KR101293498B1

KR101293498B1 - 서브틸라제 변이체

Info

Publication number: KR101293498B1
Application number: KR1020057007858A
Authority: KR
Inventors: 헨리엣트 드래그보르그; 피터 캠프 한센; 매드스 에스케룬드 뵈른바드; 매드스 뇌레가르드-마드센; 미카엘 미켈센
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 2002-11-06
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2013-08-13
Also published as: CA2503965A1; JP5474734B2; EP2138574A2; KR20140021051A; MY140915A; EP2399992A2; AU2003277836A1; CA2503965C; WO2004041979A2; KR101394294B1; EP1563064A2; EP2284258A3; EP2138574B1; CN103397010A; KR20050072467A; CN101899428A; AR041993A1; CN101899428B; KR20120044360A; CN105018451A

Abstract

본 발명은 세척 성능, 열안정성, 저장 안정성 또는 촉매 활성을 포함하는 하나 이상의 특성에 있어서 모서브틸라제와 비교하여 변화를 보이는 신규한 서브틸라제 변이체에 관련한다. 본 발명의 변이체는 예를 들어, 세탁 세제 조성물 및 자동 식기 세척 조성물을 포함하는 식기 세척 조성물과 같은 클리닝 또는 세제 조성물의 사용상 적합하다.

서브틸라제, 변이체, 세제 조성물.

Description

서브틸라제 변이체{SUBTILASE VARIANTS}

본 발명은 세척 성능, 열안정성, 저장 안정성 또는 촉매 활성을 포함하는 하나 이상의 특성에 있어서 모(parent) 서브틸라제와 관련하여 변화를 보이는 신규한 서브틸라제 변이체에 관련한다. 본 발명의 변이체는 예를 들어, 세탁 세제 조성 및 자동 식기 세척 조성물을 포함하는 식기 세척 조성물과 같은 클리닝 또는 세제 조성물에 있어서 사용상 적합하다. 본 발명은 또한 변이체를 코딩하는 분리 DNA 서열, 발현벡터, 숙주세포, 및 본 발명의 변이체를 생산 및 이용하는 방법에 관련한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 변이체를 포함하는 세척 및 세제 조성물에 관련한다.

세제 산업에 있어서 효소는 30 년 이상 세척 조성물에 사용되어 왔다. 이러한 조성물에 있어서 사용되는 효소는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀룰라제, 및 기타 효소, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 상업적으로 가장 중요한 효소는 프로테아제이다.

증가일로에 있는 다수의 상업적으로 이용되는 프로테아제는 예를 들어, Durazym^®, Relase^®, Alcalase^®, Savinase^®, Primase^®, Duralase^®, Esperase^®, Ovozyme^® 및 Kannase^® (Novozymes A/S), Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Properase^TM, Purafect^TM, Purafect OxP^TM, FN2^TM, FN3^TM 및 FN4^TM(Genencor International, Inc.)와 같은 자연 발생 야생형 프로제아제의 단백질 조작된 변이체이다. 또한, 다수의 프로테아제 변이체는 당업계에서 개시된다. 선행 기술 프로테아제 변이체의 전체 목록이 WO 99/27082에 제공된다.

그러나, 많은 유용한 프로테아 변이체가 개시되었지만, 세탁 또는 경표면 클리닝과 같은 많은 산업적 용도를 위한 신규하고 개선된 프로테아제 또는 프로테아제 변이체의 필요성은 여전하다. 그러므로, 본 발명의 목적은 이러한 목적을 위한 개선된 서브틸라제 변이체를 제공하는 것이다.

발명의 개요

따라서, 제 1 의 양태에서, 본 발명은 적어도 다음을 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다:

a)위치 62, 68, 97, 98, 99, 106, 131, 170, 245, 252 중 하나 이상에서

하기의 변형 중 적어도 하나의 조합으로;

아미노산 잔기 K,H,R,E,D,Q,N,C,V,L,I,P,M,F,W,Y,G,A,S,T 중 하나의 삽입, 치환 또는 결실;

또는

b) 하기의 조합 변이체 중 하나;

또는

C) 위치 68에서 하나 이상의 변형으로서, 상기 변형은 다음을 포함한다:

K,H,R,E,D,Q,N,C,V,L,I,P,M,F,W,Y,G,A,S 및 T로 구성되는 군 중에서 선택된 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환.

제 2 의 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다:

a) 하기 변형 중 하나 이상의 조합으로서;

하기의 변형 중 적어도 하나를 포함한다;

제 3 의 양태에서, 본 발명은 하기 표 I에 개시되는 변형 중 적어도 하나를 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다:

이 때

(a) 표 I의 변이체는 프로테아제 활성을 나타내고,

(b) 각각의 위치는 도 1 및 SEQ ID NO:1에서 나타낸 서브틸리신 BPN'의 아미노산 서열의 위치에 대응한다.

제 4 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리 폴리뉴클레오티드에 관련한다.

제 5 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관련한다.

제 6 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 미생물 숙주 세포에 관련한다.

제 7 의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 서브틸라제 변이체를 생산하는 방법에 관련하며, 이 때 본 발명에 따르는 숙주는 변이체의 발현 및 분비에 도움이 되는 조건하에서 배양되며, 변이체가 회수된다.

제 8 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이체를 포함하는 클리닝 또는 세제 조성물, 바람직하게는 세탁 또는 식기 세척 조성물에 관련한다.

제 9 의 양태에서, 본 발명은 하기 표 II에 개시된 변형 중 적어도 하나를 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다.

이 때

(a) 표 II의 변이체는 프로테아제 활성을 나타내고,

제 10 의 양태에서, 본 발명은 변형 N252D 및 N252M 중 하나를 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다.

제 11 의 양태에서, 본 발명은 상기 표 I 및 표 II에 열거된 서브틸라제 변이체와 조합으로 변형 M119L, I, V, A, S; M175L, I, V, A, S 및 M222L, I, V, A, S 중 하나 이상을 포함하는 서브틸라제 변이체에 관련한다.

정렬 및 넘버링에 관련하여, 서브틸리신 BPN'(a)(BASBPN) 및 서브틸리신 309(b)(BLSAVI) 사이의 정렬을 나타내는 도 I을 참고하시오. 이러한 정렬은 본 특허 출원에서 잔기를 넘버링하기 위한 기준으로서 사용된다.

정의

더 상세하게 본 발명을 논의하기 전에, 다음 용어 및 협약이 우선 정의될 것이다.

아미노산 및 핵산의 명명법의 상세한 설명을 위해, 본 발명자들은 참고로 본원에 수록되는 페이지 5의 시작부의 WO 00/71691을 인용한다.

변이체의 칭호를 위한 명명법 및 협약 사항

본 발명에 따라서 생산되거나 고려되는 다양한 서브틸라제 효소 변이체를 기술함에 있어서, 다음 명명법 및 협약을 참고의 용이를 위해 적합화하였다:

참고의 테두리는 우선 서브틸리신 BPN'(BASBPN)을 갖는 분리체 또는 모효소를 정렬함으로써 정의된다.

정렬은 GCG 패키지 버전 9.1의 GAP 루틴에 의하여 얻어져 다음의 매개변수를 사용하여 변이체에 넘버링할 수 있다: 갭 생성 패널티 = 8 및 갭 확장 패널티 = 8이며 다른 모든 매개변수는 그것의 디폴트값으로 유지되었다.

다른 방법은 예를 들어 WO 91/00345에서 나타낸 정렬과 같이 서브틸라제 사이의 공지된 인지 정렬을 사용하는 것이다. 대부분 경우에 있어서 차이는 전혀 중요하지 않을 것이다.

그로써 결실 및 삽입의 번호는 BASBPN(SEQ ID NO.1)에 관련하여 정의될 것이다. 도 1에서, 서브틸리신 309(SEQ ID NO.2)는 BASBPN과 비교하여 위치 36, 58, 158, 162, 163, 및 164에서 6개의 결실을 가진다. 이러한 결실은 도 1에서 별표(*)로 표시된다.

유전적 조작에 의해 폴리펩티드 내에 도입된 변형의 명명법의 상세한 설명을 위해 본 발명자들은 본원에 참고로 수록된 WO 00/71691 페이지 7-12를 인용한다.

