CN102272294B - 用于诱导病毒生长的组合物、方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本文的实施方式报道用于诱导和/或加速病毒生长的方法、组合物和用途。在某些实施方式中，方法、组合物和用途总体上涉及用于诱导病毒生长、减少滞后时间和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物组合物。在其他实施方式中，共聚物组合物的方法、组合物和用途能用于诱导黄病毒生长，减少生长滞后和/或增加噬菌斑大小。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2008年12月5日提交的美国临时专利申请号61/120,262的权益，为一切目的，该临时申请以其全部被并入本文。
发明领域
本申请的实施方式总体上报道用于加速或增加的病毒生长的方法、组合物和用途。在某些实施方式中，本申请报道用于诱导病毒加速生长和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。在其他实施方式中，报道了能加速黄病毒生长，减少黄病毒滞后时间和/或增加黄病毒噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。
发明背景
抵御传染性疾病的疫苗已用于增进人和动物健康。一种用于病毒疫苗的成功技术是用该病毒的减弱或减毒的毒株(“活减毒病毒”)免疫动物或人。由于免疫后有限的复制，该减毒的毒株不引起疾病。然而，该有限的病毒复制足以表达病毒抗原的所有组成成分，并产生对该病毒潜在和持久的免疫应答。因此，在随后暴露于该病毒的致病毒株时，免疫的个体受到保护不得病。
最近的技术进步，例如重配，反向遗传学和寒冷适应，已引起了用于流感病毒和轮状病毒的活减毒病毒的发展。许多用重组DNA技术制备的活病毒疫苗正处于人类临床试验中，包括用于西尼罗河病(West Nile disease)、登革热、疟疾、肺结核和HIV的疫苗。这些重组病毒疫苗依赖于对充分鉴定的减毒病毒疫苗，例如腺病毒、痘苗病毒、黄热病17D或登革热病毒、DEN-2 PDK-53的操作。整体而言，活减毒病毒疫苗是人类历史上最成功的医学干预之一，仅次于抗生素的出现，具有增进全世界公共健康的前景。
其他疫苗已通过在细胞培养中生长之后灭活病毒而开发。由于高浓度抗原的存在，这些“灭活病毒”疫苗诱导免疫应答。有效的灭活病毒疫苗的实例包括但不限于狂犬病疫苗、流感疫苗、甲型肝炎疫苗和脊髓灰质炎疫苗。
黄病毒引起多种具有显著影响的人和动物疾病。它们是有包膜的病毒，具有大约11000个碱基的RNA基因组。大多数黄病毒是通过节肢动物媒介传播的，通常是蚊子。存在超过70种不同的黄病毒，基于血清学将其分成三个主要类型：登革热型、日本脑炎型和黄热型。日益扩张的城市化、全球旅行和环境的改变(例如砍伐森林或雨带分布)已导致了几种威胁人类公共健康的黄病毒的出现。这样的病毒包括但不限于黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒和蜱媒脑炎病毒。
已制备了活减毒疫苗和灭活病毒疫苗，其是安全的并能抵御黄病毒疾病，例如黄热病和日本脑炎。
发明概述
本发明的实施方式总体上涉及用于诱导、增加和加速病毒生长的方法、组合物和用途。在某些实施方式中，本申请报道了用于诱导加速病毒生长和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。在其他实施方式中，报道了用于加速黄病毒生长、减少黄病毒滞后时间和/或增加黄病毒噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。
生产疫苗的一个限制因素是大规模制造和体外培养病毒，以满足对疫苗的需求。因此，本领域存在的需求之一是增加和加速病毒生长。本发明的某些实施方式涉及增加和加速病毒生长的方法和组合物。这些组合物对，例如，生产在其他技术，例如制造病毒相关的基因治疗和其他病毒产品中使用的病毒疫苗和病毒副产品是有用的。此外，本文的实施方式对增加或加速在灭活病毒疫苗中使用的病毒培养物的生长可以是有用的。
本文公开的某些组合物可以包括单独的共聚物或共聚物与其他用于增加和加速病毒生长的药剂或化合物的组合。本文的其他实施方式涉及增加活减毒病毒生长的赋形剂的组合。本文所用的共聚物包括但不限于聚氧丙烯(Pluronic)F127(泊洛沙姆407)、聚氧丙烯F68(泊洛沙姆188)、聚氧丙烯P123(泊洛沙姆403)、聚氧丙烯P85(泊洛沙姆235)、其他分子量大于3000至4000的聚环氧乙烷-聚环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物或其组合。
