CN109666666B - 一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶i热稳定性的突变体及其制备方法 - Google Patents

一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶i热稳定性的突变体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体，所述突变体为突变体BtHepIQ198R和/或突变体BtHepIK247W，所述突变体BtHepIQ198R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述突变体BtHepIK247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明突变体为热稳定性能优良的肝素酶I突变株，具有较大的工业应用潜力以及经济价值，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。

Description

一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的 突变体及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质表达技术领域，尤其是一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法。
背景技术
肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验。它在制备低分子量肝素、清除体外血液循环中肝素和确定肝素精细结构方面有着重要作用。当前对于肝素酶I的研究大都来自于肝素黄杆菌，本研究研究的是来源于多形拟杆菌的肝素酶I，但基于理性设计的肝素酶I的分子改造，尤其是关于肝素酶I热稳定性的分子改造研究未见有报道。
目前市面上报道的肝素酶I的热稳定性都很差，这一大弊端，严重地限制了肝素酶I在工业上的应用。筛选出热稳定性肝素酶I的突变体，有助于优化肝素酶I降解肝素的生产工艺；此外，对于延长肝素酶I的货架周期，也具有很重要的意义。传统的定性进化方法工作量太大，无法在短时间内得到效果良好的突变体。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法(CN106497897A)，涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。
通过对比，本发明申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法，该为热稳定性能优良的肝素酶I突变株，与野生型相比，阳性突变体BtHepIQ198R和BtHepIK247W在40℃的半衰期较野生型BtHepI分别提高了30.55％和14.63％；在50℃下的半衰期较野生型BtHepI分别提高了61.04％和30.84％，具有较大的工业应用潜力以及经济价值，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体，所述突变体为突变体BtHepIQ198R和/或突变体BtHepIK247W，所述突变体BtHepIQ198R的氨基酸序列为SEQID NO.1，所述突变体BtHepIK247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的编码基因，所述突变体BtHepIQ198R的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述突变体BtHepIK247W的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
包含如上所述的编码基因的重组质粒。
包含如上所述的编码基因的转化子。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的制备方法，步骤如下：
⑴利用AMBER16软件对肝素酶I进行分子动力学的酶柔性分析；
⑵首先通过第一次优化，优化溶剂，蛋白通过
Figure GDA0002833525620000021
的力固定住，包括2000步的最陡下降法和2000步的共轭梯度法优化；第二次优化侧链，用
Figure GDA0002833525620000022
的力固定蛋白骨架原子；第三次是全体优化，对整个体系不设置任何限制；然后是进入加热阶段，在50ps内从0K逐渐升温至300K；接着是100ps的在300K条件下的NPT模拟；最后是进入NVT模拟50ns，涉及氢原子的键采用SHAKE算法进行限制优化；
⑶接着应用MOE中的Residue scan模块进行全突变扫描；
⑷基于RMSF和dStability，即kcal/mol的值，并利用生物信息学软件，构建热稳定肝素酶I突变体的电子文库；
⑸利用多种生物信息学软件分析，筛选出除酶活性中心以外的其他备选突变体；
⑹分别利用特定的突变引物对，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；测序验证正确后，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。
而且，所述方法中表达载体为原核表达质粒和真核表达质粒；所述方法中表达宿主为原核表达宿主和真核表达宿主。
而且，具体步骤如下：
⑴BtHepI空间晶体结构：登录蛋白结构数据库htpp：//rcsb.org，下载蛋白质的晶体结构；
⑵热稳定性的肝素酶I突变体的理性设计：通过分子动力学的酶柔性分析，找到肝素酶I的不稳定区域，通过整合信息分析，筛除那些处于酶活性中心会影响酶的催化效率的氨基酸残基；根据计算的RMSF和dStability，即kcal/mol的值，进行实验验证；
⑶含突变基因BthepiQ198R和BthepiK247W表达工程菌的构建：根据上述分析结果以及BtHepI的基因序列设计2对突变引物：Q198R-F、Q198R-R；K247W-F、K247W-R；
以含有Bthepi基因的质粒pE-SUMO-Bthepi为模板，使用以上引物进行PCR，反应条件为：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-BthepiQ198R、pE-SUMO-BthepiK247W转化入表达菌株Rosetta(DE3)中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；
⑷经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的活性测定方法，步骤如下：
