JP5867795B2 - 調節性t細胞の特異的活性化ならびに喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶の治療および免疫寛容の誘導のためのその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、CD4の特定のエピトープがTreg細胞の活性化を引き起こすという新しい発見に基づく。前記エピトープは、既知のHIV-1 gp120結合部位と部分的に一致するが、驚くべきことに、この部位への結合はTreg細胞の活性化を引き起こす。この発見は、以下の理由で全く予期せぬことであった。今まで、CD4によるTreg細胞の活性化は、モノクローナル抗体BF5(WO04083247)が結合する異なるエピトープによるものとされていた。
-Carriere et al.,1995 は、CD4上のBF5の結合部位が、HIV-1 gp120の結合部位とはまったく無関係であることを研究した。-意外にも、T細胞上のCD4の直接活性化および遮断は、HIV-1 gp120により機能するという文献の報告(Diamond et al. 1988)にもかかわらず、我々はTreg細胞のCD4に対するHIV-1 gp120の活性化特性を見出した。
(a)Treg細胞を含む溶液を用意し、ここでTreg細胞は、好ましくはCD4+CD25+Treg細胞またはTr1細胞またはTh3細胞であり、前記溶液は、より好ましくは、さらに不活化同系CD3枯渇PBMC(好ましくは照射またはマイトマイシンCにより不活化されている末梢血単核細胞)もしくは樹状細胞(DC)および同種CD8+T細胞もしくは同種CD4+T細胞を含み、
(b)Treg細胞と被験物質との相互作用を可能にする条件下で前記物質を添加し、
(c)Treg細胞が活性化されたかどうかを測定し、ここで活性化Treg細胞によりTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定されることを含む前記方法に関する。
(i)CD8+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD8+T細胞の増殖抑制またはCD8+T細胞のCD25発現低下またはCD8+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD8+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(ii)CD4+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD4+T細胞の増殖抑制またはCD4+T細胞のCD25発現低下またはCD4+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD4+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(iii)細胞内cAMP(すなわち細胞質ゾル内cAMP)量の測定(ここで細胞内cAMP量の増加は活性化Treg細胞の存在を示し、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)
を用いて実施できる。
(a)Treg細胞を含む第1溶液を用意し、
(b)Treg細胞を含む第2溶液を用意し、
(c)少なくとも1つの試験物質を加えることにより第1溶液を処理し、
(d)第1および第2溶液の細胞内cAMP量を測定し、ここで第1溶液の細胞内cAMP量の増加により活性化Treg細胞の存在が示されること
を含む前記方法を提供する。
(a)CD4のHIV-1 gp120結合部位と相互作用できる物質を事前選択し(事前選択の方法については下記参照のこと)、
(b)Treg細胞を含む溶液を用意し、ここでTreg細胞は、好ましくはCD4+CD25+Treg細胞またはTr1細胞またはTh3細胞であり、前記溶液は、より好ましくは、さらに、好ましくは照射またはマイトマイシンCにより不活化されている不活化同系CD3枯渇PBMC(末梢血単核細胞)または樹状細胞(DC)および同種CD8+T細胞または同種CD4+T細胞を含み、
(c)(a)記載の事前選択された物質とTreg細胞との相互作用を可能にする条件下で前記物質を加え、
(d)Treg細胞が活性化されたかどうかを測定し、ここで活性化Treg細胞によりTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定されること
を含む前記方法に関する。前記測定は、以下のような適切な読み取りシステム:
