例通常係關於用於誘導、強化和加速病毒生長的方法、組成物及用途。在某些具體實施例中，此申請案係關於用於誘導加速病毒生長及/或增加病毒斑面積之共聚物組成物的方法、組成物及用途。在其他具體實施例中，係有關用於加速黃病毒生長、縮短黃病毒遲滯時間及/或增加黃病毒斑面積的方法、組成物及用途。
製造疫苗的一項限制為大規模製造及病毒的體外生長以支援所需的疫苗。因此，本技術中的其一需求為增強和加速病毒的生長。本發明的某些具體實施例著重於增強和加速病毒生長的方法和組成物。這些組成物被用於例如製造病毒疫苗和用於其他技術中之病毒副產物例如病毒相關基因治療及其他病毒產品的製造。此外，此處的具體實施例可被用於死毒疫苗中增強或加速培養病毒的生長。
揭示於此處的某些組成物包括單獨的共聚物或協同其他藥物或化合物以增強和加速病毒的生長。此處其他的具體實施例著重於增強減毒活病毒之生長的賦形劑組 合。用於此處的共聚物包括，但不侷限於Pluronic® F127(泊洛沙姆407)、Pluronic® F68(泊洛沙姆188)、Pluronic® P123(泊洛沙姆403)、Pluronic® P85(泊洛沙姆235)，大於3,000~4,000分子量的其他聚氧乙烯-聚氧丙烯(EO-PO)嵌段共聚物或其組合。
根據這些具體實施例，病毒包括但不侷限於黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、絲狀病毒(Filovirus)、副黏液病毒、正黏液病毒、布尼亞病毒(Bunyavirus)、沙狀病毒(Arenavirus)、逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒(Hepadna-virus)、瘟疫病毒、小RNA病毒、杯狀病毒(Calicivirus)、里奧病毒、細小病毒(Parvovirus)、乳頭瘤病毒(Papovavirus)、腺病毒、皰疹病毒，及痘病毒。一些具體實施例係關於用於培養病毒內的組成物，其包括但不侷限於含有一或多種病毒的培養例如病毒品種或單一品種的混合物，或生長於一或多種單獨共聚物組成物或協同其他藥物內的一或多種活、減毒病毒。
在其他具體實施例中，此處所述的組成物與無所述組成物之對照培養比較可在較短或相同的生長時間內增加病毒斑面積，以用於滴定、製造或測定病毒製劑的活性。在本發明的一些態樣中，可在較短的時間內獲得較高的病毒力價。或者，此處所述的組成物與不使用此處所述組成物的對照病毒培養比較可縮短遲滯時間或高至數天的加速生長時間。
其他具體實施例係關於用於調配物及方法內能 減少或預防發生一或多種此處所述病毒導致之疾病的病毒族群。根據這些具體實施例，該疾病包括但不侷限於西尼羅河病、登革熱、日本腦炎、凱沙奴森林病(Kyasanur forest disease)、澳洲和新幾內亞的墨瑞谷(Murray valley)腦炎、昆津病毒(Kunjin virus；屬於西尼羅河病毒)、Alkhurma出血熱、聖路易腦炎、C型肝炎病毒感染、蜱媒腦炎、黃熱病、非洲的Usutu、Koutango、Yaonde病毒病，及南非的Cacipacore病毒病。在某些具體實施例中，藉由利用此處所述用於加速病毒生長、生產和製造、縮短遲滯時間及/或增加病毒族群之病毒斑面積的組成物可縮短產生疫苗調配物的製造時間。
在某些具體實施例中，組成物內被用於此處製造的培養病毒包括，但不侷限於部分或完全脫水或水合疫苗調配物或其他病毒調配物。
在某些具體實施例中，用於此處所述疫苗組成物內的減毒活病毒包括但不侷限於一或多種減毒活黃病毒疫苗，包括但不侷限於減毒黃熱病病毒(例如17D)、減毒日本腦炎病毒(例如SA14-14-2)、減毒登革熱病毒(例如DEN-2/PDK-53或DEN-4△30)、減毒嵌合西尼羅河病毒，或重組嵌合黃病毒。
其他具體實施例係關於用於生長此處所述培養病毒的套組。一套組包括於疫苗生產或其他病毒組成物用之產生活、減毒族群的部分或完全脫水培養病毒。一套組亦包括一或多種此處所揭示的生長誘導組成物。
