JP2002306176A - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
アルカリプロテアーゼInfo
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- JP2002306176A JP2002306176A JP2001114048A JP2001114048A JP2002306176A JP 2002306176 A JP2002306176 A JP 2002306176A JP 2001114048 A JP2001114048 A JP 2001114048A JP 2001114048 A JP2001114048 A JP 2001114048A JP 2002306176 A JP2002306176 A JP 2002306176A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０
４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれ
に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸
残基；（ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロ
リン残基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）
位置：アスパラギン残基、から選ばれたものであるアル
カリプロテアーゼ、該アルカリプロテアーゼをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換
えベクターを含有する形質転換体、該アルカリプロテア
ーゼを含有する洗剤組成物。 【効果】 本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも
活性を有し、かつ洗浄力が高く、洗剤配合用酵素として
有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれ
に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸
残基；（ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロ
リン残基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）
位置：アスパラギン残基、から選ばれたものであるアル
カリプロテアーゼ、該アルカリプロテアーゼをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換
えベクターを含有する形質転換体、該アルカリプロテア
ーゼを含有する洗剤組成物。 【効果】 本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも
活性を有し、かつ洗浄力が高く、洗剤配合用酵素として
有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、洗剤配合用酵素と
して優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼに関
する。
して優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼに関
する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロテ
アーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗剤、化粧
料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤とい
った医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最
も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロ
テアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されてい
る。
アーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗剤、化粧
料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤とい
った医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最
も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロ
テアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されてい
る。
【０００３】ところが、衣料等の汚れは蛋白質だけでな
く、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていること
が殆どであり、斯かる実際の複合汚れに対して洗浄力の
高い洗浄剤が望まれている。このような観点から、本発
明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を
保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条
件下でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００の
アルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（Ｗ
Ｏ９９／１８２１８）。
く、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていること
が殆どであり、斯かる実際の複合汚れに対して洗浄力の
高い洗浄剤が望まれている。このような観点から、本発
明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を
保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条
件下でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００の
アルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（Ｗ
Ｏ９９／１８２１８）。
【０００４】しかし、さらに優れた洗浄性能を有し、幅
広い組成の洗剤に適用できるアルカリプロテアーゼが求
められていた。
広い組成の洗剤に適用できるアルカリプロテアーゼが求
められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、変異酵素
を中心として前記アルカリプロテアーゼを探索してきた
が、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリ
ンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素
学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全
く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、
前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、洗浄力を向
上させるには、ある種のアルカリプロテーアーゼにおい
て、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基
が必要であることを見出した。
を中心として前記アルカリプロテアーゼを探索してきた
が、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリ
ンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素
学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全
く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、
前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、洗浄力を向
上させるには、ある種のアルカリプロテーアーゼにおい
て、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基
が必要であることを見出した。
【０００６】すなわち本発明は、配列番号１の（ａ）８
４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）
３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失
又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロリン残
基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）位置：
アスパラギン残基、から選ばれたものであるアルカリプ
ロテアーゼ、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転
換体を提供するものである。
４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）
３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失
又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロリン残
基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）位置：
アスパラギン残基、から選ばれたものであるアルカリプ
ロテアーゼ、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転
換体を提供するものである。
【０００７】また本発明は、このアルカリプロテアーゼ
を含有する洗剤組成物を提供するものである。
を含有する洗剤組成物を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のアルカリプロテアーゼ
は、上記のように、配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）
