CN104017796A - 一种肝素酶ⅱ缺失突变体编码基因及其蛋白 - Google Patents

一种肝素酶ⅱ缺失突变体编码基因及其蛋白 Download PDF

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CN104017796A CN201410274912.8A CN201410274912A CN104017796A CN 104017796 A CN104017796 A CN 104017796A CN 201410274912 A CN201410274912 A CN 201410274912A CN 104017796 A CN104017796 A CN 104017796A
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gly
leu
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杜宏银
马小来
李锂
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SHENZHEN HEPALINK PHARMACEUTICAL CO Ltd
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SHENZHEN HEPALINK PHARMACEUTICAL CO Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01019—Heparinase (3.2.1.19)

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Abstract

本发明公开了一种肝素酶Ⅱ缺失突变体蛋白及其编码基因。本发明提供的肝素酶Ⅱ缺失突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2.所示,本发明的蛋白的编码基因也在保护范围之内。本发明首次通过PCR技术设计引物使得肝素酶Ⅱ缺失C端氨基酸序列，获得分子量更小，比活性较高的肝素酶Ⅱ，经过纯化后比活可达43.3IU/mg，本发明可广泛用于生产肝素酶Ⅱ缺失突变体。

Description

一种肝素酶Ⅱ缺失突变体编码基因及其蛋白
技术领域
本发明涉及酶的基因工程改造，特别涉及到肝素酶Ⅱ缺失突变体编码基因及其蛋白。
背景技术
肝素酶是一类作用于肝素或者硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶，在许多微生物中发现，包括棒状杆菌Corynebacterium sp，枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ,环状芽孢杆菌Bacillus circulans，粪便拟杆菌和肝素黄杆菌等， 但肝素黄杆菌是商业化肝素酶的唯一来源。
肝素酶的研究颇具价值：肝素酶是一种多糖裂解酶，肝素酶及其底物多糖肝素之间相互作用的研究有助于解释多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；此外，肝素酶还可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制、制备低分子的抗凝血药物低分子肝素、去除临床血液残存肝素、防止手术后出血、处理PCR反应前的血液制品。
对肝素酶Ⅱ的异源重组表达研究非常有限，文献报道傅文彬和Su等人对其进行了研究。傅文彬等人利用pET表达系统实现了肝素酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达（傅文彬，余晓等，黄杆菌肝素酶Ⅱ 的克隆与表达，食品与药品，2007，Vol.9 ：1-4)，SDS-PAGE电泳结果显示有目的蛋白条带，但表达量很低，且容易形成包涵体，可溶性肝素酶活性很低；Su研究中所表达的肝素酶Ⅱ活性有所提高，但纯化困难（(Su H，blain F，Musil RA，ZimmermannJ JF，Gu K，Bennett DC.Isolation and Expression in Escherichia coli of hepB and hepC，Genes Coding for the Glycosaminoglycan-Degrading Enzymes Heparinase Ⅱ and Heparinase Ⅲ，Respectively，from Flavobacterium heparinum.Appl.Environ.Microbiol.1996，62 ：2723-2734)。CN 101942024研究发现通过将麦芽糖结合蛋白(MBP)与酶的融合可以显著提高酶重组表达的可溶性，可提高酶Ⅱ的产量至118.4IU/L发酵液。
本实验室对肝素酶Ⅱ的基因进行缺失突变，切除C端的一段氨基酸序列，将其克隆至表达载体PMAL-C2X，得到活性较高的肝素酶Ⅱ突变体蛋白HepB-1，且其带有MBP标签方便纯化。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种缺失突变的肝素酶Ⅱ基因以及表达蛋白。
本发明所提供的肝素酶Ⅱ蛋白，名称为HepB-1，其肝素酶HepB-1是具有序列表中SEQ IDNo:2氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中的SEQ ID No:2由688个氨基酸残基组成。
肝素酶Ⅱ缺失突变体蛋白编码基因，名称为HepB-1，其具有下列核苷酸序列之一：
    1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列：
    2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；
    序列1中的DNA序列由2064个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第
1到第2064位碱基。
扩增该蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的第二个目的是提供一种表达缺失突变肝素酶Ⅱ蛋白的方法。
本发明所提供的表达缺失突变肝素酶Ⅱ蛋白的方法，是将含有上述肝素酶Ⅱ蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达缺失突变肝素酶Ⅱ蛋白，且其带有MBP标签。
pMal-HepB-1是通过PSTI和SacI将肝素酶Ⅱ编码基因全序列插入pMal-C2x ,pMal-c2x表达载体中得到的肝素酶Ⅱ蛋白编码基因的重组表达载体。其中，所述肝素酶Ⅱ编码基因全序列是以构建好的PMAL-C2X-HepA为模板，以5'-GCCTGAGCTCGCAAACCAAGGCCGATGTG 3和5'-GACTCTGCAGTTAACGATCAACAGTTTCTGAAGTTTTG 3为引物，按照常规PCR方法得到的。所述宿主菌可为大肠杆菌，所述大肠杆菌可为以下菌株：BL21。
