JP2012530690A - 変異体タンパク質およびそれらを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アデノシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有し、アデノシンと結合する。
は、対応する親受容体と比較した場合、図2に示したヒトアデノシンA2A受容体の番号付けによるLeu48及びAsn284の一以上に対応する位置において異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体である。
セロトニン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有し、セロトニンに結合する。
ムスカリン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しムスカリンに結合する。
ニューロテンシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しムスカリンに結合する。
コルチコトロピン放出ホルモン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しコルチコトロピン放出ホルモンに結合する。
オレキシン受容体は当該技術分野にて良く知られている。それらはお互いに配列相同性を共有しオレキシンに結合する。
序論
クラス1のGPCRにおいて、2.46はTM2の最も保存された残基の一つである(およそLが96%、Mが2%、Iが1.5%及びV/Tが0.5%)。[非特許文献8及び9]。TM2の底に位置し、この残基の側鎖はヘリックスの束の方を向き、非常に良く保存された残基であるTM7のNPXXY(配列番号1)モチーフのN7.49、P7.50及びY7.53で構成される「マイクロスイッチ」に近接する。下記の通り、多くの異なる受容体についての我々の様々な研究は、この残基をアラニンに変異することがアゴニスト結合受容体の熱安定性を増加させることを明らかにした。意義深いことに、近傍の残基の幾つかを変異することはアゴニスト結合受容体の熱安定性を増加させる。従って、特にこの残基とその周囲の残基を変異させることは、異なるGPCRを安定化する一般的なアプローチの構成要素となる。残基によりアゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造をとる受容体の熱安定性を増加させることが可能である。
アゴニスト結合A2Aの熱安定性に対するL2.46Aの影響
アゴニスト結合型の立体構造を安定化するために、フルアゴニストのNECAに結合したA2A受容体を安定化させ得る変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。このA2Aアゴニスト結合実験において、L2.46(L48A)は最も安定化させる単一変異体である。NECAが可溶化受容体に結合した場合、(A2A−L48Aにおいて)L48側鎖を除くことでリガンド−受容体複合体の熱安定性を劇的に増加させ、結果として界面活性剤DDM中の野生型受容体に比して14℃の増加をもたらしている(図5a)。興味深いことに、この変異はアンタゴニストの結合を消滅させ(図5b)、この側鎖を取り除くことが立体構造変化を誘導し、部分的に又は完全に受容体を活性な立体構造に固定し得ることを示唆している。我々はA2A受容体のシグナル伝達の性質をCHO細胞中に受容体を過剰発現することで評価した。A2Aアゴニスト刺激は、Gs−三量体複合体を通じてシグナル伝達を引き起こし、細胞内cAMPレベルを増加させる。細胞内cAMPの増加は抗cAMP Mab抗体競合アッセイを用いることで検出及び定量化可能である。A2A−WT受容体の効力は、発表されたデータのpEC50=7.27±0.19と良く一致する。本変異体はより高い効力(pEC50=8.10±0.39)を示す。しかしながらシグナル伝達の有効性は30%に減少する(図6)。
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストSCH23390の存在下で、アラニンスキャンが5HT2C受容体において実施された。A2Aに類似して、L2.46(5HT2CのL95)をアラニンに変異させることは、この受容体に有意な安定性を与え、受容体のTmを増加させる(図7)。L95に加えて近傍のM93(L2.46から2残基離れた)をアラニンに変異させることもまたアゴニスト結合受容体に安定性を与え、結果として2.9℃の増加をもたらすことは特記すべきである。
アンタゴニスト型の立体構造にあるM4ムスカリン受容体を安定化するために、ムスカリン性アンタゴニストのNMSに結合した受容体を安定化する変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。M4のL2.46残基をアラニンに変異させることはこの受容体の熱安定性を有意には変化させない(データ非開示)。しかしながら、L71A(L2.46の3残基N末端側)が安定化変異として同定された。この変異はこの受容体のTmを約2℃増加させる(図8a)。
我々が共有する異なる受容体から得たデータは、L2.46及びその周囲の残基が受容体の異なる立体構造を安定化する重要な役割を果たしていることを明らかに示している。この領域の配列保存の高いレベルを考慮すると、この領域の残基の立体構造特異的な安定効果は異なるGPCRの一般的な特徴であるように見える。これらの変化がいかにして受容体の安定性を改良するのかは明らかでないが、これらの残基を変異させることはRとR*(活性及び不活性な状態)の間の平衡を変える可能性がある。受容体の基底状態を不安定化することは、アゴニスト結合受容体を安定化する方法の優れた第一工程であるかも知れない。逆に活性な立体構造の形成はR状態へ向けて平衡をシフトすることで、次々に基底状態を安定化する可能性がある。
