CN107267489A - 枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多种蛋白酶变体以及用于获得蛋白酶变体的多种方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸
本发明是基于申请日为2012年12月18日，申请号为“201280063467.X”(国际申请号为PCT/EP2012/076028)，发明名称为“枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸”的专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请含有一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及相对于亲本枯草杆菌酶在一种或多种特性中展示变化的多种新蛋白酶变体，所述特性包括：洗涤性能、热稳定性、存储稳定性或催化活性。本发明的这些变体适合用于例如清洁剂或洗涤剂组合物中，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。此外，本发明涉及含有本发明变体的清洁剂和洗涤剂组合物。
相关技术说明
在洗涤剂工业中，酶在洗涤配制品中的应用已经超过30年。用于此类配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。
越来越多商业上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，和(诺维信公司(Novozymes A/S))、 以及(杜邦/杰能科国际公司(DuPont/Genencor International,Inc.))。
此外，本领域描述了多种变体，如在WO 2004/041979(诺维信公司)中描述了相对于亲本枯草杆菌酶在例如洗涤性能、热稳定性、存储稳定性或催化活性方面展示变化的多种枯草杆菌酶变体。这些变体适合用于在例如清洁剂或洗涤剂组合物中使用。
已描述多种有用的枯草杆菌酶变体，其中很多已提供在不同洗涤剂中的改进活性、稳定性以及溶解度。US 6,436,690(布罗德三世(Brode III)等人)描述了在环59至66(BPN’编号)中的变化，在WO 2009/149200(丹尼斯克公司(Danisco US INC.))中描述了在位置53和55(BPN’编号)处的取代。此外，WO 2002/31133(诺维信公司)描述了环51-56(BPN’编号)中的插入。然而，多种因素造成进一步改进蛋白酶是有利的。洗涤条件例如就温度和pH而言不断发生变化，并且很多污物仍难以在常规洗涤条件下被完全除去。因此，尽管在蛋白酶开发方面已有深入研究，但仍然存在对新的改进蛋白酶的需要。
因此，本发明的一个目的在于提供一种蛋白酶的与其亲本蛋白酶相比具有改进特性的多种变体。
发明概述
本发明涉及在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置上包含一个变化的多种蛋白酶变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且其中这些变体具有与SEQ ID NO:2至少65％一致的氨基酸序列。
本发明还涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中该变体具有与SEQ ID NO:2至少65％一致的氨基酸序列；以及回收该变体。本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
定义
蛋白酶：术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC 3.4酶组的酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号是指来自加利福尼亚州(California)，圣地哥(San Diego)，学术出版社(Academic Press)的NC-IUBMB的酶命名法1992，包括分别在欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1994,223,1-5；欧洲生物化学杂志1995,232,1-6；欧洲生物化学杂志1996,237,1-5；欧洲生物化学杂志1997,250,1-6；以及欧洲生物化学杂志1999,264,610-650中公开的补充文献1至5。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质分解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要活性类型是：其中在P1的Arg或Lys之后存在酰胺底物裂解的胰蛋白酶样活性、其中在P1的多个疏水氨基酸中的一个之后发生裂解的糜蛋白酶样活性、以及其中在P1的Ala之后裂解的弹性蛋白酶样活性。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(Materials and Methods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指基因的占据相同染色体基因座的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然地发生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自原核或真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子反转录来制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过包括剪接的一系列步骤加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的所有部件。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。为了引入特异性限制位点以便促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接，控制序列可以带有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸的线性或环形DNA分子。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹法(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在65℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体有关的特征，该特征相比于亲本、或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶、或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的蛋白酶有所改进。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在存储条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。
改进的洗涤性能：术语“改进的洗涤性能”在此被定义为一种蛋白酶变体例如通过增强的去污能力(这是特别优选的)而相对于亲本枯草杆菌酶变体、相对于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶、或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的蛋白酶的洗涤性能展示蛋白酶变体的洗涤性能的变化。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以被量化，如在此的“洗涤性能”定义下所描述的。
改进的蛋白酶活性：术语“改进的蛋白酶活性”在此被定义为通过增加的蛋白质转化而相对于(相比于)亲本枯草杆菌酶、或相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶、或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的蛋白酶的活性展示活性改变的蛋白酶变体的改变的蛋白酶活性(如上文所定义的)。
改进的热活性：术语“改进的热活性”意指一种变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。在特定温度范围内一种变体是稳定的并且保留其活性，但是随着温度增加而变得不太稳定并且因此活性有所降低。此外，由一种变体催化的初始反应速率可以通过增加温度来加速，这通过确定该变体的热活性来测量。一种具有较大热活性的变体将引起一种酶组合物在增强底物水解速率方面的增加，从而减少所需要的时间和/或降低活性所需要的酶浓度。可替代地，具有减小的热活性的一种变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。
分离的变体：术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面，如通过SDS-PAGE确定的，该变体是至少1％纯的、例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳法确定的，该分离的多核苷酸是至少1％纯的、例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的。多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成、合成来源或其任何组合。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在50℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，该成熟多肽与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列对应。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是基于预测编码信号肽的SEQ ID NO:1的核苷酸1至90的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)的SEQ ID NO:1的核苷酸322至1146。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在55℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在60℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构造，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，这样使得控制序列指导编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种蛋白酶。因此，亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的一种蛋白酶。应理解，在上下文中，表述“具有一致氨基酸序列”与100％序列一致性有关。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。在一个具体实施例中，该亲本是与具有SEQID NO:2的多肽具有至少60％的一致性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白质。
序列一致性：通过参数“序列一致性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开发软件套(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet)16:276-277)(优选版本3.0.0或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中实施的尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度。可任选使用的参数是空位开放罚分(gap open penalty)10、空位延伸罚分(gap extension penalty)0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔(Needle)标记的“最长一致性(longest identity)”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比，并且计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
出于本发明的目的，使用在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开发软件套，赖斯等人，2000，同上)(优选版本3.0.0或更新版本)的尼德尔程序中实施的尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。可任选使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的变体优选以基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
变体：术语“变体”意指具有蛋白酶活性的相比于其亲本在一个或多个(或一个或若干个)位置包含一个变化即取代、插入、和/或缺失的多肽，该亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有所述变化的蛋白酶。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在与占据一个位置的氨基酸相邻处添加氨基酸，例如1至10个氨基酸，优选1至3个氨基酸。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在70℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在45℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤(如衣物洗涤或硬表面清洁)过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。洗涤性能可以通过计算如在此处的材料与方法所述的AMSA测定中定义的所谓强度值(Int)来定量。也参见在此的实例2中的洗涤性能测试。此外，洗涤性能，特别是根据本发明的蛋白酶变体的洗涤性能可以通过以下所述的参考洗涤测试来确定。还参见在此处的实例3。
野生型蛋白酶：术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的一种蛋白酶。野生型蛋白酶的实例是BPN’，即SEQ ID NO:2。
转录启动子：术语“转录启动子”用于指为促进特定基因的转录的一个DNA区域的启动子。转录启动子典型地位于它们所调节的基因附近，在相同链上并且在上游(朝向有义链的5'区域)。
转录终止子：术语“转录终止子”用于指标记基因结束的基因序列区段或者供转录的基因组DNA上的操纵子。
变体命名惯例
出于本发明的目的，在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽是用于确定在另一个枯草杆菌蛋白酶中的相应氨基酸残基。将另一种枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽比对，并且基于该比对，使用在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开发软件套，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的尼德尔程序中实施的尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序、使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种枯草杆菌蛋白酶中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)、以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当从具有SEQ ID NO:2的成熟多肽中分出其他酶从而使得传统基于序列的比对难以检测它们的关系(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志295:613-615)时，可以使用其他成对序列比对算法。在基于序列的搜索中的较大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测关系疏远的同源物(阿特休尔等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可以实现更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯(Jones)，2003，生物信息学19:874-881)利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对曲线、以及溶剂化潜能)作为到神经网络的输入，该神经网络预测查询序列的结构折叠。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对具有未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于生成该多肽的同源性模型，并且可以使用多种出于该目的而开发的工具来评价这类模型的准确度。