酶活测定采用232nm的光吸收法，以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，一个酶活力单位指在30℃，1min内产生1μmol的△4,5不饱和糖醛酸反应效力；反应体系为：1.5mL的离心管中加入100μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠的混合液，金属浴中40℃恒温孵育10min，加入稀释纯化脱盐后的浓度为20-25ug/ml的酶液10μL，反应10min，立即加入0.06mol/L盐酸1mL终止反应；在12000r/min条件下离心5min，取上清液测定其在232nm的吸光值。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明突变体为热稳定性能优良的肝素酶I突变株，与野生型相比，阳性突变体BtHepIQ198R和BtHepIK247W在40℃的半衰期较野生型BtHepI分别提高了30.55％和14.63％；在50℃下的半衰期较野生型BtHepI分别提高了61.04％和30.84％，具有较大的工业应用潜力以及经济价值，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。
2、本发明方法利用生物信息学的分子动力学的酶柔性分析建立了热稳定性肝素酶I的电子突变文库，并基于结构特性对电子文库进行了筛选，在此基础上通过计算得到微型突变体文库。基于本发明方法可以快速获得热稳定性能优良的肝素酶I突变株，有效降低了突变文库的筛选工作量。同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明中重组质粒pE-SUMO-PhhepiQ198R构建示意图；
图2为本发明中重组质粒pE-SUMO-PhhepiK247W的构建示意图；
图3为本发明中重组突变酶BtHepIQ198R和BtHepIK247W的表达和纯化的SDS-PAGE图
其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD，25KD，15KD；泳道1、野生型pE-SUMO-Bthepi重组菌的超声破壁上清，上样20ul，泳道2、pE-SUMO-Bthepi表达产物纯化，上样20ul，泳道3、pE-SUMO-BthepiQ198R重组菌的超声破壁上清，上样20ul，泳道4、pE-SUMO-BthepiK247W表达产物的纯化，上样20ul，泳道5、pE-SUMO-PhhepiS169D/A259D重组菌的超声破壁上清，上样量20ul，泳道6、pE-SUMO-PhhepiS169D /A259D表达产物的纯化；
图4为本发明中BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W在40℃和50℃下的热稳定曲线图；
图5为本发明中BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的最适温度和pH图。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体，所述突变体为突变体BtHepIQ198R和/或突变体BtHepIK247W，所述突变体BtHepIQ198R的氨基酸序列为SEQID NO.1，所述突变体BtHepIK247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的编码基因，所述突变体BtHepIQ198R的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述突变体BtHepIK247W的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
包含如上所述的编码基因的重组质粒。
包含如上所述的编码基因的转化子。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的制备方法，步骤如下：
⑴利用AMBER16软件对肝素酶I进行分子动力学的酶柔性分析；
⑵首先通过第一次优化，优化溶剂，蛋白通过
Figure GDA0002833525620000051
的力固定住，包括2000步的最陡下降法和2000步的共轭梯度法优化；第二次优化侧链，用
Figure GDA0002833525620000052
的力固定蛋白骨架原子；第三次是全体优化，对整个体系不设置任何限制；然后是进入加热阶段，在50ps内从0K逐渐升温至300K；接着是100ps的在300K条件下的NPT模拟；最后是进入NVT模拟50ns，涉及氢原子的键采用SHAKE算法进行限制优化；
⑶接着应用MOE中的Residue scan模块进行全突变扫描；
⑷基于RMSF和dStability，即kcal/mol的值，并利用生物信息学软件，构建热稳定肝素酶I突变体的电子文库；
⑸利用多种生物信息学软件分析，筛选出除酶活性中心以外的其他备选突变体；
⑹分别利用特定的突变引物对，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；测序验证正确后，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。
较优地，所述方法中表达载体为原核表达质粒和真核表达质粒；所述方法中表达宿主为原核表达宿主和真核表达宿主。
较优地，具体步骤如下：
⑴BtHepI空间晶体结构：登录蛋白结构数据库htpp：//rcsb.org，下载蛋白质的晶体结构；
⑵热稳定性的肝素酶I突变体的理性设计：通过分子动力学的酶柔性分析，找到肝素酶I的不稳定区域，通过整合信息分析，筛除那些处于酶活性中心会影响酶的催化效率的氨基酸残基；根据计算的RMSF和dStability，即kcal/mol的值，进行实验验证；
⑶含突变基因BthepiQ198R和BthepiK247W表达工程菌的构建：根据上述分析结果以及BtHepI的基因序列设计2对突变引物：
Q198R-F：5′-CTGGATAAGCGGGGCAACCCGGTTAAGGACAAGAATG-3′
Q198R-R：5′-CGGGTTGCCCCGCTTATCCAGGCGTGCAACTTTCTC-3′
K247W-F：5′-AGCGATCGCTGGTGGCTGACCGATAAAGACGACCGTTG-3′
K247W-R：5′-GGTCAGCCACCAGCGATCGCTGTTGGCTTTGATGTAG-3′
以含有Bthepi基因的质粒pE-SUMO-Bthepi为模板，使用以上引物进行PCR，反应条件为：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-BthepiQ198R、pE-SUMO-BthepiK247W转化入表达菌株Rosetta(DE3)中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；
