JP2012045000A - サブチラーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イオン−結合部位に対して10Å又はそれ以下の距離に位置する位置、好ましくは6Å又はそれ以下の距離に位置する位置におけるアミノ酸残基に少なくとも1つの修飾を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
【選択図】なし
Description
本発明は、JP170及びBPN’様サブチラーゼ、及び変更された性質、例えば安定性(例えば、熱安定性又は貯蔵安定性)Ca2+依存性、pH依存性活性、洗浄及び清浄用途における改良された性能を有するそのような変異体の構成方法に関する。
酵素は、30年以上の間、洗浄配合物の一部として洗浄産業内で使用されて来た。プロテアーゼは、商業的展望から、そのような配合物において最も適切な酵素であるが、しかし他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はそれらの酵素の混合物もまた、しばしば使用される。
最近、サブチラーゼTY145の立体構造は解明されており、そしてそれと、サブチラーゼのスブチリシンサブグループに属するBPN’の立体構造との間にいくつかの差異が存在することが見出された(PCT/DK2004/000066号)。
サブチラーゼJP170及びJP170に類似するサブチラーゼは、当業界においてはすでに知られているが、しかしその立体構造はそのようなサブチラーゼのために開示されたことはない。
添付1は、JP170の解決された結晶構造についての構造配列を示す。
配列表:
添付される配列表においては、次のアミノ酸配列が提供される:
サブチラーゼJP170(配列番号1)
サブチラーゼY(配列番号2)
サブチラーゼSD−521(配列番号3)
サブチラーゼBPN’(配列番号4)
部分配列(配列番号5)
部分配列(配列番号6)
サブチラーゼTY145(配列番号7)
現在、本発明者は、サブチラーゼJP170の立体構造を開示する。このサブチラーゼは、スブチリシンBPN’及びTY145の構造に対して大きな構造差異を有する。
それらの差異に基づいて、本発明者は、改良された性質を有する変異体を得るために、JP170型構造を有するサブチラーゼ及びBPN’型構造を有するサブチラーゼのアミノ酸配列を修飾した。それらの変異体は、変更された性質、例えば低温での高められた活性、高められた熱安定性、与えられたpHでの高められた比活性、変更されたCa2+依存性、他の洗剤成分(例えば、漂白剤、海面活性剤、等)の存在下での高められた安定性、等を有する。
従って、本発明の目的は、変更された性質を有するサブチラーゼの構成方法、特に上記のような変更された性質を有するサブチラーゼの構成方法を提供することである。
a)JP170立体構造に関しての構造の考慮の評価に基づいて、前記性質の変更のために適切なものである、サブチラーゼの少なくとも1つのアミノ酸残基又は少なくとも1つの構造領域を同定するために、親サブチラーゼの立体構造を分析し;
b)前記性質を変更するために、親サブチラーゼに比較して、a)において同定されるアミノ酸残基又は構造部分の欠失、置換又は挿入により修飾されている変異体サブチラーゼをコードするポリヌクレオチドを構成するために前記親サブチラーゼをコードするポリペプチドのDNAを修飾し;
c)適切な宿主において前記変異体サブチラーゼを発現し;そして
d)前記性質について、前記得られるサブチラーゼ変異体を試験することを含んで成る。
a)BPN’, TY145又はJP170の立体構造に基づいて親サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し;
b)活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記JP構造体に対して親サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し;
c)段階b)における比較に基づいて、親サブチラーゼの少なくとも1つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され;
e)段階c)及びd)を、N回、反復して実施し、ここでNは1又は複数の値を有する整数であり;
f)段階a)−e)に起因する変異体を調製し;
g)前記変異体の性質を試験し;
i)親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体を選択し;
j)変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し;
k)前記生成されるサブチラーゼ変異体を単離し;
l)前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し;そして
m)前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る。
本発明をさらに詳細に論じる前、次の用語及び慣例がまず定義されるであろう。
アミノ酸及び核酸の命名法の詳細な記載のために、本発明者はWO00/71691号、5ページ(引用により本明細書に組込まれる)を言及する。遺伝子操作によりポリペプチドに導入される修飾の命名法の説明が、WO00/71691号、7−12ページ(引用により本明細書に組込まれる)に見出され得る。
用語“修飾”又は“修飾された”とは、本発明においては、タンパク質の化学的修飾、及びタンパク質をコードするDNAの遺伝子操作を包含するものとして理解されるべきである。修飾は、アミノ酸側鎖の置換、興味あるアミノ酸における又はアミノ酸での置換、欠失及び/又は挿入であり得る。従って、用語“修飾されたタンパク質”、例えば“修飾されたサブチラーゼ”とは、親タンパク質、例えばサブチラーゼに比較して、修飾を含むタンパク質として理解されるべきである。
JP170型サブチラーゼの残基(アミノ酸)位置は、それがJP170サブチラーゼに存在する特定の残基又は一部に対して相同であるか(すなわち、一次又は三次構造における位置に対応する)、又は類似する場合(すなわち、化学的に結合し、反応し、又は相互作用する同じか又は類似する機能的能力を有する)、JP170サブチラーゼの残基(位置)と同等である。
JP170の三次構造(3D構造)に対する相同性を確立するために、図1における3D構造に基づく一列整列が提供されて来た。この一列整列を用いることにより、前駆体JP170型サブチラーゼのアミノ酸整列は、JP170主要配列に直接的に相互関係され得る。新規JP170型サブチラーゼに関しては、JP170における位置に対応する(3Dの基づく)位置は、
i)新規配列に対して最も相同であるJP170型サブチラーゼを図1の一列整列から同定し、
ii)図1からのJP170型サブチラーゼにおける対応する位置を見出すために、同定される配列と新規配列とを一列整列し、そして
iii) JP170におけるその対応する位置を図1から確立することにより見出される。
最も相同の配列の発見のために、下記に記載されるようなGCGパッケージからのGAPプログラムが使用される。
従って、比較のために、JP170型サブチラーゼは、図1に提供されるように、JP170サブチラーゼ(配列番号1)の位置に参照して番号付けされる。次に、位置が、“JP170に対応する”として示される。
TY145サブグループンに属するサブチラーゼは、TY145サブチラーゼ(配列番号7)の位置を言及する。また、PCT/DK2004/000066号も参照のこと。
上記に記載されるサブチラーゼの高い相同性にかかわらず、本発明者は、X−線結晶学により、JP170(配列番号1)の立体構造を解明しており、そしてそれとBPN’の立体構造との間にいくつかの差異が存在することを見出した。本発明者はさらに、スブチリシンサブグループに属するサブチラーゼの配列相同性を比較した。これは、本発明の図3に示される。
この比較に基づいて、本発明者は、スブチリシンサブグループを分割することを示唆し、その結果、JP170型サブチラーゼはBPN’サブチラーゼ及びTY145サブチラーゼのサブグループの他に、別のサブグループになる;PCT/DK2004/000066を参照のこと。
用語“JP170 サブチラーゼ”又は“JP170型サブチラーゼ”とは、本発明においては、Siezen など. Protein Science 6 (1997) 501-523によれば、スブチリシングループに属し、そしてJP170(配列番号1)に対して少なくとも58%の相同性を有するサブチラーゼとして理解されるべきである。特に、JP170型サブチラーゼは、JP170、すなわち配列番号1に対して、少なくとも60%、例えば少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の相同性を有することができる。従って、中でも、アルカリプロテアーゼKP43、KP1790, KP9860, プロテアーゼYa, プロテアーゼ E-1 及び SD-521は、サブチラーゼのJP170サブグループに属するサブチラーゼである。
タンパク質又はその一部のための1組の構造座標が、形状を立体的に定義する相対的組の点であることは当業者に良く知られているので、完全に異なった組の配列が同一又は類似する形状を定義できることが可能である。さらに、個々の座標におけるわずかな変動は全体的な形状に対して、ほとんどか又はまったく影響を与えない。
そのような変動が、添付1の構造座標に比較して、許容できる標準誤差内、例えば0.8Åである場合、前記立体構造は、添付1の構造に対して相同であるものとして理解される。標準誤差は典型的には、例えば保存される主鎖残基の平均平方根の偏差として測定され得、ここで用語“二乗平均偏差”(RMS)とは、平均から偏差の平方の相加平均の平方根を意味する。
a)7個の鎖を有するねじれたβ−シート、
b)6個のαヘリックス、
c)少なくとも3個のイオン−結合部位を含んで成り、そしてBPN’様サブチラーゼの強及び弱イオン−結合部位を包含しないものとして特徴づけられる。
さらに、本発明のJP170サブチラーゼをコードする単離された核酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補的鎖と、好ましくは低い緊縮条件下で、少なくとも中位の緊縮条件下で、少なくとも中位/高い緊縮条件下で、少なくとも高い緊縮条件下で、少なくとも非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする。
