PL199642B1

PL199642B1 - Preparat bakteriofagowy o podwyższonej trwałości oraz zastosowanie blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu

Info

Publication number: PL199642B1
Application number: PL356897A
Authority: PL
Inventors: Janusz Boratyński; Andrzej Górski; Tomasz Lipiński; Danuta Syper; Beata Weber-Dąbrowska
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Do
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2002-11-15
Publication date: 2008-10-31
Also published as: AU2003286984A1; WO2004045645A3; AU2003286984A8; PL356897A1; WO2004045645A2

Abstract

Zaprezentowano preparaty bakteriofagowe o podwyższonej stabilności oraz nowe zastosowanie blokowych kopolimerów tlenku etylenu i tlenku propylenu do stabilizowania aktywności preparatów bakteriofagowych. Stabilizowane preparaty bakteriofagowe o podwyższonej trwałości znajdują zastosowanie w lecznictwie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są preparaty bakteriofagowe o podwyższonej stabilności oraz nowe zastosowanie blokowych kopolimerów tlenku etylenu i tlenku propylenu. Stabilizowane preparaty bakteriofagowe o podwyższonej trwałości znajdują zastosowanie w lecznictwie.

Poloxamery to nazwa chemiczna określająca grupę związków będących trójblokowymi kopolimerami tlenku etylenu i tlenku propylenu. Cząsteczka posiada symetryczną budowę przedstawioną poniżej ch₃

HO-(CH₂CH₂O)x -(CH₂CHO)y -(CH₂CH₂O)x -h A B A

Część B tworzy hydrofobowy rdzeń zbudowany z glikolu polipropylenowego (y określa liczbę jednostek) polioksyetylowany (x liczba jednostek oksyetylenowych) na obu końcowych grupach hydroksylowych - części A. Krótki łańcuch węglowy jednostek oksyetylenowych stanowi o hydrofilowym charakterze modułów A.

Związki o analogicznej budowie lecz odwróconej kolejności modułów czyli B-A-B zwane są meroxapolami. Poloxamery i meroxapole zostały wprowadzone na rynek w latach 50-tych przez firmę BASF Corp. pod nazwą Pluronic S i Pluronic R.

Poloxamery są związkami amfifilowymi rozpuszczalnymi w wodzie i solwentach organicznych. Stosunek części hydrofobowej do hydrofilowej może być łatwo zmieniany co umożliwia uzyskanie szerokiej gamy związków o poszukiwanych właściwościach. Masa cząsteczkowa dostępnych na rynku poloxamerów zawiera się w przedziale od 1100 do 14000. Związki te z racji swych amfifilowych własności są dobrymi dyspersantami, emulgatorami, posiadają zdolność tworzenia żeli. Meroxapole w porównaniu do poloxamerów wykazują mniejsze właściwości pieniące (są stosowane jako antypieniacze) i nie tworzą żeli. Poloxamery znalazły szerokie zastosowanie w technice, medycynie, przemyśle kosmetycznym, badaniach naukowych.

Wykazano, że poloksamery tworzą kompleksy z DNA i białkami, jednocześnie są chemicznie względnie inertne i co bardzo istotne nietoksyczne dla zwierząt, ludzi oraz mikroorganizmów i komórek ekariotycznych. Asocjują z membranami biologicznymi. Poloxsamery wydatnie zwiększają transfekcje genowe i posiadają przy tym własności adjuwantowe. W związku z tym, prowadzone są badania nad zastosowaniem poloxsamerów do tworzenia szczepionek DNA. Poloxamer pełni rolę cząsteczki nośnikowej umożliwiającej wniknięcie cząsteczki DNA do komórki, chroni ją przed strawieniem, asocjuje z wytworzonym antygenem i pobudza wytworzenie odpowiedzi immunologicznej (Kabanov AV, Lemieux P, Vinogradov S, Alakhov V. Pluronic block copolymers: novel functional molecules for gene therapy Adv Drug Deliv Rev. 2002 Feb 21; 54 (2): 223-33. Review).

Żele tworzone przez poloxamery odznaczają się unikalnymi właściwościami, stan ciekły utrzymuje się w niskich temperaturach, żelifikacja następuje w temperaturach podwyższonych (co jest istotne w zakresie fizjologicznym). Żele poloxamerowe stosuje się np. w mikrobiologii do zestalania podłoży. Ochłodzenie płytki z hodowlą umożliwia oddzielenie mikroorganizmu od podłoża poprzez wirowanie. Inne badania koncentrują się nad zastosowaniem takich żeli do aplikacji leków i hormonów (Paavola, A.; Yliruusi, J.; Kajimoto, Y.; Kalso, E.; Wahlstrom, T.; Rosemberg, P., 1995. Controlled release of lidocaine from injectable gels and efficacy in rat sciatic nerve błock. Pharm. Res. 12, 19972002; Paavola, A.; Yliruusi, J.; Rosemberg, P., 1998. Controlled release and dura mater permeability of lidocaine and ibuprofen from injectable poloxamer-based gels. J. Cont. Rel. 52, 169-178.; Miyazaki,