下列附圖構成本專利說明書的一部分以及被用於進一步說明此處的某些具體實施例。藉由單獨參考一或多種的這些附圖或協同所示特定具體實施例的詳細說明可更瞭解該具體實施例。
第1圖係一範例圖形，其在細胞感染及引入控制劑或共聚物組成物之後於病毒吸附期間聚合乙烯(pluronic)Pluronic® F127(泊洛沙姆407)對病毒生長的效應。
第2圖係一範例圖形，其說明於病毒吸附及/或生長期間存在共聚物之培養病毒的生長。
第3圖係一範例圖形，其說明於病毒吸附及生長期間存在大量含共聚物組成物之培養病毒的生長。
第4圖係一範例圖形，其說明於病毒吸附期間存在或未加入特定共聚物之培養病毒的生長。
第5圖係一範例表，其說明於存在或無各種濃度共聚物之範例培養病毒的病毒斑面積變化。
定義
此處所述“a”或“an”意指一或多於一的物件。
此處所述的容器包括，但不侷限於試管；迷你或微離心管；平板；組織培養瓶；細胞工廠、槽、玻璃瓶；微滴定盤或罐。
本發明說明書中所述的“生物體”或“許多生物 體”包括，但不侷限於哺乳類如人類或哺乳動物；家畜或野生動物如犬、貓、雪貂、兔、豬、馬、牛或動物園動物。
此處所述的“約”意指加減10%的誤差。
此處所述的“高分子量表面活性劑”意指大於1500分子量的表面活性、兩性分子。
此處所述的“EO-PO嵌段共聚物”意指由聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯)之嵌段所構成的共聚物。此外，此處所述的“Pluronic®”意指EOx-Poy-EOx的EO-PO嵌段共聚物。具有此構型的EO-PO嵌段共聚物亦被稱為“Poloxamer”或“Syn-peronic”。
此處所述的“減毒病毒”意指當被投與至一例如哺乳動物之生物體(如人類動物)時僅造成較輕微或無臨床症狀之病毒相關疾病的病毒。
此處所述的“加速”意指在病毒開始生產之前相對一對照可縮短遲滯時間或增加病毒生產速率而使其在一較短時間內產生具有較高的病毒濃度或在一些具體實施例中增加病毒斑的面積。
此處所述的“死毒疫苗”意指藉由技術中所習知的任何各種物理或化學方法不活化一病毒所製備的疫苗。
較佳實施例之詳細說明
在下列的章節中，為了更詳細說明各種的具體實施例將描述各種的範例組成物和方法。熟習本領域之技術者將瞭解各種具體實施例的實作並不需要運用全部或甚至一些此處所述的細節，而是經由例行的實驗調整其濃度、 時間及其他細節。在某些實例中，習知的方法或組分並未被納入此說明。
此處所述的具體實施例係關於利用各種的組成物以於病毒的生長培養中增強生長速率或縮短遲滯時間。根據這些具體實施例，組成物包括共聚物。此申請案的具體實施例一般係關於用於誘導和加速病毒生長的方法、組成物及用途。在某些具體實施例中，此申請案一般係關於用於加速病毒生長及/或增加病毒斑面積之共聚物組成物的方法、組成物及用途。在其他具體實施例中，係關於用於加速黃病毒生長、縮短生長延滯及/或增加病毒斑面積之共聚物組成物的方法、組成物及用途。此處所述的某些共聚物組成物包括，但不侷限於Pluronic® F127(泊洛沙姆407)、Pluronic® F68(泊洛沙姆188)、Pluronic® P85(泊洛沙姆235)、Pluronic® P123(泊洛沙姆403)，大於3,000~4,000分子量的其他EO-PO嵌段共聚物或其組合。
在某些具體實施例中，該組成物包括例如聚合乙烯Pluronic® F127(泊洛沙姆407)的共聚物。Pluronic® F127(泊洛沙姆407，此處亦稱為F127)係非離子聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。Pluronic®嵌段共聚物的已知非專有名稱為泊洛沙姆(poloxamer)。其最初被開發用作為表面活性劑。這些化合物係由親水性氧化乙烯(EO)和疏水性氧化丙烯(PO)嵌段所構成。該EO-PO嵌段共聚物包括聚氧乙烯(-CH2CH2O-命名為EO)和聚氧丙烯(-CH2CHCH3O-命名為PO)的嵌段。在EOx-POy-EOx構型中該PO嵌段的兩側為EO 嵌段。由於該PO成分為親水性及該EO成分為疏水性，因此可藉由改變EOx-POy-EOx嵌段結構內的x和y以調整親水性、分子量和表面活性劑性質。按照製造商的指示(例如BASF的Lutrol® F127，泊洛沙姆407)F127於乳劑和液體乳劑內可被用作為增稠劑及共乳化劑。