BPN’サブチラーゼ”又はBPN’型サブチラーゼとは、本発明においては、Siezen など. Protein Science 6 (1997) 501-523によれば、スブチリシングループに属し、そして配列番号4に対して少なくとも61%の相同性を有するサブチラーゼとして理解されるべきである。特に、BPN’サブチラーゼは、BPN’、すなわち配列番号4に対して、少なくとも65%、例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の相同性を有することができる。
R. J. Siezen and J. A. M Leunissen (Protein science, Vol. 6 (3), pp. 501-523,1997) ページ502の図1に関して、サブチラーゼの構造が、サブチラーゼか6〜8個のヘリックスから成り、それらの11個の鎖のうち7個の鎖はねじれたβ−シートの中心であるものとして記載されている。2個のイオン結合部位、いわゆる“強”及び“弱”カルシウム−結合部位が言及されている。いくつかの構造(スブチリシンDY PDB no.1BH6, 1998)に関しては、弱カルシウム−結合部位が、結晶化媒体におけるカルシウム濃度が低い場合、Na(ナトリウム)結合部位であることが示されていることが後に発見された。従って、次に、本発明者は、カルシウム−結合部位の代わりにイオン−結合部位を言及する。
TY145サブチラーゼ”又はTY145型サブチラーゼとは、本発明においては、配列番号7に対して少なくとも63%の相同性を有するサブチラーゼとして理解されるべきである。特に、TY145サブチラーゼは、TY145、すなわち配列番号7に対して、少なくとも65%、例えば少なくとも70%、少なくとも74%、少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の相同性を有することができる。
a)7個の鎖を有するねじれたβ−シート、
b)6個のαヘリックス、
c)少なくとも3個のイオン−結合部位を含んで成り、ここでBPN’型サブチラーゼの強イオン−結合部位は存在しない。
JP170サブチラーゼが、本発明のための基礎を形成する立体構造を解明するために使用された。
JP170の構造を、X-Ray Structure Determination, Stout, G. K. and Jensen, L. H. , JohnWiley & Sons, Inc. NY, 1989に与えられるようなX−線結晶学方法についての原理に従って解決した。
触媒ドメインの構造は、スブチリシンのS8ファミリーに見出されるのと同じ全体的折りたたみを示す。その構造は、次の連続的な順序S2, S3, S1, S4, S5, S6, S7で配置される7種の鎖を有するねじれたβ−シートを含んで成る。
番号H1が残基9−17を含み、H2が残基68−76を含み、H3残基110−119を含み、H4が残基139−150を含み、H5が残基253−273を含み、そしてH6が残基281−291を含む、触媒ドメイン構造に6種のαヘリックスが存在する。
部位1−A601CAと称するカルシウム原子、
部位2−A603CAと称するカルシウム原子、及び
部位3−PDB表(添付1)においてA602CAと称するカルシウム原子。
a)イオン−結部位1と、
i)Asp c−α原子との間の距離が26.70-28.70Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が22.10−24.10Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が16.95−18.95Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が15.30−17.30Åであり、
b)イオン−結部位2と、
i)Asp c−α原子との間の距離が33.50-35.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が37-39Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が29.40-31.40Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が30.70-32.70Åであり、
c)イオン−結部位3と、
i)Asp c−α原子との間の距離が41.50-43.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が42.90-44.90Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が34.50-36.50Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が35-37Åである。
金属イオンから10Åの距離までイオン−結合部位2を制限するペプチド構造は、残基378−393から構成される。
金属イオンから10Åの距離までイオン−結合部位3を制限するペプチド構造は、残基348, 350,352, 363-370,380-383, 391-400 及び 414- 420から構成される。
BPN’様サブチラーゼ構造への比較においては、JP170様サブチラーゼの構造は、“コアーサブチラーゼ−様”領域、“中間”領域及び“非相同”領域に分割され得る。
活性部位は、BPN’構造に構造的に密接に関連するコアーサブチラーゼ−様領域に見出され得る。コアーサブチラーゼ−様領域は、残基17−34、197−202及び216−232から構成され、そしてα−ヘリックスH3及び中央のα−ヘリックスH5を含み、ここで活性部位セリン残基はN−末端部分に位置する。コアーサブチラーゼ−様領域は、1.2よりも低いRMSを有する。
中間領域は、残基42−46、150−186、245−272及び278−296から成る。中間領域は、1.2〜1.8のRMSを有する。立体構造と官能価との間の関係は、JP170様サブチラーゼのこの領域において予測することは実質的に困難である。
JP170様サブチラーゼの3D構造における多くのループは、BPN’型構造とは、アミノ酸残基の長さ及び包含量において有意に異なる。JP170の次のループ又はタンパク質配合範囲を、サルビナーゼ(括弧内に番号付けされるBPN’)に比較する(図4参照):
E44-Y54 (P40-A48)
G57-G67 (V51-G63)
N79-N82(I75-V81)
I96-P107 (V95-S105)
A108-S119 (106-N117)
A131-Y137 (S128-S132)
T138-D152 (A133-G146)
E162-I169 (S156-I165)
G173-T180 (A169-A176)
E185-N199 (D181-N184)
G208-D218(G193-D197)
S232-K246(G211-T213)
D294-N303 (S256-L262)。
さらに、JP170ループS232−K246の残基からC12インヒビターの原子までの距離が計算され得る。それらの距離は次の通りである:
W240のCA原子〜CI2におけるR62のCA原子:7.49Å
F239のCA原子〜CI2におけるR62のCA原子:8.39Å
S238のCA原子〜CI2におけるR62のCA原子:8.42Å
S237のCA原子〜CI2におけるR62のCA原子:9.44Å
S238のCA原子〜CI2におけるE60のCA原子:9.42Å。
S254のCA原子〜CI2におけるE60のCA原子:5.25Å
S254のCA原子〜CI2におけるR62のCA原子:11.55Å
S254のCA原子〜CI2におけるT58のCA原子:7.06Å
S254のCA原子〜CI2におけるM59のCA原子:4.71Å。
好ましくはJP170様サブチラーゼ変異体は、ループを部分的に、又は完全に除去するために、領域S232−K246に欠失、及び1又は複数の残基の続く挿入を有する。好ましい変異体は、L233−S245の欠失+Asnの挿入、L233−D244の欠失+Glyの挿入又はS232−D244の欠失+Glyの挿入を含んで成る。
類似する考慮が、TY145構造に対する差異に関して行われ得る。
JP170型サブチラーゼ、BPN’型サブチラーゼ又はTY145型サブチラーゼのモデル構造を、相同性プログラム又は比較プログラム、例えばModellerを用いて構築することができる(両者とも、Molecular Simulations, Inc., San Diego, CAからである)。その原理は、モデル3D構造が構成されるべきであるタンパク質のアミノ酸配列と、その3D構造が知られているタンパク質のアミノ酸配列とを一列整列することである。次に、構造的に保存された領域が、コンセンサス配列に基づいて構築され得る。相同性を欠いている領域においては、ループ構造が挿入され得るか、又は配列が、例えばプログラムHamologyを用いて必要な残基の続く結合により欠失され得る。構造の続く緩和及び最適化が、Homology、又はもう1つの分子シミュレーションプログラム、例えばMolecular SimulationsからのCHARMmのいずれかを用いて行われるべきである。
異なったタンパク質の分子力学の比較が、ドメインが重要であるか、又は個々のタンパク質により適合される一定の性質に関連づけられるヒントを与えることができる。
a)JP170立体構造に関しての構造の考慮の評価に基づいて、前記性質の変更のために適切なものである、サブチラーゼの少なくとも1つのアミノ酸残基又は少なくとも1つの構造領域を同定するために、親サブチラーゼの立体構造を分析し;
b)前記性質を変更するために、親サブチラーゼに比較して、a)において同定されるアミノ酸残基又は構造部分の欠失、置換又は挿入により修飾されている変異体サブチラーゼをコードするポリヌクレオチドを構成するために前記親サブチラーゼをコードするポリペプチドのDNAを修飾し;
c)適切な宿主において前記変異体サブチラーゼを発現し;そして
d)前記性質について、前記得られるサブチラーゼ変異体を試験することを含んで成る。
