JP5728742B2 - ウイルス増殖を誘導するための組成物、方法およびキット - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本願は、２００８年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２０，２６２号の利益を主張し、この仮特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。

（分野）
本願の実施形態は、一般に、促進されたもしくは増強されたウイルス増殖のための方法、組成物および使用を報告する。特定の実施形態において、本願は、促進されたウイルス増殖を誘導し、そして／またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告する。他の実施形態において、コポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告し、これらは、フラビウイルス増殖を促進し、フラビウイルス遅延時間を減少させ、そして／またはフラビウイルスプラークサイズを増大させるためのものである。

（背景）
感染性疾患から防御するためのワクチンは、ヒトおよび動物の健康を改善するために使用されてきた。ウイルスワクチンについてのある成功裏の技術は、上記ウイルスの弱らせたもしくは弱毒化株（「生の弱毒化ウイルス」）で動物もしくはヒトを免疫することである。免疫後の制限された複製に起因して、上記弱毒化株は、疾患を引き起こさない。しかし、上記制限されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するには十分であり、上記ウイルスに対する強力かつ長期間の免疫応答を生成する。従って、その後に、上記ウイルスの病原性株に曝された際に、上記免疫された個体は、疾患から防御される。

最近の技術的進歩（例えば、再集合、逆遺伝学および低温適応）は、インフルエンザウイルスおよびロタウイルスについての生の弱毒化ウイルスの進歩をもたらしてきた。組換えＤＮＡ技術とともに発展してきた多くの生ウイルスワクチンは、ヒト臨床試験中であり、これらとしては、西ナイル病（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、デング熱、マラリア、結核およびＨＩＶのワクチンが挙げられる。これら組換えウイルスワクチンは、十分に特徴付けられた弱毒化ウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病１７Ｄもしくはデングウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３）の操作に依拠する。グループとして、生の弱毒化ウイルスワクチンは、中でも、抗生物質の出現に次いで、ヒトの歴史の中で最も成功した医療介入であり、世界中の公衆衛生を改善する見込みがある。

他のワクチンは、細胞培養物中での増殖後に、ウイルスを不活性化することによって開発されてきた。これら「不活化ウイルス」ワクチンは、存在する高濃度の抗原の存在に起因して、免疫応答を誘導する。有効な不活化ウイルスワクチンの例としては、狂犬病、インフルエンザ、Ａ型肝炎、およびポリオウイルスに対するワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。

フラビウイルスは、多大な衝撃を与える多くのヒトおよび動物の疾患を引き起こす。それらは、約１１，０００塩基のＲＮＡゲノムを有するエンベロープに包まれたウイルスである。上記フラビウイルスのうちの大部分は、節足動物媒介（一般には、蚊）によって伝染する。７０種を超える異なるフラビウイルスが存在し、これらは、血清学に基づいて、３つの大きなカテゴリーに分類される：デンググループ、日本脳炎グループ、および黄熱病グループ。都市化が拡がるにつれて、世界中の旅行および環境変化（例えば、森林破壊もしくは降雨パターン）が、ヒトの公衆衛生に対する脅威として、数種のフラビウイルスの出現をもたらした。このようなウイルスとしては、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

生の弱毒化ウイルスワクチンおよび不活化ウイルスワクチンの両方が開発されており、これらは、安全であり、フラビウイルス疾患（例えば、黄熱病および日本脳炎）を防御する。

（要旨）
本願の実施形態は、一般に、ウイルス増殖を誘導し、増強し、そして促進するための方法、組成物および使用に関する。特定の実施形態において、本願は、促進したウイルス増殖を誘導し、そして／またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告する。他の実施形態において、コポリマー組成物の方法、組成物および使用が報告され、これらは、フラビウイルス増殖を促進し、フラビウイルス遅延時間を減少させ、そして／またはフラビウイルスプラークサイズを増大させるためのものである。

ワクチンを生成するための１つの制限は、ワクチンの需要を支えるための上記ウイルスの大規模製造およびインビトロ増殖であった。従って、当該分野に存在する必要性のうちの１つは、ウイルス増殖を増強し、促進するためである。本発明の特定の実施形態は、ウイルス増殖を増強し促進するための方法および組成物に関する。これら組成物は、例えば、他の技術（例えば、ウイルス関連遺伝子治療剤および他のウイルス生成物の製造）において有用な、ウイルスワクチンおよびウイルス副生成物の生成において有用である。さらに、本明細書中の実施形態は、不活化ウイルスワクチンにおいて有用なウイルス培養物の増殖を増強もしくは促進するために有用であり得る。

本明細書で開示される特定の組成物は、コポリマーを単独で、もしくはウイルス増殖を増強し促進するための他の薬剤もしくは化合物と組み合わせて、含み得る。本明細書中の他の実施形態は、生の弱毒化ウイルスの増殖を増強する賦形剤の組み合わせに関する。本明細書中で有用なコポリマーとしては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、もしくはこれらの組み合わせが挙げられる。

