JP2007521823A - プロテアーゼ変異型 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、RP-IIまたはC-成分型に属するプロテアーゼの変異型、および変更された性質、例えば、安定性 (例えば、熱安定性または貯蔵安定性) 、Ca2+依存性およびpH依存性活性を有する、このような変異型を構築する方法に関する。
酵素は、洗剤産業において30年以上の間洗浄配合物の一部分として使用されてきている。プロテアーゼは、商業的視野からこのような配合物において、最も関係する酵素であるが、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを包含する他の酵素または酵素の混合物がまたしばしば使用される。また、プロテアーゼは他の分野、例えば、酪農製品の製造、皮革の加工、飼料の加工、およびその他において使用される。
1999年において、Rebrikov 他 (Journal of Protein Chemistry、Vol. 18、No. 1、1999) は、また、RP-IIファミリーに属するバシラス・インテルメジウス (B. intermedius) からのGlu特異的プロテアーゼを開示した。
下記表1中の相同性マトリックスが明瞭に示すように、RP-IIプロテアーゼ1〜8はマトリックス中の他のGlu特異的プロテアーゼと明瞭に異なるGlu特異的プロテアーゼの独特のグループである。
1. バシラス (Bacillus) 種JA96グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ、JA96、WO 01/16285。
2. 1p3e バシラス・インテルメジウス (B. intermedius) グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ、BIP、EMBL No. Y5136、Rebrikov 他、Journal of Protein Chemistry、Vol. 18、No. 1、1999。
3. バシラス (Bacillus) 種BO32グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ、BO32、WO 01/16285。
4. バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) 、BLC、WO 01/16285 (参照: 米国特許第4,266,031号) 。
5. バシラス (Bacillus) 種CDJ31グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ、CDJ31、WO 01/16285。
7. mpr_bacsu バシラス・サチリス (B. subtilis) セリンプロテアーゼ、MPR、EP 369 817。
8. バシラス (Bacillus) 種AA513グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ、AA513、WO 01/16285
9. eta_staau スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) 剥脱性トキシンA (Lee 他、スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) からの剥脱性トキシンAおよびトキシンB遺伝子の配列の決定および比較; J. Bacteriol. 169: 3904 (1987)) 。
10. etb_staau スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) 剥脱性トキシンB (Jackson M. P. 、Iandolo J. J.; スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) の剥脱性トキシンB遺伝子の配列; J. Bacteriol. 167: 726 (1986)) 。
12. q53782 スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) (株Mu50/ATCC 700699) (Rieneck 他、“Molecular cloning and expression of a novel Staphylococcus aureus antigen”、 Biochem. Biophys. Acta 1350: 128 (1997)) 。
13. stsp_staau スタフィロコッカスのセリンプロテイナーゼV8 Glu-C (Gray、“Nucleotide sequence of the serine gene of Staphylococcus aureus, strain V8” Nucleic Acids Res. 15: 6757 (1987) 。
しかしながら、RP-IIプロテアーゼおよびスタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) からのトキシンAに属するプロテアーゼ間の配列相同性にかかわらず、スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococcus aureus) からのトキシンAの三次元構造に基づくRP-IIプロテアーゼの三次元構造のモデル化は、構造的差のために、ことにRP-IIプロテアーゼに対する配列相同性における明確な差のために、正しくない三次元構造を生ずることがある。
本発明者らは、C成分の三次元構造に基づいて、RP-IIプロテアーゼのアミノ酸配列を修飾して、改良された性質を有する変異型を構築した。変異型は、変更された性質、例えば、低温において増加した活性、増加した熱安定性、所定のpHにおいて増加した比活性、変更されたCa2+依存性、他の洗剤成分 (例えば、漂白剤、界面活性剤、およびその他) の存在下に増加した安定性およびその他を有するであろう。
こうして、最も広い面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、親RP-IIプロテアーゼと比較して少なくとも1つの変更された性質を有する親RP-IIプロテアーゼの変異型を構築する方法に関する:
ii) 親RP-IIプロテアーゼに比較して、i) において同定されたアミノ酸残基または構造的部分において修飾されたRP-IIプロテアーゼ変異型を構築し、そして
iii) 生ずるRP-IIプロテアーゼ変異型を前記性質について試験する。
表5〜表32は、BLC RP-IIプロテアーゼの解明された結晶三次元構造についての構造座標を標準的pdbフォーマットで提供する。残基は番号1〜217が付されており、カルシウムは番号301であり、そしてDAFE基質は番号401〜404である。
本発明をさらに詳細に論ずる前に、下記の用語およびコンベンションを最初に定義する。
ポリペプチドまたはタンパク質、ことにRP-IIプロテアーゼ中に遺伝子操作により導入されたアミノ酸および核酸および修飾の命名法の詳細な説明のために、WO 01/16285、5〜15ページ (引用することによって本明細書の一部とされる) が言及される。
用語 「親」 は、本発明の関係において、タンパク質変異型をつくるように修飾されるタンパク質として理解すべきである。親タンパク質は天然に存在する (野生型) ポリペプチドであることができるか、あるいは任意の適当な手段により製造されたその変異型であることができる。例えば、親タンパク質は、天然に存在するポリペプチドの、1または2以上のアミノ酸残基の置換、化学的修飾、欠失またはトランケーションにより、あるいはアミノ酸残基に対する1または2以上のアミノ酸残基の付加または挿入により、修飾された天然に存在するタンパク質の変異型であることができる。こうして、用語 「親RP-IIプロテアーゼ」 は、RP-IIプロテアーゼ変異型をつくるように修飾されるRP-IIプロテアーゼを意味する。
用語 「変異型」 は、本発明の関係において、親タンパク質に比較して1または2以上のアミノ酸残基において修飾されたタンパク質として理解すべきである。
用語 「1または2以上の修飾」 または「修飾された」は、本発明の関係において、タンパク質の化学的修飾ならびにタンパク質をコードするDNAの遺伝子操作を包含するとして理解すべきである。1または2以上の修飾は、1または2以上のアミノ酸側鎖の1または2以上の置換、問題の1または2以上のアミノ酸中のまたはそれらにおける1または2以上の置換、1または2以上の欠失および/または挿入であることができる。こうして、用語 「修飾されたタンパク質」 、例えば、「修飾されたRP-IIプロテアーゼ」は、親タンパク質、例えば、RP-IIプロテアーゼと比較して1または2以上の修飾を含有するタンパク質として理解すべきである。
用語 「相同性」 または「に対する相同性」は、本発明の関係において、その慣用の意味において理解すべきであり、そして2つのアミノ酸配列間の「相同性」は下記のGAPプログラムにより規定された「類似性」パラメーターを使用することによって決定されるべきである: University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) パッケージ、ここでアラインメントパラメーター、比較マトリックス、ギャップおよびギャップエクステンションペナルティーについてデフォルトの設定を使用する。
本発明のRP-IIプロテアーゼを記載するとき、言及を容易とするために、下記の略号を使用する:
BLC = バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) からのRP-IIプロテアーゼ (米国特許第4,266,031号) 。
AA513 = バシラス・ハルマパルス (Bacillus halmapalus) AA513からのRP-IIプロテアーゼ (WO 01/16285) 。
AC116 = バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) AC116からのRP-IIプロテアーゼ (WO 01/16285) 。
CDJ31 = バシラス・ハルマパルス (Bacillus halmapalus) CDJ31からのRP-IIプロテアーゼ (WO 01/16285) 。
JA96 = バシラス・ピュミルス (Bacillus pumilus) JA96からのRP-IIプロテアーゼ (WO 01/16285) 。
MPR = バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) IS75からのRP-IIプロテアーゼ (EP 369 817 B1) 。
BIP = バシラス・インテルメジウス (B. intermedius) からのRP-IIプロテアーゼ (Rebrikov 他、Journal of Protein Chemistry、Vol. 18、No. 1、1999) 。
添付された配列のリストにおいて、RP-IIプロテアーゼは次のように示される:
配列番号1 = BLC (DNA) 、配列番号2 = BLC (AA) 、
配列番号3 = AA513 (DNA) 、配列番号4 = AA513 (AA) 、
配列番号5 = AC116 (DNA) 、配列番号6 = AC116 (AA) 、
配列番号7 = BO32 (DNA) 、配列番号8 = BO32 (AA) 、
配列番号9 = CDJ31 (DNA) 、配列番号10 = CDJ31 (AA) 、
配列番号11 = JA96 (DNA) 、配列番号12 = JA96 (AA) 、
配列番号13 = BSMPR (DNA) 、配列番号14 = BSMPR (AA) 、
配列番号15 = BIP (DNA) 、配列番号16 = BIP (AA) 。
用語 「位置」 は、本発明の関係において、ペプチド/ポリペプチドのN-末端から計数したとき、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中のアミノ酸残基の数として理解すべきである。通常、本発明において使用する位置の数は異なるRP-IIプロテアーゼを直接言及する。
RP-IIプロテアーゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14および16の各々に従い個々に番号が付される。
しかしながら、本発明は、これら特定のRP-IIプロテアーゼの変異型に限定されず、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) RP-IIプロテアーゼ中の同定された残基と「同等」である位置にアミノ酸残基を含有する親プロテアーゼに拡張される。本発明のある好ましい態様において、親プロテアーゼはJA96またはBIP RP-IIプロテアーゼであり、そして置換は上に列挙したものに対応するJA96またはBIP中の同等のアミノ酸残基の位置においてなされる。
ii)新規な配列を同定された配列と整列させて、図2からRP-IIプロテアーゼ中の対応する位置を見出し、そして
iii) 図2からBLC中の対応する位置を確立する。
