FR2724393A1 - Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant humanise a partir d'un anticorps monoclonal murin, sa production en cellules d'insecte, et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
L'invention est relative à l'humanisation des domaines variables d'une immunoglobuline non-humaine, par sélection de séquences d'ADN codant pour les domaines variables d'une immunoglobuline humaine dont la séquence en acides aminés des régions de charpente des domaines variables VH et VL présente entre 70 et 95% d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions de charpente des domaines variables VH et VL de l'immunoglobuline non-humaine, et dont les boucles hypervariables H1 et H2 ou L1, L2 et L3 présentent respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables H1 et H2 ou L1, L2 et L3 de l'immunoglobuline non-humaine, et remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de l'immunoglobuline humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de l'immunoglobuline non-humaine. L'invention est également relative au clonage dans un baculovirus, de fragments d'ADN qui codent pour lesdits domaines variables humanisés, et à l'expression d'un anticorps recombinant humanisé obtenu de la sorte. L'anticorps monoclonal murin K20 a été ainsi humanisé et exprimé conformément à l'invention.
Description
OBTENTION D'UN ANTICORPS MONOCLONAL RECOMBINAWT SUKANIgC
A PARTIR D'UN ANTICORPS MONOCLONAL NWRIN , SA PRODUCTION EN CELLULES D'INSECTE, ET SES UTILISATIONS.
A PARTIR D'UN ANTICORPS MONOCLONAL NWRIN , SA PRODUCTION EN CELLULES D'INSECTE, ET SES UTILISATIONS.
La présente Invention est relative à l'obtention en cellules d'insecte, d'un anticorps monoclonal recombinant humanisé.
L'anticorps monoclonal K20 est un anticorps murin qui reconnait la sous-unité B1 (CD29) des intégrines. Des expérimentations in vitro ont montré que
K20 pouvait inhiber l'activation et la prolifération des lymphocytes T périphériques induite par un anticorps anti-CD3 [GROUX et al., Nature, 339, 152-154 (1989)
TICCHIONI et al., J.Immunol., 151, 119-127 (1993)] . Il pourrait donc être envisagé d'utiliser cet anticorps dans le cadre d'une thérapeutique immunosuppressive.
K20 pouvait inhiber l'activation et la prolifération des lymphocytes T périphériques induite par un anticorps anti-CD3 [GROUX et al., Nature, 339, 152-154 (1989)
TICCHIONI et al., J.Immunol., 151, 119-127 (1993)] . Il pourrait donc être envisagé d'utiliser cet anticorps dans le cadre d'une thérapeutique immunosuppressive.
Cependant, l'utilisation d'anticorps murins en thérapeutique humaine est très limitée, car les injections répétées d'anticorps non-humains induisent chez les patients une réponse immune qui empêche un traitement au long-cours.
Afin d'éviter cet inconvénient il a été proposé de fabriquer par génie génétique des anticorps recombinants, dans lesquelles la plus grande partie possible de la molécule est dérivée d'un gène d'origine humaine.
Il a ainsi été obtenu des anticorps dits chimériques, dans lesquels seuls les parties variables sont d'origine non-humaine.
Pour réduire encore les risques de réponse immune, on cherche actuellement de plus en plus à obtenir des anticorps dits humanisés, dont les séquences des parties variables non directement impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont remplacées par des séquences d'origine humaine.
L'humanisation d'un anticorps non-humain implique donc de déterminer avec le plus de précision possible quels sont les résidus d'acides aminés de l'anticorps non-humain qui sont impliqués dans la reconnaissance de l'antigène (et qui doivent être conservés dans l'anticorps humanisé), et quels sont ceux qui au contraire, peuvent être remplacés pour reproduire les séquences d'un anticorps humain, sans affecter ou en affectant le moins possible, la reconnaissance de 1 'antigène.
La reconnaissance de l'antigène implique en particulier les régions des parties variables dénommées
CDR (régions déterminant la complémentarité), mais il a également été constaté que le positionnement de certains résidus d'acides aminés des régions de charpente (régions
FR) pouvaient également influencer la conformation du site antigénique.
CDR (régions déterminant la complémentarité), mais il a également été constaté que le positionnement de certains résidus d'acides aminés des régions de charpente (régions
FR) pouvaient également influencer la conformation du site antigénique.
La présente Invention a pour but l'humanisation de l'anticorps murin K20, et l'expression de l'anticorps humanisé ainsi obtenu dans un système vecteur/hôte approprié.
Pour humaniser l'anticorps K20, la séquence en acides aminés des régions variables VH et VL de cet anticorps a tout d'abord été déterminée, ce qui permet de localiser les CDR. Classiquement, en effet, l'humanisation d'un anticorps s'effectue en greffant ses
CDR à la place des CDR d'un anticorps humain.
CDR à la place des CDR d'un anticorps humain.
Les Inventeurs ont eu l'idée de déterminer en outre, à partir de la séquence des régions variables de
K20, le type de structure canonique des boucles hypervariables L1, L2, L3, H1 et H2.
K20, le type de structure canonique des boucles hypervariables L1, L2, L3, H1 et H2.
Les structures canoniques, qui ont été observées pour la plupart des boucles hypervariables < à l'exception de la boucle H3), et qui sont conservées entre différentes espèces, sont déterminées par un petit nombre de résidus clés des régions FR et des CDR différents types de structures canoniques ont été définis, selon la taille de la boucle, et la nature des résidus acides aminés qu'elle comprend [CHOTIA et LESK,
J. Mol.Biol., 196(4), p 901, (1987) ; CHOTIA et al.,
Nature, 342, p 877, (1989) ; CHOTIA et al., J.
J. Mol.Biol., 196(4), p 901, (1987) ; CHOTIA et al.,
Nature, 342, p 877, (1989) ; CHOTIA et al., J.
Mol.Biol.,227(3), p799, (1992)].
Les Inventeurs ont ensuite sélectionné des régions VH et VL humaines dont la séquence en acides aminés présente une forte homologie (de préférence entre 74 et 95 % d'homologie) avec la séquence des régions VH et VL de l'anticorps murin K20, et dont les boucles hypervariables L1, L2, L3, H1 et H2 présentent le même type de structure canonique que les boucles hypervariables correspondantes dudit anticorps murin.
Dans les régions VH et VL humaines ainsi sélectionnées, les Inventeurs ont alors procédé au remplacement des CDR par les CDR correspondantes de l'anticorps murin K20, afin d'obtenir les régions VH et
VL de 1 'anticorps humanise.
VL de 1 'anticorps humanise.
Le procédé décrit ci-dessus peut être généralisé à l'humanisation des régions variables de tout anticorps monoclonal d'origine non-humaine, en particulier d'origine murine.
