JPH05500312A - Ｃｄｒ―移植された抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤＲ−移植された抗体 本発明はＣＤＲ−移植された抗体分子、組換え型ＤＮＡ技術を用いるそれらの製 造方法およびそれらの治療用途に関するものである。

本出願では、多種の先行技術の参考文献が引用されている。これらはかぎ括弧［ ］内に示されている番号により参照されている。参考文献は記載の最後に番号順 に挙げられている。

本出願では、ｒＩｇＪは天然免疫グロブリン類を記載するために使用されている 。天然免疫グロブリン類は以前から公知であり、そしてそれぞれの上腕端部に向 いて抗原−結合部位を有している一般的なＹ−型分子を含んでいる。構造の残部 および特にＹの幹部がＩｇに関連しているエフェクター機能を伝達している。酵 素的切断により誘導することができるＩｇの種々のフラグメント、例えばＦ　ａ 　ｂ、　（Ｆ　ａ　ｂ’）ｚ、ＦｖおよびＦｃフラグメント、も公知である。

天然Ｉｇ類は２個のＨ鎖および２個のし鎖を含んでおり、一対のＨおよびＬ鎖の Ｎ−末端部は会合されておりそして抗原結合部位を形成している。Ｈ鎖のＣ−末 端部は会合してＦｃ部分を形成している。

本記載および請求の範囲中に示されているＩｇのＬおよびＨ鎖に関する残基表示 はカバット［１］および［２］により開発された番号付は方式に従うものである 。すなわち、残基表示は必ずしも常にアミノ酸残基の線状番号付けに直接対応す るものではない。実際の線状アミノ酸配列は厳密なカバット番号より少ないかま たはそれより多いアミノ酸残基を含有しているかもしれず、従って挿入または欠 失があることを示している。これらの挿入または欠失は鎖内のどこにでも存在す ることができる。

１ｇの配列と「標準的な」カバット番号付は配列との相同性範囲における整列に より、あるＩｇに関する残基の正確な番号を測定することができる。

多数のＩｇ類のアミノ酸配列の研究から、ＨおよびＬ鎖の両者の鎖のＮ−末端部 に位置する変異領域はアミノ酸配列がアミノ酸配列が超変異部であることが測定 されている３部分を含有していた。これらの超変異部は各側面で、配列［１］お よび［２］中より実質的に変化が少ない部分と接している。超変異部が抗原結合 に包括されていると推測される。

さらに透通では、Ｘ−線結晶写真および分子モデル作成を用いる構造研究により 、抗原結合に包括されていると思われるＨおよびＬ鎖のそれぞれの変異領域中の ３部分が定義されている［４７コ。これらの３部分は一般的には相補性測定部分 （ＣＤＲ類）と称されている。ＣＤＲ類は変異領域の残りの部分により一緒にさ れて抗原結合部位の少なくとも一部を形成している。これらの残りの部分は一般 的に骨格部分と称されている。

当技術における数人の研究者そして特にカバット［１］および［２］が超変異部 をＣＤＲ類であると称していることは認識されよう。明白にするために、本明細 書では超変異部という語は配列分析により測定された抗原結合部分を記載するた めだけに使用されており、そしてＣＤＲという語は構造分析により測定される抗 原結合部分を記載するために使用されている。

配列分析により測定された超変異部と構造研究により測定されたＣＤＲ類との比 較から、これらの部分の間には完全ではないがいくからの一致があることが示さ れている。

本出願においては、「抗体」という語は、抗体が少なくとも１個の抗原結合部位 を含んでいる限り天然性であってもまたは組換え型ＤＮＡ技術もしくは他の技術 により製造されたものでもあってよいＩｇ類またはそれらの各フラグメント、Ｌ 鎖もしくはＨ鎖車量体または二量体、並びに単一鎖抗体、例えばＨおよびＬ鎖変 異領域がペプチド結合剤により結合されている単一鎖Ｆｖ類、を記載するために 使用されている。抗体の残りはＩｇ−誘導された蛋白質配列だけがらなっている 必要はない。例えば、人間の１ｇ鎖のＤＮＡ配列コード付は部分はポリペプチド エフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコード付けするＤＮＡ配列 と融合されている遺伝子を構成することができる。従って、「抗体」はハイブリ ッドを包括している（下記を参照のこと）。

略語ｒＭＡｂＪは、ノゾブリドーマまたは誘導体細胞系により製造された単クロ ーン性抗体を示すために使用されている。

「組換え型抗体」という語は、組換え型ＤＮＡ技術の使用を含む方法により製造 された抗体を記載するために使用されている。

「キメラ性抗体」という語は、変異領域全体が第一の哺乳動物種からの抗体から 誘導されており且つ異なる哺乳動物種からの抗体がらの少なくとも１個の不変領 域上に融合されているような抗体を記載するために使用されている。

「ハイブリッド抗体」という語は、ペプチド結合により別の蛋白質の少なくとも 一部と結合されているＩｇの少なくとも抗原結合部分を含んでいる蛋白質を記載 するために使用されている。一部の専門研究者はそのような構造を記載するため に「キメラ」という語を使用するかもしれないが、本明細書ではそのような構造 はハイブリッド抗体と称されておりそしてキメラ性抗体という語は上記の意味で 使用されていると認識されよう。

ｒＣＤＲ−移植された抗体」という語は第一の種からの抗体から誘導される変異 領域の１個または２個中に少なくとも１個のそして好適には２個または３個のそ れのＣＤＲを有しており、抗体の残りのＩｇ−誘導部分が１個以上の異なる抗体 から誘導されているような抗体を記載するために使用されている。変異領域は組 換え型ＤＮＡ技術の使用によりまたはペプチド合成により製造できる。

「表示媒介体」はそこに含まれているＤＮＡ配列を表示することのできる媒介体 を含んでおり、すなわちコード付は配列はそれらの表示を行うことのできる他の 配列と操作可能状態で結合されている。有効な表示媒介体の有用であるが必ずし も常に必要ではない（すなわち昆虫細胞）要素はマーカーコード付は配列、すな わち細胞を容易に同定可能にさせる蛋白質を含有している細胞の表現性質（例え ばネオマイシン抵抗性、メチオニンスルホキシミン抵抗性またはトリプトファン 原栄養性）をもたらす媒介体配列をコード付けする配列、である。総合すると、 「表示媒介体」は機能的定義を与えており、そして特定の含有されているＤＮＡ コードの表示を行うことのできるＤＮＡ配列が特定配列に適用されるため該配列 がこの語に含まれている。目下、そのような媒介体はしばしばプラスミドの形状 である。「プラスミド」および「表示媒介体」はしばしば交換可能に使用される 。しかしながら、本発明は、同等の機能に作用しそして時には先行技術で公知に なっているそのような他の表示媒介体形、例えばレトロウィルス、試験管内系［ ４８］など、も含むものである。

前記の如く、ＤＮＡ配列が表示対照配列と操作可能状態で結合された（すなわち 機能を確保するように配置された）後に、該ＤＮ、Ａ配列は宿主細胞中で表示さ れる。これらの媒介体は典型的には宿主有機体中でエピソームとしてまたは宿主 染色体ＤＮＡの一体部分として複製可能である。

「組換え型宿主細胞」とは、組換え型ＤＮＡ技術を用いて構成された媒介体を用 いて転換されている細胞を称している。この転換により、宿主細胞は希望する生 成物を、未転換宿主により製造されると予測されているように少量ではなくすな わちより一般的に言えば検出可能な量より少ない量ではなく、有用な量で生成す ることができる。組換え型宿主細胞により、本発明の抗体は追加実験を実施する のに有用な量ですなわち約１キログラム以上の如き商業的量で製造することがで きる。

組換え型宿主からの抗体の単離方法の記載では、「細胞」および「細胞培養」と いう語はそれが明らかに別に特定されていない隈り抗体源を示すために交換可能 に使用されている。換言すると、「細胞」からの抗体の回収は回転された全細胞 からのまたは媒体および懸濁された細胞の両者を含有している細胞培養からのま たはさらに骨髄腫細胞系の場合に可能なように腹水培養からの回収を意味してい る。

天然ｒｇ類は検定、診断そしてより限定された範囲では治療において使用されて いる。しかしながら、特に治療におけるそのような用途は天然Ｉｇ類の多クロー ン性により妨害されている。治療剤としてのＩｇ類の可能性を実現させるための 意義ある段階は、定義されている特異性ＭＡｂ類の製造技術の発見である。ＭＡ ｂ類は一般的には誓歯動物の膵臓細胞と醤歯動物の骨髄腫細胞との融合により製 造されており、従って本質的に誓歯動物の蛋白質である。しかしながら、人間の ＭＡｂ類の成功を収めた製造はほとんど報告されていない。

Ｔリンパ球およびＴリンパ球の部分集合上の抗原に関する特異性を有する一連の ＭＡｂ類は、ヨーロッパ特許出願０　０１７　３８１、ヨー口・７バ特許出願０ 　０１８　７９４、ヨーロッパ特許出願０　０１９　１９５、ヨーロッパ特許出 願００２５７２２、ヨーロッパ特許出願ＯＯ３０４５０、ヨーロッパ特許出願０ 　０３０　８１４およびヨー口１．ツマ特許出願００３３　５７８中に記載され ている。

はとんどの入手可能なＭＡｂ類は全て薩歯動物源であるため、それらは人間にお いては当然抗原性であり、従って例えば人間の抗−ノーツ力ネズミ抗体（ＨＡ　 Ｍ　Ａ　）応答と称されている応答の如き望ましくない免疫応答を引き起こす可 能性がある。従って、人間における治療剤としての醤歯動物のＭＡｂ類の使用は 、人間患者のＭＡｂに対する免疫学的応答が増加するかもしれずモしてＭＡｂを 全部除去するかまたはそれの効果を少なくとも減少させてしまうという事実によ り、必然的に限定されている。従って、ＨＡＭＡ応答が発展してＭＡｂを無効に させそして望ましくない副反応を引き起こすため、実際には醤歯動物のＭＡｂ類 は１回より多いすなわち２．３回の治療のためにに患者に対して使用することに は一般的には推奨されていない。

従って、非−人間ＭＡｂ類を人間中でより小さい抗原性にさせるための提案がな されてきている。そのような技術は一般的に「人間化」技術と称することができ る。これらの技術は一般的には、抗体分子のポリペプチド鎖をコード付けするＤ ＮＡ配列を操作するための組換え型ＤＮＡ技術の使用を含んでいる。

最近の数年間では、分子生物学における進歩は希望する生成物を製造するために コード付けする異種ＤＮＡ配列を用いる宿主細胞の転換による広範囲の異種ポリ ペプチド類の製造を基にしている。

ヨーロッパ特許出願００８８９９４（シエリング・コーポレーション）は、あら かじめ決められた配位子に特異的であるＩｇのＬまたはＨ鎖の変異領域にコード 付けするｄｓＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡの構造を提唱している。ｄｓＤＮ Ａ配列にはそれぞれそれの５′−および３′−末端に開始および終結コドンが備 えられているが、変異領域に不必要なアミノ酸類をコード付けするヌクレオチド はない。ｄｓＤＮＡ配列はバクテリア細胞を転換させるために使用される。該出 願は変異領域の配列の変異は考えてはいない。

ヨーロッパ特許出願０　１０２　６３４　（武田化学工業株式会社）は、人間の ＩｇＥのＨ鎖ポリペプチドの全部または一部をコード付けする遺伝子のバクテリ ア宿主有機体におけるクローニングまたは表示を記載しているが、ポリペプチド の配列における変異は考えてはいない。

ヨーロッパ特許出願０　１２５　０２３　（ゲネンテク・インコーホレーテッド ）は、通常はを椎動物系で見いだされるものと同様なＩｇ類を製造しそしてそこ で提唱されている遺伝子修飾技術を利用してキメラ性抗体または他の修飾形の抗 体を構成するためのバクテリア細胞中の組換え型ＤＮＡ技術の使用を提唱してい る。

上記のゲネンテク出願でなされている提案は意義ある量のＩｇポリペプチド鎖の 表示をもたらすものではなく、Ｉｇ活性の製造ももたらすものではなく、希望す るキメラ性抗体中への鎖の分泌および集合をもたらすものではないと信じられて いる。

哺乳動物細胞中へのＩｇ遺伝子ＤＮＡの安定な加入を可能にする技術の最近の出 現により［３］　−［５］　、試験管内での変異誘発および新規な性質を有する 組換え型抗体を構成するためのＤＮＡトランスフェク／ヨンを使用する可能性が 開かれてきた。

しかしながら、抗体分子の機能はそれの三次元構造に依存しており、該構造はそ れの最初のアミノ酸配列に依存していることは知られている。

従って、抗体のアミノ酸配列の変化がそれの活性に悪影響を与える可能性がある 。さらに、抗体にコード付けするＤＮＡ配列における変化がＤＮＡ配列を含有し ている細胞が抗体を表示、分泌または集合させる能力に影響を与える可能性もあ る。

従って、組換え型ＤＮＡ技術により機能的に変化した抗体を製造できることは全 く明白なことではない。しかしながら、本発明の同僚は蛋白質の２部分が機能性 であるハイブリッド抗体を分泌できる方法を発明した。この方法は国際特許出願 番号ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３９２中に開示されている。しかしながら、上記の ＰＣＴ出願は完全な変異領域がＤＮＡ配列の第一部分によりコード付けされてい るハイブリッド抗体の製造だけを示している。それは変異領域の配列が変更され ているハイブリッド抗体は示していない。

ヨーロッパ特許出願０　２３９　４００は、ハツカネズミのＭＡｂのＣＤＲ類を 長いオリゴヌクレオチド類を用いる部位指定変異誘発により人間のＩｇの変異領 域の骨格部１分上に移植する方法を記載している。発明者は、骨格部分の天然ア ミノ酸配列の変更可能性にも言及している。

ＣＤＲ−移植によるＭＡｂ類の変更に関する最も初期の研究は、ＭＡｂ認識合成 抗原、例えばＮＰまたはＮＩＰ抗原、に対して行われた。しかしながら、それぞ れリゾチームを認識するハツカネズミのＭＡｂおよび人間のＴ−細胞上の抗原を 認識する鼠のＭＡｂがＣＤＲ−移植により人間化された実施例が記載されている ［６］および［７コ。