a)BPN’, TY145又はJP170の立体構造に基づいて親サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し;
b)活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記JP構造体に対して親サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し;
c)段階b)における比較に基づいて、親サブチラーゼの少なくとも1つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され;
e)前記段階c)及びd)を、N回、反復して実施し、ここでNは1又は複数の値を有する整数であり;
f)段階a)−e)に起因する変異体を調製し;
g)前記変異体の性質を試験し;
i)親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体を選択し;
j)変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し;
k)前記生成されるサブチラーゼ変異体を単離し;
l)前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し;そして
m)前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る。
1つの態様においては、親サブチラーゼは、好ましくはABSS168, BASBPN, BSSDY, 及び BLSCARから成る群から選択されたサブグループI−S1、又はサブグループI−S1の特徴を保持するその機能的変異体に属する。
さらなる態様においては、親サブチラーゼは、好ましくはTY145、プロテアーゼS41(TA41プロテアーゼとも呼ばれる)、プロテアーゼS39(TA39サブチラーゼとも呼ばれる)、等から選択されたTY145型に属する。
特に、親サブチラーゼは、好ましくはJP170, KP43, KP9860, プロテアーゼ E-1, プロテアーゼ Ya, プロテアーゼ SD-521, 等から成る群から選択されたJP170型サブグループに属する。
a)JP170の立体構造に基づいて親JP170型サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し;
b)活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記BPN’又はTY145構造体に対して親JP170型サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し;
c)段階b)における比較に基づいて、親JP170型サブチラーゼの少なくとも1つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され;
e)段階c)及びd)を、N回、反復して実施し、ここでNは1又は複数の値を有する整数であり;
f)段階a)−e)に起因するJP170型サブチラーゼ変異体を調製し;
g)前記変異体の性質を試験し;
h)任意には、段階a)−g)を、繰り返して反復し;
j)変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し;
k)前記生成されるJP170型サブチラーゼ変異体を単離し;
l)前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し;そして
m)前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る、親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有する、JP170型サブチラーゼ変異体を低めるための方法に関する。
安定性−イオン−結合部位の変更:
上記のように、添付1に提供されるようなJP170サブチラーゼの立体構造は、BPN’スブチリシン構造に存在しない3個のイオン−結合部位の存在を示し、従ってBPN’サブチラーゼの強及び弱イオン結合部位を欠いている。イオン−結合部位の安定性は、酵素の官能価のために重要である。従って、イオン−結合部位の変更は、酵素の安定性の変更をもたらす。
JP170サブチラーゼの安定化はたぶん、イオン−結合部位に密接する位置における変更により得られる。従って、本発明の方法の1つの態様においては、上記段階(c)は、JP170型親のイオン−結合部位まで10Å又はそれ以下の距離に位置するアミノ酸残基位置、好ましくは6Å又はそれ以下の距離に位置する位置を同定する。
従って、本発明の好ましい変異体は、JP170(配列番号1)のイオン−結合部位まで10Åの距離に位置する1又は複数の位置に修飾を有する。それらの位置は、下記の通りである:
191-204 (すなわち、位置191,192, 193,194, 195,196, 197,198, 199,
200,201, 202,203, 204),
224-225;
部位2:378-393 (すなわち、位置378,379, 380,381, 382,383, 384,385, 386,387,
388,389, 390,391, 392,393) ;
部位3:348, 350, 352,
363-370 (すなわち、位置363,364, 365,366, 367,368, 369,370),
380-383 (すなわち、位置380,381, 382,383),
391-400 (すなわち、位置391,392, 393,394, 395,396, 397,398, 399,400),
414-420 (すなわち、位置414,415, 416,417, 418,419, 420)。
洗剤組成物においては、カルシウムキレート化剤は、サブチラーゼからのカルシウムの除去に寄与し、そしてその結果として、酵素の続く不活性化をもたらす。例えば、カルシウムキレート化剤のカルシウム除去による不活性化を低めるために、改良されたカルシウム安定性を有する変異体が構成された。
イオン−結合部位2において安定化された好ましい変異体は、N390D及びN391Dであり、そしてイオン−結合部位3において安定化された好ましい変異体は、G394N, Q, F, Y, S 及びW392S, N, Qである。
改良された安定性(典型的には高められた熱安定性)を有する変異体は、プロリンによる置換、ジスルフィド結合の導入、水素結合接触の変更、電荷分布の変更、塩架橋の導入、より大きな側基(例えば、構造的に移動する領域における)を有する1又は複数のアミノ酸による内部構造キャビティーのフィルイン、他のアミノ酸によるヒスチジン残基の置換、脱アミド化部位の除去、又はヘリックスキャッピングにより得られる。
JP170の次の領域は、酵素の結晶構造において高められた移動度を有し、そしてそれらの領域がJP170の安定性又は活性を担当すると現在思われている。特に熱安定化はたぶん、高い移動性の領域を変更することにより得られる。酵素の改良は、下記領域及び位置における突然変異により得られる。より大きな残基、又は側鎖に多くの原子を有する残基の導入が安定性を高めることができ、又は側鎖により少ない原子を有する残基の導入は、移動度、及び従って、酵素の活性プロフィールのために重要である。
13-18 (すなわち、位置13,14, 15,16, 17,18),
37-43 (すなわち、位置37,38, 39,40, 41,42, 43),
47-50 (すなわち、位置47,48, 49,50),
57-59 (すなわち、位置57,58, 59),
96-103 (すなわち、位置96,97, 98,99, 100,101, 102,103),
131-134 (すなわち、位置131,132, 133,134),
152-153
188-195 (すなわち、位置188,189, 190,191, 192,193, 194,195),
210
234-246 (すなわち、位置234,235, 236,237, 238,239, 240,241, 242, 243,244, 245, 246),
372-378 (すなわち、位置372,373, 374,375, 376,377,378),
387-392 (すなわち、位置387,388, 389,390, 391,392),
406-407
419。
37-42 (すなわち、位置37,38, 39,40, 41,42),
57-60 (すなわち、位置57,58, 59,60),
66-67,
98-103 (すなわち、位置98,99, 100,101, 102,103),
107-111 (すなわち、位置107,108, 109,110, 111),
188-193 (すなわち、位置188,189, 190,191, 192,193),
236-240 (すなわち、位置236,237, 238,239, 240),
326-332 (すなわち、位置326,327, 328,329, 330,331, 332),
337-342 (すなわち、位置337, 338,339, 340,341, 342),
355-360 (すなわち、位置355,356, 357,358, 359,360),
372-377 (すなわち、位置372,373, 374,375, 376,377),
384-388 (すなわち、位置384,385, 386,387, 388),
404-411 (すなわち、位置404,405,406, 407,408, 409,410, 411)。
野生型 修飾された
95% 5% G355A, S
90% 10% S356T, N
80% 20% T357N, Q, D, E, P
90% 10% T358S
80% 20% A359S, T,N,Q
80% 20% S360T, N
親JP170に比較して、改良された安定性、例えば熱安定性を有する本発明のJP170変異体が、新規ドメイン間、又はドメイン内結合を導入することにより、例えばドメイン間又はドメイン内ジスルフィド架橋を確立することにより得られる。
従って、本発明のさらなる観点は、新JP170の変異体の導入方法に関し、ここで段階(c)は、親JP170型サブチラーゼにおけるアミノ酸残基位置を同定し、その修飾が、少なくとも1つのCys残基の挿入又はそれによる置換により少なくとも1つのジスルフィド架橋を創造することができる。