これら実施形態によれば、ウイルスとしては、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態（ウイルス培養物において有用な組成物に関する）としては、１種以上のウイルス（例えば、ウイルス種の混合物もしくは単一種、または１種以上のコポリマー組成物中、単独で、もしくは他の薬剤と組み合わせて増殖させられた１種を超える生の弱毒化ウイルス）を有する培養物が挙げられ得るが、これらに限定されない。

他の実施形態において、本明細書中で企図される組成物は、ウイルス調製物力価測定し、製造し、その活性を測定することにおいて使用するために、上記開示される組成物なしのコントロール培養物と比較して、減少したかもしくは同様の増殖期間において、プラークサイズを増大させ得る。本発明のいくつかの局面において、より高いウイルス力価が、減少した期間で得られ得る。あるいは、本明細書中で企図された組成物は、本明細書中で企図された組成物を使用しないコントロールウイルス培養物と比較して、遅延時間を減少させ得るか、または最大数日まで増殖時間を促進し得る。

他の実施形態は、本明細書中で企図されるウイルスのうちの１種以上によって引き起こされる医学的状態の開始を軽減もしくは予防し得るワクチン処方物に関する処方物および方法において使用するためのウイルス集団に関する。これら実施形態によれば、医学的状態は、以下の状態および／もしくは感染が挙げられ得るが、これらに限定されない：西ナイル、デング熱、日本脳炎、キャサヌール森林病、オーストラリアおよびニューギニアのマリーバレー脳炎、クンジンウイルス（西ナイルの近縁）、Ａｌｋｈｕｒｍａ出血熱、セントルイス脳炎、Ｃ型肝炎ウイルス感染、ダニ媒介性脳炎、黄熱、アフリカのＵｓｕｔｕウイルス、Ｋｏｕｔａｎｇｏウイルス、Ｙａｏｎｄｅウイルス、ならびに南米のＣａｃｉｐａｃｏｒｅが挙げられる。特定の実施形態において、ワクチン処方物を生成するための生産時間は、ウイルス増殖生成および製造を促進し、遅延時間を減少させ、そして／またはウイルス集団のプラークサイズを増大させるための本明細書中で企図された組成物を使用することによって、減少させられ得る。

特定の実施形態において、本明細書中で生成について企図されるウイルス培養物は、組成物中で使用され得、これらとしては、部分的にもしくは完全に脱水されたもしくは水和されたワクチン処方物または他のウイルス処方物が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、本明細書中で企図されるワクチン組成物における使用のための生の弱毒化ウイルスは、１種以上の、生の弱毒化フラビウイルスワクチン（弱毒化黄熱ウイルス（例えば、１７Ｄ）、弱毒化日本脳炎ウイルス（例えば、ＳＡ １４−１４−２）、弱毒化デングウイルス（例えば、ＤＥＮ−２／ＰＤＫ−５３もしくはＤＥＮ−４Δ３０）、弱毒化キメラ西ナイルワクチン、または組換えキメラフラビウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

他の実施形態は、本明細書中で企図されるウイルス培養物を増殖させるためのキットに関する。キットは、ワクチン生成もしくは他のウイルス組成物用途のために、生の弱毒化ウイルス集団を生成することにおいて有用な、部分的にもしくは完全に脱水されたウイルス培養物を含み得ることが企図される。キットは、本明細書で開示される１種以上の増殖誘導組成物を含み得ることも、企図される。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書中の特定の実施形態をさらに示すために含められる。上記実施形態は、これら図面のうちの１つ以上を単独で、もしくは示される特定の実施形態の詳細な説明と合わせて参照することによって、よりよく理解され得る。
図１は、細胞感染後のウイルス増殖、およびウイルス吸着の間の制御因子もしくはコポリマー組成物の導入に対するプルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）の効果を表す。 図２は、ウイルス吸着および／もしくは増殖の間のコポリマーの存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。 図３は、ウイルス吸着および増殖の間のコポリマー含有組成物の漸増量の存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。 図４は、ウイルス吸着の間に添加された特定のコポリマーの存在下もしくは非存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。 図５は、種々の濃度のコポリマーの存在下もしくは非存在下で、例示的ウイルス培養物のプラークサイズ（ｐｌａｇｕｅ ｓｉｚｅ）の変化を示す例示的表を表す。