根据这些实施方式，病毒可以包括但不限于黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、弹状病毒、线状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、鼠疫病毒、小RNA病毒、萼状病毒、呼肠病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。一些涉及病毒培养中使用的组合物的实施方式可以包括但不限于具有一种或多种病毒的培养物，例如多种病毒的混合物或单种病毒，或一种或多种活减毒病毒，这些病毒在单独的一种或多种共聚物组合物中生长，或与其他药剂组合中生长。
在其他实施方式中，与不含公开的组合物的对照培养物相比，本文涉及的组合物可以在减少的或相似的生长时期内增加在滴定(tittering)、制造或测量病毒制剂的活性中使用的噬菌斑大小。在本发明的一些方面，可以在减少的时期里得到较高的病毒滴度。可选地，与没有使用本文涉及的组合物的对照病毒培养物相比，本文涉及的组合物可以减少滞后时间或者加速生长时间直到几天。
其他实施方式涉及用于制剂的病毒群体和涉及能减少或预防由本文涉及的一种或多种病毒引起的医学状况开始的疫苗制剂的方法。根据这些实施方式，医学状况可以包括但不限于包括西尼罗河热、登革热、日本脑炎、库阿撒鲁尔森林病、澳大利亚和新几内亚墨莱溪谷脑炎、库宁病毒(Kunjin virus)(西尼罗河病毒的近支)、Alkhurma出血热、圣路易斯脑炎、丙型肝炎病毒感染、蜱媒脑炎、黄热、非洲的尤苏图病毒、科坦戈病毒和Yaonde病毒(Usutu，Koutango，Yaonde viruses)、以及南非的Cacipacore病毒的状况和感染。在某些实施方式中，产生疫苗制剂的生产时间可以通过使用本文考虑的用于加速病毒生长生产和制备、减少滞后时间和/或增大病毒群体的噬菌斑大小的组合物而被缩短。
在某些实施方式中，本文考虑的用于生产的病毒培养物可用于组合物，该组合物包括但不限于部分或完全脱水的或水合的疫苗制剂或其他病毒制剂。
在某些实施方式中，用于本文考虑的疫苗组合物中的活减毒病毒可以包括但不限于一种或多种活减毒黄病毒疫苗，该减毒黄病毒疫苗包括但不限于减毒黄热病毒(例如17D)、减毒日本脑炎病毒(例如SA 14-14-2)、减毒登革热病毒(例如DEN-2/PDK-53或DEN-4Δ30)、减毒嵌合型西尼罗河疫苗或重组嵌合黄病毒。
其他实施方式涉及用于培养本文考虑的病毒培养物的试剂盒。考虑试剂盒可以包括部分或完全脱水的病毒培养物，该培养物在产生用于疫苗生产或其他病毒组合物用途的活减毒病毒群体中使用。还考虑试剂盒可以包括一种或多种本文公开的生长诱导组合物。
附图简述
以下附图形成本说明的一部分，它们被包含以进一步说明本文的某些实施方式。通过单独参考一幅或多幅附图或与给出的特定实施方式的详细描述结合，可以更好地理解这些实施方式。
图1表示在细胞感染和在病毒吸附过程中引入对照药剂或共聚物组合物后，聚氧丙烯聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)对病毒生长的效果的示例性曲线图。
图2表示说明病毒吸附和/或生长过程中存在共聚物时病毒培养物生长的示例性曲线图。
图3表示说明在病毒吸附和生长过程中存在增加量的含共聚物的组合物时病毒培养物生长的示例性曲线图。
图4表示说明在病毒吸附过程中存在或不存在特定的共聚物时病毒培养物生长的示例性曲线图。
图5表示说明存在或不存在多种浓度的共聚物时示例性病毒培养物的噬菌斑大小变化的示例性表格。
定义
如本文所用，“一(a)”或“一(an)”可以指一个或多于一个的物品。
如本文所用，容器可以包括但不限于试管、小型或微量离心管、平板、组织培养瓶、细胞工厂、通道、小瓶、微量滴定板或容器。
如本说明书所用，“对象(subject)”或“多个对象(subjects)”可以包括但不限于哺乳动物，例如人或者驯化的或野生的哺乳动物，例如狗、猫、雪貂、兔、猪、马、牛或动物园动物。
如本文所用，“约”可以指正负10％。
如本文所用，“高分子量表面活性剂”可以指具有表面活性的两性分子，其分子量大于1500。
如本文所用，“EO-PO嵌段共聚物”可以指由聚环氧乙烷和聚环氧丙烷嵌段组成的共聚物。此外，如本文所用，“聚氧丙烯”可以指以EOx-POy-EOx形式的EO-PO 嵌段共聚物。EO-PO嵌段共聚物的这种结构也称为“泊洛沙姆”或“Synperonic”。
