CN109706137B

CN109706137B - 一种通过增加二硫键提高肝素酶i热稳定性的突变体及制备方法

Info

Publication number: CN109706137B
Application number: CN201910052337.XA
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 张川; 张同存; 刘耀天
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Wanxin Pharmaceutical Technology (Suzhou) Co., Ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-01-21
Filing date: 2019-01-21
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2039-01-21
Also published as: CN109706137A

Abstract

本发明涉及一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。本突变体比野生型肝素酶I(BtHepI)具有更好的热稳定性，有效降低了突变文库的筛选工作量，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。

Description

一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程技术领域，尤其是一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法。

背景技术

肝素(Heprain)是一种特异性质多分散的混合硫酸化多糖，广泛分布于哺乳动物组织中，以共价键形式和蛋白质结合。目前商业肝素主要是从牛肺和猪小肠黏膜中提，结构复杂且具有多种重要的生物学功能，一般在临床上用于血栓、心血管等疾病的治疗。低分子量肝素(Low molecular heparin,LMWH)是肝素通过某些物理化学方法裂解而产生的一小段肝素，与蛋白质或细胞结合的能力有所下降，但抗凝活性显著增加。与正常肝素相比，低分子肝素可降低抗因子IIa的活性，极大程度地减小了出血的危险性。目前，制备低分子肝素有物理、化学、生物和合成方法。其中，生物酶解法由于具备条件温和、选择性强、污染小等优点，现已成为一种新兴的方法。

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验

目前肝素酶I的热稳定性很差，导致其无法很好地适应工业化应用。这已经是阻碍酶法制备低分子肝素的瓶颈。二硫键已经报道是稳定酶结构的很重要的成分，因此通过Dsulfide scan突变扫描，构建肝素酶I二硫键突变体文库。与传统的定向进化筛选热稳定性肝素酶I的方法相比，具有筛选工作量小，速度快等等优势。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法(CN106497897A)，涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法、活性测定方法，该突变体比野生型肝素酶I(BtHepI)具有更好的热稳定性，有效降低了突变文库的筛选工作量，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

而且，所述突变体的第204位和208位氨基酸发生突变，分别由天冬氨酸和赖氨酸突变为半胱氨酸，在二者之间形成一个二硫键。

如上所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。

一种包含如上所述的编码基因的重组质粒。

一种包含如上所述的编码基因的转化子。

一种如上所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的制备方法，步骤如下：

⑴利用AMBER16软件MOE的Disulfide scan模块进行二硫键突变扫描，构建突变的电子文库；

⑵扫描流程采用LowMode模式中的Unary Quadratic Optimization，即UQO，并使用LowModeMD来搜索突变体的构象空间；LowModeMD搜索方法使用在恒定温度下短1ps的MD运行，随后全原子能量最小化来产生突变构象；当得到的构象满足能量学和几何学标准所需的条件时，它们被保存到输出数据库中；为了加速模拟，超过

的原子被标记为惰性，迭代被限制为50，同时每个突变复合物的构象被限制为5个；最后得到突变体的dStability，即kcal/mol值的排序；

⑶基于肝素酶I突变体dStability值，以dStability<-5kcal/mol作为筛选标准；

⑷利用多种生物信息学软件筛除电子文库中结构不合理的热稳定肝素酶I突变体；

⑸利用特定的突变引物和定点突变技术，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；经测序正确后，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。

而且，所述方法中使用的表达载体为原核表达质粒和真核表达质粒；所述方法中使用的表达宿主为原核表达宿主和真核表达宿主。

而且，具体步骤如下：

⑴BtHepI空间晶体结构：登录蛋白结构数据库htpp：//rcsb.org，下载蛋白质的晶体结构；

⑵热稳定性的肝素酶I突变体的理性设计：通过二硫键突变扫描分析，找到肝素酶I中能够形成二硫键的区域，通过整合信息分析，筛除那些处于酶活性中心会影响酶的催化效率的位点；根据计算的dStability，即kcal/mol的值，进行实验验证；

