JPH0235092A - 修飾バキュロウイルス、その調整方法及びそれの形質発現ベクターとしての適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、バキュロウィルスのウィルス性含有物、ポリ
ヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）及び／又はプロティ
ンＰ１０の主なポリペプチドのプロモーター（ｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ）の背後に非反復分割部位（ｕｎｉｑｕｅｃｌ
ｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ）を有する修飾された（ｍｏｄ
　ｉｆ　１ｅｄ）バキュロウィルスに関するものであり
、またそのような修飾バキュロウィルスを得るための方
法及びその形質発現ベクターとしての適用に関するもの
である。

（背景技術） 遺伝子工学では、真核細胞のウィルス性ベクターの体系
を利用して、外来性のＤＮＡを、人工的抗原変換によっ
て動物若しくは植物の細胞内に導入している。その主要
な外来性のウィルスは、哺乳動物の細胞〔例えば、ＳＶ
４０やポリオーマ（ｐｏｌｙｏｍａ）　）や、植物細胞
（例えばカリフラワー・モザイク・ウィルス）における
ＤＮＡ形質導入ベクターとして役立ちそうなものであり
、それらのヌクレオキャプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓ
ｉｄ）の構造の形態学により、制限された長さの単なる
外来性（異種）ＤＮＡを受け入れることが出来る。その
ゲノムのサイズは、導入された配列の存在によって相当
に増大されているところから、より外来性の異種ＤＮＡ
にすみかを与えることの出来る有用なベクターを有する
ことが絶対に必要であることを証明した。特に、遺伝子
工学における発展が、一つよりも多くの異種遺伝子を、
その目的、例えば調和した表現を得ることや、可能なら
ば異種遺伝子の生成物の調和した活性を得ることの目的
を有する宿主細胞内に挿入しようとする試みに向がって
いるからである。理想的なウィルスのベクターは、また
長い異種ＤＮＡセグメントの細胞内への導入を高い成功
頻度をもって許容しなければならず、また全ての細胞賞
状蛋白質の一つ若しくはそれ以上の異種遺伝子の表現へ
の生合成の変換を許容しなければならない。これら全て
の条件を満たすと思われるウィルスは、次のようなバキ
ュロウィルスである：核多角体病ウィルス群であるオー
トグラファ・カリフォルニカ（Ａｕ　ｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　；　ＡｃＮＰＶ　）であり、
これは、Ｌ、Ｋ。

Ｍｉｌｌｅｒ　　（手引書：　’ＧＥＮＥＴｒＣＥＮＧ
ＩＮＥＥＲＩＮＧ　ＩＮＰＬＡＮＴ　５ＣＩＥＮＣＥＳ
″（１９８１）の「無を推動物における遺伝子工学のた
めのウィルスベクター」における第１４章、Ｎ、Ｊ、　
Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｅｄ、、　Ｐｒａｅｇｅｒ　
Ｐｕｂｌ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、第２０３−２２３頁）によれば、真
核細胞環境において、多くの異種遺伝子の遺伝や表現の
ための優れたベクターを構成している。この研究によれ
ば、ＡｃＮＰＶは、二つの形態、即ち非封入ウィルス（
ＮＯＶ）及び封入ウィルス（ＯＶ）を提供し、それらは
バキュロウィルスによって伝染の過程において異なる役
割を果たしている。また、ポリヘトリンのために符号化
した遺伝子は必要でなく、異種遺伝子の表現の高いレベ
ルを与え得るベクタ一体系を得るために、ヘトリンに符
号を付けるヌクレオチド配列内に導入された異種ＤＮＡ
によって排除され、また置き換えられ得るものである。

更に、この研究においては、ＡｃＮＰＶ封入体のマトリ
ックスを形成する結晶性の蛋白質であり、且つ３０ｋＤ
ａの分子量を有するポリヘトリンが、その模写工程の間
にポリヘトリン遺伝子の拡大を惹起することなく、０■
によって極めて多量に合成されることが指摘されており
、またポリヘトリンｍＲＮＡ合成のプロモーターが例外
的に強力であり、そして異種の形質発現の高いレベルを
得るために使用され得ることを示唆している。

また、前記の著者は、既に確認されたＡｃＮＰＶのゲノ
ムがポリヘトリン遺伝子のために符号化されていること
が以前に確立されていたことを示している。加えて、多
くのＡｃＮＰＶの遺伝子型変態が観察され、また制限エ
ンドヌクレアーゼ部位の幾つかの変位が幾つかの自然形
成変態のために図表化されている。

また前述の研究では、Ｌ、　Ｍｉｌｌｅｒは、ＡｃＮＰ
Ｖのゲノム（ＤＮＡ）が細胞培養において伝染性である
ことを思い出させ、そして細胞培養を形質転換するため
のこのゲノムの能力が、例えばウィルス性ＤＮＡに対す
る異種ＤＮＡの結合を許容し、トランスフェクションの
プロセスによって培養セル内に組換えＤＮＡを挿入し、
また付加的なりＮＡ配列を含むウィルスを得るようなタ
イプのものであり、またそのような能力はＡｃＮＰＶの
ＤＮＡ或いは組換えやその細胞内への容易な再挿入のイ
ンビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）的操作を許容するような
タイプのものであることを思い出させ、そこではＡｃＮ
ＰＶゲノム（推定によれば８２〜８８万ダルトンの分子
量若しくは９２万ダルトンの分子量を有している）の大
きなサイズが、宿主細胞への大きな異種ＤＮＡセグメン
トの予想される導入において利点を存している。更に、
この研究では、感染した細胞において生産される大量の
ポリヘトリンにより、その表現のためのポリへドリンプ
ロモーターを用いて、ポリヘトリン遺伝子を異種ＤＮＡ
によって置き換えることにおいて利点があることが述べ
られている。

ｒＡＮＩＭＡＬ　ＶＩＲＵＳ　ＧＥＮＥＴＩＣ３，６，
ＧＥＮＥＴＩＣＭｔｌＴＡＴＴＯＮＳ　　ＯＦ　　Ａ　
　ＢＡＣＵ１０ＶＩＲＵＳｊ　　、　　ＡＣＡＤＥ旧Ｃ
ＰＲＥＳＳ（１９８０）　、　　第７１−８０頁に見ら
れるに、Ｍ、　ｐｏｔｔｅｒ及びり、に、　Ｍｉｌｌｅ
ｒによる論文においては、幾つかの制限エンドヌクレア
ーゼの部位の制限マツプに基づいて、ＡｃＮＰＶ突然変
位体の遺伝マツプを確立するためのマーカー・レスキュ
ー（ｍａｒｋｅｒｒｅｓｃｕｅ）法が記述されており、
その方法は、突然変位ＤＮＡゲノムを生体内で野性型Ａ
ｃＮＰＶのＤＮＡ制限フラグメントで組み換えることか
らなるものである。

