CN112301023A - 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用 - Google Patents

基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程改造技术领域,具体涉及一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。本发明通过对来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶通过计算机模拟，用分子动力学方法研究2709碱性蛋白酶的动态结构特征，这是目前唯一能够从原子水平上来研究2709碱性蛋白酶结构与分子动力学与酶功能关系的有效方法。通过分子动力学计算后，选择合适位点进行蛋白质工程改造，获得了适合洗涤剂工业应用的2709碱性蛋白酶突变体。本发明的蛋白酶突变体在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好的去污作用，还具有和洗涤剂中各组分兼容性好，可广泛应用于洗涤工业领域。

Description

基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造技术领域,具体涉及一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。
背景技术
酶制剂在洗涤剂工业中作为洗涤制剂的重要助剂已经使用了40多年。蛋白酶是这些制剂中最重要酶之一，当然其他酶包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶或酶混合物也用于洗涤剂中。
为改进蛋白酶的成本和/或性能，寻找具有改变特性的蛋白酶一直是近年来的研究热点，这些特性如：更高的低温活性、更高的热稳定性、在给定pH下更高的比活性、改变的Ca2+依赖性、在其他洗涤剂成份存在下不受影响且能保持更高的稳定性等。
寻找具有改变特性的蛋白酶包括发现天然存在的蛋白酶(即所谓野生型蛋白酶)和改造已熟知的蛋白酶(如通过对编码所述蛋白酶的核酸序列的基因操作) 一直是寻求酶的高效和应用改性的两个重要方向。近年来计算化学的快速进展对蛋白质三维结构和功能之间关系的认识提高了评估改变蛋白质的哪一区域来影响蛋白质特定性状的能力。通过计算化学来评估并改造高效能的酶变的越来越有可能性。
经常在洗涤剂中使用的一个酶制剂品种是蛋白酶，目前国内对于碱性蛋白酶的研究还处于起步阶段，已产业化的碱性蛋白酶酶种类较少，且在产品性能和生产成本方面与国外同类产品的差距很大，远远不能满足国内日益增长的市场需要。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种碱性蛋白酶突变体，本发明通过对来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶结构进行计算机模拟，用分子动力学方法研究和评估改变碱性蛋白酶2709的动态结构特征的哪一区域来影响其特定性状及酶效能的能力，这也是目前唯一能够从原子水平上来研究2709碱性蛋白酶结构与分子动力学与酶功能关系的有效方法。通过分子动力学计算后，选择合适位点进行蛋白质工程改造，获得了适合洗涤剂工业应用的突变体蛋白酶。本发明的蛋白酶突变体在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好的去污作用，还具有和洗涤剂中各组分兼容性好，可广泛应用于洗涤工业领域。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
尽管目前的蛋白酶晶体学研究为研究蛋白酶的催化机制提供了宝贵的结构信息，但是酶的晶体结构仅提供了底物结合前和结合后的静态构象，是基于一级氨基酸序列的比对做出的，较少考虑三维结构。同时酶与底物的结合本身是一个动态过程，会涉及一系列的构象变化和相互作用。例如，底物是如何与酶结合并定位到正确的位置。催化完成后产物如何释放？以及这些动力学过程如何调节的？
对于碱性蛋白酶2709而言，无论是与底物结合前还是结合后的结构，获取他们的分子运动特征和动力学细节信息对于全面理解其功能都是非常有必要的。鉴于实验手段的限制，直接观察蛋白质的动力学特征还无法实现，因此，通过计算机模拟，用分子动力学方法研究碱性蛋白酶2709的动态结构特征，这也是目前唯一能够从原子水平上来研究蛋白酶结构-动力学-功能关系的有效方法。我们分别对没有底物结合的蛋白酶2709和有底物结合的蛋白酶2709进行长时间分子动力学模拟，以观察底物结合前后所诱导的分子运动变化探究其动态催化机理，然后在此基础上优化突变蛋白酶2709的基因结构并进行计算选择出最适洗涤工业应用的突变点，可使2709碱性蛋白酶的作用pH和稳定性发生改变，并显著提升其分解洗涤污渍的效果，且与洗涤剂助剂相容性良好从而促成本发明。
本发明提供一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体，其亲本蛋白为地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶。
所述碱性蛋白酶突变体含有11-33区域内氨基酸的缺失或至少包含有以下位置的氨基酸修饰置换中的一个：9、12、15、16、17、18、19、33、38、39、 40、41、42、46、47、48、49、50、58、59、60、67、79、96、97、98、99、 107、108、109、110、111、116、131、132、133、134、139、140、152、153、 163、164、165、166、173、188、189、190、191、193、195、198、201、203、 211、221、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、 255、256、257、259、260、262、268、273，其中所述位置对应于氨基酸序列 SEQ ID NO：1的位置。
进一步，所述碱性蛋白酶突变体至少包含G79D、N116D、I173D、P9R、 Q273R中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列 SEQ ID NO：1的位置。
进一步，所述碱性蛋白酶突变体至少包含G46P、N96P、I110P、D139P、 N140P、P166S、A198P、A201P、V203P、T211S、L239P、G256P、G262P/S和 V268P中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。
进一步，所述碱性蛋白酶突变体含有位置17-33或15-33的氨基酸缺失，同时至少含有K12N/Q、Q19S/R、T33H/Y/K中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。
本发明提供一种质粒，该质粒携带有编码上述2709碱性蛋白酶突变体的基因。
本发明提供一种重组地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌是将上述携带有编码 2709碱性蛋白酶突变体的基因的质粒转入地衣芽孢杆菌中构建的。