参考文献［７］は、ＣＤＲ単独の移入（この論文で定義されている）はＣＤＲ− 移植された生成物中での満足のいく抗原結合活性を与えるには不充分であること を示している。参考文献［７］は、人間の配列の位置２７におけるセリン残基を 対応する鼠のフェニルアラニン残基に転化させて満足のい（抗原結合活性を有す るＣＤＲ−移植された生成物を得ることが必要であることを示している。Ｈ鎖の 位置２７におけるこの残基はＣＤＲＩに隣接している構造ループ内にある。Ｈ鎖 の位置３０における鼠のチロシン変化の他に人間のセリンも含有している別の構 造は、セリンを用いるＣＤＲ−移植された抗体と比べて、位置２７だけにおける フェニルアラニン変化に対する意義ある変えられた結合活性は有していない。こ れらの結果は、比較的複雑な抗原を認識するＣＤＲ−移植された抗体に関しては ＣＤＲ領域外の、特にＣＤＲＩに隣接しているループ中での、人間配列の残基に 対する変化は有効な抗原結合活性を得るために必要であるかもしれないことを示 している。

ＣＤＲ−移植による抗−ＴＡＣ単クコクローン性抗体更させるための技術も最近 記載されている。人間の骨格領域を選択して抗−ＴＡＣ抗体配列との相同性を最 大にしながら、ＣＤＲ外の数種の追加アミノ酸類は保有されていた。このように して変更された抗−ＴＡＣ抗体は、鼠の抗−ＴＡＣの約１／３の人間インターロ イキン−２のｐ５５鎖に対する親和性を有している［８］。

ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５８５７は、ＩＬ−２レセプターのｐ５５ＴＡＣ蛋白質に 特異的であるＣＤＲ−移植された抗体も記載している。抗原結合活性を得るため には、ＣＤＲ−移植された抗体が、ＣＤＲの他に少な（とも１個がドナー１ｇ中 のＣＤＲとすぐ隣接しているドナーＩｇからの３個以上のアミノ酸がドナー抗体 のものに対応して変化するかもしれないことがそこで言われている。

従って、ＣＤＲ−移植された抗体の製造は簡単でないということは容易に明らか である。ドナーＩｇからのＣＤＲをアクセプターＩｇからの骨格部分上に移植す ることだけでは、しばしば不充分である。結合活性を得るためには、アクセプタ ー抗体の骨格部分中の残基を変更することも必要である。しかしながら、たとえ あっても骨格残基を変える必要があるかどうかを、利用できる先行技術に基づい て予測することは不可能である。

ヨーロッパ特許出願００１８　７９４は、人間のヘルパーＴ細胞の抗原特性を認 識する鼠のＭＡｂｗｏ記載している。そのようなＭＡｂの特定例は該出願中に記 載されておりそして０ＫＴ４と表示されている。それが認識する抗原はは一般的 にＣＤ４抗原と称されている。ＭＡｂは米国、ニューシャーシー州、ラリタンの オルト・ダイアグノスティック・システムス・インコーホレーテッドから商業的 に入手することができる。

０ＫＴ４Ａとして知られている鼠のＭＡｂも同じ供給者から入手することができ る。これは○ＫＴ４により認識されるものとは異なるエピトープをＣＤ４抗原上 で認識する。

霊長類における移植実験は、０ＫＴ４および０ＫＴ４ａの両者が移植生存率を増 加させることができそして人間における免疫モジュレータ−として有用であるこ とを示している。鼠のＭＡｂＯＫＴ３を用いる腎臓移植患者の治療から得られた 経験は、時々患者集団が抗体の０ＫＴ３への中和を生じることを示している。こ の免疫応答が繰り返し投与を妨げてている。鼠の抗−ＣＤ４抗原上に対する予測 された免疫応答を減少させるために、鼠のＣＤＲ並びに人間の骨格および他のＩ ｇ誘導部分を有するＣＤＲ−移植型の０ＫＴ４Ａを製造することが望ましい。

しかしながら、上記の如（、ＣＤＲ−移植された抗体を構成するための簡単な方 式は必ずしも常に抗原を有効に結合させる抗体をもたらすものではない。ＣＤＲ 類を含んでいる正確な残基を定義するのは難しく、そしてそれらは必ずしも超変 異部中の全ての残基に対応するものではない。抗原との相互作用のためにＣＤＲ 類を配置するのに重要であるかまたはＨおよびＬ鎖の間の相互作用に含まれてい る臨界的な骨格残基があるかもしれない。ある種の骨格残基を変更してそれらが これらの位置における鼠の残基に対応するように変更させてＣＤＲ−移植された 抗体の「人間」性を比較的小さくさせることが必要となるかもしれない。

特異的なＣＤＲ−移植された抗体の製造の試みに固有の諸問題にもかかわらず、 好適態様においては本発明は人間の骨格部分を基にしておりそしてＣＤ４抗原を 認識する抗原結合部位を有するＣＤＲ−移植された抗体の製造に成功を収めた。

ある種の特に好適な態様では、ＣＤＲ−移植された抗体は鼠のＭＡｂＯＫＴ４Ａ のものと同様なＣＤ４抗原に対する親和性を有している。

従って、本発明により、骨格部分が主として第一の抗体（アクセプター）から誘 導されておりそして少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー）から誘導さ れている少なくとも１個の鎖を有している、ＣＤ４抗原を結合することのできる ＣＤＲ−移植された抗体が提供される。

好適には、ＣＤＲ−移植された鎖がドナー抗体から誘導された２個のそして最も 好適には３個全てのＣＤＲを有している。

有利には、ＣＤＲ−移植された鎖中で、該ＣＤＲまたは各ＣＤＲがＣＤＲからの 全ての残基および対応するドナー抗体の超変異部中の全ての残基からなる複合体 ＣＤＲからなっている。

好適には、ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分中の少なくとも１個の残基がそれが 抗体中の同等な残基に対応するように変更されている。

好適には、ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分が人間の抗体から誘導されている。

有利には、ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分が人間のＩｇＨ鎖から誘導されてい る。そのようなＨ鎖骨格部分中では、Ｈ鎖中の残基３５がそれがドナー抗体中の 同等な残基に対応するように変更されていることが好ましい。

有利には、そのようなＨ鎖に関しては、それぞれ残基２６−３５．５０−６５ま たは９５−１０２を含んでいる少なくとも１個の複合体ＣＤＲが人間の骨格上に 移植されていることが好ましい。この場合には、残基３５があらかじめドナー抗 体中の同等な残基に対応していることがわかるであろう。

好適には、そのようなＨ鎖中の残基２３．２４および４９はそれがドナー抗体中 の同等な残基に対応している。そのようなＨ鎖中の残基６．２３．２４．４８お よび４９がドナー抗体中の同等な残基に対応することがより好適である。希望に より、残基７１．７３および７９もそのように対応していてもよい。

親和性をさらに最適にさせるために、残基５７．５８．６０．８８および９１の いずれかまたは組み合わせをドナー抗体中の同等な残基に対応させることもでき る。

Ｈ鎖は好適には人間のＫＯＬＨ鎖から誘導される。しかしながら、それを人間の ＮＥＷＭまたはＥＵＨ鎖から誘導することもできる。

一方、ＣＤＲ−移植された鎖中の骨格部分を人間のカッパまたはラムダし鎖から 誘導することもできる。そのようなＬ鎖に関しては、有利にはそれぞれ残基２４ −３４．５０−５６または８９−９７を含んでいる少なくとも１個の複合体ＣＤ Ｒが人間の骨格上に移植されている。好適には、残基４９はドナー抗体中の同等 な残基に対応している。

親和性をさらに最適にさせるために、残基４９および８９がドナー抗体中の同等 な残基に確実に対応させることが好ましい。塩架橋を形成する同等なドナー残基 を選択することも望ましい。

Ｌ鎖は好適には人間のＲＥＩＬ鎖から誘導されている。しかしながら、それを人 間のＥＵＬ鎖から誘導させることもできる。

好適には、本発明のＣＤＲ−移植された抗体はＬ鎖およびＨ鎖を含んでおり、そ れらの一方または好適には両方が個々のＬおよびＨ鎖に関して以上で示されてい る原則に従いＣＤＲ−移植されている。

好適な場合には、Ｈ鏡上の３個全部のＣＤＲが変更されておりそしてＬ鎖中では 最少の変更がなされていることが有利である。０．１または２個のＬ鎖ＣＤＲが 変更されておりそし２て依然として結合親和性を相当な水準で保有することも可 能である。

ある場合にはＨおよびＬ鎖の両方に関してドナーおよびアクセプター残基が特定 位置においては同一であり従ってアクセプター骨格残基の変化は必要でないとい うことは認識されるであろう。

ＣＤＲ−移植された抗体の人間性質をできるだけ保有するには、できるだけ少な い残基変化を行うべきであることも認識されるであろう。多くの場合には、それ 以上のＣＤＲおよび少数の骨格残基を変化させる必要がないことが考えられる。

例外的な場合にだけ、大量の骨格残基を変化させることが必要であろう。

好適には、ＣＤＲ−移植された抗体は完全Ｔｇ、例えばアイソタイプＩ　ｇＧ、 またはＴｇＧ４のもの、である。

希望により、−窓領域のエフェクター機能を変更させるために、Ｉｇの一定領域 において１個以上の残基を変更させることもできる。

好適には、ＣＤＲ−移植された抗体は約１０５．Ｍ−’−１０”、Ｍ−’の間の 、より好適には少なくともｌＱ８．Ｍ−’の、ＣＤ４抗原に対する親和性を有し ており、そして最も好適には、親和性はＭＡｂＯＫＴ４または０ＫＴ４Ａのもの と同様である。

有利には、該ＣＤＲまたは各ＣＤＲは哺乳動物の抗体からそして好適には鼠のＭ Ａｂから誘導される。

有利には、ＣＤＲ−移植された抗体は組換え型ＤＮＡ技術の使用により製造され る。

本発明の第二面に従うと、本発明の第一面に従う第一のＣＤＲ〜移植された抗体 の製造方法が提供されており、該方法は、ＤＮＡ配列を準備し、骨格部分が主と して第一の抗体（アクセプター）から誘導されておりそして少なくとも１個のＣ ＤＲが第二の抗体（ドナー）から誘導されている第一の抗体績を適当な上向き流 および下向き流要素の調節下でコード付けし、宿主細胞を第一のＤＮＡ配列で転 換させ、そして転換された宿主細胞を培養して、本発明の第一面に従うＣＤＲ− 移植された抗体を製造することからなっている。

好適には、該方法はさらに、第二のＤＮＡ配列を準備し、第一の鎖と相補性の第 二の抗体績を適当な上向き流および下向き流要素の調節下でコード付けし、そし て宿主細胞を第一および第二の両者のＤＮＡ配列で転換させることも含んでいる 。

有利には、第二のＤＮＡ配列が、骨格部分が主として第一の抗体（アクセプター ）から誘導されておりそして少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー）か ら誘導されている第二の抗体績を、コード付けしている。

第一および第二のＤＮＡ配列が同一媒介体上に存在していてもよい。

この場合、配列は同一のもしくは異なる上向き流および／または下向き流要素の 調節下にあることができる。

一方、第一および第二のＤＮＡ配列が異なる媒介体上に存在していてもよい。。

本発明の第三面に従うと、骨格部分が王として第一の抗体（アクセプター）から 誘導されておりそして少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー）から誘導 されている抗体績をコード付けし、該抗体績により本発明の第一面に従うＣＤＲ −移植された抗体が製造できる、ヌクレオチド配列が提供される。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体は、治療における、特に移植拒絶反応の治療ま たはヘルパーＴ細胞疾病の治療における、特定用途が考えられる。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体は種々の技術により製造することができ、例え ば酵母、昆虫、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞の如きトランスフェクション化された細 胞中の表示が好適である。最も好適には、宿主細胞はＣＨＯ宿生細胞である。

ＣＤＲ−移植された抗体を設計するためには、最初に希望する結合性質を有する 抗体の変異領域配列を確認することが必要である。そのようなりＮＡ配列用に適 している原料細胞には、鳥類、哺乳動物または他のを推動物、例えば鶏、ハツカ ネズミ、鼠および兎、そして好適にはハツカネズミ、が包含される。変異領域配 列（Ｖ　ＨおよびｖＬ）は、一般的に当業界で公知の技術により各ｍＲＮＡから 合成されたＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡから測定することができる。次に照度異部分を カバット方法［２］を用いて測定することができる。ＣＤＲはＸ−線結晶写真ま たは分子モデル作成技術を用いる構造分析により測定することができる。すると 、複合体ＣＤＲが１個のＣＤＲ中に全ての残基をそして対応する照度異部分中に 全ての残基を含有していると定義することができる。これらのＣＤＲは骨格部分 からのある種の選択残基と共に好適には「抗原結合部位」として転換されるが、 抗体の残部、例えばＨおよびＬ鎖−窓領域並びに残存骨格部分、は異なる種類の 人間抗体を基にしていてもよい。そのように構成された抗体の意図する用途に適 している希望するエフェクター機能を有するように、−窓領域を選択できる。例 えば、人間のＩｇＧアイソタイプであるＩ　ｇ　Ｇ　１およびＩ　ｇＧ３は完全 固定および細胞伝達溶解用に有効である。他の目的用には、例えばＩ　ｇＧ２お よびＩｇＧ４の如き他のアイソタイプ類または例えばＩｇＭおよびＩｇＥの如き 他の種類がさらに適しているかもしれない。

人間の治療用には、治療中の抗グロブリン応答を最少にするために人間のアイソ タイプを使用することが特に望ましい。人間の一定領域ＤＮＡ配列は、好適には それらの変異領域骨格基部と一緒に、公知の工程に従い製造することができる。

これの−例は、ブラフス・ウェルカム・リミテッドから入手できるＣＡＭＰＡＴ ＨＩＨである。

本発明の好適態様に従うと、人間様の骨格部分（換言すると、変異領域のＣＤＲ 外）への選択変更を含んでいるある種のＣＤＲ移植された抗体が提供されて、満 足のいく結合親和性を有するＣＤＲ−移植された抗体を生じる。そのような結合 親和性は好適には約１０５．Ｍ−１−１０”。

Ｍ　−１、より好適には少な（ともｌＱ８．Ｍ−１、である。最も好適には、結 合親和性は鼠のＭＡｂＯＫＴ４Ａのものと大体同等である。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体の構成においては、Ｖｌｌおよび／またはＶＬ 遺伝子部分は変異誘発により変更されているかもしれない。当技術の専門家は、 抗体のＦｃ部分または他の面に含まれているアミノ酸残基または配列にコード付 けする種々の他のヌクレオチド類を同様な方法で変更できることも理解するであ ろう（例えばＰＣＴ／ＵＳ８９１００２９７を参照のこと）。

