JP5396270B2 - タンパク質表面のリモデリング - Google Patents
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Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年6月2日に出願された米国仮特許出願第60/810,364号(この全体の内容は、参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
本明細書に記載の研究は、国立衛生研究所の助成金(GM065400)の支援を一部受けている。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
(項目1)
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と;
複数の非保存表面残基を、生理学的なpHで正に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
(項目2)
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と;
複数の非保存表面残基を、生理学的なpHで負に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
(項目3)
前記非保存表面残基が疎水性である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記非保存表面残基が親水性であるか、または負に荷電している、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記非保存表面残基が親水性であるか、または正に荷電している、項目2に記載の方法。
(項目6)
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質の表面残基を同定する工程と;
該対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と;
該同定した非保存表面残基のそれぞれに疎水性値を割り当てる工程と;
少なくとも1個の表面残基を、生理学的なpHで荷電したアミノ酸残基で置換する工程であって、該置換されている残基がすべて同じ型の残基に変異し、該残基の型が正に荷電した残基であるか、または負に荷電した残基のいずれかである、工程と、
を含む、方法。
(項目7)
前記置換工程が、少なくとも1個の疎水性表面残基を置換する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記置換工程が、少なくとも1個の親水性表面残基を置換する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記置換工程が、少なくとも1個の荷電した表面残基を置換する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目10)
前記置換工程が、少なくとも1個の表面残基をリジン残基で置換する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目11)
前記置換工程が、少なくとも1個の表面残基をアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基で置換する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目12)
前記置換工程が、少なくとも2個の表面残基を置換する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目13)
前記置換工程が、少なくとも5個の表面残基を置換する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目14)
前記置換工程が、少なくとも10個の表面残基を置換する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目15)
前記置換工程が、少なくとも20個の表面残基を置換する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目16)
前記置換工程が、少なくとも30個の表面残基を置換する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目17)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHでより大きな正味電荷を有する修飾タンパク質が生成される、項目1、2または6に記載の方法。
(項目18)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHでより負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目2または6に記載の方法。
(項目19)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも−5より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目2または6に記載の方法。
(項目20)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも−10より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目2または6に記載の方法。
(項目21)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも−15より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目2または6に記載の方法。
(項目22)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも−20より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目2または6に記載の方法。
(項目23)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHでより正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目1または6に記載の方法。
(項目24)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも+5より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目1または6に記載の方法。
(項目25)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも+10より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目1または6に記載の方法。
(項目26)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも+15より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目1または6に記載の方法。
(項目27)
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なpHで少なくとも+20より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目1または6に記載の方法。
(項目28)
前記対象タンパク質が凝集しやすいタンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目29)
前記対象タンパク質が疎水性タンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目30)
