JP2012510822A - ウイルス増殖を誘導するための組成物、方法、および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年12月5日に出願された米国仮特許出願第61/120,262号の利益を主張し、この仮特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
本願の実施形態は、一般に、促進されたもしくは増強されたウイルス増殖のための方法、組成物および使用を報告する。特定の実施形態において、本願は、促進されたウイルス増殖を誘導し、そして/またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告する。他の実施形態において、コポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告し、これらは、フラビウイルス増殖を促進し、フラビウイルス遅延時間を減少させ、そして/またはフラビウイルスプラークサイズを増大させるためのものである。
感染性疾患から防御するためのワクチンは、ヒトおよび動物の健康を改善するために使用されてきた。ウイルスワクチンについてのある成功裏の技術は、上記ウイルスの弱らせたもしくは弱毒化株(「生の弱毒化ウイルス」)で動物もしくはヒトを免疫することである。免疫後の制限された複製に起因して、上記弱毒化株は、疾患を引き起こさない。しかし、上記制限されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するには十分であり、上記ウイルスに対する強力かつ長期間の免疫応答を生成する。従って、その後に、上記ウイルスの病原性株に曝された際に、上記免疫された個体は、疾患から防御される。
本願の実施形態は、一般に、ウイルス増殖を誘導し、増強し、そして促進するための方法、組成物および使用に関する。特定の実施形態において、本願は、促進したウイルス増殖を誘導し、そして/またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用を報告する。他の実施形態において、コポリマー組成物の方法、組成物および使用が報告され、これらは、フラビウイルス増殖を促進し、フラビウイルス遅延時間を減少させ、そして/またはフラビウイルスプラークサイズを増大させるためのものである。
本明細書で使用される場合、「1つの、ある(a)」もしくは「1つの、ある(an)」は、ある項目の1つもしくは1つより多くを意味し得る。
以下の節において、種々の例示的組成物および方法が、種々の実施形態を詳述するために記載される。上記種々の実施形態の実施が、本明細書中で概説される詳細のうちの全てもしくはさらにはいくつかの使用を必要としないが、むしろ濃度、時間および他の詳細は、慣用的な実験を介して改変され得ることは、当業者にとって明らかである。いくつかの場合において、周知の方法もしくは成分は、説明に含まれなかった。
特定の実施形態において、組成物は、コポリマー(例えば、プルロニック F127)を含み得る。プルロニック F127(本明細書中ではF127ともいわれる)は、非イオン性ポリエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーである。プルロニックブロックコポリマーは、ポロキサマーとしてそれらの非商標名の下で公知である。それらは、界面活性剤として使用するために最初は開発された。これら化合物は、親水性エチレンオキシド(EO)および疎水性プロピレンオキシド(PO)のブロックからなる。上記EO−POブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド(EOと称される−CH2CH2O−)およびポリプロピレンオキシド(POと称される−CH2CHCH3O−)のブロックを含み得る。上記POブロックは、EOx−POy−EOx配置において2つのEOブロックが隣接し得る。上記PO成分は、親水性であり、上記EO成分は、疎水性であるので、全体的な親水性、分子量および界面活性剤特性は、上記EOx−POy−EOxブロック構造におけるxおよびyを変化させることによって、調節され得る。製造業者(例えば、BASF,Lutrol(登録商標)F127)に依れば、F127は、クリームおよび液体エマルジョンにおいて、濃化剤および共乳化剤(co−emulsifier)として使用され得る。
さらなる実施形態は、本明細書中で記載される方法および組成物に有用なキットに関する。コポリマー組成物および生のウイルス処方物が挙げられるが、これらに限定されない組成物は、キット中に提供され得る。キットはまた、適切な容器、コポリマー組成物、本明細書で記載される生のウイルス組成物、および必要に応じて、1種以上のさらなる薬剤(例えば、他の抗ウイルス剤、抗真菌剤もしくは抗菌剤(例えば、望ましくない種の増殖を調節するため)を含み得るが、これらに限定されない。
(実施例1)