⑶含突变基因Bthepi^D204C/K208C表达工程菌的构建：根据上述分析结果以及BtHepI的基因序列设计2对突变引物D204C-F、D204C-R；K208C-F、K208C-R；

以含有Bthepi基因的质粒pE-SUMO-Bthepi为模板，使用以上引物进行两轮PCR，反应条件为：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-Bthepi^D204C/K208C转化入表达菌株Rosetta(DE3)中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；

经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。

一种如上所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的活性测定方法，步骤如下：

酶活测定采用232nm的光吸收法，以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，一个酶活力单位指在30℃，1min内产生1μmol的△4,5不饱和糖醛酸反应效力；反应体系为：1.5mL的ep管中加入100μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠的混合物，金属浴中40℃恒温孵育10min，加入稀释纯化脱盐后的浓度为20-25ug/ml的酶液10μL，反应10min，立即加入0.06mol/L盐酸1mL终止反应；在12000r/min条件下离心5min，取上清液测定其在232nm的吸光值。

本发明取得的优点和积极效果是：

1、本发明突变体比野生型肝素酶I(BtHepI)具有更好的热稳定性，有效降低了突变文库的筛选工作量，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值；该肝素酶I突变体BtHepI^D204C/K208C的催化效率较野生型并未有明显变化，但是在40℃的半衰期较野生型BtHepI提高了51.61％；在50℃下的半衰期较野生型BtHepI提高了102％。该突变株在工业上具有很大的应用潜力。

2、本发明方法利用生物信息学的二硫键突变扫描分析建立了热稳定性肝素酶I的电子突变文库，并基于结构特性对电子文库进行了筛选，在此基础上通过计算得到微型突变体文库。基于本发明方法可以快速获得热稳定性能优良的肝素酶I突变株。

附图说明

图1为本发明中肝素酶I突变体BtHepI^D204C/K208C形成二硫键区域的结构示意图；

图2为本发明中重组质粒pE-SUMO-Phhepi^D204C/K208C构建示意图；

图3为本发明中重组突变酶BtHepI^D204C/K208C的表达和纯化的SDS-PAGE图；

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD，25KD，15KD；泳道1、野生型pE-SUMO-Bthepi重组菌的超声破壁上清，上样20ul，泳道2、pE-SUMO-Bthepi表达产物纯化，上样20ul，泳道3、pE-SUMO-Bthepi^D204C/K208C重组菌的超声破壁上清，上样20ul，泳道4、pE-SUMO-Bthepi^D204C/K208C表达产物的纯化，上样20ul；

图4为本发明中BtHepI、BtHepI^D204C/K208C在40℃和50℃下的热稳定曲线图；

图5为本发明中BtHepI、BtHepI^D204C/K208C的最适温度和pH图。

具体实施方式

下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施中未注明的试验方法，如感受态的制备、热激转化质粒以及大肠杆菌Rosetta(DE3)培养基的配制等均属于常规操作方法，可以参照《分子克隆实验指南》第三版中的方法进行。

较优地，所述突变体的第204位和208位氨基酸发生突变，分别由天冬氨酸和赖氨酸突变为半胱氨酸，在二者之间形成一个二硫键。如图1所示。

一种包含如上所述的编码基因的重组质粒。

一种包含如上所述的编码基因的转化子。

较优地，所述方法中使用的表达载体为原核表达质粒和真核表达质粒；所述方法中使用的表达宿主为原核表达宿主和真核表达宿主。

较优地，具体步骤如下：

⑶含突变基因Bthepi^D204C/K208C表达工程菌的构建：根据上述分析结果以及BtHepI的基因序列设计2对突变引物：

D204C-F：5′-CCGGTTAAGTGCAAGAATGGCAAGCCGGTGTATAAAG-3′

D204C-R：5′-GCCATTCTTGCACTTAACCGGGTTGCCCTGCTTATC-3′

K208C-F：5′-AAGAATGGCTGCCCGGTGTATAAAGCAGGCAAGCCG-3′

K208C-R：5′-ATACACCGGGCAGCCATTCTTGTCCTTAACCGGGTTG-3′

以含有Bthepi基因的质粒pE-SUMO-Bthepi为模板，使用以上引物进行两轮PCR，反应条件为：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序，如图2所示；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-Bthepi^D204C/K208C转化入表达菌株Rosetta(DE3)中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；