(i)CD8+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD8+T細胞の増殖抑制またはCD8+T細胞のCD25発現低下またはCD8+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD8+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(ii)CD4+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD4+T細胞の増殖抑制またはCD4+T細胞のCD25発現低下またはCD4+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD4+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(iii)細胞内cAMP量の測定(ここで細胞内cAMP量の増加は活性化Treg細胞の存在を示し、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)
を用いて実施できる。
(a)CD4を含む第1溶液を用意し、
(b)CD4を含む第2溶液を用意し、
(c)HIV-1 gp120とCD4との結合を可能にする条件下で被験物質およびHIV-1 gp120を第1溶液に加え、
(d)HIV-1 gp120とCD4との結合を可能にする(c)と同様な条件下でHIV-1 gp120を第2溶液に加え、
(e)第1および第2溶液において、HIV-1 gp120がCD4に結合したかどうかを測定し、ここで第1溶液における結合HIV-1 gp120量の低下が、前記物質がCD4のHIV-1 gp120結合部位と相互作用できることを示すこと
を含む。
(a)Treg細胞を含む第1溶液を用意し、ここでTreg細胞は、好ましくはCD4+CD25+Treg細胞またはTr1細胞またはTh3細胞であり、前記溶液は、より好ましくは、さらに不活化同系CD3枯渇PBMC(好ましくは照射またはマイトマイシンCにより不活化されている末梢血単核細胞)もしくは樹状細胞(DC)および同種CD8+T細胞もしくは同種CD4+T細胞を含み、
(b)Treg細胞と被験物質との相互作用を可能にする条件下で前記物質を添加し、
(c)第1溶液のTreg細胞が活性化されたかどうかを測定し、
(d)Treg細胞を含む第2溶液を用意し、ここでTreg細胞は、好ましくはCD4+CD25+Treg細胞またはTr1細胞またはTh3細胞であり、前記溶液は、より好ましくは、さらに不活化同系CD3枯渇PBMC(好ましくは照射またはマイトマイシンCにより不活化されている末梢血単核細胞)もしくは樹状細胞(DC)および同種CD8+T細胞もしくは同種CD4+T細胞を含み、
(e)(b)と同様な条件下で、前記物質および配列番号1記載のアミノ酸配列を含むペプチドを加え、
(f)第2溶液のTreg細胞が活性化されたかどうかを測定し、前記測定は、以下のような適切な読み取りシステム:
(i)CD8+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD8+T細胞の増殖抑制またはCD8+T細胞のCD25発現低下またはCD8+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD8+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(ii)CD4+T細胞が抑制されたかどうかの測定(これは、好ましくはCD4+T細胞の増殖抑制またはCD4+T細胞のCD25発現低下またはCD4+T細胞のサイトカイン産生抑制を測定することにより測定でき、適切なサイトカインはIFNγまたはIL2またはTNFαであり、ここで抑制されたCD4+T細胞により活性化Treg細胞が同定され、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)または
(iii)細胞内cAMP量の測定(ここで細胞内cAMP量の増加は活性化Treg細胞の存在を示し、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される)
を用いて実施でき;
(g)(c)から得られた結果と(f)から得られた結果とを比較し、ここで(f)の活性化低下により、配列番号1記載のエピトープとの相互作用によりTreg細胞を活性化するTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定されること
を含む前記方法に関する。
a)Treg細胞および
b)少なくとも配列番号1に記載のエピトープを含むペプチド
を含む前記試験系を提供する。
(1)少なくとも配列番号1に記載のエピトープを含むペプチドに物質が結合できるかどうかを測定するためのCD4/HIV-1 gp120競合アッセイ