比較しかつ最も相同性の配列を見出すために、後述するようにGCGパッケージからのGAPプログラムを使用する。
アラインメントは、上に示したように、GCGパッケージバージョン8のGAPルーチンにより下記のパラメーターを使用して得ることができる: ギャップ発生ペナルティー = 3およびギャップエクステンションペナルティー = 0.1およびすべての他のパラメーターはそれらのデフォルト値に保持する。
こうして比較のために、RP-IIプロテアーゼは図2において提供されるようにBLC RP-IIプロテアーゼ (配列番号2) の位置を参照することによって番号を付される。次いで、位置は「BLCに対応する」として示される。
本発明者らは、BLCの三次元構造、配列番号2をX線結晶学により解明し、そして他のプロテアーゼ、例えば、RP-IIプロテアーゼの既知の構造と比較してこのプロテアーゼの構造中にいくつかの重要な特徴が存在することを発見した。これらの特徴は類似性および差の両方を包含する。
前述したように、RP-IIプロテアーゼは本発明の関係においてBLC (配列番号2) に対して少なくとも50%の相同性を有するプロテアーゼとして理解すべきである。特に、前記プロテアーゼはBLC、すなわち、配列番号2に対して少なくとも55%の相同性を有することができる。こうして、本発明は、BLCに対して少なくとも50%の相同性を有する変異型RP-IIプロテアーゼに関する。
a) 各々が逆平行の構成で6つの長いストランドを含んでなる、2つのβ-バレル、
b) 3つのα-ヘリックス、
c) 少なくとも1つのイオン結合部位、および
d) アミノ酸残基His、AspおよびSerを含んでなる活性部位。
BLC RP-IIプロテアーゼを使用して、本発明の基準を形成する三次元構造を解明した。
BLCの構造はX線結晶学的方法、例えば、下記の文献に記載されている方法に従い解明した: X-Ray Structure Determination、Stout G. K. およびJensen L. H. 、John Wiley & Sons, Inc. NY、1989。
BLCの三次元構造は位置3におけるIleのカルボニル酸素原子、位置5におけるSerのカルボニル酸素原子が配位した1つのカルシウムイオン、および位置161におけるAspのカルボン酸基による二座配位を有する。それ以上の配位は水分子によりなされる。
Ser 167 Ca原子〜Caイオン: 16.07Å
His 47 Ca原子〜Caイオン: 24.27Å
Asp 96 Ca原子〜Caイオン: 23.72Å
Gly 168 Ca原子〜Caイオン: 19.20Å
RP-IIプロテアーゼの三次元構造は、実施例1に示すように関係するプロテアーゼの既知構造および一般的モデル化ツールを使用してモデル化することができる。実際的な三次元モデル構造を得るための必要条件は、モデルが既知構造を有するプロテアーゼの配列に対して50%より高い、好ましくは55%より高い、さらにより好ましくは60%より高い、適切な配列相同性に基づくということである。RP-IIプロテアーゼのモデルは、図2におけるBLCに対する三次元誘導配列のアラインメントに基づいて構築することができる。
活性部位は普通プロテアーゼ領域において見出すことができ、この領域は構造的にトキシンA構造に密接に関係する。普通プロテアーゼ領域は残基58、70〜83から構成されている。普通プロテアーゼ領域は1.2より小さいRMSを有する。
中間領域は残基14〜28、29〜51、94〜104および155〜175から成る。中間領域は1.2より大きくかつ1.8より小さいRMSを有する。スタフィロコッカス・アウレウス (S. aureus) 三次元構造からのモデル化に基づく三次元構造と機能性との間の関係は、RP-IIプロテアーゼのこの領域において予測することが潜在的に困難である。
普通領域および中間領域は大部分の2つの中央β-バレル、ことにβ-バレルのストランドから成る。
こうして、スタフィロコッカス・アウレウス (S. aureus) トキシンAの三次元構造に対するRP-IIプロテアーゼ三次元構造のモデル構築に基づく赤外線構造-機能の関係は、非常に明らかでなくかつ純理的である。
RP-IIプロテアーゼのモデル構造は下記を使用して構築することができる: 表5〜表32中のBLC構造、または構造的要素 (a) 各々が逆平行の構成で6つの長いストランドを含んでなる2つのβ-バレルドメイン、(b) 3つのα-ヘリックス、(c) 少なくとも1つのアフィニティーイオン結合部位および (d) アミノ酸残基His、AspおよびSerを含んでなる活性部位を含んでなるBLC構造に類似する構造、または他のRP-IIプロテアーゼ構造、例えば、X線構造決定により確立された構造 (それらは将来商業的に入手可能となるであろう) 、およびHomologyTMプログラムまたは匹敵するプログラム、例えば、ModellerTM (両方はMolecular Simulation, Inc.、カリフォルニア州サンディゴから入手可能である) 。
異なるタンパク質の分子力学を比較すると、どのドメインが重要であるか、あるいは各タンパク質が関係するある種の性質に関連づけられるかに関するヒントを得ることができる。
本発明は、下記の工程を含んでなる、親BLC様RP-IIプロテアーゼに比較して少なくとも1つの変更された性質を有する親BLC様RP-IIプロテアーゼの変異型を製造する方法に関する:
b) 活性部位の残基のCA、CB、C、OおよびN原子の合致を通して構造を重ねることによって、BLC構造に対して親BLC様RP-IIプロテアーゼのモデルの三次元構造を比較し、
c) 工程a) における比較に基づいて親BLC様RP-IIプロテアーゼの少なくとも1つの構造的部分を同定し、ここで前記構造的部分における変更は変更された性質を生ずることが予測され、
d) 親BLC様RP-IIプロテアーゼをコードする核酸配列を修飾して、前記構造的部分に対応する位置における1または2以上のアミノ酸の欠失または置換、または前記構造的部分に対応する位置における1または2以上のアミノ酸の挿入をコードする核酸配列を製造し、
f) 製造されたプロテアーゼを単離し、
g) 単離されたプロテアーゼを精製し、そして
h) 生成したRP-IIプロテアーゼ変異型を回収する。
イオン結合部位は酵素の有意な特徴である。したがって、イオン結合部位に密接するアミノ酸残基の変更は、酵素の安定性の変更を生ずることが期待される。ことに、イオン結合部位におけるまたはその付近の電荷分布および/または静電場の強度に影響を与える修飾は、重要である。
イオン結合部位に密接する位置における修飾により、RP-IIプロテアーゼのイオン結合部位を安定化することができる。
このような修飾は、イオン結合部位に密接する位置における正に帯電したアミノ酸残基の中性または負に帯電した残基による置換、または中性残基の負に帯電した残基による置換、または正に帯電したまたは中性の残基の欠失を含んでなる。
他のRP-IIプロテアーゼにおける対応する位置は、本明細書中の図2を使用して同定できる。
BLC中の修飾D7EおよびD7Qは、これらの位置の1つにおいて適当な修飾の例である。
イオン結合部位を除去することによって、溶液中のカルシウムイオンまたは他のイオンに対する酵素の依存性を変更することができる。
BLC中のカルシウム部位の除去は、置換H114Rおよび/またはD161R、K + H144Q、N (配列番号2) により実施することができる。他のRP-IIプロテアーゼ中の構造的に対応する残基において、同様な修飾を行うことができる。
改良された安定性 (典型的には増加した熱安定性) を有する変異型は下記により得ることができる: 同定された領域の運動性の修飾、例えば、1または2以上のジサルファイド結合の導入、プロリンによる置換、1または2以上の水素結合の変更、電荷分布の変更、1または2以上の塩架橋の導入、1または2以上のアミノ酸を有する内部キャビティ中のより大きい側基の充填 (例えば、構造的に移動性である領域における) 、ヒスチジン残基の他のアミノ酸による置換、脱アミド化部位の除去、またはヘリックスのキャップ成形。
BLCの下に示す領域は酵素の結晶構造において増加した運動性を有し、そしてこれらの領域はBLCおよび他のRP-IIプロテアーゼの安定性または活性の原因となることができると現在考えられる。ことに、高度に移動性の領域を変更することによって、熱安定性を得ることができる。一般に、これらの領域の運動性を低下させることによって、熱安定性を改良することができる。下に識別する領域および位置における修飾により、酵素を改良することができる。
これらの領域における修飾は、RP-IIプロテアーゼの熱安定性に影響を及ぼすことが考えられる。修飾は好ましくは領域26〜31 (26、27、28、29、30および31); 89〜91 (89、90および91); 216〜221 (216、217、218、219、220および221) においてなされ、ことにBLCにおいて置換G30AおよびはG91Aである。同様な修飾は、他のRP-IIプロテアーゼ中の構造的に対応する残基において行うことができる。
51〜56 (すなわち、51、52、53、54、55、56) 、
88〜94 (すなわち88、89、90、91、92、93、94) 、
118〜122 (すなわち118、119、120、121、122) 、および
173〜183 (すなわち173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183) 。
これらの領域における修飾はRP-IIプロテアーゼの熱安定性に影響を及ぼすことが考えられる。修飾は領域51〜56および118〜122においてなされることが好ましい。
親RP-IIプロテアーゼに比較して改良された安定性、例えば、熱安定性を有する本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、新しいドメイン間またはドメイン内の結合を導入して、例えば、ドメイン間またはドメイン内のジサルファイド架橋を確立することによって、いっそう剛性または安定な構造を形成することができる。これはRP-II分子中の適当な位置に、1または2以上の置換または1または2以上の挿入により、システインを導入することによって実施することができる。
親RP-IIプロテアーゼに比較して改良された安定性 (典型的には改良された熱安定性または貯蔵安定性) を有する変異型は、RP-IIプロテアーゼの表面電荷分布を変化させることによって得ることができる。例えば、pHが約5以下に低下されるとき、ヒスチジン残基は典型的には正に帯電するようになり、結局、タンパク質表面上に不都合な静電的相互作用が発生することがある。RP-IIプロテアーゼの表面電荷を操作することによって、このような不都合な静電的相互作用を回避し、引き続いてRP-IIプロテアーゼのより高い安定性に導くことができる。
表面電荷分布は次のようにして修飾することができる: (a) 帯電した残基の欠失または非帯電残基の帯電した残基による置換により表面から帯電した残基を除去する、(b) 帯電した残基の挿入または帯電した残基の非帯電残基による置換を通して帯電した残基を付加する、または (c) 正に帯電した残基を負に帯電した残基で置換するか、あるいは負に帯電した残基を正に帯電した残基で置換することによって残基における電荷を復帰させる。
a) 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、少なくとも1つの帯電したアミノ酸残基を同定し、
b) 工程a) において同定された帯電した残基を欠失または非帯電アミノ酸残基との置換により修飾し、
c) 必要に応じて工程a) およびb) を反復し、
d) 工程a) 〜c) から生ずる変異型を調製し、
e) 前記変異型の安定性を試験し、そして
f) 必要に応じて工程a) 〜e) を反復し、そして
g) 親RP-IIプロテアーゼに比較して増加した安定性を有するRP-IIプロテアーゼ変異型を選択する。
a) 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、非帯電アミノ酸残基により占有されている少なくと1つの位置を同定し、そして
b) 非帯電アミノ酸残基を帯電したアミノ酸残基で置換するか、あるいはその位置に帯電したアミノ酸残基を挿入することによって、その位置における電荷を修飾する。
a) 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、少なくと1つの帯電したアミノ酸残基を同定し、そして
b) 工程a) において同定された帯電したアミノ酸残基を反対電荷を有するアミノ酸残基で置換する。
前述の方法を使用してBLCの表面上に見出されたアミノ酸残基はT109であり、そして置換T109R、K、Hは特に重要であることが考えられる。
改良された洗浄性能を示すRP-IIプロテアーゼを提供する目的で、WO 91/00345 (Novozymes A/S) および/またはWO 99/20771 (Genencor International Inc.) に示されているように、表面電荷の修飾によりRP-IIプロテアーゼを修飾することが可能である。
BLC中の変化:
T109R、K、H
Q143R、K、H
E209Q、N
D7N、S、T
Q174R、K、H
N216R、K、H
Y17R、K、H
Y95R、K、H.