前記対象タンパク質が膜タンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目31)
前記対象タンパク質が、過剰発現しにくいタンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目32)
前記対象タンパク質が、精製しにくいタンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目33)
前記対象タンパク質が受容体である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目34)
前記対象タンパク質が転写因子である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目35)
前記対象タンパク質が酵素である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目36)
前記対象タンパク質が構造タンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目37)
前記対象タンパク質が蛍光タンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目38)
前記対象タンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目39)
前記対象タンパク質が細胞外タンパク質である、項目1、2または6に記載の方法。
(項目40)
前記対象タンパク質がストレプトアビジンである、項目1、2または6に記載の方法。
(項目41)
前記対象タンパク質がグルタチオン−S−トランスフェラーゼである、項目1、2または6に記載の方法。
(項目42)
前記表面残基を同定する工程が、前記タンパク質の三次元構造をコンピュータモデリングする工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目43)
前記表面残基を同定する工程が、アルゴリズムを使用して、残基がタンパク質の表面に見出されるか否かを予測する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目44)
前記表面残基を同定する工程が、閾値未満のavNAPSA値を有する残基を同定する工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目45)
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、同じタンパク質ファミリーに由来する少なくとも1つの他のタンパク質と整列させる工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目46)
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、異なる種に由来する該タンパク質の少なくとも1つの他のアミノ酸配列と整列させる工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目47)
前記整列が、少なくとも2つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目45または46に記載の方法。
(項目48)
前記整列が、少なくとも3つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目45または46に記載の方法。
(項目49)
前記整列が、少なくとも5つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目45または46に記載の方法。
(項目50)
前記疎水性値を割り当てる工程が、オクタノール/水のP値を使用する工程を含む、項目6に記載の方法。
(項目51)
前記置換工程が、前記同定した疎水性表面残基を、生理学的なpHで荷電した天然アミノ酸残基で置換するように、前記タンパク質配列に突然変異を起こさせる工程を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目52)
前記天然アミノ酸残基が、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記天然アミノ酸残基が、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記天然アミノ酸残基がリジンである、項目51に記載の方法。
(項目55)
前記天然アミノ酸残基が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、項目51に記載の方法。
(項目56)
前記置換工程が、前記同定した表面残基の部位特異的突然変異誘発を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目57)
前記置換工程が、前記同定した表面残基のPCR突然変異誘発を含む、項目1、2または6に記載の方法。
(項目58)
アミノ酸配列:
(項目59)
項目58に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目60)
配列:
の項目59に記載のポリヌクレオチド。
(項目61)
アミノ酸配列:
(項目62)
項目61に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目63)
配列:
(項目64)
アミノ酸配列:
(項目65)
項目64に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目66)
配列:
(項目67)
アミノ酸配列:
(項目68)
項目67に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
(項目69)
配列:
の項目68に記載のポリヌクレオチド。
(項目70)
アミノ酸配列:
(項目71)
項目70に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
(項目72)
配列:
(項目73)
アミノ酸配列:
(項目74)
項目73に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
(項目75)
配列:
(項目76)
項目1〜57のいずれか1項に記載の方法により修飾されるタンパク質。
(項目77)
項目76に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目78)
項目1〜57のいずれか1項に記載の方法を実行するためのキット。
本発明は、タンパク質をより安定させるために修飾するシステムを提供する。本発明は、タンパク質表面の疎水性領域を修飾することにより、タンパク質の超熱力学的特性を改善することができるという認識に基づいている。本発明のシステムは、対象タンパク質の可溶性の改善、タンパク質の凝集に対する抵抗力の改善、および/またはタンパク質の復元能力の改善に特に有用である。これらの特性はすべて、タンパク質の産生、タンパク質の精製、ならびに治療薬および研究ツールとしてのタンパク質の使用に特に有用である。
「アミノ酸」:「アミノ酸」という用語は、タンパク質の基本構造サブユニットを指す。アルファアミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、およびすべてが中心の炭素原子に結合している側鎖(すなわち、R基)からなる。この中心の炭素原子は、カルボキシル基に隣接していることから、アルファ炭素と呼ばれる。天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミン酸塩、およびプロリンを含めた20個が存在する。疎水性アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンが含まれる。芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンが含まれる。極性アミノ酸には、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。含硫アミノ酸には、システインおよびメチオニンが含まれる。塩基性アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩が含まれる。非天然アミノ酸もまたタンパク質に挿入されている。ある実施形態において、「アミノ酸」という用語を使用する場合は、20個の天然アミノ酸を指している。