如本文所用，“减毒病毒”可以指当给予对象例如哺乳动物(例如人或动物)时，显示出减少的或没有病毒相关疾病的临床征象的病毒。
如本文所用，“加速”可以指在病毒生产开始前减少滞后时间或增加病毒生产速率，以至于在较短的时间里产生较高浓度的病毒，或者在一些实施方式中相对于对照，噬菌斑大小增加。
如本文所用，“灭活病毒疫苗”可以指通过本领域已知的许多种物理或化学方法中的任意方法灭活病毒而制备的疫苗。
发明详述
在以下部分，为详述多种实施方式，描述了多种示例性组合物和方法。对本领域技术人员显而易见的是，实施上述多种实施方式不需要使用本文列出的全部或甚至一些细节，而浓度，时间和其他细节可以通过日常实验修改。在一些情况下，熟知的方法或组分没有包括在本说明书中。
本文的实施方式涉及使用多种组合物以增加培养物中病毒生长的生长速率或减少滞后时间。根据这些实施方式，组合物可以包括共聚物药剂。本申请的实施方式总体上涉及用于诱导和加速病毒生长的方法、组合物和用途。在某些实施方式中，本申请总体上涉及用于加速病毒生长和/或增加噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。在其他实施方式中，涉及用于加速黄病毒生长、减少生长停滞和/或增加噬菌斑大小的共聚物组合物的方法、组合物和用途。本文考虑的某些共聚物组合物包括但不限于聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)、聚氧丙烯F68(泊洛沙姆188)、聚氧丙烯P85(泊洛沙姆235)、聚氧丙烯P123(泊洛沙姆403)、其他分子量大于3000至4000的EO-PO嵌段共聚物或其组合。
共聚物
在某些实施方式中，组合物可以包括共聚物，例如，聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)。聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407，本文也称为F127)是一种非离子聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。聚氧丙烯嵌段共聚物以其非专有名称泊洛沙姆为人所知。它们最初被开发用作表面活性剂。这些化合物由亲水性环氧乙烷(EO)和疏水性环氧丙烷(PO)嵌段组成。该EO-PO嵌段共聚物可以包括聚环氧乙烷(-CH2CH2O-表示的EO)和聚环氧丙烷(-CH2CHCH3O-表示的PO)嵌段。两个EO嵌段可以位于该PO嵌段两侧，以EOx-POy-EOx排列。由于PO组分是亲水的而EO嵌段 是疏水的，所以总亲水性、分子量和表面活性剂性质可通过改变EOx-POy-EOx嵌段结构中的x和y来调整。根据制造商(例如BASF、泊洛沙姆407)，F127可以在乳剂和液体乳胶中用作增稠剂和共乳化剂。
F127进行一种称为逆向热凝胶作用的过程，因为它在达到生理温度之后进行从液体向胶体的相变。较高的温度促进该嵌段聚合物的环氧烷单元的脱水，这可以导致溶解度降低。具体地，在高浓度下(例如约10％w/v)，某些类型的较高分子量的EO-PO嵌段共聚物会进行逆向凝胶化，当温度增加时形成胶体。此外，当这些嵌段共聚物位于临界胶束浓度(CMC)之上时，它们自组装成胶束。在水溶液中，该EO-PO嵌段共聚物会自组装成具有PO核心和亲水性EO基团冠的胶束。在某些研究中，EO-PO嵌段共聚物制剂已被研究作为潜在的用于多种疏水性药物和用于蛋白质、DNA或灭活疫苗的药物递送剂。
目前还不清楚这些聚氧丙烯聚氧丙烯嵌段共聚物活性的机制。然而，聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)已被研究作为结合壳聚糖的疫苗递送系统的缓释组分。用含有F127的破伤风类毒素接种小鼠，增加了对鼻内递送和全身递送的破伤风抗原的抗体应答。在某些方法中，聚氧丙烯聚氧丙烯已显示诱导细胞膜微粘度和流动性的改变，这些改变可以有助于其多能性。
聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)已在包括牙齿、口和缓泻药物的多种人类制药应用中使用。疫苗制剂也已使用表面活性剂作为稳定剂以防止物质损失。用某些浓度的F127(0.01％w/v)递送DNA疫苗的研究已显示增加的药物递送，可能是通过增加细胞摄取和招募成熟的树突细胞。在体温时的凝胶形成允许使用该EO-PO嵌段共聚物凝胶作为疫苗和药物递送应用中的药物贮存库。
