CN114836408A - 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 - Google Patents
含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用。本发明针对野生型的碱性蛋白酶，将其原始氨基酸序列的第110位氨基酸由A变为Y，或将第106位氨基酸由A变为N。通过定点突变获得了碱性蛋白酶突变体，并进一步构建起重组表达地衣芽胞杆菌工程菌株。结果表明，重组菌株发酵上清液的酶活分别达到21304.82 U/mL、22836.17 U/mL，和原始的碱性蛋白酶表达菌株相比，突变体菌株酶活提高了15%和23%。
Description
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用。
背景技术
碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种在工业上有用的水解酶，可切断氨基酸残基之间的肽键。食品中的肽具有抗氧化活性和安全性。酶水解也被证明是从蛋白质中生产生物活性肽的最有前途的方法，并且在许多情况下，可以增强完整蛋白质的生物活性。每年三分之二的蛋白酶用于洗涤剂行业。微生物蛋白酶，尤其是来自芽孢杆菌的蛋白酶，传统上占据着工业酶的主要市场份额。微生物蛋白酶主要应用于各种洗涤剂的配方中，在全球酶销售中占有很大份额。芽孢杆菌属的许多细菌向培养基中分泌大量酶。碱性丝氨酸蛋白酶是最重要的酶之一，由地衣芽孢杆菌或短小双歧杆菌菌株分泌到培养基中。这些碱性蛋白酶，其高碱性pH范围为9-11，是洗涤剂配方的最佳选择。
地衣芽孢杆菌所产的碱性蛋白酶的DNA序列显示信号序列和成熟酶之间存在一个中间前肽序列。前肽作为分子间伴侣，在引导成熟结构域的正确折叠中起着重要作用。它可以直接催化折叠反应或促进结构组织和齐聚、定位和分类等过程。因此，通过前导肽位点突变，蛋白质的折叠速率可以改变，以加速酶的成熟。此外，前导肽可以作为成熟酶的竞争性抑制剂，通过与活性位点强制结合，形成稳定且不活跃的前导肽-酶复合物。因此，前导肽必须在完成引导过程后进行切割和降解，然后释放出成熟酶。
本发明对碱性蛋白酶aprE序列进行分析查找其前导肽切割位点，通过序列比对，筛选出可能影响前导肽切割的位点。最终提供一种能够促进前导肽的切割、提高前导肽的切割效率，使酶活增加的碱性蛋白酶突变体。
发明内容
本发明的目的在于提供含有前肽突变体的碱性蛋白酶，所述的碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
本发明的另一个目的在于提供了含有前肽突变体的碱性蛋白酶在制备水解酶中的应用。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE(SEQ ID NO.2所示，由SEQ IDNO.1所示的核苷酸编码)为基础，通过对碱性蛋白酶的氨基酸序列进行分析，确定可能影响前导肽切割的位点，。之后通过设计引物进行PCR技术引入突变位点，获得了2个碱性蛋白酶的突变体A106N(SEQ ID NO.4)、A110Y(SEQ ID NO.5)。分别构建了上述突变体的重组菌地衣芽孢杆菌BL10/aprE-A106N、BL10/aprE-A110Y，发酵48h后酶活分别到达了21304.82U/mL、22836.17U/mL和原始的碱性蛋白酶菌株相比，突变体酶活提高了15％和23％。
表达SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的碱性蛋白酶的基因工程菌，也属于本发明的保护范围。
本发明的保护范围还包括，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的碱性蛋白酶或上述的基因工程菌在制备水解酶中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
前导肽的切割效率是制约碱性蛋白酶酶活的重要原因，本发明对碱性蛋白酶基因前导肽区域进行了优化，提高了前导肽的切割效率，且对其热稳定性具有促进作用。本发明构建的突变菌株有效促进了碱性蛋白酶的高效表达。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围，本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明的含有前肽突变体的碱性蛋白酶，可采用直接合成的方式获得，或是通过构建表达该含有前肽突变体的碱性蛋白酶的基因工程株发酵获得。
实施例1：
碱性蛋白酶突变表达菌株的构建：
野生型碱性蛋白酶AprE为SEQ ID NO.2所示，申请人通过对碱性蛋白酶的前导肽基序的分析预测了部分前导肽的切割位点，将其将第106位氨基酸由A变为N，获得了碱性蛋白酶突变体aprE-A106N为SEQ ID NO.4所示，或第110位氨基酸由A变为Y、获得了碱性蛋白酶突变体aprE-A110Y为SEQ ID NO.5所示。
以质粒pHY-aprE(CN110878293A)为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体骨架。
设计的表达突变体aprE-A106N的引物如下：
A106N-F：gaggataacgaagtaacgac
A106N-R：cgttacttcgttatcctcttcaat；
表达突变体aprE-A110Y的引物如下：
A110Y-F：caatgtatcaatcagtgccatg
A110Y-R：catggcactgattgatacattgt
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到扩增出来的条带大小，共(3661bp)。然后经过胶回收试剂盒将其回收后，用T5外切酶将其连接起来，获得重组表达载体。将其电转化至地衣芽孢杆菌BL10(CCTCC NO：M2013400)中，经菌落PCR验证后得到碱性蛋白酶突变重组菌株BL10/aprE-A106N、BL10/aprE-A110Y。
实施例2：
碱性蛋白酶突变体的表达：
将实施例1中获得的表达碱性蛋白酶突变重组菌株接种于含四环素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5ml LB培养基中再次进行活化，230r/min，12h，后吸取1ml接种至20ml种子液(LB)中，230r/min、37℃、14h至OD600至4-6之间，接种至碱性蛋白酶发酵培养基中230r/min，37℃发酵48小时。取样测碱性蛋白酶酶活。以实验室现存的菌株BL10/pp-aprE(即pHY-aprE转入BL10获得)作为对照菌株。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.2。装液量5mL。
种子液培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L,pH为7.2。装液量20mL。
碱性蛋白酶发酵培养基：玉米淀粉40g/L，豆粕45g/L，碳酸钙5g/L，硫酸铵4g/L，pH为7.2。装液量20mL
采用国标法(GBT23527-2009蛋白酶制剂的测定方法)检测碱性蛋白酶活力。
实验结果如下表所示：
| 菌株名称 | 碱性蛋白酶酶活 | 酶活提高百分比 |
| BL10/pp-aprE | 18459.58 | |
| BL10/aprE-A106N | 21304.82 | 15％ |
| BL10/aprE-A110Y | 22836.17 | 23％ |