프로테아제

단백질 기질 내 아미드 결합을 절단하는 효소는 프로테아제, 또는 (호환성 있게)펩티다아제로서 분류된다(Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman 및 Company, San Francisco, Chapter 3 참조).

아미노산 위치/잔기의 넘버링

아무것도 언급하지 않는다면 본원에서 사용되는 아미노산 넘버링은 서브틸라제 BPN'(BASBPN) 서열의 넘버링에 일치한다. BPN' 서열의 추가적 설명을 위해, 도 1, SEQ ID NO:1 또는 Siezen et al., Protein Engng.4(1991)719-737를 참조하시오.

세린 프로테아제

세린 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이고, 활성 부위에 필수적인 세린 잔기가 존재한다(White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry", 5판, McGraw-Hill Book Company, NY, pp 271-272).

세균의 세린 프로테아제는 20,000 내지 45,000 달톤 범위의 분자량을 가진다. 그들은 디이소프로필플루오로포스페이트에 의해 저해된다. 그들은 간단한 말단 에스테르를 가수분해하고 진핵세포 키모트립신뿐만 아니라 세린 프로테아제에 대한 활성에 있어서 유사하다. 더 좁은 의미인, 서브-그룹을 포함하는 알카리 프로테아제는 pH 9.0 내지 11.0에 이르는 몇몇 세린 프로테아제의 높은 pH 최적을 반영한다(개관을 위해, Priest (1997) Bacteriological Rev.41 711-753 참조).

서브틸라제

서브틸라제로 임시로 칭하여진 세린 프로테아제의 서브그룹이 Siezen et al., Protein Engng.4(1991)719-737 및 Siezen et al.Protein Science 6(1997)501-523에 의해 제안되었다. 그들은 서브틸리신 유사 프로테아제로서 이미 명명된 세린 프로테아제의 170개 이상의 아미노산 서열의 상동성 분석에 의해 정의된다. 서브틸리신은 이전에 그램 양성 세균 또는 균류에 의해 생산되는 세린 프로테아제로서 종종 정의되었고, Siezen et al.에 따라서 현재는 서브틸라제의 서브그룹이다. 매우 다양한 서브틸라제가 동정되었고, 많은 서브틸라제의 아미노산 서열이 결정되었다. 이러한 서브틸라제 및 그들의 아미노산 서열의 더 상세한 설명을 위해 Siezen et al.(1997)을 참조한다.

서브틸라제의 한 서브그룹인, I-S1 또는 "진정" 서브틸리신은 서브틸리신 168(BSS168), 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 Carlsberg(ALCALASE^®, Novozymes A/S), 및 서브틸리신 DY(BSSDY)와 같은 "전통적" 서브틸리신을 포함한다.

서브틸라제의 더 나아간 서브그룹인 I-S2 또는 고 알카리 서브틸리신은 Siezen et al.(상기)에 의해 알려진다. 서브그룹 I-S2 프로테아제는 고 알카리 서브틸리신으로서 기술되며, 서브틸리신 PB92(BAALKP)(MAXACAL^®, Genencor International Inc.), 서브틸리신 309(SAVINASE^®, Novozymes A/S), 서브틸리신 147(BLS147)(ESPERASE^®, Novozymes A/S), 및 알카리 엘라스타제 YaB(BSEYAB)를 포함한다.

"사비나제®"

사비나제®는 Novozymes A/S에 의해 시판되고 있다. 이것은 B.Lentus 유래의 서브틸리신 309이고 단지 하나의 위치(N87S)에 있어서 BAALKP와 다르다. 사비나제^®는 도 1 및 SEQ ID NO:2에서 b)로 칭해진 아미노산 서열을 가진다.

모서브틸라제

용어 "모서브틸라제"는 Siezen et al.(1991 및 1997)에 따라 정의된 서브틸라제를 의미한다. 더 나아간 상술을 위해 상기 "서브틸라제"의 설명을 참조하시오. 모서브틸라제는 또한 천연원으로부터 분리된 서브틸라제일 수 있으며, 이 때 후속적인 변형은 서브틸라제의 특징을 보유하면서 이루어졌다. 또한, 모서브틸라제는 예를 들어 J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896(1999)에 의해 기술되는 바와 같이 DNA 셔플링(shuffling) 기술을 이용하여 제조한 서브틸라제일 수 있다.

택일적으로 용어 "모서브틸라제"는 "야생형 서브틸라제"로 칭할 수 있다.

참고로 본원에 언급된 다양한 서브틸라제에 대한 약어의 표가 제공되고, 추가적 약어에 대하여, Siezen et al., Protein Engng. 4(1991)719-737 및 Siezen et al. Protein Science 6(1997)501-523을 참조하시오.

서브틸라제 변이체의 변형

본원에 사용된 용어 "변형"은 서브틸라제를 코딩하는 DNA의 유전적 조작뿐만 아니라 서브틸라제의 화학적 변형을 포함하도록 정의된다. 변형은 관심의 아미노산에서나 그 안에서의 아미노산 측쇄의 대체, 치환, 결실 및/또는 삽입일 수 있다.

서브틸라제 변이체

본 발명의 문맥에서, 용어 서브틸라제 변이체 또는 돌연변이된 서브틸라제는 원래의 또는 모유전자를 함유하고 대응 모효소를 생산하는 모미생물로부터 유도된 돌연변이 유전자를 발현시키는 미생물에 의해 생산된 서브틸라제를 의미하는데, 상기 모유전자는 상기 돌연변이된 서브틸라제 프로테아제가 적당한 숙주 내에서 발현될 때 생산되는 돌연변이 유전자를 생산하기 위해 돌연변이되었다.

상동 서브틸라제 서열

2개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 본 문맥에서 매개변수 "동일성"에 의해 기술된다.

2개의 서브틸라제 사이의 동일성의 정도를 결정하기 위해 GCG 패키지 버전 9.1의 GAP 루틴이 동일한 셋팅을 이용하여 적용될 수 있다(하기). 상기 루틴으로부터의 결과는 아미노산 정렬 외에 2개의 서열 사이의 "% 동일성"의 계산이 있다.

이러한 기술에 기초하여 당업계 숙련자가 본 발명에 따라서 변형될 수 있는 적합한 상동 서브틸라제를 동정하는 것이 용이하다.

분리된 폴리뉴클레오티드

폴리뉴클레오티드에 적용할 때, 용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드가 그것의 천연의 유전자적 환경으로부터 제거되었고 따라서 다른 외래의 또는 원치 않는 코딩 서열이 부존재하며, 유전공학적으로 조작된 단백질 생산 시스템 내 사용에 적합한 형태임을 의미한다. 이러한 분리된 분자는 그들의 천연 환경으로부터 분리되고 cDNA 및 게놈 클론을 포함하는 분자이다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 통상 관련된 다른 유전자가 부존재하지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 천연 발생의 5' 및 3' 번역되지 않은 부위를 포함할 수 있다. 관련 부위의 동정은 당업계 통상의 기술을 가진 자에게 명백할 것이다(예를 들어, Dynan 및 Tijan, Nature 316:774-78, 1985 참조). 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 택일적으로 "클론화 폴리뉴클레오티드"로 칭할 수 있다.

분리된 단백질

단백질에 적용할 때, 용어 "분리된"은 단백질이 그것의 본래의 환경으로부터 제거된 것을 나타낸다. 바람직한 형태에서, 분리된 단백질은 실질적으로 다른 단백질, 특히 다른 상동성 단백질(즉, "상동성 불순물"(하기 참조))이 부존재한다.

분리 단백질은 SDS-PAGE에 의해 결정될 때, 10% 이상의 순도, 바람직하게는 20% 이상의 순도, 더 바람직하게는 30% 이상의 순도이다. 또한 SDS-PAGE에 의해 결정될 때, 고도로 정제된 형태로, 즉 40% 이상의 순도, 60% 이상의 순도, 80% 이상의 순도, 더 바람직하게는 95% 이상의 순도, 및 가장 바람직하게는 99%이상의 순도로 단백질을 제공하는 것이 바람직하다.

용어 "분리된 단백질"은 택일적으로 "정제된 단백질"로 칭할 수 있다.