（定義）
本明細書で使用される場合、「１つの、ある（ａ）」もしくは「１つの、ある（ａｎ）」は、ある項目の１つもしくは１つより多くを意味し得る。

本明細書で使用される場合、容器（ｖｅｓｓｅｌ）は、試験管、ミニ遠心分離チューブもしくはマイクロ遠心分離チューブ、プレート、組織培養フラスコ、細胞工場（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）、チャネル、バイアル、マイクロタイタープレートもしくは容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「被験体」とは、哺乳動物（例えば、ヒトもしくは哺乳動物、飼い慣らされたもしくは野生の、例えば、イヌ、ネコ、ケナガイタチ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、もしくは動物園の動物）を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「約」とは、±１０％を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「高分子量界面活性剤」とは、１５００の分子量より大きい表面活性の両親媒性分子を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー」とは、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレン）オキシドのブロックからなるコポリマーを意味し得る。さらに、本明細書で使用される場合、「プルロニック（登録商標）」とは、ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘのＥＯ−ＰＯブロックコポリマーを意味し得る。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーのこの構成はまた、「ポロキサマー」もしくは「シンペロニック」といわれる。

本明細書で使用される場合、「弱毒化ウイルス」とは、被験体（例えば、哺乳動物（例えば、ヒトもしくは動物））に投与される場合に、ウイルス関連疾患の臨床徴候が軽減もしくは存在しないことを示すウイルスを意味し得る。

本明細書で使用される場合、「促進する」とは、ウイルス生成が始まる前に遅延時間を減少させるか、またはより高いウイルス濃度がより短期間で生成されるか、もしくはプラークサイズがコントロールと比較していくつかの実施形態で増大しているように、ウイルス増殖速度を増大させることを意味し得る。

本明細書で使用される場合、「不活化ウイルスワクチン」とは、当該分野で公知の多くの物理的手段もしくは化学的手段のうちのいずれかによって、ウイルスを不活性化することによって調製されるワクチンを意味し得る。

（説明）
以下の節において、種々の例示的組成物および方法が、種々の実施形態を詳述するために記載される。上記種々の実施形態の実施が、本明細書中で概説される詳細のうちの全てもしくはさらにはいくつかの使用を必要としないが、むしろ濃度、時間および他の詳細は、慣用的な実験を介して改変され得ることは、当業者にとって明らかである。いくつかの場合において、周知の方法もしくは成分は、説明に含まれなかった。

本明細書中の実施形態は、培養におけるウイルス増殖の増殖速度を増強するか、もしくはその遅延時間を減少させるたえに、種々の組成物を使用することに関する。これら実施形態によれば、組成物は、コポリマー因子を含み得る。本願の実施形態は、一般に、ウイルス増殖を誘導し、促進するための方法、組成物および使用に関する。特定の実施形態において、本願は、一般に、ウイルス増殖を促進し、そして／またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用に関する。他の実施形態において、フラビウイルス増殖を促進し、増殖における遅延を減少させ、そして／またはプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用に関する。本明細書中で企図された特定のコポリマー組成物としては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８）、プルロニック（登録商標）Ｐ８５（ポロキサマー２３５）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、３，０００〜４，０００ ＭＷより大きい他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、もしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

（コポリマー）
特定の実施形態において、組成物は、コポリマー（例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７））を含み得る。プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７、本明細書中ではＦ１２７ともいわれる）は、非イオン性ポリエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーである。プルロニック（登録商標）ブロックコポリマーは、ポロキサマーとしてそれらの非商標名の下で公知である。それらは、界面活性剤として使用するために最初は開発された。これら化合物は、親水性エチレンオキシド（ＥＯ）および疎水性プロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックからなる。上記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＥＯと称される−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）およびポリプロピレンオキシド（ＰＯと称される−ＣＨ_２ＣＨＣＨ_３Ｏ−）のブロックを含み得る。上記ＰＯブロックは、ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘ配置において２つのＥＯブロックが隣接し得る。上記ＰＯ成分は、親水性であり、上記ＥＯ成分は、疎水性であるので、全体的な親水性、分子量および界面活性剤特性は、上記ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘブロック構造におけるｘおよびｙを変化させることによって、調節され得る。製造業者（例えば、ＢＡＳＦ，Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７、ポロキサマー４０７）に依れば、Ｆ１２７は、クリームおよび液体エマルジョンにおいて、濃化剤および共乳化剤（ｃｏ−ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）として使用され得る。

Ｆ１２７は、逆熱ゲル化（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｈｅｒｍｏｇｅｌａｔｉｏｎ）として公知のプロセスを受ける。なぜなら、それは、生理学的温度に達した際に、液体からゲルへの相転移を受けるからである。温度が高くなるほど、上記ブロックポリマーのアルキレンオキシドユニットの脱水は促進し、このことは、低下した溶解度を生じ得る。具体的には、高濃度（例えば、約１０％ ｗ／ｖ）で、より高い分子量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーの特定のタイプは、逆ゲル化を受け、温度が上昇するにつれてゲルを形成する。さらに、これらブロックコポリマーが臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い状態にある場合、それらは、ミセルへと自己集合する。水溶液中では、上記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ＰＯコアおよび親水性ＥＯ基の最外層（ｃｏｒｏｎａ）を有するミセルへと自己集合する。特定の研究において、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー処方物は、種々の疎水性薬物に対して、およびタンパク質、ＤＮＡもしくは不活性化ワクチンに対して潜在的な薬物送達因子として調査されてきた。