经诱导表达并分离纯化出热稳定性肝素酶I突变体。

酶活测定采用232nm的光吸收法，以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，一个酶活力单位(1IU)指在30℃，1min内产生1μmol的△4,5不饱和糖醛酸反应效力；反应体系为：1.5mL的ep管中加入100μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠的混合物，金属浴中40℃恒温孵育10min，加入稀释纯化脱盐后的浓度为20-25ug/ml的酶液10μL，反应10min，立即加入0.06mol/L盐酸1mL终止反应；在12000r/min条件下离心5min，取上清液测定其在232nm的吸光值。

更具体地，相关步骤如下：

一、突变位点的筛选及确定

AMBER16软件MOE的Disulfide scan模块对肝素酶I(PDB文件：3ikw)进行二硫键突变扫描，构建突变的电子文库。利用多种生物信息学软件分析，去除在底物结合区和钙离子结合区的突变位点。并结合肝素酶I突变体dStability(kcal/mol)值，以dStability<-5kcal/mol作为筛选标准，进一步构建微型突变体文库。一共筛选选出复合上述条件的5个热稳定性肝素酶I突变体，具体如下：

筛选出的潜在的具有二硫键效应的5个热稳定性肝素酶I突变体

Mutation	dStability(kcal/mol)
		H333C,D336C	-6.7174
D204C,K208C	-6.4962
		P201C,P209C	-6.3487
S141C,G236C	-6.0551
		P283C,D286C	-5.7645

二、含有突变酶基因的工程菌的构建

采用重叠PCR技术构造含有突变酶基因Bthepi^D204C/K208C的表达质粒，分别以D204C-F、D204C-R和K208C-F、K208C-R为引物、以pE-SUMO-Bthepi为模板进行PCR(95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min)，PCR产物使用DnpI酶消化2h后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析并切胶回收。将回收产物进行重组连接，进而转化入DH5α感受态细胞，提取质粒送去测序。将测序正确的突变表达质粒转化入Rosetta(DE3)感受态细胞，通过抗性验证以及测序，成功得到表达突变酶的工程菌。

三、BtHepI^D204C/K208C的表达、纯化以及活性测定

1、将工程菌分别接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的LB培养基(NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，含50ug/L卡那霉素和34ug/L氯霉素)37℃，220r/min培养过夜。将过夜培养菌液按1％接种量接入50mL发酵培养基中(250mL摇瓶),37℃，220r/min培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在25℃，200r/min条件下诱导12h。4℃8000r/min离心10min收集菌体，用缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，200mmol/LNaCl pH 7.4)洗涤两遍，再将其悬于40mL缓冲液中，超声破碎细胞。12000r/min、4℃离心20min，收集上清，进行SDS-PAGE分析。

2、使用Co-NTA亲和层析进行纯化，Co柱使用10mL的平衡缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/LNaCl pH 7.4)平衡后上样，并使用10mL结合缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑)冲洗除掉非特异性结合蛋白，使用3mL洗脱缓冲液(20mmol/LTris-Hcl，300mmol/LNaCl，150mmol/L咪唑)洗脱重组目的蛋白，收集洗脱液即为纯化后的重组酶。使用PD-10预装脱盐柱对纯化后的酶进行脱盐处理。使用25mL的平衡缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl，200mmol/LNaCl pH 7.4)平衡后上样2.5mL，3.5mL缓冲液洗脱，从上样开始收集2.5-6mL的洗脱液为脱盐后的酶液。纯化后的突变体酶经SDS-PAGE分析，结果如图3所示，可以达到胶纯的效果。