F127在達到生理溫度時可經由逆向熱凝膠化作用進行從液態變成凝膠的相轉變。較高溫度促進嵌段聚合物之氧化烯烴單體的脫水而此將導致溶解度的降低。明確而言，在高濃度(例如約10%重量/體積)時，某些類型的較高分子量EO-PO嵌段共聚物將進行逆向凝膠化作用而在溫度升高時形成凝膠。此外，當這些嵌段共聚物高於臨界膠束濃度(CMC)時其將自組合成膠束。在水溶液內，該EO-PO嵌段共聚物將自組合成具有PO核及親水性EO基之冠狀物的膠束。在某些試驗中，已證明EO-PO嵌段共聚物調配物具有用於各種疏水性藥物及蛋白質、DNA或不活化疫苗的可能藥物傳遞劑。
目前仍未知這些聚合乙烯Pluronic®嵌段共聚物的活動機制。雖然於研究中Pluronic® F127(泊洛沙姆407)協同幾丁聚糖被用作為一種疫苗傳遞系統的緩釋成分。以含F127的破傷風類毒素的鼻內滴入方式接種小白鼠時可加強抗體的反應以及全身性地傳遞破傷風抗原。在某些方法中，聚合乙烯Pluronic®已顯示可誘導有助於其多樣性之細胞膜微黏度和流動性的改變。
Pluronic® F127(泊洛沙姆407)已被用於各種人類 醫藥的應用上包括牙科、內服和緩瀉藥物。疫苗調配物亦使用表面活性劑作為安定劑以避免材料損失。以某種濃度之F127(0.01%重量/體積)的DNA疫苗傳遞研究已顯示可加強藥物的傳遞，其可能藉由強化細胞的攝取及成熟樹突狀細胞的補充。在體溫時形成凝膠容許使用EO-PO嵌段共聚物凝膠在疫苗和藥物傳遞應用中被作為藥物載體。
此處揭示的某些組成物可包括單獨的共聚物或協同其他藥物或化合物。此外，此處揭示的組成物除了其他培養基添加劑之外包括一或多種加入該培養基之共聚物的培養基組成物。用於此處揭示組成物內的培養基包括用於生長此處所述病毒的任何技術中已知培養基或專用於特定病毒的培養基。此處的其他具體實施例係關於可大為增強活病毒(如減毒病毒)之生長的賦形劑組合。此處的又其他組成物及方法係關於縮短病毒生長有關的遲滯時間。一些具體實施例係關於調節病毒的病毒斑面積。用於此處的共聚物包括，但不侷限於Pluronic® F127(泊洛沙姆407)、Pluronic® F68(泊洛沙姆188)、Pluronic® P85(泊洛沙姆235)、Pluronic® P123(泊洛沙姆403)，大於3,000~4,000分子量的其他EO-PO嵌段共聚物或其組合。
可單獨使用此處所述的組成物或協同已被導入宿主培養細胞的培養病毒之前、期間及/或之後的培養基，此處揭示的組成物培養基可為液體、固體或半固態液體。在某些具體實施例中，在全部病毒生長期可加入補充組成物以監控、調整或刺激病毒生長過程。在其他具體實施例 中，可加入一或多種補充共聚物組成物以縮短遲滯時間、加速病毒生長及/或增加病毒斑面積。可單獨使用此處所述的組成物、協同其他補充物(如維性素、金屬離子和胺基酸)，或當培養基被加入該培養時作為培養基添加劑。