対応する修飾を他のRP-IIプロテアーゼの対応する位置において実施することができる。
RP-IIプロテアーゼの改良された熱安定性は下記のようにして得ることができる: 問題のRP-IIプロテアーゼを二次構造について分析し、間隔 [-90°<φ<-40°および-180°<ψ<180°] 、好ましくは間隔 [-90°<φ<-40°および120°<ψ<180°] または [-90°<φ<-40°および-50°<ψ<10°] に制限される二面角φ (フィー) およびψ (プシー) を有するRP-IIプロテアーゼ中の残基を同定し、そしてRP-IIプロテアーゼがα-ヘリックスまたはβ-シート構造を有するにより特徴づけられる領域に位置する残基を排除する。
プロリン残基が1または2以上の同定された位置に既に存在しない場合、天然に存在するアミノ酸残基を、好ましくは問題のRP-IIプロテアーゼをコードする遺伝子に適用された位置指定突然変異誘発により、プロリン残基で置換する。BLC様プロテアーゼのグループにおいて、プロリン残基は位置18、115、185、269および293に導入することができる。したがって、好ましいBLC変異型は1または2以上の下記の置換を有する: T60P、S221P、G193PおよびV194P.
活性部位の残基から10Åより短い距離にあるアミノ酸残基はRP-IIプロテアーゼの特異性および活性に影響を及ぼす可能性がよりい強いことが期待され、したがって下記の位置に修飾を含んでなる変異型はRP-IIプロテアーゼ変異型の活性および/または特異性に変化を与えることができる: 1、8、22〜35 (22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35) 、42〜58 (42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58) 、82〜100 (82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100) 、129〜135 (129、130、131、132、133、134、135) 、141〜142、153〜156 (153、154、155、156) 、158、161〜171 (161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171) 、188〜193 (188、189、190、191、192、193) 、195、201〜207 (201、202、203、204、205、206、207) 、210、213〜214、217。
基質結合性部位は、基質モデル、例えばDAFEと接触する残基により同定される。活性部位にDAFEが結合しているBLCプロテアーゼの三次元構造座標は、表5〜表32において見出すことができる。いかなる理論にも制限されないで、基質と酵素との間の結合は基質分子から10Åの球内、特に基質分子から6Åの球内に見出される好適な相互作用により支持されると現在考えられる。このような好適な結合の例は、水素結合、強い静電的相互作用および/または疎水性相互作用である。
BLCプロテアーゼ (配列番号1) の下記の残基はペプチドDAFEから6Åの距離内に存在し、こうして前記基質との相互作用に関係づけられると考えられる: 1、2、31、32、47、48、88、91、93、96、162、163、164、165、166、167、168、190、191、192、193、194、195および201。
RP-IIプロテアーゼについて、ヘリックスのキャップ成形はBLC中の位置221に構造的に対応する位置を修飾することによって、ことにBLCにおいて修飾A221N、Tにより得ることができる。
RP-IIプロテアーゼについて、脱アミド化部位はBLCの位置213、216および222に構造的に対応する位置を修飾することによって、ことにBLC中の下記の修飾により除去することができる:
N213A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、Y、M、W、好ましくはN213L、T、S
N216A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、Y、M、W、好ましくはN216L、T、S
N222A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、Y、M、W、好ましくはN222L、T、S
また、本発明は、前述のRP-IIプロテアーゼ変異型のいずれかと、それらのアミノ酸配列に対する任意の他の修飾との組合わせを包含する。特に、酵素に改良された性質を提供することがこの分野において知られている他の修飾との組合わせが考慮される。上に示した修飾のいずれかと組合わせるべき、このような修飾の例を下に例示する。
RP-IIプロテアーゼの安定性を増加させるために、臨界的酸化部位、例えばメチオニンを、酸化に暴露されない他のアミノ酸残基で置換するか、あるいは欠失することが有利であることがある。
アルカリ性pHにおいて、Asnの側鎖を配列的に隣接するアミノ酸のNHと相互作用させて、主鎖がAsp側鎖を通して進行しているisoAsp残基を形成できることが知られている。これはタンパク質分解に対していっそう受攻性である主鎖を残すであろう。後続する残基がGlyである場合、脱アミド化は非常にいっそう起こりやすい。Glyの前のAsnまたはGlyを変化させると、これが起こることが防止され、こうしてことに熱安定性および貯蔵安定性に関して、安定性が改良されるであろう。
Asnおよび/またはGly残基は、例えば、A、Q、S、P、TおよびYから成る群から選択されるアミノ酸の残基で置換することができる。
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N182 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G183 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N182 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G183 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G193 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G193 {*、A、Q、S、P、T、Y}
およびそれらの組合わせ。
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G193 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G193 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}
およびそれらの組合わせ。
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G46 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G46 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N74 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G75 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G75{*、A、Q、S、P、T、Y}
N196 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G197 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N196 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G197 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N201 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G202 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N201 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G202 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N74 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N196 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N196{*、A、Q、S、P、T、Y}
N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201{*、A、Q、S、P、T、Y}
N196 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N196{*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201{*、A、Q、S、P、T、Y}
N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N196 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201{*、A、Q、S、P、T、Y}
N45 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N74 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N196 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201{*、A、Q、S、P、T、Y}
およびそれらの組合わせ。
N90 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G91 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N90 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G91 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N201 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G202 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N201 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G202 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N90 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N201 {*、A、Q、S、P、T、Y}
およびそれらの組合わせ。
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G69 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N103 {*、A、Q、S、P、T、Y}; G104 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N103 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G104 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192{*、A、Q、S、P、T、Y}; G196 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N192 {*、A、Q、S、P、T、Y} + G196 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N103 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N103 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}
N68 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N103 {*、A、Q、S、P、T、Y} + N192 {*、A、Q、S、P、T、Y}
およびそれらの組合わせ。
本発明のそれ以上の面によれば、自己タンパク質分解部位におけるアミノ酸を変化させることによって、自己タンパク質分解部位を除去することができる。RP-IIプロテアーゼはGluおよびAsp残基において解裂するので、同一または同様な特異性を有する親RP-IIプロテアーゼのこのような残基を、好ましくはGlu以外の任意の他のアミノ酸で置換することによって、修飾することが好ましい。
こうして、特異的BLC、CDJ31およびAC116変異型はE101A、E152A、E173A、E209A、D6A、D51A、D135A、D161A、D212A、およびそれらの二重、三重、四重、およびその他の組合わせである。さらに、特異的BLC変異型はE104AおよびD7Aである。
こうして、特異的JA96、BO32およびBIP変異型はE81A、E143A、E151A、E202A、D5A、D6A、D69A、D96A、D103A、D135A、D152A、D161A、D173A、およびそれらの二重、三重、四重、およびその他の組合わせである。
MPRにおいて、GluおよびAspは位置E7、E89a、E152、D6、D54、D92、D96、D135、D144、D161、D177およびD209において見出される。
AA513において、GluおよびAspは位置E26、E55、E94、E117、E123、E137b、E199、D40、D96、D103b、D103d、D135、D149、D154、D161、D184およびD209において見出される。
こうして、特異的AA513変異型はE26A、E55A、E94A、E117A、E123A、E137bA、E199A、D40A、D96A、D103bA、D103dA、D135A、D149A、D154A、D161A、D18A4およびD209A、およびそれらの二重、三重、四重、およびその他の組合わせである。