⑷经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。
一种如上所述的基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体的活性测定方法，步骤如下：
酶活测定采用232nm的光吸收法，以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，一个酶活力单位(1IU)指在30℃，1min内产生1μmol的△4,5不饱和糖醛酸反应效力；反应体系为：1.5mL的离心管中加入100μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠的混合液，金属浴中40℃恒温孵育10min，加入稀释纯化脱盐后的浓度为20-25ug/ml的酶液10μL，反应10min，立即加入0.06mol/L盐酸1mL终止反应；在12000r/min条件下离心5min，取上清液测定其在232nm的吸光值。
更具体地，相关步骤具体如下：
一、含有突变酶基因的工程菌的构建
采用重叠PCR技术构造含有突变酶基因BthepiQ198R、BthepiK247W的表达质粒，分别以Q198R-F、Q198R-R和K247W-F、K247W-R为引物、以pE-SUMO-Bthepi为模板进行PCR(95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min)，PCR产物使用DnpI酶消化2h后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析并切胶回收。将回收产物进行重组连接，进而转化入DH5α感受态细胞，提取质粒送去测序。将测序正确的突变表达质粒转化入Rosetta(DE3)感受态细胞，通过抗性验证以及测序，成功得到表达突变酶的工程菌。如图1、图2所示。
二、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的表达、纯化以及活性测定
1、将工程菌分别接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的LB培养基(NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，含50ug/L卡那霉素和34ug/L氯霉素)37℃，220r/min培养过夜。将过夜培养菌液按1％接种量接入50mL发酵培养基中(250mL摇瓶)，37℃，220r/min培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在25℃，200r/min条件下诱导12h。4℃8000r/min离心10min收集菌体，用缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，200mmol/LNaCl pH 7.4)洗涤两遍，再将其悬于40mL缓冲液中，超声破碎细胞。12000r/min、4℃离心20min，收集上清，进行SDS-PAGE分析。结果如图3所示。
2、使用Co-NTA亲和层析进行纯化，Co柱使用10mL的平衡缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/LNaCl pH 7.4)平衡后上样，并使用10mL结合缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑)冲洗除掉非特异性结合蛋白，使用3mL洗脱缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/LNaCl，150mmol/L咪唑)洗脱重组目的蛋白，收集洗脱液即为纯化后的重组酶。使用PD-10预装脱盐柱对纯化后的酶进行脱盐处理。使用25mL的平衡缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl，200mmol/LNaCl pH 7.4)平衡后上样2.5mL，3.5mL缓冲液洗脱，从上样开始收集2.5-6mL的洗脱液为脱盐后的酶液。纯化后的突变体酶经SDS-PAGE分析，可以达到胶纯的效果。结果如图4所示，与野生想相比突变体在40℃的半衰期分别提高了得到了明显的提高了30.55％和14.63％；在50℃下的半衰期较野生型BtHepI分别提高了61.04％和30.84％。具有较大的工业应用潜力以及经济价值。
3、t1/2值是指酶在特定温度下处理一段时间后残余酶活为50％时对应的时间。具体测定方法如下：以未进行热处理的肝素酶I的活力作为100％，分别测定并计算出酶在40℃和50℃下处理不同时间后的残余酶活。以处理时间为横坐标，以Ln(％残余酶活)为纵坐标，绘制时间—Ln(％残余酶活)的曲线，据图计算t1/2＝Ln2/Kd，Kd为该图斜率。结果如图4所示。
三、BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的酶学性质测定
突变后肝素酶I的酶学性质可能发生改变，探究最佳酶活条件，进行了一系列实验。分别将未突变BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W在相同条件下的酶学性质进行分析比较。
1、温度对肝素酶I突变前后活性的影响
温度即能改变酶发生催化反应速度，也能导致酶蛋白活性降低或失活。本实验将同时测定未突变型BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的最佳反应温度。准备若干组100ul反应液(50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠，pH 7.4)，分别置于25、30、35、40、45、50℃下反应，添加酶量均为10ul，定时测定反应液A232变化情况，将最佳温度下测定的酶活值作为100％，计算其他温度下的相对酶活。结果如图5所示，可知BtHepIQ198R的最佳反应温度由40℃上升到45℃，而BtHepIK247W的最佳反应温度并未发生改变。
2、pH对肝素酶I突变前后活性的影响