La présente Invention a pour objet un procédé d'humanisation de la région variable VH et/ou de la région variable VL d'une immunoglobuline non-humaine, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes
- une étape où l'on sélectionne une séquence d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'une immunoglobuline humaine, la séquence en acides aminés des régions FR de ladite région VH ou de ladite région VL humaine présentant respectivement entre 70 et 95 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions FR de la région VH ou de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine, et les boucles hypervariables H1 et H2 de ladite région VH humaine ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de ladite région
VL humaine présentant respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables H1 et
H2 de la région VH ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine
- une étape où l'on procède au remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de ladite région VH ou VL humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de la région VH ou VL de l'immunoglobuline non-humaine. A l'issue de cette étape, on obtient une séquence codant pour la région VH ou VL de l'immunoglobuline humanisée.
- une étape où l'on sélectionne une séquence d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'une immunoglobuline humaine, la séquence en acides aminés des régions FR de ladite région VH ou de ladite région VL humaine présentant respectivement entre 70 et 95 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions FR de la région VH ou de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine, et les boucles hypervariables H1 et H2 de ladite région VH humaine ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de ladite région
VL humaine présentant respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables H1 et
H2 de la région VH ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine
- une étape où l'on procède au remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de ladite région VH ou VL humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de la région VH ou VL de l'immunoglobuline non-humaine. A l'issue de cette étape, on obtient une séquence codant pour la région VH ou VL de l'immunoglobuline humanisée.
Le procédé conforme à l'invention peut être complété par la mutation ponctuelle (remplacement, addition ou délétion d'un codon) d'une ou plusieurs séquences oligonucléotidiques codant pour un ou plusieurs acides aminés situés dans les FR de la région VH ou VL.
Une telle mutation peut par exemple être effectuée dans le cas où la séquence en acides aminés de la région VH ou de la région VL humaine qui a été sélectionnée pour son homologie avec la région VH ou VL non-humaine, présente, à une position déterminée, un acide aminé "inhabituel n pour le sous-groupe de variabilité auquel elle appartient. Il peut être alors opportun de remplacer cet acide aminé par un acide aminé plus représentatif. De manière générale, on cherchera à se rapprocher autant que possible des séquences consensus des FRs du sous-groupe humain le plus homologue, afin de réduire encore l'immunogénicité de l'anticorps humanisé.
Il peut également être indiqué de procéder à une telle mutation lorsque l'on souhaite augmenter l'affinité de l'anticorps humanisé pour l'antigène ; on cherchera dans ce cas là à se rapprocher de la structure canonique des boucles hypervariables de l'immunoglobuline non-humaine parentale.
La présente Invention a également pour objet un fragment d'ADN, codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé, et caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé conforme à l'invention, tel que défini cidessus.
Un fragment d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé conformément à l'invention peut ensuite être fusionné avec un fragment d'ADN codant pour la région constante d'une chaîne H ou L humaine, en vue d'exprimer les chaînes H et L complètes obtenues de la sorte.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit anticorps humanisé est obtenu à partir de l'anticorps murin K20. Dans ce qui suit, on désignera un anticorps humanisé obtenu par le procédé conforme à l'invention par l'abréviation Hu-Ac, et plus particulièrement, l'anticorps humanisé dérivé de l'anticorps K20, par l'abréviation Hu-K20.
La présente Invention a pour objet un fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.
Pour exprimer un anticorps humanisé conforme à l'Invention, on utilisera de préférence un système d'expression qui a également été mis au point par les
Inventeurs, qui utilise un vecteur d'expression dérivé d'un baculovirus, et permet de produire à la fois la chaîne lourde < H) et la chaîne légère (L) d'un anticorps donné dans une cellule d'insecte.
Inventeurs, qui utilise un vecteur d'expression dérivé d'un baculovirus, et permet de produire à la fois la chaîne lourde < H) et la chaîne légère (L) d'un anticorps donné dans une cellule d'insecte.
La présente Invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN recombinant constituée par une séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou par une séquence codant pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine , laquelle séquence d'ADN recombinant est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit promoteur est un promoteur de baculovirus.
A titre d'exemple de promoteurs de baculovirus utilisables pour la mise en oeuvre de la présente
Invention, on citera les promoteurs de la polyédrine et de P10 des baculovirus AcMNPV ou SlMNPV, ou des dérivés de promoteurs de baculovirus, constitués par des promoteurs synthétiques ou recombinants, obtenus à partir d'un promoteur de baculovirus, et fonctionnels en cellules d'insectes, tel que par exemple celui décrit par
WANG et al, [Gene, 100, 131-137, (1991)].
Invention, on citera les promoteurs de la polyédrine et de P10 des baculovirus AcMNPV ou SlMNPV, ou des dérivés de promoteurs de baculovirus, constitués par des promoteurs synthétiques ou recombinants, obtenus à partir d'un promoteur de baculovirus, et fonctionnels en cellules d'insectes, tel que par exemple celui décrit par
WANG et al, [Gene, 100, 131-137, (1991)].
Une cassette d'expression conforme à ce mode de réalisation comprend par exemple:
- un promoteur de baculovirus, tel que défini ci-dessus
- une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion
- une séquence d'ADN codant pour la chaîne H ou la chaîne L d'un anticorps HU-Ac, tel que défini cidessus.
- un promoteur de baculovirus, tel que défini ci-dessus
- une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion
- une séquence d'ADN codant pour la chaîne H ou la chaîne L d'un anticorps HU-Ac, tel que défini cidessus.
Un grand nombre de séquences codant pour des peptides signal fonctionnels en cellules d'insecte sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente
Invention. A titre d'exemple non limitatif, on citera les séquences codant pour les peptides signal de l'acétylcholinestérase de Drosophile, de la trophoblastine ovine, ainsi que les séquences codant pour les peptides signal des chaînes H et L d'immunoglobulines murines ou humaines, etc...
Invention. A titre d'exemple non limitatif, on citera les séquences codant pour les peptides signal de l'acétylcholinestérase de Drosophile, de la trophoblastine ovine, ainsi que les séquences codant pour les peptides signal des chaînes H et L d'immunoglobulines murines ou humaines, etc...
Chacune des cassettes conformes à l'invention permet l'expression, soit de la chaîne légère, soit de la chaîne lourde, d'un anticorps Hu-Ac, possédant la spécificité de l'anticorps monoclonal parental.
On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes légères kappa (x) et lambda (x).
On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes lourdes fl, , 73, y4, a, , et CL. On peut ainsi obtenir un anticorps recombinant appartenant à la classe d'immunoglobuline (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM) que l'on souhaite.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, portant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ; dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier des baculovirus recombinants permettant l'expression de l'anticorps Hu-Ac, ainsi que des plasmides de transfert permettant la construction desdits baculovirus recombinants.
Les plasmides de transfert conformes à l'invention portent un insert comprenant : une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome viral en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette.
Selon un mode de réalisation préféré des plasmides de transfert conformes à la présente Invention, lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine.
Selon une disposition particulièrement avantageuse de ce mode de réalisation, la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène P10 dans le baculovirus sauvage.