其他具體實施例包括用於減毒活病毒之培養病毒的庫存，該病毒包括但不侷限於小RNA病毒(如小兒麻痺病毒、口蹄疫病毒)；杯狀病毒(如SARS病毒、貓傳染性腹膜炎病毒)；披膜病毒(如辛德畢斯(sindbis)病毒、馬腦炎病毒、基孔肯雅(chikungunya)病毒、德國麻疹病毒、羅斯河(Ross River)病毒、牛腹瀉病毒、豬瘟病毒)；黃病毒(如登革熱病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、聖路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒)；冠狀病毒(人冠狀病毒(感冒)、豬胃腸炎病毒)；棒狀病毒(如狂犬病病毒、水泡性口腔炎病毒)；絲狀病毒(如馬爾堡(Marburg)病毒、伊波拉(Ebola)病毒)；副黏液病毒(如麻疹病毒、犬瘟熱病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、新城疫病毒、牛瘟病毒)；正黏液病毒(如人流感病毒、禽流感病毒、馬流感病毒)；布尼亞病毒(如漢他(Hanta)病毒、拉克羅斯(LaCrosse)病毒、里夫谷熱(Rift Valley fever)病毒)；沙狀病毒(如拉薩熱(Lassa)病毒、馬秋波(Machupo)病毒)；里奧病毒(如人里奧病毒、人輪狀病毒)；雙RNA病毒(如傳染性華氏囊炎病毒、魚胰臟壞死病毒)；逆轉錄病毒(如HIV1、HIV2、HTLV-1、HTLV-2、牛白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒)；嗜肝DNA病毒(如B型肝炎病 毒)；細小病毒(如人B型細小病毒、犬細小病毒、貓瘟熱病毒)；乳頭瘤病毒(如人乳頭瘤病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒)；腺病毒(如人腺病毒、犬腺病毒、牛腺病毒、豬腺病毒)；皰疹病毒(如單純皰疹病毒、水痘帶狀疱疹病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、人巨細胞病毒、人皰疹病毒6)；以及痘病毒(如牛痘、雞痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、傳染性軟疣病毒)。
根據這些具體實施例，某些減毒活疫苗包括但不侷限於減毒活黃病毒。一些具體實施例係關於包括但不侷限於單獨生長於一或多種共聚物組成物或協同其他藥物的一或多種減毒活病毒例如一或多種減毒活黃病毒之組成物。根據這些具體實施例，黃病毒包括但不侷限於登革熱病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、聖路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒或其他已知黃病毒。
在其他具體實施例中，此處所述的組成物與無所述生長組成物之對照比較可在較短或相同的生長時間內增加病毒斑面積，以用於測定病毒活性或滴定病毒製劑。或者，此處所述的組成物與不使用此處所述組成物的對照培養病毒比較可縮短遲滯時間或高至數天的加速生長時間。在某些具體實施例中，其預定病毒力價可較早於生長於技術中已知的其他培養基或添加無共聚物之供培養輔助組成物或病毒製劑數小時、半天、1天、2天、3天、4天或甚至高至10天的時間。一些具體實施例的最適病毒力價可為約1x106蝕斑/毫升至約1x108蝕斑/毫升。在某些具體實施例 中，含F127培養基內的黃病毒力價在約4天內可達到約1x107蝕斑/毫升的濃度，與無F127培養基內生長比較則約需6天的時間。
此處一些具體實施例係關於調節培養病毒達到預定濃度之生長時間的組成物及方法。根據這些具體實施例，生長時間可縮短約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%及更短。在各種具體實施例中，與技術中已知的其他組成物比較此處所述組成物可在約80%、或約70%、或約60%的時間內達到預定的培養病毒密度。
在某些具體實施例中，組成物內被用於此處製造的培養病毒包括，但不侷限於部分或完全脫水或水合疫苗調配物。在其他具體實施例中，此處所述用於製造疫苗調配物的培養病毒可以較短的時間和較低的成本被培養。此外，可以較少的勞力、時間和成本製造這些疫苗調配物，例如當發生黃病毒相關疾病之流行或爆發以及在短時間內需要疫苗調配物時。