对于具有已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，已对蛋白质的SCOP超家族进行结构比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(Shindyalov和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的变体中，采用以下所述的命名法以方便参考。采用已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代。对于一个氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变通过加号(“+”)、逗号或空格分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”、“G205R,S411F”、“G205R S411F”，分别代表位置205和411的甘氨酸(G)取代为精氨酸(R)，以及丝氨酸(S)取代为苯丙氨酸(F)。
缺失。对于一个氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入：额外的氨基酸残基的插入，例如像在G195后插入赖氨酸可以表示为：Gly195GlyLys或者G195GK。可替代地，额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸可以表示为：*195aL。当插入多于一个的氨基酸残基，例如像在G195后插入Lys和A1a时，这种插入可以表示为：Gly195GlyLysAla或者G195GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在一个或多个插入的氨基酸残基前的氨基酸残基位置号处来对一个或多个插入的氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*195aK*195bA。在以上的实例中，序列194至196因此为：
在其中取代和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或者简单地为S99AD。相同修饰也可以表示为S99A+*99aD。
在其中插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG或者*195aGbG。对于以下变化，相同的实际变化也可以仅表示为A194AG或者*194aG，从
这些情况对于技术人员来说是显而易见的，并且因此表示式G195GG和这种类型插入的相应表示式旨在包括这种等同简并表示式。
不同变化。可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指示以下变体：
“Tyrl67Gly+Argl70Gly”、“Tyrl67Gly+Argl70Ala”、“Tyrl67Ala+Argl70Gly”、以及“Tyrl67Ala+Argl70Ala”。
发明详细说明
先前没有预料到的是，发明人发现在位置53-57处含有一个或多个缺失和/或取代的蛋白酶变体相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有该一个或多个变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶具有改进的洗涤性能。与SEQ ID NO:2的位置53-57相对应的氨基酸形成一个环的部分，该环的部分连接β-折叠与含有H64的α-螺旋，该H64是活性位点的催化三联体D32、H64和S221的一部分。α-螺旋的氨基酸序列在S8-型的野生型蛋白酶之间是非常保守的。β-折叠也是保守的。然而，连接环具有一个高度序列变化性。这通过两种S8蛋白酶BPN’(SEQ ID NO:2)和诺维信蛋白酶(一种本领域已熟知的蛋白酶)的氨基酸序列位置51-70的以下比对进行举例说明：
生成在位置53-57(BPN’编号)中含有一个单一缺失的新蛋白酶变体以及在环区域内含有该缺失以及一个或若干个取代的变体，并如“材料与方法”所述对其测试洗涤性能，并且发明人证明在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的一个位置的一个或多个氨基酸的一个或多个缺失相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有这些变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶显著改进了洗涤性能。因此，本发明涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括以下步骤：在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失；以及回收该变体。在一个优选实施例中，蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2，即与具有SEQ ID NO:2的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)蛋白酶(BPN’)具有至少65％的一致性。因此，本发明的一个方面涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性；以及回收该变体。因此，本发明涉及这样一种方法，该方法包括在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中缺失一个或多个氨基酸，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，根据本发明的方法产生的变体是由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少70％的一致性的多核苷酸编码的多肽。在一个实施例中，根据本发明的方法产生的变体是由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸具有至少70％的一致性、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
另一个实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中缺失一个或多个氨基酸，特别是如以上所述的方法，其中亲本枯草杆菌酶是选自下组，该组由以下各项组成：
a.与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％的序列一致性的一种多肽；
b.由在中严谨度或高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
c.由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种序列具有至少70％一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
d.具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
一个具体实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个位置引入一个缺失，其中所产生的变体是亲本蛋白酶的变体，该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个具体实施例中，蛋白酶变体是在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失的一种BPN’变体。因此，一个具体方面涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该一个或多个缺失是在SEQ ID NO 2中进行的。在另一个实施例中，本发明涉及一种方法，其中该变体包含与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的两个、三个、四个或五个缺失。一个优选实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入两个或更多个氨基酸的缺失，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。另一个实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相对应的环中引入两个或更多个氨基酸的缺失，其中所产生的变体是亲本蛋白酶的变体，它与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％的序列一致性。在一个具体实施例中，蛋白酶变体是在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失的一种BPN’变体。
一个特别优选的实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％的一致性并且其中该方法包括分别在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中缺失一个或多个选自下组的氨基酸，该组由Ser、Glu、Thr、Asn或Pro组成。一个具体实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入一个或多个选自下组的氨基酸的缺失，该组由Ser、Glu、Thr、Asn或Pro组成，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％的一致性，如与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个方面，用于获得该蛋白酶变体的方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ IDNO:2的位置53相对应的位置引入一个缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53处引入氨基酸的缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置53相对应的位置引入氨基酸Ser的缺失或者由其组成。
在一个方面，用于获得该蛋白酶变体的方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ IDNO:2的位置54相对应的位置引入一个缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置54处引入氨基酸的缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置54相对应的位置引入氨基酸Glu的缺失或者由其组成。
在一个方面，该蛋白酶变体通过一种方法获得，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置55相对应的位置引入一个缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55处引入氨基酸的缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置55相对应的位置引入氨基酸Thr的缺失或者由其组成。
在一个方面，该蛋白酶变体通过一种方法获得，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置56相对应的位置引入一个缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置56处引入氨基酸的缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置56相对应的位置引入氨基酸Asn的缺失或者由其组成。
在一个方面，该蛋白酶变体通过一种方法获得，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置57相对应的位置引入一个缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置57处引入氨基酸的缺失或者由其组成。在另一方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的位置57相对应的位置引入氨基酸Pro的缺失或者由其组成。
在本发明的一个特别优选的方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失。在一个优选的实施例中，所述方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性。在本发明的一个特别优选的方面，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失。在一个优选的实施例中，所述方法包括在亲本枯草杆菌酶的与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性。因此，本发明的一个方面涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性。因此，本发明涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
本发明的一个方面涉及一种产生根据本发明的多种变体的方法，其中该方法包括在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中缺失一个氨基酸，并且进一步包括在与位置53、54、55、56或57相对应的一个或多个位置包含一个取代，其中
(a)该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％且小于100％的序列一致性并且
(b)该变体具有蛋白酶活性。
在一个实施例中，根据所述方法获得的变体在与SEQ ID NO:2的位置53相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置54、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，根据所述方法获得的变体在与SEQ ID NO:2的位置54相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，根据所述方法获得的变体在与SEQ ID NO:2的位置55相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，根据所述方法获得的变体在与SEQ ID NO:2的位置56相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，根据所述方法获得的变体在与SEQ ID NO:2的位置57相对应的位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55或56相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代
变体