本文公开的某些组合物可以包括单独的共聚物或共聚物与其他药剂或化合物的组合。此外，本文公开的组合物可以包括培养基组合物，除了其他的培养基添加物外，该培养基组合物具有一种或多种被加入到培养基中的共聚物药剂(或多个)。用于本文公开的组合物的培养基可以包括本领域已知的已知培养本文考虑的病毒生物的任意培养基，或者对特定病毒生物特异的培养基。本文的其他实施方式涉及极大地增加活病毒(例如减毒病毒)生长的赋形剂的组合。而本文的其他组合物和方法涉及减少与病毒生物生长有关的滞后时间。一些实施方式涉及调整病毒生物的噬菌斑大小。本文所用的共聚物包括但不限于聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)、聚氧丙烯F68(泊洛沙姆188)、聚氧丙烯P85(泊洛沙姆235)、聚氧丙烯P123(泊洛沙姆403)、其他分子量大于3000至4000的EO-PO嵌段共聚物或其组合。
本文考虑的组合物可以在病毒培养物被引入宿主培养物之前、期间或之后单独使用或者与培养基结合使用。本文所公开的组合物的细胞培养基可以是液体、固体或半固体液体。在某些实施方式中，补充组合物可以在整个病毒生长期间加入，以监测、调节或促进病毒生长过程。在其他实施方式中，可以加入一种或多种补充共聚物组合物，以减少滞后时间，加速病毒生长和/或增加病毒噬菌斑大小。本文考虑的组合物可以单独使用，与其他补充物(例如维生素、金属离子和氨基酸)组合使用，或当将培养基加入到培养物时作为培养基补充物。
其他实施方式包括用于培养病毒培养物例如活减毒病毒的原液，这些活减毒病毒包括但不限于小RNA病毒(例如脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒)、萼状病毒(例如SARS病毒、猫传染性腹膜炎病毒)、披膜病毒(例如辛德比斯病毒、马脑炎病毒、基孔肯亚病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、牛腹泻病毒、猪霍乱病毒)、黄病毒(例如登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒)、冠状病毒(例如人冠状病毒(普通感冒)、猪肠胃炎病毒)、弹状病毒(例如狂犬病病毒、水疱性口炎病毒)、线状病毒(例如马尔堡病毒、埃博拉病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒、犬瘟热病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、新城疫病毒、牛瘟病毒)、正粘病毒(例如人流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒)、布尼亚病毒(例如汉坦病毒、拉克罗斯病毒(LaCrosse virus)、山谷热病毒)、沙粒病毒(例如拉沙病毒、马丘坡病毒)、呼肠病毒(例如人呼肠病毒、人轮状病毒)、双RNA病毒(例如传染性粘液囊病病毒(infectious bursal virus)、鱼胰腺坏死病毒)、逆转录病毒(例如HIV1、HIV2、HTLV-1、HTLV-2、牛白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、猫肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、细小病毒(人细小病毒B、犬细小病毒、猫白细胞减少症病毒)、乳多空病毒(例如人乳头瘤病毒、SV40、牛乳头瘤病毒)、腺病毒(例如人腺病毒、犬腺病毒、牛腺病毒、猪腺病毒)、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6)、和痘病毒(例如牛痘、禽痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、猴痘病毒、牛痘病毒、传染性软疣病毒(musculum contagiosum virus))。
根据这些实施方式，某些活减毒病毒包括但不限于活减毒黄病毒。一些涉及组合物的实施方式可以包括但不限于一种或多种活减毒病毒，例如一种或多种活减毒黄病毒，这些病毒在一种或多种共聚物组合物中单独培养或与其他药剂组合培养。根据这些实施方式，黄病毒可以包括但不限于登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒或其他已知的黄病毒。