本发明提供一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物含有上述2709碱性蛋白酶突变体。
本发明提供一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体的应用，应用于清洁或洗涤领域。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1.本发明通过计算机模拟，用分子动力学方法研究2709碱性蛋白酶的动态结构特征，选择合适位点进行蛋白质工程改造，获得了适合洗涤剂工业应用的 2709碱性蛋白酶突变体。
2.本发明2709碱性蛋白酶突变体具有较好的热稳定性。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，2709碱性蛋白酶及其突变体50℃保温半小时，可以明显看出2709碱性蛋白酶突变体剩余活力明显高于2709碱性蛋白酶，即使保温更长时间，始终是突变改进后的突变体的残余活力高。
3.本发明2709碱性蛋白酶突变体在碱性pH条件下稳定性好，适用范围更加宽泛。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，碱性蛋白酶及其突变体在不同 pH下保温1小时，可以明显看出突变体剩余活力在pH大于9后明显高于原 2709碱性蛋白酶。
4.本发明2709碱性蛋白酶突变体酶相比2709碱性蛋白酶在市售浓缩粉和标准液体洗涤体系中有更好的稳定性。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，添加相同量的2709碱性蛋白酶及其突变体在市售浓缩粉和标准液体洗涤体系中，可以明显看出2709碱性蛋白酶突变体相比2709碱性蛋白酶活在上述两种洗涤剂体系中酶活均较均更稳定。有助于拓展碱性蛋白酶的使用范围，为其更广泛的应用于洗涤工业领域奠定了基础。
5.本发明2709碱性蛋白酶突变体在极端条件下有更好的保留活性。在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，测定2709碱性蛋白酶及其突变体在40℃表面充分暴露、75％湿度的苛刻环境下的湿热稳定性，可以看出2709碱性蛋白酶突变体的剩余活力始终高于原始2709碱性蛋白酶，且蛋白酶突变体两周后的残余酶活力都在75％以上，而2709碱性蛋白酶残余酶活仅有35％左右。
6.本发明的2709碱性蛋白酶突变体较原始型2709碱性蛋白酶对蛋白污渍的去污效果得到显著提升，取得了意料不到的技术效果，同时本发明所述2709碱性蛋白酶突变体在其它洗涤剂存在的情况下不受影响仍能保持较高的去污能力。
附图说明
图1 2709碱性蛋白酶蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；其中Mr所示为蛋白Marker；泳道1所示为2709碱性蛋白酶表达情况，泳道2所示为2709碱性蛋白酶突变体(对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2)的表达情况。
图2为50℃条件下，2709碱性蛋白酶突变体与2709碱性蛋白酶酶活力稳定性曲线图。
图3为pH对2709碱性蛋白酶突变体与2709碱性蛋白酶的酶活力影响曲线图。
图4为2709碱性蛋白酶突变体与2709碱性蛋白酶在不同洗涤剂中稳定性曲线图。
图5为2709碱性蛋白酶突变前后湿热稳定性图。
图中2709碱性蛋白酶突变体1对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，2709碱性蛋白酶突变体2对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列， 2709碱性蛋白酶突变体3对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，下述实例中所用方法如无特别说明均为分子克隆、蛋白质纯化以及酶分析的常规方法。其中，原始2709 碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，2709碱性蛋白酶突变体 1的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，2709碱性蛋白酶突变体2的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列，2709碱性蛋白酶突变体3的氨基酸序列为 SEQ ID NO：4所示序列。
实施例1
碱性蛋白酶酶活力的测定：
碱性蛋白酶酶活测定方法：参照GB/T 23527-2009附录B福林法进行,具体反应过程如下:首先取出一系列空试管,每组将一个试管标记为对照组,将其余三个试管标记为实验组。在所有试管中，加入1mL用缓冲液配制的1％的酪素溶液,并将试管在40℃下保温2min；向除了空白之外的试管中加入1mL的粗酶液，使酶液和底物反应10min；加入2mL0.4mol/L三氯乙酸以终止反应；对照组加入1mL酶液；静置10min后离心，各取1mL上清液于新的试管中；加入5mL碳酸钠，1mL Folin试剂；置于40℃显色20min。在680nm处测定吸光值。酶活计算公式如下:X＝A×K×4/10×n,其中X代表蛋白酶酶活力(U/mL)；A表示样品平行试验的平均吸光度；K代表吸光常数(实验室测定值K＝97)；4表示反应试剂的总体积(mL)；10表示反应时间10min；n为稀释倍数。
实施例2
2709碱性蛋白酶突变体基因的筛选及合成
分子动力学模拟通过Amber软件完成，在山西大学计算中心GPU计算集群上进行，使用1个GPU显卡，24个小时的模拟时间单位尺度为100ns。分子动力学模拟的具体参数设置为：时间步长为2飞秒(fs)；静电相互作用由PME算法描述，静电相互作用的截断半径设置为
Figure BDA0002778298990000071
范德华相互作用的截断半径设置为
Figure BDA0002778298990000072
溶质(即蛋白质分子)和溶剂(即水分子和钠离子)被分别进行热浴处理，温度设置为300K；压力设置为一个标准大气压。原子的初始速率根据300k温度下的麦克斯维尔(Maxwell)分布随机生成。生产分子动力学模拟的时长为300ns，共含有30000帧。由于碱性蛋白酶的研究多是基于一级氨基酸序列的比对作出的，较少考虑三维结构。借助于运用计算化学分子动力学的三维结构模拟计算出洗涤应用效果显著的酶制剂三维结构后，进行定点突变并计算定点突变后碱性蛋白酶突变体在分解底物及水环境下的能量及稳定性。根据分子动力学模拟通过Amber软件计算完成的碱性蛋白酶突变体结构，更具有效性。
实施例3
碱性蛋白酶突变体的构建和表达：
本发明的碱性蛋白酶突变体的构建可通过本领域技术人员熟知的方法构建和表达。发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001) 和CURRENT ROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。而且本发明不限定于实施例中记载的具体方法、实验方案和试剂，还包括本领域的技术人员。