在一些具體實施例中，用於此處所述疫苗組成物內的減毒活病毒包括但不侷限於一或多種減毒活黃病毒疫苗，包括但不侷限於減毒黃熱病病毒(例如17D)、減毒日本腦炎病毒(例如SA14-14-2)、減毒登革熱病毒(例如DEN-2/PDK-53或DEN-4△30)、減毒嵌合西尼羅河病毒，或重組嵌合黃病毒。在某些具體實施例中，該用於疫苗組成物內的培養黃病毒可被生長於含有一或多種此處揭示之共聚物的培養基組成物內。
其他具體實施例係關於用於調配物及方法內能減少或預防發生一或多種此處所述黃病毒導致之疾病的病毒族群。根據這些具體實施例，該疾病包括但不侷限於西尼羅河病感染、登革熱、日本腦炎、凱沙奴森林病、墨瑞谷腦炎、Alkhurma出血熱、聖路易腦炎、蜱媒腦炎、黃熱病及C型肝炎病毒感染。因此，利用此處所述用於加速生長、縮短遲滯時間及/或增加用於揭示調配物之病毒族群所形成之病毒斑面積的組成物可縮短產生這些調配物的製造時間。
其他具體實施例係關於用於治療用途的病毒組成物。此類用途包括，但不侷限於基因療法。基因療法中用於傳遞基因至細胞的病毒包括慢病毒(lentiviruses)、腺病毒、腺病毒相關病毒和皰疹病毒。病毒組成物的其他用途包括，但不侷限於癌病毒治療(如“致癌”病毒)或癌症免疫療法。
此處可使用任何用於生長培養細胞(如宿主細胞)的培養基。例如，可使用一般用於細胞培養的培養基。根據這些具體實施例，培養基包括但不侷限於DMEM(高葡萄糖Dulbecco’s改良伊格爾培養基，含L-麩醯胺酸、鹽酸吡哆素，每升中含3.7克碳酸氫鈉的無丙酮酸鈉)；MEM；BSS/YE-LAH；F-10(Ham’s培養基)；F-12；M-199；RPMI；瓊脂；LB肉汁；以及PBS基礎培養基。此外，可藉由技術中已知的任何方法進行培養。例如，細胞可為在多層內、在滾桶瓶內、在培養孔或試管內被生長於鋪滿層(confluent layer)的懸浮液。
在某些具體實施例中，宿主細胞可被用於培養此處揭示的病毒。可使用為此處揭示宿主-病毒所習知的任何細胞。用於生長此處揭示病毒的一些宿主細胞包括，但不侷限於Vero(非洲綠猴腎細胞)、LLC-MK2細胞、C6/36斑蚊細胞或技術中已知的其他細胞。
本發明的一些具體實施例報告含有一或多種高分子量表面活性劑或共聚物化合物之用於各種培養病毒的組成物與不含有共聚物組成物的組成物比較其揭示於此處的一些組成物能調節病毒生長的態樣(例如較大的病毒斑面積、縮短遲滯期)至約10%、至約15%、至約20%、至約25%、至約30%、至約35%、至約40%、至約45%、至約50%或更高。
進一步具體實施例係關於用於此處所述方法及組成物的套組。組成物包括，但不侷限於提供於套組內的共聚物組成物及活病毒調配物。套組亦包括，但不侷限於此處所述的一適當容器、共聚物組成物、活病毒組成物以及選擇性地含有一或多種添加劑例如其他抗病毒劑、抗真菌劑或抗菌劑以控制有害品種的生長。
該套組進一步包括用於培養病毒的適當等量共聚物組成物。此外，此處組成物可為部分或完全脫水或含水培養病毒及/或用於傳遞病毒的宿主細胞以及液態或部分或完全脫水的培養基。此處所述套組視特定調配物和成分可被儲存於此處所揭示的室溫、冷凍或於冷藏溫度。
套組的容器通常包括被置入較佳為等分之組成 物的至少一個玻璃瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射筒或其他容器。當提供附加成分時，該套組亦通常含有被置入該附加物質或成分的一或多個附加容器。此處套組通常亦包括容納該物質、組成物及任何其他試劑容器於密封狀態以供販售的方法。此類容器包括可容納所需玻璃瓶的注射或吹塑塑膠容器。
下列實施例被用於說明此處的某些具體實施例。熟習本領域之技術者應瞭解揭示於實施例內的技術係代表下列具有良好運作功能的經揭示技術，而因此可被用於其實務。然而，依據本發明之熟習本領域的技術者應瞭解該經揭示特定具體實施例在製出許多變化之下仍可獲得類似或相同的結果而不偏離此處的精神及範圍。