3、t_1/2值是指酶在特定温度下处理一段时间后残余酶活为50％时对应的时间。具体测定方法如下：以未进行热处理的肝素酶I的活力作为100％，分别测定并计算出酶在40℃和50℃下处理不同时间后的残余酶活。以处理时间为横坐标，以Ln(％残余酶活)为纵坐标，绘制时间—Ln(％残余酶活)的曲线，据图计算t_1/2＝Ln2/K_d，K_d为该图斜率，结果如图4所示。

四、BtHepI、BtHepI^D204C/K208C的酶学性质测定

突变后肝素酶I的酶学性质可能发生改变，探究最佳酶活条件，进行了一系列实验。分别将未突变BtHepI、BtHepI^D204C/K208C在相同条件下的酶学性质进行分析比较。

1、温度对肝素酶I突变前后活性的影响

温度即能改变酶发生催化反应速度，也能导致酶蛋白活性降低或失活。本实验将同时测定未突变型BtHepI、BtHepI^D204C/K208C的最佳反应温度。准备若干组100ul反应液(50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠，pH 7.4)，分别置于25、30、35、40、45、50℃下反应，添加酶量均为10ul，定时测定反应液A232变化情况，将最佳温度下测定的酶活值作为100％，计算其他温度下的相对酶活。结果如图5所示，可知突变前后反应的最适温度并未发生改变。

2、pH对肝素酶I突变前后活性的影响

酶反应都有其最佳的pH值范围，pH值过高或者过低对酶发生催化反应的活性都会产生影响，本实验将同时测定未突变型BtHepI、BtHepI^D204C/K208C的最佳反应pH。准备若干组100ul反应液(50mmol/L醋酸钠，5mmol/L醋酸钙，5mmol/L肝素钠)，分别调节pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，添加酶量均为10ul，置于37℃反应，定时测定反应液A232变化情况，将pH值为4条件下测得的未突变的酶活值作为100％，计算其他pH值下的相对酶活。结果如图5所示，实验结果表明未突变型BtHepI、BtHepI^D204C/K208C的最佳反应pH都是7.0。说明突变前后并未改变肝素酶I的最适pH值。

突变引物、DNA聚合酶、DpnI酶、DNA和蛋白质Maker等均可以购自Thermo公司。测序可以由苏州金唯智公司完成。质粒提取，PCR产物切胶回收试剂盒等均可以购自全式金公司。纯化用的Co柱可以购自GE公司。

序列表

SEQ ID NO.1

BtHepI^D204C/K208C氨基酸序列

1

MLTAQTKNTQTLMPLTERVNVQADSARINQIIDGCWVAVGTNKPHAIQRDFTNLFDGKPSYRFELKTEDNTLEGYAKGETKGRAEFSYCYATSDDFRGLPADVYQKAQITKTVYHHGKGACPQGSSRDYEFSVYIPSSLDSNVSTIFAQWHGMPDRTLVQTPQGEVKKLTVDEFVELEKTTFFKKNVGHEKVARLDKQGNPVKCKNGCPVYKAGKPNGWLVEQGGYPPLAFGFSGGLFYIKANSDRKWLTDKDDRCNANPGKTPVMKPLTSEYKASTIAYKLPFADFPKDCWITFRVHIDWTVYGKEAETIVKPGMLDVRMDYQEQGKKVSKHIVDNEKILIGRNDEDGYYFKFGIYRVGDSTVPVCYNLAGYSER