受容体の発現
A2AR−(2−316)の発現はpRG/III−hs−MBP大腸菌発現ベクター及びDH5α細胞を用いて行った。細胞は、アンピシリン(100μg/mL)及びグルコース(0.2%w/v)が補充された500mLの2×TY培地を含む2Lフラスコ中で、37℃で増殖させた。OD600がおよそ0.7にて、IPTGとテオフィリンを最終濃度をそれぞれ0.5mMと100μMとして添加し温度を20℃へ下げた。22から24時間後に細胞を14mLの分量にて集菌し、30分遠心分離し−20℃で保管した。5HT2CとM4受容体は一時的にHEK293T細胞にて、製造業者のガイドラインに従って使用したGeneJuiceトランスフェクション試薬を用いて発現した。
野生型又は変異体A2AR−(2−316)を発現する大腸菌細胞の一定分量(14mL)が氷上で解凍され、細胞を500μLのバッファーA(完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ)が補充された、50mM Tris HCl mM/pH7.4;0.4MのNaCl、250μg/mLのリゾチーム(シグマ)、1mg/mLのDNAse I(シグマ))に再懸濁され、4℃で1時間インキュベートした。試料は次いで、カップ−ホーンソニケーターを使用して超音波処理された。受容体は1%DDMを添加することで可溶化され4℃で1時間インキュベートした。不溶性物質はチューブを5分間13000gで4℃にて遠心分離により除去した。可溶化した受容体は一部がNi−NTAアガロース(Qiagen)により精製された。事前にバッファーAにて平衡化された300μLのアガロースビーズを可溶化受容体700μLに添加した。界面活性剤の濃度を減らすために、50mM Tris HCl mM/pH7.4;0.4M NaClを最終体積が2mLとなるまで添加した。4℃で2時間インキュベート後に、試料を13000gで10秒間4℃で遠心分離し、バッファーB(Hepes 25mM/pH7.4 KOH,0.025% DDM)にて3回洗浄し、50mMのヒスチジンを補充したバッファーBにより4℃で30分間溶出した。上清を直接放射性リガンド結合実験に使用した。具体的には、可溶化した受容体108μLを4μM[3H]−NECAを12μLと混合し(最終濃度が400nM)、又は1μM[3H]−ZM241385を12μLと混合した(最終濃度が100nM)。試料を4℃で45分間、次いで特定温度で30分間、その後4℃で30分間インキュベートした。受容体結合及び遊離した放射性リガンドは96穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離した。
このアッセイは、クリプテートで標識された抗−cAMP Mabの存在下で色素d2で標識されたcAMPを用いる均一時間分解蛍光(HTRF)をうまく利用する。本方法は細胞により生産されたcAMPと色素d2で標識されたcAMPの間の競合免疫測定法に基づく。CHO細胞をGlutamax HamのF12、透明な底と黒壁の96穴プレート(Costar)中の10%FBSを用いて増殖した。ウエルあたり12500細胞の密度で細胞が播種され、一晩増殖し、PBSで洗浄し、次いでウエルあたり0.3μLのGeneJuice(ノバジェン)でプレインキュベートした、100ngのpCDNA−3−A2A(2−316)で形質移入した。受容体発現の48時間後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、総量50μL中ロリプラム(50μM)とアデノシンデアミナーゼの存在下で30分間異なるNECAの濃度を用いることで刺激した。希釈は、血清無しで、製造元のプロトコールに従ってHamfのF12/cAMP−d2抱合体中で実現した。アゴニスト刺激の30分後、抱合体と溶解バッファーで希釈した50μLの抗−cAMP/クリプテートをウエルあたり添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、次いでPherastar96穴時分割蛍光プレートリーダー(Ex 340nm;Em 665/620nm)を用いて読み取った。
結果
アゴニスト結合A2Aの熱安定性に対するNpxxY(配列番号1)モチーフ中の残基を変異させることの影響
A2Aアゴニスト結合研究において、アラニンスキャンによる変異の影響を二点熱安定性測定により最初に決定した。これらの実験において、野生型受容体と単一変異を含む受容体を界面活性剤DDMに可溶化し、4℃で保持されるNECAの量と、不安定化温度、例えば30℃、を決定した。不安定化温度で野生型受容体と比較した変異体受容体に対するアゴニスト結合の10%超の増加は、有意と見なされ、熱安定性の増加の指標となる。A2Aアゴニストスキャンにおいて、アスパラギン284残基(N284、N7.49)の変異は、不安定化温度において、野生型と比べて増加したアゴニスト結合により示唆された通り、増加した熱安定性をもたらした。
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストSCH23390の存在下、5HT2C受容体においてアラニンスキャンを実施した。A2Aと同様に、NPxxY(配列番号1)モチーフ内とその周囲の残基を変異させることが熱安定性の増加をもたらした。二点の熱安定性試験において、残基7.48(I363)及び7.51(L366)のアラニンへの変異は、不安定化温度で野生型受容体と比較してアゴニスト結合の増加をもたらし、安定性の増加を示している。図9はL366(NPLVY(配列番号363)モチーフのL)をアラニンへ変異させることが安定性を付与し、受容体のTmを4℃だけ増加させることを示している。
アゴニスト型の立体構造を安定化するために、アゴニストのニューロテンシン存在下、ラットのニューロテンシン受容体NTS1においてアラニンスキャンを実施した。2点の熱安定性試験において、NPxxY(配列番号1)のYを意味する残基7.53(Y369)のアラニンへの変異は、不安定化温度で野生型受容体と比較してアゴニスト結合の増加をもたらし、安定性の増加を示している。