實施例 實施例1
示於第1圖的一範例方法中，在一範例細胞株Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)內測定聚合乙烯Pluronic® P123或F127(分別為泊洛沙姆403或泊洛沙姆407)在黃病毒生長上的影響。在以0.001感染倍率(MOI)感染黃病毒(如所示)之前於T-75平方釐米燒瓶內將Vero細胞生長2天至鋪滿為止。於有或無聚合乙烯Pluronic®(P123或F127(分別為泊洛沙姆403或泊洛沙姆407))的2毫升PBS內測定180分鐘的病毒吸附作用。對照樣本為無共聚物之PBS內的病毒吸附作用。在吸附之後加入生長培養基(18毫升無血清DMEM)。每 天採取等分樣本及在Vero單層細胞上進行滴定。測定如示於第1圖的病毒力價。
在示於第2圖的另一實施例中，以無或含各種濃度之Pluronic® F127共聚物測定Vero細胞內嵌合黃病毒DEN-2/4的生長。在以0.001感染倍率感染DEN-2/4之前於T-75平方釐米燒瓶內將Vero細胞生長2天至鋪滿為止。於有或無F127的2毫升DMEM內將病毒吸附120分鐘。以PBS從該細胞單層洗滌細胞接種物接著加入25毫升有或無F127之含5% FBS的所示生長培養基，然後生長14天。每天採取等分樣本及在Vero單層細胞上進行滴定。測定如示於第2圖的病毒力價。
實施例2
在另一範例方法中，於吸附中含增量F127的Vero細胞內生長嵌合DEN2/4(登革病毒2/4)以及測定其生長(請看例如第3圖)。鋪滿單層Vero細胞生長於含10% FBS和對照或較高濃度F127之25毫升DMEM培養基的T-75平方釐米燒瓶內。用於此實驗的範例F127濃度包括0.063%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%和2.0%的F127。在MOI=0.001以DEN2/4感染該細胞。參數包括於1毫升DMEM/F127內1.5小時的吸附。每隔一天採取等分樣本，以及在Vero單層細胞上滴定。測定如示於第3圖的病毒力價。
此外，另一實驗分析該共聚物F127在嵌合黃病毒DEN 2/1之病毒吸附期間的效應。在此實施例中，DEN2/1以0.001的MOI於Vero細胞的鋪滿燒瓶上被吸附90分鐘。於 有或無1% F127的1毫升生長培養基(BA-1)內進行吸附作用。病毒吸附之後，將含2% FBS和無F127的20毫升DMEM加至該培養內。每隔一天採取等分樣本，以及在Vero單層細胞上滴定。測定如示於第4圖的病毒力價。
實施例3
另一範例方法分析於存在範例共聚物F127之下是否增加病毒斑的面積。第5圖代表一範例表，表1。此實驗證明生長期間增加聚合乙烯Pluronic® F127(泊洛沙姆407)的濃度可增加黃病毒之病毒斑的面積。此處，鋪滿單層Vero細胞被生長於有或無F127之20毫升DMEM 2% FBS培養基的T-75平方釐米燒瓶內，而在MOI=0.001以DEN2/4感染該Vero細胞。在有(0.1%或1.0%)或無F127的1毫升DMEM內進行1.5小時的吸附作用。在燈箱上可看到病毒斑(例如8)，及測量其直徑。表1代表生長於無F127或有高濃度F127之DENVax 2/4內病毒斑面積(毫米)差異之單因子變異數分析(ANOVA)的結果。
材料與方法