酶反应都有其最佳的pH值范围，pH值过高或者过低对酶发生催化反应的活性都会产生影响，本实验将同时测定未突变型BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的最佳反应pH。准备若干组100ul反应液(50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠)，分别调节pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，添加酶量均为10ul，置于37℃反应，定时测定反应液A232变化情况，将pH值为4条件下测得的未突变的酶活值作为100％，计算其他pH值下的相对酶活。结果如图5所示，实验结果表明未突变型BtHepI、BtHepIQ198R和BtHepIK247W的最佳反应pH都是7.0。说明突变前后并未改变肝素酶I的最适pH值。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法
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<211> 376
<212> PRT
<213> BtHepIQ198R氨基酸序列(Unknown)
<400> 1
Met Leu Thr Ala Gln Thr Lys Asn Thr Gln Thr Leu Met Pro Leu Thr
1 5 10 15
Glu Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Arg Ile Asn Gln Ile Ile
20 25 30
Asp Gly Cys Trp Val Ala Val Gly Thr Asn Lys Pro His Ala Ile Gln
35 40 45
Arg Asp Phe Thr Asn Leu Phe Asp Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu
50 55 60
Leu Lys Thr Glu Asp Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ala Glu Phe Ser Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Asp Asp Phe
85 90 95
Arg Gly Leu Pro Ala Asp Val Tyr Gln Lys Ala Gln Ile Thr Lys Thr
100 105 110
Val Tyr His His Gly Lys Gly Ala Cys Pro Gln Gly Ser Ser Arg Asp
115 120 125
Tyr Glu Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Leu Asp Ser Asn Val Ser
130 135 140
Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Gln
145 150 155 160
Thr Pro Gln Gly Glu Val Lys Lys Leu Thr Val Asp Glu Phe Val Glu
165 170 175
Leu Glu Lys Thr Thr Phe Phe Lys Lys Asn Val Gly His Glu Lys Val
180 185 190
Ala Arg Leu Asp Lys Arg Gly Asn Pro Val Lys Asp Lys Asn Gly Lys
195 200 205
Pro Val Tyr Lys Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly
210 215 220
Gly Tyr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Gly Gly Leu Phe Tyr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Asn Ser Asp Arg Lys Trp Leu Thr Asp Lys Asp Asp Arg Cys
245 250 255
Asn Ala Asn Pro Gly Lys Thr Pro Val Met Lys Pro Leu Thr Ser Glu
260 265 270
Tyr Lys Ala Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Leu Pro Phe Ala Asp Phe Pro
275 280 285
Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Arg Val His Ile Asp Trp Thr Val Tyr
290 295 300
Gly Lys Glu Ala Glu Thr Ile Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Arg
305 310 315 320
Met Asp Tyr Gln Glu Gln Gly Lys Lys Val Ser Lys His Ile Val Asp
325 330 335
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Phe
340 345 350
Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asp Ser Thr Val Pro Val Cys Tyr
355 360 365
Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Glu Arg
370 375
<210> 2
<211> 376
<212> PRT
<213> BtHepIK247W氨基酸序列(Unknown)
<400> 2
Met Leu Thr Ala Gln Thr Lys Asn Thr Gln Thr Leu Met Pro Leu Thr
1 5 10 15
Glu Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Arg Ile Asn Gln Ile Ile
20 25 30
Asp Gly Cys Trp Val Ala Val Gly Thr Asn Lys Pro His Ala Ile Gln
35 40 45
Arg Asp Phe Thr Asn Leu Phe Asp Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu
50 55 60
Leu Lys Thr Glu Asp Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ala Glu Phe Ser Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Asp Asp Phe
85 90 95