多数の刊行物が、Ｌ、　Ｍｉｌｌｅｒがその研究におい
て報告したデータを用いている。出願人がザ・テキサス
・ニー・アンド・エム・ユニバージティー・システム（
発明者は、Ｇ、Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ　　及びり。

Ｓｕｍｍｅｒｓとされている）であるヨーロッパ特許出
願第０１２７８３９号、出願人：マイクロジエネシス（
発明者は、Ｍ９Ｍ、　Ｃｏｃｈｒａｎとされている）で
あるヨーロッパ特許出願第（１２２８０３６号、Ｄ、Ｈ
，Ｌ、　Ｂ１５ｈｏｐ及びＣ，Ｙ、　Ｋａｎｇが出願人
及び発明者であるヨーロッパ特許出願第（１２６（１０
９０号は、何れも、敏感な宿主昆虫細胞に感染するよう
に用いられる組換えバキュロウィルス表現ベクターを製
造することを、その目的としている。

それらのプロセスによれば、ポリヘトリン蛋白質にコー
ドを付けたＤＮＡ配列やポリへドリンプロモーターを含
むＤＮＡフラグメントは、先ずオートグラファ・カリフ
ォルニカ（Ａ　ｃ　ＭＮ　Ｐ　Ｖ、）の如き適当なバキ
ュロウィルスから分離される。

そして、それら三つの刊行物の最初のものによれば、そ
の分離されたフラグメントは、プラスミドＰＵＣ８の如
きクローニングベクターに挿入され、クローニング媒介
物（プラスミド）からなる転移ベクターを形成する。こ
のクローニング媒介物は、必然的にポリへドリンプロモ
ーターを含み（しかし、ポリヘトリンのためにコード化
したＤＮＡ配列は必然的でない）、また該プロモーター
の転写制御の下に存在する選択遺伝子をクローニングす
るに有効な部位を有している；それから組換え転移ベク
ターが、組換えＤＮＡ手法の使用によって、選択された
遺伝子の前記有効なりローニング部位への挿入によって
形成される。そして、最後に、この組換え転移ベクター
からトランスフェクションによって該組換え転移ベクタ
ーのフラグメントをバキュロウィルスＤＮＡ内に組み入
れることによって、組換え表現ベクターが形成されるの
である。このような方法において形成された組換えバキ
ュロウィルス表現ベクターは、前記組換え転移ベクター
内に挿入された選択遺伝子を表現し得るものである。

また、前記三つの刊行物のうち二つ目のものは、ウィル
スによって感染された宿主細胞におけるＨ８表面抗原の
如きポリペプチドを製造することを目的とするものであ
り、バキュロウィルス（昆虫宿主細胞に感染することの
出来るウィルス）から、ポリへドリンプロモーターの如
きウィルス性プロモーターを含む第一のＤＮＡセグメン
トを分離し、次いで適当な源からポリペプチドのために
コード化された配列を含む第二のＤＮＡセグメントを分
離し、そしてそれら二つのＤＮＡセグメントを結合して
、第三のＤＮＡセグメントの連続的なストランドを形成
する。この第三のＤＮＡセグメントは、前記第二のＤＮ
Ａセグメントが前記第一のＤＮＡセグメントのプロモー
ターに隣接したベクタ−ＤＮＡを含み、また転写シグナ
ルの端部を有している；組換えベクターは、それから上
記の第三のセグメントをバキュロウィルスのゲノムＤＮ
Ａで組み換えることによって形成され、その後、該組換
えベクターは、前記宿主細胞内への組換えベクターセグ
メントの結合を惹起して、それらの感染するような条件
の下で、植物宿主細胞と接触して配置される；それから
、それらは培養され、細胞から或いは培養上澄み液から
Ｈ８表面抗原が分離される。

さらに、前記三つの刊行物のうちの三番目のもの（ヨー
ロッパ特許出願第（１２６（１０９０号）は、ＨＢウィ
ルス表面抗原蛋白質（ＨＢｓＡｇ）またはプロティンＰ
ＲＯ−３２の少なくとも一つの抗原フラクションを含む
ポリペプチドを製造することを、その目的とするもので
ある。そこでは、ポリへドリンプロモーターの表現の制
御の下に、目的とするポリペプチド（ＨＢｓＡｇ）のた
めにコード化したＤＮＡセグメントを含む組換えバキュ
ロウィルスによって構成される表現ベクターにて昆虫若
しくは敏感な昆虫細胞を感染させることが行なわれてい
る。この組換えバキュロウィルスは、それ自身、伝染性
バキュロウィルスＤＮＡを有する昆虫細胞培養物と、Ｈ
Ｂウィルス抗原を示す遺伝子を有するバキュロウィルス
転移プラスミドベクターとのコトランスフェクションに
よって得られるものであり、かかるベクターは、バキュ
ロウィルスポリヘトリン遺伝子のためにコード化された
、しかしポリへドリンプロモーターの制御の下に最初の
５′配列の部位に配置されている。

これら三つの刊行物は、表現ベクターを得るために、異
種遺伝子が詰め込まれた媒体である転換ベクターを用い
る必要があるという共通の態様を有している（その異種
遺伝子は、ヨーロッパ特許出願第０１２７９３９号にお
いては、ベーターインターフェロンのためのものであり
、ヨーロッパ特許出願第（１２２８０３６号や第（１２
６（１０９０号では、ＨＢｓＡｇのための遺伝子である
）。その転換ベクターが詰め込まれる時に、異種遺伝子
は、ウィルス内に移される必要がある。そして、それは
それら特許出願の場合に、コトランスフェクションによ
って成し遂げられ、その後組換えウィルスは、捜し求め
られて分離され、有効であろうとなかろうと、表現ベク
ターを構成することとなる。それら転移及び選択操作は
、長く且つ微妙なものであり、異種配列は、プラスミド
転換（若しくは転移）ベクターによって構成される中間
構造内に詰め込まれ、そしてそれから表現ベクターを得
るためにコトランスフェクション及びそれ故にマーカー
・レスキュー法を用いる必要がある。

また、　　ｒｐＨｙｓｒｃａｔ、　　ＡＮＡ［、ＹＳＩ
Ｓ　　ＯＦ　　ＡＵＴＯＧＲＡＰＩ（ＡＣＡＬＩＦＯＲ
ＮＩＣＡ　ＮＵＣＬＥＡＲＰＯＬＹＨＥＤＲＯ５ＩＳ　
ＶＩＲｔｌＳＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＳ　　ＦＯＲＰＯＬ
ＹＨＥＤＲＩＮ　　ＡＮＤ　　１（１０（１０−Ｍｌｏ
ｏＯｏ−八ＲＷＥＩＧＩＩＴ　ＰＲＯＴＥＩＮｊなる表
題のＳｍ１ｔｈ。