本发明提供了多种蛋白酶变体，这些蛋白酶变体在与位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置包含一个缺失，其中该变体具有蛋白酶活性。因此，本发明涉及多种蛋白酶变体，其中包含与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置的环已缩短至少一个氨基酸。此外，在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中缺失一个氨基酸以及在环区域内的多个取代相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶引起显著改进的洗涤性能。与SEQ ID NO:2的位置53-57相对应的氨基酸形成一个环的部分，该环的部分连接β-折叠与在位置64处含有活性位点残基组氨酸的α-螺旋。在不受任何理论约束的情况下，认为改变该环影响了活性位点组氨酸。扩散到活性位点残基的环变化尤其可以是缺失，但是取代对于扩散到序列下游约7至11个位置也可以具有足够强的影响。甚至在活性位点残基定位的微秒改变可以具有酶活性和因此酶性能的显著影响。特别用Gly、Ala、Ser、Thr以及Asn进行环中的氨基酸取代，因为它们较小并因此不会对蛋白质具有其他不希望的影响，例如化学位阻。此外，Gly、Ala、Ser、Thr以及Asn的疏水性不是很强，这对于这个水暴露位置时很重要的。
因此，本发明涉及多种分离的蛋白酶变体，这些变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置包含一个变化，其中该变体具有蛋白酶活性。本发明的一个实施例涉及一种分离的蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体具有蛋白酶活性。本发明的一个具体实施例涉及一种分离的蛋白酶变体，该变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。优选地，该变体具有蛋白酶活性。
本发明的另一个方面涉及一种在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个缺失以及一个或多个取代的变体。优选地，该变体具有蛋白酶活性。
一个具体实施例涉及一种分离的蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置进一步包含一个或多个取代，其中该变体具有蛋白酶活性。另一个实施例涉及一种分离的蛋白酶变体，该变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置进一步包含一个或多个取代，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。优选地，该变体具有蛋白酶活性。
在一个实施例中，该变体在与SEQ ID NO:2的位置53相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置54、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，该变体在与SEQ ID NO:2的位置54相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，该变体在与SEQ ID NO:2的位置55相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，该变体在与SEQ ID NO:2的位置56相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55或57相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，该变体在与SEQ ID NO:2的位置57相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55或56相对应的一个或多个位置进一步包含一个取代。
在一个实施例中，该变体与亲本枯草杆菌蛋白酶或者具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有变化的蛋白酶的氨基酸序列具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在一个方面，在本发明的变体中的总变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变化。
在另一个方面，根据本发明的变体在与位置53、54、55、56、以及57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置包含一个变化。在另一个方面，根据本发明的变体在与位置53、54、55、56、以及57中任一个相对应的两个位置包含一个变化。在另一个方面，根据本发明的变体在与位置53、54、55、56、以及57中任一个相对应的三个位置包含一个变化。在另一个方面，根据本发明的变体在与位置53、54、55、56、以及57中任一个相对应的四个位置包含一个变化。在另一个方面，根据本发明的变体在与位置53、54、55、56、以及57相对应的每个位置包含一个变化。
在另一个方面，该变体在与位置53相对应的位置上包含一个变化或由其组成。在另一个方面，在与位置53相对应的位置上的氨基酸被Ala、Gly或Thr、优选Gly取代。在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G或者由该取代组成。在一个具体实施例中，在位置53上的变化是一个缺失，即该位置是不存在的。因此，在与位置53相对应的位置上的氨基酸选自Gly、Ala或Thr或者是不存在的。术语“不存在”在此背景下应被理解为氨基酸已从其原始背景中缺失，即不再存在于与SEQ ID NO:2的位置53至57相对应的环中。这实际上意味着与SEQ ID NO:2的位置53至57相对应的环已缩短一个氨基酸。
在另一个方面，该变体在与位置54相对应的位置上包含一个变化或由其组成。在另一个方面，在与位置54相对应的位置上的氨基酸被Ala、Gly、Ser、或Thr、优选Ala取代。在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A或者由该取代组成。在一个具体实施例中，在位置54上的变化是一个缺失，即该位置是不存在的。因此，在与位置54相对应的位置上的氨基酸选自Ser、Gly、Ala或Thr或者是不存在的。
在另一个方面，该变体在与位置55相对应的位置上包含一个变化或由其组成。在另一个方面，在与位置55相对应的位置上的氨基酸被Ala、Gly或Ser、优选Ser取代。在另一方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S或者由该取代组成。在一个具体实施例中，在位置55上的变化是一个缺失，即该位置是不存在的。因此，在与位置55相对应的位置上的氨基酸选自Ser、Gly或Ala或者是不存在的。
在另一个方面，该变体在与位置56相对应的位置上包含一个变化或由其组成。在另一个方面，在与位置56相对应的位置上的氨基酸被Ala、Gly、Ser、或Thr、优选Ser取代。在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56S或者由该取代组成。在一个具体实施例中，在位置56上的变化是一个缺失，即该位置是不存在的。因此，在与位置56相对应的位置上的氨基酸选自Ser、Gly、Ala或Thr或者是不存在的。
在另一个方面，该变体在与位置57相对应的位置上包含一个变化或由其组成。在另一个方面，在与位置57相对应的位置上的氨基酸被Ala、Gly、Ser、或Thr、优选Ala取代。在另一方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A或者由该取代组成。在一个具体实施例中，在位置57上的变化是一个缺失，即该位置是不存在的。因此，在与位置57相对应的位置上的氨基酸选自Ser、Gly、Ala或Thr或者是不存在的。
在另一方面，该变体在与位置53和54相对应的位置上包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53和55相对应的位置上包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53和56相对应的位置上包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53和57相对应的位置上包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54和55相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54和56相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54和57相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置55和56相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置55和57相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置56和57相对应的位置上包含变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、54、以及55相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、54、以及56相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、54、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、55、以及56相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、55、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、56、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54、55、以及56相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54、55、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54、56、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置55、56、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、54、55、以及56相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置54、55、56、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一方面，该变体在与位置53、54、55、56、以及57相对应的位置包含多个变化或由其组成，例如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体包含一个或多个(例如，若干个)选自下组的取代(该组由X53G、X54A、X55S、X56A、X57AX53G组成，优选选自下组的取代，该组由S53G、E54A、T55S、N56A、P57A组成)和/或一个或多个(例如，若干个)选自下组的缺失(该组由53*、54*、55*、56*、57*组成)或者由其组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G或者由该取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A或者由该取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G和缺失54*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G和缺失55*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G和缺失56*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G和缺失57*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A和缺失53*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A和缺失55*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A和缺失56*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A和缺失57*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S和缺失53*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S和缺失54*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S和缺失56*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S和缺失57*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A和缺失53*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A和缺失54*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A和缺失55*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A和缺失57*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A和缺失53*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A和缺失54*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A和缺失55*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P57A和缺失56*或者由该取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+P57A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+N56A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+N56A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+P57A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N56A+P57A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+N56A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+P57A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+N56A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+T55S+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+N56A+P57A和缺失55*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+N56A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T55S+N56A+P57A和缺失54*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失53*+54*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失53*+55*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失53*+56*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失53*+57*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失54*+55*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失54*+56*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失54*+57*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失55*+56*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失55*+57*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的缺失56*+57*或者由这些缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S+N56A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+N56A+P57A或者由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S+N56A和缺失57*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代S53G+E54A+T55S+P57A和缺失56*或者由这些取代和该缺失组成。