Schématiquement, la construction des plasmides de transfert conformes à l'invention se fait en insérant dans un plasmide capable de se répliquer chez un hôte bactérien (en général E. colt), la région du gène de baculovirus (par exemple p10 ou polyédrine, ou tout autre locus du baculovirus) à la place duquel on souhaite insérer les gènes codant pour les chaînes H ou L d'immunoglobuline. Dans cette région, la séquence codante du gène de baculovirus (et éventuellement la séquence promoteur dudit gène) est remplacée par la séquence codant pour la chaîne d'immunoglobuline à exprimer (et éventuellement par la séquence du promoteur sous contrôle duquel on souhaite exprimer cette chaîne d'immunoglobuline, s'il s'agit par exemple d'un promoteur "dérivé"). Le plasmide de transfert ainsi obtenu contient donc un insert comprenant une séquence hétérologue (séquence d'une chaîne de l'anticorps Hu-Ac) flanquée de séquences de baculovirus.
Pour permettre l'expression simultanée de la chaîne lourde (chaîne H) et de la chaîne légère (chaîne
L) et leur réassociation pour former la molécule d'anticorps recombinant, les Inventeurs ont inséré les deux cassettes sur un même vecteur d'expression. Ils ont ainsi obtenu un baculovirus double recombinant dans lequel la séquence codante de chacune des chaînes H et L est sous le contrôle d'un promoteur fort.
L) et leur réassociation pour former la molécule d'anticorps recombinant, les Inventeurs ont inséré les deux cassettes sur un même vecteur d'expression. Ils ont ainsi obtenu un baculovirus double recombinant dans lequel la séquence codante de chacune des chaînes H et L est sous le contrôle d'un promoteur fort.
Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, permettant l'expression de l'anticorps Hu
Ac, peut être construit selon le principe suivant
- l'on prépare séparément deux plasmides de transfert, tels que définis ci-dessus : un pour la chaîne
H, et un pour la chaîne L.
Ac, peut être construit selon le principe suivant
- l'on prépare séparément deux plasmides de transfert, tels que définis ci-dessus : un pour la chaîne
H, et un pour la chaîne L.
On cotransfecte ensuite les cellules d'insecte avec l'ADN des vecteurs de transfert ainsi réalisés et lwADN du baculovirus. Cette cotransfection est effectuée en deux étapes
Le plasmide de transfert contenant la cassette d'expression pour le gène de la chaîne légère flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, est utilisé, avec l'ADN de baculovirus sauvage AcMNPV, pour cotransfecter des cellules d'insecte en culture.
Le plasmide de transfert contenant la cassette d'expression pour le gène de la chaîne légère flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, est utilisé, avec l'ADN de baculovirus sauvage AcMNPV, pour cotransfecter des cellules d'insecte en culture.
Par recombinaison homologue entre l'ADN viral et le plasmide, les séquences codantes de la chaîne légère de l'immunoglobuline recombinante sont transférées dans le génome viral.
Après réplication de l'ADN viral dans les cellules transfectées, l'on procède à la sélection des baculovirus recombinants ayant intégré la séquence de la chaîne légère de l'immunoglobuline recombinante.
Ces baculovirus recombinants sont sélectionnés selon deux critères leur incapacité à produire des polyèdres et leur capacité à exprimer la chaîne légère
Dans une deuxième étape, les cellules sont cotransfectées avec l'ADN du baculovirus recombinant obtenu à l'issue de la première étape, et avec celui du plasmide de transfert contenant la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps recombinant Hu-Ac flanquée des régions entourant le gène P10 du baculovirus. Par recombinaison homologue, comme précédemment, le gène de la chaîne lourde est transféré dans l'ADN viral.
Dans une deuxième étape, les cellules sont cotransfectées avec l'ADN du baculovirus recombinant obtenu à l'issue de la première étape, et avec celui du plasmide de transfert contenant la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps recombinant Hu-Ac flanquée des régions entourant le gène P10 du baculovirus. Par recombinaison homologue, comme précédemment, le gène de la chaîne lourde est transféré dans l'ADN viral.
L'on sélectionne alors les virus doublerecombinants qui sont capables de produire simultanément une chaîne lourde et une chaîne légère d'immunoglobuline.
La détection de la chaîne lourde et de la chaîne légère d'immunoglobuline est effectuée par ELISA.
La présente Invention a pour objet un baculovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression, telle que définie ci-dessus, comprenant une séquence codant tout ou partie de la chaîne H ou une séquence codant pour tout ou partie de la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, laquelle séquence est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fort de baculovirus.
Selon un mode de réalisation d'un baculovirus recombinant conforme à l'invention il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne L, de l'anticorps Hu-Ac.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux promoteurs différents.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'un dedits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et l'autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la P10.
Selon encore une autre modalité avantageuse de cette disposition, l'un des promoteurs est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et l'autre est le promoteur de la p10 ou l'un de ses dérivés.
Avantageusement, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est le promoteur de la P10 ou l'un de ses dérivés.
Selon une autre disposition de ce mode de réalisation, la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux séquences différentes.
Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, a été déposé le 9 septembre 1994, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du
Docteur ROUX, Paris), sous le numéro I-1476.
Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du
Docteur ROUX, Paris), sous le numéro I-1476.
La présente Invention englobe également des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant conforme à l'invention.
L'expression et la production de l'anticorps monoclonal recombinant Hu-Ac est obtenue in vitro dans des cellules d'insecte conformes à l'invention.
L'infection des cellules par un baculovirus double recombinant conforme à l'Invention résulte dans la production simultanée des chaînes H et L. Ces chaînes s'assemblent pour reconstituer l'anticorps Hu-Ac qui est par la suite sécrété dans le milieu de culture.
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un anticorps recombinant humanisé , caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant conforme à l'invention, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture.
Un anticorps recombinant humanisé conforme à l'Invention peut être utilisé pour le diagnostic, ou pour la thérapeutique. Une utilisation particulièrement intéressante, dans le cas de l'anticorps humanisé K20 concerne l'obtention de médicaments immunosuppresseurs.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention, conformément à l'Invention, de l'anticorps recombinant humanisé Hu-K20, conforme dans un baculovirus recombinant.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1. : Clonage et séquençage des parties variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps K2O.
Le MAb K20 est un anticorps murin produit par un hybridome. Il est dirigé contre la sous-unité 13 des récepteurs CD29 des lymphocytes [BOUMSELL et al., J. Exp.
Med. 152, p. 229 (1980)].
L'ARN total de l'hybridome produisant l'anticorps monoclonal K20 a été extrait à l'aide du kit "RNA extraction Kit" de PHARMACIA. L'ADNc est synthétisé à partir de 1OCLg d'ARN par transcription inverse (First
Strand cDNA Synthesis kit ; PHARMACIA).
Strand cDNA Synthesis kit ; PHARMACIA).
Les parties variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) sont amplifiées par ACP (amplification en chaîne par polymérase) à partir de lRg d'ADNc simple brin, en utilisant la Taq DNA polymérase.