Ｖｌａｃｋ及びＳｕｍｍｅｒｓによる論文にも言及され
るべきである。かかる論文は、ｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆＶｉｒｏｌｏｇｙ　Ｊ　１９８３年１月、第２１５〜
２２５頁に見られ、それら著者は、ＡｃＭＮＰＶポリヘ
トリン（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　
ｖｉｒｕｓＡｕＬｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ）のｍＲＮＡの５′及び３′末端を特定するＤＮＡ
配列の大きさ転写方向及び配備を記述している。このポ
リヘトリンは、ウィルス性封入体の主たる構造的ポリペ
プチドである；この論文においては、ポリヘトリンに匹
敵し得る（大）量において、感染された宿主細胞で生産
される１ＯＫＤａオーダーの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにお
ける低分子量のＡｃＭＮＰＶプロティンの問題がある。

この文献によれば、ＰＩＯプロティンは、ポリヘトリン
のようにＡＣＭＮＰＶの遺伝子であり、感染後２４時間
で、ＡｃＭＮＰＶ感染細胞は、ポリヘトリンやプロティ
ンＰＩＯのための遺伝子が位置するゲノム領域とハイブ
リッドを形成する大量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含む；感
染した細胞に蓄積するそれら二つの遺伝子のｍＲＮＡ及
びプロティンは、昆虫細胞において、それら遺伝子の表
現の制御の理解を与えている。かかる研究は、感染の末
期段階で、ポリヘトリン及びプロティンＰ１０のより好
ましい表現の原因となるＤＮＡ配列をモデルとして用い
て実行されたものである。先に指摘のヨーロッパ特許出
願第０１２７８３９号（ザ・テキサス・ニー・アンド・
エム・ユニバーシティ・システムズ）において、発明者
であるＳｍ１ｔｈやＳｕｍｍｅｒｓは、プラスミドの如
きクローニング媒体内に挿入された遺伝子若しくはその
フラグメント（それ自身、最初はバキュロウィルスＤＮ
Ａ分割によって得られるＤＮＡフラグメントの挿入によ
って修飾され、そしてバキュロウィルス遺伝子若しくは
そのフラグメントを含み、要求される組換えバキュロウ
ィルス転移ベクターを形成している）は、ポリヘトリン
遺伝子か、或いはその断片でポリへドリンプロモーター
を含むものか、又はプロティンＰ１０プロモーターを含
むプロティンＰ１０遺伝子である。ＡｃＭＮＰＶゲノム
におけるポリヘトリン遺伝子やプロティンＰＩＯ遺伝子
のそれぞれの位置は、この特許出願に示されている。ま
た、そこには、選択遺伝子が効果的に部位特定方法にお
いて導入され得る未知の非反復制限部位をＡｃＭＮＰＶ
ゲノムが有しているために、遺伝子転移のための中間媒
体として作用する架空のプラスミドベクター（若しくは
転移ベクター）を構成することが必要であることを述べ
ている。

（発明の目的） 従って、本発明は、転移ベクターの中間段階を通過する
必要なく、得ることの出来る表現ベクターを提供するこ
とを、その目的とするものである。

また、本発明は、実際に、ある配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を負荷し得る、未負荷の表現ベクター（ｕｎ　１ｏａ
ｄｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）を提供し
ようとするものであり、加えて遺伝子操作によってイン
ビトロで直接に異種配列が負荷せしめられ得る表現ベク
ターを提供しようとするものである。

（発明の構成） 本発明は、外来性の遺伝子の表現ベクターとして用いら
れ得る修飾バキュロウィルスを製造するための手法にお
いて、適当な制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉ
ｔｅ）が、転移ベクターの援助に頼らないで、少なくと
も一つのプロティンのための遺伝子の強い後期プロモー
ター（ｓｔｒｏｎｇ　１ａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の
下流で、完全若しくは不完全なバキュロウィルス・ゲノ
ムに直接に挿入され、またかかるプロティンは、バキュ
ロウィルス会合形成体（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）　　（ポリヘ
トリンの如きバキュロウィルスのウィルス性封入物、若
しくはプロティンＰＩＯの如き、ウィルス性封入物以外
のバキュロウィルス会合プロティン）を構成するもので
あり、そしてそのような操作によって、少なくとも一つ
の異種遺伝子の少なくとも一つの配列を受け入れる用意
のある未負荷の表現ベクターであって、その表現が目的
とするものであるものを構成する修飾ウィルスを得るこ
とを特徴とするものである。

そのようなプロティンの遺伝子の中には、特にポリヘト
リンのための遺伝子やプロティンＰＩＯのための遺伝子
がある。

本発明に従う方法の一つの具体例によれば、その表現が
目的とされるものである異種ＤＮＡフラグメントを受け
入れる用意のある未負荷の表現ベクターを構成する修飾
バキュロウィルスを組み立てるために、少なくとも一つ
の所定の酵素のための制限部位を欠くバキュロウィルス
が用いられ、かかる酵素上によく検討された少なくとも
一つの酵素のために少なくとも一つの非反復制限部位が
位置せしめられるのである。

本発明に従う修飾バキュロウィルスを製造する方法の有
利な態様によれば、用いられる所定の酵素のための制限
部位を欠く元の（最初の）バキュロウィルスは、該制限
部位を自然に欠くバキュロウィルスであり、特に例えば
スボドプーラ・フルギパル　　Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　
ｆｒｕ　ｉ　ａｒｄａ　　：　Ｓｆ）の核多角体病バキ
ュロウィルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓ
ｉｓｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　）である。

本発明に従う修飾バキュロウィルスの製造方法に係る他
の有利な具体例によれば、用いられる所定の酵素のため
の制限部位を欠く元のバキュロウィルスは、そのゲノム
に僅かに位置せしめられた（ｐｏｃｙｒｌｙ　５ｉｔｕ
ａｔｅｄ）制限部位が最初は抑圧されている（ｓｕｐｐ
ｒｅｓｓｅｄ）バキュロウィルスである。

修飾バキュロウィルスの製造方法に係る有利な具体例に
よれば、僅かに位置させられた制限部位の抑圧（ｓｕｐ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ）が望まれる場合において、そのよう
な抑圧は考慮された元のバキュロウィルスからのＤＮＡ
とプラスミドとのコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって達成されるものである
。かかるプラスミドには、直線状となるように、酵素に
よって開裂される制限部位を含むＤＮＡフラグメントが
クローニングされ、そしてリンカ−が結紮され、またそ
のような結紮の後、抑圧された制限部位を欠くプラスミ
ドに転換されるのである。このコトランスフェクション
は、そのような部位を欠く組換えウィルスを生み出して
いる。