アラニンスキャンをアンタゴニストメスレルギンの存在下、5HT2C受容体とともにアデノシンA2A受容体において同様に実施した。双方のアラニンスキャンはアンタゴニスト型の立体構造を更に安定化するために実施した。双方のスキャンにおいて、NPxxY(配列番号1)モチーフ由来のアミノ酸をアラニンに変えた場合、アンタゴニスト結合が著しく減少するように見えたのは特記すべきことである(表1)。アデノシンA2AのモチーフはNPFIY(配列番号364)であり、5HT2CにおいてはNPLVY(配列番号363)である。従って、受容体のこの領域の変異はアゴニスト型の立体構造に特異的な変異を安定化することを含み、アンタゴニストの結合に悪影響を与える。
5HT2C受容体は形質移入後約40時間後に、一時的に形質移入した哺乳動物細胞から50mM Hepes pH7.4/100mM KCl/0.5% DDM/(0.1%CHS/0.6%CHAPSがSCH23390アゴニストアッセイのために添加された)とプロテアーゼ阻害剤に可溶化された。細胞溶解物はローテータ上で4℃のままにし、次いで4℃で13200rpmにて20分間の遠心分離で除かれた。熱安定性分析が可溶性溶解物において直接実施された。Tmは108μLの溶解物を、最終濃度17nMの[N6−methyl−3H]メスレルギン放射性リガンドとともに、又は9nM[3H]SCH23390とともに4℃で1時間インキュベートすることで決定した。6つのリガンドのインキュベーションが次いで25℃から55℃の6つの異なる温度で30分間インキュベートされた。受容体に結合及び遊離の放射性リガンドがG25セファデックススピンカラムを用いて分離された。
序論
クラス2GPCRはクラス1に直接アラインメントしないがファミリーの範囲内においては構造の鍵となる役割を果たすであろう数多くの保存された残基がある。クラス2の残基L2.59はTM2においてクラス1のL2.46に相当する場所に位置する(図14)。この残基は最も保存された残基の一つである。
アンタゴニスト結合CRF1の熱安定性に対するI2.58Aの影響
アンタゴニスト型の立体構造のCRF1を安定化するために、アンタゴニストのリガンドCP−376395に結合した受容体を安定化する変異を同定するために、系統的なアラニンスキャンが実施された。I2.58をアラニンに変異させることは(I163A)、CRF1に有意な安定性を与え、熱安定性を3.9(±0.5)℃だけ増加させている(図15)。
受容体発現
CRF1受容体は、GeneJuice形質移入試薬を製造元のガイドラインに従って使用し、一時的に10cmのプレート上のHEK293T細胞に発現させた。
CRF1を発現する細胞を形質移入後約40時間後にPBSにて収集し、950μlの再懸濁バッファー(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,2×完全EDTA−フリープロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ),pH7.5)に再懸濁した。細胞は5分間氷に移す前に、120nMのCP−376395及び30nM[3H]−CP−376395により37℃で2時間インキュベートした。受容体は1%のDDMの添加により可溶化され、4℃で1時間、穏やかに攪拌してインキュベートした。不溶性物質は1600×gで4℃で10分間遠心分離して除去した。可溶化した受容体は、一部はNi−NTAアガロース(Qiagen)で精製した。Ni−NTA樹脂は平衡化バッファー(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,2×完全EDTA−フリープロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ),0.025% DDM,pH7.5)で平衡化し、400μlの50:50樹脂スラリーが個々の試料に添加された。樹脂スラリーは4℃で1時間30分穏やかな攪拌によりインキュベートし、受容体と結合させた。樹脂スラリーは次いでバッチカラムフィルタープレート(Chromabond)へ移し、1000×gで1分間遠心分離し、素通り画分は廃棄した。樹脂は1mlの洗浄バッファー(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,2×完全EDTA−フリープロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ),0.025% DDM,20mM Imidazole,pH7.5)で2回洗浄し、その後1mlの溶出バッファー(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,2×完全EDTA−フリープロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ),0.025% DDM,100mMヒスチジン,30nM[3H]−CP−376395,120nM CP−376395,pH7.5)で4℃で30分間再懸濁して溶出した。溶出した試料を直接熱安定性試験に使用した。個々の試料の120μlを氷に直接移す前に30分間特定の温度でインキュベートした。受容体結合及び遊離の放射性リガンドを次いで96穴プレートゲル濾過アッセイを用いて分離した。
オレキシン2(OX2)は睡眠−覚醒サイクルとエネルギー恒常性の調節に関与するクラス1のGPCRである。
結果
アンタゴニスト結合ヒトOX2の熱安定性に対するL2.46Aの影響