G21C+A86C, V26C+A265C, G57C+G105C, G74C+A229C, Q111C+N143C, G160C+S170C, A286C+V349C, A27C+A122C, A45C+G78C, V72C+P258C, G78C+A229C, D98C+G104C, Q111C+Y147C, G135C+G167C, R142C+P354C, V144C+A178C, G182C+P217C, A183C+G223C, A195C+Y225C, F271C+P279C, A287C+A430C, A293C+T310C, E322C+S428C, S324C+A332C, S327C+P424C, D352C+N397C, G355C+T362C, G291C+S314C。
JP170と相同のサブチラーゼにおけるシステイン置換のために適切な類似する残基は、図1の一列整列における相同位置を見出すことにより解明され得る。もう1つのJP170様配列に関しては、システイン置換のために適切な相同位置は、上記のようなGAP分析方法を用いて、図1のすべての配列と、前記JP170様配列とを一列整列することにより選択され得る。次に、適切な残基が、図1に一列整列されているサブチラーゼの配列である、配列番号1,2及び3のほとんどの相同体における相同位置に従って選択され得る。
親サブチラーゼに比較して、改良された安定性(典型的には、改良された熱安定性)を有する変異体は、サブチラーゼの表面電荷分布を変えることにより得られる。例えば、pHが約5又はそれ以下に低められる場合、ヒスチジン残基は典型的には、正に電荷され、そして結果的に、タンパク質表面上での好ましくない静電相互作用が生じ得る。サブチラーゼの表面電荷を構築することにより、サブチラーゼのより高い安定性に導くそのような好ましい静電相互作用を回避できる。
荷電されたアミノ酸残基は、(a)正に荷電され:Lys, Arg, His (pH < 5), Tyr (pH > 9) 及び Cys(pH > 10)、そして(b)負に荷電される:Asp及びGlu。
a)親サブチラーゼ、好ましくはJP170様又はBPN’様サブチラーゼの表面上のAsp, Glu, Arg, Lys及びHisから成る群から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基を同定し;
b)親サブチラーゼ、好ましくはJP170様又はBPN’様サブチラーゼの表面上のAsp, Glu, Arg, Lys及びHisから成る群から選択された少なくとも1つのアミノ酸残基を、荷電されていないアミノ酸残基により置換し;
c)任意には、段階a)及びb)を、繰り返して反復し;
d)任意には、b)以外の1又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換である変更を行い;
e)段階a)−d)に起因する変異体を調製し;
f)前記変異体の安定性を試験し;そして
g)任意には、段階a)−f)を、繰り返し反復し;そして
h)親サブチラーゼに比較して、高められた安定性を有するサブチラーゼ変異体を選択することを含んで成る。
b)親サブチラーゼの表面上の少なくとも1つの電荷されていないアミノ酸残基を、Asp,Glu, Arg, Lys及びHisから成る選択された荷電されたアミノ酸残基により置換する段階。
サブチラーゼの表面上に存在するアミノ酸残基の電荷を変える場合、上記方法がまた使用され得る。再び、上記方法に比較して、唯一の差異は、この場合、解釈する次の段階a)及びb)である:
a)親サブチラーゼの表面上の、Asp, Glu, Arg, Lys及びHisから成る群から選択された少なくとも1つの荷電されたアミノ酸残基を同定し;
b)段階a)において同定された、親サブチラーゼの表面上の少なくとも1つの荷電されたアミノ酸残基を、反対の電荷を有するアミノ酸残基により置換する段階。
サブチラーゼの表面上に存在するアミノ酸を決定するために、表面接近可能領域がDSSP プログラム(Kabsch and Sander, Biopolymers (1983), 22,2577-2637)を用いて測定される。0 0, 0.10, 0.20, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55 又は 0.60よりも高い表面接近性を有するすべての残基が、表面残基と見なされる。
類似する置換が、他のJP170様サブチラーゼの同等の位置に導入され得る。
表面の改良された熱安定性は、問題のサブチラーゼを二次構造についての分析にゆだね、間隔[[-90° < φ < -40° 及び-180° <Ψ< 180°]、好ましくは間隔[-90° <φ< -40° 及び120° <Ψ< 180° ] 又は[-90° <φ< -40° 及び-50° < Ψ <10° ]に制限される2面角φ及びΨを有するサブチラーゼにおける残基を同定し、そしてサブチラーゼがα−ヘリカル又はβ−シート構造を有することにより特徴づけられる領域に位置する残基を排除することにより得られる。
JP170型サブチラーゼのグループにおいては、プロリン残基は好都合には、位置22,44, 110,139, 140,166, 198,201, 203,231, 282,356, 357 及び 378で導入され得る。従って、好ましいJP170変異体は、1又は複数の次の置換を有する:Q22P, E44P, L110P, T139P, D140P, S166P I198P, V201P, Q203P, S231P, S282P, S356P, T357P 及び K378P。1又は複数のE44P、Q203P及びS356Pを含んで成る変異体が特に好ましい。
言及されるように、JP170サブチラーゼは、長く、明らかに非触媒性のC−末端を有することにおいてBPN’様サブチラーゼとは非常に異なる。JP170の可能な切断は、非触媒性C−末端である領域311−433の欠失又は前記領域内の欠失により得られる、2種のイオン−結合部位を包含する約115個の残基の除去である。好ましい欠失は、領域317−433又は315−433を含んで成る。好ましくは、新しいC−末端は、311−325の領域内に存在するであろう。さらに、欠失は、追加の置換、例えば1又は複数のL283N, Q; A290S, N 及び W306H, Y, Kにより最適化され得る。
好ましい切断は、次のものを含んで成る:
a)領域317−433の欠失及び置換L283N + A290S + W306H:
b)領域315−433の欠失及び置換L283N + A290S + W306H:
基質結合部位は、基質モデル、例えばCI2インヒビターと接触する残基により同定される。活性部位に結合されるCI2を有するJP170サブチラーゼの3D構造座標は、添付1に提供される。いずれの理論にも制限されないが、現在、基質と酵素との間の結合は、基質分子から領域10Å内に見出される好ましい相互作用により支持されると思われる。そのような好ましい結合の例は、水素結合、強い静電相互作用及び/又は疎水性相互作用である。
29-32, (すなわち、残基29, 30,31, 32)
64-72, (すなわち、残基64,65, 66,67, 68,69, 70,71, 72)
93,
96-98, (すなわち、残基96,97, 98)
100-110, (すなわち、残基100,101, 102,103, 104,105,106, 107,108,109, 110)
113-114,
127-136, (すなわち、残基127,128, 129,130, 131,132, 133,134, 135,136)
144,157, 174,
180-183, (すなわち、残基180,181, 182,183)
191,193-194,
202-207, (すなわち、残基202,203, 204,205, 206,207)
211,
223-226, (すなわち、残基223,224, 225,226)
234-241, (すなわち、残基234,235, 236,237, 238,239, 240,241)
249-258 (すなわち、残基249,250,251, 252,253, 254,255, 256,257, 258)。
特別なイオン−結合部位を有するJP170:
BPN’サブチラーゼからの強いイオン−結合部位は、N79−N82の欠失及びLNNSLGV(配列番号5)の続く挿入、続く置換A45D、N及び任意には置換E44P、T及び/又はR49QによりJP170(又はJP170サブグループにおけるサブチラーゼ)中に移植され得る。
イオン−結合を除去することにより、媒体におけるカルシウムの酵素依存性を低めることが可能である。JP170又は他のJP170サブチラーゼにおけるイオン−結合部位は、他の関連するサブチラーゼ、例えばBPN’型サブチラーゼ、例えばサビナーゼ又は、BPN’、及びTY145型サブチラーゼの立体構造についての情報からのガイドにより除去され得る。
イオン−結合部位1は、野生型JP170サブチラーゼ、又は上記のようにして切断されたJP170サブチラーゼから除去され得る。
同様に、JP170型サブチラーゼ及びTY145型サブチラーゼの立体構造についての情報は、BPN’型サブチラーゼにおける強及び弱イオン−結合部位を除去するために使用され得るか、又はTY145型サブチラーゼにおけるイオン−結合部位は、JP170及びBPN’型サブチラーゼについての構造部位に基づいて除去され得る。
i)領域A194−L196(BPN’番号)の完全な又は一部の欠失及びJP170位置P209−P217から選択された3個又はそれ以上の残基の挿入、及び
ii) 領域L75−L82(BPN’番号)の完全な又は一部の欠失及びTY145位置H83−Y92から選択された少なくとも1つの残基の挿入、又は
i)領域A194−L196(BPN’番号)の完全な又は一部の欠失及びJP170位置P209−P217から選択された3個又はそれ以上の残基の挿入、及び
ii) 領域L75−L82(BPN’番号)の完全な又は一部の欠失及びJP170位置N79−K83から選択された少なくとも1つの残基の挿入のいずれかにより除去され得る。
JP型サブチラーゼ プロテアーゼの安定性を高めるためには、決定的酸化部位、例えばメチオニンを、酸化を受けにくい他のアミノ酸残基により置換するか、又は前記酸化部位を欠失することが好都合である。