図1に表される1つの例示的方法において、フラビウイルス増殖に対するプルロニックの効果を、1つの例示的細胞株であるVero細胞(アフリカミドリザルVero細胞)で試験した。Vero細胞を、例えば、T−75cm2フラスコ中で、MOI 0.001でフラビウイルスに(示されるように)感染させる前に2日間、コンフルエントになるまで増殖させた。180分間のウイルス吸着を、プルロニック(P123もしくはF127)の存在下もしくは非存在下で、2mL PBS中で評価した。コントロールサンプルは、コポリマーなしのPBS中でウイルス吸着を含んでいた。増殖培地(18mL 無血清DMEM)を、吸着後に添加した。アリコートを、毎日採取し、Vero細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図1中に図示されるように、測定した。
別の例示的方法において、吸着および増殖の間に、漸増量のF127を含む、Vero細胞中でのDEN 2/4(Dengue 2/4)キメラの増殖を、試験した(例えば、図3を参照のこと)。Vero細胞のコンフルエントな単層を、10% FBSを含む25mL DMEM培地中、およびコントロールもしくは漸増濃度のF127中、T75cm2フラスコ中で増殖させた。本実施例において使用した例示的なF127濃度は、0.063%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%および2.0% F127を含んでいた。上記細胞を、MOI=0.001でDEN2/4に感染させた。パラメーターは、1mL DMEM/F127中、1.5時間の吸着を含んだ。アリコートを1日おきに採取し、Vero細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図3に図示されるように測定した。
別の例示的方法で、例示的コポリマーF127の存在下でプラークサイズが増大するか否かを分析した。図5は、例示的な表(表1)を表す。この実験は、フラビウイルスのプラークサイズが、増殖の間にプルロニック F127の漸増濃度の存在下で増大することを実証した。ここで、Vero細胞のコンフルエントな単層を、F127の存在下もしくは非存在下で、20mL DMEM2% FBS培地中、T75cm2フラスコで増殖させ、ここで上記Vero細胞を、MOI=0.001でDEN2/4に感染させた。吸着は、F127の存在下(0.1%もしくは1.0%)もしくは非存在下で1mL DMEM中、1.5時間であった。プラーク(例えば、8)を、ライトボックスで可視化し、それらの直径を測定した。表1は、F127の非存在下、もしくはF127の漸増濃度の存在下で、DENVax 2/4増殖のプラークサイズ(mm)差の一元配置ANOVAの結果を表す。
当該分野で公知の任意の方法は、本明細書で記載される任意の組成物、方法および/もしくは使用のために使用され得ることが企図される。特定の実施形態において、特定の方法が、ウイルス増殖(例えば、他の方法より、フラビウイルス増殖のために使用する材料および方法)により適していることが企図される。他の実施形態において、特定の方法が、他のフラビウイルスに適しているより、Dengueの増殖により適していることが企図される。以下は、F127の存在下で、高力価キメラDengueワクチンもしくは任意の生の弱毒化フラビウイルスを増殖させるための方法に関して、簡単な説明を提供する。T−75cm2フラスコを使用して、例えば、Vero細胞を、5x106細胞/フラスコの密度で、ウイルス感染/吸着の2日前に播種する。このウイルス増殖は、T−25cm2〜10個積み重ね細胞工場までの範囲に及ぶ組織培養容器を含むように、「スケールアップ」され得る。ウイルスを、F127(0.1%)を含む1mL DMEM中に細胞を播種した2日後に、Vero細胞のコンフルエント単層に吸着させる。上記培養容器を、什器容器を10分毎に浸透させながら、1.5時間にわたって37℃でインキュベートする。ウイルス吸着後、上記細胞単層を、10mL PBSで3回洗浄する。次いで、増殖培地(3.7g/L NaHCO3および0.1% F127を含み、FBSなしの10mL DMEM pH=7.2)を、上記単層に添加し、37℃で4日間通気ありまたはなしでインキュベートする。ウイルス増殖の4日目に、ウイルス吸着の後に行われる場合、上記増殖培地を置換する。6日目に開始して、12日目までに、感染培地を、上記増殖チャンバから完全に除去し、清澄かのための遠心分離した。このウイルス増殖を安定化し、その力価がVero細胞単層のプラークアッセイによって試験され得るまで、−80℃で保存する。毎日採取した後に、上記増殖培地を、4日目に行われる場合、組織培養容器に置換する。12日目まで毎日の採取を続ける。毎日の採取を、Vero細胞に対して個々に力価測定し、高力価の採取物を、均一のサンプルを得るためにプールし得る。DNAの高レベルを回避するために、しばしば、第1日目の採取物(6日目)は含めない。
そのpHを7.2に調節。
Claims (24)
- ウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、該組成物は、
1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマー;および
必要に応じて、培地、
を含み、