本発明に従う修飾バキュロウィルスの製造方法に係る他
の有利な具体例によれば、バキュロウィルス会合形成体
を構成する少なくとも一つのプロティンのための遺伝子
の強力な後期プロモーターの下流に、特にバキュロウィ
ルス・ポリヘトリン及び／又はポリペプチドＰＩＯ遺伝
子のためのプロモーターの下流側に所定の酵素のために
制限部位を導入することは、前記強力な後期プロモータ
ーの下流側に位置せしめられた制限部位を含むフラグメ
ントがクローニングされた適当なプラスミドとバキュロ
ウィルス許容細胞の細胞培養物とのコトランスフェクシ
ョンによって、実行される。

このようなコトランスフェクションは、修飾された再結
合ウィルスの形成を導くものである。この再結合ウィル
スは、異種配列が負荷されていない昆虫細胞上へのその
表現を期待して、少なくとも一つの異種配列を受け入れ
る用意のある表現ベクターに対応するものである。

本発明に係る方法の他の有利な具体例によれば、少なく
とも二つの異種ＤＮＡフラグメントを受け入れる用意の
ある未負荷の表現ベクターを構成する修飾バキュロウィ
ルスを組み立てるために、少なくとも二つの同一若しく
は異なる酵素のための少なくとも二つの同一若しくは異
なる制限部位が適当な選択されたバキュロウィルス上に
設けられている。

かかる具体例の有利な変形例によれば、元のバキュロウ
ィルスが、二つの同一若しくは異なる酵素のために二つ
の制限部位を欠く場合において、それら二つの制限部位
は、バキュロウィルス上に設けられることが望まれる第
一の制限部位を含むフラグメントがクローニングされた
第一のプラスミドとのコトランスフェクションによって
、そしてそれから、バキュロウィルス上に設けられるこ
とが望まれる第二の制限部位を含むフラグメントがクロ
ーニングされた第二のプラスミドとのコトランスフェク
ションによって、連続して導入されることとなる。

この具体例の他の有利な変形例によれば、元のバキュロ
ウィルスが、そのゲノムに僅かに位置させられた制限部
位を含む場合において、それら部位は、抑圧されるべき
各々の制限部位を欠くプラスミドとの連続したコトラン
スフェクションによって、連続的に抑圧されることとな
る。

未負荷の表現ベクターとして修飾バキュロウィルスを製
造する方法の有利な具体例によれば、そのベクターは、
バキュロウィルス会合プロティンの遺伝子に近接して設
けられた、或いはこの遺伝子の強い後期プロモーターに
近接して設けられた非反復制限部位を含んでいることに
おいて特徴付けられている。

未負荷の表現ベクターを構成する修飾バキュロウィルス
を製造する方法の他の有利な具体例によれば、このベク
ターは、それぞれ、バキュロウィルス会合プロティンの
ための遺伝子と、この遺伝子の強い後期プロモーターに
近接して設けられた二つの同一若しくは異なる部位を有
していることにおいて特徴付けられる。

本発明は、また、その目的として、バキュロウィルス会
合プロティンのための遺伝子の適当な強い後期プロモー
ターの下流側に配置された非反復制限部位を持つ修飾バ
キュロウィルスを対象とするものであり、そしてそれは
未負荷の表現ベクターを形成するために適当なものであ
る。

未負荷の表現ベクターを構成し得る、そのような修飾バ
キュロウィルスを得るための有利な方法によれば、その
ベクターは、少なくとも一つのバキュロウィルス会合プ
ロティンのための遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）　Ａ　
Ｔ　Ｇに密接して、或いは該遺伝子の強い後期プロモー
ターに密接して設けられた非反復制限部位を有する修飾
バキュロウィルスである。

本発明の修飾バキュロウィルスを得るための他の有利な
方法によれば、それは少なくとも一つのバキュロウィル
ス会合プロティンのための遺伝子のＡＴＣコドンに密接
し、またかかるウィルスの他の強い後期プロモーターに
密接して設けられた少なくとも二つの制限部位を有して
いる。

本発明は、また、その目的として、上記に定義された修
飾バキュロウィルスによって構成される未負荷の遺伝子
−表現ベクターを存するものである。

本発明は、更に、その目的として、少なくとも一つの異
種配列を有する未負荷の表現ベクターに負荷を与えるた
めの方法を有するものであり、そのような方法は少なく
とも一つの異種配列が、遺伝子操作によって、インビト
ロで、前記表現ベクター内に直接的に導入されることを
特徴としている。

かかる負荷プロセスの一つの具体例によれば、少なくと
も一つの異種配列は、最初は未負荷の表現ベクターを構
成する修飾されたウィルスのゲノム内に直接に導入され
るものである。

かかる具体例の有利な変形例によれば、ウィルスのゲノ
ムは、少なくとも一つの異種配列の直接の導入の前に、
制限酵素の作用によって、先ず、直線状とされる。

かかる負荷プロセスの他の有利な具体例にょれば、異種
ＤＮＡフラグメントは、前記未負荷の表現ベクターの第
一の制限部位内に直接に導入され、それから該第一のも
のと同一若しくはそれとは異なる第二のＤＮＡフラグメ
ントが直接に該表現ベクターの第二の制限部位に導入さ
れ、そしてその二つの制限部位が、共に異なる酵素のた
めの非反復制限部位となるものである。

かかる負荷プロセスの他の有利な具体例によれば、同一
若しくは異なる異種ＤＮＡフラグメントは、非反復制限
部位に負荷せしめられる。即ち、それら制限部位は、一
つの同一の酵素に対して二つの異なる制限部位が存在す
るとして定義されるものであり、前記未負荷の表現ベク
ターの部分的な消化（ｐａｒｔｉａｌ　ｄｉｇｅｓｔｉ
ｏｎ）によって部位（ｓｉｔｅ）を開き、その中に第一
のＤＮＡフラグメントがそれから導入され、また前記ベ
クターは、第二の部分的消化に晒されて、前者と同一の
第二の部位（ｓｉｔｅ）を開口せしめ、その中に第二の
ＤＮＡフラグメントが負荷せしめられるのである。

本発明は、また、その目的として、負荷されたウィルス
を有するものであり、それは少なくとも一つの異種ＤＮ
Ａ配列（その表現は目的とするものである）が直接にイ
ンビトロで導入される、最初は未負荷の表現ベクターを
構成する修飾バキュロウィルスによって形成されている
ことを特徴とするものである。