Les produits d'amplification sont purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,2% pour les séparer des oligonucléotides ; la bande correspondant au produit recherché est excisée du gel, et l'ADN est élué par centrifugation (microcentrifugeuse SPIN-X, COSTAR,
Cambridge, MA), puis extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol,
1. Clonaae de la région variable de la chaîne légère in de K20
La transcription inverse a été réalisée en utilisant l'amorce VxlFOR *VxlFOR : 5'- GGT AGA TCT CAG CTT GGT CCC 3'
Cette amorce est complémentaire de la séquence consensus à l'extrémité 3' de la région variable VK des gènes murins, et comporte un site BalII (souligné).
Cambridge, MA), puis extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol,
1. Clonaae de la région variable de la chaîne légère in de K20
La transcription inverse a été réalisée en utilisant l'amorce VxlFOR *VxlFOR : 5'- GGT AGA TCT CAG CTT GGT CCC 3'
Cette amorce est complémentaire de la séquence consensus à l'extrémité 3' de la région variable VK des gènes murins, et comporte un site BalII (souligné).
L'ADNc obtenu a été amplifié par ACP en utilisant d'une part l'amorce VxlFOR ci-dessus, et d'autre part l'amorce VxlBAC: *VxlBAC : 5'- GAC ATT CAGCTG ACC CAG TCT CCA -3' (site PvuII souligné).
Ces amorces ont été décrites par ORLANDI et al.[ Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86, p 3833, (1989)].
Le produit d'amplification a été récupéré par électrophorèse sur gel d'agarose, extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol, puis digéré par PvuII et BalII, et le fragment obtenu a été cloné dans le phage M13VKPCR1 (ORLANDI et al., publication précitée), préalablement digéré par PvuII et
BclI, pour donner le phage M13VKK20PCR1 (figure 1A).
BclI, pour donner le phage M13VKK20PCR1 (figure 1A).
2- Clonaae de la région variable de la chaîne lourde yl de K20
La transcription inverse sur l'ARN total extrait de l'hybridome producteur de K20 a été réalisée en utilisant l'amorce VHlFOR. Cette même amorce, et l'amorce VHlBAC ont par la suite servi à amplifier la région VH à partir de l'ADNc *VH1FOR : 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA
G-3' (Site BstEII souligné).
La transcription inverse sur l'ARN total extrait de l'hybridome producteur de K20 a été réalisée en utilisant l'amorce VHlFOR. Cette même amorce, et l'amorce VHlBAC ont par la suite servi à amplifier la région VH à partir de l'ADNc *VH1FOR : 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA
G-3' (Site BstEII souligné).
*VHlBAC : 5'-AG GT(C/G) (A/C)A(A/G) CTG CAG (C/G) AG
TC(A/T) GG-3' (Site PstI souligné).
TC(A/T) GG-3' (Site PstI souligné).
Ces amorces ont été décrites par ORLANDI et al. (publication précitée).
Le produit d'amplification a été purifié comme décrit ci-dessus, puis digéré par BstEII et PstI, et le fragment obtenu a été cloné dans le phage M13VHPCR1 (ORLANDI et al., publication précitée), préalablement digéré par BstEII et PstI, pour donner le phage M13VHK20PCR1
La figure 1A représente les étapes du clonage des séquences VK et VH de K20. Les phages Mî3VKK20PCRl et
M13VHK20PCR1 comprennent, outre les séquences de K20, un promoteur (P) de chaîne H d'Ig, et la séquence de tête (L) du gène VH V47 de souris.
La figure 1A représente les étapes du clonage des séquences VK et VH de K20. Les phages Mî3VKK20PCRl et
M13VHK20PCR1 comprennent, outre les séquences de K20, un promoteur (P) de chaîne H d'Ig, et la séquence de tête (L) du gène VH V47 de souris.
La séquence nucléotidique des inserts K20 des phages M13VKK20PCR1 et M13VHK20PCR1 a été déterminée.
La séquence de l'insert codant pour la région variable VK de la chaîne légère de l'anticorps K20, et la séquence polypeptidique correspondante sont représentées à la figure 2 A.
La séquence de l'insert codant pour la région variable VH de la chaîne lourde de l'anticorps K20,et la séquence polypeptidique correspondante sont représentées à la figure 2 B.
Les emplacements des CDR, ainsi que ceux des amorces qui ont été utilisées, et ceux des sites de restriction ayant permis le clonage sont indiqués sur ces figures 2A et 2B.
Exemple 2. : Ruisation des parties variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps K2O.
La figure 1B représente les étapes de l'humanisation des régions variables VK et VH de K20.
1. Humanisation de la région variable de la chaîne légère K de K20
M13VKPCR1 contient un gène VK de souris, qui comprend les régions charpente (FRs) de la protéine K de myélome humain REI, et les régions déterminant la complémentarité (CDRs) de l'anticorps monoclonal de souris D1.3 [VERHOEYEN et al., Science, 239, p 1534 (1988)].
M13VKPCR1 contient un gène VK de souris, qui comprend les régions charpente (FRs) de la protéine K de myélome humain REI, et les régions déterminant la complémentarité (CDRs) de l'anticorps monoclonal de souris D1.3 [VERHOEYEN et al., Science, 239, p 1534 (1988)].
Les régions charpente de ce gène VK ont été utilisées pour humaniser le gène VK de K20.
3 oligonucléotides, VKMUTCDR1, VKMUTCDR2, et
VKMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs 1, 2, et 3 de la chaîne VK de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs VK de D1.3. Ces 3 oligonucléotides comprennent également 12 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' et au moins 12 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 3', incluant un C ou un G terminal, et complémentaires du voisinage immédiat du CDR à remplacer.
VKMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs 1, 2, et 3 de la chaîne VK de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs VK de D1.3. Ces 3 oligonucléotides comprennent également 12 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' et au moins 12 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 3', incluant un C ou un G terminal, et complémentaires du voisinage immédiat du CDR à remplacer.
La mutagénèse a été effectuée selon le protocole préconisé par KUNDLE [Proc. Natal. Acad. Sci.
USA, 82, p 488 (1985)]
Le phage résultant du remplacement dans
M13VKPCR1, des CDRs VK de D1.3 par les CDRs de VK de K20, est dénommé M13HuVKK20PCR1
2. Humanisation de la région variable de la chaîne lourde de K20
Les régions charpente du gène VH humain F1 (numéro d'accès EMBL X17675) ont été utilisées pour humaniser le gène VH de K20.
Le phage résultant du remplacement dans
M13VKPCR1, des CDRs VK de D1.3 par les CDRs de VK de K20, est dénommé M13HuVKK20PCR1
2. Humanisation de la région variable de la chaîne lourde de K20
Les régions charpente du gène VH humain F1 (numéro d'accès EMBL X17675) ont été utilisées pour humaniser le gène VH de K20.
Le gène VH F1 a été amplifié par ACP à partir du vecteur M13mpl8VHFlRF. [MILILI et al., Mol. Immunol., 28, p 753 (1991)], en utilisant les amorces VH1BAK et
VHlFOR décrites ci-dessus.
VHlFOR décrites ci-dessus.
Le produit d'amplification a été purifié comme décrit ci-dessus, puis digéré par BstEII et PstI, et le fragment obtenu a été cloné dans le phage M13VHPCR1.
3 oligonucléotides, VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, et
VHMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs 1, 2, et 3 de la chaîne VH de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs VH de F1 par ceux de K20.
VHMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs 1, 2, et 3 de la chaîne VH de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs VH de F1 par ceux de K20.
La mutagénèse a été effectuée comme décrit cidessus, et le phage résultant est dénommé M13HuVHK20PCR1.
Les séquences complémentaires inverses de celles des oligonucléotides utilisés pour l'humanisation des régions variables des chaînes lourde et légères sont représentées à la figure 3. Les nucléotides correspondant aux CDRs des gènes humanisés sont soulignés ; les nucléotides existant initialement dans le gène VKREI/D1.3 et dans le gène VHF1 sont en lettres capitales ; les nucléotides changés par mutagénèse sont en lettres minuscules ; les emplacements des nucléotides délétés par mutagénèse des gènes initiaux sont représentés par des tirets.
Exemple 3 : Construction de plasmides de transfert portant les séquences variables hunnisées de K2O
A) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LEGERE
KAPPA
1) Obtention du plasmide ABC'C
a- Plasmide pGmAcll6T :
Ces vecteur est dérivé du plasmide pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], luimême dérivé du plasmide pAcl [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] contenant le fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d' Autographa californica (AcMNPV), et donc le gène polyédrine, et les séquences flanquant ledit gène.Pour obtenir pGmAcll6T, le plasmide pGmAcll5T a été délété d'un fragment de 1900pb allant d'un site EcoRI situé en amont du gène polyédrine à un site XhoI situé 1900pb en aval de ce site EcoRI.
A) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LEGERE
KAPPA
1) Obtention du plasmide ABC'C
a- Plasmide pGmAcll6T :
Ces vecteur est dérivé du plasmide pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], luimême dérivé du plasmide pAcl [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] contenant le fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d' Autographa californica (AcMNPV), et donc le gène polyédrine, et les séquences flanquant ledit gène.Pour obtenir pGmAcll6T, le plasmide pGmAcll5T a été délété d'un fragment de 1900pb allant d'un site EcoRI situé en amont du gène polyédrine à un site XhoI situé 1900pb en aval de ce site EcoRI.
5 Fg du plasmide pGmAcll5T ont été digérés pendant 2 heures à 37 C par 15 unités d'enzyme XhoI (BOEHRINGER), dans un volume réactionnel de 50 Fl et dans les conditions préconisées par le fournisseur. Après extraction au phénol/chloroforme, 1'ADN plasmidique a été précipité à l'alcool. Cet ADN a été ensuite partiellement coupé par EcoRI (BOEHRINGER) dans un volume réactionnel de 50 Fl en présence de 0,5 unité d'enzyme. L'incubation a été faite à 37 C pendant 20 minutes. Après une nouvelle extraction au phénol/chloroforme, les extrémités générées par les coupures XhoI et EcoRI ont été rendues franches par l'enzyme de Klenow (BIOLABS) en présence des 4 dNTPs, selon le protocole préconisé par le fournisseur.L'ADN plasmidique a enfin été précipité à l'alcool et incubé avec la ligase du phage T4 (BOEHRINGER) dans les conditions préconisées par le fournisseur.
Des bactéries E. coli compétentes ont été transformées par une partie du mélange de ligation ; le criblage des colonies issues de cette transformation a permis de sélectionner le plasmide pGmAcll6T. Ce plasmide contient un site BalII en aval du promoteur de la polyédrine.
b- Peptide signal
La séquence codante de ce peptide est celle du peptide signal d'un gène VH de souris [NEUBERGER M.S., EMBO J.,2, 1373-1378, (1983)].
La séquence codante de ce peptide est celle du peptide signal d'un gène VH de souris [NEUBERGER M.S., EMBO J.,2, 1373-1378, (1983)].
Cette séquence a été synthétisée chimiquement sous forme de deux oligonucléotides complémentaires ayant des extrémités permettant l'insertion du duplex dans un site BalII. Pour l'appariement, 15 g de chacun des deux oligonucléotides sont incubés dans 50 gl de tampon (Tris 1 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM), pendant 5 minutes dans un bain marie à 70'C. Le bain est ensuite laissé refroidir jusqu'à température ambiante (22 à 25 C). Le produit d'appariement est utilisé directement dans les réactions de ligation avec le plasmide pGmAcll6T préalablement coupé par BalII.
Les conditions de ligation sont les suivantes :
lAg du plasmide pGmAcll6T coupé par BalII lRg de l'oligonucléotide bicaténaire portant la séquence codant pour le peptide signal ; 2 l de tampon ligase 10X (BOEHRINGER) ; eau distillée q.s.p. 19 l ; 1 unité (1 l) de ligase (BOEHRINGER). L'incubation est effectuée à 22 C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
lAg du plasmide pGmAcll6T coupé par BalII lRg de l'oligonucléotide bicaténaire portant la séquence codant pour le peptide signal ; 2 l de tampon ligase 10X (BOEHRINGER) ; eau distillée q.s.p. 19 l ; 1 unité (1 l) de ligase (BOEHRINGER). L'incubation est effectuée à 22 C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
c- Région constante C#:
La séquence codante de la région constante de la chaîne légère K humaine a été amplifiée par ACP en utilisant comme matrice de 1'ADNc de lymphocytes B humains. Les lymphocytes humains (environ 5x108) ont été préparés à partir de 200 ml de sang en utilisant HISTOPAQUEX (SIGMA). L'ARN total a été extrait de ces lymphocytes en utilisant un kit PHARMACIA (RNA extraction kit). Le premier brin d'ADNc a été préparé à partir de l'ARN total à l'aide du kit "First-Strand cDNA synthesis kit" de PHARMACIA.
La séquence codante de la région constante de la chaîne légère K humaine a été amplifiée par ACP en utilisant comme matrice de 1'ADNc de lymphocytes B humains. Les lymphocytes humains (environ 5x108) ont été préparés à partir de 200 ml de sang en utilisant HISTOPAQUEX (SIGMA). L'ARN total a été extrait de ces lymphocytes en utilisant un kit PHARMACIA (RNA extraction kit). Le premier brin d'ADNc a été préparé à partir de l'ARN total à l'aide du kit "First-Strand cDNA synthesis kit" de PHARMACIA.
Les amorces utilisées pour amplifier le cDNA CK sont les suivantes * HuCKBAC 5'-AG CTC GAG ATC AAA CGG-3' (le site XhoI est souligné).
Cette amorce correspond à une séquence consensus en 3' des séquences codant pour les domaines variables des chaînes légères d'immunoglobulines de souris (JK), et contient un site de coupure par XhoI.
* HuCKFOR 5'-GAA GAT CTA ACA CTC TCC GCG GTT GAA G-3' (le site BalII est souligné).
Cette amorce est complémentaire de l'extrémité 3' des gènes CK humains et apporte un site BalII en aval du codon stop TAG.
L'amplification avec les amorces HuCKBAC et
HuCKFOR a permis d'obtenir un fragment d'environ 340 pb contenant la totalité de la région CK encadrée des sites
XhoI et BalII.