例示技術には、適当な読み取り枠が保有されているなら、限定数の種々のヌクレ オチド類の追加、欠失もしくは非保存型置換または多数のヌクレオチド類の保存 型置換が包含される。

最終的な構造にするためには、置換、欠失、挿入またはいずれかの複合を使用す °ることができる。６４個の可能なコドン配列があるが公知のアミノ酸は２０個 だけであるため、異なるコドンが同一のアミノ酸を生成するかもしれないという 意味で遺伝コードは退化性である。しかしながら、コードは１個のアミノ酸に対 しては厳密である。従って、１個のアミノ酸に対しては少なくとも１個のコドン があり、すなわち１個のコトンは単一のアミノ酸を生成しそして他のものは生成 しない。最終的に製造されるポリペプチド中の適切なアミノ酸配列を得るために は翻訳中に適当な読み取り枠を保有すべきであることは明らかであろう。

既知の配列を有するあらかじめ測定されたアミノ酸部位における追加、欠失また は置換に関する技術は公知である。例示技術には、オリゴヌクレオチド−伝達さ れた部位指定変異誘発およびポリメラーゼ鎖反応が包含される。

オリゴヌクレオチド−伝達された部位指定変異誘発は本質的には、希望する変異 誘発をコード付けするオリゴヌクレオチドを変異誘発させようとする部分を含有 している１個のＤＮＡストランドで７−イプリ・ンド化させ、モして該１個のス トランドをオリゴヌクレオチドの延長用鋳型として用いて突然変異を含有してい るストランドを製造することを含んでいる。この技術は、種々の形態で、参考文 献［９］　−［１２］に記載されている。

ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は本質的には、オリゴヌクレオチドに対して特異 的な配列を用いて試験管内でＤＮＡを指数増幅させることを含んでいる。オリゴ ヌクレオチドは希望により配列変更を含むこともできる。ポリメラーゼ鎖反応は 参考文献［１３］中に記載されている。ＰＣＲを用いる変異誘発の例は参考文献 ［１４］　−［１７］中に記載されている。

最終的には希望するＣＤＲ−移植された抗体を表示することのできる本発明のヌ クレオチド配列は、種々のポリヌクレオチド類（ゲノム性ＤＮＡ５ｃＤＮＡＳＲ ＮＡまたは合成オリゴヌクレオチド類）から製造することができる。現在では、 ポリヌクレオチド配列がｃＤＮＡおよびゲノム性ＤＮＡの融合を含んでいること が好適である。ポリヌクレオチド配列は種々のｒｇ成分類（例えば、Ｖ、Ｊ、Ｄ 、およびＣ領域）をコード付けすることができる。それらは種々の技術により構 成することができる。適当なゲノム性およびｃＤＮＡ配列の連結が現在では最も 一般的な製造方法であるが、ｃＤＮＡ配列を使用することもできる（ヨーロッパ 特許出願０　２３９　４００および［７］を参照のこと）。

ある種の適切な表示媒介体および宿主細胞は、米国特許出願４８１６５６７中に 記載されている。

そこに開示されている媒介体および方法は広範囲の原核性および真核性有機体に わたる宿主細胞中での使用に適している。

もちろん、一般的には本発明で有用な媒介体を構成するためのＤＮＡ配列のクロ ーニング用には原核生物が好適である。例えば大腸菌ＤＨ５αが特に有用である 。もちろん、この例は説明用であり限定用ではない。

原核生物を表示用に使用することもできる。上記の大腸菌株、バララス類、例え ば枯草菌、および他の腸内細菌科、例えば不ズミチフス菌またはセレイシア・マ ルセッセンス、および種々のシュードモナス種を使用することができる。

一般的には、宿主細胞と相容性である種から誘導されたレプリコンおよび対照配 列を含有しているプラスミド媒介体がこれらの宿主と関連して使用される。媒介 体は一般的には、転換された細胞中で表現型選択を与えることのできる複製部位 並びに標識配列を有している。例えば、大腸菌は典型的には大腸菌種から誘導さ れるプラスミドであるｐＢＲ３２２の多数の誘導体を用いて転換される。ｐＢＲ ３２２はアンピシリンおよびテトランクリン抵抗性のための遺伝子を含有してお り、従って転換された細胞を同定する容易な方法を与えるものである。ｐＢＲ３ ２２プラスミド、それの世代降下または他の微生物プラスミドは、組換え型蛋白 質の表示用に微生物有機体により使用できるプロモーターを含有することができ または含有するように改変することができる。組換え型ＤＮＡ構造中で一般的に 使用されているこれらのプロモーターには、ラクトースプロモーター系［１９］ 　−［２］コ並びにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［２２］およびヨ ーロッパ特許出願０　０３６　７７６が包含される。これらが最も一般的に使用 されているが、他の微生物プロモーターも発見および使用されており、そしてそ れらのヌクレオチド配列に関する詳細事項が発表されており、専門研究者はそれ らをプラスミド媒介体中へ結紮させることができる［２３コ。

原核生物の他に、例えば酵母培養の如き真核性微生物を使用することもできる。

サツカロミセス・セレグイシエすなわち一般的なパン酵母が真核性微生物の中で は最も一般的に使用されているが、多数の他の菌株も一般的に利用できる。サツ カロミセス中での表示用には、プラスミドＹＲｐ７、例えば［２４］および［２ ６］、が一般的に使用されている。

このプラスミドはすでに、トリプトファン中での成長能力を有していない酵母の 変異菌株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１［２７］、用の分 泌標識を与えるｔｒｐｌ遺伝子を含有している。酵母宿主細胞ケノムの特徴であ るｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの不存在下における成長による転換検 出用の有効な環境を与える。

酵母媒介体中の適当な促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ［２８］ または他のグリコール性酵素用のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルア ルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルベートデ カルボキンラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイ ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオー スホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーセおよびグルコキナ ーゼ［２９］および［３０コが包含される。適当な表示プラスミドの構造におい ては、これらの遺伝子と会合されている終結配列もｍＲＮＡおよび終結のポリア デニル化を与えるために表示されることが望まれている配列の表示媒介体３′中 に結紮されている。成長条件により調節される転写という別の利点を有する他の プロモーターは、アルコールデヒドロケナーゼ２、イソシトクロームＣ１酸ホス フアターゼ、窒素代謝と会合されている酵素、並びに上記のグリセルアルデヒド −３−ホスフェートデヒドロゲ六−ゼ、マルトースおよびガラクト−ス利用に応 答可能な酵素［３０］用のプロモータ一部分である。酵母相容性プロモーター、 複製源および終結配列を含有しているプラスミド媒介体が適している。

微生物の他に、多細胞有機体から誘導される細胞の培養を宿主として使用するこ ともできる。原則的には、を推動物または非を推動物有機体のどちらから得られ たそのような細胞培養でも操作することができる。

しかしながら、現在までには、を推動物細胞の興味が最も大きく、そして培養（ 組織培養）中のを推動物細胞の繁殖が最近の数年間に日常的な工程になり始めて いる［３］］。そのような有用な宿生細胞系の例は、ＶＥＲＯｌＨｅＬａ、チャ イニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）　、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７、Ｍ ＤＣＫおよび骨髄腫細胞系である。そのような細胞用の表示媒介体には、（必要 なら）適当な複製源、並びに表示しようとする遺伝子の前に！かれているプロモ ーターが、必要なすポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ボリアディル化 部位および転写終結剤配列と共に、包含される。

哺乳動物の細胞中での使用のためには、表示媒介体上の対照機能はしばしばウィ ルス物質により与えられる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは人間の シトメガロウイルス（ＨＣＭ　Ｖ　）　、ポリオマウイルス、アデノウィルス２ 、および最も好適にはノミアンウィルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ ４０ウィルスの初期および後期プロモーターが特に有用であり、その理由は両者 とも該ウィルスから複製ＳＶ４０ウィルス源も含有しているフラグメントとして 容易に得られるからである。さらに、対照配列が宿主細胞系と相容性である限り 、希望する遺伝子配列と一般的には会合されているプロモーターまたは対照配列 を利用することもでき、そしてそれがしばしば望ましい。

複製源は、例えばＳＶ４０もしくは他のウィルス（例えばポリオマウイルス、ア デノウィルス、ＶＳ■もしくはＢＰＶ）源から誘導されるような外因性源を含む ような媒介体の構造により供給することもでき、または宿主細胞染色体複製機構 により供給することもてきる。媒介体を宿主細胞染色体中に一体化する場合には 、しばしば後者で充分である。

当該ＤＮＡ部分（例えばＨおよびＬ鎖コード付は配列並びに表示対照配列）を含 有している媒介体を、細胞宿主の型により変わる公知の方法により、宿主細胞に 転換させることができる。例えば、塩化カルシウムトランスフエクンヨンが原核 性細胞用に一般的に使用されているが、燐酸カルシウム処理、リポフエクション またはエレクトロポレーションを他の細胞宿主用に使用することができる［３３ ］。

表示された後に、本発明のＣＤＲ−移植された抗体を、硫酸アンモニウム沈澱、 親和性カラム、カラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの当技術の標 準的工程に従い精製することができる［３４］。このようにして表示された構造 の結合親和性は、本明細書の実施例部分でさらに充分例示されている当技術で公 知の技術により確認することができる。

少なくとも９０−９５％の均質性を有する実質的に純粋なＣＤＲ−移植された抗 体が好適であり、そして９８−９９％またはそれ以上の均質性が薬学的使用には 最も好適である。部分的にまたは希望する均質度まで精製された後に、ＣＤＲ− 移植された抗体を次に診断用もしくは治療用（体外的も含む）または検定工程、 免疫蛍光染色などの開発および実施において使用することができる［３５］。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体は典型的には、Ｔ−細胞伝達疾病の治療におけ る用途が見いだされるであろう。例えば、治療に適している典型的な疾病症状に は、例えば心臓、肺、腎臓または肝臓の如き器官の移植を受けた患者における移 植対宿主疾病および移植拒絶反応が包含される。池の疾病には、自己免疫疾病、 例えばタイプ■糖尿病、多発性硬化症、類リューマチ関節炎、全身的紅斑性狼癒 および筋無力症が包含される。

Ｔ細胞は、例えば巨大細胞の如き特異的な抗原表示細胞上および他の組織上の特 異的なＨＬＡ分子と結合されているペプチドを認識することのできる唯一のＴ細 胞抗原レセプターを表示する単一細胞からのクローン性拡大である。これらのＴ 細胞の活性化を、Ｔ細胞レセプター複合体またはペプチド−ＨＬＡ複合体を認識 する抗体により、遮蔽することができる。０ＫＴ３は、Ｔ細胞レセプターと物理 的に複合されている数種の副単位からなるＣＤ３分子を認識する。ＣＤ４および ＣＤ８分子を含むＴ細胞上の他の数個の分子も、Ｔ細胞レセプター結合部位とは 異なる部位におけるＨＬＡ分子との結合によりＴ細胞活性化に含まれている。

ＣＤ４はＴ細胞とＨＬＡ種類工１分子を認識するＴ細胞レセプターとの亜集団上 で見いだされる。従って、免疫抑制の一方式は免疫抑制性である単クローン性抗 体、例えば０ＫＴ４または０ＫＴ４Ａ、の使用を含んでおり、その理由はそれら がＣＤ４分子とＨＬＡ種類ＩＩ分子との相互作用を抑制するからである。ＣＤ４ に対する抗体結合が、通常の活性化信号、下降抑制信号通路の始動、または細胞 表面からのこのレセプターの調整を含む多数の機構により免疫抑制をもたらすこ とができる。それは他の同種反応性または自己反応性の亜集団を抑制することの できるＴ細胞の亜集団を誘発することもできる。抗−ＣＤ４抗体は、相補性もし くは抗体−依存性Ｔ細胞溶解の誘発によりまたは血液流もしくは炎症部位からの Ｔ細胞の除去により、作用することができる。従って、各抗体のＦｃ−レセプタ ー結合特性はそれらの機能にとって重要である。別の方式は、放射標識が付けら れているかまたは毒素と結合されている抗−ＣＤ４抗体の使用を含んでいる。

これらの抗−ＣＤ４抗体のこれらの免疫抑制性質が、移植および自己免疫に伴わ れる疾病を伝達する活性化されたＴリンパ球の抑制において治療的に使用される 。ＣＤ４分子はＨＩＶウィルスのｇｐ１２０副単位用のレセプターでもある。０ ＫＴ４Ａはｇｐ１２０とＣＤ４との結合を抑制するため、この抗体またはそれの フラグメントはウィルス感染を遮蔽することができる。

ＣＤ４分子は、ＨＬＡ種ＩＩ分子との結合の結果としてのＴ細胞に対する同時刺 激信号を与える際に、通常音まれている。従って、抗−ＣＤ４抗体が他の信号誘 発試薬と組み合わされて同時刺激機能を与えることも可能である。この治療方式 は免疫折衷患者の治療において有用である。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体は他の抗体、特に該疾病に応答する人間細胞上 の他の標識と反応性であるＭＡｂ、と組み合わせて使用することもできる。例え ば、適当なＴ−細胞標識にはファースト・インターナショナル・ロイコサイト・ ディファレンンエーション・ワークショップにより名付けられているいわゆる「 クラスターズ・オブ、デイファレンシエーション」に分類されるものが包含され る［３６］。

一般的には、このＣＤＲ−移植された抗体は精製された形状で薬学的に適してい る担体と一緒に使用される。典型的には、これらの担体には水性もしくはアルコ ール／水性の溶液、乳化液または懸濁液が包含され、食塩水および緩衝媒体も含 まれる。非経口的賦形薬には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、 デキストロース並びに塩化ナトリウムおよび乳酸処理されたリンゲルが包含され る。該複合体を懸濁液状に保つために、必要に応じて、例えばカルボキシメチル セルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩類の如き増粘 剤から適切な生理学的に許容可能な佐薬を選択することができる。

静脈内賦形薬には、流体および栄養補充剤および電気分解質補充剤、例えばリン ゲルデキストロースを基にしたもの、が包含される。防腐剤および他の佐薬、例 えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性気体、が存在することも できる［３７］。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体は、別個に投与される組成物としてまたは他の 試薬と一緒に、使用することができる。これらには、種々の免疫治療薬、例えば シクロスポリン、メトトレキシレート、アドリアマイシンまたはンスブラチナム 、および免疫毒素が包含される。薬学的組成物は、本発明のＣＤＲ−移植された 抗体と組み合わされた種々の細胞毒性または他の試薬の「カクテル」または本発 明に従うＣＤＲ−移植された抗体と異なる特異性を有するＣＤＲ−移植された抗 体の組み合わせも含むことができる。