１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又は
これに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミ
ノ酸残基；（ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：
プロリン残基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、
（ｄ）位置：アスパラギン残基、から選ばれたものであ
る。すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列
番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテ
アーゼにおける前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置の
アミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸
配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又
は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、こ
れらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施
した変異体であってもよい。
は、上記のように、配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）
１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又は
これに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミ
ノ酸残基；（ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：
プロリン残基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、
（ｄ）位置：アスパラギン残基、から選ばれたものであ
る。すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列
番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテ
アーゼにおける前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置の
アミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸
配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又
は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、こ
れらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施
した変異体であってもよい。
【０００９】ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」と
しては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸
化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４
３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番
号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつア
ミノ酸配列を有するものがより好ましい。特に配列番号
１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミ
ノ酸配列を有するものであって、酸化剤耐性を有し、ア
ルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５
０℃においてもpH１０で１０分間処理したとき８０％以
上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（Ｄ
ＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（Ｐ
ＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が
４３，０００±２，０００のものが好ましい。ここで、
酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを
５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中
で、pH１０（２０mMグリットンロビンソン緩衝液）で、
２０℃２０分間の残存活性（合成基質法）が少なくとも
５０％以上を保持していることをいう。
しては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸
化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４
３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番
号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつア
ミノ酸配列を有するものがより好ましい。特に配列番号
１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミ
ノ酸配列を有するものであって、酸化剤耐性を有し、ア
ルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５
０℃においてもpH１０で１０分間処理したとき８０％以
上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（Ｄ
ＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（Ｐ
ＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が
４３，０００±２，０００のものが好ましい。ここで、
酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを
５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中
で、pH１０（２０mMグリットンロビンソン緩衝液）で、
２０℃２０分間の残存活性（合成基質法）が少なくとも
５０％以上を保持していることをいう。
【００１０】ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４
３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げ
られ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の
相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアー
ゼ」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エスピーＫ
ＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由
来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示されるア
ミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチルス N
o.Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、ＪＰ７４０
７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する
プロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配列番号
５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＳＤ５
２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１
６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で示され
るアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（ＮＣＩＢ
１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番号７で
示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−２（Ｎ
ＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）等が挙げ
られる。このうち、配列番号２〜７から選ばれるアミノ
酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアルカリ
プロテアーゼが好ましく、さらにこれと９０％以上の相
同性を有するアルカリプロテアーゼがより好ましく、特
に９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが
好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン
−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,
1985）によって計算される。
配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４
３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げ
られ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の
相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアー
ゼ」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エスピーＫ
ＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由