CD4(sCD4、Immunodiagnostics社、米国)100ng/ウェル(PBS溶液、pH7.4)を用い、終夜4℃で96ウェルアッセイプレート(Nunc社、ドイツ)をコーティングする。コーティングしたプレートをPBS/3%BSA緩衝液で飽和させ、3回洗浄する。試験物質の結合を測定するために、種々の濃度で試料を1時間添加する。対照ウェルには試験物質を添加しない。3回洗浄後、プレートにHIV-1 gp120-ペルオキシダーゼ結合体(Immunodiagnostics社、米国)を1時間添加する。3回洗浄して、非結合HIV-1 gp120-ペルオキシダーゼ結合体を取り除く。洗浄後、ペルオキシダーゼ用3,3,5,5-テトラメチルベンジジン発色基質(Pierce社、米国)を添加し、450nmでの吸光度を測定する。CD4HIV-1 gp120結合部位と相互作用する物質は、標識HIV-1 gp120の結合をブロックし、対照と比較してシグナルが低下するので同定することが可能である。
(2.1)細胞の分離法
(2.1.1)PBMCの分離
健常人の通常のバフィーコート調製物から標準的な密度勾配遠心分離により分離されるPBMC(末梢血単核細胞)から分離法を始める。また、末梢血全血または白血球アフェレーシス産物から分離したPBMCを使用することもできる。
Treg細胞の抑制活性を測定するために、高度に精製した細胞集団が必要である。従って、抗体被覆磁性ビーズを用いる(Miltenyi社(ドイツ)および/またはDynal社(ノルウェー))。磁性ビーズは、ここでは、特定のモノクローナル抗体に結合した常磁性粒子のことをいう。これは標的細胞集団を磁気標識するために用いられる。この抗体被覆磁性ビーズは標的細胞に結合する。この標識細胞画分は磁力により保持され、続いて高度に精製した状態で回収できる(正の選択(positive selection))。CD4+CD25-ヘルパーT細胞の正の分離(positive isolation)の前に、製造業者の使用説明書(Miltenyi社、ドイツ)に従って、洗浄緩衝液50mlでPBMCを2回洗浄する。CD4+T細胞の分離のために、製造業者の使用説明書に従ってCD4マイクロビーズ(Miltenyi社、ドイツ、マイクロビーズ2〜4μL/PBMC 107個)を用いる。製造業者の使用説明書に従って、MACS分離装置(Miltenyi社)を用いてCD4+画分を分離する。MACS分離装置は、磁力により磁性ビーズ標識細胞を保持する。第2ステップにおいて、製造業者の使用説明書(詳細については、2.1.4参照)に従って、CD25 Dynabeads(Dynal社、ノルウェー)を用い、0.5ビーズ/細胞の条件で、混在するCD4+CD25+Treg細胞を枯渇させる。この枯渇方法により、高度に精製したCD4+CD25-ヘルパーT細胞が得られる(負の選択(negative selection))。
CD8+エフェクターT細胞の正の分離の前に、製造業者の使用説明書(Miltenyi社、ドイツ)に従って、洗浄緩衝液50mlでPBMCを2回洗浄する。CD8+CD25-T細胞の分離のために、製造業者の使用説明書に従ってCD8マイクロビーズ(Miltenyi社、ドイツ、マイクロビーズ2〜4μL/PBMC 107個)を用いる。MACS分離装置(Miltenyi社)を用い、製造業者の使用説明書に従ってCD8+画分を分離する。第2ステップにおいて、製造業者の使用説明書(詳細については、2.1.4参照)に従って、CD25 Dynabeads(Dynal社、ノルウェー)を用い、0.5ビーズ/細胞の条件で、混在するCD4+CD25+Treg細胞を枯渇させる。この枯渇方法により、高度に精製したCD4+CD25-エフェクターT細胞が得られる(負の選択)。
CD4+CD25+Treg細胞の分離のために、正および負の選択を組み合わせる。製造業者の使用説明書に従って(Miltenyi社、ドイツ)PBMCを洗浄緩衝液で洗浄し、続いて、製造業者の使用説明書に従って、分離緩衝液(1×108個/ml)中、4℃で20分間CD25マイクロビーズ(マイクロビーズ2μL/PBMC 107個)と共にインキュベートする。その後、PBSで細胞を2回洗浄する。MACS分離装置(Miltenyi社)を用いて、製造業者の使用説明書に従って、CD25+画分を分離する。正の選択で得たCD25+画分は、65〜80%のCD4+T細胞ならびに混在する20〜35%のCD19+B細胞、CD8+T細胞および少しのCD14+単球を含む。混在する細胞をDynabeads(Dynal社、ノルウェー)で枯渇させる。以下の量のビーズを用いる:CD19 Dynabeads:2ビーズ/細胞、CD8 Dynabeads:3ビーズ/細胞、CD14 Dynabeads:1ビーズ/細胞。製造業者の使用説明書に従って、磁性粒子濃縮装置(Dynal社)を用い、回収したDynabeadsを15ml管中、枯渇緩衝液で2回洗浄する。CD25+PBMC画分(5×107個/ml)を枯渇緩衝液に添加し、シェーカー(サンプルミキサー、Dynal社)上、4℃で20分間インキュベートする。製造業者の使用説明書に従って、磁性粒子濃縮装置を用い、混在する細胞を枯渇させる。CD4+CD25+Treg細胞の純度をさらに高めるために、Dynabeadsによる枯渇を1回繰り返す(枯渇2ラウンド後に>98%)。