これらプルロニック（登録商標）ブロックコポリマーの活性化の機構は、現在未知である。しかし、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）は、キトサンと組み合わせて、ワクチン送達系の徐放性成分として研究されてきた。Ｆ１２７を含む破傷風トキソイドによるマウスのワクチン接種は、鼻内に送達した破傷風抗原および全身に送達した破傷風抗原において抗体応答を増大させた。特定の方法において、プルロニック（登録商標）は、細胞膜の微小粘性、およびその融通性に寄与し得る流動性の変化を誘導することが示された。

プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）は、種々のヒト薬学的適用（歯科医薬、口腔医薬および緩下医薬が挙げられる）において使用されてきた。ワクチン処方物はまた、材料損失を防ぐために、安定化剤として界面活性剤を使用してきた。特定の濃度のＦ１２７（０．０１％ ｗ／ｖ）を用いたＤＮＡワクチン送達の研究は、おそらく、成熟樹状細胞の細胞取り込みおよび漸増を強化することによって、増大した薬物送達を示した。体温でのゲル処方物は、上記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーゲルの使用が、ワクチンおよび薬物送達適用において薬物デポーとして作用することを可能にする。

本明細書で開示される特定の組成物は、コポリマーを、単独で、もしくは他の薬剤もしくは化合物と合わせて含み得る。さらに、本明細書で開示される組成物は、１種以上のコポリマー因子が、他の培地補充物に加えて上記培地に添加された培地組成物を含み得る。本明細書で開示される組成物において有用な培地は、本明細書で企図されるウイルス生物を増殖させることが公知の、当該分野で公知の任意の培地、または特定のウイルス生物に対して特異的な培地を含み得る。本明細書中の他の実施形態は、生のウイルス（例えば、弱毒化ウイルス）の増殖を大いに増強する賦形剤の組み合わせに関する。本明細書中のなお他の組成物および方法は、ウイルス生物の増殖に関する遅延時間を減少することに関する。いくつかの実施形態は、ウイルス生物のプラークサイズ（ｐｌａｇｕｅ ｓｉｚｅ）を調節することに関する。本明細書中で有用なコポリマーとしては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８）、プルロニック（登録商標）Ｐ８５（ポロキサマー２３５）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、３，０００〜４，０００ ＭＷより大きい他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーもしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で企図された組成物は、ウイルス培養物が、液体、固体もしくは半固体液体であり得る、本明細書で開示される組成物の宿主細胞培養培地に導入される前、その間、および／もしくはその後に、単独で、もしくは培地と組み合わせて、使用され得る。特定の実施形態において、補充組成物は、ウイルス増殖プロセスをモニターするか、調節するかもしくは刺激するために、ウイルス増殖期全体の間に添加され得る。他の実施形態において、１種以上の補助コポリマー組成物は、遅延時間を減少させ、ウイルス増殖を促進し、そして／またはウイルスプラークサイズを増大させるために、添加され得る。本明細書中で企図された組成物は、単独で、他の補充物（例えば、ビタミン、金属イオンおよびアミノ酸）と組み合わせて、または培地が上記培養物に添加される場合に培地補充物として、使用され得る。

他の実施形態は、ウイルス培養物（例えば、生の弱毒化ウイルス）を培養するためのストックを含む。上記ウイルス培養物としては、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス）、カリチウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス）、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス、ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、風疹ウイルス、ロスリバー・ウイルス、ウシ下痢ウイルス、豚コレラウイルス）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ヒトコロナウイルス（風邪）、ブタ胃腸炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス）、フィロウイルス（例えば、マールブルグ・ウイルス、エボラウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザ・ウイルス、ＲＳウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛疫ウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザ・ウイルス）、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス、ラクロッセウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサ・ウイルス、マチュポウイルス）、レオウイルス（例えば、ヒトレオウイルス、ヒトロタウイルス）、ビルナウイルス（例えば、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｖｉｒｕｓ）、魚類膵臓壊死ウイルス（ｆｉｓｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ））、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ウシ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス Ｂ、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス）、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス）、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ウシアデノウイルス、ブタアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、サルポックスウイルス、牛痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