本発明に従う薬学的組成物の投与方式は、当技術の専門家に一般的に公知である 方式のいずれであってもよい。限定免疫治療以外のものも含む治療用には、本発 明のＣＤＲ−移植された抗体を患者に標準的技術に従い投与することができる。

非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、または適宜カテーテルを用いる直接注入な どのいずれかの適当な方式により、投与を行うことができる。投与量および投与 頻度は、患者の年令、性および症状、他の試薬の同時投与、反対指示症候、並び に医師が考慮すべき他の要素に依存するであろう。

本発明のＣＤＲ−移植された抗体を貯蔵用に凍結乾燥しそして使用前に適当な担 体中で再構成することもできる。この技術は一般的な免疫グロブリン類を用いる 際に有効であることが示されており、そして当技術で公知の凍結乾燥および再構 成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性 損失をもたらすことがあり（例えば一般的な免疫グロブリンを用いると、ＩｇＭ 抗体はＩｇＧ抗体より大きい活性損失を有する傾向がある）そして使用基準を調 節して補充すべきであることは、専門家は認識しているであろう。

このＣＤＲ−移植された抗体を含有している組成物またはそれらのカクテルを予 防および／または治療処置用に投与することができる。ある種の治療適用では、 分泌される細胞集団の少なくとも部分的な抑制または死滅を与えるのに適してる 量が「治療上に有効な投与量」と定義される。この投与量を得るのに必要な量は 疾病の重さおよび患者自身の免疫系の一般的状態に依存しているが、一般的には １ｋｇの体重光たり０゜００５−５．０ｍｇのＣＤＲ−移植された抗体の範囲で あり、０．０５−２．０ｍｇ／ｋｇ／投与がより一般的に使用される。予防適用 には、本ＣＤＲ−移植された抗体を含有している組成物またはそれらのカクテル をそれと同様またはそれよりわずかに低い投与量で投与することができる。

本発明に従うＣＤＲ−移植された抗体を含有している組成物は、予防および治療 設定で利用して哺乳動物中の選択Ｔ細胞目標集団の変更、不活性化、死滅または 除去を助けることができる。

他の態様では、ここに記載されている構造を肉体外ですなわち試験管内で細胞の 不均質集合からの目標細胞集団を選択的に死滅、枯渇または別の方法で効果的に 除去するために使用することもできる。哺乳動物からの血液を肉体外でＣＤＲ− 移植された抗体と組み合わせて、それにより標準的技術に従い哺乳動物に戻すた めに望ましくない細胞を死滅させるかまたは他の方法で血液から除去することも できる。

治療用途の他に、ＣＤＲ−移植された抗体は診断検定における用途も見いだされ ている。ＣＤＲ−移植された抗体は当業界で公知の技術に従い標識付けすること ができる。ＣＤＲ−移植された抗体は生体内目的用にも適している。例えば、Ｃ ＤＲ−移植された抗体を末梢血液細胞の選択的細胞治療用に使用することもでき 、ここでは目標Ｔリンパ球だけを除去することまたは同様に細胞媒体中では望ま しくないＴリンパ球を除去することが望まれている。

次に添付図面を参照しながら本発明を単に例示用のために記載する。

図１は、０ＫＴ４ＡＨ鎖変異領域のヌクレオチド配列を示している。

図２は、０ＫＴ４ＡＬ鎖変異領域のヌクレオチド配列を示している。

図３は、ＣＤＲに下線が引かれている０ＫＴ４ＡＨ鎖変異領域アミノ酸配列を示 している。

図４は、ＣＤＲに下線が引かねている０ＫＴ４ＡＬ鎖変異領域アミノ酸配列を示 している。

図５は、ＣＤＲに下線が引かれており、人間の配列が上部の場合であり、そして 鼠の配列が下部の場合である、ＫＯＬと０ＫＴ４ＡＣＤＲ−移植された■（鎖ア ミノ酸配列との整列を示している。

図６は、ＣＤＲに下線が引かれており、人間の配列が上部の場合であり、そして 鼠の配列が下部の場合である、ＲＥＩと０ＫＴ４ＡＣＤＲ−移植されたＬ鎖アミ ノ酸配列との整列を示している。

図７は、ＣＤＲ−移植されたＨ鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸翻訳を示している 。

図８は、ＣＤＲ−移植されたＬ鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸翻訳を示している 。

図９は、ＣＤＲ−移植された○ＫＴ４ＡＨ鎖表示媒介体の構造を示している。

図１０は、キメラ性０ＫＴ４ＡＨ鎖と組み合わされたＣＤＲ−移植された○ＫＴ ４ＡＬ鎖構造の結合および遮蔽検定を示している。

図１１は、０ＫＴ４ＡＬ鎖と組み合わされた０ＫＴ４ＡＨ鎖構造であるＨＣＤＲ ｌ、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の結合および遮蔽検定を示している。

図１２は、ＣＤＨに下線力＜ｇ＋かれており、人間の配列が上部の場合であり、 そして鼠の配列が下部の場合である、ＲＥＩとＣＤＲ−移植されたＯ　Ｋ　Ｔ　 ４　Ａ　Ｌ鎖であるＬＣＤＲＩおよびＬＣＤＲ２との整列、並びに鼠の０ＫＴ４ ＡＬ鎖アミノ酸配列を示している。

図１３は、ＣＤＲに下線が引かれており、人間の配列が上部の場合であり、そし て鼠の配列が下部の場合である、ＫＯＬとＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ鎖で あるＨＣＤＲＩ−ＨＣＤＲＩＯとの整列、並びに鼠の０ＫＴ４ＡＨ鎖アミノ酸配 列を示している。

図１４は、ＣＤＲ−移植されたＬ鎖ＬＣＤＲ２と組み合わされたＣＤＲ−移植さ れたＨ鎖構造であるＨＣＤＲＩ、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の結合および遮蔽 検定を示している。

図１５は、Ｌ！ｍＬｃＤＲ２と組み合わされたＣＤＲ−移植されたＨ鎖構造であ るＨＣＤＲ４−ＨＣＤＲＩＯの結合および遮蔽検定を示している。

図１６（ＡおよびＢ）は、Ｌ鎖構造であるＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２ Ｑ、ＬＣＤＲ３Ｑ、およびＬＣＤＲ４Ｑ、並びにキメラ形の０ＫＴ４Ａとｍみ合 ワサれた０ＫＴ４ＡＨ！構造テあるＨＣＤＲ５、ＨＣＤＲ６、およびＨＣＤＲＩ Ｏの遮蔽検定を示している。

図１７は、陰性対照として鼠およびキメラ形の０ＫＴ３を用いる、Ｌ鎖構造であ るＬＣＤＲ２並びにキメラおよび皿形の０ＫＴ４Ａと組み合わされたｏＫＴ４Ａ Ｈ鎖構造であるＨＣＤＲ５およびＨＣＤＲＩＯの相対的親和性検定を示している 。

図１８は、陰性対照としてＴ６を用いる種々の抗体によるＭＬＲの抑制に関する 研究の結果を示している。

図１９は、種々の抗体による増殖の抑制に関する研究の結果を示している。

０ＫＴ４Ａの人間化 ○ＫＴ４Ａは、生としてヘルパー下リンパ球上に配置されているＣＤ４を認識す る鼠の単クローン性抗体である。ＨおよびＬ鎖の両者の変異領域のＣＤＲが鼠の ０ＫＴ４Ａ配列から誘導されているＣＤＲ−移植された抗体はこれまでに構成さ れている。変異領域骨格および一定領域は人間の抗体配列から誘導されていた。

ＨおよびＬ鎖の両者上にある３個のＣＤＲは、構造研究により抗原結合中に含ま れていることが示されているこれらの残基からなっている。

理論的には、鼠の０ＫＴ４Ａ抗体のＣＤＲが人間骨格上に移植されてＣＤＲ−移 植された変異領域を形成しておりそしてこの変異領域が人間の一定領域と連結し ているなら、生成するＣＤＲ−移植された抗体は本質的には人間のＣＤ４抗原を 結合させる鼠の０ＫＴ４Ａの特異性を有する人間抗体であるであろう。この抗体 の高い「人間」性があるなら、患者に投与される時には鼠の０ＫＴ４よりはるか に少ない免疫原性となることが予測されるであろう。

ＣＤＲだけが人間骨格上に移植されているＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体の 抗原結合に関する試験を行うと、これがＣＤ４抗原用の妥当な親和性を有するＣ ＤＲ−移植された抗体を製造しないことが示されていた。従って、機能的抗体を 発生させるためには、ＣＤＲの一部と隣接している追加残基および臨界的骨格残 基を人間から対応する鼠の０ＫＴ４Ａ残基に変換させる必要があるということが 決定された。

変異領域の０ＫＴ４ＡＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡおよびＤＮＡ配列分析の単ＣＤＲ− 移植された抗体を設計するためには、最初に鼠の０ＫＴ４ＡＨおよびＬ鎖の変異 領域の配列を測定することが必要であった。配列は、各ｍＲＮＡから合成されて いるＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡから測定された。

ｍＲＮＡは、０ＫＴ４Ａ−生成用ハイブリドーマ細胞から、グアニジニウムチオ シアネート抽出およびその後の塩化セシウム勾配精製により、製造された［３８ ］。カリフォルニア州う・ヨラのザ・Ｒ，Ｗ、ジョンソン・ファーマシューティ カル・リサーチ・インスティテユートにあるＪ。

ローゼン博士の研究室てｃＤＮＡが合成されそしてライブラリーが製造され、ふ るいわけされた。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから合成され、ＥｃｏＲＩリンカ−が加え られ、そしてそれを次にＩｇｔｌＯクローニング媒介体のＥｃｏＲＩ部位中に結 紮された。組換え型ファージを感染性粒子中に包装し、それらを使用して大腸菌 Ｃ６００を感染させた。

このライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブであるＣｇおよびＦＲ３を用い て０ＫＴ４ＡＨ鎖配列に関してふるいわけた。Ｃｇ（ファーマシア・ＬＫＢ・バ イオチクノロシーズ・インコーホレーテッドからのｍＲＮＡ配列用プライマー） は配列 ５’ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３’を有しており、そして鼠のＩｇＧ一定 領域と結合する。プローブＦＲ３は配列 ５’ＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴ３’を有しており、そして鼠のＨ鎖 の変異領域の第三骨格部分と結合する。

５個の陽性クローンを、南部翻訳およびプローブ類Ｃｇ、ＦＲ３およびｃＤＮＡ から鼠のＩｇＧ２ａＣＨ３へのハイブリッド化により、評価した。３個全てのプ ローブにハイブリッド化する１６００ｂｐＥｃｏＲＩ挿入を有する１個のクロー ンが選択された。

ライブラリーを、配列 ５’ＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧ３’を有しておりそ して鼠のカッパ一定領域と結合するオリゴヌクレオチドプローブであるＣｋ（フ ァーマノアからのｍＲＮＡ配列用プライマー）を用いて０ＫＴ４ＡＬ鎖配列に関 してふるいわけた。６個の陽性クローンをさらに南部翻訳および配列が ５’ＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧ３’を有しておりそ して鼠のカッパ鎖骨格領域３と結合するオリゴヌクレオチドプローブであるＴ４ ＡＫおよびＣｋへのハイブリッド化により、評価した。９００ｂｐＥｃｏＲＩ挿 入を含有しておりそして両方のプローブにハイブリッドされた１個のクローンが 選択された。

１６００ｂｐＨ鎖ｃＤＮＡをｐブルースクリプトプラスミド媒介体（ストラタジ ーン・コローニング・システム）およびＭ１３ｍｐ８配列用媒介体（ファーマシ ア・ＬＫＢ・バイオチクノロシーズ・インコーホレーテッド）のＥｃｏＲＩ部位 に亜クローニングした。９００ｂｐＬ鎖ｃＤＮＡをプラスミド媒介体ｐＵＣ８（ ファーマシア・ＬＫＢ・バイオチクノロシーズ・インコーホレーテッド）および Ｍ１３ｍｐ１９配列用媒介体のＥｃｏＲ１部位に亜クローニングした。

ＤＮＡ配列分析のジデオキシ−ヌクレオチド鎖集結方法［３９］を使用して、単 一ストランド（Ｍ１３）および二重ストランド（プラスミド）鋳型の両者の配列 を測定した。５′未翻訳部分の配列、信号配列、変異領域および一定領域の一部 をＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡの両者に関して測定した。ＨおよびＬ鎖に関するＤＮＡ 配列を図１および２に示す。Ｈ鎖変異領域配列のアミノ酸翻訳は図３に表されて いる。Ｌ鎖変異領域の翻訳は図４に表されている。

Ｌ鎖に対して与えられているヌクレオチド配列がＣＤＲＩコード付は配列の開始 点に向かって位置１６３におけるＡ残基を有していることに注目すべきである（ 図２を参照のこと）。

この配列の翻訳がＬ鎖中の位置２７におけるグルタミン残基を与える（図４を参 照のこと）。

０ＫＴ４の配列化か元々行われている時には、ヌクレオチド残基１６３はＣ残基 であると考えられており、Ｌ鎖中の位置２７にプロリン残基を与えている。本発 明により製造された第一のＣＤＲ−移植された抗体は、Ｌ鎖残基２７がプロリン 残基であるという仮定に基づいて構成されている。これは図６．８および１２か られかる。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４抗体の設計ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４抗体を設計 するためには、鼠の０ＫＴ４のどの残基がＬおよびＨ鎖のＣＤＲを含んでいるか を測定することが必要であった。抗体Ｘ−線結晶構造の試験により、抗原結合表 面が変異領域のｂ−バレル骨格から伸びている一連の３個のループ上に位置する ことが示されている。従ってこれらのループを使用してＣＤＲを定義することが できる。鼠の０ＫＴ４Ａの結晶構造は入手できないため、既知の結晶構造の同様 な鼠の抗体の構造を使用してループの残基を定義することができる。

照度異性およびそれより少ない変異性骨格配列の３部分がＬおよびＨ鎖の両者上 で見いだされている［２］。はとんどの場合に、これらの照度異部分はＣＤＲに 対応しているがそれより伸びているかもしれない。