選択的に、自己タンパク質分解は、問題のGluまたはAsp残基後の第1および/または第2 位置を占有するアミノ酸残基をProに変化させることによって、防止することができる。例えば、これは次のようにしてBLC、CDJ31およびAC116において位置174および/または175で実施することができる:
または同様な方法により、JA96、BO32またはBIPにおいて位置152および/または153でD152P; T153P; またはD152P + T153Pとして実施することができる。
対応する変異型は、これらおよび任意の他のRP-IIプロテアーゼにおいて容易に同定される。
タンパク質を安定化するために、例えば、米国特許第5,118,623号に記載されているように、タンパク質表面におけるトリプトファン残基を置換または欠失することが有利であることがある。トリプトファン残基をF、T、QまたはGで好都合に置換することができる。こうして、本発明のそれ以上の態様において、本発明は1または2以上の下記の置換を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型に関する:
W35 {F、T、Q、G}; W88 {F、T、Q、G}; W142 {F、T、Q、G}; W217{F、T、Q、G}
CDJ31:
W142 {F、T、Q、G}; W217 {F、T、Q、G}
BO32、JA96およびBIP:
W142 {F、T、Q、G}
W30 {F、T、Q、G}; W72 {F、T、Q、G}; W142 {F、T、Q、G}
MPR:
W57 {F、T、Q、G}; W88 {F、T、Q、G}; W112 {F、T、Q、G}; W142 {F、T、Q、G}; W217 {F、T、Q、G}
洗浄性能に関して、ある種のチロシン残基をフェニルアラニンに修飾すると、洗浄性能が改良されることが発見された。いかなる特定の理論によっても拘束されないで、アルカリ性洗浄液中でこれらのTyr残基を滴定すると、マイナスの作用が生じ、これらの作用はTyr残基を他の残基、ことにPheまたはTrp、特にPheで置換することによって軽減されると考えられる。
特異的変異型の例は1または2以上の下記の置換を含んでなる: Y17 {F、W} 、Y19 {F、W} 、Y50 {F、W} 、Y72 {F、W} 、Y74 {F、W} 、Y82 {F、W} 、Y88 {F、W} 、Y95 {F、W} 、Y97 {F、W} 、Y112 {F、W} 、Y115 {F、W} 、Y117 {F、W} 、Y132 {F、W} 、Y154 {F、W} 、Y158 {F、W} 、Y163 {F、W} 、Y172 {F、W} 、Y195 {F、W} 、Y200 {F、W} 。
特異的JA96、BO32およびBIP変異型の例は1または2以上の下記の置換を含んでなる: Y19 {F、W} 、Y24 {F、W} 、Y50 {F、W} 、Y57 {F、W} 、Y64 {F、W} 、Y83 {F、W} 、Y88 {F、W} 、Y95 {F、W} 、Y112 {F、W} 、Y132 {F、W} 、Y157 {F、W} 、Y158 {F、W} 、Y195 {F、W} およびY216 {F、W} 。
AA513親RP-IIプロテアーゼにおいて、下記のチロシン残基を修飾することができる: 24、74、77、84、88、97、130、132、158、163、193a。
MPR親RP-IIプロテアーゼにおいて、下記のチロシン残基を修飾することができる: 19、28a、30、50、72、74、77、83、95、97、113、115、154、158、163、172、175、200、216。
特異的BLC変異型の例は1または2以上の下記の置換を含んでなる:
E152 {A、R、K、G}
E173A
E209A
E152G + G164R
本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、任意のこの分野において知られている方法により製造することができる。また、本発明は、本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含んでなるDNA構築物およびこのような構築物またはポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞に関する。
典型的には、プロテアーゼ変異型は親タンパク質をコードする遺伝子を位置指定突然変異誘発させ、突然変異した遺伝子を発現ベクター、宿主細胞、およびその他の中に導入することによって製造することができる。親タンパク質をコードする遺伝子は、ポリペプチドを産生する株からまたは発現ライブラリーからクローニングすることができる、すなわち、それはゲノムDNAから単離するか、あるいはcDNAから製造するか、あるいはそれらの組合わせにより製造することができる。なお、遺伝子は完全に合成的に製造された遺伝子であることができる。
ランダム突然変異誘発は、問題の示されるアミノ酸配列に移行する遺伝子の少なくとも3つの部分において、または全遺伝子内において、局在化されたまたは領域特異的ランダム突然変異誘発として適当に実施される。
親RP-IIプロテアーゼをコードするDNA配列のランダム突然変異誘発は、任意のこの分野において知られている方法を使用することによって好都合に実施することができる。
a) 親プロテアーゼをコードするDNA配列を局在化または領域特異的ランダム突然変異誘発に付し、
b) 工程a) において得られた突然変異したDNA配列を宿主細胞中で発現させ、そして
c) 親RP-IIプロテアーゼに関して変更された性質を有するRP-IIプロテアーゼを発現する宿主細胞についてスクリーニングする。
オリゴヌクレオチドを使用して突然変異誘発を実施するとき、オリゴヌクレオチドの合成間に、オリゴヌクレオチドを変化すべき位置において3つの非親ヌクレオチドでドープまたはスパイクすることができる。ドーピングおよびスパイキングは、不必要なアミノ酸のコドンが回避されるように、実施することができる。適当であると思われる任意の発表された技術、例えば、PCR、LCRまたは任意のDNAポリメラーゼおよびリガーゼを使用して、RP-IIプロテアーゼをコードするDNAの中にドープドまたはスパイクドオリゴヌクレオチドを組込むことができる。
ランダム突然変異誘発は、問題の親RP-IIプロテアーゼの一部分に好都合に局在化させることができる。これは、例えば、酵素のある種の領域が酵素の所定の性質に特に重要であることが同定されたとき、および修飾されたとき、改良された性質を有する変異型を生ずることが期待されるとき、好都合である。このような領域は、通常、親酵素の三次構造が解明され、酵素の機能に関係づけられたとき、同定することができる。
局在化ランダム突然変異誘発は下記の工程により実施ことができる:
1. 親酵素における修飾に重要な領域を選択し、
2. 選択された領域における突然変異部位および非突然変異部位を決定し、
3. 例えば、構築すべき変異型の必要な安定性および/または性能に関して、どの種類の修飾を実施すべきであるかを決定し、
4. 構造的に基準となる突然変異を選択し、
5. 工程4に関して工程3において選択された残基を調節し、
7. 必要に応じて、例えば、遺伝暗号から生ずる拘束を考慮し、例えば、停止コドンの導入を回避するために、必要とする残基を遺伝暗号の実現に調節し; 当業者は気づくように、いくつかのコドンの組合わせは実際に使用できず、適合させることが必要であろう、
8. プライマーを作り、
9. プライマーを使用することによって局在化ランダム突然変異誘発を実施し、
10. 必要な改良された性質についてスクリーニングすることによって、生ずるRP-IIプロテアーゼ変異型を選択する。
本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型をコードする核酸配列を含んでなる組換え発現ベクターは、組換えDNA手法に好都合に付すすることができ、かつ核酸配列を発現させることができる、任意のベクターであることができる。
さらに、本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞においてベクターを複製可能とするDNA配列を含んでなることができる。
本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型をコードするDNA配列は、それを導入する宿主細胞に対して相同的または異種的であることができる。宿主細胞に対して相同的である場合、すなわち、天然の宿主細胞により産生される場合、それは典型的には他のプロモーター配列に作用可能に結合されるか、あるいは適用可能な場合、その天然の環境以外において他の分泌シグナル配列および/またはターミネーター配列に作用可能に結合されるであろう。用語「相同的」は、問題の宿主生物に対して自然である酵素をコードするDNA配列を包含することを意図する。用語「異種的」は、自然における宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することを意図する。こうして、DNA配列は他の生物に由来するか、あるいは合成配列であることができる。
本発明の酵素を発現させるために、本発明の酵素をコードする核酸配列を含んでなるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた前述の宿主細胞を、典型的には、必要な分子の産生を可能とする条件下に適当な栄養培地中で培養し、次いでこれらを細胞または培養ブロスから回収する。
本発明の酵素を洗剤組成物に添加し、こうしてクリーニングまたは洗剤組成物の1構成成分とすることができる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布帛の前処理に適当な洗濯添加剤組成物およびリンス添加布帛柔軟剤組成物を包含する手によるまたは機械的洗濯洗剤組成物として配合することができるか、あるいは一般的家庭用硬質表面クリーニング作業において使用する洗剤組成物として配合することができるか、あるいは手による皿洗浄作業または機械的皿洗浄作業のために配合することができる。
一般に、1種または2種以上の選択した酵素は、選択した洗剤と適合性 (すなわち、pH最適値、他の酵素および非酵素成分、およびその他と適合性) であるべきであり、そして1種または2種以上の酵素は有効量で存在すべきである。
適当なプロテアーゼは、動物、植物または微生物由来のプロテアーゼを包含する。微生物由来は好ましい。化学的または遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼはセリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバシラス (Bacillus) に由来するもの、例えば、スブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147およびスブチリシン168 (WO 89/06279に記載されている) である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン (例えば、ブタまたはウシ由来) およびWO 89/06270およびWO 94/25583に記載されているフザリウム (Fusarium) プロテアーゼである。
好ましい商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は下記を包含する: AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、CoronaseTMおよびKannaseTM (Novozymes A/S) 、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TMおよびFN3TM (Genencor International Inc.) 。
適当なリパーゼは細菌または真菌由来である。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有効なリパーゼの例は下記由来のリパーゼを包含する: フミコラ (Humicola) (同義語Thermomyces) 、例えば、EP 258 068およびEP 305 216に記載されているフミコラ・ラヌギノサ (H. lanuginosa) (T. lanuginosa) またはWO 96/13580に記載されているフミコラ・インソレンス (H. insolens) 、シュードモナス (Pseudomonas) リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス (P. alcaligenes) またはシュードモナス・シュードアルカリゲネス (P. pseudoalcaligenes) (EP 218 272) 、シュードモナス・セパシア (P. cepacia) (EP 331 376) 、シュードモナス・スツゼリ (P. stutzeri) (GB 1,372,034) 、シュードモナス・フルオレセンス (P. fluorescens) 、シュードモナス (Pseudomonas) 種株SD 705 (WO 95/06720およびWO 96/207002) 、シュードモナス・ウィスコンシネンシス (P. wisconsinensis) (WO 96/12012) 、バシラス (Bacillus) リパーゼ、例えば、バシラス・サチリス (B. subtilis) (Dartois 他 (1993) 、Biochimica et Biophysica Acta 1131、253-360) 、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) (JP 64/744992) またはバシラス・ピュミルス (B. pumilus) (WO 91/16422) 。
好ましい商業的に入手可能なリパーゼ酵素は、LipolaseTM、Lipolase UltraTMおよびLipexTM (Novozymes A/S) である。
適当なアミラーゼ (α-および/またはβ-) は細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。アミラーゼは、例えば、バシラス (Bacillus) 、例えば、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) の特別の株から得られるα-アミラーゼを包含する (GB 1,296,839にいっそう詳細に記載されている) 。
商業的に入手可能なα-アミラーゼは下記のものを包含する: DuramlyTM、TermamylTM、FungamylTMおよびBANTM (Novozymes A/S) 、RapidaseTMおよびPurastarTM (Genencor International Inc.) 。