按照北京全氏金生物技术有限公司的Fast Mutagenesis System设计上下游引物，以构建好的碱性蛋白酶2709突变体的重组质粒pBE 2R-AP为模板，以相应的突变体引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物。
PCR扩增反应体系为：2×PCR SuperMix 25μL,引物Up(10μmol/L)1μL, 引物Dn(10μmol/L)1μL，模板(1/30)1μL,加水补足至50μL。
扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性20s，55℃退火20s，7 2℃延伸4min，25个循环；72℃延伸10min。4℃保存。
加1μL DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。加2-5μL的DMT酶消化产物，用热激法转入地衣芽孢杆菌，提质粒进行测序确定。
将测序正确的重组质粒转入感受态细胞WB600中，具体转化过程如下：用枪头挑取在LB(蛋白胨1％，NaCl 1％，酵母粉0.5％，琼脂粉1.5％)平板上生长的单菌落于2mLGMI中，培养12h；
GMI配制方法：10mL溶液A，1.5mL溶液B，25mL溶液C，100uL溶液 D，25mL溶液G，加灭菌水至100mL。其中，溶液A配制方法：0.4g酵母提取物，0.08g酪蛋白水解物，溶于40mL水中；溶液B配制方法：5g葡萄糖，溶于10mL水中；溶液C配制方法：4.8g KH2PO4，11.2g K2HPO4，0.16g MgSO4·7H2O，0.8g柠檬酸三钠，1.6g(NH4)2SO4，溶于200mL水中；溶液D：0.9gMnCl2·4H2O，1.415g硼酸，0.68g FeSO4·7H2O，13.45mg CuCl2·2H2O， 23.5mg ZnSO4·7H2O，20.2mg CoCl2·6H2O，12.6mg高钼酸钠，0.855g酒石酸钠，溶于500mL水中；溶液G配制方法：36.5g山梨醇，溶于100mL水中。
将过夜培养的菌液加到98mLGMI中，37℃，200rpm培养约4h；取10mL 菌液加入90mLGMII(GMII配制方法：98mL GMI，1mL溶液E，1mL溶液F，混匀。其中，溶液E配制方法：2.16gMgCl2·6H2O，溶于20mL水中；溶液F 配制方法：147mg CaCl2溶于20mL水中)中，37℃，200rpm培养约90min；菌体冰水浴30min，4000rpm，4℃离心30min，去上清；加10mL GMIII(GMIII 配制方法：9mL GMII，1mL甘油)，混匀，即为感受态细胞。
在500μL感受态细胞中加入5μL质粒，直接将感受态细胞置于37℃， 200rpm摇床培养1.5h，低速离心3min，弃部分上清，均匀涂布于含40μg/mL 卡那霉素的脱脂奶粉培养基平板上，37℃恒温培养箱培养12h。次日平板上的单菌落即为含碱性蛋白酶突变体的重组菌株。
碱性蛋白酶突变体地衣芽孢杆菌重组工程菌接种于5mL LB液体培养基(蛋白胨1％，NaCl 1％，酵母粉0.5％)中，37℃，200rpm振荡培养12h，将菌液按 2％的接菌量分别转接于发酵产酶培养基(糊精1％,可溶性淀粉2％，酵母粉1％， NaCl 0.5％，pH值为7.0)中，37℃，200rpm振荡培养84h。
发酵完成后，发酵液13000r/min离心15min，然后上清液用0.22μm膜在正压滤器上过滤去除残留地衣芽孢杆菌。上清液分别缓慢加硫酸铵粉末到碱性蛋白酶突变体的粗酶液中，使硫酸铵浓度至70％，待硫酸铵粉末完全溶解，在4℃层析柜中过夜静置，再以13000rpm离心30min，收集沉淀，将沉淀于50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH＝8的缓冲液透析并用超滤杯超滤浓缩。上样至用相同缓冲液(50mM Tris-HCl，1 00mM NaCl，pH 8)平衡好的Superdex75凝胶层析柱(购自GE公司)，收集2709碱性蛋白酶突变体。在SDS-PAGE电泳，图1结果显示为单一条带的蛋白样品。
实施例4
碱性蛋白酶突变体的稳定性实验：
蛋白浓度为0.2mg/ml，蛋白缓冲液为50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0。酶活测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林法进行。
1.日常洗涤温度一般为30℃或40℃，本实验在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，测试2709碱性蛋白酶及其突变体在50℃条件下的活力稳定性情况，确认其可在正常洗涤温度中稳定发挥去污作用。将试样在50℃条件下保温3h，每隔0.5h取样测定酶活性。酶活测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林法进行。从图2可以看出在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，2709碱性蛋白酶及其突变体在50℃条件下保温半小时，2709碱性蛋白突变体的剩余活力明显高于原始2709碱性蛋白酶，并且即使保温更长时间，突变体的残余活力始终高于原始2709碱性蛋白酶。
2.在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，测试2709碱性蛋白酶及其突变体 1和2在pH为5-13范围的酶活力，酶活测定方法参照GB/T 23527-2009附录B 福林法进行。从图3可以明显看出突变体的剩余活力在pH大于9后明显高于原始2709碱性蛋白酶。
3.在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，分别添加相同量的2709碱性蛋白酶和其突变体1和2于市售浓缩粉和标准液体洗涤体系中，测其酶活力，酶活测定方法参照GB/T23527-2009附录B福林法进行。从图4可以明显看出2709 碱性蛋白酶突变体相比2709碱性蛋白酶在上述两种洗涤剂体系中有更好的稳定性。
4、在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，测定2709碱性蛋白酶及其突变体1、2和3在40℃表面充分暴露、75％湿度的苛刻环境下的湿热稳定性，图5 可以看出2709碱性蛋白酶突变体的剩余活力始终高于原始2709碱性蛋白酶，且蛋白酶突变体两周后的残余酶活力都在75％以上，而2709碱性蛋白酶残余酶活仅有35％左右。
综合表明本发明所述的2709碱性蛋白酶具有较好的耐热性能，其酶活力在碱性条件下有明显提高，且湿热稳定性较好。2709碱性蛋白酶突变体作为洗涤助剂使用时，具有良好的去污作用，比亲本蛋白酶在极端条件下能更好的保留活性，可以在更高的温度下以及更强的碱性环境下使用。表明本发明所述2709 碱性蛋白酶突变体可广泛应用于洗涤工业领域。
实施例5
2709碱性蛋白酶突变体应用于洗涤剂中的蛋白污渍去污效果验证实验
1、实验材料：
1)碱性蛋白酶样品：
市售国外碱性蛋白酶产品：酶活5000U/ml；
本发明所述2709碱性蛋白酶突变体1：酶活5000U/ml；