タンデムなアラニンとロイシンを系統的に変異導入する戦略が低分子アンタゴニストEMPAに結合したOX2の熱安定性を増強する変異を同定するために用いられた。OX2のL2.46(OX2のL96)のアラニンへの置換は受容体の熱安定性にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながらTyr91(L2.46の5残基N末端側)の変異は増加した安定性を与えることが見いだされ、野生型OX2と比較しTmを1℃だけ上昇させた(図16)。
熱安定性試験はM4において記載された通り以下の修正を伴って、部分的に精製された受容体において実施された。細胞溶解物は1×完全EDTAフリー阻害剤混合物(ロッシュ)を補填した50mM Tris pH7.4,150mM NaCl,1% DDMに可溶化した。放射性リガンド結合反応は、温度のポイントごとに20nmの3H−EMPA(最終濃度)と混合し1/10量溶出した受容体を用いて設定された。
Claims (52)
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体のGタンパク質共役受容体(GPCR)を生産する方法であって、該方法は親GPCRを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作ることを含み、(i)一以上の変異がiプラス又はマイナス5残基のウインドウ内に位置し、ここでiは親GPCRがクラス1GPCRである場合、親GPCRのアミノ酸残基2.46の位置であり、又は親GPCRがクラス2又は3GPCRである場合、iは親GPCRの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び/又は(ii)一以上の変異が親GPCRの膜貫通ヘリックス7のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がiプラス又はマイナス5残基のウインドウと相互作用し、増加した安定性を持つ親GPCRの一以上の変異体を与えることを含む方法。
- 工程(i)における一以上の変異がiプラス又はマイナス4残基のウインドウ内に位置し、工程(ii)における一以上の変異が親GPCRの膜貫通ヘリックス7のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がiプラス又はマイナス4残基のウインドウと相互作用する、請求項1に記載の方法。
- 親GPCRの一以上の変異体が特定の立体構造の増加した安定性を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 一以上の変異体がアゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造において、増加した安定性を有する、請求項3に記載の方法。
- 親GPCRの一以上の変異体が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なpHの任意の一以上に対して増加した安定性を有する、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- 一以上の変異体が増加した熱安定性を有する、請求項5に記載の方法。
- 親GPCRの一つ又は変異体がGタンパク質と共役することが可能であるかどうか決定される、請求項1から6の何れかに記載の方法。
- 親GPCRがクラス1GPCR又はクラス2GPCRである、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 親GPCRがアデノシン受容体、セロトニン受容体、βアドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン受容体、コルチコトロピン放出ホルモン受容体又はオレキシン受容体の何れかである、請求項8に記載の方法。
- 親GPCRの膜貫通ヘリックス7のアミノ酸配列が、該アミノ酸配列がiプラス又はマイナス5残基のウインドウと相互作用し、親GPCRがクラス1GPCRである場合、NPxxY(配列番号1)モチーフプラス又はマイナス3残基であり、又は親GPCRがクラス2GPCRである場合、SFQモチーフプラス又はマイナス3残基であり、又は親GPCRがクラス3GPCRである場合、xPKxY(配列番号4)モチーフプラスマイナス3残基である、請求項1から9の何れかに記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図2に示したヒトアデノシンA2A受容体の番号付けによるLeu48及びAsn284の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 変異体アデノシン受容体が、図2に配列が示されたヒトアデノシンA2A受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図3に示したヒト5HT2C受容体の番号付けによるMet93、Ser94、Leu95、Ile363及びLeu366の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体セロトニン受容体である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 変異体セロトニン受容体が、図3に配列が示されたヒト5HT2C受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図4に配列が示されたヒトM4ムスカリン受容体の番号付けによるLeu71に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ムスカリン受容体である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 