適当なセルラーゼは細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。適当なセルラーゼは下記由来のセルラーゼを包含する: 属バシラス (Bacillus) 、シュードモナス (Pseudomonas) 、フミコラ (Humicola) 、フザリウム (Fusarium) 、チエラビア (Thielavia) 、アクレモニウム (Acremonium) 、例えば、US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757およびWO 89/09259に開示されているフミコラ・インソレンス (Humicola insolens) 、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora thermophila) およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) から産生された真菌セルラーゼ。
商業的に入手可能なセルラーゼは下記のものを包含する: RenozymeTM、CelluzymeTMおよびCarezymeTM (Novozymes A/S) 、ClazinaseTMおよびPuradax HATM (Genencor International Inc.) およびKAC-500(B)TM (Kao Corporation) 。
適当なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有効なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス (Coprinus) 、例えば、コプリヌス・シネレウス (C. cinereus) からのペルオキシダーゼ、およびそれらの変異型、例えば、WO 93/24618、WO 95/10602およびWO 98/15257に記載されているものを包含する。
1種または2種以上の洗剤酵素は、洗剤組成物の中に、1種または2種以上の酵素を含有する別々の添加剤を添加するか、あるいはこれらの酵素のすべてを含んでなる添加剤の組合わせを添加することによって添加することができる。本発明の洗剤添加剤、すなわち、別々の添加剤または添加剤の組合わせは、例えば、粒体、液体、スラリー、およびその他として配合することができる。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒体、特に非ダスチング粒体、特に安定化された液体またはスラリーである。
洗剤組成物は1種または2種以上の界面活性剤を含んでなることができ、これらの界面活性剤は非イオン性であることができ、半極性および/またはアニオン性および/または双生イオン性の界面活性剤を包含する。典型的には、界面活性剤は0.1〜60重量%のレベルで存在する。
現在、洗剤組成物において、酵素、特に本発明の酵素は0.01〜100 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液、好ましくは0.05〜5 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液、特に0.1〜1 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液に相当する量で添加することができることが考えられる。
さらに、本発明の酵素は、WO 97/07202 (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されている洗剤配合物中に添加できる。
また、本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、食物の加工において、例えば、酪農製品、例えば、乳、クリームおよびチーズの分野において、さらに食肉および蔬菜類の加工において使用することができる。
また、本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、畜牛、家禽およびブタの飼料の加工において、ことにペット食品のために使用することができる。
また、本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、皮革の処理において使用することができる。
また、本発明のRP-IIプロテアーゼ変異型は、器具、表面、および病院、クリニックおよび食肉加工プラント、およびその他における他の物質を除染して、例えば、プリオンまたは他の感染因子を分解する方法において利用することができる。
菌株:
バシラス・サチリス (B. subtilis) DN1855: WO 01/16285に開示されている。
pNM1003: WO 01/16285に開示されている。
pSX222: WO 96/34946に開示されている。
pNM1008: 実施例2参照。
本発明は、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供し、ここで酵素をコードするDNA配列で形質転換された適当な宿主細胞を酵素の産生を可能とする条件下に培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する。
酵素をコードするDNA配列を含んでなる発現ベクターを相同宿主細胞の中に形質転換するとき、本発明の酵素の異種組換え産生を可能とすることができる。これにより、相同不純物を含まないことを特徴とする、高度に精製されたRP-IIプロテアーゼ組成物を作ることが可能である。
酵素活性は、スクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-グルタミン酸-パラニトロアニリンを基質として使用するPNAアッセイにより、測定することができる。PNAアッセイの原理は下記の文献に記載されている: Journal of American Oil Chemists Society、Rothgeb T. M.、Goodlander B. D.、Garrison P. H. およびSmith L. A. (1998) 。
標準繊維材料片は下記から入手した: EMPA St. Gallen、Lerchfeldstrasse 5、CH-9014 St. Gallen、Switzerland。ことにEMPA 116型 (血液、乳およびインキで汚した綿の繊維材料) およびEMPA 117型 (血液、乳およびインキで汚したポリエステル/綿の繊維材料) 。繊維材料を5×3 cmまたは13×3 cmの小片に切断することができる。
他の関係するプロテアーゼ株、例えば、C-03、C-05、C-10 (CFT、Center For Testmateerias、Viaardingen、netherlands) をその上使用することができる。
本発明の酵素は、WO 97/07202に開示されている洗剤配合物中で、またはwfk testgewebe GmbHまたは同様な供給会社から購入した洗剤配合物中で試験することができる。
wfk testgewebeからの試験洗剤のリスト
・ IEC 60456 A型に基づく洗剤
・ IEC 60456 B型に基づく洗剤
・ IEC 60456 C型に基づく洗剤
・ リン酸塩を含むECE参照洗剤 (1977)
・ リン酸塩を含まないECE参照洗剤 (1998)
・ AHAM標準洗剤
・ EU ECOLABEL (洗剤) 軽質洗剤
・ EU ECOLABEL (洗剤) PVP
・ Omo Multi Asco HDP (Uniliver、ブラジル)
・ Tide HDL (P & G、米国)
・ Wisk HDL (Uniliver、米国)
・ TOP HDP (ライオン、日本)
・ Attack HDP (花王、日本)
・ Ariel Regular HDP (P & G、ヨーロッパ)
・ Ariel Compact HDP (P & G、ヨーロッパ)
・ Prsil Megaeris (Henkel、ドイツ)
・ Persil (Unilever、英国)
洗剤が酵素を含有する場合、洗剤は使用前に不活性化して、洗剤中に既に存在する酵素活性を排除すべきである。これは洗剤貯蔵溶液を電子オーブン中で85℃に5分間加熱することによって実施される。電子オーブン中の洗剤貯蔵溶液の濃度は4〜20 g/lである。
他のRP-IIプロテアーゼに対するバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) プロテアーゼBLCの全体の相同性は高い。異なるRP-IIプロテアーゼ間の類似性は表1に記載されている。図2の配列アラインメントに従い、適当なモデル化ツール、例えば、AccellrysソフトウェアHomologyまたはModeller (また、Accellyrsから) またはNestのような他のソフトウェアを使用することによって、JA96プロテアーゼのモデルを構築することができる。これらのプログラムは最初の粗いモデルとして結果を提供し、ModellerおよびNestプログラムにおいていくらかの最適化が得られる。
BLCの構築および発現
RP-IIプロテアーゼBLCおよびその突然変異体をコードする遺伝子に適合した、バシラス・サチリス (B. subtilis) -大腸菌(E. coli)シャトルベクター、pNM1003、を構築した。それはWO 01/16285に記載されているようなバシラス・サチリス (B. subtilis) 発現ベクターpSX222 (WO 96/34946に記載されている) に由来する。クローニングを促進するために、pNM1008を構築してkpnI制限部位をHindIII部位の下流に導入して、ベクター内部におけるフラグメントのクローニングを促進した。バシラス (Bacillus) 中の形質転換のために、pNM1008をHindIIIで制限し、そして4350 bpのDNAフラグメントを単離し、連結した。連結混合物を使用して、コンピテントバシラス・サチリス (B. subtilis) DN1885を形質転換し、プロテアーゼ活性について選択した (WO 01/16285に記載されているように) 。
必要な修飾を含有するオリゴヌクレオチドにより産生されたPCRフラグメントの伝統的クローニング (Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor) により、分子中に特異的置換、挿入または欠失を含んでなる本発明のBLC部位特異的変異型を作る。テンプレートとして、pNM1008を使用する。突然変異のプライマー (アンチセンス) を使用する第1 PCRにおいて、MluI部位の下流に適当な反対センスプライマー (例えば、5’-CTGTGCCCTTTAACCGCACAGC (配列番号17)) を使用する。第2 PCRにおいて、KpnI消化部位から上流において適当なアンチセンスプライマー (例えば、5’-GCATAAGCTTTTACAGGTACCGGC (配列番号18)) と一緒にセンスプライマーとして、生ずるDNAフラグメントを使用する。この生ずるPCR生成物をKpnIおよびMluIで消化し、制限酵素で消化したpNM1008中に連結した。
本発明のBLC変異型を発現させるために、変異型を含んでなるpNM1008由来プラスミドをHindIIIで消化し、連結し、成分バシラス・サチリス (B. subtilis) 株の中に形質転換し、プロテアーゼ活性について選択した。
この手順は、バシラス (Bacillus) 宿主細胞中で本発明のRP-IIプロテアーゼを製造する2リットル規模の発酵物の精製に関する。
ほぼ1.6リットルの発酵ブロスを、1リットルのビーカー中で5000 rpmにおいて35分間遠心する。上清を10%の酢酸でpH 7に調節し、フィルタープレート (Seitz Supra S 100) に通して濾過する。
セファデックスG25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を一緒にし、10%の酢酸でpH 6に調節し、0.01 Mのジメチルグルタル酸、0.01 Mのホウ酸および0.002 Mの塩化カルシウムを含有する緩衝液 (水酸化ナトリウムでpH 6に調節した) と平衡化した150 mlのCMセファローズ (Sepharose) CL 6Bカチオン交換カラム (直径5 cm) に適用した。
最後に、CMセファローズカラムからのプロテアーゼ含有画分を一緒にし、0.2 μのフィルターに通して濾過する。
変異型の構築および発酵のために実施例2の技術、および上記単離手順を使用することによって、下記のRP-IIプロテアーゼおよびそれらの変異型を製造し、単離することができる。
AMSA
自動機械的応力アッセイ(Automatic Mechanical Stess Assay) (AMSA) を使用して、本発明の酵素変異型を試験する。AMSA試験を使用して、大量の小体積の酵素-洗剤溶液の洗浄性能を検査することができる。AMSAプレートは多数の試験溶液用スロットを有し、そして蓋は洗浄すべき繊維材料スワッチをすべてのスロット開口に対して堅固に絞る。洗浄時間の間に、プレート、試験溶液、繊維材料および蓋を激しく震蘯させて、試験溶液を繊維材料と接触させ、機械的応力を加える。それ以上の説明については、WO 02/42740、ことに23〜24ページの節「特別の方法の態様」を参照のこと。
アッセイを下に特定する実験条件下に実施する。使用する洗剤に関して、上において「材料および方法」の下の表3に列挙したすべての洗剤を使用することができる:
P = Int(v) - Int(r)
ここで
Int(v) は酵素変異型で洗浄した繊維材料表面の光強度値であり、そしてInt(r) は参照酵素BLCで洗浄した繊維材料表面の光強度値である。
性能スコア (S) は、次のような試験した酵素変異型の性能 (C) の合計である:
S = 2 これは変異型の性能がすべての3つの濃度 (5、10および30 nM) において参照のそれよりもすぐれることを示し、そして
S = 1 これは変異型の性能が1つまたは2つの濃度において参照のそれよりもすぐれることを示す。
ある変異型が少なくとも1つの洗剤組成物において参照よりもすぐれた性能を示す場合、その変異型は改良された洗浄性能を示すと考えられる。
性能スコアを規定に従いミニ洗浄の結果として与える:
性能スコア (S) は、次のような試験した酵素変異型の性能 (C) の合計である:
S = 2 これは変異型の性能がすべての3つの濃度 (5、10および30 nM) において参照のそれよりもすぐれることを示し、そして
S = 1 これは変異型の性能が1つまたは2つの濃度において参照のそれよりもすぐれることを示す。
ある変異型が少なくとも1つの洗剤組成物において参照よりもすぐれた性能を示す場合、その変異型は改良された洗浄性能を示すと考えられる。