従って、さらなる態様においては、本発明は、酸化に対して敏感な1又は複数のアミノ酸残基、特に分子の表面に露出されるメチオニン残基が欠失されているか、又は酸化に対して低い敏感性である他のアミノ酸残基により置換されているRP−IIプロテアーゼ変異体に関する。酸化に対して低い感受性のアミノ酸残基は、A, E, N, Q, I, L, S及びKから成る群から選択され得る。
アルカリ性pHで、Asnの側鎖は、その主鎖がAsp側鎖を通り抜けるイソAsp残基を形成するために、隣接する連続的アミノ酸のNH基を相互作用できることは知られている。これは、主鎖をタンパク質分解を受けやすいままに残すであろう。脱アミド化は、次ぐ残基が、Glyである場合に、より頻繁に生じる。Glyの前のAsn又はGlyの変更は、ハプニングからこれを保護し、そして従って安定性、特に熱−及び貯蔵安定性に関して改良する。
Asn及び/又はGly残基は例えば、A, Q, S, P, T及びYから成る群から選択されたアミノ酸の残基により置換され得る。
洗浄性能に関しては、フェニルアラニンへの一定のチロシン残基の修飾が改良された洗浄性能を提供することが見出されている。いずれの特定の理論にも関連しないが、アルカリ洗浄液におけるそれらのTyr残基の滴定は、Tgy残基を他の残基、特にPhe又はTrp、特にPheにより置換することにより軽減される負の効果を有すると思われる。
SD−521及びYaプロテアーゼにおいては、チロシン残基は、次の位置において修飾され得る:17, 20, 54, 137, 147, 187, 243, 247, 249, 299, 319, 334, 361, 379, 386, 388, 411, 及び 418。
タンパク質を安定化するためには、アメリカ特許第5,118,623号に記載されるように、タンパク質の表面でのトリプトファン残基を置換するか又は欠失することが好都合である。トリプトファン残基は好都合には、F, T, Q又はGにより置換され得る。従って、さらなる態様においては、本発明は、1又は複数の次の置換を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体に関する:SD-521及びYaプロテアーゼに関しては、位置118、129、240、306、350及び392;及びJP170プロテアーゼに関しては、位置129、240、306、350及び392。
従って、本発明は、1又は複数の次の置換を含んで成るJP170変異体に関する:W129 {F, T, Q,G}, W240 {F, T, Q, G}, W306 {F, T, Q, G}, W350 {F, T, Q,G}, 及び W392 {F, T, Q, G}。
本発明はまた、そのアミノ酸配列に対してのいずれか他の修飾と組合してのいずれかの上記サブチラーゼ変異体も包含する。特に、酵素に改良された性質を提供することが当業界において知られている他の修飾との組合せが予測される。
JP170様又はBPN’様サブチラーゼ変異体の調製方法:
サブチラーゼ変異体、すなわち本発明のJP170及びBPN’変異体は、当業界において知られているいずれかの方法により生成され、そして本発明はまた、本発明のサブチラーゼ変異体をコードする核酸、前記核酸を含んで成るDNA構造体、及び前記核酸配列を含んで成る宿主細胞にも関する。
典型的には、タンパク質変異体は、親タンパク質の特定の部位の突然変異誘発、発現ベクター中への導入、宿主細胞、等により生成され得る。親タンパク質は、ポリペプチドを生成する株、又は発現ライブラリーからクローン化され得、すなわちそれらはゲノムDNAから単離されるか、又はcDNAから調製されるか、又はそれらの組合せであり得る。
さらに、変異体は、下記方法により構成され得る:
ランダム突然変異誘発は、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3つの部分において、又は完全な遺伝子内で、局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発として適切に行われる。
突然変異誘発されたDNA配列はさらに、突然変異誘発されたDNA配列の発現を可能にする機能をコードするDNA配列を含んで成る。
ランダム突然変異誘発は、問題の親α−アミラーゼの部分に都合良く局在化され得る。これは、例えば、酵素の一定領域が酵素の所定の性質のために特に重要なものであることが同定されている場合、及び修飾が改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される場合、好都合であり得る。そのような領域は通常、親酵素の三次構造が解明され、そして酵素の機能と関連ずけられている場合に同定され得る。
ランダム突然変異誘発は、次の段階により行われ得る:
1.親酵素における修飾のための興味ある領域の選択;
2.選択された領域における突然変異部位及び突然変異誘発されていない部位の決定;
3.どの種類の突然変異が構成される変異体の所望する安定性及び/又は性能に関して実施されるべきであるかの決定;
4.構造的に適切な突然変異の選択;
5.段階4に関して、段階3により選択された残基の調整;
6.ヌクレオチド分布の適切なドープアルゴリズムの使用による分析;
7.必要なら、たとえば停止コドンの導入を回避するために、遺伝子コードに起因する強制を考慮して、遺伝子コードリアリズムへの所望する残基の調整;当業者は、いくつかのコドンの組み合わせが実際、使用され得、そして適合される必要があることを気づくであろう;
8.プライマーの製造;
9.プライマーの使用によるランダム突然変異誘発の実施;
10.所望する改良された性質についてスクリーニングすることによる、得られたフィターゼ変異体の選択。
本発明のサブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含んで成る組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利には、ゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクターであり得る。
本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。
宿主細胞中に導入される、本発明の酵素をコードするDNA配列を有するポリヌクレオチドは、問題の宿主に対して相同であっても、又は異種であっても良い。宿主細胞に対して相同である場合、すなわち天然において宿主細胞により生成される場合、それは、典型的には、もう1つのプロモーター配列、又は適用できるなら、その天然の環境においてよりももう1つの分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に操作可能的に連結されるであろう。用語“相同”とは、問題の宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA配列を包含することが意図される。用語“異種”とは天然において宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することが意図される。従って、DNA配列は、もう1つの生物からであり得るか、又はそれは合成配列でもあり得る。
細胞、例えばE.コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は、典型的には不溶性粒質物(封入体として知られている)として細胞質に保持され得るか、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして粒質物が回収され、そして変性され、この後、酵素は変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、酵素は、細胞周辺腔の内容物を放すために、例えば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊することにより、細胞周辺腔から回収され得る。
本発明の酵素を発現するためには、本発明の酵素をコードをする核酸配列を含んで成るベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされた、上記に言及される宿主細胞が、典型的には、所望する分子の生成を可能にする条件下で適切な栄養培地において培養され、この後、それらは細胞、又は培養ブイヨンから回収される。
本発明の酵素は、添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分を得る。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械用洗濯洗剤組成部物、例えば染色された布の前処理のために適切な選択用添加剤組成物、及びすすぎに添加される布用ソフトナー組成物として配合され得るか、又は一般的な家庭用硬質表面清浄操作への使用のための洗剤組成物として配合され得るか、又は手動又は機械用皿洗い操作、特に自動皿洗い(ADW)のために配合され得る。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合すべきであり(すなわち、pH−最適性、他の酵素及び非酵素成分との適合性、等)、そして酵素は有効量で存在すべきである。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM (Genencor International Inc.) を包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM 及びLipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM 及びBAMTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 及びPurastarTM (Genencor International Inc.)である。
市販のセルラーゼは、CelluzymeTM 及びCarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM 及びPuradex HATM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)TM (Kao Corporation) を包含する。