Arg Gly Leu Pro Ala Asp Val Tyr Gln Lys Ala Gln Ile Thr Lys Thr
100 105 110
Val Tyr His His Gly Lys Gly Ala Cys Pro Gln Gly Ser Ser Arg Asp
115 120 125
Tyr Glu Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Leu Asp Ser Asn Val Ser
130 135 140
Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Gln
145 150 155 160
Thr Pro Gln Gly Glu Val Lys Lys Leu Thr Val Asp Glu Phe Val Glu
165 170 175
Leu Glu Lys Thr Thr Phe Phe Lys Lys Asn Val Gly His Glu Lys Val
180 185 190
Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Pro Val Lys Asp Lys Asn Gly Lys
195 200 205
Pro Val Tyr Lys Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly
210 215 220
Gly Tyr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Gly Gly Leu Phe Tyr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Asn Ser Asp Arg Trp Trp Leu Thr Asp Lys Asp Asp Arg Cys
245 250 255
Asn Ala Asn Pro Gly Lys Thr Pro Val Met Lys Pro Leu Thr Ser Glu
260 265 270
Tyr Lys Ala Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Leu Pro Phe Ala Asp Phe Pro
275 280 285
Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Arg Val His Ile Asp Trp Thr Val Tyr
290 295 300
Gly Lys Glu Ala Glu Thr Ile Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Arg
305 310 315 320
Met Asp Tyr Gln Glu Gln Gly Lys Lys Val Ser Lys His Ile Val Asp
325 330 335
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Phe
340 345 350
Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asp Ser Thr Val Pro Val Cys Tyr
355 360 365
Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Glu Arg
370 375
<210> 3
<211> 1128
<212> DNA/RNA
<213> BtHepIQ198R核苷酸序列(Unknown)
<400> 3
atgttaaccg cccagaccaa aaatacccag accctgatgc cgctgacaga gcgtgttaac 60
gttcaggcag atagcgcccg catcaaccag attatcgacg gctgctgggt ggcagtgggc 120
acaaacaaac cgcacgcaat tcagcgcgac tttaccaatc tgttcgatgg taagccgagc 180
tatcgctttg agctgaagac cgaagacaac accctggaag gctatgcaaa gggtgagaca 240
aagggccgcg ccgaattcag ctactgctac gcaaccagcg atgattttcg cggtctgccg 300
gccgacgtgt atcagaaagc ccagattacc aaaaccgtgt accaccacgg caaaggcgca 360
tgtccgcagg gtagcagccg cgattatgag ttcagcgtgt acatcccgag cagcctggac 420
agtaacgtga gtacaatctt cgcccagtgg cacggcatgc ctgaccgtac cttagttcag 480
acaccgcagg gcgaagtgaa aaagctgacc gttgatgagt ttgttgagct ggaaaaaacc 540
acctttttta aaaagaacgt tggccatgag aaagttgcac gcctggataa gcggggcaac 600
ccggttaagg acaagaatgg caagccggtg tataaagcag gcaagccgaa tggctggctg 660
gtggaacagg gtggttatcc gccgctggcc ttcggcttta gtggcggcct gttctacatc 720
aaagccaaca gcgatcgcaa atggctgacc gataaagacg accgttgcaa tgccaacccg 780
ggtaagaccc ctgtgatgaa accgctgacc agtgagtaca aggccagcac aattgcctac 840
aaactgccgt tcgccgactt tccgaaagat tgctggatca ccttccgcgt tcacattgac 900
tggaccgtgt atggcaaaga agctgaaacc attgttaaac cgggcatgct ggacgtgcgc 960
atggattacc aggaacaggg taaaaaagtg agtaaacaca tcgtggacaa cgaaaaaatc 1020
ctgatcggcc gcaacgacga agacggctac tactttaagt tcggcattta tcgtgtgggc 1080
gatagcaccg ttccggtgtg ttacaatctg gccggctata gtgagcgc 1128
<210> 4
<211> 1128
<212> DNA/RNA