ＣＤＲ中のこれらの鼠の０ＫＴ４Ａ残基と照度異部分中のものとの組み合わせが 人間の抗体骨格上に移植しようとする複合体ＣＤＲを含んでいるであろうと結論 された。鼠の０ＫＴ４ＡＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列は図３および４に表されて おり、選択された複合体ＣＤＲには下線が引かれている。

Ｈ鎖に関する人間の抗体骨格配列は人間抗体ＫＯＬのものである。ＫＯＬのＸ− 線結晶写真構造が高い分解能まで測定されているため、ＫＯＬが選択された。こ れは抗体の正確な分子モデル作成を可能にするはずである。同じ理由のために、 人間のＬ鎖二量体であるＲＥＩの骨格配列がＬ鎖骨路用に使用された。ＫＯＬお よびＲＥＩのアミノ酸配列は、ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ（ＨＣＤＲＩ） およびＬ　（ＬＣＤＲＩ）鎖変異領域のものと比較されて、図５および６に示さ れている。

ＣＤＲ−移植されたＨ鎖は人間のｉ　ｇＧ４一定部分を有するように設計された 。Ｉ　ｇＧ４亜種は、腎臓移植拒絶反応の治療用に使用されている鼠の抗−ＣＤ ３単クロ一ン性抗体である０ＫＴ３を用いる実験に基づいて選択された。０ＫＴ ３は鼠のＩ　ｇＧ２ａアイソタイプを有しており、そして人間中で補体を固定す るものではない。人間のＩｇＧ４アイソタイプも補体を固定するものではない。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖は人間のカッパ一定領域を用いて構成されて いた。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ遺伝子の構造ＨおよびＬ鎖ＣＤＲ−移植された変 異領域は、［４０］で使用された方法と同様にして合成二重ストランドＤＮＡオ リゴマー類の結紮により構成された。変異領域の５′端部は鼠の単クローン性抗 体Ｂ７２．３のＬおよびＨ鎖の信号配列を含有している［４１コ。信号配列は哺 乳動物細胞からの抗体の分泌を指定している。コザック配列［４２］が直ちにＡ ＵＧ開始コドンを進行させて翻訳を促進させる。次に変異領域を人間の一定領域 用のＤＮＡコードに結紮させて、ＣＤＲ−移植されたＨおよびＬ鎖遺伝子を作成 する。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ鎖構造長さが約３０ｂｐであるオリゴマー類の ８個の相補性対は、重複している端部を有しておりそして変異領域が骨格２中に 置かれているＸｈ。

■部位から第一の一定領域の開始点のＨｉｎｄＩ１１部位へ及ぶように設計され た。これらの８個のオリゴマー対を合成し、段階的方法で一緒に結紮させ、そし て次に人間のＩｇＧ４一定領域ＲＮＡのＨｉｎｄＩ工１５’に結紮させた。Ｉｇ Ｇ４ＤＮＡは、セルチク・リミテッド（英国、スラブ）により、ゲノム性ＤＮＡ として供給されていた。それは５’Ｅｃ。

Ｒｒおよび３’ＥｃｍＨＩ制限部位を有するＭ１３ファージＤＮＡ中の２１５３ ｂｐである。ＣＨＩ、蝶番、ＣＨ２およびＣＨ３領域は４個のイントロンにより 囲まれている。遺伝子はセルチクにより、ＣＨｌのペヌルチメート基部において Ｃ−Ａ変化を有してＣＤＲ−移植された遺伝子構成目的用の新規なＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位を作成するように改変されていた。

それぞれ長さが約９０ｂｐである合成オリゴマー類の２個の相補性対を結紮させ ることにより、変異領域の５′端部を作成した。５’ＥｃｏＲＩ端部および３’ Ｘｈｏｌ端部を有するこのフラグメントを上記のフラグメントのＸｈｏＴ端部と 結紮させて、完全ＣＤＲ−移植されたＨ鎖遺伝子を生成した。この遺伝子は長さ が２３６４ｂｐであり、そして５′ＥｃｏＲＩ端部および３’ＥｃｍＨＩ端部を 有している。遺伝子のアミノ酸翻訳を有するＤＮＡ配列は図７に示されている。

ヌクレオチド番号により規定されている当該部分を以下に記す・１−１４Ｅｃｏ ＲＩ部位およびコザック配列１５−７１　信号配列 ７２−　１４６　骨格１ １４２−　１７６　ＣＤＲ１ １７７−２１８骨格２ ２１９−　２５４　ＣＤＲ２ ２５５−３６２骨格３ ３６３−　３９２　ＣＤＲ３ ３９３−４３１骨格４ ４３２−　７２７　ＣＨＩ領域 ７２８−１１１７　イントロン １１１８−１１５３　蝶番領域 １１５４−１２７１　イントロン １２７２−１５９９　ＣＨ２領域 １６００−１６９８　イントロン １６９９−２０１６　ＣＨ３領域 ２０１７−２３６６　３’未翻訳領域 ＣＤＲ−移植されたＬ鎖遺伝子構造 重複している端部を有する合成オリゴマー類の１２個の相補性対を同時に結紮さ せて、ＣＤＲ−移植されたＬ鎖変異領域に擬した。このフラグメントは、５’Ｅ ｃｏＲＩおよび３’Ｎａ　ｒ　Ｔ端部を有していた。これを人間のカッパ一定領 域ＤＮＡの５’ＮａｒＴ端部と結紮させた。人間のカッパ一定ｃＤＮＡはセルチ クにより、第三および第四コドン中にＮａｒＩ制限部位を含むように改変されて いた。生成したＣＤＲ−移植されたＬ鎖遺伝子は長さが７５４ｂｐでありそして ＥｃｏＲＩ端部を有していた。アミノ酸翻訳を有するＤＮＡ配列は図８に示され ている。ヌクレオチド番号により規定されている当該部分を以下に記す：１−　 ８　ＥｃｏＲ１部位およびコザック配列９−　６８　信号配列 ６９−　１４３　骨格１ １４４−　１６４　ＣＤＲ１ １６５−２１５骨格２ ２１６−　２３６　ＣＤＲ２ ２３７−３３８骨格３ ３３９−　３５６　ＣＤＲ３ ３５７−４０４骨格４ ４０５−　７１０　カッパ一定領域 ７１１−　７１０　未翻訳 Ｈ鎖遺伝子を表示プラスミドｐＥｅ６ＨＣＭＶＢｇ１２中に挿入しモしてＳＶ４ ０源およびグルタミン合成酵素小遺伝子からなるＧＳフラグメントを追加するこ とにより、ＣＤＲ−移植されたＨ鎖表示媒介体を構成した。これらの段階は図９ に図示されている。ｐＥｅ６ＨＣＭＶＢｇ１２およびＧＳフラグメントはセルチ ク・リミテッドにより供給された。

ｐＥｅ６ＨＣＭＶをＥｃｏＲＩおよびＢｃ１１部位において消化させた。ｐＥｅ ６ＨＣＭＶＢｇ１２ＤＮＡは、それをデオキシアデノシンメチラーゼを欠いてい るＤＡＭ大腸菌株ＧＭ２４２中に通すことにより、脱メチル化されていた。Ｂｃ ｌＩは、酵素の認識部位においてＮ６−メチル化されたデオキ／アデノシンを含 有していないＤＮＡだけを制限するであろう。Ｂｃｌｌｆｌｌ限から生じる突出 はＢａｍＨＩ突出と相容性である。次にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩＣＤＲ−移植さ れたＨ鎖遺伝子（ＨＣＤＲｌ）をｐＥｅ６ＨｃＭＶＢｇ１２のＥｃｏＲＩ、／Ｂ ｃｌＩ端部と結紮させて、ｐＥｅ６ＨｃＤＲ１を製造した。

グルタミン合成酵素小遺伝子および複製のＳＶ４０源並びに初期および後期プロ モーターを含有している５５００ｂｐＢａｍＨＩフラグメントをｐＥｅ６ＨｃＤ Ｒ１のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＥｅ６ＨＣＤＲ１ｇｓを製造した。ＧＳフ ラグメントの正確な配向は制限分析により立証された。哺乳動物の細胞トランス フェクション用のｐＥｅ６ＨＣＤＲ１ｇｓはアルカリ性溶解方法および塩化セシ ウム勾配精製により製造された［４３］。

ｐＥｅ６ＨｃＤＲ１ｇｓはＣＯＳおよびＣＨＯ細胞中でＣＤＲ−移植された○Ｋ Ｔ４ＡＨ鎖を表示することができる。ＨＣＭＶプロモーターはＨ鎖遺伝子に対し て５′にあり、そしてそれの転写を指示している。

該遺伝子に対して３′にあるＳＶ４０ポリアデニル化信号配列は転写ターミネー タ−として作用する。ＣＯ８細胞中での一時的表示用には、複製のＳＶ４０源が Ｇ５５５００ｂｐフラグメント中に存在している。ＧＳ小遺伝子は、ＣＨＯ細胞 トランスフェクション後の使用のための選択可能なマーカーとして存在している 。グルタミン合成酵素小遺伝子の表示はＳＶ４０後期プロモーターにより駆動さ れる。ＧＳフラグメントは、ＳＶ４０後期プロモーターがＨＣＭＶプロモーター と同じ方向に転写を駆動させるように、配向されている。

数種の後転写行動が起きて、ＣＤＲ−移植されたＨ鎖を製造する。核内では、Ｉ 　ｇＧ４一定部分の３個の介在配列が除去され、そしてエキソンが一緒に組み継 がれて成熟ｍＲＮＡを製造する。翻訳後に、１９アミノ酸信号配列がラフ小胞体 （ＥＲ）中で除去される。信号炭水化物をＥＲ中の各鎖のＣＨ２領域およびＧｏ 　］　ｇ　ｉ装置に加えた。各鎖は４個の鎖内二硫化物結合も含有している。Ｌ 鎖ペプチドが共トランスフェクション化されたＬ鎖表示媒介体により供給されて いる時には、成熟抗体が２個のＨおよび２個のし鎖を二硫化物結合により一緒に 結合させることにより組み合わされている。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖表示媒介体の構造ＣＤＲ−移植されたＬ鎖遺 伝子を表示媒介体ｐＥｅ６ＨｃＭＶＢｇ１２中に挿入しそして次にＳＶ４０源お よびグルタミン合成酵素小遺伝子−含有ＧＳフラグメントを追加することにより 、ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖表示媒介体を構成した。Ｌ鎖表示媒介体は 、図９に示されている如きＨ鎖表示媒介体用に使用されたものと本質的に同じ方 法により構成されていた。Ｌ鎖遺伝子を、ｐＥｅ６ＨｃＭＶＢｇ１２のＥｃ。

Ｒ１部位中に結紮させて、ｐＥｅ６ＬｃＤＲ１を製造した。Ｌ鎖遺伝子の正確な 配向は制限分析により立証された。５５００ｂｐＧＳフラグメントをＢａｍＨ１ 部位中に挿入して、ｐＥｅ６ＬｃＤＲ１ｇｓを製造した。ＧＳフラグメントの正 確な配向は制限分析により立証された。哺乳動物の細胞トランスフェクション用 のｐＥｅ６ＬｃＤＲ１ｇｓはアルカリ性溶解方法および塩化セシウム勾配精製に より製造された［４３］。

ＣＤＲ−移植されたＨ鎖遺伝子を用いる如く、ｐＥｅ６ＬｃＤＲ１ｇＳ中のＣＤ Ｒ−移植されたＬ鎖遺伝子はＨＣＭＶプロモーターにより駆動され、そしてトラ ンスフェクション終結はＳＶ４０ポリアデニル化信号配列により信号化されてい る。ＧＳフラグメント中に含まれている複製のＳＶ４０源がＣＯ８細胞中のこの 構造の自動的複製を可能にしている。ＧＳフラグメント中のグルタミン合成酵素 小遺伝子が、ＣＨ○細胞中の選択および増幅に関する機構を提供している。

ＣＤＲ−移植されたＬ鎖ｍＲＮＡの後転写二稈は、イントロンが遺伝子中に存在 していないため、翻訳前には必要ない。翻訳後に、リーダー配列がラフＥＲ中で 除去される。２個の鎖内二硫化物結合が製造された。

成熟抗体の組み合わせは前節で論じられている。

ＣＯ５−１細胞中のＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａの一時的表示ＣＯ３−１細胞 中のＣＤＲ−移植された遺伝子の一時的表示が、ＣＤＲ−移植されたＯ　Ｋ　Ｔ 　４　Ａ抗体表示および機能を試験するための急速で且つ簡便なシステムを与え る。ＣＯ３−１細胞は、複製ＳＶ４０源を運んでいるエピソームの一時的複製を 担持しているＳＶ４０大工抗原を構造的に表示する［４４］。ＣＤＲ−移植され た遺伝子表示媒介体であるｐＥｅ６ＨｃＤＲ１ｇｓおよびｐＥｅ６ＬｃＤＲ１ｇ ｓはＧＳフラグメントの一部として複製のＳＶ４０源を含有している。Ｃ０８− １細胞中へのトランスフェクションで、表示媒介体は核中に高い複製番号まで複 製されて、相対的に高い表示水準を生じる。

ＣＯ３−細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＲＬ１６５ ０）から得られ、そしてダルベツコの改変イーグル媒体（ＧＩＢＣＯからのＤＭ ＥＭ）中で１０％胎牛血清を用いて培養された。ＣＤＲ−移植された遺伝子表示 媒介体は、ＤＥＡＥ−デキストラン方法およびその後のＤＭＳＯショックを用い てＣＯ８細胞中にトランスフェクション化される［４５］。簡単には、０．２ｍ Ｉの緩衝液中のＩｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランを０８ｍｌのＤ　Ｍ　Ｅ 　Ｍ　／　トリス中の１５ｍｇの媒介体ＤＮＡに加える。これを６０ｍｍの組織 培養板中で１−１．５Ｘ１０’個の細胞に加え、そして約６時間にわたり培養し た。ＤＭＥＭ−デキストラン／ＤＮＡ複合体を除去し、そして緩衝液中の１０％ ＤＭＳ○を２分間にわたり板に加えた。これを除去し、細胞をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで １回洗浄し、そして次に１０％の胎生血清を含有しているＤＭＥＭと共に３−４ 日間培養した。その時点で、ウェルからの上澄み液を採取し、そして抗体水準お よびＣＤ４陽性リンパ細胞を結合させる能力に関して試験した。