S.; Yokouchi, C.; Nakamura, T.; Hashiguchi, N.; Hou, W.-M.; Takada, M., 1986. Pluronic F-127 gels as a novel vehicle for rectal administration on indomethacin. Chem. Pharm. Bull. 34, 1801-1808; Kim MR, Park TG. Temperature-responsive and degradable hyaluronic acid/Pluronic composite hydrogels for controlled release of human growth hormone. J Control Release 2002 Apr 23; 80 (1-3): 69-77). Roztwory poloksamerów wykazują zdolność do stabilizowania białek, dodanie poloxamerów (np. Pluronic F127) do roztworów peptydów i białek pomaga zachować ich aktywność biologiczną.

W związku z tym, stosuje się poloxamery w przemyśle farmaceutycznym do stabilizacji leków.

PL 199 642 B1

W biotechnologii wykorzystuje się bioreaktory (fermentory) do hodowli komórek eukariotycznych produkujących pożądane substancje, np. bioaktywne peptydy, przeciwciała. Jest to niezwykle trudny proces choćby ze względu na dużą wrażliwość komórek na bodźce mechaniczne. Stwierdzono, że silna agitacja, a zwłaszcza napowietrzanie, jest przyczyną śmierci znacznej liczby komórek, co powoduje duże straty. Dodatek poloxamerów do podłoża w znacznym stopniu redukuje negatywne efekty silnego mieszania i napowietrzania.

Surfaktanty poloxamerowe posiadają zdolność uszczelniania uszkodzonych czynnikami chemicznymi (toksyny) bądź fizycznymi (np. promieniowanie jonizujące, szok cieplny) błon komórkowych (Padanilam, J.T., Bischof, J.C., Lee, R.C., Cravalho, E.G., Tomkins, R.G., Yarmush, M.L., and Toner, M.'Effectiveness of Poloxamer 188 in Arresting Calcein Leakage From Thermally Damaged Isolated Skeletal Muscle Cells'. Annals of NYAS, Vol. 720, pp. 111-123, 1994; Merchant, FA, Holmes, W.H., Capelli-Schellpfeffer, M., Lee, R.C., and Toner, M. 'Poloxamer 188 Enhances Functional Recovery of Lethally Heat-Shocked Fibroblasts'. J Surg Res. 74: 1031-1040, 1998. Greenebaum, B., Carrillo, C.S., Hannig, J., Beckett, M. A., Weichselbaum, R.R. and Lee, R.C. 'Poloxamer 188 Prevents Acute Necrosis of Adult Skeletal Muscle Fibers after High-dose Irradiation'. Radiation Research (in press); Marks JD, Cromie W, and Lee RC. Nonionic surfactant prevents NMDA-induced death in cultured hippocampal neurons. Soc Neurosci Abs 24(1): 462, 1998; Palmer, J.S., Cromie, W. J and Lee, R.C. 'Surfactant Administration Reduces Testicular Ischemia-Reperfusion Injury'. J. Urology 159: (6) 2136-2139, June, 1998; Hannig J, Yu J, Beckett M, Weichselbaum R, and Lee RC. 'Poloxamine 1107 sealing of radiopermeabilized erythrocyte membranes' Int J M Rad Biol 75: 379-385, 1999).

Żelujący poloxamer, Pluronik F 68 zastosowano do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z pł ynu po hodowli komórek hybrydoma w systemie wodnej ekstrakcji dwufazowej. (Journal of Chemical Engineering of Japan, vol. 26 no 2 pp 183-188 (1993) TOSHIHIKO KITAHARA, MASAMICHI KAMIHIRAAND HIROSHI TAKEUCHI).

Zdolność poloxamerów do absorbcji na błonach biologicznych i tworzenia kompleksów z niektórymi białkami może być wykorzystana do wpływania na istotne procesy biologiczne, takie jak adhezja komórek do powierzchni (np. implantów), aglutynacja komórek, funkcjonowanie systemów transportu leków, takich jak liposomy, mikrokapsułki. Penetracja i klirens tych struktur w organizmie, wreszcie uwalnianie leku w odpowiednim czasie i lokalizacji, zależą w dużym stopniu od właściwości ich powierzchni. Poloxamery dają szerokie możliwości w uzyskiwaniu pożądanych właściwości (Chandaroy P, Sen A, Alexandridis P, Hui SW. Utilizing temperature-sensitive association of Pluronic F-127 with lipid bilayers to control liposome-cell adhesion. Biochim Biophys Acta. 2002 Feb 10; 1559 (1): 32-42.; Ahmed F, Alexandridis P, Shankaran H, Neelamegham S. The ability of poloxamers to inhibit platelet aggregation depends on their physicochemical properties.; Fichtner I, Kreuter J, Berndt A, Diederichs JE, Reszka R. Influence of surface-modifying surfactants on the pharmacokinetic behavior of 14C-poly (methylmethacrylate) nanoparticles in experimental tumor models. Pharm Res. 2001 Nov; 18 (11): 1613-9).