さらに、本発明は、その目的として、上記で定義された
ような負荷ウィルスを用いることを特徴とする異種遺伝
子の表現のための方法を有するものである。

本発明に従う表現ベクターは、前記配列が特定の制限部
位を含まないという条件で、実質的に他の配列で負荷さ
れ得るものである。

その結果として、本発明に従う表現ベクターは、原核プ
ロティンや真核プロティンの如きプロティンのためにコ
ード化される全ての遺伝子、生合成遺伝子のためにコー
ド化される全ての配列、ウィルスのプロティン抗原及び
、特に非制限実施例として、無を推動物やを推動物のア
セチルコリンエステラーゼのための遺伝子を表現するた
めに用いられ得るものである。

前記引用した刊行物、特に先述のヨーロッパ特許出願は
、ベーターインターフェロンのための遺伝子がもしそれ
が遺伝子Ｐｎ上で最初のＡＴＧコドンの上流側の、即ち
このＡＴＧコドンに近接した幾つかのヌクレオチドに挿
入されるならば、−層存効に発現されることを述べてい
る。また、それらは、得られた組換えベクタープラスミ
ドが、例えば転写出発部位の下流側、即ち挿入ベクター
における野性型ＡＴＣコドン位置の上流側の約１０ヌク
レオチドの位置する非反復ＢａｍＨ１部位を有するポリ
へドリンプロモーター領域を含んでいることを述べてい
る。換言すれば、今日の技術状態では、限定されたバキ
ュロウィルスプロモーターの下流側の位置に非反復クロ
ーニング部位を有し、ウィルスのゲノムの相同配列によ
って側面に位置させられたクローニングベクターの構成
が提案されており、その挿入によって相同組換え（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ、ｔｉｏｎ）が
行なわれているのである。

この知識は、本発明において未負荷の表現ベクターの製
造に適用される。

転移ベクターへの依存を避けることについての本発明に
よって提供される可能性は、異種プロティンを表現する
ことの出来る負荷組換えバキュロウィルスを得るための
方法を相当に単純化する二本当に、転移ベクターを必然
的に含むプロセスでは、負荷組換えバキュロウィルスの
製造のために、数週間を要するものであるが、本発明の
プロセスでは、負荷バキュロウィルスを２，３日で得る
ことが出来るのである。

上記の如き特性の他にも、本発明は、以下の記述から明
らかなる特性を更に含むものである。

（実施例） 以下に、本発明によってカバーされるプロセスの幾つか
の実施例を挙げ、更に詳しく説明するが、そのような記
述を参照することによって、本発明はより良く理解され
るであろう。しかしながら、それら実施例は、本発明の
詳細な説明するためにのみ提供されたものであり、それ
らが本発明を何等限定するものでないことが、明瞭に理
解されねばならない。

未負荷の表現ベクター、即ち異種配列を受け入れる用意
のある修飾バキュロウィルスを組み立てるために、所定
の酵素のための制限部位を欠くノ＼キュロウイルスが選
択された；これは、例外的であり、しかしＳｍａ　Ｉ制
限部位を有しない入水上ブチ−・フルギペル゛　Ｓ　ｏ
ｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ）の核多角体病
のバキュロウィルスを用いたケースである。

一つ若しくはそれ以上の不充分に位置させられた制限部
位は、またバキュロウィルスのゲノムにおいて抑圧され
得るものである：スポドプテー・トー１ス　Ｓ　ｏｄｏ
　ｔｅｒａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓの核多角体病のバキ
ュロウィルスのＰｓｔ−１−Ｇフラグメント内に位置せ
しめられた一つのＳｍａ　Ｉ部位は、特に以下の手法に
よって抑圧された： ＦＡＴ１５３タイプのプラスミドにクローニングされた
ＳＩＭＮＰＶのＰｓＬ−１−Ｇフラグメントは、Ｓｍａ
　Ｉで切断され、リンカ−ＫｐｎＩが線状とされたプラ
スミドに連結された。この連結の後の形質転換によって
得られたＳｍａ　１部位のないプラスミドは、Ｓｍａ　
Ｉ部位を欠く組換えウィルスを得るために、元のＳＩＭ
ＮＰＶとコトランスフェクションされた。組換えウィル
スは、このコトランスフェクションの後に得られたウィ
ルスの子孫から選択された。元のウィルスに比較して、
それらウィルスは、Ｓｍａ　Ｉ部位をなくし、即ち、最
早、Ｓｍａ　１部位を有するものではなくなり、Ｋｐｎ
１部位を有するものであり、それ故に全体で７＋１＝８
Ｋｐｎ１部位を有するものとなった。次のような工程が
、それら組換えウィルスを選択するために使用された：
トランスフェクションされたキャタピラ−の死の後に取
り入れられたポリへドラ（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ）は、新
たなトランスフェクションに供されるＤＮＡのソースで
ある。

この新たなトランスフェクションの前にＤＮＡはＳｍａ
　Ｉで切断された。この処理は、それらのゲノムが開い
ているので、元のウィルスの増殖を抑圧する効果を有し
、それで組換えウィルスの増殖のみを許容する。これを
基礎とするウィルスの増殖の数回のサイクルが、Ｓｍａ
　ｒによる切断を最初に免れた元のウィルスの子孫を排
除するために必要とされる場合がある。

この僅かに位置せしめられたＳｍａ　Ｉ制限部位を抑圧
するプロセスが、添付の第１図に示されている。

非反復部位（ＳｍａＩ若しくはその他のもの）は、ポリ
ヘトリン（若しくはＰＩＯ）のための遺伝子の最初のコ
ドンであるＡＴＧ領域に置かれなければならない。この
部位がＡＴＣ前に置かれると、それはそれ自身のＡＴＧ
の制御の下に異種遺伝子の表現を許容する（負荷部位の
位置はＡＴＣの上流側、即ちＡ　Ｔ　Ｇの５′サイド上
にあると言われる）。これは、尤も共通した望ましい位
置である。かかる部位が、ＡＴＧの後に（ＡＴＧの下流
側に、即ちこのＡＴＧの３′サイド上に）位置せしめら
れると、その状況は、所謂融合プロティンの製造を許容
する。ポリヘトリンＡＴＧの制御の下に、かかる融合プ
ロティンは、Ｎ一端末部分においてポリヘトリン配列に
対応するアミノ酸や、Ｃ一端末部分において融合異種配
列に対応するアミノ酸を含む。前記部位が設けられた領
域は、単なる例示として−Ｉｏｎから＋Ｉｏｎまで延び
ることの出来るものである。ＡＴＧのＡを＋１として数
え、またＴを＋２として、更にＧを＋３として数えるこ
とは、従来のとおりである。ＡＴＣ前のベースは、マイ
ナス符号（−）で番号が付けられる；Ａよりも先にくる
ベースは−１、などと番号が付けられるのである。