技術中已知的任何方法可被用於此處所述的任何組成物、方法及/或用途。在某些具體實施例中，某些方法例如用於黃病毒生長的材料與方法將比其他方法更適合病毒的生長。在其他具體實施例中，某些方法將比用於其他黃病毒更適合用於生長登革熱病毒。於下文中簡單說明於存在F127之下生長高力價嵌合登革熱疫苗或任何減毒活 病毒的方法。病毒以每瓶5x106個細胞的密度感染/吸附之前兩天利用例如T-75平方釐米燒瓶接種Vero細胞。此病毒生長可被“擴充”至包括範圍從T-25平方釐米至10-堆疊細胞工廠的組織培養瓶。在細胞接種於含F127(0.1%)之1毫升DMEM內之後兩天病毒被吸附於鋪滿Vero單層細胞上。在37℃於每隔10分鐘振盪一次培養瓶之下將其培養1.5小時。於病毒吸附之後，以10毫升PBS將該單層細胞洗滌三次。然後將生長培養基(10毫升DMEM pH=7.2，含3.7克/升NaHCO3及無FBS的0.1% F127)加至該單層細胞，以及在有或無充氣的37℃之下培養4天。於病毒生長的第4天，如病毒吸附後的方法更換該生長培養基。從第6天至第12天從生長箱完全移除該感染培養基及離心使其澄清。病毒生長將趨穩定化，及在Vero單層細胞上進行病毒斑試驗以測定力價之前將其儲存於-80℃。於每天收獲之後，如於第4天的方法在組織培養瓶上更換該生長培養基。繼續進行每天的收獲直至第12天為止。每天的收獲物於Vero細胞上個別測定其力價，及匯集高力價收獲物以獲得均質的樣本。通常捨棄第一天(第6天)的收獲物以避免高濃度的宿主細胞(Vero)DNA。
依據本揭示可在無不當實驗之下作出及實施全部此處揭示和宣稱的組成物及方法。雖然已利用較佳具體實施例描述該組成物及方法，但是對熟習本領域之技術者而言顯然瞭解此處所述的組成物和方法以及其方法的步驟 或步驟的順序可有不同的變化而不偏離此處的概念、精神和範圍。更明確而言，此處所述的物質可被化學和生理上相關的某些物質所取代而仍可達到相同或類似的結果。熟習本領域之技術者清礎瞭解全部該類似的取代物和修飾物仍被視為屬於申請專利範圍附件所定義的精神、範圍和概念內。

Claims (28)

  1. 一種用於製造包膜RNA或DNA病毒之方法，該方法包含：生長宿主細胞；在病毒感染該宿主細胞之前、期間或之後於該宿主細胞引入包含用於生長病毒培養物之培養基的一組成物，其包含一或多種氧化乙烯-氧化丙烯(EO-PO)嵌段共聚物；該一或多種EO-PO嵌段共聚物包含泊洛沙姆407(poloxamer 407)、泊洛沙姆403或其等之組合，其中該一或多種EO-PO嵌段共聚物之濃度係自0.001%至3.0%；在引入該組成物之前、期間或之後於該宿主細胞引入病毒；將該宿主細胞、該病毒及該培養基培養達一預定期間；使該培養基與該宿主細胞分開；以及自該培養基收獲病毒。
  2. 如請求項1之方法，其中使該培養基與該宿主細胞分開係進一步包含將該培養基更換為新鮮培養基以供進一步之病毒擴張。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含，與無該一或多種EO-PO嵌段共聚物之培養物中的病毒族群生長相較，加速病毒生長及/或增加培養物之病毒斑面積。
  4. 如請求項1之方法，其中於該宿主細胞引入病毒之後，含有病毒之生長培養基係每天移除並更換以供使感染培養基澄清並測定力價。
  5. 如請求項1之方法，其中該一或多種EO-PO嵌段共聚物中之至少一者包含泊洛沙姆407。
  6. 如請求項1之方法，其中該用於生長之培養基包含Dulbecco’s改良伊格爾培養基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
  7. 如請求項1之方法，其中該病毒包含減毒活病毒以供用於疫苗。
  8. 如請求項1之方法，其中該病毒係選自於由下列所組成的組群：黃病毒、披膜病毒(Togavirus)、冠狀病毒、絲狀病毒(Filovirus)、副黏液病毒、正黏液病毒、布尼亞病毒(Bunyavirus)、沙狀病毒(Arenavirus)、逆轉錄病毒、嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)、瘟疫病毒、皰疹病毒、及痘病毒。
  9. 如請求項1之方法，其中該病毒係黃病毒之病毒。
  10. 如請求項1之方法，其中該病毒係痘病毒之病毒。
  11. 如請求項1之方法，其中病毒培養物於收穫時具有力價在約1x106蝕斑/毫升(pfu/mi)至約1x109蝕斑/毫升之間。