Bakteriofagi wykorzystywane w terapii powinny być pozbawione niekorzystnych zanieczyszczeń, takich jak przykładowo endotoksyny bakteryjne. Odpowiednie szczepy bakteryjne mogą być otrzymane i oczyszczane, na przykład metodami opisanymi w polskich zgłoszeniach patentowych dokonanych przez Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu: P. 348740 z dnia 18 lipca 2001, P 354822 z dnia 30 czerwca 2002, P.355355 z dnia 5 sierpnia 2002, albo międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/PL02/000053 z dnia 18 lipca 2002. Dotychczas znane preparaty bakteriofagowe, zwłaszcza wysokooczyszczone, tracą aktywność, szczególnie gdy są przechowywane w warunkach niekorzystnych. Nawet zamrażanie bakteriofagów w roztworze soli fizjologicznej nie chroni bakteriofagów przed utratą aktywności.

W opisie patentowym US 5,616,487 zaproponowano zastosowanie stabilizowanych wirusów, zmodyfikowanych poprzez wykorzystanie czynnika stabilizującego. Proces otrzymywania tego rodzaju stabilizowanego wirusa przeprowadzany jest poprzez hodowlę komórek produkujących wirusa w obecności czynnika stabilizującego, w temperaturze poniżej 37°C. Ujawniona stabilizowana kompozycja retrowirusów zawiera retrowirus i blokowy kopolimer a-hydro-(O-hydroksypoli-(oksyetyleno)poli(oksypropyleno)poli(oksyetylenu). Stabilizowana kompozycja zawiera ponadto cholesterol, olej z wątroby dorsza, octan d-a-tokoferolu oraz TWEEN 80™.

Jednakże, problem utraty aktywności bakteriofagów, charakteryzujących się odmiennymi właściwościami niż retrowirusy, pozostaje wciąż aktualny. W szczególności, bakteriofagi posiadają odmienną stabilność w roztworach. Pożądane jest zatem otrzymanie (oczyszczonych) preparatów bakte4

PL 199 642 B1 riofagowych, które cechowałyby się podwyższoną stabilnością, pozwalającą na ich długotrwałe przechowywanie, zwłaszcza w warunkach ambulatoryjnych czy aptecznych, bez utraty aktywności. Aby preparaty bakteriofagowe, zwłaszcza oczyszczone, mogły znaleźć zastosowanie w terapii koniecznym stało się opracowanie metody stabilizacji aktywności.

Nieoczekiwanie niniejszy wynalazek rozwiązuje problem stabilizacji aktywności preparatów bakteriofagowych.

Przedmiotem wynalazku jest preparat bakteriofagowy o podwyższonej trwałości, charakteryzujący się tym, że jako czynnik stabilizujący zawiera kopolimer blokowy tlenku etylenu i tlenku propylenu, przy czym korzystnie czynnik stabilizujący jest poloksamerem albo meroksapolem, w szczególności został on wybrany z grupy zawierającej: pluronic L-44, F 68, F 87, F108 i F127 co odpowiada odpowiednio poloxamerom o symbolach 124, 188, 237, 338 i 407.

Korzystnie preparat według wynalazku zawiera szczep bakteriofagowy wybrany spośród szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-dodatnie i szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-ujemne.

W szczególnie korzystnej realizacji wynalazku preparat według wynalazku zawiera zawiesinę bakteriofagów pozbawioną endotoksyn.

Korzystnie czynnik stabilizujący jest zawarty w stężeniach wyższych od 0,1%, a zwłaszcza w stężeniach od 2-5%.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu do stabilizowania aktywności preparatów bakteriofagowych.

Korzystnie stosowanym kopolimerem jest poloksamer albo meroksapol, zwłaszcza wybrany z grupy zawierają cej: pluronic L-44, F 68, F 87, F108 i F127 co odpowiada odpowiednio poloxamerom o symbolach 124, 188, 237, 338 i 407. Korzystnie tak okreś lony kopolimer jest stosowany do stabilizowania preparatu bakteriofagowego, który zawiera szczep bakteriofagowy wybrany spośród szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-dodatnie i szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-ujemne, przy czym korzystnie preparat bakteriofagowy zawiera zawiesinę bakteriofagów pozbawioną endotoksyn. Korzystnie kopolimer stosuje się w stężeniach wyższych od 0,1%, zwłaszcza w stężeniach od 2-5%.