市販のペルオキシダーゼは、GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る1又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量%のレベルで存在する。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば4−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体1L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体1L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体1L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明の酵素はさらに、引用により本明細書に組み込まれるWO97/07202号に開示される洗剤配合物に組み込まれる。
織物:
標準の織物片を、EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Switzerlandから得る。特に、タイプEMPA116(血液、ミルク及びインキにより染色された綿織物)及びEMPA117(血液、ミルク及びインキにより染色されたポリエステル/綿織物)を得た。他の標準織物片を、wfk-Cleaning Technology Research Institute, Chris- tenfeld 10, D-41379Bruggen-Bracht, Germanyから得る。特に、タイプwfk10N(卵/色素により染色された綿織物)、wfk10eggEG(卵黄により染色された綿織物)を得る。Wfk10Nの変性は、オートクレープにおいて生じる。
本発明は、本発明の単離された酵素の生成方法を提供し、ここで前記酵素をコードするDNA配列により形質転換された適切な宿主細胞が前記酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そして得られる酵素が培養物から、回収される。
酵素をコードするDNA配列を含んで成る発現ベクターが異種宿主細胞を形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換え生成を可能にする。それにより、相同不純物を有さないことを特徴とする、高く精製されたサブチラーゼ組成物を製造することが可能である。
JP170及びTY145における下記に言及される領域を、JP170及びTY145からサビナーゼにトランスファーするために選択した。本明細書に記載されるようなサブチラーゼ変異性の調製のための分子方法の使用により、サブナーゼ領域(BPN’番号付け)を除去し、そしてJP170及びTY145領域の代わりに挿入した。サブナーゼ領域はイオン−結合部位と接触して存在するので、修飾目的は、サビナーゼからイオン−結合部位を除去することである。
JP170領域P209−P217、及び
サビナーゼ 領域L75−L82
TY145領域H83-Y92
他方では、修飾は下記の通りであり得る:
サビナーゼ 領域A194−L196
JP170領域P209−P217、及び
サビナーゼ 領域L75−L82
JP170領域N79−K83。
特定部位の突然変異誘発:
特定の挿入及び特定の置換を含んで成る本発明のサブチラーゼJP170特定部位変異体を、所望する挿入を含むオリゴを用いて、PCRにより生成されたDNAフラグメント(Bambrookなど., molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989)の従来のクローニングにより製造した(下記参照のこと)。
鋳型プラスミドDNAはpSX222、又はスブチリシンJP170の変異体を含むこの類似体である。突然変異は、変異体の構成に対して、オリゴ指図された突然変異誘発により導入された。
特定部位の突然変異誘発を行うために使用される全体の方法は次の通りである:
突然変異誘発プライマー(オリゴヌクレオチド)を、挿入/欠失/置換を定義するDNA塩基対により分離される、突然変異の部位を有するDNA配列に対応して合成する。
発酵の後、スブチリシン変異体の精製を、Hydro- phobic Charge Induction Chromatography(HCIC)及び続く真空濾過を用いて行う。酵素を捕獲するために、HCICは、4−メルカプト−エチル−ピリジン(4−MEP)が結合するセルロースマトリックスを使用する。
80−100μmのセルロースマトリックスのビーズを、酵母、及びスブチリシン変異体を分泌できる形質転換されたB. サブチリスを含む培地と共に混合し、そしてUnifilter(商標)マイクロプレートにおいてpH9.5でインキュベートする。
ビーズから酵素を溶離するために、溶出緩衝液(pH5)によるフィルターの洗浄により、pHを低める。それにより、酵素は、ビーズから分離し、そして緩衝液から回収され得る。
精製された酵素を、種々の量の活性部位を阻害するために、異なった濃度で、高い親和性のインヒビターCI−2Aと共にインキュベートする。プロテアーゼ及びインヒビターは、1:1の比でお互い結合し、そして従って、酵素濃度はインヒビターの濃度に直接的に関連し、この点ですべてのプロテアーゼは不活性である。残留プロテアーゼ活性を測定するために、基質(トリス/HCl緩衝液中、0.6mMのSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)を、インヒビターとのインキュベーションの後に参加し、そして次の4分間、変性生成物pNA(パラニトロフェノール)の進行を、Elisa Reader上で405nmで定期的に測定する。
H243K; S238K; L233T; L233S; L233D; Y247R; H200D ; H200A ;H200G ; E185D; S193Q; S193Y; N390D; G394N; G394F; W240H; G355A; G355S; N316D; N79D; K246R; K83R; H200D+D196N ; H243E。
AMSA−試験方法の記載:
洗浄実験を、洗剤組成物における選択されたJP170サブチラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために行う。本出願のサブチラーゼを、自動機械応力アッセイ(AMSA)を用いて試験した。AMSAにより、多量の少体積の酵素−洗剤溶液の洗浄機能を試験することができる。AMSAプレートは、試験溶液のための多くのスロット、及びすべてのスロット開口に対して、洗浄されるべき織物見本を強く圧縮する蓋を有する。洗浄時間の間の、プレート、試験溶液、織物及び蓋を激しく振盪し、試験溶液を織物とを接触せしめ、そして機械的対応を、規則的で定期的振盪の態様で適用する。さらなる記載に関しては、WO02/42740号、特に23−24ページの“Special method embodimments”を参照のこと。
実験を、下記に特定される実験条件化で行った:
酵素変異体の性能を、特定のプロテアーゼにより洗浄された織物サンプルの色の明るさとして測定する。明るさはまた、白色光により照射される場合、織物サンプルから反射される光の強度として表され得る。織物が染色される場合、反射される光の強度は、きれいな織物のその強度よりも低い。従って、反射される光の強度は、混合されたプロテアーゼの洗浄性能を測定するために使用され得る。
本発明のサブチラーゼの洗浄性能試験のための洗剤を、市販の十分に配合された洗剤を購入することにより入手し、そして続いて、熱処理(水溶液について95℃で5分間)により酵素成分を不活性化する。さらに、酵素を有さない市販の洗剤基剤を、その製造業者から直接的に購入する。さらに、適切なモデル洗剤を購入し、そして洗剤性能試験のために使用することができる。
トリポリリン酸ナトリウム 23.0%
クエン酸ナトリウム・ニ水和物 22.3%
過硼酸ナトリウム・一水和物 6.0%
テトラアセチルエチレンジアミン 2.0%
ニ珪酸ナトリウム(非結晶) 5.0%
線状脂肪アルコールエトキシレート 2.0%
(非イオン性界面活性剤、低発泡性)
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 4.0%
(ナトリウム塩、炭酸ナトリウムに対して50%活性)
無水炭酸ナトリウム 100%まで
Claims (39)
- 親サブチラーゼに比較して少なくとも1つの変更された性質を有する、親サブチラーゼの変異体の構成方法であって、
a)JP170立体構造に関しての構造の考慮の評価に基づいて、前記性質の変更のために適切なものである、サブチラーゼの少なくとも1つのアミノ酸残基又は少なくとも1つの構造領域を同定するために、親サブチラーゼの立体構造を分析し;
b)前記性質を変更するために、親サブチラーゼに比較して、a)において同定されるアミノ酸残基又は構造部分の欠失、置換又は挿入により修飾されている変異体サブチラーゼをコードするポリヌクレオチドを構成するために前記親サブチラーゼをコードするポリペプチドのDNAを修飾し;
c)適切な宿主において前記変異体サブチラーゼを発現し;そして
d)前記性質について、前記得られるサブチラーゼ変異体を試験することを含んで成る方法。 - 親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体の生成方法であって、
a)BPN’, TY145又はJP170の立体構造に基づいて親サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し;
b)活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記JP170構造体に対して親サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し;
c)段階b)における比較に基づいて、親サブチラーゼの少なくとも1つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され;
d)前記構造部分に対応する位置での1又は複数のアミノ酸の少なくとも1つの欠失又は置換、又は前記構造部分に対応する位置における1又は複数のアミノ酸残基の少なくとも1つの挿入をコードする核酸配列を生成するために、親サブチラーゼをコードする核酸配列を修飾し;