抗体水準はＥＬＩ　ＳＡにより想定された。ウェルを山羊の抗−人間ＦＣ特異的 抗体でコーティングした。分泌された抗体を含有している種々の希釈度のＣＯ８ 細胞を加え、加湿室中で室温において１時間培養し、そして洗浄した。セイヨウ ワサビ過酸化酵素と結合されている山羊の抗−人間カッパ鎖抗体を加え、室温で １時間培養し、そして洗浄した。セイヨウワサビ過酸化酵素用の基質を検出用に 加えた。ｐＥｅ６ＨＣＤＲＩｇｓおよびｐＥｅ６ＬｃＤＲ１ｇｓの共−トランス フェクション後のＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ水準は、２００−１２００ｎｇ ／ｍｌのＣＯ８細胞上澄み液であった。

ＣＯ８細胞により製造されたＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａを、それが人間の末 梢血液リンパ球（ＰＢＬ類）またはＣＤ４−陽性ＨＰＢＡＬＬ（人間の末梢血液 急性リンパ球白血病）細胞系と結合する能力に関して試験した。それが鼠の０Ｋ Ｔ４Ａとこれらの細胞との結合を遮蔽する能力に関してもそれを試験した。結合 は下記の工程により測定された。

ＰＢＬ類を血清から単離するか、またはＨＰ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｌ細胞を組織培養か ら採取した。細胞を種々の希釈度の試験抗体、陽性対照抗体または陰性対照抗体 と共に４°Ｃにおいて１時間にわたり培養した。細胞を１回洗浄し、モしてＦＩ ＴＣ−標識の付いた山羊の抗−人間ＩｇＧ（Ｆｃ−特異的、ハツカネズミに吸収 されている）を４℃において１時間にわたり培養した。細胞を２回洗浄し、そし て細胞蛍光写真により分析した。キメラ性０ＫＴ４Ａ　（以下に記載されている ）を陽性対照として使用した。

ＦＩＴＣ−標識の付いた鼠のＯＫ　Ｔ　’４　Ａを直接結合用の陽性対照として 使用した。細胞を模擬−トランスフェクション化されたＣＯ８細胞上澄み液と共 に培養し、そしてその後、陰性対照として供されているＦＩＴＣ−標識の付いた 山羊の抗−人間ＩｇＧと共に培養した。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４．Ａが鼠の０ＫＴ４Ａ結合を遮蔽する能力を試験す るために、ＰＢＬ類またはＨＰＢＡＬＬ細胞を種々の希釈度の試験抗体または対 照抗体と共に４℃において１時間にわたり培養した。

固定された飽和量のＦＩＴＣ−ＯＫＴ４Ａを加えた。飼料を４℃において１時間 培養し、２回洗浄し、そして細胞蛍光写真により分析した。最大結合を測定する ための陽性対照はＦＩＴＣ−標識の付いた０ＫＴ４Ａであり、そして標識の付い ていない鼠の０ＫＴ４Ａが遮蔽用の対照標準であった。陰性対照は模擬−トラン スフエクンヨン化された細胞上澄み液を用いてまたは用いない未染色細胞であっ た。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖がＣＤ４陽性細胞を結合しそして鼠の０ＫＴ ４Ａの結合を遮蔽する能力をキメラ性ＯＫ　Ｔ　４　、Ａ　Ｈ鎖と組み合わせて 最初に試験した。キメラ性０ＫＴ４ＡＨ鎖は鼠の０ＫＴ４Ａ変異領域および人間 のＩｇＧ４一定部分からなっている。キメラ性Ｈ鎖遺伝子は、ＣＤＲ−移植され た遺伝子用に使用されたのと同じ表示媒介体中で表示されている。ＣＤＲ−移植 されたＬ鎖表示媒介体およびキメラ性Ｈ鎖表示媒介体はＣＯ８細胞中で共−トラ ンスフェクション化された。

完全キメラ性０ＫＴ４抗体（キメラ性り鎖およびキメラ性Ｈ鎖）は、ＣＤ４陽性 細胞に完全に結合させそして鼠の○ＫＴ４とこれらの細胞との結合を完全に遮蔽 できることが見いだされた。

図１０は、キメラ性０ＫＴ４ＡＨ鎖と組み合わされたＣＤＲ−移植された０ＫＴ ４ＡＬ鎖であるＬＣＤＲＩはＣＤ４陽性細胞に結合させるかまたは鼠の０ＫＴ４ とこれらの細胞との結合を完全に遮蔽するためには使用できなかったことを示し ている。

図１１は、キメラ性０ＫＴ４ＡＬ鎖と組み合わされたＣＤＲ−移植された０ＫＴ ４ＡＨ鎖であるＨＤＣＲＩを用いて行われた結合および遮蔽研究を示している。

キメラ性０ＫＴ４ＡＬ鎖は、鼠の０ＫＴ４Ａ変異領域および人間のカッパ一定領 域からなっている。それはＣＤＲ−移植された抗体用に使用されたのと同じ表示 媒介体中でも表示されている。ＣＯ８細胞はＣＤＲ−移植されたＨ鎖表示媒介体 およびキメラ性り鎖表示媒介体と共に共−トランスフエクンヨン化された。

キメラ性０ＫＴ４ＡＬ鎖と組み合わされたＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ鎖で あるＨＤＣＲＩもＣＤ４陽性細胞に結合させるかまたは鼠の０ＫＴ４とこれらの 細胞との結合を完全に遮蔽するためには使用できな結合および遮蔽データは、最 初に設計されたＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体がＣＤ４抗原を認識できなか ったことを明らかに示している。

抗体のそれ以上の修飾が必要であった。鼠の０ＫＴ４ＡＣＤＲ類はさらに拡大さ せる必要があるか、またはＣＤＲ類、領域包装またはＬおよびＨ鎖相互作用の位 置に含まれる臨界的骨格残基を人間からハツカネズミに変化させる必要があった 。

分子モデル作成法を使用して、成功を収めた抗原相互作用に関して最も臨界的で あると思われる残基を同定した。モデル作成はセルチク・リミテッドにおいてシ リコングラフィックス器具上でのＨＹＤＲＡソフトウェアを用いて行われた。

ＣＤＲ−移植されたし鎖の修飾 ０ＫＴ４Ａの結晶構造は測定されていなかったため、０ＫＴ４Ａ自身の分子モデ ルを分析で使用することはできなかった。ＣＤＲ−移植されたし鎖の残基を分析 するために、人間のＲＥＩＬ鎖の分子モデルをハツカネズミのＭＯＰＣ６０３Ｆ ａｂフラグメントを用いて重ねた。ＭＯＰＣ６０３Ｌ鎖はアミノ酸配列において ０ＫＴ４Ａと同様であった。人間のＲＥＩＬ鎖および人間のＫＯＬＨ鎖を連結さ せる研究も行われた。人間のＩｅｕおよびａｓｐからの残基３３および３４から 鼠の０ＫＴ４Ａｉ１ｅおよびａｌａへの転化によりＣＤＲ］を延長させるという 決定を行った。人間のＲＥＩ残基ｇｌ　ｕ３８はＨ鎖およびＬ鎖包装中に含まれ ていることが見いだされた。これから鼠の０ＫＴ４Ａｈ　ｉ　ｓ３８への変更が 有利である。ＣＤＲ２のアミノ末端部における残基４９は直接ＣＤＲ２に衝撃を 与え、そしてＨ鎖のＣＤＲ３と接触する。ＣＤＲ３のアミノ末端部近くの残基８ ９はＬ鎖のＣＤＲ３中のｐｈｅ９８と相互作用し、そしてＨ鎖のＣＤＲ３とも接 触する。ＲＥＩｔｙｒ４９およびｇｌｎ８９を鼠の０ＫＴ４Ａｈ　ｉ　ｓ４９お よび１ｅｕ８９に変更させた。

上記の変更により生じた新規なＣＤＲ−移植されたＯ　Ｋ　Ｔ　４　Ａ、　Ｌ鎖 遺伝子は、ＬＣＤＲ２と表示された。人間のＲＥＩ、ＬＣＤＲＩ、ＬＣＤＲ２の 変異部分のアミノ酸配列と、推定された鼠の０ＫＴ４ＡＬ鎖との比較は、図１２ に示されている。部位−指定変異誘発によりコドンを変更させることにより、変 更が行われた［４６］。ストラタシーン・クローニング・システムスからのブル ースクリプト・ファーンミド媒介体を使用して、変異誘発用の単一ストランド鋳 型を製造した。表示媒介体ｐＥｅ６ＬＣＤＲ２ｇｓはＬＣＤＲＩと同じ方法で構 成されていた。ＣＯ８細胞はｐＥｅ６ＬＣＤＲ２ｇｓおよびキメラ性Ｈ鎖表示媒 介体と共−トランスフェクション化された。

結合および遮蔽研究の結果は図］−〇に示されている。キメラ性０ＫＴ４ＡＨ鎖 と組み合わされたＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖のＬＣＤＲ２は、ＣＤ４陽 性細胞を結合させそして鼠の０ＫＴ４Ａの結合を遮蔽することができる。これら のデータは、ＬＣＤＲ２が機能性ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖であること を示している。

ＣＤＲ−移植されたＨ鎖の修飾 Ｈ鎖のモデル作成研究のために、人間の抗体ＫＯＬの分子を使用した。

コドンを変化させるための部位−指定変異誘発により、全ての残基変更が行われ た。鼠の０ＫＴ４Ａのｇｌｕ５７およびｈｉｓ５８がらｔｈｒ５７およびｔｙｒ ５８へ変更させる決定を行った。この変更されたＣＤＲ−移植されたＨ鎖は、Ｈ ＣＤＲ２と表示された。残基５７および５８における変更の他に、残基２４はＣ ＤＲＩの近くにありモしてＣＤＲＩの位置づけに含まれていてもよい。残基８８ および９１もＨ鎖変異領域包装中並びにＨおよびＬの境界に含まれている。ＫＯ Ｌから鼠の０ＫＴ４Ａへのこれらの３個の追加残基の変更がＨ鏡型ＨＣＤＲ３中 に加えられた。ＫＯＬ、ＨＣＤＲＩ、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、鼠＋７）ＯＫＴ ４ＡＨ鎖の変異領域と下記の型とのアミノ酸配列の比較は、図１３に示されてい る。

表示媒介体であるｐＥｅ６ＨＣＤＲ２ｇＳおよびｐＥｅ６ＨＣＤＲ３ｇｓを、キ メラ性０ＫＴ４ＡＬ鎖表示媒介体またはｐＥｅ６ＬＣＤＲ２ｇｓを用いてＣＯ８ 細胞中に共−トランスフェクション化させた。結合および遮蔽データは、図１１ および１４中に表示されている。ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３は、キメラ性また はＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＬ鎖と組み合わされている時には、抗原と効果 的に相互作用できなかった。

ＣＤＲ−移植されたＨ鎖へのそれ以上の修飾が検査された。ＫＯＬｔｙｒ３５か ら鼠の０ＫＴ４Ａｓｅｒ３５への変更の測定を行った。分子モデル作成は、残基 ４２がＣＤＲ２の位置づけに含まれていたことを示していた。残基４４はＬ鎖接 触中に含まれている。ＫＯＬｇ１７４２およびｇ１７４４から鼠のＯＫＴ４Ａｇ ｌｕ４２および８１ｇ４４へ変更させることが有利である。ＫＯＬａｌａ６０を 鼠の０ＫＴ４Ａｐｒｏ６０に変更させた。これらの変更は種々の組み合わせ中に 加えられたが、前の型中の残基２４．５７．５８．８８、および９１において行 われた変更は保有された。これらの後者の型は、ＨＣＤＲ４、ＨＣＤＲ５、ＨＣ ＤＲ６、ＨＣＤＲ７、ＨＣＤＲ８と示された。それぞれの中の残基変更は、図１ ３に記載されている。他の構造と同じ表示媒介体が使用された。ＣＯ８細胞を新 らしいＨ鎖表示媒介体およびｐＥｅ６ＬＣＤＲ２ｇＳを用いて共−トランスフェ クション化させた。

ＬＣＤＲ２と組み合わされた結合および遮蔽研究の結果（図１５）は、ＨＣＤＲ ８以外の全てのこれらの型中のＣＤ４抗原との陽性相互作用を示している。明ら かに、ｔｙｒ３５から鼠の５ｅｒ３５への転化は臨界的変更である。位置６０に おける１、２鼠残基への変更は抗原相互作用を促進させるようにみえるが（ＨＣ Ｄ　Ｒ６対ＨＣＤＲ４）　、位置４４における変化はわずかに抑制的であるよう にみえる（ＨＣＤＲ５対ＨＣＤＲ４、およびＨＣＤＲ７対ＨＣＤＲ６）。

残基３５および６０における変更が抗原結合に対して充分であるかどうかを測定 するために、ＨＣＤＲ９（位置２４．３５．５７．５８．８８．９１における鼠 の残基）およびＨＣＤＲＩＯ（位置２４．３５．５７．５８．８８．９１におけ る鼠の残基）が部位指定変異誘発により製造された。同じ表示媒介体システムが これらの型のＣＤＲ−移植されたＨ鎖用に使用された。それらはＣＯ８細胞中で ｐＥｅ６ＬＣＤＲ２ｇｓを用いて共−トランスフェクション化された。

結合および遮蔽実験の結果が先行型のＣＤＲ−移植されたＨ鎖と共に、図１５中 に示されている。明らかに、ＰＣＴ’、’ｔＪｓ　８９１０５８５７中に示され ている基準とは対照的に、先行型中の残基４２および４４において行われた変更 は不必要であった。ＨＣＤＲＩＯ中には存在しているがＨＣＤＲＱ中には存在し ていない残基６０における変更が有利である。

ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ鎖並びに結合および遮蔽検定におけるそれらの 活性のまとめが表１に示されている。最も少ない鼠の残基を含有している最も活 性なＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体は、ＨＣＤＲＩＯおよびＬＣＤＲ２の組 み合わせである。

表１ ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡＨ鎖およびそれらの活性ＣＤＲ−移植　新規残基 　合計鼠　結合　遮蔽されたＨＣ変更零　券蒸門　型埋　憇 Ｉ（ＣＤＲＩ　なし　なし ＨＣＤＲ２５７，５８５７，５８ ＨＣＤＲ３２４，８８，９１２４，５７，５８，８８，９１ＨＣＤＲ４３５，４ ２２４，３５，４２，５７，５８，８８，９１＋＋　＋＋［ｌＣＤＲ５３５，４ ２，４４２４，３５，４２，４４，５７，５８，８８，９１＋＋　＋＋ＨＣＤＲ ６３５，４２，６０２４，３５，４２，５７，５ｇ、６０．８８．９１　＋＋　 ＋＋＋ＨＣＤＲ７３５，４２，４４，６０２４，３５，４２，４４，５７，５８ ，６０，８８，９１＋＋＋＋ＥＣＤＲ８４２，４４，６０２４，４２，４４，５ ７，５ｇ、６０．８８．９１　＋　−ＨＣＤＲ９３５２４，３５，５７，５８， ８８，９１＋＋　＋＋ＨＣＤＲＩＯ３５，６０２４，３５，５７，５８，６０， ８８，９１＋＋　＋＋＋木　残基はそれらのカバット位置番号により示されてい る［２］。