HuCKFOR a permis d'obtenir un fragment d'environ 340 pb contenant la totalité de la région CK encadrée des sites
XhoI et BalII.
Le produit de l'amplification a été digéré par AglII et XhoI avant d'être cloné dans les sites XhoI- Balai du plasmide pGmAc portant la séquence codant pour le peptide signal.
La composition du mélange de ligation est la suivante
lgg du plasmide pGmAc coupé par XhoI et
BalII ; 200 ng du fragment CK amplifié et digéré par
BalII et XhoI, 2R1 de tampon ligase 10X (BOEHRINGER), eau distillée q.s.p. 19F1, 1 unité (1R1) de ligase (BOEHRINGER).
lgg du plasmide pGmAc coupé par XhoI et
BalII ; 200 ng du fragment CK amplifié et digéré par
BalII et XhoI, 2R1 de tampon ligase 10X (BOEHRINGER), eau distillée q.s.p. 19F1, 1 unité (1R1) de ligase (BOEHRINGER).
L'incubation est effectuée à 22 C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
Le plasmide obtenu est dénommé pBCK.
2) Clonaae de la région variable humanisée de la chaînez de K20
Le clonage de la région variable humanisée de la chaîne légère x de K20 a été réalisé de la manière suivante
La région VK humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant
- comme matrice, l'ADN du phage
M13HuVKK20PCR1 décrit à l'exemple 2 ci-dessus
- une amorce OPP-SoVK(3'), dont la séquence est la suivante: * OPP-SoVK(3'):
5' -ACG TTT CTC GAG CYT GGT SCC - 3'
(site XhoI souligné)
Y représente C ou T, et S représente C ou G
- une amorce VKK20Hu(5'), dont la séquence est la suivante:
* VKK20Hu(5')
5' - GAC ATC GAG CTC ACC CAG- 3'
(site SacI souligné)
Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction XhoI et SacI.
Le clonage de la région variable humanisée de la chaîne légère x de K20 a été réalisé de la manière suivante
La région VK humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant
- comme matrice, l'ADN du phage
M13HuVKK20PCR1 décrit à l'exemple 2 ci-dessus
- une amorce OPP-SoVK(3'), dont la séquence est la suivante: * OPP-SoVK(3'):
5' -ACG TTT CTC GAG CYT GGT SCC - 3'
(site XhoI souligné)
Y représente C ou T, et S représente C ou G
- une amorce VKK20Hu(5'), dont la séquence est la suivante:
* VKK20Hu(5')
5' - GAC ATC GAG CTC ACC CAG- 3'
(site SacI souligné)
Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction XhoI et SacI.
L'amplification a été réalisée en 30 cycles successifs d'incubation à 95 C pendant 30 secondes, 40 C pendant 30 secondes, et 72 C pendant 30 secondes, puis a été suivie d'une incubation à 72 C pendant 10 minutes.
Après amplification de la région VK, une digestion par les enzymes SacI et XhoI du produit d'amplification a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites SacI et XhoI du plasmide pBLUESCRIPT IIKS ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
Quelques clones sont sélectionnés, et séquencés pour vérification.
L'ADN plasmidique du clone sélectionné est préparé, digéré par SacI et XhoI, et le fragment SacI-
XhoI de 303 pb est purifie.
XhoI de 303 pb est purifie.
Le fragment SacI-XhoI est introduit dans pBCK. La composition du mélange de ligation est la suivante
2 1 de tampon 10X pour la T4-DNA ligase (BOEHRINGER) ; 100 ng du fragment SacI-XhoI, 1 Fl du plasmide pBCx coupé par SacI et XhoI ; 1 Fl de ligase (1 unité), et eau distillée q.s.p. 20 Rl.
2 1 de tampon 10X pour la T4-DNA ligase (BOEHRINGER) ; 100 ng du fragment SacI-XhoI, 1 Fl du plasmide pBCx coupé par SacI et XhoI ; 1 Fl de ligase (1 unité), et eau distillée q.s.p. 20 Rl.
L'incubation est effectuée à 16-C pendant 8 heures puis le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
On sélectionne un clone contenant le plasmide pBCK-VlcK20hu, qui sera utilisé comme vecteur de transfert.
B) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LOURDE
1) Obtention du plasmide DBCy1
a- Plasmide de transfert :
Le plasmide pGml6 [BLANC et al, Virology, 192, 651-654, (1993)] dérive d'un plasmide dans lequel a été cloné le fragment EcoRI-P du baculovirus AcMNPV contenant le gène plO. La quasi-totalité de la séquence codante a été délétée et remplacée par un site BolII permettant l'insertion de séquences à exprimer sous le contrôle du promoteur plO.
1) Obtention du plasmide DBCy1
a- Plasmide de transfert :
Le plasmide pGml6 [BLANC et al, Virology, 192, 651-654, (1993)] dérive d'un plasmide dans lequel a été cloné le fragment EcoRI-P du baculovirus AcMNPV contenant le gène plO. La quasi-totalité de la séquence codante a été délétée et remplacée par un site BolII permettant l'insertion de séquences à exprimer sous le contrôle du promoteur plO.
b- Peptide signal
La séquence codante de ce peptide est celle d'un gène VH de souris (NEUBERGER M.S., 1983. EMBO J,2, 1373-1378).
La séquence codante de ce peptide est celle d'un gène VH de souris (NEUBERGER M.S., 1983. EMBO J,2, 1373-1378).
Elle a été synthétisée chimiquement sous forme de brins complémentaires, de manière à ce qu'elle puisse être insérée dans un site BalII. Les conditions d'appariement et de ligation sont identiques à celles utilisées pour la chaîne légère.
c- Régions constantes humaines (Ct1):
Le cDNA de la séquence codante de la région CY1 humaine a été amplifié par ACP en utilisant les amorces suivantes *HuCtlBAC : 5' CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC - 3' (site KDnI souligné).
Le cDNA de la séquence codante de la région CY1 humaine a été amplifié par ACP en utilisant les amorces suivantes *HuCtlBAC : 5' CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC - 3' (site KDnI souligné).
Cette amorce comprend un site KgnI.
*HuCtlFOR : 5'-GAAGATC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3' (site BalII souligné).
L'amorce permet de reconstituer après amplification un site BolII en aval du codon stop.
La matrice utilisée pour amplifier la région Cy1 humaine est le même mélange d'ADNc que celui utilisé pour l'amplification des séquences CK
Le produit d'amplification a été séquencé et cloné dans le vecteur de transfert pGml6 portant la séquence codant pour le peptide signal. La construction obtenue a été appelée pBC,'1.
Le produit d'amplification a été séquencé et cloné dans le vecteur de transfert pGml6 portant la séquence codant pour le peptide signal. La construction obtenue a été appelée pBC,'1.
2) Clonaae de la région variable humanisée de la chaîne lourde de K20
Le clonage de la région VH humanisée de la chaîne lourde de K20 a été réalisé de la manière suivante
La région variable VH humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant
- comme matrice l'ADN du phage M13HuVHK20PCR1 décrit à l'exemple 2 ci-dessus
- l'amorce VHlBAC ci-dessous 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT WCG GG-3' (Site PstI souligné)
S = C ou G ; M = A ou C ; R = A ou G ; W = A ou T
- l'amorce VHFOR ci-dessous 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GCC CCA G-3' (Sites BstEII et KDnI soulignés).