樹状細胞(DC)は健常人のバフィーコートから調製する。800U/ml GM-CSF(Leukomax;ノバルティス社、スイス・バーゼル)および1,000U/ml IL-4(Strathmann Biotec社、ドイツ・ハンブルク)を含む熱失活自己血漿を1.5%添加したX-VIVO-15(Cambrex社、ベルギー・ヴェルヴィエ)3ml中、15x106細胞/ウェルの密度のPBMC(2.1.6)を、6ウェル組織培養プレートにプレーティングする。1日おきに(2日、4日および6日目)、培地を1ml除き、サイトカインを含む新鮮培地1mlを添加することにより、培養物に栄養を補給する。7日目に、非付着細胞を採取し、新しい6ウェルプレートに移し、10ng/ml IL-1、10ng/ml TNF-α、1,000U/ml IL-6(いずれもStrathmann Biotech社製(ドイツ))および1μg/ml PGE2(Pharmacia-Upjohn、スウェーデン・ウプサラ)の存在下でさらに培養する。培養9日目に成熟CD83+DCを採取する。
CD3 Dynabeads(Dynal社、ノルウェー)を用い、0.5ビーズ/細胞の条件で、PBMCから細胞を枯渇させる。製造業者の使用説明書に従って、磁性粒子濃縮装置(Dynal社)を用い、回収したDynabeadsを15ml管中、枯渇緩衝液で2回洗浄する。PBMC(5×107個/ml)を枯渇緩衝液に添加し、シェーカー(サンプルミキサー、Dynal社)上、4℃で20分間インキュベートする。磁性粒子濃縮装置を用い、製造業者の使用説明書に従って、CD3+細胞を枯渇させて、>98%の純度のCD3-PBMCを得る。
PBMCは、(2.1.1)に従って分離する。CD25 Dynabeads(Dynal社、ノルウェー)を用い、製造業者の使用説明書に従って(詳細については2.1.4参照)、0.5ビーズ/細胞の条件で、PBMC調製物中のCD25発現調節性T細胞を枯渇させる。製造業者の使用説明書に従って、磁性粒子濃縮装置(Dynal社)を用い、回収したDynabeadsを15ml管中、枯渇緩衝液で2回洗浄する。PBMC(5×107個/ml)を枯渇緩衝液に添加し、シェーカー(サンプルミキサー、Dynal社)上、4℃で20分間インキュベートする。製造業者の使用説明書に従って、磁性粒子濃縮装置を用い、CD25+細胞を枯渇させて、>99%の純度のCD25陰性PBMCを得る。
(2.2.1)共培養抑制アッセイA:混合白血球反応(MLR)
CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞に対するCD4+CD25+Treg細胞の抑制活性を分析するためには、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞とCD4+CD25+Treg細胞および同種DCとの共培養を行わなければならない。従って、96ウェル平底培養プレートにおいて、X-VIVO 15(Cambrex社、ベルギー・ヴェルヴィエ)中、CD4結合化合物、例えばHIV-1 gp120(0.1〜10μg/ml)の存在下または非存在下で、1x105個/ウェルのCD4+ヘルパーT細胞(2.1.2)またはCD8+エフェクターT細胞(2.1.3)と種々の数のCD4+CD25+Treg細胞(2.1.4;比率1:1〜1:4)および1x104個/ウェルのDCとを共培養する。(2.1.5)に記載されているように調製された成熟樹状細胞(DC)は、CD4+CD25+Treg細胞と同じドナーに由来するが(同系)、T細胞刺激には、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞と同種を用いる。このアッセイにおいては、同種DC(MLR)によってのみCD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞が活性化され、T細胞サブセットの顕著な増殖が引き起こされる。非活性化CD4+CD25+Treg細胞は、Treg細胞活性化化合物の非存在下でこの増殖を抑制しなかった。CD4結合化合物によるCD4+CD25+Treg細胞の機能的活性化は、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞の増殖低下を引き起こした。