林鼠の残基は骨格内の残基を称しているがＣＤＲではない。

別のＬ鎖構造 上記の如く、本り鎖構造は０ＫＴ４ＡＬ鎖中の位置２７においてはプロリン残基 があるという仮定に基づいて製造された。位置２７がグルタミン残基でなければ ならないことが認識された時に、３種の新規なし鎖構造が製造されそして表示さ れた。これらはＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびＬＣＤＲ４Ｑと標識が付けられ、 それらは位置２７においてプロリン（Ｐ）残基の代わりにグルタミン（Ｑ）があ ること以外はＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびＬＣＤＲ４と同一である。これらの し鎖が完全活性を保有していたことが示されている。これを示しているデータは 図１６に表示されている。

プロリンはそれが平面構造を有しているという点で他の全てのアミノ酸とは相当 異なっていることに注目すべきである。従って、それは鎖の配向における変化が 生じるペプチド配列中の位置において一般的に見いだされる。従って、残基２７ のところでプロリンを有するＬ鎖ＣＤＲＩの構造は残基２７のところでグルタミ ンを有するＬ鎖ＣＤＲＩのものとは相当異なっているよってある。これにもかか わらず、２個のし鎖が機能性観点からは同等であることが示されている。このこ とは、機能性ＣＤＲ−移植された抗体を製造するためには抗体中での６個全ての ＣＤＲを変更させる必要がないというここに表されている観察を支持している。

ＣＤＲ−移植されたしおよびＨ鎖の別の修飾後者の型のＣＤＲ−移植されたＬお よびＨ鎖中で行われた残基変化は、ＣＤＲ−移植された抗体自身のものではなく ＲＥＩ、ＫＯＬおよび関連ハツカネズミ抗体の分子モデルを基にして行われた。

変更の一部は、特に低い結合親和性における、結合用には不必要であるかもしれ ない。我々は数種のＣＤＲ−移植されたＬおよびＨ鎖遺伝子を構成し、そこでは あらかじめハツカネズミの残基に変更されている骨格残基の一部は人間に逆に変 更されている。一般的には、これらの残基はＣＤＲの延長には直接食まれていな いか、またはＣＤＲの配置が種々の組み合わせ中で人間残基に逆に変更されてい る。表２に、鼠から人間に逆転している残基番号を有するこれらのしおよびＨ鎖 遺伝子を挙げられている。部位−指定変異誘発を用いてこれらの遺伝子を構成し た。それらはＣＯ８細胞中で表示されており、そしてそれらがＣＤ４を認識する 能力は結合および遮蔽検定で試験されるであろう。最も望ましいＣＤＲ−移植さ れた抗体は、鼠の０ＫＴ４Ａのものと同様な親和性を有するＣＤ４を認識できる 最も少ない鼠の残基を用いるものである。

表２ ＣＤＲ−移植されたＬおよびＨ鎖への修飾構造　残基変化＊　合計鼠残基＊＊ Ｌ鎖： ＬＣＤＲ３３８３３，３４，４９，８９ＬＣＤＲ４４９３３，３４，３８，８９ ＬＣＤＲ５８９３３，３４，３８，４９ＬＣＤＲ６３８，４９，８９３３，３４ Ｈ鎖： ＨＣＤＲｌｌ　８９．９１　２４．３５．４７．５８．６０ＨＣＤＲ１２２４， ８８，９１３５，４７，５８，６０＊　残基はそれらのカバット位置番号により 示されている［２コ。

記されている残基は鼠の配列から人間の配列に変化されるであろう。

＊＊鼠の残基は骨格内の残基を称しているがＣＤＲではない。

相対的結合親和性の測定 ＣＤＲ−移植された抗−ＣＤ４単クロ一ン性抗体の相対的結合親和性は、ＣＤ４ 抗原としてＨＰＢ−ＡＬＬ人間り細胞系をそしてトレーサー抗体として既知の結 合親和性を有する蛍光性−共役鼠０ＫＴ４Ａ　（Ｆｌ−ＯＫＴ４Ａ）を用いる競 合結合［８］により、測定された。Ｆｌ−ＯＫＴ４Ａｌ−レーサー抗体の結合親 和性は直接的結合検定により測定され、そこでは増加量のＦｌ−ＯＫＴ４ＡがＨ ＰＢ−ＡＬＬ　（５Ｘ１０’）と共に５％胎生血清を有するＰＢＳ中で４０℃に おいて６０分間培養された。細胞を洗浄し、そして蛍光強度が定量的マイクロビ ードストランドで目盛り付けされているＦＡＣ９ｃａｎ流動細胞計上で測定され た（フロー・サイトメトリー・スタンダーズ、ノースカロライナ州のリサーチ・ トライアングル・パーク）。予備測定された数のハツカネズミＩｇＧ抗体結合部 位を有するマイクロビーズ（シンブリー・セルラー・ビーズ、フロー。サイトメ トリー・スタンダーズ）を使用することにより、抗体分子当たりの蛍光強度（Ｆ ／Ｐ比）を測定した。Ｆ／Ｐは、ビーズ当たりの結合部位数により割られたＦｌ −ＯＫＴ４Ａで飽和しているビーズの蛍光強度に等しい。１個の細胞当たりの平 均結合強度から結合されたおよび遊離Ｆｌ−ＯＫＴ４Ａの量を計算し、そして結 合／遊離比を結合された抗体のモル数に対してプロットした。線状適合を使用し て結合の親和性を測定した（勾配の絶対値）。

競合結合に関しては、増加量の競合抗体を飽和以下の投与量のＦｌ−ＯＫＴ４Ａ に加え、そして５×１０５個のＨＰＢ−ＡＬＬと共に５％の胎生血清を有する２ ００μｍのＰＢＳ中で４℃において６０分間培養した。細胞の蛍光強度を定量的 マイクロビードストランドで目盛り付けされているＦＡＣ３ｃａｎ流動細胞計上 で測定した。結合されたおよび遊離Ｆｌ−ＯＫＴ４Ａの濃度を計算した。競合抗 体の親和性を式％式％） から計算し、ここでＫａは鼠の０ＫＴ４Ａの親和性であり、Ｋｘは競合Ｘの親和 性であり、［コは結合／遊離結合がＲ／２である競合抗体の濃度であり、モして Ｒは最大の結合／遊離結合である。

親和性結果 人間化された抗体の相対的親和性定数（図１７、表３）を測定し、モしてＨＣＤ ＲＩＯと組み合わされたＬＣＤＲ２は元の親和性の６８％を保有していた。ＬＣ ＤＲ２／ＨＣＤＲ５（表１）は鼠の抗原親和性の１３％だけしか保有していなか った。これらの結果は、遮蔽検定で得られたものと一致している（図１．６　ａ およびｂ）　。ＨＣＤＲ５とＨＣＤＲ７との比較（図１５）は、活性に関しては 厳密ではないが残基６０はドナー配列におけるものに転化された時には有利であ ることを示唆している。

同じ図において、位置４４におけるドナー残基の悪影響も見られる（ＨＣＤＲ４ 対ＨＣＤＲ５）。

表３ ＣＤＲ−移植された抗体の相対的親和性定数抗体構造　５０％抑制における　親 和性定数対数濃度競合剤（ｐＭ）　（Ｋｘ） 鼠の０ＫＴ４Ａ　２．４　３Ｘ１０’ ＊ｊ　ラ性０ＫＴ４Ａ　２．９　１．ｌＸ１０９ＬＣＤＲ２／ＨＣＤＲＩＯ２， ６２，ＩＸ］、０９ＬＣＤＲ２／ＨＣＤＲ５３，４０，４Ｘ１０’キメラ性０Ｋ Ｔ３　抑制なし 鼠の０ＫＴ３　抑制なし ○ＫＴ４Ａ並びにそれのキメラ性およびＣＤＲ−移植された同等物により認識さ れるＣＤ４抗原がＣＤ４抗原を運ぶＴリンパ球の生物学的機能を与える相互作用 に含まれていることが信じられている。特に、ＣＤ４抗原は混合リンパ細胞反応 （ＭＬＲ）中および末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖中に含まれていると信 じられている。本発明のＣＤＲ−移植された抗体が鼠の０ＫＴ４Ａと同じ生物学 的活性を有するようであることを示すために、下記の機能性研究を実施した。

ＭＬＲの抑制 人間のＰＢＭＣをフィニルを用いる密度勾配遠心により単離し、そして１％の胎 生血清（Ｆｅ２）を含有している完全Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中に再懸濁させた。２×１ ０５個のレスポンダ−および１×１０５個の照射された（２メガラツド）同種Ｐ ＢＭＣを９６ウ工ル組織培養板の各ウェルに加え、その後、一連の希釈度の精製 された抗−ＣＤ４抗体を加えた。細胞を６日間培養し　ｓＨチミジンで２４時間 にわたりパルスを送り、そして採取した。３Ｈチミジン加入は液体シンチレーシ ョンにより測定された。

陰性対照としては、照射されたレスポンダ−細胞を照射された同種ＰＢＭＣの代 わりに使用し、そして抗体を加えなかった。陽性対照としては、抗体を用いずに 実験を行った。実験では、使用された抗体は鼠の０ＫＴ４Ａ、キメラ性０ＫＴ４ Ａおよび鼠の０ＫＴ４ＡのＦ（ａｂ’）ｚフラグメントであった。

実験結果は図１８に示されている。キメラ性０ＫＴ４Ａおよび鼠の０ＫＴ４Ａの 両者はＭＬＲの同様な抑制を示した。

Ｔリンパ球上のＣＤ３抗原を認識する鼠のＭＡｂである０ＫＴ３　（２０ｎｇ／ ｍｌ）をポリスチレン類の９６ウ工ル組織培養板上で２０℃において４時間にわ たり運動抑制した。板を燐酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗浄し、そして １×１０５個のＰＢＭＣを各ウェルに加えた。その後、一連の希釈度の抗−ＣＤ ４抗体を加えた。細胞を７２時間培養し、３Ｈチミジンで２４時間にわたりパル スを送り、そして採取した。３Ｈチミジン加入は液体シンチレーションにより測 定された。

陰性対照としては、０ＫＴ３および抗−ＣＤ４抗体の両者の不存在下で増殖を測 定した。陽性対照としては、増殖を０ＫＴ３だけの存在下で測定した。実験では 、使用された抗体は鼠の０ＫＴ４Ａ、キメラ性０ＫＴ４Ａおよび鼠の０ＫＴ４Ａ のＦ（ａｂ’）２フラグメントであった。

実験結果は図１９に示されており、それはキメラ性０ＫＴ４Ａが鼠の０ＫＴ４Ａ と実質的に同じ増殖抑制能力を有していることを示している。

上記の機能性研究は、キメラ性０ＫＴ４Ａが鼠の○ＫＴ４Ａと同等の生物学的性 質を有することを示している。ＣＤＲ−移植された抗−ＣＤ４抗体はキメラ性○ ＫＴ４Ａと同じＣＤ４抗原に対する親和性を有しているためそしてキメラ性０Ｋ Ｔ４Ａ抗体がＣＤ　Ｒ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体と同じ一定領域を有している ため、ＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体は鼠の０ＫＴ４Ａと同じ生物学的機能 を有しており従って治療における用途を有するであろう。

棗至竺 多数の異なるＣＤＲ−移植された０ＫＴ４Ａ抗体が製造された。本質的には、鼠 の○ＫＴ４ＡＨおよびＬ鎖のＣＤＲ類にコード付けするＤＮＡが人間のＨ鎖ＫＯ ＬおよびＬ鎖ＲＥＴ抗体遺伝子の骨格上に移植された。これらの変異領域は人間 のカッパＬ鎖およびＩｇＧ４Ｈ鎖−足部分をコード付けするＤＮＡに結紮されて いる。生成したＣＤＲ−移植された遺伝子はＣ０６−１細胞中に表示されている 。組織培養媒体中に分泌された抗体を集め、ＥＬＩＳＡにより定量化し、そして それがＣＤ４陽性細胞を結合させそして鼠の０ＫＴ４Ａの結合を遮蔽する能力に 関して試験した。

最初に設計されたＣＤＲ−移植された抗体はＣＤ４と相互作用できなかった。Ｌ 鎖に対して多数の修飾を行い、そこでは分子モデル作成により同定されているＲ ＥＩ配列中の臨界的な人間骨格残基が鼠の０ＫＴ４Ａ残基に変更されていた。こ の新規型のし鎖であるＬＣＤＲ２はＣＤ４抗原を認識することができた。同様に 、多数のＨ鎮火間骨格残基が種々の組み合わせにおいて鼠に変更されてＨＣＤＲ ２−ＨＣＤＲＩＯを製造し、た。ＬＣＤＲ２と組み合わされた数個のこれらのＨ 鎖はＣＤ４に関しては鼠の○ＫＴ４Ａ抗体と良く匹敵していた。現在では、選択 されるＣＤＲ−移植された０ＫＴ４ＡはＬＣＤＲ２ＱおよびＨＣＤＲＩＯの組み 合わせである。別の型のＬおよびＨ鎖が最近製造され、そこではあらかじめ鼠の 残基に変更されている骨格残基を人間に逆に変更されている。