상동성 불순물

용어 "상동성 불순물"은 본 발명의 서브틸라제를 최초에 얻은 그 상동성 세포로부터 기원한 임의의 불순물(예를 들어, 본 발명의 서브틸라제외에 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

로부터 얻어지는

특정 미생물 공급원과 관련하여 본원에서 사용되듯이 용어 "로부터 얻어지는"은 폴리뉴클레오티드 및/또는 서브틸라제가 특정 공급원에 의해, 또는 상기 공급원으로부터 유전자가 삽입된 세포에 의해 생산되는 것을 의미한다.

기질

프로테아제에 대한 기질과 관련하여 사용되는 용어 "기질"은 서브틸리신 프로테아제에 의해 가수분해되기 쉬운 적어도 하나의 펩티드(아미드) 결합을 수반하는 화합물을 포함함으로서 그것의 가장 넓은 형태로 해석되어야 한다.

산물

프로테아제 효소 반응으로부터 유도된 산물과 관련하여 사용된 용어 "산물"은 본 발명의 문맥에 있어서, 서브틸라제 프로테아제를 포함하는 가수분해 반응의 산물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 산물은 후속하는 가수분해 반응에 있어서 기질일 수 있다.

세척 성능

본 문맥에 있어서 용어 "세척 성능"은 예를 들어 세척 또는 경표면을 클리닝하는 동안 클리닝되는 물체 상에 존재하는 단백질성 또는 유기의 오염을 제거하는 효소의 능력으로서 사용된다. 또한 본원에서 실시예 3에서 세척 성능 테스트를 참조하시오.

도 1은 상기 언급된 GAP 루틴을 사용하여 서브틸리신 BPN'(a) 및 사비나제^®(b) 사이의 정렬을 도시한다.

본 발명은 세척 성능, 열안정성, 저장 안정성 또는 촉매 활성을 포함하는 하나 이상의 특성에 있어서 모서브틸라제와 관련하여 변화를 보여주는 신규한 서브틸라제 변이체에 관련한다.

본 발명의 일부로서 고려되는 변이체는 야생형 서브틸라제와 비교할 때, 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 삽입된 그러한 변이체이며, 상기 변이체는 다음 중 적어도 하나를 포함하는 그러한 변이체이다:

a) 위치 62, 68, 97, 98, 99, 106, 131, 170, 245, 252 중 하나 이상에서

하기의 변형 중 적어도 하나의 조합으로:

아미노산 잔기 K, H, R, E, D, Q, N, C, V, L, I, P, M, F, W, Y, G, A, S, T 중 하나의 삽입, 치환 또는 결실

또는

b) 다음 조합 변이체 중 하나:

또는

c) 위치 68에서 하나 이상의 변형, 상기 변형은 K, H, R, E, D, Q, N, C, V, L, I, P, M, F, W, Y, G, A, S 및 T로 구성되는 군 중에서 선택된 아미노산 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

또한, 본 발명의 변이체는 표 I 및 II에서 나타낸 변형 중 적어도 하나 이상을 포함하며, 이 때

(a) 표 I 및 II의 변이체는 프로테아제 활성을 가지고,

(b) 각각의 위치는 서브틸리신 BPN'의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)의 위치에 대응한다.

본 발명의 제 1 의 양태의 서브틸라제 변이체는 천연으로부터 동정 또는 분리된 모 또는 야생형 서브틸라제일 수 있다. 이러한 모야생형 서브틸라제는 당업계 공지된 표준 기술에 의해 특이적으로 스크리닝될 수 있다.

이를 실행하는 바람직한 한 방법은 수많은 상이한 미생물로부터, 바람직하게는 상이한 Bacillus 균주로부터의 서브틸라제로부터 관심있는 보존된 DNA 부위를 특이적으로 PCR 증폭함에 의할 수 있다.

서브틸라제는 그들의 DNA 및 아미노산 서열이 상동이라는 의미에서 한 군의 보존 효소이다. 따라서, 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 양측에 접하는 상대적으로 특이적인 프라이머를 제작하는 것이 가능하다.

수많은 상이한 미생물, 바람직하게는 상이한 Bacillus 균주로부터 DNA를 증폭하는 그러한 PCR 프라이머를 사용하여, 상기 증폭된 PCR 단편의 DNA 서열화 이후, 본 발명의 서브틸라제 변이체를 생산하는 균주를 동정하는 것이 가능하다. 이러한 관심있는 서브틸라제의 균주 및 부분적 DNA 서열이 동정된다면, 이러한 서브틸라제의 클로닝, 발현 및 정제를 완성하는 것은 당업계 숙련자에게 용이한 작업이다. 그러나, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 주요하게 모서브틸라제의 변이체임이 예측된다.

본원에서 기술된 이용상 적합한 서브틸라제 변이체는 부위-특이적/무작위 돌연변이유발 또는 다른 서브틸라제 서열의 DNA 셔플링과 같은 당업계 공지된 표준 기술에 의해 제조할 수 있다. 추가적 상술을 위해 본명세서의 "물질 및 방법" 편 및 실시예 1(하기 참조)을 참조하시오.

숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 기술된 변이체는 하나 이상의 추가적 변형, 특히 하나 이상의 추가적 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 기술된 변이체는 단지 하나의 위치 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 변이체는 예를 들어 4 내지 8 위치에서와 같이 1 위치, 2 위치, 3 위치 또는 3 위치 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다.

모 서브틸라제는 천연이나 다양한 인공 생산 유래의 효소라는 점, 그리고 모서브틸라제로부터 디자인하고 생산하는 변이체라는 점 모두에서 서브그룹 I-S1 또는 I-S2, 특히 I-S2에 속하는 것이 바람직하다.

서브그룹 I-S1으로부터의 변이체와 관련하여, BSS168(BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR(BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC, 및 BSSPRD로 구성되는 군, 또는 서브그룹 I-S1의 특징을 보유하는 그의 기능적 변이체 중에서 모서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.

서브그룹 I-S2로부터의 변이체와 관련하여, BSAPRQ, BLS147(BSAPRM, BAH101), BLSAVI(BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB, BAPB92, TVTHER, 및 BSAPRS로 구성되는 군, 또는 서브그룹 I-S2의 특징을 보유하는 그의 기능적 변이체 중에서 모서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.

특히, 모서브틸라제는 BLSAVI(Savinase®, Novozymes A/S)이고, 따라서 본 발명의 바람직한 서브틸라제는 Savinase®의 변이체이다.

본 발명은 또한 그것의 아미노산 서열에 임의의 다른 변형을 조합한 상기 언급한 임의의 서브틸라제 변이체를 포함한다. 특히 효소에 개선된 특성을 제공하는 당업계 공지된 다른 변형과의 조합이 고려된다. 상기 기술은 다른 개선된 특성을 갖는 다수의 서브틸라제 변이체를 설명하고 많은 서브틸라제 변이체가 본 명세서 "배경 기술" 편(상기 참조)에서 언급된다. 그들 참고문헌은 서브틸라제 변이체를 동정하기 위해 참고로서 본원에서 개시되는데, 이것은 본원에 설명된 서브틸라제 변이체와 이롭게 결합될 수 있다.

이러한 조합은 위치:222(산화 안정성의 개선), 218(열안정성의 개선), 효소를 안정화하는 Ca²⁺-결합 부위 내 치환, 예를 들어 위치 76, 및 선행 기술로부터 다른 많은 명백한 것을 포함한다.

추가적 구체예에 있어서 본원에서 설명된 서브틸라제 변이체는 다음의 임의의 위치 중 하나 이상의 변형으로 이롭게 결합될 수 있다;

27, 36, 56, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 120, 123, 159, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 및 274.

구체적으로, 다음 BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK, 및 BAALKP 변형은 다음의 조합으으로 적절히 고려된다:

또한 다음의 임의의 변형을 포함하는 변이체는 상기 언급된 임의의 하나 이상의 변형과 조합하여 개선된 특성을 나타낸다:

특히 관심있는 변이체는 다음 치환을 함유하는 본 발명에 따르는 변형에 추가적인 변이체이다:

또한, 본 발명의 주요한 양태의 서브틸라제 변이체는 위치 129, 131 및 194 중 임의의 것에서 하나 이상의 변형, 바람직하게는 129K, 131H 및 194P 변형, 및 가장 바람직하게는 P129K, P131H 및 A194P변형으로서 바람직하게 결합된다. 임의의 그들 변형은 그들의 생성에 있어서 서브틸라제 변이체의 더 높은 발현 수준을 제공하는 것으로 예상된다.