本发明所述2709碱性蛋白酶突变体2：酶活5000U/ml；
本发明所述2709碱性蛋白酶突变体3：酶活5000U/ml；
本发明所述原始2709碱性蛋白酶：酶活5000U/ml。
2)市售洗衣浓缩粉和标准液体洗涤剂
3)JB02国标蛋白污布GB/T 7568.2-2008
2、去污力洗涤实验条件：
将上述碱性蛋白酶样品分别按比例(表1方式)添加到市售洗涤浓缩粉及标准液体洗涤剂中，通过循环洗涤的方法(GB/T 13174-2008)确定2709碱性蛋白酶突变体对JB02国标蛋白污布的去污效果。
洗涤设备：立式去污机(RHLQⅡ)，中国日用化学工业研究院
洗涤温度：30℃
洗涤时间：20min
搅拌速度：120r/min
水质硬度：250mg/kg(nCa2+/nMg2+＝3/2)
洗涤剂浓度：标准洗衣液2g/L；市售洗涤浓缩粉1g/L
反射值测量仪：白度仪(WSD-3C)
测试污布：JB02国标蛋白污布
R457白度：蓝光白度Wr
3、实验结果如下：
表1不同碱性蛋白酶对JB02国标蛋白污布洗前洗后白度差值
Figure BDA0002778298990000121
Figure BDA0002778298990000131
表2不同碱性蛋白酶对JB02国标蛋白污布的去污比值
Figure BDA0002778298990000132
备注：洗后与洗前的白度差值越大，去污效果越明显；去污比值越大，去污效果越好。
从表1和表2的数据可以看出，添加2709碱性蛋白酶突变体样品的实验组 2-5对JB02国标蛋白污布洗后与洗前白度差值较大，说明2709碱性蛋白酶突变体对蛋白污渍确实具有一定的去污效果；其中，添加2709碱性蛋白酶突变体的实验组3-5和8-10对蛋白污渍的去污力明显高于原始型2709碱性蛋白酶实验组 2和7以及对照组1和2，与国外市售蛋白酶产品对蛋白污渍的去污能力相当。从而说明，本发明所述2709碱性蛋白酶突变体较原始型2709碱性蛋白酶对蛋白污渍的去污效果得到显著提升，取得了意料不到的技术效果，同时本发明所述2709碱性蛋白酶突变体在其它洗涤剂存在的情况下不受影响仍能保持较高去污能力。表明该2709碱性蛋白酶突变体可用于清洁或洗涤领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
SEQ ID NO：1
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val GlnAla Gln Gln Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile GlnAla Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu AlaTyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly Met Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala LeuAsp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val LysVal Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu TrpAla Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly SerThr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Lys Arg Val Val Val Val AlaVal Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys TyrGlu Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe SerSer Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr TyrPro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val AlaGly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val ArgAsn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys GlyLeu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
SEQ ID NO：2
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Arg Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val GlnAla Gln Gln Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile GlnAla Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu AlaTyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly Met Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala LeuAsp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val LysVal Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu TrpAla Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly SerThr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Lys Arg Val Val Val Val AlaVal Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys TyrGlu Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe SerSer Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr TyrPro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val AlaGly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val ArgAsn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys GlyLeu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Arg
SEQ ID NO：3