これら実施形態によれば、特定の生の弱毒化ウイルスとしては、生の弱毒化フラビウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。組成物に関するいくつかの実施形態としては、１種以上の生の弱毒化ウイルス（例えば、単独で、もしくは他の薬剤と組み合わせて、１種以上のコポリマー組成物中で増殖させた１種以上の生の弱毒化フラビウイルス）が挙げられ得るが、これらに限定されない。これら実施形態によれば、フラビウイルスとしては、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、もしくは他の公知のフラビウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。

他の実施形態において、本明細書中で企図された組成物は、本明細書で開示される組成物で増殖させなかったコントロールと比較して、ウイルス活性を評価するかもしくはウイルス調製物を力価測定するのに使用するために、減少したもしくは類似の増殖期間中にプラークサイズを増大させ得る。あるいは、本明細書中で企図された組成物は、遅延時間を減少させ得るか、最大数日まで、本明細書中で企図された組成物を使用しないコントロールウイルス培養物より速く、増殖時間を促進し得る。特定の実施形態において、所定のウイルス力価は、当該分野で公知の他の培地もしくはコポリマーを有さない培養物へと与えられた補充組成物中で増殖させたウイルス調製物より、数時間、半日、１日、２日、３日、４日もしくはさらに最大１０日間速く生じ得る。いくつかの実施形態の最適のウイルス力価は、約１ｘ１０^６ｐｆｕ／ｍＬ〜約１ｘ１０^８ｐｆｕ／ｍＬであり得る。特定の実施形態において、フラビウイルス力価は、Ｆ１２７なしの培地中で増殖させた培養物（これは、約６日間かかる）と比較して、Ｆ１２７を含む培地中、約４日間で約１ｘ１０^７ｐｆｕ／ｍＬの濃度に達し得る。

本明細書中のいくつかの実施形態は、所定の濃度に達するように、ウイルス培養物の増殖のための時間を調節するための組成物および方法に関する。これら実施形態によれば、増殖時間は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％以上、減少し得る。種々の実施形態において、所定のウイルス培養物密度は、当該分野で公知の他の組成物と比較して、本明細書で開示される組成物を使用すると、約８０％、もしくは約７０％、もしくは約６０％の時間で達成され得る。

特定の実施形態において、本明細書で生成が企図されるウイルス培養物は、部分的にもしくは完全に脱水されたもしくは水和されたワクチン処方物が挙げられるが、これに限定されない組成物中で使用され得る。他の実施形態において、ワクチン処方物の生成のために本明細書中で企図されるウイルス培養物は、減少した時間およびコストで培養され得る。さらに、これらワクチン処方物の生成は、労働力、時間およびコストが、例えば、フラビウイルス関連の疾患の流行もしくは大発生が起こり、ワクチン処方物が短期間で必要とされる場合の時間が、減少し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書中で企図されるワクチン組成物において使用するための生の弱毒化ウイルスとしては、１種以上の生の弱毒化フラビウイルスワクチン（弱毒化黄熱ウイルス（例えば、１７Ｄ）が挙げられるが、これらに限定されない）、弱毒化日本脳炎ウイルス（例えば、ＳＡ １４−１４−２）、弱毒化デングウイルス（例えば、ＤＥＮ−２／ＰＤＫ−５３もしくはＤＥＮ−４・３０）、弱毒化キメラ西ナイルウイルス、もしくは組換えキメラフラビウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ワクチン組成物において使用するための上記フラビウイルス培養物は、本明細書で開示される１種以上のコポリマーを有する培地組成物中で増殖させられ得る。

他の実施形態は、本明細書中で企図されるフラビウイルスのうちの１つ以上によって引き起こされる医学的状態の発生を減少もしくは予防し得るワクチン処方物に関する処方物および方法において有用なウイルス集団に関する。これら実施形態によれば、医学的状態は、西ナイル感染、デング熱、日本脳炎、キャサヌール森林病、マリーバレー脳炎、Ａｌｋｈｕｒｍａ出血熱、セントルイス脳炎、ダニ媒介性脳炎、黄熱およびＣ型肝炎の感染が挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、これら処方物を生成するための製造時間は、開示される処方物において使用されるウイルス集団の増殖を増大させ、遅延時間を減少させ、そして／またはプラークサイズ（ｐｌａｇｕｅ ｓｉｚｅ）を増大させるために、本明細書中で企図された組成物を使用して、減少させられ得る。

他の実施形態は、治療的適用において有用なウイルス組成物に関する。このような用途としては、遺伝子治療適用が挙げられ得るが、これらに限定されない。遺伝子治療適用において細胞へ遺伝子を送達するために使用されるウイルスとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルス組成物の他の用途としては、癌ウイルス治療（例えば、「腫瘍崩壊」ウイルス）もしくは癌免疫療法が挙げられ得るが、これらに限定されない。