Ｓｍａ　Ｉの選択は、バキュロウィルスにおけるＳｍａ
Ｉ部位の相対的な希薄性（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｒａｒｉ
ｔｙ）によって左右される。ウィルスＤＮＡがプラント
末端の製造にて、このエンドヌクレアーゼＳｍａＩ認識
部位で切断されるという事実は、かかるプランド末端が
異種配列のための一般的な入口を構成するところから、
確かに利点のあることである。

この利点は、その選択において決定的要素ではない。ス
タート時では、そのようでないそれらの末端を鈍らせる
のが通常であるがらである。プロモーターの下流側に適
当に位置せしめられた非反復制限部位を認識し得る制限
エンドヌクレアーゼは、負荷された遺伝子の表現のため
の異種配列の導入を時々それらの末端の僅かな修飾部位
で許容する。

本発明に従って、Ｓｍａ　Ｉ制限部位を欠くウィルス上
に、例えば実施例１に従って処理されたスポドプテー・
フルギペル゛若しくは久±ヱ１孟旦ニュ上ｉニスのＮＰ
Ｖ上にポリヘトリン遺伝子プロモーター（プロティンＰ
ＩＯのものの如き、その他の強い後期プロモーター）の
下流側のＳｍａ１部位（ウィルスのゲノムのための非反
復部位を与える）を設けることが必要である。最良位置
へのＳｍａ　１部位の設置は、ポリヘトリン遺伝子配列
が先ず確立されること（特に、プロモーター領域）を前
提としている。このＳｍａ　ｒ部位を取り付けるには、
ゲノムにポリヘトリン遺伝子の制限された部分において
開口せしめられることを認める非反復制限部位を利用す
ることが必要である。

この非反復部位は、全ウィルスにおいて稀なものである
。この非反復部位の発見の可能性は、配列の大きさが小
さくなると増大する。

かかる導入は、幾つかの方法によって行なわれ得るもの
である。その中で挙げることの出来るのは、非反復部位
の創成を伴なう管理された突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ
　ｍｕｔａｔｉｏｎ）であり、それらの部位にＳｍａｌ
リンカ−の導入が行なわれるのである。

また、他の方法は、５ａｃｌ部位でウィルス配列の開裂
を伴なうＢａ１３１−誘起欠失を惹起せしめることであ
る。プラスミドのポリリンカーにおいて、第二の５ａｃ
ｌ部位が存在するので、Ｂａ１３１による消化に先立っ
て、かかる５ａｃｌ部位をポリリンカーから抑圧するこ
とが必要である。

ポリリンカーは、当初は、次のような組成を有している
：ＥｃｏＲＩ；５ａｃｌ；Ｋｐｎｌ；Ｓｍ　ａ　Ｉ　；
　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　；　Ｘ　ｂ　ａ　Ｔ　＋　Ｓ　ａ
　ｌ　Ｉ　；　Ｐ　ｓｔ　Ｉ　；Ｓｐｈ　Ｉ　；Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ。

ｐＵｃ１９におけるＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをクロ
ーニングした後、制御された欠失がＥｘｏｌＩ［Ｍｕｎ
ｇビーン・システムを用いて行なわれた。

封鎖部位は、ポリリンカー５′領域に含まれるＰｓｔＩ
部位であり、また消化部位は、ポリリンカーとＨｉｎｄ
ｌＩ［−にフラグメントのＸｂａ　１部位との間に位置
するＨｐａ１部位である。この欠失は、一方では、Ｐｓ
ｔＩとＨｐａｌとの間に含まれるセグメントの消滅を導
き、他方では、同様なＨｐａ１部位とウィルスＸｂａ　
１部位との間に含まれるセグメントの消滅を導く。

かかる欠失されたプラスミドは、ウィルスの配列のＸｂ
ａ　１部位の周りで後から欠失されるプラスミドの直接
的な配列のために（単に、必需品の理由のために）、準
備される。この段階で、ポリリンカーは次のような組成
を有している：Ｅｃ。

ＲＩ；５ａｃｌ；ＫｐｎＴ；ＳｍａＩ；ＢａｍＨｌ　；
Ｘｂａ　Ｉ　；５ａＩＩ、そして３′での第一の重要な
ウィルス部位はＸｂａｌである。

それからポリリンカーの５ａｃｌ部位は、二重のＢｅ　
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化によって脱離され、ＸｂａＩ及
びＳａｎ部位のみを有するポリリンカーを形成する。こ
の方法において、５ａｃｌ部位の周りを取り除き、且つ
その取り除いた場所にそのプラスミドにおいて非反復と
なるＳｍａ　Ｉリン、カーを取り付けることが可能であ
る。Ｓｍａ　１部位の位置はＸｂａ　ＩがＡＴＣのＡに
対して−４０に位置しているところから、−３０〜＋３
０の間になければならない。

プラスミドｐ１３．２１Ｘｓｓは、Ｓ、　］１ｔｔｏｒ
ａＮｓ細胞培養物上でコトランスフェクションされ、そ
して異種配列で負荷さていない表現ベクターに対応する
組み換えられたウィルスが［ＰマイナスＪ表現型によっ
て見い出される。この表現型は、ポリへドラがプラーク
法において見い出され得ない伝染性フォーカスの原因と
なるウィルスのそれである。

このＳｍａ　Ｉ制限部位を取り付けるためのプロセスが
、添付の第２図に示されている。

ＩＡＴＧの　上゛　への　　　　の 旦 表現ベクターの構成におけるこのステップは、本発明に
従って修飾されたバキュロウィルス、即ち例えば−４位
置に配置された非反復部位を有するウィルス（かかる数
字の付は方は、いつもポリヘトリン遺伝子の最初のＡＴ
ＧのＡに対して＋１となっている）を具備することを前
提条件としている。かかる修飾ウィルスは、Ｂａ　１３
１が消化する５ａｃｌ部位が＋１４０に位置せしめられ
ているところから、実際には、−３から約＋２８０の間
に延びるベースから切除されている。ベクターの調整は
、表現され得る異種配列の調整を引き受けるものである
。

ルコリンエステラーゼ配列。

この表現されるべき配列は、Ｄ、　ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅのた
めのプラスミドｐＥＭＢ　　Ｌ−Ａ　　ｃ　　ｈ　　ｅ
　　（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　　ＩＮＲ
Ａ＋　　八ｎｔｉｂｅｓによって得られたプラスミドｐ
Ｅ６）の複製形態から得られる。この配列は、Ｈａｌｌ
及びＳｐｉｅｒｅｒ（ＥＭＢＯＪ、、　１９８６．第２
９５２頁）によって最初に発表され、３４８１の長いベ
ースである。＋８６９から＋３４８１に延びるＮｒｕＩ
−３ａｃＩセグメントは、ｐＵｃ１９においてＳｍａｌ
−３ａｃｌに対して注意深くサブクローニングされ得る
ものである。Ｎｒｕｌは、この遺伝子のＡＴＧの上流側
でアセチルコリンエステラーゼ遺伝子１２７ベースを開
裂する。＋９２１での非配列ＡａｔｌＩ部位は、全Ａｃ
ｈｅ遺伝子を含むＡａｔ■−３ａｃ■フラグメントの回
復を許容する（即ち、７２ベースのリーダー配列、１９
４７ベースのＯＲＦ及び＋３０５０でのポリアゾニレ−
ジョン信号を存する２４１ベースの３′配列）。