配列番号1に記載のエピトープに結合できるHIV-1 gp120などの物質の、CD4+CD25+Treg細胞の抑制機能のみへの影響を研究するために、我々は、エフェクターとしてCD8+T細胞を含む共培養アッセイを開発して、この物質の後者への影響を排除した(CD8+T細胞はCD4を発現しない)。この設定において、アロ反応性CD8+エフェクターT細胞の活性化は、例えば抗CD3mAbによるさらなる刺激を受けた活性化CD4+CD25+Treg細胞によってのみ抑制される(陽性対照)。例えばHIV-1 gp120の、CD4+CD25+Treg細胞の機能に対する影響を評価するために、さまざまな濃度(0.1〜10μg/ml)の種々のHIV-1 gp120標品の存在下で、分離されたCD4+CD25+Treg細胞(2.1.4)を、同系T細胞枯渇照射(50Gy)PBMC(2.1.6)および同種CD8+エフェクターT細胞(2.1.3)と共培養する。簡潔に言えば、さまざまな量のHIV-1 gp120の存在下または非存在下で、CD4+CD25+Tre細胞1x105個を同系T細胞枯渇PBMC 3x105個と共にインキュベートする。0.5μg/ml抗CD3モノクローナル抗体(OKT-3、ebioscience社、米国)での刺激を陽性対照とする。刺激を行わないものは陰性対照を表す。直ちに、あるいは24時間後に、培養物に同種CD8+エフェクターT細胞1x105個を添加し、さらに72時間後に3H-Tdr取り込み(37kBq/ウェル)により増殖を測定する。配列番号1に記載のエピトープとの相互作用によるCD4+CD25+Treg細胞の機能的活性化により、CD8+エフェクターT細胞の増殖抑制が引き起こされ、それと共に、Treg細胞アクチベーターとして物質が同定される(データについては、図1参照)。
PBMCなどの抗原提示細胞の非存在下で、化合物の直接Treg細胞活性化能を評価するために、陽性対照としての0.5μg/ml抗CD3モノクローナル抗体(OKT-3)または種々の濃度のHIV-1 gp120の存在下、分離されたCD4+CD25+Treg細胞(2.1.4に記載)を、単独でX-VIVO-15中、16〜48時間前培養する。その後、細胞を強く洗浄し、同系照射(50Gy)PBMCおよび同種CD4+ヘルパーT細胞mまたはCD8+エフェクターT細胞の共培養物に添加する。さらに72時間後、3H-Tdr取り込み(37kBq/ウェル)により増殖を測定する。配列番号1に記載のエピトープとの相互作用によるCD4+CD25+Treg細胞の機能的活性化により、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞の増殖抑制が引き起こされ、それと共に、Treg細胞アクチベーターとして物質が同定される。
(2.3.1)増殖の分析
(2.2.1)、(2.2.2)および(2.2.3)に示したアッセイにおける、3〜4日の細胞のインキュベーション後に、T細胞増殖を測定する。さらに16時間、細胞に3H-Tdr(37kBq/ウェル、MB Biomedicals社)を適用し、液体シンチレーションカウンター(Betaplate、Wallac/PerkinElmer社)を用いて、取り込まれた放射能を測定する。Treg細胞活性化化合物の非存在下では、休止期Treg細胞は、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞の増殖を抑制できない(陰性対照)。対照的に、活性化CD4結合化合物または抗CD3モノクローナル抗体(陽性対照)の存在下では、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞の増殖は、CD4+CD25+Treg細胞により抑制される。放射能の取り込みの低下は、増殖抑制と類似し、それによりCD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞抑制が同定され、それと共にCD4+CD25+Treg細胞が活性化されたことが同定される。