細胞培養物（例えば、宿主細胞）の増殖のために使用される任意の培地が、本明細書で有用であり得ることは、本明細書で企図される。例えば、細胞培養のために一般に使用される培地が、企図される。これら実施形態によれば、培地としては、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコースと、Ｌ−グルタミンと、塩酸ピリドキシン、ピリ便酸ナトリウム非含有、３．７ｇ 炭酸水素ナトリウム／Ｌを含む）、ＭＥＭ、ＢＳＳ／ＹＥ−ＬＡＨ、Ｆ−１０（Ｈａｍ’ｓ）、Ｆ−１２、Ｍ−１９９、ＲＰＭＩ、Ａｇａｒｓ、ＬＢブロス、およびＰＢＳベースの培地が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、細胞は、当該分野で公知の任意の手段によって培養され得ることが企図される。例えば、細胞は、コンフルエントな層中で、懸濁物として、複数層中で、ローラーボトル中で、ウェル中で、もしくはチューブ中で増殖させられ得る。

特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書で開示されるウイルスを培養するために使用され得る。本明細書で開示されるウイルスの宿主になることが公知の任意の細胞が、企図される。本明細書で開示されるウイルスを増殖するために有用ないくつかの宿主細胞としては、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞）、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞、Ｃ６／３６蚊細胞もしくは当該分野で公知の他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のいくつかの実施形態は、種々のウイルス培養物を培養するための方法において有用な１種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマー化合物を有する組成物を報告し、ここで本明細書で開示されるいくつかの組成物は、コポリマー組成物を有さない組成物と比較して、約１０％まで、約１５％まで、約２０％まで、約２５％まで、約３０％まで、約３５％まで、約４０％まで、約４５％まで、約５０％以上、ウイルス増殖の種々の局面を調節し得る（例えば、より大きなプラークサイズ、減少した遅延相）。

（キット）
さらなる実施形態は、本明細書中で記載される方法および組成物に有用なキットに関する。コポリマー組成物および生のウイルス処方物が挙げられるが、これらに限定されない組成物は、キット中に提供され得る。キットはまた、適切な容器、コポリマー組成物、本明細書で記載される生のウイルス組成物、および必要に応じて、１種以上のさらなる薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗真菌剤もしくは抗菌剤（例えば、望ましくない種の増殖を調節するため）を含み得るが、これらに限定されない。

上記キットは、ウイルス培養物に有用な適切にアリコートに分けたコポリマー組成物をさらに含み得る。さらに、本明細書中の組成物は、部分的にもしくは完全に脱水されたもしくは水性のウイルス培養物、および／または上記ウイルスを増殖させるための宿主細胞、ならびに液体または部分的にもしくは完全に脱水された培地であり得る。本明細書で企図されるキットは、本明細書で開示されるように、特定の処方物および成分に依存して、室温で保存され得るか、凍結され得るか、または冷蔵庫の温度で保存され得る。

上記キットの容器手段は、一般に、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジもしくは他の容器手段を含む。その中に組成物が配置され得、好ましくは、適切にアリコートにされ得る。さらなる成分が提供される場合、上記キットはまた、一般に、１種以上のさらなる容器を含む。その中に、この薬剤もしくは成分が配置され得る。本明細書中のキットはまた、代表的には、市販するために、密に拘束して、上記薬剤、組成物および任意の他の試薬容器を含むための手段を含む。このような容器は、望ましいバイアルが保持される射出成形プラスチック容器もしくは吹き込み成形プラスチック容器を含み得る。

以下の実施例は、本明細書で示される特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例中で開示される技術は、本明細書で開示される実施において十分機能することが発見された技術を表し、従って、その実施について考慮され得ることは、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みれば、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ得、本明細書の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様のもしくは類似の結果をなお得ることを認識すべきである。

（実施例）
（実施例１）
図１に表される１つの例示的方法において、フラビウイルス増殖に対するプルロニック（登録商標）Ｐ１２３またはＦ１２７（それぞれ、ポロキサマー４０３または４０７）の効果を、１つの例示的細胞株であるＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞）で試験した。Ｖｅｒｏ細胞を、例えば、Ｔ−７５ｃｍ^２フラスコ中で、ＭＯＩ ０．００１でフラビウイルスに（示されるように）感染させる前に２日間、コンフルエントになるまで増殖させた。１８０分間のウイルス吸着を、プルロニック（登録商標）（Ｐ１２３もしくはＦ１２７（それぞれ、ポロキサマー４０３または４０７））の存在下もしくは非存在下で、２ｍＬ ＰＢＳ中で評価した。コントロールサンプルは、コポリマーなしのＰＢＳ中でウイルス吸着を含んでいた。増殖培地（１８ｍＬ 無血清ＤＭＥＭ）を、吸着後に添加した。アリコートを、毎日採取し、Ｖｅｒｏ細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図１中に図示されるように、測定した。