e)段階c)及びd)を、N回、反復して実施し、ここでNは1又は複数の値を有する整数であり;
f)段階a)−e)に起因する変異体を調製し;
g)前記変異体の性質を試験し;
h)任意には、段階a)−g)を、繰り返して反復し;
i)親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体を選択し;
j)変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し;
k)前記生成されるサブチラーゼ変異体を単離し;
l)前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し;そして
m)前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る方法。 - 親サブチラーゼが、好ましくはABSS168, BASBPN, BSSDY, 及び BLSCARから成る群から選択されたサブグループI−S1、又はサブグループI−S1の特徴を保持しているその機能的変異体に属する請求項1又は2記載の方法。
- 親サブチラーゼが、好ましくはBLS147, BLS309, BAPB92, 及び BYSYABから成る群から選択されたサブグループI−S2、又はサブグループI−S2の特徴を保持しているその機能的変異体に属する請求項1又は2記載の方法。
- 前記親サブチラーゼが、好ましくはTY145, S39及びS41から成る群から選択されたTY145型サブグループに属する請求項1又は2記載の方法。
- 前記親サブチラーゼが、好ましくはJP170, プロテアーゼKP43, KP1790, KP9860, プロテアーゼYa, プロテアーゼE-1 及び SD-521から成る群から選択されたJP170型サブグループに属する請求項1又は2記載の方法。
- モデル化される親JP170型サブチラーゼは、配列番号1に対して少なくとも58%相同であり、好ましくは少なくとも60%相同であり、より好ましくは配列番号1の配列に対して、少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、又はさらにより好ましくは少なくとも99%相同である請求項6記載の方法。
- 前記親JP170サブチラーゼが、全体的なスブチリシン折りたたみ、及び次の構造特徴:
a)7個の鎖を有するねじれたβ−シート、
b)6個のαヘリックス、
c)少なくとも3個のイオン−結合部位を含んで成り、そしてBPN’様サブチラーゼの強及び弱イオン−結合部位を包含しない、配列番号1の配列に対して少なくとも58%相同であるJP170様サブチラーゼであり、ここで前記サブチラーゼの立体構造における前記3個のイオン−結合部位の位置が、サブチラーゼの3個の活性部位アミノ酸残基、すなわちSer, His及びAspのc−α原子、及び活性部位Ser残基の次のアミノ酸残基(Serの次の)のc−α原子への距離により定義され、ここで
I)イオン−結部位1と、
i)Asp c−α原子との間の距離が26.70-28.70Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が22.10−24.10Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が16.95−18.95Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が15.30−17.30Åであり、
II)イオン−結部位2と、
i)Asp c−α原子との間の距離が33.50-35.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が37-39Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が29.40-31.40Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が30.70-32.70Åであり、
III )イオン−結部位3と、
i)Asp c−α原子との間の距離が41.50-43.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が42.90-44.90Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が34.50-36.50Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が35-37Åである請求項6又は7記載の方法。 - a)JP170の立体構造に基づいて親JP170型サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し;
b)活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記BPN’又はTY145構造体に対して親JP170型サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し;
c)段階b)における比較に基づいて、親JP170型サブチラーゼの少なくとも1つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され;
d)前記構造部分に対応する位置での1又は複数のアミノ酸の少なくとも1つの欠失又は置換、又は前記構造部分に対応する位置における1又は複数のアミノ酸残基の少なくとも1つの挿入をコードする核酸配列を生成するために、親JP170型サブチラーゼをコードする核酸配列を修飾し;
e)段階c)及びd)を、N回、反復して実施し、ここでNは1又は複数の値を有する整数であり;
f)段階a)−e)に起因するJP170型サブチラーゼ変異体を調製し;
g)前記変異体の性質を試験し;
h)任意には、段階a)−g)を、繰り返して反復し;
i)親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有するJP170型サブチラーゼ変異体を選択し;
j)変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し;
k)前記生成されるJP170型サブチラーゼ変異体を単離し;
l)前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し;そして
m)前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る、親サブチラーゼに比較して、少なくとも1つの変更された性質を有する、JP170型サブチラーゼ変異体を低めるための請求項1又は2記載の方法。 - 段階(c)が、JP170型親のイオン−結合部位まで10Å又はそれ以下に位置するアミノ酸残基位置、好ましくは6Å又はそれ以下の距離に位置する位置を同定する請求項9記載の方法。
- 段階(c)が、JP170型親におけるアミノ酸残基位置を同定し、この修飾が同定される少なくとも1つの位置の修飾によるイオン結合部位の除去を提供する請求項9記載の方法。
- 段階(c)が、JP170型親の高い移動性領域におけるアミノ酸位置を同定する請求項9記載の方法。
- 段階(c)が、JP170型親の移動性領域におけるアミノ酸位置を同定する請求項9記載の方法。
- 段階(c)が、親JP170型におけるアミノ酸残基位置を同定し、その修飾が少なくとも1つのCys残基の挿入又はその残基による置換により、少なくとも1つのジスルフィド架橋を創造できる請求項9記載の方法。
- 段階(c)及び(d)が、
c’) 親JP170型の表面上の少なくとも1つの荷電されたアミノ酸残基を同定し;
d’) 荷電されていないアミノ酸残基の欠失又はそれによる置換を通して、段階(a)において同定される荷電された残基を修飾することにより、修飾された表面荷電分布を有する親JP170型の変異体の構成を提供する請求項9記載の方法。 - c’’) 親JP170型の表面上の荷電されていないアミノ酸残基により支配される少なくとも1つの位置を同定し;
d’’)荷電されたアミノ酸残基により荷電されていないアミノ酸残基を置換することにより、又は前記位置で荷電されたアミノ酸残基を挿入することにより、その位置における荷電を修飾することにより、修飾された表面電荷分布を有する親JP170型の変異体の構成を提供する請求項9記載の方法。 - 段階(c)及び(d)が、
c’’’) 親JP170型の表面上の少なくとも1つの荷電されたアミノ酸残基を同定し;
d’’’) 反対の電荷を有するアミノ酸残基により、段階(a)において同定される荷電された残基を置換することにより、修飾された表面荷電分布を有する親JP170型の変異体の構成を提供する請求項9記載の方法。 - 段階(c)が、親JP170型におけるアミノ酸残基位置を同定し、Proに対するこの修飾が改良された安定性を示すJP170型変異体を創造できる請求項9記載の方法。
- 段階(c)が、活性部位残基から10Å以下の距離で親JP170型におけるアミノ酸残基位置を同定する請求項9記載の方法。
- 段階(a)におけるNが、1〜50,45, 40,35, 30,25, 20,15, 14,13, 12,11, 10,9, 8,7,6, 5,4, 3,又は2の整数である請求項9〜19のいずれか1項記載の方法。
- イオン−結合部位に対して10Å又はそれ以下の距離に位置する位置、好ましくは6Å又はそれ以下の距離に位置する位置におけるアミノ酸残基に少なくとも1つの修飾を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
- 修飾が、次の位置:
a)イオン−結合部位1:183,184, 185,186, 187,188, 189,191, 193,195, 196,197, 198, 199,200, 201,202, 203,224 及び 225、
b)イオン−結合部位2:378,379, 380,381, 382,383, 384,385, 386,387, 388,389, 390, 391,392 及び 393、