Le clonage de la région VH humanisée de la chaîne lourde de K20 a été réalisé de la manière suivante
La région variable VH humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant
- comme matrice l'ADN du phage M13HuVHK20PCR1 décrit à l'exemple 2 ci-dessus
- l'amorce VHlBAC ci-dessous 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT WCG GG-3' (Site PstI souligné)
S = C ou G ; M = A ou C ; R = A ou G ; W = A ou T
- l'amorce VHFOR ci-dessous 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GCC CCA G-3' (Sites BstEII et KDnI soulignés).
L'amorce VHFOR diffère de l'amorce VHlFOR en ce qu'un C a été remplacé par un A pour créer un site KanI.
Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction enzymatiques PstI et KDnI.
Après amplification, une digestion PstI-KDnI du fragment d'amplification obtenu a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites PstI et KDnI du plasmide pBLUESCRIPT IIKS ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.
Quelques clones sont sélectionnés, et vérifiés par séquencage.
L'ADN plasmidique du clone sélectionné est préparé, digéré par PstI et KDnII, et le fragment PstI
KDnI de 327 pb est purifié.
KDnI de 327 pb est purifié.
Le fragment PstI-KDnI est introduit dans pBC71 pour donner le plasmide chargé pBCyl-VHK20hu.
Exemple 4 : Construction d'un baculovirus recoibinant produisant l'anticorps R20 humanisé
a- Insertion de la chaîne lourde
Le plasmide chargé pBCtl-VHR2 Ohu a été utilisé en cotransfection avec l'ADN d'un baculovirus modifié appelé AcSLplO [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)], qui est dépourvu du gène polyédrine (promoteur+séquence codante), mais porte la séquence codante de la polyédrine sous contrôle du promoteur P10, dans le locus naturel P10. Ce virus produisant des polyédres dans les cellules infectées, la recombinaison au niveau du locus P10 peut ainsi être facilement détectée.Les conditions de cotransfection sont les suivantes 500 ng d'ADN viral sont mélangés avec 5 'Lg d'ADN plasmidique et 40 Rl de solution DOTAP (BOEHRINGER) dans 3 ml de milieu de culture sans sérum pour cellules d'insectes. Ce mélange est utilisé pour recouvrir 4 x 106 cellules Sf9 (ATCC35CRL 1711) ; après 4 heures de contact, le mélange de cotransfection est remplacé par 4 ml de milieu complet et l'incubation est faite à 27 C pendant 5 jours.
a- Insertion de la chaîne lourde
Le plasmide chargé pBCtl-VHR2 Ohu a été utilisé en cotransfection avec l'ADN d'un baculovirus modifié appelé AcSLplO [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)], qui est dépourvu du gène polyédrine (promoteur+séquence codante), mais porte la séquence codante de la polyédrine sous contrôle du promoteur P10, dans le locus naturel P10. Ce virus produisant des polyédres dans les cellules infectées, la recombinaison au niveau du locus P10 peut ainsi être facilement détectée.Les conditions de cotransfection sont les suivantes 500 ng d'ADN viral sont mélangés avec 5 'Lg d'ADN plasmidique et 40 Rl de solution DOTAP (BOEHRINGER) dans 3 ml de milieu de culture sans sérum pour cellules d'insectes. Ce mélange est utilisé pour recouvrir 4 x 106 cellules Sf9 (ATCC35CRL 1711) ; après 4 heures de contact, le mélange de cotransfection est remplacé par 4 ml de milieu complet et l'incubation est faite à 27 C pendant 5 jours.
A la suite de la cotransfection, le virus produisant la chaîne lourde de l'anticorps K20 humanisé sous le contrôle du promoteur P10 a été purifié par la technique des plages de lyse. Ce virus a été appelé bPP1 HK2Ohu.
b- Insertion de la chaîne légère
Le plasmide chargé pBCx-VaK2Ohu a été utilisé en cotransfection avec 1'ADN du baculovirus modifié bPP1 HK2Ohu.
Le plasmide chargé pBCx-VaK2Ohu a été utilisé en cotransfection avec 1'ADN du baculovirus modifié bPP1 HK2Ohu.
Les doubles recombinants ont été sélectionnés par la technique de la dilution limite, associée à 1 'ELISA.
Après la cotransfection, on effectue une gamme de dilutions du surnageant infectieux, et chaque dilution est utilisée pour l'infection de cellules d'insectes.
Trois jours après l'infection, les surnageants sont testés en ELISA pour rechercher la présence d'anticorps de type humain correctement assemblés. Les surnageants des puits les plus positifs pour les dilutions les plus importantes sont à leur tour dilués et utilisés pour infecter d'autres cultures ; après quelques cycles dilution/infection, les surnageants enrichis en baculovirus produisant l'anticorps entier sont étalés sur un tapis cellulaire, et clonés par la méthode des plages de lyse.
Un clone dénommé AclOHK20hu-33LK20hu(111) a été sélectionné. Ce clone a été déposé auprès de la CNCM, le 9 septembre 1994, sous le numéro I-1476.
Exemple 5 - Production et purification de l'anticorps K2O humanisé (Ku-K2O):
Le virus double recombinant AclOHK20hu 33LK20hu(111) a été amplifié par une série de passages sur des cellules d'insecte en culture. Le stock viral a été ensuite utilisé pour infecter une culture agitée en spinner (500 ml de culture à 106 cellules par ml).
Le virus double recombinant AclOHK20hu 33LK20hu(111) a été amplifié par une série de passages sur des cellules d'insecte en culture. Le stock viral a été ensuite utilisé pour infecter une culture agitée en spinner (500 ml de culture à 106 cellules par ml).
Après 72 heures d'infection, la culture est récoltée et centrifugée à 1000 g pour clarifier le surnageant. Ce dernier a été concentré jusqu'au 1/3 de son volume initial par centrifugation à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 30 kDa (CENTRIPEP 30, Amicon) (père centrifugation 1000g, 20'C, 30 minutes ; élimination du filtrat ; 2ème centrifugation 1000g, 20'C, 20 minutes)
La solution a été équilibrée dans un tampon de fixation sur protéine A, par dilution dans ce tampon suivie d'une nouvelle concentration par centrifugation (tampon de dilution : Glycine 1,5M, NaCl 3M; pH 8,9). La solution équilibrée est ensuite passée dans une colonne de protéine A, elle même équilibrée dans le même tampon que la solution de Hu-K20.Après rinçage de la colonne, l'anticorps est élué par un tampon d'élution (Acétate 0,lM, NaCl0,5M; pH3). L'élution est suivie en mesurant la
DO à 280 nm. Les fractions contenant l'anticorps ont été mélangées et concentrées par centrifugation à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa (CENTRIPEP 10, AMICON). La solution concentrée est diluée avec du
PBS puis reconcentrée de la même manière. La solution d'anticorps obtenue est conservée à +4 C dans le PBS (137 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 4,3 mM Na2HP04-7H20; 1,4 mM KH2P04.