在其他实施方式中，与没有在本文公开的组合物中培养的对照相比，本文考 虑的组合物可以在减少的或相似的生长时期内增加噬菌斑大小，用于评估病毒活性或滴定病毒制备物。可选地，本文考虑的组合物可以减少滞后时间或加速生长时间，多达比没有使用本文考虑的组合物的对照病毒培养物早数日。在某些实施方式中，预先确定的病毒滴度能比在本领域已知的其他培养基或提供给不含共聚物的培养物的补充组合物中培养的病毒制备物早数小时、半天、1天、2天、3天、4天或甚至多达10天出现。一些实施方式的最优病毒滴度可以是约1×106pfu/ml至约1×108pfu/ml。在一些实施方式中，在含F127的培养基中培养约4天，黄病毒的滴度可以达到约1×107pfu/ml的浓度，与之相比，在不含F127的培养基中培养的黄病毒需要约6天。
本文的一些实施方式涉及用于调整病毒培养物生长以达到预定浓度的时间的组合物和方法。根据这些实施方式，生长时间可以减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％或更多。在多种实施方式中，与本领域已知的其他组合物相比，使用本文公开的组合物，可以在约80％、或约70％、或约60的时间内达到预定的病毒培养物密度。
在某些实施方式中，本文考虑的用于生产的病毒培养物可在组合物中使用，该组合物包括但不限于部分或完全脱水的或水合的疫苗制剂。在其他实施方式中，本文考虑的用于生产疫苗制剂的病毒培养物可以用减少的时间和成本培养。另外，生产这些疫苗制剂可以减少劳动量、时间和成本，例如，当发生黄病毒相关疾病流行或爆发，在短时间内需要疫苗制剂时。
在一些实施方式中，本文考虑的用于疫苗组合物的活减毒病毒可以包括但不限于一种或多种活减毒黄病毒疫苗，该活减毒黄病毒疫苗包括但不限于减毒黄热病毒(例如17D)、减毒日本脑炎病毒(例如SA 14-14-2)、减毒登革热病毒(例如DEN-2/PDK-53或DEN-4Δ30)、减毒嵌合西尼罗河病毒或重组嵌合黄病毒。在某些实施方式中，用于疫苗组合物的黄病毒培养物可以在含有一种或多种本文公开的共聚物的培养基组合物中培养。
其他实施方式涉及用于制剂的病毒群体和涉及能减少或预防由一种或多种本文考虑的黄病毒引起的医学状况发生的疫苗制剂的方法。根据这些实施方式，医学状况可以包括但不限于西尼罗河病毒感染、登革热、日本脑炎、库阿撒鲁尔森林病、墨莱溪谷脑炎、Alkhurma出血热、圣路易斯脑炎、蜱媒脑炎、黄热病和丙型肝炎病毒感染。因此，使用本文考虑的用于增加生长、减少滞后时间和/或增加公开的制剂中使用的病毒群体的噬菌斑大小的组合物，可以缩短产生这些制剂的生产时间。
其他实施方式涉及用于治疗应用的病毒组合物。这样的用途可以包括但不限于基因治疗应用。在基因治疗应用中使用的将基因递送到细胞的病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒。病毒组合物的其他用途可以包括但不限于癌症病毒治疗(例如“溶瘤”病毒)或癌症免疫治疗。
本文考虑用于培养细胞培养物(例如宿主细胞)的任意培养基可以用于本文。例如，常用的用于细胞培养物的培养基被考虑。根据这些实施方式，培养基可以包括但不限于DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，高葡萄糖，含有L谷氨酰胺，含有盐酸吡哆醇，不含丙酮酸钠，含有3.7g/升的碳酸氢钠)、MEM、BBS/YE-LAH、F-10(Ham’s)、F-12、M-199、RPMI、Agars、LB Broth和基于PBS的培养基。另外，考虑细胞可以用本领域已知的任意方法培养。例如，细胞可以以汇合层培养，作为悬浮液，在滚瓶中、在孔中或在管中以多层培养。
在某些实施方式中，宿主细胞可以用于培养本文公开的病毒。考虑对本文公开的宿主病毒已知的任何细胞。一些用于培养本文公开的病毒的宿主细胞包括但不限于Vero(非洲绿猴Vero细胞)、LLC-MK2细胞、C6/36蚊细胞或本领域已知的其他细胞。
本发明的一些实施方式报道了含有一种或多种高分子量表面活性剂或共聚物化合物的组合物，该组合物用于培养多种病毒培养物的方法，其中与不含共聚物组合物的组合物相比，本文公开的一些组合物能调整病毒生长的多个方面(例如，较大的噬菌斑大小、减少的停滞期)达约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％或更多。
试剂盒
另外的实施方式涉及用于本文所述方法和组合物的试剂盒。试剂盒中可提供包括但不限于共聚物组合物的组合物和活病毒制剂。试剂盒还包括但不限于适当的容器、共聚物组合物、本文详述的活病毒组合物以及任选地，一种或多种另外的药剂例如其他抗病毒药剂、抗真菌药剂或抗菌剂，例如以调节非期望的物种的生长。