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val GlnAla Gln Gln Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile GlnAla Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu AlaTyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly Met Pro Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala LeuAsp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val LysVal Leu Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Pro Glu TrpAla Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly SerThr Ala Met Lys Gln Ala Val Pro Pro Ala Tyr Ala Lys Arg Val Val Val Val AlaVal Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Ser Ala Lys TyrGlu Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe SerSer Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Pro Pro Gly Pro Gly Val Tyr Ser Thr TyrPro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val AlaGly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val ArgAsn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys GlyLeu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
SEQ ID NO：4
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Asn Ala Asp Lys Val GlnAla Ser Gln Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp His Gly Ile GlnAla Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu AlaTyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly Met Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala LeuAsp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val LysVal Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu TrpAla Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly SerThr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Lys Arg Val Val Val Val AlaVal Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys TyrGlu Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe SerSer Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr TyrPro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val AlaGly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val ArgAsn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys GlyLeu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln。
序列表
<110> 山西大学
<120> 分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
Ala Gly Thr Val Pro Thr Gly Ile Pro Leu Ile Leu Ala Ala Leu Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Pro Leu Gly Ala Ala Val Leu Val Ala Val Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Ile Gly Ala Ser His Pro Ala Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Pro Val Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Met Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Thr Ala Val Leu Val Leu Ala
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Gly Thr
100 105 110
Ala Thr Thr Ala Gly Met Ala Val Ile Ala Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Leu Gly Ala Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu
130 135 140
Ala Val Val Val Val Ala Val Gly Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ala Thr Ile Gly Thr Pro Ala Leu Thr Gly Ser Val Ile Ala Val Gly
165 170 175
Ala Val Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Ala
180 185 190
Gly Leu Gly Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Thr Ser Thr Thr Pro
195 200 205
Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu Ala Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
210 215 220
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Leu His Pro Ala Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ser Gly Val Ala Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Ser Ser Pro Thr Thr Gly Leu Gly Leu Ile Ala Val Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Gly
<210> 2
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Gly Thr Val Pro Thr Gly Ile Ala Leu Ile Leu Ala Ala Leu Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Pro Leu Gly Ala Ala Val Leu Val Ala Val Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Ile Gly Ala Ser His Pro Ala Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Pro Val Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Met Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Thr Ala Val Leu Val Leu Ala
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Gly Thr
100 105 110
Ala Thr Thr Ala Gly Met Ala Val Ile Ala Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Leu Gly Ala Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu
130 135 140
Ala Val Val Val Val Ala Val Gly Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ala Thr Ile Gly Thr Pro Ala Leu Thr Gly Ser Val Ile Ala Val Gly
165 170 175
Ala Val Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Ala
180 185 190
Gly Leu Gly Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Thr Ser Thr Thr Pro
195 200 205
Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu Ala Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
210 215 220
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Leu His Pro Ala Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ser Gly Val Ala Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Ser Ser Pro Thr Thr Gly Leu Gly Leu Ile Ala Val Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Ala
<210> 3
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Pro Leu Gly Ala Ala Val Leu Val Ala Val Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Ile Gly Ala Ser His Pro Ala Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Pro Val Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Met Pro
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Thr Ala Val Leu Val Leu Pro
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ile Val Ser Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Ala Thr Thr Ala Gly Met Ala Val Ile Ala Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Leu Gly Ala Val Pro Pro Ala Thr Ala Leu
130 135 140
Ala Val Val Val Val Ala Val Gly Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ala Thr Ile Gly Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Val Ile Ala Val Gly
165 170 175
Ala Val Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Ala
180 185 190
Gly Leu Gly Val Met Pro Pro Gly Pro Gly Val Thr Ser Thr Thr Pro
195 200 205
Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu Ala Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
210 215 220
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Leu His Pro Ala Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ser Gly Val Ala Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Thr Leu Gly