在另一个方面，该变体包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代E54A+T55S+N56A+P57A和缺失53*或者由这些取代和该缺失组成。
这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个额外的变化。
氨基酸改变可以具有次要性质,即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域中已知的，并且(例如)由H.纽拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在《蛋白质》(学术出版社，纽约)中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的这种性质。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
例如，这些变体在与位置53、54、55、56、57相对应的位置上可以包含一个变化并且在选自下组的任何位置上进一步包含一个变化，该组由位置4、14、63、79、84、86、88、92、98、101、146、以及217组成，优选为位置63和217(根据SEQ ID NO:2编号)。在一个优选实施例中，在选自下组的任何位置上的变化是一个取代，该组由4、14、63、79、84、86、88、92、98、101、146、以及217组成。在一个特别优选的实施例中，根据本发明的变体在与SEQ ID NO:2的位置53、54、55、56、57相对应的位置上包含一个变化，其中这些变化中的至少一个是缺失并且该变体进一步包含一个或多个选自下组的取代，该组由V4I、P14T、S63G、I79T、P86H、A88V、A92S、A98T、S101L、G146S或Y217L组成。
在本发明的一个实施例中，根据本发明的变体包括以下任何变体或者由其组成：
S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A+S101L+Y217L、V4I+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、T55S+N56*+P57A+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+I79T+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+P86H+A92S+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+A88V+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+A98T+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、S53G+T55P+N56*+S63G+G146S+Y217L
在一个特别优选的实施例中，本发明的变体在与SEQ ID NO:2的位置53、54、55、56、57相对应的一个或多个位置上包含一个缺失并且进一步包含取代Y217L。
在另一个特别优选的实施例中，本发明的变体在与SEQ ID NO:2的位置53、54、55、56、57相对应的两个或更多个位置上包含一个缺失并且进一步包含取代Y217L。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。酶活性位点或其他生物学相互作用也可以通过对结构进行物理学分析来确定，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变相结合来确定。参见，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份还可以从与相关多肽的比对来推断。对于BPN’(SEQ ID NO:2)，包含氨基酸S221、H64、以及D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必须的。
这些变体可以由200至900个氨基酸，例如210至800、220至700、230至600、240至500、250至400、255至300、260至290、265至285、270至280、或者270、271、272、273、274、275、276、277、278、279或280个氨基酸组成。
在一个实施例中，该变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶具有改进的催化活性。
在一个实施例中，该变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶具有改进的洗涤性能，其中如在此处的“材料与方法”所述地在AMSA中测量洗涤性能。
在一个实施例中，根据本发明的变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶具有改进的热稳定性，其中该变体在特定温度下相对于亲本或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有变化的蛋白酶或者相对于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶的温度依赖活性曲线展示改变的温度依赖活性曲线。在一个具体实施例中，根据本发明的变体具有减小的热活性，其中所述变体在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。在一个具体实施例中，该亲本是具有SEQ ID NO:2或者与其具有至少65％的一致性的蛋白酶。
亲本蛋白酶
裂解蛋白质底物中的酰胺键的酶被分类为蛋白酶或(可互换地)肽酶(参见，沃尔什(Walsh)，1979，酶促反应机制(Enzymatic Reaction Mechanisms)，福利曼出版公司(W.H.Freeman and Company)，旧金山(San Francisco)，第3章)。
氨基酸位置/残基的编号
如果没有另外指出，则在此所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN'(BASBPN)序列的氨基酸编号。对于进一步描述BPN’序列，参见SEQ ID NO:2或斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程4(1991)719-737。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(怀特(White)、汉德勒(Handler)和史密斯(Smith)，1973，“生物化学原理(Principles ofBiochemistry)”，第五版，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约(NY)，第271-272页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围是20,000至45,000道尔顿。它们被二异丙基氟磷酸所抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上与同样是丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶相似。一个更狭义的术语碱性蛋白酶包括一个亚组，它反映某些丝氨酸蛋白酶的最佳高pH值pH 9.0至pH 11.0(综述参见普里斯特(Priest)(1977)细菌学评论(BacteriologicalRev.)41:711-753)。
枯草杆菌酶
斯艾森等人，蛋白质工程4(1991)719-737以及斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523提出了被暂时命名为枯草杆菌酶(subtilase)的一个丝氨酸蛋白酶亚组。它们是通过对先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的170多个氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据斯艾森等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定大量的枯草杆菌酶，并且已确定很多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶以及其氨基酸序列的更详细描述参见斯艾森等人(1997)。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包含“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(subtilisin Carlsberg)(诺维信公司)、以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。BPN’是来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’，BPN’具有氨基酸序列SEQ IDNO:2。
斯艾森等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一个亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并且包括如以下的酶：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(杜邦/杰能科国际公司)、枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(诺维信公司)、以及碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌蛋白酶是来自S8家族、特别是来自S8A子族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)所定义的。
BPN’和诺维信蛋白质分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。
亲本枯草杆菌酶
根据本发明的亲本蛋白酶是一种亲本枯草杆菌酶。术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据斯艾森等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。更详细的信息参见以上“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源中分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特性的同时，对其进行随后的修饰。此外，亲本枯草杆菌酶可以是一种通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶，如通过J.E.内斯(Ness)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17,893-896(1999)所描述的。
可替代地，术语“亲本枯草杆菌酶”可被称为“野生型枯草杆菌酶”。
提供了在此提到的各种枯草杆菌酶的首字母缩写参考表，对于另外的首字母缩写，参见斯艾森等人，蛋白质工程4(1991)719-737以及斯艾森等人，蛋白质科学6(1997)501-523。
表III
枯草杆菌酶的修饰
在此使用的术语“修饰”被定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。该修饰可以是氨基酸侧链的置换、在感兴趣氨基酸中或感兴趣氨基酸处的取代、删除和/或插入。
枯草杆菌酶变体
术语“变体”和术语“枯草杆菌酶变体”是如以上所定义的。
同源枯草杆菌酶序列
两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“一致性百分比”。
基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是相当简单的。
基本上同源的亲本枯草杆菌酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，术语“一个或多个”与术语“若干个”是互换使用的。这些改变优选具有一种次要性质，即并不显著影响蛋白质或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代和其他取代；典型地具有1个至约30个氨基酸的小缺失；以及小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基、具有至多约20-25个残基的一种小接头肽、或促进纯化(亲和标记)的一种小延伸，如一种多组氨酸序列、或蛋白质A(尼尔森(Nilsson)等人，1985，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)4:1075；尼尔森等人，1991，酶学方法(MethodsEnzymol.)198:3)。通常还参见，福特(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(ProteinExpression and Purification)2:95-107。
尽管以上所述的这些改变优选具有一种次要性质，此类改变也可以具有一种实质性质，如至多300个氨基酸或更多个氨基酸的更大多肽的融合，二者都作为氨基-或羧基-末端延伸。
亲本枯草杆菌酶可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有蛋白酶活性的片段，或者由其组成。在一个方面，该亲本枯草杆菌酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者由其组成。
该亲本枯草杆菌酶可以是(a)与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％序列一致性的一种多肽；(b)由在中严谨度或高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；或者(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽。
在一个方面中，该亲本与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列一致性，该成熟多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的不同不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者由其组成。在另一个方面，该亲本包含具有SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。在另一个方面，该亲本包含SEQID NO:2的氨基酸1至275或者由其组成。
在另一个方面，该亲本是具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段含有至少202个氨基酸残基，例如SEQ ID NO:2的位置28至230。