该试剂盒还可包含用于病毒培养物的适当分装的共聚物组合物。此外，本文的组合物可以是部分或全部脱水的或者水性的病毒培养物和/或用于增殖该病毒的宿主细胞以及液体或部分或全部脱水的培养基。本文考虑的试剂盒可以在室温、冷冻或冷藏温度下储存，如本文所公开地取决于具体的制剂和组分。
该试剂盒的容器装置将通常包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，组合物可以放入该容器中，并优选地，适当地分装。当提供额外的组分时，该试剂盒还会通常包含一个或多个额外的容器，该药剂或组分可以放于其中。本文的试剂盒还将典型地包含将药剂、组合物和任意其他试剂容器密封包装，以供商业销售的方法。这样的容器可以包括注射或者吹塑成型的塑料容器，期望的管形瓶保留在其中。
包括了以下实施例以说明本文所述的某些实施方式。本领域技术人员应当理解，接下来的这些实施例中公开的技术代表了在本文公开的实践中发现的运转良好的技术，因而可以考虑用于其实践。然而，本领域技术人员应当，根据本公开内容，理解可以对公开的具体实施方式进行许多改变，仍然获得同样或相似的结果，而不背离本文的精神和范围。
实施例
实施例1
在一个示例性方法中，如图1所示，在一个示例性细胞系——Vero细胞(非洲绿猴Vero细胞)中测试了聚氧丙烯聚氧丙烯P123或F127(分别为泊洛沙姆403或407)对黄病毒生长的效果。将Vero细胞培养到汇合，例如在T-75cm2烧瓶中培养2天，然后用黄病毒(如指明的)以0.001的MOI感染。在存在或不存在聚氧丙烯聚氧丙烯(P123或F127(分别为泊洛沙姆403或407))时在2mL PBS中评价180分钟的病毒吸附。对照样品包含没有共聚物的PBS中的病毒吸附。在吸附后加入生长培养基(18mL无血清DMEM)。每天取等分试样，并在单层Vero细胞上进行滴定。测量的病毒滴度如图1所示。
在另一个实施例中，如图2所示，测定了不存在或存在不断变化浓度的共聚物——聚氧丙烯F127时，嵌合黄病毒DEN2/4在Vero细胞中的生长。将Vero细胞培养到汇合，例如在T-75cm2烧瓶中培养2天，然后用DEN2/4以0.001的MOI感染。将病毒在2mL含有或不含F127的DMEM中吸附120分。用PBS将病毒接种物从细胞单层上冲洗掉，然后加入25mL指定的生长培养基，该培养基含有5％PBS，含有或不含F127，培养14天。每天取等分试样，并在Vero细胞单层上测滴度。测量的病毒滴度如图2所示。
实施例2
在另一个示例性方法中，检测了在吸附和生长期间含有不断增加量的F127的Vero细胞中的DEN2/4(登革热2/4)嵌合病毒的生长(参见例如图3)。在T75cm2 烧瓶中，在25mL含10％PBS和对照或不断增加浓度的F127的DMEM培养基中培养Vero细胞的汇合单层。在该实验中使用的示例性F127浓度包括0.063％、0.125％、0.25％、0.5％、1.0％和2.0％F127。用DEN2/4在MOI＝0.001时感染细胞。参数包括在1mL DMEM/F127中吸附1.5小时。每两天取等分试样，并在Vero细胞单层上进行滴定。测量的病毒滴度如图3中所示。
此外，另一个实验分析了嵌合黄病毒DEN2/1的病毒吸附期间共聚物F127的效果。在该实施例中，DEN2/1以0.001的MOI吸附到Vero细胞的汇合烧瓶上90分钟。吸附是在1mL含有或不含1％F127的生长培养基(BA-1)中进行的。在病毒吸附后，向培养物中加入20mL含2％FBS，不含F127的DMEM。每两天取等分试样，并在Vero细胞单层上进行滴定。测定的病毒滴度如图4中所示。
实施例3
另一个示例性方法分析了示例性共聚物F127存在时噬菌斑大小是否增加。图5表示一个示例性表格——表1。该实验证明生长期间存在不断增加浓度的聚氧丙烯聚氧丙烯F127(泊洛沙姆407)时，黄病毒噬菌斑大小增加。在此，在T75cm2烧瓶中，在20mL含有或不含F127的DMEM2％FBS培养基中培养Vero细胞的汇合单层，其中将Vero细胞用DEN2/4在MOI＝0.001时感染。吸附1.5小时，是在1mL存在(0.1％或1.0％)或不存在F127的DMEM中进行的。将噬菌斑(例如8)在光盒上可视化，并测量其直径。表1显示了在不存在F127或存在不断增加浓度的F127时，DENVax2/4生长噬菌斑大小(mm)差异的单因素方差分析(one way ANOVA)的结果。
材料与方法：