La solution a été équilibrée dans un tampon de fixation sur protéine A, par dilution dans ce tampon suivie d'une nouvelle concentration par centrifugation (tampon de dilution : Glycine 1,5M, NaCl 3M; pH 8,9). La solution équilibrée est ensuite passée dans une colonne de protéine A, elle même équilibrée dans le même tampon que la solution de Hu-K20.Après rinçage de la colonne, l'anticorps est élué par un tampon d'élution (Acétate 0,lM, NaCl0,5M; pH3). L'élution est suivie en mesurant la
DO à 280 nm. Les fractions contenant l'anticorps ont été mélangées et concentrées par centrifugation à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa (CENTRIPEP 10, AMICON). La solution concentrée est diluée avec du
PBS puis reconcentrée de la même manière. La solution d'anticorps obtenue est conservée à +4 C dans le PBS (137 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 4,3 mM Na2HP04-7H20; 1,4 mM KH2P04.
La qualité de l'anticorps a été contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, en utilisant comme témoin une IgG1 humaine du commerce (SIGMA). Cette expérience a montré que l'anticorps chimère non-réduit (ponts disulfure intacts) migre au même niveau que l'anticorps humain témoin.
Après traitement par le dithiotréitol (DTT), on observe l'apparition de deux bandes correspondant aux chaînes lourdes et légères, et migrant au même niveau que les chaînes de l'anticorps humain témoin également réduit au DTT.
Pour confirmer les résultats précédents, les protéines des fractions comprenant l'anticorps ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose, et les chaînes H et L ont été détectées par des anticorps spécifiques des région Cyl et Cx humaines.
Cette expérience démontre que l'anticorps produit par les cellules d'insectes est bien constitué de chaînes H et L, et que les parties constantes de ces chaînes sont reconnues par des anticorps spécifiques.
Le virus sélectionné AclOHK20hu-33LR20hu(111) est multiplié sur cellules d'insectes Sf9 en milieu TGV2 (2% de sérum de veau foetal). La concentration d'anticorps produit et sécrété est évaluée par ELISA elle est d'environ 10 mg/l.
Exemple 6 - Test de l'activité et de la specificité du Ku-K2O produit par les cellules d'insectes
L'anticorps monoclonal parental K20 est dirigé contre la sous unité B1 des intégrines humaines (récepteur CD29) localisée à la surface des lymphocytes.
L'anticorps monoclonal parental K20 est dirigé contre la sous unité B1 des intégrines humaines (récepteur CD29) localisée à la surface des lymphocytes.
La fixation de K20 sur la molécule CD29 inhibe la prolifération des lymphocytes T4 humains activés [GROUX et al., Nature, 339, 152-154, (1989)]. L'effet suppressif de K20 sur la prolifération cellulaire T permet d'envisager l'utilisation de cet anticorps dans la prévention des rejets de greffes.
La fixation de l'anticorps Hu-K20 produit conformément à l'invention, sur la molécule CD29 a été vérifiée par immunofluorescence. Les protocoles expérimentaux suivis ont pour l'essentiel été précédemment décrits [GROUX et al. Nature 339, 152-154 (1989); TICCHIONI et al. Journal of Immunology 151, 119127 (1993)].
Expériences d'imunofluorescence
Des lymphocytes humains portant le récepteur
CD29 ont été fixés sur lame de verre puis incubés en présence du Hu-K20 produit conformément à l'Invention, du
K20 murin parental, ou du tampon seul.
Des lymphocytes humains portant le récepteur
CD29 ont été fixés sur lame de verre puis incubés en présence du Hu-K20 produit conformément à l'Invention, du
K20 murin parental, ou du tampon seul.
Après une série de rinçages, on rajoute ou bien un anticorps secondaire fluorescent spécifique du
Hu-K20 produit conformément à l'invention, ou bien un anticorps secondaire fluorescent spécifique du K20 murin parental.
Hu-K20 produit conformément à l'invention, ou bien un anticorps secondaire fluorescent spécifique du K20 murin parental.
Après un nouveau rinçage, les préparations ont été observées au microscope pour visualiser la fluorescence. Ceci a montré que le Hu-K20 produit conformément à l'Invention se fixe de manière spécifique sur les lymphocytes portant le CD29, tout comme le témoin positif K20 murin parental ; aucune fluorescence n'a été détectée en l'abscence des anticorps K20, ou sur des cellules lymphocytaires B ne portant pas l'antigène CD29.
Claims (23)
1) Procédé d'humanisation de la région variable VH et/ou de la région variable VL d'une immunoglobuline non-humaine, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes
- une étape où l'on sélectionne une séquence d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'une immunoglobuline humaine, la séquence en acides aminés des régions FR de ladite région VH ou de ladite région VL humaine présentant respectivement entre 70 et 95 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions FR de la région VH ou de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine, et les boucles hypervariables H1 et H2 de ladite région VH humaine ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de ladite région
VL humaine présentant respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables H1 et
H2 de la région VH ou les boucles hypervariables L1, L2 et L3 de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine
- une étape où l'on procède au remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de ladite région VH ou VL humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de la région VH ou VL de l'immunoglobuline non-humaine.
2) Fragment d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé Hu-Ac, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 1.
3) Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu à partir de l'anticorps murin K20, et code pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé dénommé Hu-K20.
4) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 2 ou 3, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
5) Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments permettant l'expression de la chaîne lourde ou de la chaîne légère d'un anticorps recombinant Hu-Ac, lesdits éléments étant constitués par
- un promoteur de baculovirus, sous contrôle transcriptionnel duquel sont placés
- une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion ; et
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou bien
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.
6) Cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que le promoteur de baculovirus est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, ou bien le promoteur de la plO ou l'un de ses dérivés.
7) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 2 ou 3.
8) Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6.
9) Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un vecteur de transfert, portant un insert comprenant : une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome de baculovirus en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette.
10) Vecteur de transfert selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine.
11) Vecteur de transfert selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène P10 dans le baculovirus sauvage.
12) Baculovirus recombinant caractérisé en ce qu il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6.
13) Baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne
L de l'anticorps Hu-Ac.
14) Baculovirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux promoteurs différents.
15) Baculovirus recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'un desdits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et l'autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la P10.
16) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de l'un de ses dérivés, et la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est sous contrôle du promoteur de la P10 ou de l'un de ses dérivés.
17) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux séquences différentes.
18) Baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit du baculovirus recombinant Acl0HK20hu-33LK20hu (111), déposé le 9 septembre 1994, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro I-1476.
19) Cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 18.
20) Procédé de préparation d'un anticorps recombinant humanisé, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte selon la revendication 19, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture.
21) Anticorps recombinant humanisé, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 20.
22) Anticorps recombinant humanisé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps Hu-K20.
23) Utilisation de l'anticorps recombinant humanisé Hu-K20 selon la revendication 22 pour l'obtention d'un médicament.
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