これらのさらに人間化されたＣＤＲ−移植された抗体はそれらがＣＤ４を認識す る能力に関して試験されるであろう。

参考文献 ［１］　カバット他、シークエンセス・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロ ジカル・インタレスト中、ＵＳデパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒユー マン・サービセス、１９８７゜１９７０゜ ［３］　オイ池、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、且、８２５．１９８３゜［４］　ノイベル ゲル、ＥＭＢＯＪ、、λ、１３７３．１９８３゜［６］　ヴエルホーエン他、サ イエンス、ス旦旦、１５３４．１９８８゜ ［７］　レイヒマン他、ネーチャー、１旦ｌ、３２３．１９８８゜［８コ　クイ ーン他、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、１旦、１００２９．１９８９゜ ［９コ　シラーおよびスミス、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、旦、６４８７． １９８２゜ ［１０コ　ノリス他、Ｎｕｃ、、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、上よ、５１０３．１９ ８３゜ 〔１１］　シラーおよびスミス、ＤＮＡ、３．４７９．１９８４゜［１２〕　ク ラマー他、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、よ旦、６４７５．１９８２゜ ［１３］　ム＋）ｔ、および７ｒルーナ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、工５５．３３５ ．１９８７゜ ［１４］　ヒグチ他、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１旦、７３５１．１９８ ８゜ ［１５］　ホー他、ジーン、ヱユ、５１．１９８９゜［１６］　ホー他、エンジ ニアリング・ハイブリシセーンヨン・レストリクジョン・ジーンズ・ウィズアウ ト・ジ・ユース・オブ・レストリクジョン・エンザイムス・ノーン・スプライシ ング・パイ・オバーラップ・エクステンション中。

［１７］　ホルトン他、ジーン、ヱユ、６１．１９８９゜［１８］　ポリヴアー 他、シーン、ｌ、９５．１９７７゜［１９］　チャン他、ネーチャー、旦旦】、 ６１５．１９７８゜［２０］　イタクラ他、サイエンス、よ１旦、１０５６．１ ９７８゜［２１］　ケーブル他、ネーチャー、λ旦１．５４４．１９７９゜［２ ２］　ゲーデル他、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、旦、４０５７．１９８０゜ ［２３］　シーベンリスト他、セル、且、２６９．１９８０゜［２４］　スチン ヒコンム他、ネーチャー、旦旦１１３９．１９７９゜［２５］　キンゲスマン他 、ジーン、ヱ、１４１．１９７９゜［２６］　チェンバー他、ジーン、１旦、１ ５７．１９８０゜［２７］　ジョーンズ、ゲネテイックス、１立、１２．１９７ ７゜［２８］　ヒララマン他、Ｊ、Ｂ　ｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、、λ５５．２０７ ３．１９８０゜ ［２９］ヘス他、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、、ヱ、１４９．１９６８ ゜ ［３０］　ホーランド他、バイオケミストリー、１ヱ、４９００．１９７８゜ ［３１コ　クルースおよびバダーリン、ティッシュ・カルチャー中、アカデミツ ク・プレス、１９７３゜ ［３２］　フィエルス他、ネーチャー、λヱ且、１１３．１９７８゜［３３コ　 マニアチス他、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル中 、２版、コールド・スプリング・）１−／＼−−・プレス、１９９００ ［３４］　スコーペス、プロティン・ピューリフィケーション中、スブリンゲル ・フェルラグ、ニューヨーク、１９８２゜［３５］　レフコヴアイトおよびペル ニス、イミュノロジカル、メ・八。

ズ、■およびＩＩ中、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９７９および１ ９８１゜ ［３６］　バーンハード他、リューコサイト・タイピング中、スプリレゲル・フ ェルラグ、ニューヨーク、１９８４゜［３７］　マツグ、レミントンス・ファー マシューティカル・サイエンセス、１６版中、１９８２゜ ［３８］　チルブライン他、バイオケミストリー、１８．５２９４．１［４０］ 　ジョーンズ他、ネーチャー、旦λ１．５２２．１９８６゜［４１コ　ウィッテ ル他、プロティン・エンジニアリング、Ｌ　４９９．１９８７゜ ［４２］　コザック他、Ｊ、Ｍｏ　ｌ、Ｂ　ｉ　ｏ　１　．１９６．９４７．１ ９８７゜ ［４３］　バーンポイムおよびドリー、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４． １５１３．１９７９゜ ［４４］　グルズマン、セル、ス旦、１７５．１９８１゜［４５コ　ロバタ他、 Ｎｕｃ、Ａ、ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、よ１．５７０７．１９８４゜ ［４６］　クンケル、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、多ユ、４８８．１９８５゜［４７］　 チョチアおよびレスク、Ｊ、Ｍｏ１．ＢｉＣｌ２、旦、４．９０１．１９８７゜ ［４８］　バラノフ他、ジーン、旦」、２．４６３．１９８９゜ＦＩＧ、　１ Ｏｋ丁４Ａ　Ｈ４の支、異−舒今のヌ２しＴテド駆列Ｉ　ＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧ 　ＡＡＴＣＧＡＴｒＣＣＣＭ；ＴＴＣＣＴＣＡ　ＣＡＴＴＣＡＧＴＣＡ　ＧＣＡ ＣＴＧＡＡＣＡ５５１　ＣＴＣＴＡＧＧＡＴに　Ｃ ＦＩＧ、　２ ４５１　ＧＣＡにＴｒＡＡＣＡ　ＴＣＴＧＧＡＧＧＵ− 〉 匡 〉 一 ＣＤＲ−ＲｊｌＱトｆ＝　ｏＫ−ｒ４ｓ　ｈ４ｈ５；Ｗ、＋ｚ＋ｒｉ＊ｉｉ（ｇ 密ｆ旬９し） ＦＩＧ、　９　（ｉｉ） ＦＩＧ、　１０ ０に丁ｔＡ−杓）ｉｔ：ｈｒ：　Ｌ４喰、１％！、、４ｊ、合−ｔｘｔＯＫＴ４ Ａ　−Ｈ１Ｂ＝ｈｒ＝　ｕ！ｍＲｎｍｋｇＬＦＩ６．１１ ””Ａｈ　ｒａ　：　ｈ　ｒ：　）（４１ａａ　都合ハエＯにＴＥＡ−吟Ｆ１葎 ｒ＝　ｈ布膳走虐紅狼尤ＦＩＧ、１４ ｏにＴｚＡ　−ＬＣＤＲ２Ｎ　ｎｕ　７ｈｒ：　Ｈ＃　ｆ、６イ：ｓｔＯにτｌ −Ａ　−ＬＣＤＲ２クイ　杓橿ごトｔ：１備遮献環９乞ＦＩ６．１５ ０ＫＴ４Ａ　−物ＦＪ　、”　（ｊ：　ａｒ＋、ｓ　ｉｍ、１０ＫＴ４Ａ　−ｈ 　ｎ　：ｒｈｒ：＊漆遇敵膣定家支５ｆＪ、、／１ １８を／道帥 ＣＰＭ 要　約 枠領域が主として第一抗体（受容体）から誘導されておりそして少な（とも１種 のＣＤＲが第二抗体（供与体）から誘導されており、ここでＣＤＲ−グラフト化 された抗体がＣＤ４抗原と結合可能であるような少なくとも１個の鎖を有するＣ ＤＲ−グラフト化された抗体、それの製造方法、それの製造において使用するた めのヌクレオチド配列、それを含何している組成物、並びに治療におけるそれの 使用が開示されている。

１−一−＾−１ｗＮｍＮａ　ＰＣＴ／鑓９０１０２０１５１ｎＮ内＋ｔｅＭＩＩ 　ＡｌｐＨｅａｌ）６ＭＩＩ１．　ＰＣＴ／ＧＯ９０１０２０１５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨格部分が主として第一の抗体（アクセプター）から誘導されておりそして 少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー）から誘導されている少なくとも １個の鎖を有している、ＣＤ４抗原を結合することのできるＣＤＲ−移植された 抗体。 ２．ＣＤＲ−移植された鎖がドナー抗体から誘導された２個のＣＤＲを有してい る、請求項１に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ３．ＣＤＲ−移植された鎖がドナー抗体から誘導された３個のＣＤＲを有してい る、請求項１または２に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ４．ＣＤＲ−移植された鎖中で、該ＣＤＲまたは各ＣＤＲがＣＤＲからの全ての 残基および対応するドナー抗体の超変異部中の全ての残基からなる複合体ＣＤＲ からなっている、請求項１−３のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ５．ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分中の少なくとも１個の残基がそれが抗体中 の同等な残基に対応するように変更されている、請求項１−４のいずれかに記載 のＣＤＲ−移植された抗体。 ６．ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分が人間の抗体から誘導されている、請求項 １−５のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ７．ＣＤＲ−移植された鎖の骨格部分が人間のＩｇＨ鎖から誘導されている、請 求項１−６のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ８．Ｈ鎖骨格部分中の残基３５かそれがドナー抗体中の同等な残基に対応するよ うに変更されている、請求項７に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ９．それぞれ残基２６−３５、５０−６５または９５−１０２を含んでいる少な くとも１個の複合体ＣＤＲが人間の骨格上に移植されている、請求項７または請 求項８に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １０．Ｈ鎖骨格部分中の残基２３、２４および４９がそれがドナー抗体中の同等 な残基に対応するように変更されている、請求項７−９のいずれかに記載のＣＤ Ｒ−移植された抗体。 １１．残基６、２３、２４、４８および４９がドナー抗体中の同等な残基に対応 している、請求項１０に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １２．残基７１、７３および７９がドナー抗体中の同等な残基に対応している、 請求項７−１１のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １３．Ｈ鎖中で、残基５７、５８、６０、８８および９１のいずれかまたは組み 合わせがそれがドナー抗体中の同等な残基に対応している、請求項７−１２のい ずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １４．Ｈ鎖が人間のＫＯＬＨ鎖から誘導されている、請求項７−１３のいずれか に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １５．ＣＤＲ−移植された鎖中の骨格部分が人間のＩｇＬ鎖から誘導されている 、請求項１−６のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １６．Ｌ鎖中で、それぞれ残基２４−３４、５０−５６または８９−９７を含ん でいる少なくとも１個の複合体ＣＤＲが人間の骨格上に移植されている、請求項 １５に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １７．Ｌ鎖中の残基４９がドナー抗体中の同等な残基に対応している、請求項１ ５または請求項１６に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １８．Ｌ鎖中で残基４９および８９がドナー抗体中の同等な残基に対応している 、請求項１５−１７のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 １９．Ｌ鎖が人間のＲＥＩＬ鎖から誘導されている、請求項１５−１８のいずれ かに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２０．Ｌ鎖およびＨ鎖を含んでおり、それらの一方が請求項２−１９のいずれか に示されている原則に従いＣＤＲ−移植されている、請求項１−１９のいずれか に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２１．ＣＤＲ−移植された鎖がＨ鎖であり、そしてＨ鎖中の３個全部のＣＤＲが 変更されている、請求項２０に記載のＣＤＲ−移植された抗体２２．Ｌ鎖および Ｈ鎖を含んでおり、それらの両方が請求項２−１９のいずれかに示されている原 則に従いＣＤＲ−移植されている、請求項１−２０のいずれかに記載のＣＤＲ− 移植された抗体。 ２３．Ｈ鎖中の３個全部のＣＤＲが変更されており、そしてＬ鎖中の１または２ 個だけのＣＤＲが変更されている、請求項２２に記載のＣＤＲ一移植された抗体 。 ２４．１０５．Ｍ−１−１０１２．Ｍ−１のＣＤ４抗原に対する親和性を有する 、請求項１−２３のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２５．少なくとも約１０８．Ｍ−１のＣＤ４抗原に対する親和性を有する、請求 項２４に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２６．ＯＫＴ４Ａのものと同様なＣＤ４抗原に対する親和性を有する、請求項２ ４または請求項２５に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２７．該ＣＤＲもしくは各ＣＤＲまたは複合体ＣＤＲが哺乳動物の抗体から誘導 されている、請求項１−２６のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２８．該ＣＤＲもしくは各ＣＤＲまたは複合体ＣＤＲが鼠のＭＡｂから誘導され ている、請求項２７に記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ２９．完全Ｉｇである、請求項１−２８のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された 抗体。 ３０．アイソタイプＩｇＧ４である、請求項２９に記載のＣＤＲ−移植された抗 体。 ３１．一定領域のエフェクター機能を変更させるためにＩｇの一定領域内の１個 以上の残基が変更されている、請求項２９または請求項３０に記載のＣＤＲ−移 植された抗体。 ３２．組換え型ＤＮＡ技術の使用により製造されている、請求項１−３１のいず れかに記載のＣＤＲ−移植された抗体。 ３３．第一のＤＮＡ配列を準備し、骨格部分が主として第一の抗体（アクセプタ ー）から誘導されておりそして少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー） から誘導されている第一の抗体鎖を適当な上向き流および下向き流要素の調節下 でコード付けし、宿主細胞を第一のＤＮＡ配列で転換させ、そして転換された宿 主細胞を培養して、請求項１−３２のいずれかに記載のＣＤＲ−移植された抗体 を製造することからなる、請求項１−３２のいずれかに記載のＣＤＲ−移植され た抗体の製造方法。 ３４．第二のＤＮＡ配列を準備し、第一の鎖と相補性の第二の抗体鎖を適当な上 向き流および下向き流要素の調節下でコード付けし、そして宿主細胞を第一およ び第二の両者のＤＮＡ配列で転換させることからなる、請求項３３に記載の方法 。 ３５．第二のＤＮＡ配列が、骨格部分が主として第一の抗体から誘導されており そして少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体から誘導されている第二の抗体鎖を コード付けする、請求項３４に記載の方法。 ３６．第一および第二のＤＮＡ配列が同一媒介体上に存在している、請求項３４ または請求項３５に記載の方法。 ３７．配列が同一の上向き流および／または下向き流要素の調節下にある、請求 項３６に記載の方法。 ３８．配列が異なる上向き流および／または下向き流要素の調節下にある、請求 項３６に記載の方法。 ３９．第一および第二のＤＮＡ配列が異なる媒介体上に存在している、請求項３ ４または請求項３５に記載の方法。 ４０．宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３３−３９のいずれかに記載の方法 。 ４１．骨格部分が主として第一の抗体（アクセプター）から誘導されておりそし て少なくとも１個のＣＤＲが第二の抗体（ドナー）から誘導されている抗体鎖を コード付けしており、該抗体鎖が請求項１−３２のいずれかに記載のＣＤＲ−移 植された抗体を製造することのできる、ヌクレオチド配列。 ４２．治療において、特に移植拒絶反応の治療またはヘルパーＴ細胞疾病の治療 において、使用するための、請求項１−３２のいずれかに記載のＣＤＲ−移植さ れた抗体。 ４３．薬学的に許容可能な賦形薬と組み合わされている請求項１−３２のいずれ かに記載のＣＤＲ−移植された抗体を含んでいる、薬学的組成物。 ４４．治療を必要とする患者に有効量の請求項１−３２のいずれかに記載のＣＤ Ｒ−移植された抗体または請求項４３に記載の組成物を投与することからなる、 移植拒絶反応またはヘルパーＴ細胞疾病の治療方法。