在另一个实施例中，该亲本是具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位基因变体。
在另一个方面，该亲本是由在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、或高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列以及具有SEQ ID NO:2的多肽或其片段可以用于设计核酸探针，从而根据领域内熟知的方法，从不同属或种的菌株中识别并克隆编码亲本的DNA。具体来说，可以根据标准的DNA印迹程序，将这类探针用于与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便在其中鉴别并分离相对应的基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。这类探针涵盖于本发明。
可以筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中与上述探针杂交并且编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离来自这类其他菌株的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素或其他合适的载体材料上并且固定于其上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹法中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸与和(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列；(iv)其全长互补体；或者(v)其子序列相对应的标记的核酸探针；在非常低至非常高严谨度条件下杂交。可以使用例如X-射线片或本领域中已知的任何其他检测手段检测核酸探针在这些条件下所杂交的分子。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核苷酸探针是SEQ ID NO:1的80至1140个核苷酸长片段，例如长度为90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是编码具有SEQID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的一种多核苷酸。在另一个方面，该核酸探针是SEQID NO:1或编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列。
在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列一致性。
该多肽可以是一种杂合多肽，其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N末端或C末端处。
该亲本可以是一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N末端或C末端。融合多肽是通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸来产生。产生融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，以使得它们在框内并且融合多肽的表达受到相同的一个或多个启动子和终止子的控制。融合多肽还可以使用内蛋白技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
一个融合多肽可以在两个多肽之间进一步包含一个切割位点。一旦分泌融合蛋白，该位点就被裂解，从而释放这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现的世界(Drug Discovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。
在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。
在一个方面，该亲本是一种解淀粉芽孢杆菌蛋白酶，例如SEQ ID NO:2的蛋白酶。
公众在许多培养物保藏中心易于获得这些种的菌株，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心南方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接从天然生境分离微生物和DNA的技术是本领域内熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得一种具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：(a)在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的一个或多个(例如，若干个)位置上引入一个变化；以及(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等等来制备这些变体。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
定点诱变可以在体外通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR来完成。定点诱变还可以在体外通过表达盒诱变来执行，这涉及用限制酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行裂解，并且随后将含有该突变的寡核苷酸连接在该多核苷酸中。消化该质粒和该寡核苷酸的限制酶通常是相同的，从而允许该质粒和插入物的粘性末端互相连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。
定点诱变还可以在体内通过本领域已知的方法完成。参见，例如美国专利申请号2004/0171154；Storici等人，2001，自然生物技术19:773-776；克伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中，可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计成编码目标多肽的多核苷酸分子。可以利用多种技术进行基因合成，如由田(Tian)等人(2004，自然432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；鲍依(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定位诱变(region-directed mutagenesis)(德比修(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(内丝等人，1999，自然生物技术l7:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以从这些宿主细胞中回收并使用本领域的标准方法来快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。基因的限定区域因而可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物扩增，而其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体之前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克等人，1989(见上文)中。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子是从以下基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例是从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(休(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
控制序列还可以是编码连接至一个变体的N-末端的一个信号肽并指导该变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva)，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57:109-137进行描述。
该控制序列还可以是编码位于一个变体的N-末端的前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来进行表达。在形成该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA程序并且可以引起多核苷酸的表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与该载体待引入其中的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何构件。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中整合它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置的整合可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含可扩增的选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，并且由此是该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌、梭菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、海洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌、大肠杆、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门菌、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
可以通过原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学和基因组(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829、或者杜布(Dubnau)和大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或共轭(参见，例如，凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)实现DNA到芽孢杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化(参见，例如，哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)或者电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)实现DNA到大肠杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化、电穿孔(参见，例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.(Praha))49:399-405)、共轭(参见，例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或者转导(参见，例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)实现DNA到链霉菌细胞中的引入。可以通过电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)、或者共轭(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学71:51-57)实现DNA到假单孢菌细胞中的引入。可以通过天然感应态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现DNA到链球菌细胞中的引入。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。
产生方法
本发明还涉及用于产生一种变体的方法，这些方法包含：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源以及无机盐。适合的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心目录中)来制备。如果变体被分泌到营养培养基中，那么可以从该培养基中直接回收该变体。如果变体不被分泌，那么可以从细胞裂解物中回收它。
可以使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的这些变体特异的方法检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及大小排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
在某一方面中，根据本发明的这些变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有变化的蛋白酶或者相比于具有SEQ ID NO:2的蛋白酶具有改进的洗涤性能，其中如在此处的“材料与方法”所述地在AMSA中测量洗涤性能。
因此，在一个优选实施例中，组合物是一种洗涤剂组合物，并且本发明的一个方面涉及包含根据本发明的一种变体的洗涤剂组合物在清洁过程(如衣物洗涤或硬表面清洁)中的使用。
额外组分的选择是在普通技术人员技术范围内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。虽然以下提及的组分根据特定功能通过通用标题(general header)进行分类，但是这并不被解释为限制，因为正如本领域的普通技术人员所了解的，一种组分可以包含额外的功能。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液体0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。
可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如为多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO 92/19709和WO 92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO 2005/105826和WO 2009/118375所述的肽醛或酮使根据本发明的变体稳定化。
本发明的变体还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，该专利通过引用结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的表面活性剂、或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化的季铵(AQA)。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，具体地说是从约1％至约20％、从约3％至约10％、例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、以及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极化表面活性剂。半极化表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺、以及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、以及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶剂极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水和疏水两种特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而，助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见，例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体与界面科学新见(Current Opinionin Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生自聚集，如发现表面活性剂和脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、以及聚合物的混合物)的相状态、稳定性、以及胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、以及其组合。