来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示されるア
ミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチルス N
o.Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、ＪＰ７４０
７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する
プロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配列番号
５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＳＤ５
２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１
６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で示され
るアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（ＮＣＩＢ
１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番号７で
示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−２（Ｎ
ＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）等が挙げ
られる。このうち、配列番号２〜７から選ばれるアミノ
酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアルカリ
プロテアーゼが好ましく、さらにこれと９０％以上の相
同性を有するアルカリプロテアーゼがより好ましく、特
に９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが
好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン
−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,
1985）によって計算される。
【００１１】また、「相当する位置のアミノ酸残基」を
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較す
ることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ
酸配列をこのような方法で整列させることにより、相当
する位置のアミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列
中の位置を決めることが可能である。相当する位置は、
三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプ
ロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有する
ことが推定できる。
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較す
ることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ
酸配列をこのような方法で整列させることにより、相当
する位置のアミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列
中の位置を決めることが可能である。相当する位置は、
三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプ
ロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有する
ことが推定できる。
【００１２】すなわち、（ａ）配列番号１の８４位のア
ミノ酸残基はリジン残基であるが、その位置に相当する
位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることによ
り、例えば配列番号３においてはそれぞれ８３位のリジ
ン残基というように特定することができる。当該アミノ
酸残基は、アルギニンであるのが好ましい。
ミノ酸残基はリジン残基であるが、その位置に相当する
位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることによ
り、例えば配列番号３においてはそれぞれ８３位のリジ
ン残基というように特定することができる。当該アミノ
酸残基は、アルギニンであるのが好ましい。
【００１３】（ｂ）配列番号１の１０４位のアミノ酸残
基はロイシン残基であるが、当該アミノ酸残基又はこれ
に相当するアミノ酸残基はプロリン残基であるのが好ま
しい。
基はロイシン残基であるが、当該アミノ酸残基又はこれ
に相当するアミノ酸残基はプロリン残基であるのが好ま
しい。
【００１４】（ｃ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残
基はメチオニン残基であるが、当該アミノ酸残基は特に
アラニンあるいはセリン残基であるのが好ましい。
基はメチオニン残基であるが、当該アミノ酸残基は特に
アラニンあるいはセリン残基であるのが好ましい。
【００１５】（ｄ）配列番号１の３６９位のアミノ酸残
基はアスパラギン酸残基であるが、当該アミノ酸残基又
はこれに相当するアミノ酸残基は、アスパラギン残基で
あるのが好ましい。
基はアスパラギン酸残基であるが、当該アミノ酸残基又
はこれに相当するアミノ酸残基は、アスパラギン残基で
あるのが好ましい。
【００１６】プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配
列番号１）の（ａ）〜（ｄ）位に相当する位置及びアミ
ノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアー
ゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
列番号１）の（ａ）〜（ｄ）位に相当する位置及びアミ
ノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアー
ゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
【００１７】
【表１】
【００１８】また、本発明アルカリプロテアーゼにおけ
るアミノ酸残基の欠失又は（ａ）〜（ｄ）の選択は、２
個所以上が同時になされていていもよい。
るアミノ酸残基の欠失又は（ａ）〜（ｄ）の選択は、２
個所以上が同時になされていていもよい。
【００１９】本発明のアルカリプロテアーゼが変異体で
ある場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親ア
ルカリプロテアーゼということがある）としては、「配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として
示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すこと
により本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例え
ばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ
酸配列の前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置のアミノ
酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、
具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列の前
記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のア
ミノ酸残基に置換することにより得られる。
ある場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親ア
ルカリプロテアーゼということがある）としては、「配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として
示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すこと
により本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例え
ばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ
酸配列の前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置のアミノ
酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、
具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列の前
記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のア
ミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００２０】本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以
下の方法により得ることができる。すなわち、クローニ
ングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子
に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当
な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することに
より得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺
伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用
いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１
１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行え
ばよい。
下の方法により得ることができる。すなわち、クローニ
ングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子