<213> BtHepIK247W核苷酸序列(Unknown)
<400> 4
atgttaaccg cccagaccaa aaatacccag accctgatgc cgctgacaga gcgtgttaac 60
gttcaggcag atagcgcccg catcaaccag attatcgacg gctgctgggt ggcagtgggc 120
acaaacaaac cgcacgcaat tcagcgcgac tttaccaatc tgttcgatgg taagccgagc 180
tatcgctttg agctgaagac cgaagacaac accctggaag gctatgcaaa gggtgagaca 240
aagggccgcg ccgaattcag ctactgctac gcaaccagcg atgattttcg cggtctgccg 300
gccgacgtgt atcagaaagc ccagattacc aaaaccgtgt accaccacgg caaaggcgca 360
tgtccgcagg gtagcagccg cgattatgag ttcagcgtgt acatcccgag cagcctggac 420
agtaacgtga gtacaatctt cgcccagtgg cacggcatgc ctgaccgtac cttagttcag 480
acaccgcagg gcgaagtgaa aaagctgacc gttgatgagt ttgttgagct ggaaaaaacc 540
acctttttta aaaagaacgt tggccatgag aaagttgcac gcctggataa gcagggcaac 600
ccggttaagg acaagaatgg caagccggtg tataaagcag gcaagccgaa tggctggctg 660
gtggaacagg gtggttatcc gccgctggcc ttcggcttta gtggcggcct gttctacatc 720
aaagccaaca gcgatcgctg gtggctgacc gataaagacg accgttgcaa tgccaacccg 780
ggtaagaccc ctgtgatgaa accgctgacc agtgagtaca aggccagcac aattgcctac 840
aaactgccgt tcgccgactt tccgaaagat tgctggatca ccttccgcgt tcacattgac 900
tggaccgtgt atggcaaaga agctgaaacc attgttaaac cgggcatgct ggacgtgcgc 960
atggattacc aggaacaggg taaaaaagtg agtaaacaca tcgtggacaa cgaaaaaatc 1020
ctgatcggcc gcaacgacga agacggctac tactttaagt tcggcattta tcgtgtgggc 1080
gatagcaccg ttccggtgtg ttacaatctg gccggctata gtgagcgc 1128
<210> 5
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> Q198R-F(Unknown)
<400> 5
ctggataagc ggggcaaccc ggttaaggac aagaatg 37
<210> 6
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> Q198R-R(Unknown)
<400> 6
cgggttgccc cgcttatcca ggcgtgcaac tttctc 36
<210> 7
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> K247W-F(Unknown)
<400> 7
agcgatcgct ggtggctgac cgataaagac gaccgttg 38
<210> 8
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> K247W-R(Unknown)
<400> 8
ggtcagccac cagcgatcgc tgttggcttt gatgtag 37

Claims (6)

1.一种热稳定性提高的肝素酶I 突变体，其特征在于：所述突变体为突变体BtHepIQ198R和/或突变体BtHepIK247W，所述突变体BtHepIQ198R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述突变体BtHepIK247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的编码基因，其特征在于：所述突变体BtHepIQ198R的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述突变体BtHepIK247W的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
3.包含如权利要求书2所述的编码基因的重组质粒。
4.包含如权利要求书2所述的编码基因的转化子。
5.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
利用定点突变技术，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；测序验证正确后，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）；经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的突变体。
6.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的活性测定方法，其特征在于：步骤如下：
以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，反应体系为：1.5 mL 的离心管中加入100 μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50 mmol/L 醋酸钠，5 mmol/L 醋酸钙，5 mmol/L 肝素钠的混合液，金属浴中40 ℃恒温孵育10 min，加入纯化后浓度为20-25ug/ml的酶液10 μL，反应10 min，立即加入0.06 mol/L 盐酸1 mL终止反应；在12000 r/min 条件下离心5 min，取上清液测定其在232 nm的吸光值。
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