変異体ムスカリン受容体が、図4に配列が示されたヒトM4ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図11に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるTyr369に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ニューロテンシン受容体である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 変異体ニューロテンシン受容体が、図11に配列が示されたラットニューロテンシン受容体と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項17に記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図12に示されたヒトCRF1の番号付けによるIle163に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図12に配列が示されたヒトCRF1と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項19に記載の方法。
- 親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図13に示されたヒトOX2の番号付けによるTyr91に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体オレキシン受容体である、請求項1から10に記載の方法。
- 変異体オレキシン受容体が、図13に配列が示されたヒトOX2のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項21に記載の方法。
- 請求項1から22に記載の何れかの方法で生産された親GPCRに対して増加した安定性を持つ変異体GPCR。
- 親GPCRと比較した場合、親GPCRを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有する変異体GPCRであって、(i)一以上の変異がiプラス又はマイナス5残基のウインドウ内に位置し、ここでiは親GPCRがクラス1GPCRである場合、親GPCRのアミノ酸残基2.46の位置であり、又は親GPCRがクラス2又は2GPCRである場合、iは親GPCRの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び/又は(ii)一以上の変異が、親GPCRの膜貫通ヘリックス7のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列はiプラス又はマイナス5残基のウインドウと相互作用し、該変異体GPCRが不安定化条件に曝された場合、親GPCRと比較して増加した安定性を有する変異体GPCR。
- 親GPCRと比較した場合、親GPCRを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有し、ここで(i)一以上の変異がiプラス又はマイナス5残基のウインドウ内に位置し、ここでiは親GPCRがクラス1GPCRである場合、親GPCRのアミノ酸残基2.46の位置であり、又は親GPCRがクラス2又は3GPCRである場合、iは親GPCRの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び/又は(ii)一以上の変異が、親GPCRの膜貫通ヘリックス7のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がiプラス又はマイナス5残基のウインドウと相互作用する変異体GPCRを含む組成物において、該変異体GPCRが、変異体GPCRよりも大きく親GPCRを不安定にするのに有効な不安定化条件に曝されることを特徴とする組成物。
- 変異体GPCRが変異体アデノシン受容体であって、対応する親受容体と比較した場合、図2に示されたヒトアデノシンA2A受容体の番号付けによるLeu48及びAsn284の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- アデノシン受容体が図2に配列が示されたヒトアデノシンA2A受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図3に示されたヒト5HT2C受容体の番号付けによるMet93、Ser94、Leu95、Ile363及びLeu366の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体セロトニン受容体である、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- 変異体セロトニン受容体が図3に配列が示されたヒト5HT2C受容体のアミノ酸配列にと少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項28に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図4に示されたヒトM4ムスカリン受容体の番号付けによるLeu71に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体である、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- 変異体ムスカリン受容体が、図4に配列が示されたヒトM4ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項30に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが、対応する親GPCRと比較した場合、図11に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるTyr369に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体である、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- 