に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当
な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することに
より得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺
伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用
いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１
１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行え
ばよい。
【００２１】親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子の変異手段としては、一般的に行われているランダム
変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。よ
り具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutage
nesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用い
て行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（po
lymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academ
ic press, New York, 1990）を用いることによって、遺
伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当す
る配列と置換することが可能である。
子の変異手段としては、一般的に行われているランダム
変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。よ
り具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutage
nesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用い
て行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（po
lymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academ
ic press, New York, 1990）を用いることによって、遺
伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当す
る配列と置換することが可能である。
【００２２】得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテ
アーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増
幅できるＤＮＡベクターに連結させる、あるいは当該変
異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させ
るなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードする
ＤＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効
率よく発現させることが可能である宿主に導入させ、変
異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条
件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸
菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
アーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増
幅できるＤＮＡベクターに連結させる、あるいは当該変
異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させ
るなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードする
ＤＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効
率よく発現させることが可能である宿主に導入させ、変
異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条
件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸
菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
【００２３】かくして得られる本発明のアルカリプロテ
アーゼは、アルカリ側で活性を有し、高級脂肪酸によっ
てカゼイン分解活性の阻害を受けず、且つ優れた洗浄力
を示すものである。従って、本発明の変異プロテアーゼ
は、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。本発
明の洗剤組成物中への上記プロテアーゼの含有量は変異
プロテアーゼが活性を示す量であればよく、洗浄組成物
１kg当たり０．１〜５０００Ｐ．Ｕ．が含有できるが、
経済性を考慮し１０００Ｐ．Ｕ．以下、好ましくは５０
０Ｐ．Ｕ．以下である。
アーゼは、アルカリ側で活性を有し、高級脂肪酸によっ
てカゼイン分解活性の阻害を受けず、且つ優れた洗浄力
を示すものである。従って、本発明の変異プロテアーゼ
は、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。本発
明の洗剤組成物中への上記プロテアーゼの含有量は変異
プロテアーゼが活性を示す量であればよく、洗浄組成物
１kg当たり０．１〜５０００Ｐ．Ｕ．が含有できるが、
経済性を考慮し１０００Ｐ．Ｕ．以下、好ましくは５０
０Ｐ．Ｕ．以下である。
【００２４】本発明の洗剤組成物は、本発明のアルカリ
プロテアーゼ以外にさまざまな酵素を併用することもで
きる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、ト
ランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガー
ゼ、シンテターゼ等である。このうち、プロテアーゼ、
ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラー
ゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グル
コシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ及び本発明に用いる
アルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼ等が好まし
い。
プロテアーゼ以外にさまざまな酵素を併用することもで
きる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、ト
ランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガー
ゼ、シンテターゼ等である。このうち、プロテアーゼ、
ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラー
ゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グル
コシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ及び本発明に用いる
アルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼ等が好まし
い。
【００２５】プロテアーゼとしては市販のアルカラー
ゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノ
ボ ノルディスク社）、プロペラーゼ、プラフェクト
（ジェネンコア社）、ＫＡＰ（花王社）等が挙げられ
る。セルラーゼとしては、セルザイム、ケアザイム（以
上ノボ ノルディスク社）、ＫＡＣ（花王社）、特開平
１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピー
ＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ等が
挙げられる。アミラーゼとしては、ターマミル、デュラ
ミル（以上、ノボ ノルディスク社）、プラスター（ジ
ェネンコア社）、ＫＡＭ（花王社）等が挙げられる。リ
パーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ（以
上、ノボ ノルディスク社）等が挙げられる。これらの
酵素は０．００１〜１０％、好ましくは０．０３〜５％
配合される。
ゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノ
ボ ノルディスク社）、プロペラーゼ、プラフェクト
（ジェネンコア社）、ＫＡＰ（花王社）等が挙げられ
る。セルラーゼとしては、セルザイム、ケアザイム（以
上ノボ ノルディスク社）、ＫＡＣ（花王社）、特開平
１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピー
ＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ等が
挙げられる。アミラーゼとしては、ターマミル、デュラ
ミル（以上、ノボ ノルディスク社）、プラスター（ジ
ェネンコア社）、ＫＡＭ（花王社）等が挙げられる。リ
パーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ（以
上、ノボ ノルディスク社）等が挙げられる。これらの
酵素は０．００１〜１０％、好ましくは０．０３〜５％
配合される。
【００２６】界面活性剤は、洗剤組成物中０．５〜６０
重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗剤
組成物については１０〜４５％、液体洗剤組成物につい
ては２０〜５０％配合することが好ましい。また本発明
洗剤組成物が漂白洗剤又は自動食器洗浄機用洗剤である
場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜
５％配合される。
