JP2012530690A5

JP2012530690A5 -

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Publication number: JP2012530690A5
Application number: JP2012515557A
Authority: JP
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2013-08-01

Claims

親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を生産する方法であって、該方法は親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一以上の変異を作ることを含み、一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、任意で該方法は親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置する一以上の変異を作成することを含み、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、増加した安定性を持つ親ＧＰＣＲの一以上の変異体を与えることを含む方法。
前記方法が位置ｉに少なくとも一つの変異を作成することを含む、請求項１に記載の方法。
親ＧＰＣＲの一以上の変異体が特定の立体構造の増加した安定性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
一以上の変異体がアゴニスト型又はアンタゴニスト型の立体構造において、増加した安定性を有する、請求項３に記載の方法。
親ＧＰＣＲの一以上の変異体が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの任意の一以上に対して増加した安定性を有し、任意で一以上の変異体が増加した熱安定性を有する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
親ＧＰＣＲの一つ又は変異体がＧタンパク質と共役することが可能であるかどうか決定される、請求項１から５の何れかに記載の方法。
親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲ又はクラス２ＧＰＣＲである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
親ＧＰＣＲがアデノシン受容体、セロトニン受容体、βアドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン受容体、コルチコトロピン放出ホルモン受容体又はオレキシン受容体の何れかである、請求項７に記載の方法。
親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列が、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、ＮＰｘｘＹ（配列番号１）モチーフプラス又はマイナス３残基であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２ＧＰＣＲである場合、ＳＦＱモチーフプラス又はマイナス３残基であり、又は親ＧＰＣＲがクラス３ＧＰＣＲである場合、ｘＰＫｘＹ（配列番号４）モチーフプラスマイナス３残基である、請求項１から８の何れかに記載の方法。
親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲが、（ｉ）対応する親受容体と比較した場合、図２に示したヒトアデノシンＡ_２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体であり、任意で該変異体アデノシン受容体が、図２に配列が示されたヒトアデノシンＡ _２Ａ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｉ）対応する親受容体と比較した場合、図３に示したヒト５ＨＴ _２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体セロトニン受容体であり；任意で該変異体セロトニン受容体が、図３に配列が示されたヒト５ＨＴ _２Ｃ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｉｉ）対応する親受容体と比較した場合、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ムスカリン受容体であり；任意で該変異体ムスカリン受容体が、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｖ）対応する親受容体と比較した場合、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置に異なるアミノ酸を持つ変異体ニューロテンシン受容体であり；任意で該変異体ニューロテンシン受容体が、図１１に配列が示されたラットニューロテンシン受容体と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｖ）対応する親受容体と比較した場合、図１２に示されたヒトＣＲＦ _１の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体であり；任意で該変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図１２に配列が示されたヒトＣＲＦ _１と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｖｉ）対応する親受容体と比較した場合、図１３に示されたヒトＯＸ _２の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体オレキシン受容体であり；任意で該変異体オレキシン受容体が、図１３に配列が示されたヒトＯＸ _２のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から９の何れかに記載の方法。
請求項１から１０に記載の何れかの方法で生産された親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を持つ変異体ＧＰＣＲ。
親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有する変異体ＧＰＣＲであって、（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は２ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列はｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用し、該変異体ＧＰＣＲが不安定化条件に曝された場合、親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲ。
親ＧＰＣＲと比較した場合、親ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列において一以上の変異を有し、ここで（ｉ）一以上の変異がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウ内に位置し、ここでｉは親ＧＰＣＲがクラス１ＧＰＣＲである場合、親ＧＰＣＲのアミノ酸残基２．４６の位置であり、又は親ＧＰＣＲがクラス２又は３ＧＰＣＲである場合、ｉは親ＧＰＣＲの等価なアミノ酸残基の位置であり、及び／又は（ｉｉ）一以上の変異が、親ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス７のアミノ酸配列内に位置し、該アミノ酸配列がｉプラス又はマイナス５残基のウインドウと相互作用する変異体ＧＰＣＲを含む組成物において、該変異体ＧＰＣＲが、変異体ＧＰＣＲよりも大きく親ＧＰＣＲを不安定にするのに有効な不安定化条件に曝されることを特徴とする組成物。
変異体ＧＰＣＲが（ｉ）対応する親受容体と比較した場合、図２に示されたヒトアデノシンＡ _２Ａ受容体の番号付けによるＬｅｕ４８及びＡｓｎ２８４の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体であって；任意で該アデノシン受容体が図２に配列が示されたヒトアデノシンＡ _２Ａ受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｉ）対応する親受容体と比較した場合、図３に示されたヒト５ＨＴ _２Ｃ受容体の番号付けによるＭｅｔ９３、Ｓｅｒ９４、Ｌｅｕ９５、Ｉｌｅ３６３及びＬｅｕ３６６の何れか一以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体セロトニン受容体であり；任意で該変異体セロトニン受容体が図３に配列が示されたヒト５ＨＴ _２Ｃ受容体のアミノ酸配列にと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｉｉ）変異体ＧＰＣＲが、対応する親受容体と比較した場合、図４に示されたヒトＭ４ムスカリン受容体の番号付けによるＬｅｕ７１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体であり；任意で該変異体ムスカリン受容体が、図４に配列が示されたヒトＭ４ムスカリン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｉｖ）対応する親ＧＰＣＲと比較した場合、図１１に示されたラットニューロテンシン受容体の番号付けによるＴｙｒ３６９に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体であり；任意で該変異体ニューロテンシン受容体が、図１１に配列が示されたラットニューロテンシン受容体のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｖ）対応する親受容体と比較した場合、図１２に示されたヒトＣＲＦ _１の番号付けによるＩｌｅ１６３に対応する位置に異なるアミノ酸を有するコルチコトロピン放出ホルモン受容体であり；任意で該変異体コルチコトロピン放出ホルモン受容体が、図１２に配列が示されたヒトＣＲＦ _１のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は（ｖｉ）対応する親受容体と比較した場合、図１３に示されたヒトＯＸ _２の番号付けによるＴｙｒ９１に対応する位置に異なるアミノ酸を有するオレキシン受容体であり；任意で該変異体オレキシン受容体が、図１３に配列が示されたヒトＯＸ _２のアミノ酸配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の変異体ＧＰＣＲ又は請求項１３に記載の組成物。
変異体ＧＰＣＲには膜が無い、請求項１１、１２、及び１４の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項１３又は１４に記載の組成物。
変異体ＧＰＣＲがリガンドの欠損下で親ＧＰＣＲと比べて増加した安定性を有し、又は変異体ＧＰＣＲがリガンドの存在下で親ＧＰＣＲと比べて増加した安定性を有する、請求項１１、１２、１４及び１５の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項１３から１５の何れかに記載の組成物。
不安定化条件が、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、極端なｐＨ、有機溶媒、水溶液又は膜の無い環境の何れかであり、又は変異体ＧＰＣＲが、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの何れか一に対して増加した安定性を有する、請求項１１、１２及び１４から１６の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項１３から１６の何れかに記載の組成物。
変異体ＧＰＣＲが可溶化形態にある；又は変異体ＧＰＣＲには実質的に他のタンパク質が無い；又は変異体ＧＰＣＲが固体支持体に固定された、請求項１１、１２及び１４から１７の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項１３から１７の何れかに記載の組成物。
結晶化；又は創薬（例えばリガンド結合スクリーニング又はアッセイの開発における）のための；又はバイオセンサーとしての請求項１１、１２及び１４から１８の何れかに記載の変異体ＧＰＣＲ、又は請求項１４から１８の何れかに記載の組成物。