缺失突变体肝素酶Ⅱ蛋白的诱导表达条件可为0.1mM IPTG .16摄氏度诱导18小时：所采用的培养基为LB培养基,胰蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L。
本发明通过PCR技术，设计引物使得肝素酶Ⅱ缺失了的C端一段氨基酸序列，构建了肝素酶Ⅱ缺失突变体表达载体，因其带有MBP标签，从而能通过amylose树脂实现一步亲和分离得到了分子量更小，比活较高的的肝素酶Ⅱ缺失突变体蛋白;大肠杆菌E coli BL21(DE3) (pMAL-hepB-1)在37摄氏度培养3小时后加入0. 1mM IPTG，诱导温度16摄氏度18h，通过缺失突变方法为肝素酶Ⅱ的活性与结构研究提供了现实基础，本发明为将在低分子肝素钠的生产上发挥重要作用。
附图说明
图1为HepB-1的PCR电泳图谱。
图2为阳性转化子的双酶切鉴定示意图。
图3为HepB-1蛋白通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
实施例1、缺失肝素酶Ⅱ蛋白HepB-1的表达。
l. 表达载体pMal- HepB-1的构建。
模板PMal- HepB的构建参考专利CN 101942024。
表达载体pMal- HepB-1的构建具体过程如下：以已经构建好的PMAL- HepB为模板，所用的上下游引物分别为5' GCCTGAGCTCGCAAACCAAGGCCGATGTG 3（带下划线的碱基为PST I的酶切位点），5' –GACTCTGCAGTTAACGATCAACAGTTTCTGAAGTTTTG- 3（带下划线的碱基为SacI酶切位点），分别引入PSTI和SacI酶切位点，扩增的反应体系为：50ng模板DNA，200nmol每种引物，5×PS buffer扩增缓冲液，2.5uMol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为：95摄氏度变性5分钟，50-60摄氏度引物退火15秒，72摄氏度引物延伸120秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR．结果如图1所示，表明扩增得到2.0kb的肝素酶Ⅱ基因片段。图1中，1-6分别为引物退火温度为55、57、59、61、63、65℃扩增结果，M为分子量marker DL10,000，目标片断处为2.0kb。
将HepB-1和pMal-c2x载体和PCR产物分别用PSTI和SacI双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化BL21，提质粒通过PSTI和SacI双酶切验证。验证结果如图2示，同时将结果送去测序，其中序列完全正确的一株命名为重组大肠杆菌BL21 (pMal-HepB-1)。
2. 缺失突变肝素酶Ⅱ蛋白HepB-1的表达。
重组大肠杆菌BL21 (pMal- HepB-1)在LB培养基（含l00ng/ml Amp）37℃培养3小时，待OD600=0.7-0.8时加入0.1mM IPTG在15℃进行诱导培养。诱导20小时后菌液在8000rpm下离心10min，弃滤液后重悬在40ml 20mmol Tris. HCl中超声破碎（超声功率为150W，超声5s，间歇时间5s，超声200个循环），18000rpm.30min离心。
实施例2、通过直链淀粉柱纯化肝素酶Ⅰ蛋白HepB-1及肝素酶ⅠHepB-1活性测定。
1. 肝素酶Ⅱ蛋白HepB-1及肝素酶ⅡHepB-1的纯化。
本发明中利用的融合伙伴(fusion partner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下：将0.1mmol IPTG诱导表达20小时的菌体诱导后菌液在8000rpm下离心10min，弃滤液后重悬在40ml 20mmol Tris. HCl中超声破碎（超声功率为150W，超声5s，间歇时间5s，超声200个循环），18000rpm.30min离心。离心后上清液体以0. 5ml/min通过20ml预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过10mM 0. 5ml/min麦芽糖梯度洗脱并收集。
用10mM麦芽糖在10个柱体积下能够将目标蛋白洗脱。结果如图3所示，表明经过直链淀粉树脂一步纯化后目标蛋白可占95%以上。图3为不同浓度的麦芽糖浓度梯度洗脱SDS-PAGE电泳图，M为分子量marker，1-9 为可溶目标蛋白MBP- HepB-1,分子量为115KD。 
2. 肝素酶HePB-1活性测定。
肝素酶活性测定：在5 ml石英比色皿中加入在35 ℃预热过的2.5 ml肝素浓度为1 mg/ml的Tris-HCl(50 mM, 含CaCl2 10 mM, pH7.0)缓冲液，移取20 μl酶液，摇匀后在232 nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。以双键的摩尔消光系数3500计算其形成量，换算为酶液中酶的国际单位。蛋白浓度测定采用Bradford法。
<110>  深圳市海普瑞药业股份有限公司
 
<120>  一种肝素酶Ⅱ缺失突变体编码基因及其蛋白
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
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<400>  1
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aagacccacc cgcgtttgta tctacgtgag cagcaagttc ctgacctgaa aaacaggatg    120
 
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Gln Thr Lys Ala Asp Val Val Trp Lys Asp Val Asp Gly Val Ser Met
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Pro Ile Pro Pro Lys Thr His Pro Arg Leu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln
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Val Pro Asp Leu Lys Asn Arg Met Asn Asp Pro Lys Leu Lys Lys Val
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Trp Ala Asp Met Ile Lys Met Gln Glu Asp Trp Lys Pro Ala Asp Ile
    50                  55                  60                 
 