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku została ona zilustrowana poniższymi przykładami. Błędne byłoby jednak ograniczanie zakresu wynalazku jedynie do tych przykładowych realizacji.

Jako czynniki stabilizujące zastosowano kopolimery blokowe pluronic, pluronic F 68, F 127 oraz poloxamer i poloxameru 188, 407 i 182. Dodanie tych polimerów sprawiało, że preparaty bakteriofagowe przechowywane w roztworze zachowywały niezmienioną aktywność przez wiele miesięcy.

P r z y k ł a d 1

Wyjściową zawiesinę bakteriofagów całkowicie lizującą bakterie szczepu Pseudomonas w rozcieńczeniu 10³ zmieszano z roztworem pluronic'a F68 o stężeniu 50 mg/ml. Końcowe stężenie polimeru blokowego w próbce wynosiło 2%. Zawieszenie bakteriofagów w roztworze zawierającym pluronic skutkowało tym, że oczyszczone bakteriofagi nie traciły zdolności litycznej bakterii.

Bakteriofagi przechowywane w temperaturze 4°C zachowywały po pięciotygodniowym i dziesięciotygodniowym okresie przechowywania 100% aktywności litycznej.

Bakteriofagi przechowywane w bulionie hodowlanym przechowywane w +4°C nieznacznie traciły aktywność lityczną. Bakteriofagi przechowywane w roztworze soli fizjologicznej znacznie traciły aktywność po 22 dniach a po 35 dniach przechowywania były nieaktywne. Preparaty zamrażane -20°C zarówno w bulionie jak i w soli fizjologicznej traciły aktywność, natomiast preparaty mrożone w obecności pluronicu zachowywały aktywność biologiczną.

P r z y k ł a d 2

Wyjściową zawiesinę bakteriofagów całkowicie lizującą bakterie szczepu Pseudomonas w rozcieńczeniu 10³ zmieszano z roztworem poloxameru o stężeniu 100 mg/ml. Końcowe stężenie polimeru blokowego w próbce wynosiło 1%. Zawieszenie bakteriofagów w roztworze zawierającym poloxamer skutkowało tym, że oczyszczone bakteriofagi nie traciły zdolności litycznej bakterii. Bakteriofagi przechowywane w temperaturze -20°C zachowywały po dwu miesięcznym przechowywaniu 100% aktywności litycznej. Bakteriofagi przechowywane w bulionie hodowlanym przechowywane w +4°C nieznacznie traciły aktywność lityczną. Obecność poloxameru w zawiesinie bakteriofagów sprawiała, że preparat zachowywał aktywność po zamrożeniu -20°C.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Preparat bakteriofagowy o podwyższonej trwałości, znamienny tym, że jako czynnik stabilizujący zawiera kopolimer blokowy tlenku etylenu i tlenku propylenu, przy czym zachowuje on 100% aktywności litycznej bakteriofagów po 5 tygodniowym przechowywaniu w temperaturze 4°C.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik stabilizujący jest poloksamerem albo meroksapolem.
3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik stabilizujący został wybrany z grupy zawierającej: pluronic L-44, F 68, F 87, F 108 i F 127, co odpowiada odpowiednio poloxamerom o symbolach 124, 188, 237, 338 i 407.
4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera szczep bakteriofagowy wybrany spośród szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-dodatnie i szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-ujemne.
5. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera zawiesinę bakteriofagów pozbawioną endotoksyn.
6. Preparat wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e zawiera czynnik stabilizujący w stężeniach wyższych od 0,1%.
7. Preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera czynnik stabilizujący w stężeniach od 2-5%.
8. Zastosowanie blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu do stabilizowania aktywności preparatów bakteriofagowych, przy czym zachowuje on 100% aktywności litycznej bakteriofagów po 5 tygodniowym przechowywaniu w temperaturze 4°C.
9. Zastosowanie wedł ug zastrz. 8, znamienne tym, ż e stosowanym kopolimerem jest poloksamer albo meroksapol.
10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że stosowany kopolimer został wybrany z grupy zawierającej: pluronic L-44, F 68, F 87, F 108 i F 127, co odpowiada odpowiednio poloxamerom o symbolach 124, 188, 237, 338 i 407.
11. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że preparat bakteriofagowy zawiera szczep bakteriofagowy wybrany spośród szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gramdodatnie i szczepów bakteriofagowych lizujących bakterie Gram-ujemne.
12. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że preparat bakteriofagowy zawiera zawiesinę bakteriofagów pozbawioną endotoksyn.
13. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że kopolimer stosuje się w stężeniach wyższych od 0,1%.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że kopolimer stosuje się w stężeniach od 2-5%.