考虑本领域已知的任意方法可用于本文描述的任意组合物、方法和/或用途。在某些实施方式中，考虑某些方法会比其他方法更适于病毒生长，例如用于黄病毒生长的材料和方法。在其他实施方式中，考虑某些方法对登革热病毒的生长将比对其他黄病毒更合适。下文提供关于在存在F127时培养高滴度嵌合登革热疫苗或任意活减毒黄病毒的方法的简要说明。例如，使用T-75cm2烧瓶，在病毒感染/吸附2天之前以每个烧瓶5×10^6个细胞的密度接种Vero细胞。该病毒生长可以“按比例增加”以包括从T-25cm2到10套细胞工厂的组织培养容器。在细胞接种2天后，将病毒在1mL含F127(0.1％)的DMEM中吸附到Vero细胞的汇合单层上。将该培养容器在37℃温育1.5小时，每10分钟摇动容器。在病毒吸附后，用10mLPBS冲洗细胞单层3次。然后将生长培养基(10mL DMEM，pH＝7.2，含有3.7g/LNaHCO3和0.1％F127，不含FBS)加入到该单层，并在通风或不通风的条件下在37℃温育4天。在病毒生长的第4天，如病毒吸附后所做的，更换生长培养基。 从第6天开始，直到第12天，将感染培养基从培养室中完全移除，并离心澄清。将该病毒培养物稳定并储存在-80℃，直到其滴度能通过在Vero细胞单层上的噬菌斑分析而测定。在每天的收获后，如第4天所做的，更换组织培养容器上的生长培养基。每天的收获持续到第12天。每天的收获物分别在Vero细胞上滴定，可以将高滴度的收获物混合以获得均匀样品。通常，不包括第一天的收获物(第6天)，以避免高水平的宿主细胞(Vero)DNA。
表1.DMEM-F12的例子：F-12营养混合物(Ham)、含有L-谷氨酰胺的粉末(21700)。每10L的添加物：11.76g碳酸氢钠、100ml青霉素链霉素，调整将pH调到7.2
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本文公开和要求保护的全部组合物和方法可以根据本公开内容制备和实施，不需要过多的实验。虽然该组合物和方法以优选的实施方式描述，但是对本领域技术人员明显的是在不背离本文的构思、精神和范围的条件下，可以对组合物和方法，以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序实施改变。更具体地，某些化学上和生理学上相关的药剂可代替本文所述的药剂，而将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的所有这样相似的替换和修改都被视为在如所附权利要求所限定的精神、范围和构思内。
Claims (24)
1.用于培养病毒培养物的组合物，其包括：
一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物，所述EO-PO嵌段共聚物包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆403或其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至3.0％；
病毒培养物；
宿主细胞；以及
用于培养所述病毒培养物的培养基，
其中所述EO-PO嵌段共聚物加速病毒培养物的生长。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述病毒培养物选自黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、弹状病毒、线状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、鼠疫病毒、小RNA病毒、萼状病毒、呼肠病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述病毒培养物是黄病毒培养物。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述病毒培养物是痘病毒培养物。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的至少一种包括泊洛沙姆407，所述培养基包括Dulbecco's ModifiedEagle Medium(DMEM)。
6.增加病毒生长速度的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包含一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的组合物，所述EO-PO嵌段共聚物包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆403或其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至3.0％，其中所述组合物增加所述培养物中的病毒生长速度。