アンカーリング・テイル（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　ｔａｉ
ｌ）のために、コード化した配列の存在を避けるために
、またアセチルコリンエステラーゼの精製をより容易と
為すために、Ａａ　ｔ　ＩＩ−Ｘｍｎ　Ｉセグメント（
＋９２１〜＋２８５６）を使用することは極めて有益で
ある。このセグメントは、ショウジヨウバエのＡｃｈｅ
遺伝子の下流側に６４９から離れた２８アミノ酸の截頭
型プロティンを与えるものである。この組合せの結果は
、３′位置で融合したプロティンに導くこととなる。こ
の融合したプロティンの本質はＢａ１３１ｇ￥；起欠失
にて得られた残渣に依存している。Ａｃｈｅの後期コド
ン及びＧＧＧコドン（Ｓｍａ　Ｉ半部位である）によっ
て形成されたＡＣＴＧＧＧ配列の後に、融合プロティン
がポリヘトリンの約１２０アミノ酸を含んでいる良好な
読出しフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）におけ
るポリヘトリン遺伝子のベースが続いているか、或いは
約３０コドンの後に現れる停止コドンを有する乏しい読
出しフレームにおけるベースが続いている。

Ｓｍａ　１部位で修飾ウィルス内に挿入されるべき二重
に寄り合わされたＤ’ＮＡの端部が、もし必要ならば、
部位５ａｃｌ及びＡａｔＩＩのためのＭｕｎｇ　−ｂｅ
ａｎの作用によって鈍感とされる。

５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　１ｉｔｔｏｒａｌｉｓ細胞のト
ランスフェクションの後、アセチルコリンエステラーゼ
活性が怒染後４８時間で分離されたｘｉ胞から取り出さ
れ、そしてアセチルコリンエステラーゼを生産するため
に、更に４８時間維持された上澄み液及び／又はホモジ
ネートについて連続して測定される。

高い酵素作用を有するバッチは、制限稀釈によってクロ
ーニングされる。正のクローンの存在は、ｐＵｃ−Ａｃ
ｈｅプローブを有する雑種形成によって探索される。

先の実施例のように、本実施例でも、修飾バキュロウィ
ルスの存在は当然のことである。このケースにおいては
、５ａｃｌ部位からＢａ　１３１によって生じた欠失は
、ＡＴＧを免じるものである。

カサダバン・プラスミドｐＭｃ１８７１　（ファルマシ
ア社から販売されているプラスミド）のＳｍａｌ−３ａ
Ｉ！フラグメント力側ｕｎｇ　−ｂｅａｎによるＳａｎ
末端の修飾の後、形質転換されたＳｍａ　１部位内に挿
入される。

この組立ては、以下の構造を示している＝（・　・　・
・ポリへドリンプロモーター・・ＡＴＧ　　ＴＡＴ・・
　〈・・・ＧＧＧ　　ＧＡＴＣＣＣＧＴＣ−−・・Ｌａ
ｃｚ・・・ＡＡＡ　　ＴＡＡ　　ＴＡＡ　　ＴＡＡ　　
ＣＣＧ　　ＧＧＣＡＧＧ　　ＧＧＣＧＡＴ　　ＣＣＧ・
〉　・・・ポリヘトリンＯＲＦの３′末端 かかる構造を有する組換えウィルスは、Ｘ−ｇａｌを用
いたそれらの青色着色によって、細胞培養物中において
認められる。

上記したところより明らかなように、本発明は、より明
確且つ具体的な形態において、上記されたそれら操作方
法、具体例、適用例のみに限定されるものではなく、本
発明の範囲と趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の
知識に基づき、各種の変形を加えることが出来るもので
あり、本発明がそのような変形例をも含むものであるこ
とが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、実施例１及び実施例２
の操作を示すフローチャートである。 出願人　アンスティテユ・ナショナール・ドウ・う・ル
シェルシュ・アグロミーク アイエヌアールエー サントル・ナショナール・ドウ・う・ルシェルシュ・シ
アンティフィーク ーシーエヌアールエス 同