본 발명의 선택된 변이체의 세척 성능은 본원의 실시예 3에 개시된 세척 성능 테스트에서 시험될 수 있다. 세척 성능은 표준 또는 상업적 세제 조성물에 혼합될 때, 대조군 시스템과 비교하여 표준 직물로부터 단백질 오염을 제거하는 변이체의 능력, 즉 모 서브틸라제 또는 유사 서브틸라제가 훨씬 더 나은 세척 성능을 나타내는 것을 평가하기 위해 사용될 수 있다(동일한 세제 시스템에 혼합되고 동일한 조건하에서 테스트되었음). 본 출원의 효소 변이체는 자동 기계적 압력 분석법(AMSA)을 사용하여 테스트하였다. AMSA 테스트에 있어서 소량 효소-세제 용액의 매우 다량의 세척 성능이 신속하게 조사될 수 있다. 본 테스트을 사용할 때, 선택된 변이체의 세척 성능이 초기에 조사될 수 있고, 만일 선택된 변이체가 모서브틸라제와 비교하여 테스트에 있어서 현저한 개선을 보이지 않는다는 이론적 근거가 있다면, 추가적 테스트 실험을 수행하는 것이 보통 불필요하다.

그러므로, 본원에 설명된 목적을 위하여 특히 관심있는 변이체는 세척 성능 테스트(실시예 3)에서 설명되는 바와 같이 미국형 세제, 아시아형, 유럽형 또는 라틴 아메리카형 세제와 같은 상업적 세제 조성물에서 테스트될 경우, 동일한 조건 하에 테스트된 모서브틸라제와 비교하여 개선된 세척 성능을 보인다.

세척 성능의 향상은 본원의 실시예 3에서 정의된 소위 강도 값(Int)을 계산함으로써 정량화할 수 있다.

본 발명의 매우 관심있는 구체예에 있어서, 본 발명의 변이체는, 세척 성능 테스트에서 테스트될 때 적어도 1, 바람직하게는 2의 수행능 점수(S)를 가지며, 이 때:

S(2)= 변이체는 모든 3개의 효소 농도(5, 10 및 30 nM)에서 대조군보다 더 잘 수행하고,

S(1)= 변이체는 하나 또는 두개의 농도에서 대조군보다 더 잘 수행한다.

명백하게, 본 발명의 변이체는 최소한의 언급된 최저 수준, 더 바람직하게는 언급된 최고 수준에서 상기 기준을 달성하는 것이 바람직하다.

서브틸라제 변이체 생산

서브틸라제를 클로닝하고 유전자 내로(예를 들어, 서브틸라제 유전자) 치환, 결실 또는 삽입을 도입하는 많은 방법이 당업계 잘 알려져 있다.

일반적으로 유전자의 클로닝 및 상기 유전자 내로 돌연변이를 도입(무작위 및/부위 특이적)하는 표준 과정이 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 적합한 기술의 추가적 설명을 위해 본원의 실시예 1(하기 참조) 및 (Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al.,(eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley 및 Sons, 1995;Harwood, C.R.,및 Cutting, S.M.(eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley 및 Sons, 1990), 및 WO 96/34946를 참조하시오.

또한, 서브틸라제 변이체는 상이한 서브틸라제 유전자의 DNA 셔플링(WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91(1994)과 같이 다양한 인공적 생산을 위한 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 동정된 하나 이상의 부분 서브틸라제 서열을 이용하여 사비나제^®를 코딩하는 유전자의 DNA 셔플링은 개선된 세척 성능 변이체에 대한 후속적 스크리닝 후 본원에서 설명된 목적을 위하여 적합한 서브틸라제 변이체를 제공할 것이다.

발현 벡터

본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 구조를 포함하는 재조합 발현 벡터는 용이하게 재조합 DNA 과정에 놓일 수 있는 임의의 벡터일 수 있다.

벡터의 선택은 종종 도입되는 숙주 세포에 의존적일 것이다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터일 수 있는데, 즉 벡터는 염색체외 실재로서 존재하고, 그것의 복제는 예를 들어 플라스미드와 같은 염색체의 복제에 독립적이다.

택일적으로, 벡터는 숙주세포 내로 도입되어 부분적 또는 전체적으로 숙주세포 게놈 내로 통합되어 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수도 있다.

벡터는 바람직하게는 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가적 분절에 작동적으로 연결된 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 양쪽 모두의 요소를 함유할 수 있다. 용어, "작동적으로 연결된"은 분절이 그것의 의도된 목적, 예를 들어 프로모터에서 전사가 개시되어 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 속행하는 것과 같은 목적에 맞게 작용하도록 배열된 것을 가리킨다.

프로모터는 선택의 숙주 세포 내에서 전사적 활성을 보이는 임의의 DNA 서열일 수 있고 숙주 세포에 상동 또는 비상동인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유도될 수 있다.

세균의 숙주 세포 내 사용을 위하여 적합한 프로모터의 예는 Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자, Bacillus licheniformis 알파-아밀라제 유전자, Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라제 유전자, Bacillus subtilis 알카리 프로테아제 유전자, 또는 Bacillus pumilus xylosidase 유전자, 또는 파지 Lambda P_R 또는 P_L 프로모터 또는 E. coli lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함한다.

본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열은 또한, 필요하다면, 적당한 터미네이터에 작동적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 또한 벡터가 문제의 숙주 세포 내에서 복제하는 것을 가능케하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 선택가능한 마커를 포함할 수 있는데, 예를 들어 숙주 세포 내 결점을 보완하는 유전자 산물, 또는 예를 들어, 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 등과 같은 항생제에 대한 내성, 또는 중금속이나 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 효소를 숙주 세포의 분비 경로속으로 유도하기 위해, 분비 신호 서열(또한 리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로서 알려짐)이 재조합 벡터 내에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 올바른 판독 플레임 내의 효소를 코딩하는 DNA 서열로 연결된다. 분비 신호 서열은 보통 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 5'에 위치된다. 분비 신호 서열은 정상적으로 효소와 관련된 것 일 수 있고 또는 다른 분비 단백질을 코딩하는 유전자로부터 올 수 있다.

본 효소, 프로모터 및 선택적으로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열, 각각에 대하여 코딩하는 DNA 서열을 리게이션거나, 적당한 PCR 증폭 계획에 의해 이들 서열을 모으고, 복제 또는 통합에 필요한 정보를 함유하는 적당한 벡터 속으로 그들을 삽입하는데 사용되는 과정은 당업계 숙련자에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al., 상기 인용 문헌 참조)

숙주 세포

숙주 세포 속으로 도입된 본 효소를 코딩하는 DNA 서열은 문제의 숙주에 상동 또는 비상동일 수 있다. 만약 숙주세포에 상동이면, 즉 숙주 세포에 의하여 천연적으로 생산되면, 그것은 일반적으로 그것의 천연적 환경보다는 다른 프로모터 서열이나 만약 적용가능하다면 다른 분비 신호 서열 및/또는 터미테이터 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 용어 "상동성"은 문제의 숙주 생체에 본래의 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것이 의도된다. 용어 "비상동"은 천연적으로 숙주 세포에 의해 발현되지 않은 DNA 서열을 포함하는 것이 의도된다. 따라서, DNA 서열은 다른 생체 유래일 수 있고, 또는 그것은 합성 서열일 수 있다.

본 발명의 DNA 구조 또는 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는 본 효소를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있고 세균, 효모, 균류 및 식물을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다.

배양에서, 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 미생물 숙주 세포의 예는, 균주 B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium 또는 B. thuringiensis와 같은 Bacillus, 또는 S. lividans 또는 S. murinus와 같은 균주 Streptomyces, 또는 Escherichia coli와 같은 그램-음성 세균이다.

세균의 형질전환은 원형질체 형질전환, 전기 천공법, 접합에 의해, 또는 원래 알려진 방식으로 반응능 세포를 사용하여 수행할 수 있다(참고, Sambrook et al., 상기 문헌).