変異体ニューロテンシン受容体が、図11に配列が示されたラットニューロテンシン受容体のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項32に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図12に示されたヒトCRF1の番号付けによるIle163に対応する位置に異なるアミノ酸を有するコルチコトロピン放出ホルモン受容体である、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- 変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図12に配列が示されたヒトCRF1のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項34に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが、対応する親受容体と比較した場合、図13に示されたヒトOX2の番号付けによるTyr91に対応する位置に異なるアミノ酸を有するオレキシン受容体である、請求項24に記載の変異体GPCR又は請求項25に記載の組成物。
- 変異体オレキシン受容体が、図13に配列が示されたヒトOX2のアミノ酸配列と少なくとも20%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項36に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRには膜が無い、請求項23、24、及び26から37の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から37の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRがリガンドの欠損下で親GPCRと比べて増加した安定性を有する、請求項23、24及び26から38の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から38の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRがリガンドの存在下で親GPCRと比べて増加した安定性を有する、請求項23、24及び25から39の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から39の何れかに記載の組成物。
- 不安定化条件が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、極端なpH、有機溶媒、水溶液又は膜の無い環境の何れかである、請求項23、24及び26から40の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から40の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRが、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なpHの何れか一に対して増加した安定性を有する、請求項23、24及び26から41の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から41の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRが増加した安定性を有する、請求項23、24及び26から41の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から41の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRがその親よりも少なくとも1℃、より安定である、請求項43に記載の変異体GPCR又は組成物。
- 変異体GPCRが可溶化形態にある、請求項23、24及び26から44の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から44の何れかに記載の組成物。
- 変異体GPCRには実質的に他のタンパク質が無い、請求項23、24及び26から45の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から45の何れかに記載の組成物。
- 固体支持体に固定された、請求項23、24及び26から46の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から46の何れかに記載の組成物。
- 請求項23、24及び26から46の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から46の何れかに記載の組成物が固定される固体支持体。
- 請求項23、24及び26から46の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から46の何れかに記載の組成物の結晶化のための使用。
- 請求項23,24及び26から46の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から46の何れかに記載の組成物の創薬における使用。
- 変異体GPCR又は組成物がリガンド結合スクリーニング又はアッセイの開発に使用される、請求項50に記載の使用。
- 請求項23、24及び26から46の何れかに記載の変異体GPCR、又は請求項25から46の何れかに記載の組成物のバイオセンサーとしての使用。
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