c)イオン−結合部位3:348,350, 352,363, 364,365, 366,367, 369,370, 380,381, 382, 383,391, 392,393, 394,395,396, 397,398, 399,400, 414,415, 416,417, 418,419, 420の少なくとも1つで行われ、好ましくは前記修飾は、S193Q, Y;H200D, N;H200D,N+D196N ; N390D;N391 D ; G394N, Q, F, Y, S 及び W392S, N, Qである請求項21記載の変異体。 - BPN’様ファミリーのサブチラーゼの強いイオン−結合部位に対応するイオン−結合部位の導入を包含するJP170型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が配列番号1の領域N79−N82の部分的又は完全な欠失、及び1又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくは配列LNNSIQV(配列番号5)の挿入、続く置換A45D、N及び任意には、置換E44、T及び/又はR47Qを有することを特徴とする変異体。
- 1又は複数のイオン−結合部位が除去されているJP170型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が配列番号1の領域N186−N199の部分的又は完全な欠失、及び1又は複数のアミノ酸残基の続く挿入、好ましくは配列SSN(配列番号6)の挿入を包含し、そして好ましくは、置換17Q及びV3Yの1つ又は両者をさらに含んで成ることを特徴とする変異体。
- イオン−結合部位が除去されているBPN’型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が、
a)領域A194−L196(BPN’番号付けにおけるサビナーゼ)又はもう1つのBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び3又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのP209−P217又はもう1つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、及び
領域L75−L82(BPN’番号付けにおけるサビナーゼ)又は前記他のBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び1又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくはTY145からのH83−’122’又はもう1つのTY145様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、又は
b)領域A194−L196(BPN’番号付けにおけるサビナーゼ)又はもう1つのBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び3又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのP209−P217又はもう1つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、及び
領域L75−L82(BPN’番号付けにおけるサビナーゼ)又は前記他のBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び1又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのN79-K83又はもう1つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入を含んで成ることを特徴とする変異体。 - 下記位置:
13,14, 15,16, 17,18, 37,38, 39,40, 41,42, 43,47, 48,49, 50,58, 59,60, 67,96, 97,98, 99,107, 108,109, 110,111, 131,132, 133,134, 152,153, 163,164, 165,166, 188,189, 190,191, 193,195, 210,234, 235,236, 237,238, 239,240, 241,242, 243,244, 245,326, 327,328, 329,330, 331,332, 337,338, 339,340, 342,355, 356,357, 359,360, 372,373, 374,375, 376,377, 378, 384, 385,387, 388,389, 390,391, 392,404, 405,406, 407,408, 409,410, 411 及び 419を包含する群から選択された位置に少なくとも1つの修飾を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。 - 1又は複数の次の修飾:W240H, Y; G355A, S; S356T, N; T357N, Q, D, E, P;A359S, T, N, Q 又は S360T, Nを含んで成る請求項26記載のサブチラーゼ変異体。
- JP170の活性部位に結合されるC12インヒビターから10Åの距離以内に存在する1又は複数の位置に変更を含んでなる変異体サブチラーゼであって、配列番号1において特定されるように、前記位置は、
29,30,31, 32,64, 67,68, 69,70, 71,72,93, 96,97, 98,107,108,109, 110,113, 114, 127,128, 129,130, 131,132, 133,134, 136,138, 139,140, 141,144, 157,174, 180,181, 182,183, 191,193, 202,203, 205,206, 207,211, 223,224, 225,226, 234,235, 236,237, 238,239, 240,241,249, 250,251, 252,253, 254,257, 258であり、好ましくは置換W129Lを含んでなる変異体。 - 1又は複数の次の修飾:
G21C+A86C, V26C+A265C, G57C+G105C, G74C+A229C, Q111C+N143C, G160C+S170C, A286C+V349C, A27C+A122C, A45C+G78C, V72C+P258C, G78C+A229C, D98C+G104C, Q111C+Y147C, G135C+G167C, R142C+P354C, V144C+A178C, G182C+P217C, A183C+G223C, A195C+Y225C, F271 C+P279C, A287C+A430C, A293C+T310C, E322C+S428C, S324C+A332C, S327C+P424C, D352C+N397C, G355C+T362C, G291C+S314C;
好ましくは1又は複数の置換:
G21C+A86C, V26C+A265C, G57C+G105C, G74C+A229C, Q111C+Y143C, G160C+S170C, A286C+V349C, A4C+P222C及びA27C+A117C(ここで位置は、配列番号1における位置に対応する)に導入される1又は複数のジスルフィド架橋を含んで成るJP170様サブチラーゼ。 - 1又は複数の位置N79, N316, L381, K9及びK313に変更を含んで成り、好ましくは配列番号1の1又は複数の置換を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
- 1又は複数の位置22,44, 110,139, 140,166, 198,201, 203,231, 282,356, 357 及び 378に変更を含んで成り、好ましくは1又は複数の置換:Q22P, E44P,L110P, T139P, D140P,S166P 1198P, V201P, Q203P,S231 P, S282P, S356P, T357P 及び K378Pを含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
- 領域311−433の欠失、好ましくは位置317−433又は315−433の欠失を含んで成り、さらに1又は複数の置換L283N, Q; A290S, N 及びW306H,Y, Kを含んで成るJP170様サブチラーゼ変異体。
- 請求項21〜32のいずれか1項において定義されるか又は生成されるサブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。
- 前記核酸配列が、
a)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも58%の相同性を有する酵素をコードする核酸配列、及び
b)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも58%の相同性を有する酵素をコードする核酸配列の相補的鎖と、低い緊縮条件下で、好ましくは中くらいのの緊縮条件下で、特に高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、又は
c)少なくとも100個のヌクレオチドのa)又はb)のいずれかの副配列から成る群から選択される請求項33記載の単離された核酸配列。 - 適切な発現宿主においてポリペプチドの発現を指図することができる1又は複数の制御配列に操作可能に連結された、請求項33又は34記載の核酸配列を含んで成る単離された核酸構造体。
- 請求項35記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項21〜32のいずれか1項記載の変異体の生成方法であって、
a)請求項36記載の組換え宿主細胞を、サブチラーゼ変異体の生成の助けとなる条件下で培養し;そして
b)前記変異体を回収することを含んで成る方法。 - 請求項21〜32のいずれか1項記載のJP170型サブチラーゼ変異体又はBPN’型サブチラーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
- 清浄又は清浄用途への請求項21〜32のいずれか1項記載のJP170型サブチラーゼ変異体又はBPN’型サブチラーゼ変異体の使用。
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