下記のRP-II変異型を実施例2に示されているように構築し、実施例3に従い精製し、そして上に示したように試験した:
D7E; D7Q; H144R; D161R; D161K;
H144Q + D161R
運動性修飾:
G30A; G91A
S145C + T128C
表面変化修飾:
D7N、S、T; Y17R、K、H; Y95R、K、H; T109R、K、H; Q143R、K、H; Q174R、K、H; E209Q、N; N216R、K、H
プロリン安定性;
T60P; S221P; G193P; V194P
親および変異型の「残留活性」を規則的時間間隔において測定することによって、本発明の変異型の貯蔵安定性を決定する。しばしば、貯蔵安定性は半減期T1/2として表し、活性までの経過時間は初期値の半分である。
残留活性 = (t=iにおける活性)/( t=0における活性)×100%
タンパク質分解活性を前述したように測定する (PNAアッセイ) 。
典型的には約2 mg/mlの変異型を含有する溶液中で0.5℃/分の加熱速度において、示差走査熱量測定 (DSC) により、本発明のプロテアーゼ変異型の熱安定性を決定する。
比較発酵実験
発酵実験において、本発明のRP-II変異型を親RP-IIプロテアーゼと比較する。
変異型および親の両方をpNM1008発現ベクターの背景においてクローニングし、適当な培地中で発酵させる。
5日間の発酵後、1.5 mlの発酵培地を遠心し、前述したように、上清を使用してタンパク質分解活性 (KPNU) を測定する。
親の活性に比較してタンパク質分解活性を増加させる変異型は、親に関して改良された自己タンパク質分解安定性を有すると考えられる。
50℃およびpH 7において20分後、変異型を0.01 Mの過酢酸中で酸化安定性について試験する。
酸化または加熱により未処理の試料に関係して、熱処理された試料における残留タンパク質分解活性により結果を表す。
Claims (36)
- 下記の工程を含んでなる、親RP-IIプロテアーゼと比較して少なくとも1つの変更された性質を有するRP-IIプロテアーゼ変異型を構築する方法:
a) 前記RP-IIプロテアーゼの三次元構造を分析して、構造的考察の評価に基づいて、前記性質の変更に関連する、前記RP-IIプロテアーゼの少なくとも1つのアミノ酸残基または少なくとも1つの構造的領域を同定し、
b) 前記親をコードするポリヌクレオチドのDNAを修飾して、変異型RP-IIプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを構築し、前記変異型RP-IIプロテアーゼは、親RP-IIプロテアーゼと比較して、前記性質を変更するためにi) において同定されたアミノ酸残基または構造的部分の欠失、置換または挿入により修飾されており、
c) 適当な宿主において変異型RP-IIプロテアーゼを発現させ、そして
d) 生ずるRP-IIプロテアーゼ変異型を前記性質について試験する。 - 下記の工程を含んでなる、親BLC様RP-IIプロテアーゼに比較して少なくとも1つの変更された性質を有するBLC様RP-IIプロテアーゼ変異型を構築する方法:
a) BLCの三次元構造に基づいて親BLC様RP-IIプロテアーゼのモデル構造を製造し、
b) 活性部位の残基のCA、CB、C、OおよびN原子の合致を通して構造を重ねることによって、BLC構造に対して親BLC様RP-IIプロテアーゼのモデルの三次元構造を比較し、
c) 工程a) における比較に基づいて親BLC様RP-IIプロテアーゼの少なくとも1つの構造的部分を同定し、ここで前記構造的部分における変更は変更された性質を生ずることが予測され、
d) 親BLC様RP-IIプロテアーゼをコードする核酸配列を修飾して、前記構造的部分に対応する位置における1または2以上のアミノ酸の少なくとも1つの欠失または置換、または前記構造的部分に対応する位置における1または2以上のアミノ酸の少なくとも1つの挿入をコードする核酸配列を製造し、
e) 工程c) およびd) を繰返しN回実施し、ここでNは1または2以上の値を有する整数であり、
f) 工程a) 〜e) から生ずる変異型を調製し、
g) 前記変異型の安定性を試験し、そして
h) 必要に応じて工程a) 〜g) を反復的に実施し、
i) 親RP-IIプロテアーゼに比較して少なくとも1つの変更された性質を有するRP-IIプロテアーゼ変異型を選択し、
j) 宿主細胞中で修飾された核酸配列を発現させて、変異型RP-IIプロテアーゼを製造し、
k) 製造されたプロテアーゼを単離し、
l) 単離されたプロテアーゼを精製し、そして
m) 精製されたRP-IIプロテアーゼ変異型を回収する。 - 工程c) において親RP-IIプロテアーゼのイオン結合部位に対して10Å以下の距離に位置する、好ましくは6Å以下の距離に位置する、アミノ酸残基の位置を同定する、請求項2に記載の方法。
- 工程c) において親RP-IIプロテアーゼ中のアミノ酸残基の位置を同定し、前記位置の修飾は少なくとも1つの同定された位置の修飾によりイオン結合部位を除去する、請求項2に記載の方法。
- 工程c) において親RP-IIプロテアーゼの高度に移動性の領域中のアミノ酸残基の位置を同定する、請求項2に記載の方法。
- 工程c) において親RP-IIプロテアーゼの移動性領域中のアミノ酸残基の位置を同定する、請求項2に記載の方法。
- 工程c) において親RP-IIプロテアーゼ中のアミノ酸残基の位置を同定し、前記位置の修飾は少なくとも1つのCys残基の挿入またはそれとの置換により少なくとも1つのジサルファイド架橋をつくることができる、請求項2に記載の方法。
- 工程c) およびd) において、下記の工程により、修飾された表面電荷分布を有する親RP-IIプロテアーゼの変異型を構築する、請求項2に記載の方法:
c’) 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、少なくと1つの帯電したアミノ酸残基を同定し、そして
d’) 非帯電アミノ酸残基の欠失または置換により、工程a) において同定された帯電残基を修飾する。 - 工程c) およびd) において、下記の工程により、修飾された表面電荷分布を有する親RP-IIプロテアーゼの変異型を構築する、請求項2に記載の方法:
c”) 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、非帯電アミノ酸残基により占有されている少なくと1つの位置を同定し、そして
d”) 非帯電アミノ酸残基を帯電したアミノ酸残基で置換するか、あるいはその位置に帯電したアミノ酸残基を挿入することによって、その位置における電荷を修飾する。 - 工程c) およびd) において、下記の工程により、修飾された表面電荷分布を有する親RP-IIプロテアーゼの変異型を構築する、請求項2に記載の方法:
c''') 親RP-IIプロテアーゼの表面上において、少なくと1つの帯電したアミノ酸残基を同定し、そして
d''') 工程a) において同定された帯電したアミノ酸残基を反対電荷を有するアミノ酸残基で置換する。 - 工程c) において親RP-IIプロテアーゼ中のアミノ酸残基の位置を同定し、前記位置のProへの修飾は改良された安定性を有するRP-IIプロテアーゼ変異型をつくることができる、請求項2に記載の方法。
- 工程c) において活性部位の残基から10Åより短い距離における親RP-IIプロテアーゼ中のアミノ酸残基の位置を同定する、請求項2に記載の方法。
- 工程e) におけるNが1〜50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3または2である、請求項2〜12のいずれかに記載の方法。
- イオン結合部位に対して10Å以下の距離に存在する位置、好ましくは6Å以下の距離に存在する位置にアミノ酸残基において少なくとも1つの修飾を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型。
- 修飾が下記の位置: 1、2、3、4、5、6、7、8、143、144、145、146、158、159、160、161、162、194、199、200および201、好ましくは2、3、4、5、6、7、144、159、160および161の少なくとも1つにおいてなされており、そしてことにBLC (配列番号2) における修飾D7EおよびD7Qであり、ここで位置はBLCまたは対応する位置である、請求項14に記載の変異型。
- 修飾が正に帯電したアミノ酸残基の中性または負に帯電した残基による置換、または中性残基の負に帯電した残基による置換、または正に帯電した残基または中性の残基の欠失を含んでなる、請求項14または15に記載の変異型。
- BLCの位置144および161に対応する少なくとも1つの位置における修飾、ことにBLC (配列番号2) 中の修飾H114Rおよび/またはD161R、K + H144Q、Nにより、イオン結合部位が除去されている、請求項14に記載の変異型。
- BLCの位置26〜31 (26、27、28、29、30および31); 89〜91 (89、90および91); 216〜221 (216、217、218、219、220および221) に対応する少なくとも1つの位置における高度に移動性の領域中のアミノ酸残基に少なくとも1つの修飾を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型。
- 親がBLCであり、そして修飾がG30Aおよび/またはG91Aを含んでなる、請求項18に記載の変異型。
- BLCの位置51〜56 (51、52、53、54、55、56) 、88〜94 (88、89、90、91、92、93、94) 、118〜122 (118、119、120、121、122) および173〜183 (173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183) 、好ましくは51〜56および118〜122に対応する少なくとも1つの位置において高度に移動性の領域中に作られた少なくとも1つの修飾を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型。
- BLC中の位置128および145または対応する位置におけるアミノ酸残基のCysへの修飾、好ましくはBLCまたは対応する位置における置換S145CおよびT128Cにより提供された少なくとも1つのジサルファイド架橋を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型。
- BLCの位置7、17、95、109、143、174、209、216に対応する少なくとも1つの位置に修飾、ことにBLC (配列番号1) 中の修飾:
D7N、S、T
Y17R、K、H
Y95R、K、H、
T109R、K、H
Q143R、K、H
Q174R、K、H
E209Q、N
N216R、K、H
を含んでなる親RP-IIプロテアーゼに比較して修飾された表面電荷分布を有するRP-IIプロテアーゼ変異型。 - BLC中の位置18、115、185、269および293に対応する少なくとも1つの位置にProへの置換、ことにBLC (配列番号1) 中の1または2以上の置換: T60P、S221P、G193P、V194Pを含んでなる親RP-IIプロテアーゼに比較して改良された安定性を示すRP-IIプロテアーゼ変異型。
- 活性部位の残基から10Åより短い距離にあるBLC中の位置1、8、22〜35 (22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35) 、42〜58 (42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58) 、82〜100 (82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100) 、129〜135 (129、130、131、132、133、134、135) 、141〜142、153〜156 (153、154、155、156) 、158、161〜171 (161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171) 、188〜193 (188、189、190、191、192、193) 、195、201〜207 (201、202、203、204、205、206、207) 、210、213〜214、217に対応する位置のアミノ酸残基中に修飾を含んでなるRP-IIプロテアーゼ変異型。
- 下記の修飾の少なくとも1つの修飾をさらに含んでなる、請求項14〜24のいずれかに記載のRP-IIプロテアーゼ変異型: (i) 欠失または置換、好ましくはAsp、Gln、Ser、Pro、ThrまたはTyrとの置換により修飾されているAsn-Gly配列の一部分を形成する位置におけるアミノ酸残基; (ii) Phe、Thr、GlnまたはGlyとの置換により修飾されているTrpにより占有された位置におけるアミノ酸残基; (iii) Alaとの置換により修飾されているGluまたはAspにより占有された位置におけるアミノ酸残基; (iv) Proとの置換により修飾されているGluまたはAsp残基により占有された位置後の第1または第2 位置である位置におけるアミノ酸残基; または (v) 欠失または置換、好ましくはSerまたはAlaとの置換により修飾されているMetにより占有された位置におけるアミノ酸残基。
- 少なくとも1つから50までの位置、または1〜45位置、または1〜40位置、または1〜35位置、または1〜30位置、または1〜25位置、または1〜20位置、または1〜15位置、または1〜14位置、または1〜13位置、または1〜12位置、または1〜11位置、または1〜10位置、または1〜9位置、または1〜8位置、または1〜7位置、または1〜6位置、または1〜5位置、または1〜4位置、または1〜3位置、または1〜2位置の範囲の多数の位置において修飾され、このような修飾が示した数の位置に置換、欠失、挿入およびそれらの組合わせを含んでなる、請求項14〜25のいずれかに記載のRP-IIプロテアーゼ変異型。
- 請求項1〜26のいずれかにおいて規定されまたは製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型をコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
- 核酸配列が配列番号1、3、5、7、9、11、13または配列番号15に示す核酸配列と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の相同性を有する、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- 適当な発現宿主におけるポリペプチドの発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された、請求項27〜28のいずれかに記載の核酸配列を含んでなる単離された核酸構築物。