ここで該高分子量界面活性剤もしくはコポリマーは、ウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。 - 前記高分子量界面活性剤もしくはコポリマーは、プルロニック F127、プルロニック F68、プルロニック P85、プルロニック P123、3,000〜4,000 MWより大きい他のEO−POブロックコポリマー、もしくはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記ウイルス培養物は、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記ウイルス培養物は、フラビウイルス培養物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ウイルス培養物は、ポックスウイルス培養物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記高分子量界面活性剤は、EO−POブロックコポリマーであるプルロニック F127、プルロニック P123もしくはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記高分子量界面活性剤のうちの少なくとも1種は、分子量1500以上を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記高分子量界面活性剤のうちの少なくとも1種は、1種以上のコポリマーをさらに含み、前記少なくとも1種の高分子量界面活性剤因子の分子量は、3000以上である、請求項1に記載の組成物。
- 前記高分子量界面活性剤のうちの少なくとも1種の濃度は、約0.001%〜約3.0%である、請求項1に記載の組成物。
- 前記高分子量界面活性剤のうちの少なくとも1種は、プルロニック F127を含み、前記培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む、請求項1に記載の組成物。
- ウイルス増殖速度を増大させるための方法であって、該方法は、ウイルスに感染した宿主細胞培養物に、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを含む組成物を投与する工程を包含し、ここで該組成物は、ウイルス増殖速度を増大させる、方法。
- ウイルス増殖速度を増大させるための方法であって、該方法は、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを含む組成物を、宿主細胞培養物のウイルス感染の前、その間、もしくはその後に、該宿主細胞培養物に投与する工程を包含する、方法。
- ウイルス培養物のプラークサイズを増大させるための方法であって、該方法は、ウイルスに感染した宿主細胞培養物に、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを含む組成物を投与する工程を包含し、ここで該組成物は、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを投与しないコントロールウイルス培養物と比較して、ウイルスプラークサイズを増大させる、方法。
- ウイルス培養物の増殖遅延時間を減少させるための方法であって、該方法は、ウイルスに感染した宿主細胞培養物に、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを含む組成物を投与する工程を包含し、ここで該組成物は、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーを投与しないコントロールウイルス培養物と比較して、該ウイルス培養物の遅延時間を減少させる、方法。
- 前記ウイルス培養物は、フラビウイルス培養物から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記ウイルス培養物は、生の、弱毒化ウイルスワクチンを生成するためのウイルス培養物を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記遅延時間の減少は、1種以上の高分子量界面活性剤もしくはコポリマーなしのウイルス培養物と比較して、遅延時間の少なくとも10%減少を含む、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1種の高分子量界面活性剤は、プルロニック F127、プルロニック F68、プルロニック P85、プルロニック P123、3,000〜4,000 MWより大きい他のEO−POブロックコポリマーもしくはこれらの組み合わせを含む、請求項14に記載の方法。
- ウイルスを培養するためのキットであって、該キットは、
少なくとも1個の容器;
1種以上の高分子量界面活性剤を含む組成物;および
必要に応じて、1種以上のウイルス培養物
を含む、キット。 - 前記高分子量界面活性剤のうちの少なくとも1種は、プルロニック F127、プルロニック F68、プルロニック P85、プルロニック P123、3,000〜4,000 MWより大きい他のEO−POブロックコポリマーもしくはこれらの組み合わせを含む、請求項19に記載のキット。
- 前記EO−POブロックコポリマーであるプルロニック F127の濃度は、0.001%〜約3.0%である、請求項19に記載のキット。
- 前記ウイルス培養物は、1種以上のフラビウイルスを含む、請求項19に記載のキット。
- 培地をさらに含む、請求項19に記載のキット。
- 宿主細胞ストック培養物をさらに含む、請求項19に記載のキット。
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