 
Pro Glu Val Lys Asp Phe Arg Phe Tyr Phe Asn Gln Lys Gly Leu Thr
65                  70                  75                  80 
 
 
Val Arg Val Glu Leu Met Ala Leu Asn Tyr Leu Met Thr Lys Asp Pro
                85                  90                  95     
 
 
Lys Val Gly Arg Glu Ala Ile Thr Ser Ile Ile Asp Thr Leu Glu Thr
            100                 105                 110        
 
 
Ala Thr Phe Lys Pro Ala Gly Asp Ile Ser Arg Gly Ile Gly Leu Phe
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Met Val Thr Gly Ala Ile Val Tyr Asp Trp Cys Tyr Asp Gln Leu Lys
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Pro Glu Glu Lys Thr Arg Phe Val Lys Ala Phe Val Arg Leu Ala Lys
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Met Leu Glu Cys Gly Tyr Pro Pro Val Lys Asp Lys Ser Ile Val Gly
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His Ala Ser Glu Trp Met Ile Met Arg Asp Leu Leu Ser Val Gly Ile
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Ala Ile Tyr Asp Glu Phe Pro Glu Met Tyr Asn Leu Ala Ala Gly Arg
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Phe Phe Lys Glu His Leu Val Ala Arg Asn Trp Phe Tyr Pro Ser His
    210                 215                 220                
 
 
Asn Tyr His Gln Gly Met Ser Tyr Leu Asn Val Arg Phe Thr Asn Asp
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Leu Phe Ala Leu Trp Ile Leu Asp Arg Met Gly Ala Gly Asn Val Phe
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Asn Pro Gly Gln Gln Phe Ile Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Lys Arg Arg
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Pro Asp Gly Gln Ile Leu Ala Gly Gly Asp Val Asp Tyr Ser Arg Lys
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Lys Pro Lys Tyr Tyr Thr Met Pro Ala Leu Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr
    290                 295                 300                
 
 
Lys Asp Glu Tyr Leu Asn Tyr Glu Phe Leu Lys Asp Pro Asn Val Glu
305                 310                 315                 320
 
 
Pro His Cys Lys Leu Phe Glu Phe Leu Trp Arg Asp Thr Gln Leu Gly
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Ser Arg Lys Pro Asp Asp Leu Pro Leu Ser Arg Tyr Ser Gly Ser Pro
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Phe Gly Trp Met Ile Ala Arg Thr Gly Trp Gly Pro Glu Ser Val Ile
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Ala Glu Met Lys Val Asn Glu Tyr Ser Phe Leu Asn His Gln His Gln
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Asp Ala Gly Ala Phe Gln Ile Tyr Tyr Lys Gly Pro Leu Ala Ile Asp
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Ala Gly Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Gly Tyr Asn Ser Pro His Asn
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Lys Asn Phe Phe Lys Arg Thr Ile Ala His Asn Ser Leu Leu Ile Tyr
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Asp Pro Lys Glu Thr Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Asp His
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Thr Asp Phe Ala Ala Asn Asp Gly Gly Gln Arg Leu Pro Gly Lys Gly
    450                 455                 460                
 
 
Trp Ile Ala Pro Arg Asp Leu Lys Glu Met Leu Ala Gly Asp Phe Arg
465                 470                 475                 480
 
 
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Asp Tyr Thr Tyr Leu Lys Gly Asp Ile Thr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys
            500                 505                 510        
 
 
Val Lys Glu Val Lys Arg Ser Phe Leu Phe Leu Asn Leu Lys Asp Ala
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Pro Asp Phe Lys Lys Phe Trp Leu Leu His Ser Ile Glu Gln Pro Glu
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Ile Lys Gly Asn Gln Ile Thr Ile Lys Arg Thr Lys Asn Gly Asp Ser
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Ile Thr Ser Ile Gly Gly Lys Gly Lys Asp Phe Trp Val Phe Gly Thr
        595                 600                 605            
 
 
Asn Tyr Thr Asn Asp Pro Lys Pro Gly Thr Asp Glu Ala Leu Glu Arg
    610                 615                 620                
 
 
Gly Glu Trp Arg Val Glu Ile Thr Pro Lys Lys Ala Ala Ala Glu Asp
625                 630                 635                 640
 
 
Tyr Tyr Leu Asn Val Ile Gln Ile Ala Asp Asn Thr Gln Gln Lys Leu
                645                 650                 655    
 
 
His Glu Val Lys Arg Ile Asp Gly Asp Lys Val Val Gly Val Gln Leu
            660                 665                 670        
 
 
Ala Asp Arg Ile Val Thr Phe Ser Lys Thr Ser Glu Thr Val Asp Arg
        675                 680                 685            
 

Claims (4)

1.一种肝素酶Ⅱ缺失突变体蛋白，是由序列表中序列SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列式序列表中SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。
4.含有权利要求2所述基因的工程菌。
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