- 請求項29に記載の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
- 下記の工程を含んでなる請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型を製造する方法:
a) RP-IIプロテアーゼ変異型の製造を促進する条件下に請求項30に記載の組換え宿主細胞を培養し、そして
b) 変異型を回収する。 - 請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型を含んでなる洗剤組成物。
- 洗浄またはクローニングプロセスのための請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型の使用。
- 食物を加工するための請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型の使用。
- 飼料を加工するための請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型の使用。
- 皮革を処理するための請求項1〜26のいずれかにおいて規定または製造されたRP-IIプロテアーゼ変異型の使用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016528894A (ja) * | 2013-07-26 | 2016-09-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ゲノムエンジニアリング |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2336331A1 (en) * | 1999-08-31 | 2011-06-22 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
CN101490548A (zh) * | 2006-06-02 | 2009-07-22 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 蛋白质表面重建 |
US9150626B2 (en) | 2006-06-02 | 2015-10-06 | President And Fellows Of Harvard College | Protein surface remodeling |
EP2124603B1 (en) * | 2006-12-20 | 2014-11-19 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Milk protein hydrolyzates with reduced immunogenic potential |
BRPI0823506A8 (pt) | 2007-12-13 | 2018-05-15 | Danisco Us Inc Genencor Div | composições e métodos para a produção de isoprene |
MY153871A (en) | 2008-04-23 | 2015-03-31 | Danisco Us Inc | Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene |
SG10201501879PA (en) | 2009-04-23 | 2015-05-28 | Danisco Us Inc | Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants |
WO2010129023A2 (en) | 2009-04-28 | 2010-11-11 | President And Fellows Of Harvard College | Supercharged proteins for cell penetration |
EP2633043A2 (en) | 2010-10-27 | 2013-09-04 | Danisco US Inc. | Isoprene synthase variants for improved production of isoprene |
US9163263B2 (en) | 2012-05-02 | 2015-10-20 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene |
WO2015014790A2 (en) | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
EP3027749B1 (en) * | 2013-07-29 | 2019-02-06 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
US10402358B2 (en) * | 2014-09-30 | 2019-09-03 | Honeywell International Inc. | Module auto addressing in platform bus |
CN104561075A (zh) * | 2014-11-13 | 2015-04-29 | 广东省微生物研究所 | 一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法 |
WO2019157061A2 (en) * | 2018-02-06 | 2019-08-15 | Novozymes Bioag A/S | Methods of protecting a plant from fungal pests |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04166085A (ja) * | 1990-10-24 | 1992-06-11 | Shionogi & Co Ltd | 新規プロテアーゼ |
WO2001016285A2 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
Family Cites Families (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US53711A (en) | 1866-04-03 | Improvement in the construction of pulleys | ||
GB1296839A (ja) | 1969-05-29 | 1972-11-22 | ||
GB1372034A (en) | 1970-12-31 | 1974-10-30 | Unilever Ltd | Detergent compositions |
GB1483591A (en) | 1973-07-23 | 1977-08-24 | Novo Industri As | Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique |
GB1590432A (en) | 1976-07-07 | 1981-06-03 | Novo Industri As | Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced |
CH642395A5 (de) | 1978-07-04 | 1984-04-13 | Novo Industri As | Proteasen enthaltende zubereitungen zum einsatz in waschmitteln. |
US4288627A (en) | 1980-02-12 | 1981-09-08 | Phillips Petroleum Company | Oxidation of thiols employing cobalt molybdate/triethylamine catalyst |
DK187280A (da) | 1980-04-30 | 1981-10-31 | Novo Industri As | Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode |
US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US4879236A (en) | 1984-05-16 | 1989-11-07 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
DK263584D0 (da) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | Novo Industri As | Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4775624A (en) | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
WO1987000859A1 (en) | 1985-08-09 | 1987-02-12 | Gist-Brocades N.V. | Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions |
US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
AU607690B2 (en) | 1985-12-24 | 1991-03-14 | Marion Laboratories, Inc. | Use of synthetic sulfated saccharides to enhance wound healing |
US4935349A (en) | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
EG18543A (en) | 1986-02-20 | 1993-07-30 | Albright & Wilson | Protected enzyme systems |
DE3750450T2 (de) | 1986-08-29 | 1995-01-05 | Novo Industri As | Enzymhaltiger Reinigungsmittelzusatz. |
NZ221627A (en) | 1986-09-09 | 1993-04-28 | Genencor Inc | Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios |
DE353250T1 (de) * | 1987-04-06 | 1998-05-28 | Novonordisk As | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen. |
US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
CA1309680C (en) | 1987-07-24 | 1992-11-03 | David Harano | Airlift insect cell culture |
US5024947A (en) | 1987-07-24 | 1991-06-18 | Cetus Corporation | Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby |
ES2076939T3 (es) | 1987-08-28 | 1995-11-16 | Novo Nordisk As | Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola. |
JPS6474992A (en) | 1987-09-16 | 1989-03-20 | Fuji Oil Co Ltd | Dna sequence, plasmid and production of lipase |
DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
EP0394352B1 (en) | 1988-01-07 | 1992-03-11 | Novo Nordisk A/S | Enzymatic detergent |
JP3079276B2 (ja) | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体dna、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
US5776757A (en) | 1988-03-24 | 1998-07-07 | Novo Nordisk A/S | Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof |
EP0406314B1 (en) | 1988-03-24 | 1993-12-01 | Novo Nordisk A/S | A cellulase preparation |
US5118623A (en) | 1988-05-27 | 1992-06-02 | Solvay Enzymes, Inc. | Bleach stable enzymes |
CA2003078A1 (en) | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Alan Sloma | Protease deletion |
GB8910962D0 (en) | 1989-05-12 | 1989-06-28 | Natural Environment Res | Novel baculovirus expression vectors and use thereof in the expression of foreign proteins in insects or insect cells |
DK316989D0 (da) | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
US5077214A (en) | 1989-07-07 | 1991-12-31 | The Texas A&M University System | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells |
GB8915658D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-08-23 | Unilever Plc | Enzymes,their production and use |