增效剂和助增效剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0％-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂增效剂或助增效剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，增效剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。增效剂剂和/或助增效剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何增效剂和/或助增效剂。增效剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、以及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0％-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂助增效剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以包括单独的助增效剂、或者与一种增效剂(例如沸石增效剂)结合的助增效剂。助增效剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐)、以及烷基-或链烯基琥珀酸。额外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、以及其组合和盐。其他示例性增效剂和/或助增效剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，例如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂(photobleach)、漂白活化剂、过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)、预成型过酸以及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸和盐、过碳酸和盐、过白啶酸(perimidic acid)和盐，过氧单硫酸和盐(例如，过硫酸氢钾(Oxone(R)))、以及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成的漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰基乙二胺(TAED)以及4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)、和/或WO 98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中，并且在该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的增效能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下化学式的有机催化剂：
(i)
(ii)
(iii)以及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基或包含从11至24个碳的直链烷基，优选每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基或包含从11至18个碳的直链烷基，更优选每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基以及异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、WO 2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的助增效剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抗发泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的主旨。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、以及聚羧化物(例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸与低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯与聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)、以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物着色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物着色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物着色剂改变表面的色彩。合适的织物着色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由属于颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫以及碱性红、或其混合物，例如，如WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1876226(它们通过引用结合在此)中所描述的。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物着色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物着色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO2007/087257、WO 2007/087243中。
(额外的)酶
在一个实施例中，将根据本发明的变体与一种或多种酶，例如至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。
洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如碳水化合物活性酶，如碳水化物酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的清洁剂相容(即最佳pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
可商购获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际有限公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(KaoCorporation))。
蛋白酶
额外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选微生物来源。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶的蛋白酶可以例如是来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森等人，蛋白质工程4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶子组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有丝氨酸的蛋白酶子组，它与底物一起形成共价加合物。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛疏抗生素肽酶家族、Kexin家族和热分解素(Pyrolysin)家族。在本发明的一个方面，额外的蛋白酶可以是枯草杆菌酶，如枯草杆菌蛋白酶或其变体。
枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、芽孢杆菌lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。额外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。枯草杆菌酶变体的其他实例可以是在任何以下位置上具有突变的那些：使用BPN’编号的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274。更优选的枯草杆菌酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)以及如WO 89/06270和WO 94/25583中所述的镰孢霉蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、以及WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个以下位置上具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司)所述的中性金属蛋白酶。
优选的可商购获得的蛋白酶包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、Liquanase UltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(诺维信公司)、AxapemTM(吉斯特-布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、Purafect PrimeTM以及PuramaxTM(杜邦/杰能科国际公司)。另一种优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO 95/23221中所述)、以及其变体(在WO92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
脂肪酶和角质酶：合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如在EP 258 068和EP 305 216中描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO 96/13580中描述的特异腐质霉(H.insolens)；一种假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；一种芽胞杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达托斯(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学学报(Biochemica et BiophysicaActa)，1131:253-360)、嗜热脂肪芽杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，例如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/060063、WO2007/087508以及WO 2009/109500中描述的那些。
优选的可商购获得的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM、以及LipexTM；LecitaseTM、LipolexTM；LipocleanTM、LipoprimeTM(诺维信公司)。其他可商购获得的脂肪酶包括Lumafast(杜邦/杰能科国际公司)；Lipomax(吉斯特-布罗卡德斯公司/杰能科国际公司)以及来自苏威公司(Solvay)的芽胞杆菌脂肪酶。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α淀粉酶，例如，在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株。
有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、以及WO 97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置上具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、以及444。
可商购获得的淀粉酶为DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM以及BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM(来自杜邦/杰能科国际有限公司)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶、以及其变体(如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO98/15257中描述的那些)。
可商购获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。可以将洗涤剂添加剂即独立添加剂或组合添加剂配制为例如颗粒、液体、浆液等等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)、或浆液。
无尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露地产生，并且可以可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多羧酸包含至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。合适的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(Powdered Detergents,Surfactant science series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含额外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些:二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝CBS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的是，荧光增白剂是可商购获得的Parawhite KX，它由派拉蒙矿物和化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)(孟买，印度)供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物有助于从织物、例如棉或聚酯基织物上除去污物，特别是从聚酯基织物上除去疏水污物。污物释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包含一个芯结构和连接至该芯结构的多个烷基化基团的两亲性烷基化油污清洁聚合物。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用结合在此)。此外，任意接枝共聚物是合适的污物释放聚合物。合适的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素、以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、以及其混合物。