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Ser Ser Pro Thr Thr Gly Leu Gly Leu Ile Ala Val Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Gly
<210> 4
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Gly Thr Val Pro Thr Gly Ile Pro Leu Ile Ala Ala Ala Leu Val
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Pro Leu Gly Ala Ala Val Leu Val Ala Val Leu Ala
20 25 30
His Gly Ile Gly Ala Ser His Pro Ala Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Pro Val Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Met Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Thr Ala Val Leu Val Leu Ala
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Gly Thr
100 105 110
Ala Thr Thr Ala Gly Met Ala Val Ile Ala Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Leu Gly Ala Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu
130 135 140
Ala Val Val Val Val Ala Val Gly Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ala Thr Ile Gly Thr Pro Ala Leu Thr Gly Ser Val Ile Ala Val Gly
165 170 175
Ala Val Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Ala
180 185 190
Gly Leu Gly Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Thr Ser Thr Thr Pro
195 200 205
Thr Ser Thr Thr Ala Thr Leu Ala Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His
210 215 220
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Leu His Pro Ala Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ser Gly Val Ala Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Ser Ser Pro Thr Thr Gly Leu Gly Leu Ile Ala Val Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Gly

Claims (8)

1.一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体，其特征在于：所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白为地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体含有11-33区域内氨基酸的缺失或至少包含有以下位置的氨基酸修饰置换中的一个：9、12、15、16、17、18、19、33、38、39、40、41、42、46、47、48、49、50、58、59、60、67、79、96、97、98、99、107、108、109、110、111、116、131、132、133、134、139、140、152、153、163、164、165、166、173、188、189、190、191、193、195、198、201、203、211、221、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、255、256、257、259、260、262、268、273，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQID NO：1的位置。
2.根据权利要求1所述的一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体，其特征在于：所述碱性蛋白酶突变体至少包含G79D、N116D、I173D、P9R、Q273R中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。
3.根据权利要求1所述的一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体，其特征在于：所述碱性蛋白酶突变体至少包含G46P、N96P、I110P、D139P、N140P、P166S、A198P、A201P、V203P、T211S、L239P、G256P、G262P/S和V268P中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。
4.根据权利要求1所述的一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体，其特征在于：所述碱性蛋白酶突变体含有位置17-33或15-33的氨基酸缺失，同时至少含有K12N/Q、Q19S/R、T33H/Y/K中的一个位置上的氨基酸修饰置换，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的位置。
5.一种质粒，其特征在于：所述的质粒携带有编码权利要求1-4任一项所述的2709碱性蛋白酶突变体的基因。
6.一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述的地衣芽孢杆菌是将权利要求5所述的质粒转入地衣芽孢杆菌中构建的。
7.一种洗涤剂组合物，其特征在于：含有权利要求1-4中任一项所述的2709碱性蛋白酶突变体。
8.一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体的应用，其特征在于：用于清洁或洗涤领域。
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