重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗剤
組成物については１０〜４５％、液体洗剤組成物につい
ては２０〜５０％配合することが好ましい。また本発明
洗剤組成物が漂白洗剤又は自動食器洗浄機用洗剤である
場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜
５％配合される。
【００２７】二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０
％、好ましくは５〜４０％配合される。
％、好ましくは５〜４０％配合される。
【００２８】アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０
％、好ましくは１〜４０％配合される。
％、好ましくは１〜４０％配合される。
【００２９】再汚染防止剤は０．００１〜１０％、好ま
しくは１〜５％配合される。
しくは１〜５％配合される。
【００３０】漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）
は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用する
ときは漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１
０％配合することができる。
は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用する
ときは漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１
０％配合することができる。
【００３１】蛍光剤はビフェニル型蛍光剤（例えばチノ
パールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ
型蛍光染料）等が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２
％配合するのが好ましい。
パールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ
型蛍光染料）等が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２
％配合するのが好ましい。
【００３２】本発明の洗剤組成物は、上記方法で得られ
るアルカリプロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み
合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態
は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、
粉体、顆粒等にすることができる。なお、本発明のアル
カリプロテアーゼを粉末洗剤組成物に用いる場合は、洗
剤製造時、あるいは使用時に作業者や消費者が酵素との
接触をできるだけ避ける目的や、熱による失活あるいは
分解を防ぐため特開昭６２−２５７９９０号公報に記載
の方法に基づき製造した顆粒を洗剤粒子製造後に混合す
ることが好ましい。
るアルカリプロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み
合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態
は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、
粉体、顆粒等にすることができる。なお、本発明のアル
カリプロテアーゼを粉末洗剤組成物に用いる場合は、洗
剤製造時、あるいは使用時に作業者や消費者が酵素との
接触をできるだけ避ける目的や、熱による失活あるいは
分解を防ぐため特開昭６２−２５７９９０号公報に記載
の方法に基づき製造した顆粒を洗剤粒子製造後に混合す
ることが好ましい。
【００３３】かくして得られる本発明洗剤組成物は、衣
料用洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、配水管洗
浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗
剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤として好適に使用
することができる。
料用洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、配水管洗
浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗
剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤として好適に使用
することができる。
【００３４】
【実施例】（洗浄力の測定法）変異酵素の洗浄力評価
は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行っ
た。市販の衣料用洗剤を所定の使用濃度になるように調
製した溶液に、変異酵素を最終濃度で１０mPU/L、２０m
PU/Lになるように添加した。次いで、変異酵素の洗浄力
評価に供する汚染布ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血
液／ミルク／カーボン）を６×６ｃｍ画に裁断したもの
を添加し、特に断らない限り２０℃で洗浄（１００ｒｐ
ｍ）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色
差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度
を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算
出した。
は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行っ
た。市販の衣料用洗剤を所定の使用濃度になるように調
製した溶液に、変異酵素を最終濃度で１０mPU/L、２０m
PU/Lになるように添加した。次いで、変異酵素の洗浄力
評価に供する汚染布ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血
液／ミルク／カーボン）を６×６ｃｍ画に裁断したもの
を添加し、特に断らない限り２０℃で洗浄（１００ｒｐ
ｍ）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色
差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度
を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算
出した。
【００３５】（カゼイン分解活性の測定法）１％（ｗ／
ｖ）カゼイン（ハマーステイン：メルク社製）を含む５
０mmol／Ｌホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０．５）１mL
を３０℃で５分間保温した後、０．１mLの酵素溶液を添
加し、３０℃で１５分間反応を行った。ＴＣＡ溶液
（０．１１mol／Ｌトリクロロ酢酸：０．２２mol／Ｌ酢
酸ナトリウム：０．３３mol／Ｌ酢酸）２mLを添加して
反応を停止し、室温で１０分間放置した後、酸変性蛋白
を濾過（No．２濾紙：ワットマン社製）した。そして濾
液０．５mLにアルカリ性銅試薬（１％（ｗ／ｖ）酒石酸
カリウム・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％
（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム、０．１mol／Ｌ水酸化ナト
リウム＝１：１：１００（ｖ／ｖ））２．５mLを添加
し、３０℃、１０分間保温した後、希釈フェノール試薬
（フェノール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で２
倍に希釈したもの）０．２５mLを加え、３０℃、３０分
間保温した後、６６０nmにおける吸光度を測定した。上
記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を
加えた系をブランクとした。なお、酵素１単位（Ｐ．
Ｕ．）は、上記の反応条件において１分間に１mmolのチ
ロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量
とした。
ｖ）カゼイン（ハマーステイン：メルク社製）を含む５
０mmol／Ｌホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０．５）１mL
を３０℃で５分間保温した後、０．１mLの酵素溶液を添
加し、３０℃で１５分間反応を行った。ＴＣＡ溶液
（０．１１mol／Ｌトリクロロ酢酸：０．２２mol／Ｌ酢
酸ナトリウム：０．３３mol／Ｌ酢酸）２mLを添加して
反応を停止し、室温で１０分間放置した後、酸変性蛋白
を濾過（No．２濾紙：ワットマン社製）した。そして濾
液０．５mLにアルカリ性銅試薬（１％（ｗ／ｖ）酒石酸
カリウム・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％
（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム、０．１mol／Ｌ水酸化ナト
リウム＝１：１：１００（ｖ／ｖ））２．５mLを添加
し、３０℃、１０分間保温した後、希釈フェノール試薬
（フェノール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で２
倍に希釈したもの）０．２５mLを加え、３０℃、３０分
間保温した後、６６０nmにおける吸光度を測定した。上
記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を
加えた系をブランクとした。なお、酵素１単位（Ｐ．
Ｕ．）は、上記の反応条件において１分間に１mmolのチ
ロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量
とした。
【００３６】実施例１ プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．
０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。
先ず、本２．０kbを増幅できるプライマーを用いＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡを５ng、リン酸化