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）外来性の遺伝子のために、表現ベクターとして用
   いられ得る修飾バキュロウイルスを製造する方法にして
   、適当な制限フラグメントが、ポリヘドリンの如きバキ
   ュロウイルス会合形成体又はプロテインＰ１０の如きウ
   ィルス封入物よりも他のバキュロウイルス会合プロテイ
   ンを構成するプロテイン類の少なくとも一つのための遺
   伝子の強い後期プロモーターのコントロールの下に、転
   移ベクターの援助に頼らないで、バキュロウイルスの完
   全な若しくは不完全なゲノム内に直接的に挿入され、そ
   の表現が目的とされるものである少なくとも一つの異種
   遺伝子の少なくとも一つの配列を受け入れる用意のある
   未負荷の表現ベクターを構成する修飾ウィルスを得るこ
   とを特徴とする方法。
2. （２）その表現が目的とされるものである異種ＤＮＡフ
   ラグメントを受け入れる用意のある未負荷の表現ベクタ
   ーを構成する修飾バキュロウイルスを組み立てるために
   、少なくとも一つの所定の酵素のための制限部位を欠く
   バキュロウイルスが用いられ、その上に少なくとも一つ
   の問題の酵素のために少なくとも一つの非反復制限部位
   が設けられることを特徴とする請求項（１）に従う方法
   。
3. （３）少なくとも一つの所定の酵素のための制限部位を
   欠く、用いられる最初のバキュロウイルスは、該制限部
   位を自然に欠くバキュロウイルス、特にスポドプテラ・
   フルギパルダ（Ｓｆ）核多角体病のバキュロウイルスの
   如きものであることを特徴とする請求項（２）に従う方
   法。
4. （４）少なくとも一つの所定の酵素のための制限部位欠
   く、用いられる最初のバキュロウイルスは、そのゲノム
   に僅かに位置せしめられた制限部位が最初に抑圧されて
   いるバキュロウイルスであることを特徴とする請求項（
   ２）に従う方法。
5. （５）僅かに位置させられた制限部位が抑圧されるべき
   である場合において、そのような抑圧が考慮された元の
   バキュロウイルスのＤＮＡとプラスミドとのコトランス
   フェクションによって得られるものであり、またかかる
   プラスミドは、その中にかかる制限部位を含むＤＮＡフ
   ラグメントがクローニングされており、また線状となる
   ように酵素によって開裂されており、更にリンカーが連
   結されたものであり、更にまたその連結の後、抑圧され
   るべき制限部位を欠くプラスミドに転換されるものであ
   り、そして該コトランスフェクションが、そのような部
   位を欠く組換えウィルスを生み出していることを特徴と
   する請求項（４）に従う方法。
6. （６）バキュロウイルス会合形成体を構成するプロテイ
   ン類の少なくとも一つのための遺伝子の強い後期プロモ
   ーターの下流側に、特にバキュロウイルス・ポリヘドリ
   ン若しくはプロテインＰ１０遺伝子のためのプロモータ
   ーの下流側に、所定の酵素のための制限部位を導入する
   ことが、任意のバキュロウイルス細胞の細胞培養物と、
   該強い後期プロモーターの下流側に配置された制限部位
   を含むフラグメントがクローニングされてなる適当なプ
   ラスミドとのコトランスフェクションによって行なわれ
   、そしてこのコトランスフェクションが、昆虫細胞にお
   けるその表現を期待して、異種配列を受け入れる用意の
   ある未負荷の異種配列表現ベクターに対応する修飾され
   た組換えウィルスの形成を導くものであることを特徴と
   する請求項（１）に従う方法。
7. （７）少なくとも二つの異種ＤＮＡフラグメントを受け
   入れる用意があり、その表現が目的とするものである未
   負荷の表現ベクターを構成する修飾バキュロウイルスを
   組み立てるために、少なくとも二つの同一若しくは異な
   る酵素のための少なくとも二つの制限部位が、適当な選
   択されたバキュロウイルス上に設置されることを特徴と
   する請求項（１）に従う方法。
8. （８）最初のバキュロウイルスが、二つの同一若しくは
   異なる酵素のための二つの制限部位を欠く場合において
   、それら二つの制限部位が、該バキュロウイルスに設置
   されることが望まれる第一の制限部位を含むフラグメン
   トがクローニングされた第一のプラスミドとのコトラン
   スフェクションによって、そしてそれから該バキュロウ
   イルス上に設置されることが望まれる第二の制限部位を
   含むフラグメントがクローニングされてなる第二のプラ
   スミドとのコトランスフェクションによって、連続して
   導入されるものであることを特徴とする請求項（７）に
   従う方法。
9. （９）最初のバキュロウイルスが、そのゲノムに僅かに
   位置させられた制限部位を含む場合において、それら部
   位が抑圧されるべき各々の制限部位を欠くプラスミドと
   のそれぞれのコトランスフェクションによって、連続的
   に抑圧されていることを特徴とする請求項（７）に従う
   方法。
10. （１０）バキュロウイルス会合プロテインの遺伝子に近
    接して設けられた或いはこの遺伝子の強い後期プロモー
    ターに近接して設けられた非反復制限部位を含んでいる
    ことを特徴とする請求項（１）に従う方法。
11. （１１）バキュロウイルス会合プロテインの遺伝子に近
    接し、またこの遺伝子の強い後期プロモーターに近接し
    て、それぞれ設けられた二つの同一若しくは異なる部位
    を含んでいることを特徴とする請求項（１）に従う方法
    。
12. （１２）バキュロウイルス会合プロテインの少なくとも
    一つのための遺伝子の強い後期プロモーターの下流側に
    設けられた非反復制限部位を含み、かかるバキュロウイ
    ルスが未負荷の表現ベクターを構成し得るものであるこ
    とを特徴とする修飾バキュロウイルス。
13. （１３）少なくとも一つのバキュロウイルス会合プロテ
    インのための遺伝子のＡＴＧコドン若しくはその遺伝子
    の強い後期プロモーターに近接して設けられた制限部位
    を含む修飾バキュロウイルスによって構成されているこ
    とを特徴とする請求項（１２）に従う修飾バキュロウイ
    ルス。
14. （１４）少なくとも一つのバキュロウイルス会合プロテ
    インのための遺伝子のＡＴＧコドン及びかかるウィルス
    の強い後期プロモーターにそれぞれ近接して設けられた
    、少なくとも二つの制限部位を有することを特徴とする
    修飾バキュロウイルス。
15. （１５）前記請求項（１２）乃至（１４）の何れかに従
    う修飾バキュロウイルスによって構成されていることを
    特徴とする未負荷の遺伝子表現ベクター。
16. （１６）少なくとも一つの異種配列が、遺伝子操作によ
    ってインビトロで表現ベクター内に直接に導入されるこ
    とを特徴とする、少なくとも一つの異種配列にて未負荷
    の表現ベクターを負荷するための方法。
17. （１７）少なくとも一つの異種配列が、前記請求項（１
    ５）に従う最初は未負荷の表現ベクターを構成する修飾
    ウイルスゲノム内に、直接に導入されることを特徴とす
    る請求項（１６）に従う負荷方法。
18. （１８）少なくとも一つの異種配列を直接に導入するた
    めに、ウィルスのゲノムが、最初に制限酵素の作用によ
    って線状化されることを特徴とする請求項（１７）に従
    う負荷方法。
19. （１９）異種のＤＮＡフラグメントが、前記未負荷の表
    現ベクターの第一の制限部位に直接的に導入され、そし
    てそれから該第一のものと同一若しくはそれとは異なる
    第二のＤＮＡフラグメントが、前記表現ベクターの第二
    の制限部位に直接的に導入され、それら二つの制限部位
    の両方が異なる酵素のための非反復制限部位となること
    を特徴とする請求項（１６）乃至（１８）の何れかに従
    う負荷方法。
20. （２０）同一若しくは異なる異種のＤＮＡフラグメント
    が、非反復制限部位（即ち、同一の酵素のための二つの
    異なる制限部位であるとして定義される）に一つの部位
    を開くべく、前記未負荷の表現ベクターの部分的な消化
    によって負荷され、その後、かかる部位に第一のＤＮＡ
    フラグメントが導入され、更に前記ベクターが、該第一
    のものと同一の第二の非反復部位を開くために、第二の
    部分的な消化に晒され、かかる第二の部位内に第二のＤ
    ＮＡフラグメントが負荷されることを特徴とする請求項
    （１６）乃至（１８）の何れかに従う負荷方法。
21. （２１）少なくとも一つの異種ＤＮＡ配列が、インビト
    ロで直接的に挿入された、その表現が目的とするもので
    ある、最初は未負荷の表現ベクターを構成する修飾バキ
    ュロウイルスによって、形成されていることを特徴とす
    る負荷ウィルス。
22. （２２）前記請求項（２１）に従う負荷ウィルスを用い
    ることを特徴とする異種遺伝子の表現のための方法。