E. coli와 같은 세균 속에서 효소를 발현시킬 때, 효소는 전형적으로 불용성 과립으로서(봉입체로 알려짐) 세포질 내에 보유되거나, 세균 분비 서열에 의해 원형질막주위 공간으로 유도될 수 있다. 전자의 경우에, 세포는 용해되어 과립이 회수되고 변성된 다음 효소는 변성제의 희석에 의하여 리폴딩된다. 후자의 경우, 효소는 예를 들어 초음파 처리 또는 삼투압 쇽에 의해 세포를 파괴하여 원형질막주위 공간의 함유물을 방출하고 효소를 회수하여 원형질막주위 공간으로부터 회수될 수 있다.

Bacillus 또는 Streptomyces 균주와 같은 그램-양성 세균 내에서 효소를 발현시킬 때, 효소는 세포질 내에 보유될 수 있거나, 세균의 분비 서열에 의해 세포외 배지로 유도될 수 있다. 후자의 경우에, 효소는 아래 기술되는 바와 같이 배지로부터 회수될 수 있다.

서브틸라제 변이체를 생산하는 방법

본 발명은 본 발명에 따르는 분리된 효소를 생산하는 방법을 제공하는데, 역서 효소를 코딩하는 DNA 서열을 이용하여 형질전환된 적합한 숙주 세포는 효소의 생성을 가능케하는 조건하에서 배양되고 결과의 효소는 상기 배양액으로부터 회수된다.

효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터가 비상동 숙주 세포 속으로 형질전환될 때, 본 발명의 효소의 비상동 재조합체 생산을 가능케 할 수 있다. 이로써 상동성 불순물이 부존재하는 것을 특징으로 하는 고도로 정제된 서브틸라제를 제작할 수 있다.

형질전환된 숙주 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 임의의 전통적 배지일 수 있다. 발현된 서브틸라제는 배양 배지 속으로 편리하게 분비되며, 원심분리 또는 여과에 의해 배지에서 세포를 분리하고, 황산 암모늄과 같은 염에 의하여 배지의 단백질 성분을 침전시키는 것을 포함하는 주지의 과정에 이어서, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 과정에 의해 그것으로부터 회수될 수 있다.

클리닝 및 세제 조성물

본 발명의 효소는 첨가되어서 세제 조성물의 성분이 될 수 있다. 일반적으로, 클리닝 및 세제 조성물은 당업계에서 잘 설명되고 적합한 클리닝 및 세제 조성물의 추가적 설명에 대하여 WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011를 참고하시오.

본 발명의 세제 조성물은 예를 들어 오염된 섬유의 전처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 섬유 유연제 조성물 첨가된 헹굼제를 포함하여 손 또는 기계 세탁 세제 조성물로서 제형될 수 있거나, 일반적으로 가정용의 경표면 클리닝 작업용 세제 조성물로서 제형될 수 있고, 또는 손 또는 기계 식기세척 작업용으로 제형될 수 있다. 구체적 양태에서, 본 발명은 본 발명의 효소를 포함하는 세제 첨가제를 제공한다. 세제 첨가제 및 세제 조성물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 예를 들어, 락카제, 및/또는 퍼옥시다제와 같은 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다.

일반적으로 선택된 효소의 특성은 선택된 세제와 양립가능해야 하고,(즉 pH-최적, 기타 효소 및 비효소 성분과 양립가능성 등), 효소는 유효량으로 존재해야만 한다.

프로테아제: 적합한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것을 포함한다. 미생물 기원이 바람직하다. 화학적으로 변형된 또는 단백질 조작된 변이가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 금속 프로테아제, 바람직하게는 알카리 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제일 수 있다. 알카리 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 예를 들어, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Calsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168과 같은 Bacillus로부터 유도된 서브틸리신이다(WO 89/06279에 개시됨). 트립신 유사 프로테아제의 예는 트립신(예를 들어, 돼지나 소 기원) 및 WO 89/06270 및 WO 94/25583에 기재된 Fusarium 프로테아제이다.

유용한 프로테아제의 예는 WO 98/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946에 기재된 변이체, 특히 다음 위치 중 하나 이상에서 치환을 갖는 변이체이다: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 및 274.

상업적으로 이용가능한 프로테아제 효소는 바람직하게는 Durazym^®, Relase^®, Alcalase^®, Savinase^®, Primase^?, Duralase^®, Esperase^®, Ovozyme^® 및 Kannase^®(Novozymes A/S), Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Properase^TM, Purafect^TM, Purafect OxP^TM, FN2^TM, FN3^TM 및 FN4^TM(Genencor International, Inc.)를 포함한다.

리파제: 적합한 리파제는 세균 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 변이체가 포함된다. 유용한 리파제의 예는 EP 258 068 및 EP 305 216에 기재되는 바와 같이 예를 들어, H. lanuginosa (T. lanuginosus)기원 또는 WO 96/13580에 기재되는 바와 같이 H. insolens기원의 Humicola(이명 Thermomyces)기원의 리파제, 예를 들어, P. alcaligenes 또는 P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. 균주 SD 705 (WO 95/06720 및 WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012)기원의 Pseudomonas 리파제, 예를 들어, B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131,253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) 또는 B. pumilus (WO 91/16422)기원의 Bacillus 리파제를 포함한다.

다른 예는 WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 및 WO 97/07202에 기재되는 바와 같이 리파제 변이체이다.

바람직한 상업적으로 이용가능한 리파제 효소는 Lipex^®, Lipolase^® 및 Lipolase Ultra^®(Novozymes A/S)를 포함한다.

아밀라아제: 적합한 아밀라아제(α 및/또는 β)는 세균 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 변이체가 포함된다. 아밀라아제는 예를 들어, GB 1,296,839에 더 상세하게 기재되는 B. licheniformis의 특별한 균주와 같은 Bacillus로부터 얻은 α-아밀라아제를 포함한다.

유용한 아밀라아제의 예는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, 및 WO 97/43424에 기재된 변이체, 특히 다음 위치 중 하나 이상에서 치환을 갖는 변이체이다: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, 및 444.

상업적으로 이용가능한 아밀라아제는 Duramyl^®, Termamyl^®, Fungamyl^® 및 BAN^® (NovozymesA/S), Rapidase^TM 및 Purastar^TM(Genencor International, Inc.)이다.

셀룰라제: 적합한 셀룰라제는 세균 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라제는 genera Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium기원의 셀룰라제, 예를 들어 US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259에 개시된 Humicola insolens, Myceliophthora thermophila 및 Fusarium oxysporum으로부터 생산된 균류 셀룰라아제를 포함한다.

특히 적합한 셀룰라아제는 색상 보호 있점을 갖는 알카리 또는 중성 셀룰라제이다. 이러한 셀룰라제의 예는 EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940에 기재된 셀룰라제이다. 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299에 기재된 바와 같이 셀룰라제 변이체이다.

상업적으로 이용가능한 셀룰라제는 Celluzyme^®, 및 Carezyme^®(Novozymes A/S), Clazinase^TM, 및 Puradax HA^TM (Genencor International, Inc.), 및 KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)을 포함한다.

퍼옥시다제/옥시다제: 적합한 퍼옥시다제/옥시다제는 식물, 세균 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다제의 예는 예를 들어, C. cinereus와 같은 Coprinus기원의 퍼옥시다제, 및 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257에 기재된 바와 같은 그것의 변이체를 포함한다. 상업적으로 이용가능한 퍼옥시다제는 Guardzyme^®(Novozymes A/S)를 포함한다.

세제 효소는 하나 이상의 효소를 함유하는 개별 첨가제를 첨가함으로써, 또는 이들 모든 효소를 포함하는 연합 첨가제를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가물, 즉 상이한 첨가제 또는 연합 첨가제는 예를 들어, 과립, 액체, 슬러리 등으로서 제조될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 조성물은 과립, 특히 무분진 과립, 액체, 특히 안정화 액체, 또는 슬러리이다.