  12. 如請求項1之方法，其進一步包含使該宿主細胞生長於鋪滿層(confluent layer)。
  13. 如請求項1之方法，其中該宿主細胞包含Vero細胞(非洲綠猴Vero細胞)、LLC-MK2細胞、或C6/36斑蚊細胞。
  14. 如請求項1之方法，其中該一或多種EO-PO嵌段共聚物之濃度係自0.063%至3.0%。
  15. 一種用於製造黃病毒及/或登革熱病毒之方法，該方法包含：生長宿主細胞至接近鋪滿；在病毒感染該宿主細胞之前、期間或之後於該宿主細胞引入包含用於生長病毒培養物之培養基與一或多種氧化乙烯-氧化丙烯(EO-PO)嵌段共聚物的一組成物；該一或多種EO-PO嵌段共聚物包含泊洛沙姆407(poloxamer 407)、泊洛沙姆403或其等之組合，其中該一或多種EO-PO嵌段共聚物之濃度係自0.001%至3.0%；在引入該組成物之前、期間或之後於該宿主細胞引入該黃病毒及/或登革熱病毒；將該宿主細胞、該黃病毒及/或登革熱病毒及該生長培養基培養達約1小時及約5小時；使該培養基與該宿主細胞分開；以及自該培養基收獲黃病毒及/或登革熱病毒。
  16. 如請求項15之方法，其中於該宿主細胞引入病毒之後，含有黃病毒及/或登革熱病毒之生長培養基係每天移除並更換以供使感染培養基澄清並測定力價。
  17. 如請求項15之方法，其中該宿主細胞包含Vero細胞(非洲綠猴Vero細胞)、LLC-MK2細胞、或C6/36斑蚊細胞。
  18. 如請求項15之方法，其中該黃病毒包含登革熱病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、黃熱病病毒、日本腦炎病 毒、聖路易腦炎病毒、或蜱媒腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus)。
  19. 如請求項15之方法，其中該黃病毒及/或登革熱病毒包含減毒活病毒。
  20. 如請求項19之方法，其中該減毒活病毒係嵌合體。
  21. 如請求項15之方法，其中該生長培養基包含Dulbecco’s改良伊格爾培養基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
  22. 如請求項15之方法，其中使該培養基與該宿主細胞分開係進一步包含將該培養基更換為新鮮培養基以供進一步之病毒擴張。
  23. 一種用於生長黃病毒及/或登革熱病毒之組成物，其包含：一黃病毒培養物；一或多種氧化乙烯-氧化丙烯(EO-PO)嵌段共聚物，該EO-PO嵌段共聚物包含泊洛沙姆407(poloxamer 407)、泊洛沙姆403或其等之組合，其中該EO-PO嵌段共聚物之濃度係自0.063%至3.0%；一宿主細胞培養物；以及生長培養基，其中該EO-PO嵌段共聚物加速黃病毒在該宿主細胞培養物中的擴張。
  24. 如請求項23之組成物，其中黃病毒及/或登革熱病毒培養物包含減毒活黃病毒。
  25. 如請求項23之組成物，其中黃病毒及/或登革熱病毒培養物包含嵌合病毒。
  26. 如請求項23之組成物，其中該黃病毒培養物包含西尼羅河病毒(West Nile viruses)、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、聖路易腦炎病毒、或蜱媒腦炎病毒(tick-borne encephalitis viruses)。
  27. 如請求項23之組成物，其中該宿主細胞培養物包含Vero細胞(非洲綠猴Vero細胞)、LLC-MK2細胞、或C6/36斑蚊細胞。
  28. 如請求項23之組成物，其中該生長培養基包含Dulbecco’s改良伊格爾培養基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
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