抗再沉淀剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉淀剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物、以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉淀剂。
其他合适的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两层或更多层的片剂、规则或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器剂量单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物是选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物(例如PVA)在膜中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括水可降解且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由盖里，印第安纳州，美国(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇以及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包含固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)
可以通过水可溶的袋中或不同片剂层中的室将洗涤剂成分彼此物理地分开。由此可以避免组分之间的不利的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解特性曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
颗粒洗涤剂配制品
可以如WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854所述地，配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于WO09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO 09/072069、WO09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO 09/103822、WO09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO 09/047128、WO09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO 09/040544、WO09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO 09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO 09/021813、WO09/030632、以及WO 09/015951。
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方法和用途
本发明还涉及用于在纺织品和织物的洗涤例如工业和机构清洁、家用衣物洗涤以及工业衣物洗涤中使用其组合物的方法。
本发明还涉及用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。
可以将本发明的蛋白酶变体添加到洗涤剂组合物中并且因此使其成为该洗涤剂组合物的组分。因此，本发明的一个方面涉及包含一种蛋白酶变体的洗涤剂组合物在清洁过程例如衣物洗涤和/或硬表面清洁中的用途，该蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性。另一个方面涉及包含一种变体的洗涤剂组合物的用途，该变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置上进一步包含一个或多个取代，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％且小于100％的序列一致性并且该变体具有蛋白酶活性。
本发明的一个实施例涉及一种蛋白酶变体在如衣物洗涤和/或硬表面清洁的清洁过程中的用途，该蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失，其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％的一致性，并且其中该变体当如“材料与方法”下所述地在AMSA中测试时相对于亲本或者相对于具有所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶亲本具有增大的洗涤性能。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在一个特定方面，本发明提供了一种包含本发明的多肽的洗涤剂添加剂，如在此所述的。
清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。
经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻、亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。
本发明进一步涉及本发明的蛋白酶变体在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质污物可以是如以下的污物：食物污物(例如婴儿食物、可可、鸡蛋以及牛奶)或者体液污染(如血液和皮脂)或者其他污染(如油墨或草屑)或其组合。
典型的洗涤剂组合物包含除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像增效剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。
在一个具体实施例中，本发明涉及包含本发明的蛋白酶变体的一种组合物在衣物洗涤或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包含以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、增效剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分。
在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶变体情况下使用的表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减小。优选地，是一种表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分以以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶变体的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面，将本发明的蛋白酶变体用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
洗涤方法
本发明的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中以以下浓度使用组合物：从约100ppm、优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在多个具体实施例中，在以下pH下执行该洗涤方法：从约5.0至约11.5、或者从约6至约10.5、约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或者约7至约8、约8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10、约10至约11，优选约5.5至约11.5。
在多个具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约16°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
本发明涉及一种使用包含本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。
一个优选的实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个衣物洗涤或餐具洗涤过程。
另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。
在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包含至少一种如以上“其他酶”部分列出的额外的酶，如选自下组的酶，该组由水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角质酶、糖水化合物酶(如淀粉酶)、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、以及果胶酶或其组合组成。在另一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物包含减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。
还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是已熟知的(参见，例如，美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过一种方法改善织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一个方面，在压力下用该溶液处理该织物。
在一个实施例中，在纺织品编织过程中或之后或者在脱浆阶段或一个或多个额外织物加工步骤过程中应用本发明的蛋白酶变体。在纺织品编织过程中，螺纹暴露于大量的机械应变中。在机械织布机上进行编织之前，为了提高拉伸强度并防止破裂，经常在经纱上涂上淀粉浆或淀粉衍生物。可以采用蛋白酶变体来除去这些蛋白质浆或蛋白质衍生物。在编织完纺织品之后，织物可以进行到脱浆阶段。这之后可以是一个或多个额外的织物加工步骤。脱浆是从纺织品上除去浆料的作用。编织后，为了确保均匀和耐洗效果，应在对织物进行进一步加工之前除去所涂的浆料。还提供了一种脱浆方法，该方法包括通过酶的作用酶促水解浆料。
在此应用中针对蛋白酶变体披露的所有问题、主题以及实施例还可应用于在此所述的方法和用途。因此，明确参考对于也在此描述的这些方法和用途的所述披露。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料与方法
常规分子生物学方法：
除非另外提及，使用标准分子生物学方法(萨姆布鲁克等人(1989)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(1995)；哈伍德(Harwood)和卡廷(Cutting)(1990))进行DNA操纵和转化。
蛋白酶测定：
1)Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％曲拉通(Triton)X-100，调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、以及11.0，使用HCl或NaOH。
将20μl蛋白酶(在0.01％曲拉通X-100)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μlpNA底物(将50mg溶解于1.0ml DMSO并进一步用0.01％曲拉通X-100稀释45x)开始测定。监控OD405的增加作为蛋白酶活性的测量。
2)Protazyme AK测定：
底物：Protazyme AK片剂(交联和染色的酪蛋白；来自Megazyme公司)
温度：37℃(或设定为其他测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％曲拉通X-100、pH 6.5或pH 7.0。
通过轻微搅拌将Protazyme AK片剂悬浮于2.0ml 0.01％曲拉通X-100中。在微量离心管中分配500μl的此悬浮液和500μl测定缓冲液，并将其放置在冰上。将20μl蛋白酶溶液(在0.01％曲拉通X-100中稀释)添加到冰冷的混合物中。通过将该管转移到37℃下的热混合器中并以最高速度(1400rpm)进行震荡来开始测定。15分钟后，将该管放回到冰浴中。为了除去未反应的底物，在冰冷离心机上将混合物离心几分钟并且将200μl上清液转移到微量滴定板上。测量上清液在650nm的吸光度。平行测定具有20μl 0.01％曲拉通X-100而不是蛋白酶溶液的样品，并且从蛋白酶样品测量值中减去它的值。
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评定洗涤性能，在衣物洗涤中使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、织物和盖子剧烈振动从而使测试溶液与织物接触并以规则、周期性摆动方式应用机械压力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，特别是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
标准洗涤剂和测试材料如下：
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:7.5)添加到测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当纺织品受到污染时，反射光的强度低于干净纺织品的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))、Midtager 29、DK-2605(丹麦(Denmark))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：
实例1：蛋白酶变体的制备和测试
变体的制备和表达
突变和表达盒到枯草杆菌的引入。
通过PCR(例如萨姆布鲁克等人；分子克隆；冷泉港实验室出版社)进行所有DNA操纵并且可以由本领域每位技术人员重复。
使用编码枯草杆菌酶变体的重组枯草杆菌构建体来接种含有富营养培养基(例如，PS-1:100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa2HPO4.12H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L普朗尼克(Pluronic)PE 6100(BASF102-3098))的摇瓶中。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。
变体发酵
可以通过本领域熟知的或如以下的方法进行发酵。将具有相关表达质粒的枯草杆菌菌株划线接种在具有相关抗生素(6μg/ml氯霉素)的LB琼脂板上，并在37℃下生长过夜。将菌落转移到在500ml摇瓶中补充有相关抗生素的100ml PS-1培养基上。通过在4500rpm下离心20-25分钟从发酵液中除去细胞和其他未溶解的材料。然后，过滤出上清液以获得澄清溶液。
实例2：
使用如“材料与方法”下描述的AMSA方法在30℃的温度下，测试在粉状和液体标准洗涤剂中的蛋白酶变体以及来自发酵上清液的其相应蛋白酶亲本的洗涤性能。
结果：
蛋白酶变体以及其相应蛋白酶亲本(SEQ ID NO:2)对于两种污物PC-03(在棉布/聚酯上的巧克力牛奶和烟灰)和PC-05(在棉布/聚酯上的血液、牛奶以及油墨)的相对洗涤性能示出在以下表2.1中。
相对于BPN’(SEQ ID NO:2)的蛋白酶洗涤性能百分比。
相对于BPN’Y217L的蛋白酶洗涤性能百分比示出在表2.2中。
以上两表显示所有研究的变体的洗涤性能都相对于BPN’(SEQ ID NO:2)增大。位置55、56或57的缺失显著地且大幅度改进洗涤性能。当存在位置53或54的缺失时观察到改进的洗涤性能。
此外，在环区域中的取代引起显著改进的洗涤性能。在与环中的缺失相邻的位置上的取代引起稍微进一步改进的洗涤性能。在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环外包含额外的突变(例如，Y217L)的测试变体显示至少与其不具有额外突变的亲本一样良好的洗涤性能。
实例3：
通过使用以下标准化污物确定根据本发明的蛋白酶变体的洗涤性能：