무분진 과립은 예를 들어, US 4,106,991 및 4,661,452에 개시되는 바와 같이 생산할 수 있고 선택적으로 당업계 공지된 방법에 의해 코팅할 수 있다. 왁스상 코팅 물질의 예는 1000 내지 20000의 평균 몰중량을 갖는 폴리(에틸렌 옥사이드) 산물(폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 에틸렌 옥사이드 유닛을 갖는 에톡실화 노닐페놀; 알콜이 12 내지 20 탄소 원자를 함유하고 15 내지 80 에틸렌 옥사이드 유닛을 갖는 에톡실화 지방 알콜; 지방 알콜; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기법에 의한 적용에 적합한 필름-형성 코팅 물질의 예는 GB 1483591에 나타낸다. 액체 효소 제조는 예를 들어, 확립된 방법에 따라서 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알콜, 젖산 또는 붕산과 같은 폴리올을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216에 개시된 방법에 따라서 제조될 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는 수성, 전형적으로 최대 70%의 물 및 0-30% 유기 용매, 또는 비-수성일 수 있다.

세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있는데, 이것은 반-극성 및/또는 음이온 및/또는 양이온 및/또는 쌍성이온일 수 있다. 계면활성제는 전형적으로 중량으로 0.1% 내지 60% 수준으로 존재한다.

거기에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 예를 들어 선형 알킬벤젠술포네이트, 알파-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트(지방 알콜 술페이트), 알콜 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트, 알파-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산 또는 비누와 같은 약 1% 내지 약 40%의 음이온 계면활성제를 함유할 것이다.

거기에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 예를 들어 알콜 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥사이드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실 N-알킬 유도체("글루카미드")와 같은 약 0.2% 내지 약 40%의 비-이온 계면활성제를 함유할 것이다.

세제는 예를 들어, 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 알킬- 또는 알케닐-숙신산, 가용성 규산염 또는 층상 규산염(예를 들어, Hoechst의 SKS-6)와 같은 0-65%의 세제 강화제 또는 착화제를 함유할 수 있다.

세제는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 예는 카르복시메틸-셀룰로스, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐-피리딘-N-옥사이드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리-아크릴레이트와 같은 폴리카르복실레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체이다.

세제는 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트와 같은 과산-형성 표백 활성제와 결합될 수 있는 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H₂O₂ 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 선택적으로, 표백 시스템은 예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰형과 같은 과산을 포함할 수 있다.

세제는 또한 예를 들어, 클레이, 거품 부스터, 비누거품 억제제, 항-부식제, 오물-현탁제, 항-오물 재부착제, 염료, 살균제, 광학 광택제, 친수제, 변색 억제제, 또는 향수를 포함하는 섬유 컨디셔너와 같은 기타 종래의 세제 성분을 포함할 수 있다.

예를 들어, 물 경도 및 물 온도와 같은 국소 및 국부적 조건의 변화는 국부적 세제 조성물을 요한다. 세제 실시예 1 및 2는 각각 전형적인 라틴 아메리카 세제 및 전형적인 유럽 분말 세제의 조성물에 대하여 배치한다.

세제 실시예 1. 전형적인 라틴 아메리카 세제 조성물.

그룹 하위명칭 함량

계면활성제 0-30%
술포네이트 0-30%
술페이트 0-5%
비누 0-5%
비-이온 0-5%
양이온 0-5%
FAGA 0-5%

표백제 0-20%
SPT/SPM 0-15%
NOBS, TAED 0-5%

강화제 0-60%
포스페이트 0-30%
제올라이트 0-5%
Na₂OSiO₂ 0-10%
Na₂CO₃ 0-20%

충전제 0-40%
Na₂SO₄ 0-40%

기타 최대 100%까지
폴리머
효소
거품 조절제
물
친수제
기타

세제 실시예 2. 전형적인 유럽 분말 세제 조성물.

그룹 하위명칭 함량

계면활성제 0-30%
술포네이트 0-20%
술페이트 0-15%
비누 0-10%
비-이온 0-10%
양이온 0-10%
기타 0-10%

표백제 0-30%
SPT/SPM 0-30%
NOBS+ TAED 0-30%

강화제 0-60%
포스페이트 0-40%
제올라이트 0-40%
Na₂OSiO₂ 0-20%
Na₂CO₃ 0-20%

충전제 0-40%
Na₂SO₄ 0-40%
NaCl 0-40%

기타 최대 100%까지
폴리머
효소
거품 조절제
물
친수제
기타

본 발명의 세제 조성물의 효소는 전통적인 안정화제를 사용하여 안정화 될 수 있는데, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤과 같은 폴리올, 당 또는 당 알콜, 젖산, 붕산, 또는 붕산 유도체, 예를 들어, 방향족 붕산염 에스테르, 또는 4-포르밀페닐 보론산과 같은 페닐 보론산 유도체이고, 상기 조성물은 예로써 WO 92/19709 및 WO 92/19708에 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다.

세제 조성물에 있어서 임의의 단일 효소, 특히 본 발명의 효소는 세척액 1 리터 당 0.01-200 mg의 효소 단백질, 바람직하게는 세척액 1 리터 당 0.05-50 mg의 효소 단백질, 특히 세척액 1 리터 당 0.1-10 mg의 효소 단백질에 상응하는 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 효소는 참고로서 본원에 인용되는 WO 97/07020에 개시되는 세제 조성물에 추가적으로 혼합될 수 있다.

재료 및 방법

직물:

표준 직물 조각은 EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Switzerland로부터 얻는다. 특히 타입 EMPA116(혈액, 우유 및 잉크로 오염된 면직물) 및 EMPA117(혈액, 우유 및 잉크로 오염된 폴리에스테르/면직물).

균주 및 플라스미드

Bacillus lentus 균주 309를 NCIB에 기탁하고 승인 번호 NCIB 10309를 부여받고, 본원에 참고로서 인용된 미국 특허 제 3,723,250에 개시한다. 모서브틸라제 309 또는 Savinase®는 균주 309로부터 얻을 수 있다. 발현 숙주 미생물은 Bacillus subtilis이다.

플라스미드 pSX222는 E. coli-B. subtilis 셔틀 벡터 및 B. subtilis 발현 벡터로서 사용된다(WO 96/34946에 설명되는 바와 같음).

일반 분자생물학 방법

달리 언급하지 않는다면 DNA 조작 및 형질전환은 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 수행된다(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harborlab., Cold Spring Harbor, N Y ; A usubel, F. M. et a1.(eds.) "Current protocols in Molecular Biology". JohnWiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.)"Molecular Biological Methods for Bacillus". JohnWiley and Sons, 1990).

DNA 조작을 위한 효소

달리 언급하지 않는다면 DNA 조작을 위한 모든 효소, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제, 리가아제 등은 New England Biolabs, Inc.로부터 얻는다. DNA 조작을 위한 효소는 공급자의 설명서에 따라서 사용된다.

발효:

서브틸라제 효소의 생산을 위한 발효는 2-3일 간 15 ml 더블 TY 배지를 함유하는 50 ml 튜브 내에서 회전 진탕 테이블(225 rpm.) 상에서 pH 7.3 및 37℃로 수행하였다.

TY 배지의 설명을 위해, Media Preparation and Bacteriological Tools in "Current protocols in Molecular Biology". JohnWiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.), 페이지 1.1.3을 참조하시오.

정제

숙주 세포로부터 분비된 서브틸라제 변이체는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하고, 황산 암모늄과 같은 염을 사용하여 배지의 단백질 성분을 침전시키는 주지된 과정에 이어서, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피의 사용에 의해 배양 배지로부터 편리하게 회복될 수 있다.

세척 성능 테스트

세제 조성물 내 선택된 서브틸라제의 세척 성능을 평가하기 위해, 세척 실험이 수행된다. 본 출원의 효소 변이체를 자동 기계적 압력 분석(AMSA)을 사용하여 실험한다. AMSA 테스트를 이용하여 소량 효소-세제 용액의 다량의 세척 성능을 조사할 수 있다. AMSA 플레이트는 테스트 용액을 위한 다수의 구멍을 가지며 모든 구멍 통로에 대하여 세척되는 직물 조각을 확고히 압착하는 덮개를 가진다. 세척 시간 동안, 플레이트, 테스트 용액, 직물 및 덮개는 활발히 진동하여 테스트 용액이 직물과 접촉하도록 옮기고 기계적 압력을 가한다. 추가적 설명을 위해 WO 02/42740 특히, 페이지 23-24의 "특별한 방법 구체예"단락을 참조하시오.