US5162222A (en) | 1989-07-07 | 1992-11-10 | Guarino Linda A | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses |
US5155037A (en) | 1989-08-04 | 1992-10-13 | The Texas A&M University System | Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems |
DK63490D0 (da) | 1990-03-09 | 1990-03-09 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af ost |
DK0528828T4 (da) | 1990-04-14 | 1998-08-31 | Genencor Internat Gmbh | Alkaliske bacillus-lipaser, DNA-sekvenser, der koder herfor, og bacilli der producerer sådanne lipaser |
AU639570B2 (en) | 1990-05-09 | 1993-07-29 | Novozymes A/S | A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme |
DK115890D0 (da) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | Novo Nordisk As | Enzym |
EP0548228B1 (en) | 1990-09-13 | 1998-08-12 | Novo Nordisk A/S | Lipase variants |
ATE219136T1 (de) | 1991-01-16 | 2002-06-15 | Procter & Gamble | Kompakte waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven cellulasen |
AU666660B2 (en) | 1991-04-30 | 1996-02-22 | Procter & Gamble Company, The | Built liquid detergents with boric-polyol complex to inhibit proteolytic enzyme |
EP0511456A1 (en) | 1991-04-30 | 1992-11-04 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme |
KR100258460B1 (ko) | 1991-05-01 | 2000-06-01 | 한센 핀 베네드 | 안정화 효소 및 세제 조성물 |
DK72992D0 (da) | 1992-06-01 | 1992-06-01 | Novo Nordisk As | Enzym |
DK88892D0 (da) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Novo Nordisk As | Forbindelse |
KR100294361B1 (ko) | 1992-07-23 | 2001-09-17 | 피아 스타르 | 돌연변이체알파-아밀라제,세정제,접시세척제,및액화제 |
MX9306229A (es) | 1992-10-06 | 1994-05-31 | Novo Nordisk As | Variantes de celulasa y composiciones detergentes que la contienen. |
ES2126743T5 (es) | 1993-02-11 | 2010-02-05 | Genencor International, Inc. | Alfa-amilasa oxidativamente estable. |
PL306812A1 (en) | 1993-04-27 | 1995-04-18 | Gist Brocades Nv | Novel lipase variants suitable for use in detergents |
DK52393D0 (ja) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Novo Nordisk As | |
JP2859520B2 (ja) | 1993-08-30 | 1999-02-17 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物 |
CN1133062A (zh) | 1993-10-13 | 1996-10-09 | 诺沃挪第克公司 | 对过氧化氢稳定的过氧化物酶变体 |
JPH07143883A (ja) | 1993-11-24 | 1995-06-06 | Showa Denko Kk | リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ |
JP3553958B2 (ja) | 1994-02-22 | 2004-08-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 脂質分解酵素の変異体の製造方法 |
DE69536145D1 (de) | 1994-03-08 | 2011-04-07 | Novozymes As | Neuartige alkalische Zellulasen |
JP3851656B2 (ja) | 1994-05-04 | 2006-11-29 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ |
AU2884595A (en) | 1994-06-20 | 1996-01-15 | Unilever Plc | Modified pseudomonas lipases and their use |
AU2884695A (en) | 1994-06-23 | 1996-01-19 | Unilever Plc | Modified pseudomonas lipases and their use |
JPH10507073A (ja) | 1994-10-06 | 1998-07-14 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | エンドグルカナーゼ活性を有する酵素及び酵素調製品 |
BE1008998A3 (fr) | 1994-10-14 | 1996-10-01 | Solvay | Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci. |
WO1996013580A1 (en) | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Novo Nordisk A/S | An enzyme with lipolytic activity |
AR000862A1 (es) | 1995-02-03 | 1997-08-06 | Novozymes As | Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del |
JPH08228778A (ja) | 1995-02-27 | 1996-09-10 | Showa Denko Kk | 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法 |
EP0815209B2 (en) | 1995-03-17 | 2015-02-25 | Novozymes A/S | Novel endoglucanases |
US6682924B1 (en) * | 1995-05-05 | 2004-01-27 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
KR100380006B1 (ko) | 1995-05-05 | 2004-05-27 | 노보자임스 에이/에스 | 프로테아제변이체와조성물 |
WO1997007202A1 (en) | 1995-08-11 | 1997-02-27 | Novo Nordisk A/S | Novel lipolytic enzymes |
WO1997004079A1 (en) | 1995-07-14 | 1997-02-06 | Novo Nordisk A/S | A modified enzyme with lipolytic activity |
US5763385A (en) | 1996-05-14 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified α-amylases having altered calcium binding properties |
WO1998008940A1 (en) | 1996-08-26 | 1998-03-05 | Novo Nordisk A/S | A novel endoglucanase |
WO1998012307A1 (en) * | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Novo Nordisk A/S | Cellulase variants |
EP0963192B1 (en) | 1996-10-08 | 2003-01-08 | Novozymes A/S | Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors |
DE69739020D1 (de) | 1996-11-04 | 2008-11-13 | Novozymes As | Subtilase varianten und verbindungen |
JP4044143B2 (ja) | 1996-11-04 | 2008-02-06 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ズブチラーゼ変異体及び組成物 |
WO1998034946A1 (en) | 1997-02-12 | 1998-08-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis |
MA24811A1 (fr) | 1997-10-23 | 1999-12-31 | Procter & Gamble | Compositions de lavage contenant des variantes de proteases multisubstituees |
US6558939B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-05-06 | Novozymes, A/S | Proteases and variants thereof |
US6350599B1 (en) | 2000-01-12 | 2002-02-26 | Novozymes A/S | Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties |
CN1267720C (zh) | 2000-11-27 | 2006-08-02 | 诺和酶股份有限公司 | 用于筛选洗涤成分的自动机械应力分析 |
EP1995319B1 (en) * | 2002-04-10 | 2011-08-31 | Novozymes A/S | Bacillus licheniformis mutant host cell |
-
2005
- 2005-02-14 WO PCT/DK2005/000097 patent/WO2005078074A2/en active Application Filing
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2010
- 2010-04-13 US US12/758,943 patent/US8563289B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04166085A (ja) * | 1990-10-24 | 1992-06-11 | Shionogi & Co Ltd | 新規プロテアーゼ |
WO2001016285A2 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016528894A (ja) * | 2013-07-26 | 2016-09-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ゲノムエンジニアリング |
US10563225B2 (en) | 2013-07-26 | 2020-02-18 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
JP2020110152A (ja) * | 2013-07-26 | 2020-07-27 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ゲノムエンジニアリング |
JP6993063B2 (ja) | 2013-07-26 | 2022-01-13 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ゲノムエンジニアリング |
US11306328B2 (en) | 2013-07-26 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2305821A3 (en) | 2011-04-13 |
US8563289B2 (en) | 2013-10-22 |
US20100196990A1 (en) | 2010-08-05 |
WO2005078074A3 (en) | 2005-11-03 |
US20070281332A1 (en) | 2007-12-06 |
WO2005078074A2 (en) | 2005-08-25 |
EP1713919A2 (en) | 2006-10-25 |
CN102250861A (zh) | 2011-11-23 |
CN1942584B (zh) | 2011-07-27 |
EP2325318A1 (en) | 2011-05-25 |
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