本発明は、タンパク質をより安定させるために修飾するシステムを提供する。前記システムは、タンパク質表面の非保存アミノ酸を、より極性の高いまたは荷電したアミノ酸残基に変更することによって機能すると考えられる。修飾するアミノ酸残基は、疎水性である場合もあれば、親水性である場合もあり、荷電している場合もあり、あるいはこれらの組み合わせである場合もある。いずれのタンパク質も、より安定した変異体を産生するために、本発明のシステムを使用して修飾される場合がある。これらの表面残基の修飾によって、タンパク質の超熱力学的特性が改善されることが明らかにされている。タンパク質が治療薬として使用されることが多くなっており、かつ研究ツールとしても依然として使用されていることから、タンパク質をより安定させるために変質させるシステムが重要であり、有用である。本発明の方法によって修飾されるタンパク質は通常、凝集に対する抵抗力を持ち、リフォールディング能力が高く、不適切なフォールディングに対する抵抗力を持ち、可溶性が高く、加熱や洗浄剤の存在といった変性条件を含めた広範な条件において一般的により高い安定性を有する。
ヒトの疾患において周知の原因であるタンパク質凝集(それぞれ参考として本明細書で援用される、Cohen,F.E.;Kelly,J.W.,Nature 2003,426,(6968),905‐9;Chiti,F.;Dobson,C.M.,Annu Rev Biochem 2006,75,333‐66)はまた、治療薬や診断薬としてタンパク質を使用する上で直面する主要な問題である(それぞれ参考として本明細書で援用される、Frokjaer,S.;Otzen,D.E.,Nat Rev Drug Discov 2005,4,(4),298‐306;Fowler,S.B.;Poon,S.;Muff,R.;Chiti,F.;Dobson,C.M;Zurdo,J.,Proc Natl Acad Sci USA 2005,102,(29),10105‐10)。タンパク質凝集の問題の見識は、天然タンパク質に関する研究から得られたものである。タンパク質は、正味電荷がゼロとなる等電点において可溶性が最低であることがかねてから知られていた(参考として本明細書で援用される、Loeb,J.,J Gen Physiol 1921,4,547‐555)。より最近になって、正味電荷のわずかな差(±3の荷電単位)により、球状タンパク質の変異体における(参考として本明細書で援用される、Chiti,F.;Stefani,M.;Taddei,N.;Ramponi,G.;Dobson,C.M.,Nature 2003,424,(6950),805‐8)、ならびにまた本質的に無秩序なペプチドにおける(参考として本明細書で援用される、Pawar,A.P.;Dubay,K.F.;Zurdo,J.;Chiti,F.;Vendruscolo,M.;Dobson,C.M.,J Mol Biol 2005,350,(2),379‐92)凝集の傾向が予測されることが明らかにされている。タンパク質によっては正味電荷の著しい変化を許容できるものもあるという最近の証拠(例えば、表面リジンの徹底的な化学的アセチル化の後に炭酸脱水酵素が触媒作用を維持するという所見(参考として本明細書で援用される、Gudiksenら、J Am Chem Soc 2005,127,(13),4707‐14))とともに、これらの所見によって本発明者等は、正味電荷を増加させるように表面を広範に変異させるプロセス(本発明者等は本明細書において「超荷電」と呼ぶ)によって、フォールディングや機能を停止させることなく、いくつかのタンパク質の可溶性および凝集抵抗を大幅に増大させられる可能性があると結論付けた。
設計手順および超荷電タンパク質配列:溶媒曝露残基(以下灰色で示す)を、公表された構造データ(それぞれ参考として本明細書で援用される、Weber,P.C.,Ohlendorf,D.H.,Wendoloski,J.J.&Salemme,F.R.Structural origins of high‐affinity biotin binding to streptavidin.Science 243,85‐88(1989);Dirr,H.,Reinemer,P.&Huber,R.Refined crystal structure of porcine class Pi glutathione S‐transferase(pGST Pl‐1)at 2.1 A resolution.J Mol Biol 243,72‐92(1994);Pedelacq,J.D.,Cabantous,S.,Tran,T.,Terwilliger,T.C.&Waldo,G.S.Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.Nat Biotechnol 24,79‐88(2006))から、AvNAPSA値(AvNAPSAとは側鎖原子当たりの平均的な隣接原子(10Å以内)である)が150未満の構造であると同定した。荷電するかまたは高い極性を有する溶媒曝露残基(DERKNQ)を、陰性超荷電(赤色)の場合はAspもしくはGluのいずれかに、陽性超荷電(青色)の場合はLysもしくはArgに変異させた。緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体中で変異させるためのさらなる表面露出位置を、GFP相同体内のこれらの位置における配列変化に基づいて選択した。ストレプトアビジン(SAV)とグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ(GST)の超荷電設計プロセスは全自動であり、まず残基は溶媒曝露によって分類された後、大部分が溶媒曝露した、荷電するかまたは高い極性を有する残基を、陽性超荷電の場合はLysに、または陰性超荷電の場合はGlu(但し、開始残基がAsnの場合はAspに)のいずれかに変異させた。
nneg:負に荷電したアミノ酸の数
ncharged:荷電アミノ酸の総数
Qnet:中性pHにおける理論上の等電点
pI:算出した等電点
n.d.:測定せず
a グアニジン変性により測定(図2c)。
b サイズ排除クロマトグラフィーにより測定。
c 100℃にて5分間の加熱、25℃への冷却、軽い遠心分離後に上清に残留するタンパク質の割合。
d 大腸菌に発現しなかったタンパク質。
以上の説明が単に本発明のある好ましい実施形態を表しているにすぎないことを、当業者であれば容易に理解するであろう。以下の特許請求の範囲で定める本発明の趣旨または適用範囲から逸脱することなく、上述の手順および組成物の種々の変更および改変を行うことが可能である。
Claims (11)
- 請求項1に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項5に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 配列:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK
の、緑色蛍光タンパク質(+48 GFP)。 - 請求項9に記載の緑色蛍光タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
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