세제

본 발명의 서브틸라제 효소의 세척 성능 테스트를 위한 세제는 시장에서 완전히 제조된 상업상의 세제를 구입함으로써 얻을 수 있으며 그 후에 열 처리(수성 용액에서 85℃로 5분)에 의해 효소 성분을 비활성화한다. 또한 효소가 없는 상업상의 세제 기재는 제조업자로부터 직접 구매가능하다. 또한 적합한 모델 세제는 본원에서 페이지 19-24의 규정에 따라 제조되고 세척 성능 테스트에 사용될 수 있다.

실시예 1

효소 변이체의 제조 및 발현:

부위-특이적 돌연변이유발:

특정 삽입/결실/치환을 포함하는 본 발명의 서브틸리신 309 (Savinase^®) 부위-특이적 변이체는 원하는 돌연변이를 함유하는 올리고를 이용한 PCR에 의해 생산된 DNA 단편(Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989)의 전통적인 클로닝에 의해 제조한다.

주형 플라스미드 DNA는 pSX222, 또는 서브틸리신 309의 변이체를 함유하는 이것의 유사체일 수 있다. 돌연변이는 변이체의 구조에 올리고 유도된 돌연변이유발에 의해 도입된다.

서브틸리신 309 변이체를 E. coli 내로 형질전환시킨다. 이 형질전환체의 하룻밤 배양으로부터 정제된 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 분해, DNA 단편의 정제, 리게이션, B. subtilis의 형질전환에 의해 B. subtilis 내로 형질전환된다. B. subtilis의 형질전환은 Dubnau et al.,1971,J.Mol.Biol.56, pp.209-221에 의해 설명되는 바와 같이 수행된다.

특정 구역에서 돌연변이를 도입하기 위한 부위-특이적 돌연변이유발:

부위-특이적 변이유발을 수행하기 위해 사용되는 총체적인 전략은 다음과 같다:

변이유발 프라이머(올리고뉴클레오티드)는 돌연변이 부위의 양측에 접하는 DNA 서열에 대응하여 합성되고, 삽입/결실/치환을 한정하는 DNA 염기쌍에 의해 분리된다.

후속하여, 결과의 변이유발 프라이머를 변형된 플라스미드 pSX222를 이용한 PCR 반응에 사용한다. 결과의 PCR 조각을 정제하고 2차 PCR 반응으로 확장하고, 엔도뉴클레아제에 의해 소화시키고 E. coli-B.subtilis 셔틀 벡터 pSX222 내로 클로닝하기 전에 결과의 PCR 산물을 정제하고 3차 PCR 반응으로 확장한다. PCR 반응은 표준 조건하에서 수행한다. 플라스미드 DNA를 주지의 기술에 의해 E. coli 내로 형질전환하고 하나의 E. coli 콜로니를 서열화하여 계획된 돌연변이를 확인한다.

본원의 페이지 2의 표 I에 열거된 각각의 변이체는 상기 설명되는 바와 같이 제조할 수 있다. 본 발명의 서브틸라제 변이체를 정제하기 위해, 본 발명의 변이체를 포함하는 pSX222 발현 플라스미드를 반응능 B.서브틸리신 균주내로 형질전환하였고 상기 설명되는 바와 같이 발효하였다.

실시예 2

효소 농도의 정제 및 평가

발효 후 서브틸리신 변이체의 정제를 수소성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 및 후속적 진공 여과를 이용하여 완성한다. 효소를 포획하기 위해, HCIC는 4-메르캅토-에틸-피리딘(4-MEP)가 결합된 셀룰로스 매트릭스를 사용한다.

80-100 ㎛ 크기의 셀룰로스 매트릭스의 비즈(beads)를 효모추출물 및 서브틸리신 변이체를 분비할 수 있는 형질전환된 B. subtilis를 함유하는 배지와 혼합하고 Unifilter^® 마이크로플레이트 내에서 pH 9.5로 배양하였다.

4-MEP는 pH>7에서 소수성이고 서브틸리신 변이체는 pH 9.5에서 소수성이므로 소수성 결합이 비즈 상에서 분비된 효소 및 4-MEP사이에 형성된다. 배양 후 배지 및 세포 찌꺼기를 비즈 및 효소를 필터 상에 유지시키는 동안 진공 여과에 의해 제거한다.

비즈로부터 효소를 용리하기 위해 pH는 용리 완충액(pH 5)을 이용하여 필터를 세척한 다음에 낮춰진다. 이로써 효소를 비즈로부터 분리하고 완충액으로부터 회수할 수 있다.

정제된 서브틸리신 효소 변이체의 농도를 활성 부위 적정(AST)에 의해 평가하였다.

정제된 효소를 개별 농도에서 고 친화성 저해자 C1-2A와 함께 배양하여 활성 부위의 변화량을 저해한다. 프로테아제 및 저해자는 1:1 비율로 서로 결합하고 따라서 효소 농도는 저해자의 농도에 직접 연관될 수 있는데, 이 때 모든 프로테아제는 활성이다. 잔여 프로테아제 활성을 측정하기 위해, 기질(Tris/HCl 완충액 중 0.6 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)을 저해자와 배양 후 첨가하고 이후 4 분 동안 분해 산물 pNA(파라니트로페놀)의 전개를 Elisa 판독기 상에서 405 nm로 주기적으로 측정한다.

본원의 페이지 2의 표 I에 열거된 본 발명의 각각의 변이체를 상기 과정에 따라 정제하고 후속하여 효소 농도를 측정하였다.

표 I의 변이체의 알려진 농도를 하기 설명된 바와 같이 세제 내에서 세척 성능에 대하여 테스트하였다.

실시예 3

사비나제 변이체의 세척 성능

상업상의 세제 기재 조성물 내 선택된 서브틸라제 변이체의 세척 성능을 평가하기 위해, 세척 실험을 수행하였다. 본 출원의 효소 변이체를 자동 기계적 압력 분석(AMSA)을 사용하여 테스트하였다. AMSA 테스트를 이용하여 소량 효소-세제 용액의 다량의 세척 성능을 조사할 수 있다. AMSA 플레이트는 테스트 용액을 위한 다수의 구멍 및 모든 구멍 통로에 대하여 세척되는 직물 조각을 확실하게 압착하는 뚜껑을 가진다. 세척 시간 동안, 플레이트, 테스트 용액, 직물 및 덮개는 활발히 진동하여 테스트 용액이 직물과 접촉하도록 옮기고 기계적 압력을 가한다. 추가적 설명을 위해 WO 02/42740 특히 페이지 23-24의 "특별한 방법 구체예" 단락을 참조하시오.

두가지 분석을 하기 특이적 실험 조건 하에서 수행하였다.

분석 A

상업상의 세제 기재	라틴 아메리카형
세제 투여량	1.5-2.5 g/l
테스트 용액량	160 마이크로리터
pH	NaHCO₃로 조절된 10-10.5
세척 시간	14분
온도	20℃
물 경도	6-9°dH
테스트 용액 중 효소 농도	5 nM, 10 nM 및 30 nM
테스트 물질	EMPA 117

라틴 아메리카형 세제를 본원의 페이지 24의 세제 실시예 1의 조건에 따라 제조하였다. 물 경도를 테스트 시스템에 대하여 CaCl₂ 및 MgCl₂(Ca²⁺:Mg²⁺=4:1)의 첨가에 의해 6-9°dH로 조정하였다. 세척 후 직물 조각에 수돗물로 씻고 자연 건조하였다.

분석 B

상업상의 세제 기재	유럽 분말형 1
세제 투여량	6 g/l
테스트 용액량	160 마이크로리터
pH	세제 내와 동일(약 10-10.5)
세척 시간	20분
온도	30℃
물 경도	6-9°dH
테스트 용액 중 효소 농도	5 nM, 10 nM 및 30 nM
테스트 물질	EMPA 116

유럽식 분말형 세제를 본원의 페이지 24의 세제 실시예 2의 조건에 따라 제조하였다. 물 경도를 테스트 시스템에 대하여 CaCl₂*2H₂O; MgCl₂*6H₂O; NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO^3- = 4:1:10)의 첨가에 의해 15°dH로 조정하였다. 세척 후 직물 조각을 수돗물로 씻고 자연 건조하였다.