SEQ ID NO.2

BtHepI^D204C/K208C核苷酸序列

2

Atgttaaccgcccagaccaaaaatacccagaccctgatgccgctgacagagcgtgttaacgttcaggcagatagcgcccgcatcaaccagattatcgacggctgctgggtggcagtgggcacaaacaaaccgcacgcaattcagcgcgactttaccaatctgttcgatggtaagccgagctatcgctttgagctgaagaccgaagacaacaccctggaaggctatgcaaagggtgagacaaagggccgcgccgaattcagctactgctacgcaaccagcgatgattttcgcggtctgccggccgacgtgtatcagaaagcccagattaccaaaaccgtgtaccaccacggcaaaggcgcatgtccgcagggtagcagccgcgattatgagttcagcgtgtacatcccgagcagcctggacagtaacgtgagtacaatcttcgcccagtggcacggcatgcctgaccgtaccttagttcagacaccgcagggcgaagtgaaaaagctgaccgttgatgagtttgttgagctggaaaaaaccaccttttttaaaaagaacgttggccatgagaaagttgcacgcctggataagcagggcaacccggttaagtgcaagaatggctgcccggtgtataaagcaggcaagccgaatggctggctggtggaacagggtggttatccgccgctggccttcggctttagtggcggcctgttctacatcaaagccaacagcgatcgcaaatggctgaccgataaagacgaccgttgcaatgccaacccgggtaagacccctgtgatgaaaccgctgaccagtgagtacaaggccagcacaattgcctacaaactgccgttcgccgactttccgaaagattgctggatcaccttccgcgttcacattgactggaccgtgtatggcaaagaagctgaaaccattgttaaaccgggcatgctggacgtgcgcatggattaccaggaacagggtaaaaaagtgagtaaacacatcgtggacaacgaaaaaatcctgatcggccgcaacgacgaagacggctactactttaagttcggcatttatcgtgtgggcgatagcaccgttccggtgtgttacaatctggccggctatagtgagcgc

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 376

<212> PRT

<213> 突变体的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Leu Thr Ala Gln Thr Lys Asn Thr Gln Thr Leu Met Pro Leu Thr

1 5 10 15

Glu Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Arg Ile Asn Gln Ile Ile

20 25 30

Asp Gly Cys Trp Val Ala Val Gly Thr Asn Lys Pro His Ala Ile Gln

35 40 45

Arg Asp Phe Thr Asn Leu Phe Asp Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu

50 55 60

Leu Lys Thr Glu Asp Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr

65 70 75 80

Lys Gly Arg Ala Glu Phe Ser Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Asp Asp Phe

85 90 95

Arg Gly Leu Pro Ala Asp Val Tyr Gln Lys Ala Gln Ile Thr Lys Thr

100 105 110

Val Tyr His His Gly Lys Gly Ala Cys Pro Gln Gly Ser Ser Arg Asp

115 120 125

Tyr Glu Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Leu Asp Ser Asn Val Ser

130 135 140

Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Gln

145 150 155 160

Thr Pro Gln Gly Glu Val Lys Lys Leu Thr Val Asp Glu Phe Val Glu

165 170 175

Leu Glu Lys Thr Thr Phe Phe Lys Lys Asn Val Gly His Glu Lys Val

180 185 190

Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Pro Val Lys Cys Lys Asn Gly Cys

195 200 205

Pro Val Tyr Lys Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly

210 215 220

Gly Tyr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Gly Gly Leu Phe Tyr Ile

225 230 235 240

Lys Ala Asn Ser Asp Arg Lys Trp Leu Thr Asp Lys Asp Asp Arg Cys

245 250 255

Asn Ala Asn Pro Gly Lys Thr Pro Val Met Lys Pro Leu Thr Ser Glu

260 265 270

Tyr Lys Ala Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Leu Pro Phe Ala Asp Phe Pro

275 280 285

Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Arg Val His Ile Asp Trp Thr Val Tyr

290 295 300

Gly Lys Glu Ala Glu Thr Ile Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Arg

305 310 315 320

Met Asp Tyr Gln Glu Gln Gly Lys Lys Val Ser Lys His Ile Val Asp

325 330 335

Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Phe

340 345 350

Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asp Ser Thr Val Pro Val Cys Tyr