図２に図示される別の例において、種々の濃度のコポリマーＰｌｕｏｒｏｎｉｃ Ｆ１２７なしもしくはありでの、Ｖｅｒｏ細胞中のキメラフラビウイルス ＤＥＮ−２／４の増殖を試験した。Ｖｅｒｏ細胞を、ＭＯＩ ０．００１でＤＥＮ−２／４に感染させる前に、例えば、Ｔ−７５ｃｍ^２フラスコ中、２日間コンフルエントになるまで増殖させた。ウイルスを、Ｆ１２７ありまたはなしの２ｍＬ ＤＭＥＭ中に１２０分間吸着させた。ウイルス接種物を、細胞単層からＰＢＳですすぎ、続いて、５％ ＦＢＳを含む、Ｆ１２７ありまたはなしの２５ｍＬの示された増殖培地を添加し、１４日間で増殖させた。アリコートを毎日採取し、ｖｅｒｏ細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図２に図示されるように測定した。

（実施例２）
別の例示的方法において、吸着および増殖の間に、漸増量のＦ１２７を含む、Ｖｅｒｏ細胞中でのＤＥＮ ２／４（Ｄｅｎｇｕｅ ２／４）キメラの増殖を、試験した（例えば、図３を参照のこと）。Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層を、１０％ ＦＢＳを含む２５ｍＬ ＤＭＥＭ培地中、およびコントロールもしくは漸増濃度のＦ１２７中、Ｔ７５ｃｍ^２フラスコ中で増殖させた。本実施例において使用した例示的なＦ１２７濃度は、０．０６３％、０．１２５％、０．２５％、０．５％、１．０％および２．０％ Ｆ１２７を含んでいた。上記細胞を、ＭＯＩ＝０．００１でＤＥＮ２／４に感染させた。パラメーターは、１ｍＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２７中、１．５時間の吸着を含んだ。アリコートを１日おきに採取し、Ｖｅｒｏ細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図３に図示されるように測定した。

さらに、別の実験で、上記キメラフラビウイルス ＤＥＮ２／１のウイルス吸着の間に、上記コポリマーＦ１２７の効果を分析した。本実施例において、ＤＥＮ２／１を、ＭＯＩ ０．００１で９０分間、Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントなフラスコに吸着させた。１％ Ｆ１２７ありもしくはなしの１ｍＬの増殖培地（ＢＡ−１）中で吸着を行った。ウイルス吸着の後、２％ ＦＢＳを含みＦ１２７を含まない２０ｍＬ ＤＭＥＭを、上記培養物に添加した。アリコートを１日おきに採取し、Ｖｅｒｏ細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図４に図示されるように測定し得る。

（実施例３）
別の例示的方法で、例示的コポリマーＦ１２７の存在下でプラークサイズが増大するか否かを分析した。図５は、例示的な表（表１）を表す。この実験は、フラビウイルスのプラークサイズが、増殖の間にプルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）の漸増濃度の存在下で増大することを実証した。ここで、Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層を、Ｆ１２７の存在下もしくは非存在下で、２０ｍＬ ＤＭＥＭ２％ ＦＢＳ培地中、Ｔ７５ｃｍ２フラスコで増殖させ、ここで上記Ｖｅｒｏ細胞を、ＭＯＩ＝０．００１でＤＥＮ２／４に感染させた。吸着は、Ｆ１２７の存在下（０．１％もしくは１．０％）もしくは非存在下で１ｍＬ ＤＭＥＭ中、１．５時間であった。プラーク（例えば、８）を、ライトボックスで可視化し、それらの直径を測定した。表１は、Ｆ１２７の非存在下、もしくはＦ１２７の漸増濃度の存在下で、ＤＥＮＶａｘ ２／４増殖のプラークサイズ（ｍｍ）差の一元配置ＡＮＯＶＡの結果を表す。