A：在棉布上的巧克力牛奶和烟灰：产品号C-03可从CFT(测试材料中心(Centerfor Testmaterials))B.V.，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰(Netherlands)获得，
B：在棉布上的血液、牛奶、油墨：产品号C-05可从CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰获得，
C：在棉布/聚酯上的巧克力牛奶和烟灰：产品号PC-03可从CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰获得，
D：在棉布/聚酯上的血液、牛奶、油墨：产品号PC-05可从CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰获得，
E：棉布上的草屑：产品号164可从 Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[国家材料与测试机构，测试材料(Federal materials andtesting agency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)获得。
将具有以下组成的液体洗涤剂用作基本配制品(所有的值都以重量百分比计)：0.3％至0.5％黄原胶、0.2％至0.4％消泡剂、6％至7％甘油、0.3％至0.5％乙醇、4％至7％FAEOS(脂肪醇醚硫酸酯)、24％至28％非离子型表面活性剂、1％硼酸、1％至2％柠檬酸钠(二水合物)、2％至4％苏打、14％至16％椰子脂肪酸、0.5％HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-二磷酸))、0％至0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0％至0.05％光增亮剂、0％至0.001％颜料、其余去离子水。
基于此基本配制品，通过添加如表3.1和3.2所指示的对应蛋白酶制备根据本发明的各种蛋白酶变体将BPN′变体BPN′Y217L用作参考，该参考蛋白酶已显示良好洗涤性能，尤其是在液体洗涤剂中。以基于总蛋白质含量(5mg/l洗涤液体)的相同量添加蛋白酶。
液体洗涤剂的剂量之比是4.7克/升洗涤液体，并且在20℃和40℃的温度下进行60分钟洗涤程序，水具有15.5与16.5°(德国硬度)之间的水硬度。
白度(即污物的增白)被光度测定地确定为洗涤性能的指示。使用美能达(Minolta)CM508d分光仪装置，该装置事先使用提供有单位的白标准进行校准。
获得的结果是使用根据本发明的蛋白酶变体获得的缓解单位(remission unit)与使用含有参考蛋白酶的洗涤剂获得的缓解单位之间的差值。因此，正值指示本发明的蛋白酶变体的改进的洗涤性能。从表3.1(在40℃下的结果)和表3.2(在20℃下的结果)可看出，根据本发明的蛋白酶变体显示改进的洗涤性能。
表3.1：
表3.2：
蛋白酶变体/污物 A B C D E
V4I+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L 1.1 0.3 3.1 3.9 0.5
P14T+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L 2.0 1.0 3.3 4.5 0.9
T55S+N56*+P57A+Y217L 1.6 0.0 3.5 3.6 0.6
S53G+T55S+N56*+P57A+I79T+Y217L 1.0 0.2 3.4 4.0 0.1
S53G+T55S+N56*+P57A+V84I+Y217L 0.8 0.4 2.8 3.8 1.1
S53G+T55S+N56*+P57A+P86H+A92S+Y217L 1.3 0.1 1.5 3.6 1.2
S53G+T55S+N56*+P57A+A88V+Y217L 0.8 0.5 3.5 4.0 0.9
S53G+T55S+N56*+P57A+A98T+Y217L 1.1 0.1 3.9 4.7 1.5
S53G+T55S+N56*+P57A+N118R+Y217L 0.6 0.8 0.9 1.3 0.5
H17Y+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L 2.3 0.8 1.4 2.6 1.0
S53G+T55S+N56*+P57A+G97D+Y217L 0.7 0.9 3.6 2.3 0.1
S53G+T55S+N56*+P57A+S101N+Y217L 0.1 0.9 3.2 2.2 0.5
S53G+T55S+N56*+P57A+G110A+Y217L 1.9 0.6 4.4 2.0 0.1
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等效方面都旨在处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说通过上述描述将变得清楚。这类修改也旨在属于所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
维尔纳，贝森马特（Werner，Besenmatter）
<120> 枯草杆菌酶变体和编码它们的多核苷酸
<130> 12099
<160> 2
<170> PatentIn 3.4版
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
atgagaggca aaaaagtatg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60
gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatat 120
attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaagaa agatgtcatt 180
tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc ttcagctaca 240
ttaaacgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagacccga gcgtcgctta cgttgaagaa 300
gatcacgtag cacatgcgta cgcgcagtcc gtgccttacg gcgtatcaca aattaaagcc 360
cctgctctgc actctcaagg ctacactgga tcaaatgtta aagtagcggt tatcgacagc 420
ggtatcgatt cttctcatcc tgatttaaag gtagcaggcg gagccagcat ggttccttct 480
gaaacaaatc ctttccaaga caacaactct cacggaactc acgttgccgg cacagttgcg 540
gctcttaata actcaatcgg tgtattaggc gttgcgccaa gcgcatcact ttacgctgta 600
aaagttctcg gtgctgacgg ttccggccaa tacagctgga tcattaacgg aatcgagtgg 660
gcgatcgcaa acaatatgga cgttattaac atgagcctcg gcggaccttc tggttctgct 720
gctttaaaag cggcagttga taaagccgtt gcatccggcg tcgtagtcgt tgcggcagcc 780
ggtaacgaag gcacttccgg cagctcaagc acagtgggct accctggtaa atacccttct 840
gtcattgcag taggcgctgt tgacagcagc aaccaaagag catctttctc aagcgtagga 900
cctgagcttg atgtcatggc acctggcgta tctatccaaa gcacgcttcc tggaaacaaa 960
tacggggcgt acaacggtac gtcaatggca tctccgcacg ttgccggagc ggctgctttg 1020
attctttcta agcacccgaa ctggacaaac actcaagtcc gcagcagttt agaaaacacc 1080
actacaaaac ttggtgattc tttctactat ggaaaagggc tgatcaacgt acaggcggca 1140
gctcagtaa 1149
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275

Claims (17)

1.一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56以及57相对应的一个或多个位置引入缺失，其中该变体具有与SEQ ID NO:2至少65％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。
2.如权利要求1所述的方法，其中该变体包含与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的两个、三个、四个或五个缺失。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过一种方法获得该蛋白酶变体，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中引入一个或多个选自下组的氨基酸的缺失，该组由Ser、Glu、Thr、Asn或Pro组成，其中该变体与SEQ ID NO 2具有至少65％的一致性。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过一种方法获得该蛋白酶变体，该方法包括在亲本枯草杆菌酶的与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置55、56或57相对应的环中引入一个或多个氨基酸的缺失。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶是选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少65％的序列一致性的一种多肽；
(b)由在中严谨度或高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一种序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一种序列具有至少70％一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
(d)具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
8.一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的环中包含一个或多个氨基酸的缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55、56或57相对应的位置进一步包含一个或多个取代，其中
(a)该变体与SEQ ID NO:2具有至少65％且小于100％的序列一致性，并且
(b)该变体具有蛋白酶活性。
9.如权利要求8所述的变体，其中该变体在与SEQ ID NO:2的位置53相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置54、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含取代，和/或
其中该变体在与SEQ ID NO:2的位置54相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、55、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含取代，和/或
其中该变体在与SEQ ID NO:2的位置55相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、56或57相对应的一个或多个位置进一步包含取代，和/或
其中该变体在与SEQ ID NO:2的位置56相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55或57相对应的一个或多个位置进一步包含取代，或者
其中该变体在与SEQ ID NO:2的位置57相对应的一个位置包含一个缺失并且在与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置53、54、55或56相对应的一个或多个位置进一步包含取代。
10.如权利要求8至9所述的变体，其中在与位置53相对应的该位置上的氨基酸是选自Gly、Ala、Thr、Asn或者是不存在的，和/或
其中在与位置54相对应的该位置上的氨基酸是选自Gly、Ala、Ser、Thr、Asn或者是不存在的，和/或
其中在与位置55相对应的该位置上的氨基酸是选自Gly、Ala、Ser、Asn或者是不存在的，和/或
其中在与位置56相对应的该位置上的氨基酸是选自Gly、Ala、Ser、Thr或者是不存在的，或者
其中在与位置57相对应的该位置上的氨基酸是选自Gly、Ala、Ser、Thr、Asn或者是不存在的。
11.如权利要求8至10中任一项所述的变体，该变体在与位置53、54、55、56、以及57中任一个相对应的三个位置包含变化。
12.如权利要求8至11中任一项所述的变体，该变体包含一个或多个选自下组的变化，该组由缺失S53*、E54*、T55*、N56*以及P57*和/或取代S53G、T55S以及P57A组成。
13.如权利要求8至12中任一项所述的变体，其中该变体是选自以下变体：S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A+S101L+Y217L、V4I+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、P14T+S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、T55S+N56*+P57A+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+I79T+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+P86H+A92S+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+A88V+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+A98T+Y217L、S53G+T55S+N56*+P57A+Y217L、S53G+T55P+N56*+S63G+G146S+Y217L。
14.如权利要求8至13中任一项所述的变体，该变体相比于该亲本或者相比于具有SEQID NO:2的该蛋白酶具有改进的洗涤性能。
15.如权利要求8至14中任一项所述的变体，其中该变体是选自下组，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少65％的序列一致性的一种多肽；
b.由在中严谨度或高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一种序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
c.由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种序列具有至少65％一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
d.具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
16.如权利要求8至15中任一项所述的变体，其中该变体与具有SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的序列一致性。
17.如权利要求8至16中任一项所述的变体，其中在该变体中的变化总数是1至20个，例如1至10个和1至5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个变化。
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