355 360 365

Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Glu Arg

370 375

<210> 2

<211> 1128

<212> DNA/RNA

<213> 编码基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atgttaaccg cccagaccaa aaatacccag accctgatgc cgctgacaga gcgtgttaac 60

gttcaggcag atagcgcccg catcaaccag attatcgacg gctgctgggt ggcagtgggc 120

acaaacaaac cgcacgcaat tcagcgcgac tttaccaatc tgttcgatgg taagccgagc 180

tatcgctttg agctgaagac cgaagacaac accctggaag gctatgcaaa gggtgagaca 240

aagggccgcg ccgaattcag ctactgctac gcaaccagcg atgattttcg cggtctgccg 300

gccgacgtgt atcagaaagc ccagattacc aaaaccgtgt accaccacgg caaaggcgca 360

tgtccgcagg gtagcagccg cgattatgag ttcagcgtgt acatcccgag cagcctggac 420

agtaacgtga gtacaatctt cgcccagtgg cacggcatgc ctgaccgtac cttagttcag 480

acaccgcagg gcgaagtgaa aaagctgacc gttgatgagt ttgttgagct ggaaaaaacc 540

acctttttta aaaagaacgt tggccatgag aaagttgcac gcctggataa gcagggcaac 600

ccggttaagt gcaagaatgg ctgcccggtg tataaagcag gcaagccgaa tggctggctg 660

gtggaacagg gtggttatcc gccgctggcc ttcggcttta gtggcggcct gttctacatc 720

aaagccaaca gcgatcgcaa atggctgacc gataaagacg accgttgcaa tgccaacccg 780

ggtaagaccc ctgtgatgaa accgctgacc agtgagtaca aggccagcac aattgcctac 840

aaactgccgt tcgccgactt tccgaaagat tgctggatca ccttccgcgt tcacattgac 900

tggaccgtgt atggcaaaga agctgaaacc attgttaaac cgggcatgct ggacgtgcgc 960

atggattacc aggaacaggg taaaaaagtg agtaaacaca tcgtggacaa cgaaaaaatc 1020

ctgatcggcc gcaacgacga agacggctac tactttaagt tcggcattta tcgtgtgggc 1080

gatagcaccg ttccggtgtg ttacaatctg gccggctata gtgagcgc 1128

<210> 3

<211> 37

<212> DNA/RNA

<213> D204C-F(Unknown)

<400> 3

ccggttaagt gcaagaatgg caagccggtg tataaag 37

<210> 4

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> D204C-R(Unknown)

<400> 4

gccattcttg cacttaaccg ggttgccctg cttatc 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> K208C-F(Unknown)

<400> 5

aagaatggct gcccggtgta taaagcaggc aagccg 36

<210> 6

<211> 37

<212> DNA/RNA

<213> K208C-R(Unknown)

<400> 6

atacaccggg cagccattct tgtccttaac cgggttg 37

Claims

1.一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组质粒。

4.一种包含如权利要求2所述的编码基因的转化子。

5.一种如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的制备方法，其特征在于：步骤如下：

利用定点突变技术，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；经测序正确后，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）；经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的肝素酶I突变体。

6.根据权利要求5所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C ^/K208C的制备方法，其特征在于：所述方法中使用的表达载体为原核表达质粒。

7.根据权利要求5所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C ^/K208C的制备方法，其特征在于：含突变基因BtHepI^D204C/K208C表达工程菌的构建具体步骤如下：

设计2对突变引物：D204C-F、D204C-R；K208C-F、K208C-R，所述D204C-F、D204C-R；K208C-F、K208C-R序列为：

D204C-F：SEQ ID NO.3；

D204C-R：SEQ ID NO.4；

K208C-F：SEQ ID NO.5；

K208C-R：SEQ ID NO.6；

以含有野生型BtHepI基因的质粒 pE-SUMO-BtHepI 为模板，使用以上引物进行两轮PCR，反应条件为：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 7min，30个循环；72℃ 5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-BtHepI^D204C/K208C转化入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；

经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的肝素酶I突变体。

8.一种如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的活性测定方法，其特征在于：步骤如下：

以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性；反应体系为在1.5 mL 的EP管中加入100 μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50 mmol/L 醋酸钠，5 mmol/L 醋酸钙，5 mmol/L 肝素钠的混合物，金属浴中40 ℃恒温孵育10 min，加入纯化后浓度为20-25ug/ml的酶液10 μL，反应10min，立即加入0.06 mol/L 盐酸1 mL终止反应；在12000 r/min 条件下离心5 min，取上清液测定其在232 nm的吸光值。