プライマーを２０pmoL、各ｄＮＴＰを２０nmoL、１μmo
LのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５μmoLのＫＣ
ｌ、０．１５μmolのＭｇＣｌ2、そして２．５Ｕ Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含有し、最終液量を１００μL
とした。ＰＣＲ温度条件は、９４℃において５分間放置
し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分
間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０
サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベ
ーリンガー社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬ
の滅菌水で溶出させた。引き続き、１μLの溶出液を使
用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型Ｄ
ＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じである。２回
目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１０
０μLの滅菌水で溶出させた。
０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。
先ず、本２．０kbを増幅できるプライマーを用いＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡを５ng、リン酸化
プライマーを２０pmoL、各ｄＮＴＰを２０nmoL、１μmo
LのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５μmoLのＫＣ
ｌ、０．１５μmolのＭｇＣｌ2、そして２．５Ｕ Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含有し、最終液量を１００μL
とした。ＰＣＲ温度条件は、９４℃において５分間放置
し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分
間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０
サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベ
ーリンガー社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬ
の滅菌水で溶出させた。引き続き、１μLの溶出液を使
用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型Ｄ
ＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じである。２回
目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１０
０μLの滅菌水で溶出させた。
【００３７】増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みは
TaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応によ
る方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精
製溶出液３５μLにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍
濃縮液）を５μL、ｄＮＴＰ溶液を８μL、ＬＡＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを０．５μL、さらに鋳型としてプラ
スミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロ
テアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量
を５０μLにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃
４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。そ
の後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。こ
のＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有す
るプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連
結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によ
るリガーゼ反応処理を行った。
TaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応によ
る方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精
製溶出液３５μLにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍
濃縮液）を５μL、ｄＮＴＰ溶液を８μL、ＬＡＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを０．５μL、さらに鋳型としてプラ
スミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロ
テアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量
を５０μLにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃
４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。そ
の後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。こ
のＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有す
るプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連
結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によ
るリガーゼ反応処理を行った。
【００３８】次に、同リガーゼ反応液１０μLを用いてB
acillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行っ
たところ約４×１０5個の形質転換体が取得された。そ
こでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有
培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化
ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、
テトラサイクリン７．５μg／mL）上に生育させ、プロ
テアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形
成状態を観察した。
acillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行っ
たところ約４×１０5個の形質転換体が取得された。そ
こでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有
培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化
ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、
テトラサイクリン７．５μg／mL）上に生育させ、プロ
テアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形
成状態を観察した。
【００３９】実施例２ 実施例１で得られた変異プロテアーゼの洗浄力の測定結
果を図１に示す。本発明の変異アルカリプロテアーゼは
いずれも変異を導入する前の野生型酵素に比べて優れた
洗浄力を有していた。
果を図１に示す。本発明の変異アルカリプロテアーゼは
いずれも変異を導入する前の野生型酵素に比べて優れた
洗浄力を有していた。
【００４０】実施例３ （１）粒状洗剤の調製 ＷＯ９９／２９８３０号公報の実施例３に記載の洗剤を
用いて洗浄力評価を行った。即ち攪拌翼を有した１ｍ3
の混合槽に水４６５kgを加え、水温が５５℃に達した後
に、５０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸ナト
リウム水溶液４８kg、４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸
ナトリウム水溶液１３５kgを添加した。１５分間攪拌し
た後、炭酸ナトリウム１２０kg、硫酸ナトリウム６０k
g、亜硫酸ナトリウム９kg、蛍光染料３kgを添加した。
更に１５分間攪拌した後、ゼオライト３００kgを添加
し、３０分間攪拌して均質なスラリーを得た（スラリー
中の水分は５０重量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の
塔頂付近に設置した圧力噴射ノズルから噴霧することで
ベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔
下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で
排出）。次に非イオン界面活性剤１５重量部と５０重量
％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液１５
重量部とポリエチレングリコール１重量部を７０℃にな
るように加熱混合し、混合液を作製した。レディゲミキ
サー（松坂技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）
に上記ベース顆粒１００重量部を投入し、主軸（１５０
rpm）とチョッパー（４０００rpm）の攪拌を開始した。
なお、ジャケットに７５℃の温水を１０Ｌ／分で流し、
そこに上記混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌
を行った。更にこの洗剤粒子群の粒子表面に結晶性アル
ミノ珪酸塩１０重量部で表面被覆を行い、最終粒状洗剤
を得た。 ［使用した原料］ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液：ネオペ
レックスＦ６５（花王（株）製） 非イオン界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル
数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製） ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１０００
０（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法
に従って製造した） 炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製） ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型
（東ソー（株）製） ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分
子量８５００（花王（株）製） 蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
用いて洗浄力評価を行った。即ち攪拌翼を有した１ｍ3
の混合槽に水４６５kgを加え、水温が５５℃に達した後
に、５０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸ナト
リウム水溶液４８kg、４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸
ナトリウム水溶液１３５kgを添加した。１５分間攪拌し
た後、炭酸ナトリウム１２０kg、硫酸ナトリウム６０k
g、亜硫酸ナトリウム９kg、蛍光染料３kgを添加した。
更に１５分間攪拌した後、ゼオライト３００kgを添加
し、３０分間攪拌して均質なスラリーを得た（スラリー
中の水分は５０重量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の
塔頂付近に設置した圧力噴射ノズルから噴霧することで
ベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔
下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で
排出）。次に非イオン界面活性剤１５重量部と５０重量
％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液１５
重量部とポリエチレングリコール１重量部を７０℃にな
るように加熱混合し、混合液を作製した。レディゲミキ
サー（松坂技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）
に上記ベース顆粒１００重量部を投入し、主軸（１５０
rpm）とチョッパー（４０００rpm）の攪拌を開始した。
なお、ジャケットに７５℃の温水を１０Ｌ／分で流し、
そこに上記混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌
を行った。更にこの洗剤粒子群の粒子表面に結晶性アル
ミノ珪酸塩１０重量部で表面被覆を行い、最終粒状洗剤
を得た。 ［使用した原料］ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液：ネオペ
レックスＦ６５（花王（株）製） 非イオン界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル
数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製） ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１０００
０（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法
に従って製造した） 炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製） ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型
（東ソー（株）製） ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分
子量８５００（花王（株）製） 蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
【００４１】（２）プロテアーゼ造粒物の調製 本発明のアルカリプロテアーゼ及び親アルカリプロテア
ーゼの精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報に
記載の方法に基づきプロテアーゼ造粒物を調製した（６
Ｐ．Ｕ．／ｇ）。
ーゼの精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報に
記載の方法に基づきプロテアーゼ造粒物を調製した（６
Ｐ．Ｕ．／ｇ）。
【００４２】（３）洗浄力の測定 ２０℃に温度調節した１Ｌのカルシウム水溶液（７１．
２mg炭酸カルシウム／１Ｌ）に表２に示す洗剤組成物を
０．６７ｇ溶解した。試験布（ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰ
Ａ社製、血液／ミルク／カーボン））を６×６cmに裁断
後、Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（上島製作所製）を
使用し、２０℃、１００rpmで１０分間洗浄を行った。
濯ぎ、乾燥後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５
００ｄ）を用いて明度を測定し、下式より洗浄率を算出
した。結果を表２に併せて示す。
２mg炭酸カルシウム／１Ｌ）に表２に示す洗剤組成物を
０．６７ｇ溶解した。試験布（ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰ
Ａ社製、血液／ミルク／カーボン））を６×６cmに裁断
後、Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（上島製作所製）を
使用し、２０℃、１００rpmで１０分間洗浄を行った。
濯ぎ、乾燥後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５
００ｄ）を用いて明度を測定し、下式より洗浄率を算出
した。結果を表２に併せて示す。
【００４３】
【数１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下
でも活性を有し、かつ洗浄力が高く、洗剤配合用酵素と
して有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
でも活性を有し、かつ洗浄力が高く、洗剤配合用酵素と
して有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
【００４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Alkaline protease <130> P01541304 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305 310 315 320 Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser 325 330 335 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 2 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Ala Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Ile Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr 305 310 315 320 Val Asn Glu Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr 325 330 335 Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Ser Ala Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 3 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Thr Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Thr Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 4 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asn Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 5 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 5 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val 130 135 140 Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Leu Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val 305 310 315 320 Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His <210> 6 <211> 434 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 6 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Thr Ser Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser 85 90 95 Val Met Asp Ser Asn Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Val Ser 100 105 110 Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn 115 120 125 Ser Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn 130 135 140 Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Ala Val Leu Phe Ala Ala 145 150 155 160 Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg 195 200 205 Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly 210 215 220 Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe 225 230 235 240 Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met 245 250 255 Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe 260 265 270 Ile Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala 275 280 285 Leu Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asn 290 295 300 Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe 305 310 315 320 Val Asn Glu Thr Ser Ser Leu Ser Thr Asn Gln Lys Ala Thr Tyr Ser 325 330 335 Phe Thr Ala Gln Ser Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser 340 345 350 Asp Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu 355 360 365 Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp 370 375 380 Phe Thr Ala Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu 385 390 395 400 Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Val Glu Val 405 410 415 Gln Ala Tyr Asn Val Pro Gln Gly Pro Gln Ala Phe Ser Leu Ala Ile 420 425 430 Val Asn <210> 7 <211> 433 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 7 Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn 1 5 10 15 Phe Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp 50 55 60 Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile 85 90 95 Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ala Asn Leu Gln Thr 100 105 110 Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser 115 120 125 Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val 130 135 140 Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Glu Gly Pro Gly Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys 165 170 175 Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Pro Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr 210 215 220 Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp 225 230 235 240 Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala 245 250 255 Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val 260 265 270 Lys Asn Arg Gly Val Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Phe Pro Asn Gly Asn Gln 290 295 300 Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe Val 305 310 315 320 Asn Glu Thr Ser Pro Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe 325 330 335 Thr Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp 340 345 350 Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp 355 360 365 Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe 370 375 380 Thr Ala Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn 385 390 395 400 Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Val Glu Val Gln 405 410 415 Ala Tyr Asn Val Pro Val Ser Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile Val 420 425 430 His
【図１】各変異アルカリプロテアーゼの洗浄力を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/54 5/00 Ａ (72)発明者 荒木 裕行 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 佐藤 剛 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 佐伯 勝久 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 影山 泰 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA04 CA06 DA07 EA04 GA11 HA01 4B050 CC04 DD02 LL04 4B065 AA15Y AA19X AB01 AC14 BA02 BD45 CA57 4H003 DA01 EC02 FA47
Claims (8)
- 【請求項１】 配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０
４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれ
に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸
残基； （ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロリン残
基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）位置：
アスパラギン残基、から選ばれたものであるアルカリプ
ロテアーゼ。 - 【請求項２】 配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれ
と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアル
カリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）８４
位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３
６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又
は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロリン残
基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）位置：
アスパラギン残基、から選ばれたものであるアルカリプ
ロテアーゼ。 - 【請求項３】 配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％
以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロ
テアーゼが、配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列
を有する請求項２記載のアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項４】 請求項１〜３記載のアルカリプロテアー
ゼをコードする遺伝子。 - 【請求項５】 請求項４記載の遺伝子を含有する組換え
ベクター。 - 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターを含有す
る形質転換体。 - 【請求項７】 宿主が微生物である請求項６記載の形質
転換体。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアル
カリプロテアーゼを含有する洗剤組成物。
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