（材料および方法：）
当該分野で公知の任意の方法は、本明細書で記載される任意の組成物、方法および／もしくは使用のために使用され得ることが企図される。特定の実施形態において、特定の方法が、ウイルス増殖（例えば、他の方法より、フラビウイルス増殖のために使用する材料および方法）により適していることが企図される。他の実施形態において、特定の方法が、他のフラビウイルスに適しているより、Ｄｅｎｇｕｅの増殖により適していることが企図される。以下は、Ｆ１２７の存在下で、高力価キメラＤｅｎｇｕｅワクチンもしくは任意の生の弱毒化フラビウイルスを増殖させるための方法に関して、簡単な説明を提供する。Ｔ−７５ｃｍ^２フラスコを使用して、例えば、Ｖｅｒｏ細胞を、５ｘ１０^６細胞／フラスコの密度で、ウイルス感染／吸着の２日前に播種する。このウイルス増殖は、Ｔ−２５ｃｍ^２〜１０個積み重ね細胞工場までの範囲に及ぶ組織培養容器を含むように、「スケールアップ」され得る。ウイルスを、Ｆ１２７（０．１％）を含む１ｍＬ ＤＭＥＭ中に細胞を播種した２日後に、Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエント単層に吸着させる。上記培養容器を、什器容器を１０分毎に浸透させながら、１．５時間にわたって３７℃でインキュベートする。ウイルス吸着後、上記細胞単層を、１０ｍＬ ＰＢＳで３回洗浄する。次いで、増殖培地（３．７ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３および０．１％ Ｆ１２７を含み、ＦＢＳなしの１０ｍＬ ＤＭＥＭ ｐＨ＝７．２）を、上記単層に添加し、３７℃で４日間通気ありまたはなしでインキュベートする。ウイルス増殖の４日目に、ウイルス吸着の後に行われる場合、上記増殖培地を置換する。６日目に開始して、１２日目までに、感染培地を、上記増殖チャンバから完全に除去し、清澄かのための遠心分離した。このウイルス増殖を安定化し、その力価がＶｅｒｏ細胞単層のプラークアッセイによって試験され得るまで、−８０℃で保存する。毎日採取した後に、上記増殖培地を、４日目に行われる場合、組織培養容器に置換する。１２日目まで毎日の採取を続ける。毎日の採取を、Ｖｅｒｏ細胞に対して個々に力価測定し、高力価の採取物を、均一のサンプルを得るためにプールし得る。ＤＮＡの高レベルを回避するために、しばしば、第１日目の採取物（６日目）は含めない。

表１． ＤＭＥＭ−Ｆ１２の例：Ｆ−１２栄養素混合物（Ｈａｍ）、Ｌ−グルタミン添加物を有する粉末（２１７００）／１０Ｌ：１１．７６ｇ 炭酸水素ナトリウム、１００ｍｌ ペニシリン ストレプトマイシン
そのｐＨを７．２に調節。

開示され、本明細書で特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に鑑みて、過度の実験なくして作製され得、かつ行われ得る。上記組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から記載されてきたが、バリエーションが、上記組成物および方法に、本明細書に記載される方法の工程でおよび工程順で、本明細書に記載される概念、趣旨および範囲から逸脱することなく適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、化学的にかつ物理的に関連する特定の薬剤は、本明細書に記載される薬剤の代わりに使用され得るが、同じもしくは類似の結果が達成される。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換物および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される、趣旨、範囲および概念内にあるとみなされる。

Claims (15)

1. ウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、該組成物は、
   １種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ３．０％以下の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー；
   宿主細胞；および
   ウイルス培養物を増殖させるための培地、
   を含み、
   ここでＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。
2. エチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーの濃度は、０．００１％〜３．０％である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーは、ポロキサマー４０７を含み、前記培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、請求項１に記載の組成物。
4. エンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス増殖に関する１つ以上のパラメータを調節するための方法であって、該方法は、
   宿主細胞をエンベロープ型ウイルス培養物に感染させる工程、
   前記ウイルスに感染した宿主細胞培養物に、１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーを投与する工程（ここで、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含む）、および
   培養物においてエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス増殖の前記１つ以上のパラメータを調節する工程
   を含む方法。
5. 前記組成物を、宿主細胞培養物のエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス感染の前、その間、もしくはその後に、該宿主細胞培養物に投与する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記組成物を投与することにより、エンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのプラークサイズを、前記組成物を投与しないコントロールエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して増大させる工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記組成物を投与することにより、宿主細胞培養物におけるエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物の遅延時間を、前記組成物を投与しないコントロールエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して減少させる工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
8. 前記ウイルス培養物は、フラビウイルス培養物から選択される、請求項４に記載の方法。
9. 前記ウイルス培養物は、生の、弱毒化ウイルスワクチンを生成するためのウイルス培養物を含む、請求項４に記載の方法。
10. 前記遅延時間の減少は、前記組成物なしのエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して、遅延時間の１０％以上の減少を含む、請求項４に記載の方法。
11. ウイルスを培養するためのキットであって、該キットは、
    １個以上の容器；および
    請求項１に記載の１種以上の組成物
    を含む、キット。
12. 前記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーであるポロキサマー４０７の濃度は、０．００１％〜３．０％である、請求項１１に記載のキット。
13. 前記ウイルス培養物は、１種以上のフラビウイルスを含む、請求項１１に記載のキット。
14. フラビウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、
    １種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ０．００１％〜３．０％の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、
    フラビウイルス培養物、
    宿主細胞、および
    フラビウイルス培養物を増殖させるための培地
    を含み、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはフラビウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。
15. ポックスウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、
    １種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ０．００１％〜３．０％の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、
    ポックスウイルス培養物、
    宿主細胞、および
    ポックスウイルス培養物を増殖させるための培地
    を含み、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはポックスウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。