由表可看出，使用碱性蛋白酶发酵培养基培养48h，本发明所构建的碱性蛋白酶突变重组菌株的酶活力显著提高，其中重组菌株BL10/aprE-A106N酶活达到了21304.82U/mL，相比原始菌株提高了15％。BL10/aprE-A110Y酶活达到了22836.17U/mL，相比原始菌株提高了23％。
实施例3：
碱性蛋白酶突变体的耐热性测定：
将实施例1中获得的表达碱性蛋白酶突变重组菌株接种于含四环素抗性的LB平板上37℃培养12h，挑取单菌落接种于5ml LB培养基中再次进行活化，230r/min，12h，后吸取1ml接种至20ml种子液(LB)中，230r/min、37℃、14h至OD600至4-6之间，接种至碱性蛋白酶发酵培养基中230r/min，37℃发酵48小时。取48h的样品置于80℃的水浴锅中反应5min后取出，立即测定碱性蛋白酶酶活。以实验室现存的菌株BL10/pp-aprE作为对照菌株。采用国标法(GBT23527-2009蛋白酶制剂的测定方法)检测碱性蛋白酶活力。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.2。装液量5mL。种子液培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L,pH为7.2。装液量20mL。碱性蛋白酶发酵培养基：玉米淀粉40g/L，豆粕45g/L，碳酸钙5g/L，硫酸铵4g/L，pH为7.2。装液量20mL。
实验结果如下：
从实验结果来看，本发明所构建的碱性蛋白酶突变重组菌株的热稳定性明显增强，突变菌株BL10/aprE-A106N的发酵液在经过80℃处理之后酶活残留率为48％，相比于对照菌BL10/pp-aprE，热稳定性提高了9％。变菌株BL10/aprE-A110Y的发酵液在经过80℃处理之后酶活残留率为55％，相比于对照菌BL10/pp-aprE，热稳定性提高了26％。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60
agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120
gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180
ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240
ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300
tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360
cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420
gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480
gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacacatgt ggccgggacg 540
attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600
gctgttaaag tattaggggc gagcggttca ggttcggtca gctcgattgc ccaaggattg 660
gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720
agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780
gcatctggga attcaggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840
gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900
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agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagc ccttgttaaa 1020
caaaagaacc catcttggtc caatgtacaa atccgcaatc atctaaagaa tacggcaacg 1080
agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgcagaagc ggcaacacgc 1140
taa 1143
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Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
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Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
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Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
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Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
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Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
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Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
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Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr
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Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
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<212> DNA
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<400> 9
catggcactg attgatacat tgt 23
Claims (4)
1.人工合成的含有前肽突变体的碱性蛋白酶，所述蛋白酶为SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示。
2.权利要求1所述的碱性蛋白酶在制备水解酶中的应用。
3.表达权利要求1所述碱性的蛋白酶的基因工程菌。
4.权利要求3所述的基因工程菌在制备水解酶中的应用。
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