7.增加病毒生长速度的方法，包括在病毒感染宿主细胞培养物之前、期间或之后给予所述宿主细胞培养物包含一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的组合物和增加所述宿主细胞培养物中的病毒生长速度，所述EO-PO嵌段共聚物包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆403或其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至3.0％。
8.增加病毒培养物噬菌斑大小的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包含一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的组合物，所述EO-PO嵌段共聚物包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆403或其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至3.0％，其中与没有给予一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的对照病毒培养物相比，所述组合物增加病毒噬菌斑大小。
9.减少病毒培养物生长滞后时间的方法，包括给予用病毒感染的宿主细胞培养物包含一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的组合物，所述EO-PO嵌段共聚物包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆403或其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至3.0％，其中与没有给予一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的对照病毒培养物相比，所述组合物减少所述病毒培养物的滞后时间。
10.权利要求9所述的方法，其中所述病毒培养物选自黄病毒培养物。
11.权利要求9所述的方法，其中所述病毒培养物包含用于产生活减毒疫苗的病毒培养物。
12.权利要求9所述的方法，其中所述滞后时间的减少包含与没有给予一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物的病毒培养物相比，至少10％的滞后时间减少。
13.用于培养病毒的试剂盒，包括：
至少一个容器；和
权利要求1所述组合物。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述病毒培养物是一种或多种黄病毒。
15.权利要求13所述的试剂盒，还包含宿主细胞储备培养物，所述宿主细胞储备培养物包含Vero细胞、LLC-MK2细胞或C6/36蚊细胞。
16.权利要求13所述的试剂盒，其中所述EO-PO嵌段共聚物浓度为0.063％至2％。
17.权利要求1所述的组合物，其中所述病毒包括黄病毒，并且所述宿主细胞培养物包含Vero细胞、LLC-MK2细胞或C6/36蚊细胞。
18.权利要求1所述的组合物，其中所述EO-PO嵌段共聚物浓度为0.063％至2％。
19.用于培养病毒培养物的组合物，其包括：
泊洛沙姆403，其浓度范围为0.063％至3.0％；
病毒培养物；
贴壁的宿主细胞；以及
用于培养所述病毒培养物的培养基，
其中EO-PO嵌段共聚物诱导病毒培养物的生长。
20.权利要求19所述的组合物，进一步包括泊洛沙姆407。
21.权利要求19所述的组合物，其中所述泊洛沙姆403的浓度为0.063％至2％。
22.权利要求19所述的组合物，其中所述病毒培养物的滴度为1×106pfu/mL至1×109pfu/mL。
23.用于培养病毒培养物的组合物，主要由以下组成：
一种或多种环氧乙烷环氧丙烷(EO-PO)嵌段共聚物，所述EO-PO嵌段共聚物选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆403、及其组合，其中所述EO-PO嵌段共聚物的浓度为0.063％至2％；
病毒培养物；
宿主细胞；以及
用于培养所述病毒培养物的培养基，
其中所述EO-PO嵌段共聚物加速病毒培养物的生长。
24.权利要求17所述的组合物，其中所述Vero细胞是非洲绿猴Vero细胞。
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