효소 변이체의 수행은 그러한 특이적 효소 변이체로 세척된 직물 샘플의 색조의 밝기로써 측정된다. 밝기는 또한 흰색 빛으로 비출 경우 직물 샘플로부터 반사된 빛의 강도로서 표현될 수 있다. 직물이 오염될 때 반사된 빛의 강도는 깨끗한 직물의 강도 보다 낮다. 따라서, 반사된 빛의 강도는 효소 변이체의 세척 성능을 측정하는데 사용될 수 있다.

색 측정은 전문 평상형 스캐너(PFU DL2400프로)를 이용하여 이루어지는데, 이것은 세척된 직물 샘플의 이미지를 포획하는데 사용된다. 스캔은 200 dpi의 해상도 및 24 비트의 출력값 색조 부(dept)로 이루어진다. 정확한 결과를 얻기 위해, 스캐너를 코닥 리플렉티브 IT8 타겟으로 자주 보정한다.

스캔된 이미지로부터 빛 강도에 대한 값을 얻기 위해, 특별 고안된 소프트웨어 응용이 사용된다(노보자임스 컬러 벡터 애널라이저). 프로그램은 이미지로부터 24 비트 픽셀 값을 회수하고 그들을 적색, 녹색 및 청색에 대한 값으로 전환한다. 강도 값(Int)을 벡터로서 RGB 값을 함께 추가하여 계산하고 그 후 결과의 벡터의 길이를 취한다:

변이체의 세척 성능(P)을 하기 식에 따라 계산하였다:

P = Int(v) - Int(r)

상기식에서

Int(v)는 효소 변이체로 세척된 직물 표면의 빛 강도 값이고

Int(r)은 대조군 효소 서브틸리신 309(BLSAVI)로 세척된 직물 표면의 빛 강도 값이다.

하기 표 IV 및 V에 나타낸 결과는 다음으로서 테스트된 효소 변이체의 수행능(P)을 합계한 수행 점수(S)이다:

S(2)는 변이체가 모든 3개의 농도(5, 10 및 30 nM)에서 참고보다 더 잘 수행함을 나타내고

S(1)은 변이체가 1 또는 2개의 농도의 대조군보다 더 잘 수행함을 나타낸다.

분석법 C

상업적 세제 기재	유럽식 분말형 2
세제 투여량	4 g/l
테스트 용액량	160 마이크로리터
pH	세제 내와 동일(약 10-10.5)
세척 시간	20분
온도	30℃
물 경도	6-9°dH
테스트 용액 중 효소 농도	5 nM, 10 nM 및 30 nM
테스트 물질	EMPA 116

유럽식 분말형 세제를 본원의 페이지 24의 세제 실시예 내 조건에 따라 제조하였다. 물 경도를 테스트 시스템에 대하여 CaCl₂*2H₂O; MgCl₂*6H₂O; NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO^3- = 4:1:10)의 첨가에 의해 15°dH로 조정하였다. 세척 후 직물 조각을 수돗물로 씻고 자연 건조시켰다.

분석법 D

상업적 세제 기재	유럽식 분말형 1
세제 투여량	6 g/l
테스트 용액량	160 마이크로리터
pH	세제 내와 동일(약 10-10.5)
세척 시간	20분
온도	30℃
물 경도	6-9°dH
테스트 용액 중 효소 농도	5 nM, 10 nM 및 30 nM
테스트 물질	Center for Testmaterials, Vlaardingen,NL로부터 C-10 천 견본

유럽식 분말형 세제를 본원의 페이지 24의 세제 실시예 2의 조건에 따라서 제조하였다. 물 경도를 테스트 시스템에 대하여 CaCl₂*2H₂O; MgCl₂*6H₂O; NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO^3- = 4:1:10)의 첨가에 의해 15°dH로 조정하였다. 세척 후 직물 조각을 수돗물을 쏟아 씻고 자연 건조시켰다.

<110> Novozymes A/S <120> Subtilase variants <150> PA 2002 01705 <151> 2002-11-06 <150> PA 2002 01933 <151> 2002-12-18 <150> 60/507,537 <151> 2003-10-01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens(subtilisin BPN') <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> B. lentus(subtilisin 309) <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265

Claims

X68A,S,L,I의 조합을 포함하고,

다음 변형 중 하나 이상을 가지며,

S9G,D,R,K,L,V; A15M,T; H120N,D,Q,K,E,Y,S; Q245R,K,E,D,T,F,N,V,W,G,I,S,C,L,A,M

각각의 위치가 SEQ ID NO:1의 서브틸리신 BPN'의 아미노산 서열의 위치와 상응하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.

제 1 항에 있어서, 다음 변이 중 하나 이상 포함하며,

S9R+A15T+V68A+Q245R V68A+H120K+Q137E S9R+A15T+V68A+Q137D V68A+G118D+Q245R V68A+S106A+G118D+Q245R S9R+A15T+V68A+N218D+Q245R S9R+A15T+V68A+S99G+Q245R+N261D S9R+A15T+V68A+H120N+N218D+Q245R S9R+A15T+V68A+A174V+Q245R S9R+A15T+V68A+A98L+Q245R S9R+A15T+G46D+V68A+N218D+Q245R S9R+A15T+V68A+A98G+S99V+Q245R S9R+A15T+V68A+A98M+S99G+Q245R+ T274A S9R+A15T+V68A+A98M+Q245R+N248D S9R+A15T+V68A+A98L+S99G+Q245R S9R+A15T+G61E+V68A+A98S+S99G+ Q245R S9R+A15T+V68A+H120D+P131S+Q137H+ Q245R S9R+A15T+V68A+A98G+S99I+K237R+ Q245R S9R+A15T+V68A S9R+A15T+V68A+H120N+P131S+Q137H+ Q245R S9R+A15T+G20*+L21F+*61aA+V68A+ Q245R V68A+S106A+Q245W V68A+S106A+Q245R+N252D V68A+S106A+Q245W+N252K V68A+S106A+A174V+Q245R+N252D S9R+A15T+V68A+Q245R+N252S S9R+A15T+V28I+V68A+Q245R+ N252A S9R+A15T+V68A+A194T+Q245R+N252E S9R+A15T+G20*+L21F+*61aS+V68A+ G160D+Q245R S9R+A15T+V68A+H120N+P131S+Q137H+ Q245M

상기 표시 *는 결실을 의미하고,

이 때

(a) 변이체는 프로테아제 활성을 갖고,

(b) 각각의 위치가 SEQ ID NO:1의 서브틸리신 BPN'의 아미노산 서열의 위치와 상응하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.

제 1 항에 있어서, 모 서브틸라제는 서브그룹 I-S1에 속하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
제 1 항에 있어서, 모 서브틸라제는 서브그룹 I-S2에 속하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
제 4 항에 있어서, 모 서브틸라제는 BLSAVI(Savinase^®)인 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
제 1 항의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열.
제 6 항의 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 7 항의 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 미생물 숙주 세포.
제 8 항에 있어서, 박테리아인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 박테리아는 바실러스(Bacillus)인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 바실러스(Bacillus)는 바실러스 렌투스(B. lentus)인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 8 항에 있어서, 균류 또는 효모인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 12 항에 있어서, 균류는 사상 균류인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 13 항에 있어서, 사상 균류는 아스퍼길러스(Aspergillus)인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 변이체를 생산하는 방법으로서, 제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하고, 서브틸라제 변이체를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 변이체를 포함하는 클리닝 또는 세제 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 세탁 또는 식기 세척 조성물인 것을 특징으로 하는 클리닝 또는 세제 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 셀룰라제, 리파제, 아밀라제, 큐티나제, 프로테아제, 헤미셀룰라제, 에스테라제, 락타제, 글리코아밀라제, 폴리갈락투로나제, 베타-갈락토시다제, 리그니나제 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 클리닝 또는 세제 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 변이체는 다음 변형 중 하나 이상을 더 포함하고, 하기 표시 *는 결실을 의미하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체:

K27R, *36D, S56P, N62D, N76D, S87N, G97N, S99SE, S101G, V104A, V104I, V104N, V104Y, S106A, H120D, H120N, N123S, G159D, Y167A, R170S, R170L, A194P, N204D, V205I, Q206E, L217D, N218S, N218D, M222S, M222A, T224S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N248D, N252K, T274A, S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A.