活性化Treg細胞は、共培養したCD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞の増殖を抑制するばかりでなく、これらのT細胞のサイトカイン合成もまた抑制する。従って、共培養したT細胞により産生されるサイトカインの検出は、試薬のTreg細胞活性化能を分析するための代替法である。このアッセイにおいて、前記(2.2)のように、分離されたCD4+CD25+Treg細胞(2.1.4に記載)、同系CD3枯渇PBMC(2.1.6に記載)および同種CD8+エフェクターT細胞(2.1.3に記載)を共培養する。7日後、アロ反応性CD8+エフェクターT細胞はポリクローナルであり、モネンシン(BD GolgiStop(登録商標)、BD Biosciences Pharmingen社、1.3μM)の存在下、2.4μg/mlフィトヘムアグルチニン(PHA、Sigma社、ドイツ)および1ng/ml PMAで5時間再刺激する。その後、細胞を採取し、PBSで洗浄し、製造業者による使用説明書(perm/fix溶液、BD PharMingen社、ドイツ)に従って固定して透過処理し、サイトカイン特異的モノクローナル抗体(抗IFN-γ、抗IL-2、抗TNF-α、いずれもBD PharMingen社製)0.5μg/試験で染色する。続いて、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞によるサイトカインの産生をフローサイトメトリーにより分析する。Treg細胞活性化化合物の非存在下で、Treg細胞はCD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞のサイトカイン産生を抑制できない(陰性対照)。対照的に、活性化CD4結合化合物または抗CD3モノクローナル抗体(陽性対照)の存在下では、CD4+ヘルパーT細胞またはCD8+エフェクターT細胞のサイトカイン産生は、機能的活性化Treg細胞により抑制される。サイトカイン産生の低下により抑制が同定され、それと共にCD4+CD25+Treg細胞が活性化されたことが同定される。
Treg細胞の刺激により、細胞質ゾル内(すなわち細胞内)cAMPの顕著な増加が引き起こされる。従って、Treg細胞内のcAMPの分析は、HIV-1 gp120とCD4陽性細胞のCD4エピトープとの結合に干渉できる物質がTreg細胞を活性化できるかどうかを測定するためのさらなる方法である。このアッセイにおいて、新鮮分離CD4+CD25+Treg細胞(2.1.4に記載)(1×105個〜1x106個/ウェル)を、16時間、抗CD3モノクローナル抗体(OKT-3;0.5μg/ml)またはHIV-1 gp120(0.1〜10μg/ml; Protein Science Corp.社、米国コネチカット州メリデン)と共にインキュベートするか、あるいは非処理で放置する。細胞質ゾル内cAMP濃度を評価するために、cAMP特異的ELISA(Parameter(登録商標)Cyclic AMPAssay、カタログ番号KGE002;R&D Systems社、ドイツ・ヴィースバーデン)を行う。氷冷したPBSでTreg細胞を3回洗浄し、続いて、製造業者により提供される溶解緩衝液を用いて溶解し(1x107個/ml)、製造業者の推奨に従ってELISAを行う。
(3.1)NOD-ScidマウスへのヒトPBMCの移植によるGVHDの誘発方法および疾患の重症度の測定方法
NOD-Scidマウス、すなわち非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全マウス(変異対立遺伝子:Prkdcscid、系統:NOD.CB17-Prkdcscid、(Shultz et al 1995))(Central Laboratory Animal Facility of the University of Mainzから入手、同様に、Charles River Laboratories社経由でThe Jackson Laboratory社からも入手可能(ドイツ))を、ヒト末梢血免疫細胞移植の動物モデルとして用い、ひいては免疫調節相互作用のin vivo分析に用いる(Hesselton et al. 1995)。NOD-Scidマウスに移植したヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、進行性年齢依存性移植片対宿主疾患(GVHD)を誘発する。移植細胞数によりこの疾患の発症が決まるが、ヒトTregの同時移植により、この疾患を徐々に遅延または予防することができる。このモデル系により、さらにヒトTreg機能の研究が可能となる。GVHDを誘発するために、生後3〜6日齢のNOD-Scidマウスの腹腔内にヒトPBMC(ヒトPBMCの分離は2.1.1に従って行う)を1x107〜3x107個注入する。マウスに注入したPBMC画分中のヒトエフェクターT細胞の免疫学的(異種)活性化によりGVHDが誘発される。しかしながら、NOD-Scidマウスは、移植したヒトPBMCに対しては反応できない。ヒトPBMC誘発疾患は、処理動物における体重増加および体重減少、不活性、円背、立毛ならびに臓器炎症という不全を特徴とする(Kizilisik and Al-Sebayel 1997)。ヒトPBMCの移植は、非処理マウスと比較して、移植後30〜40日以内に(移植細胞数に応じて)成長停止または体重減少を引き起こす。GVHDの重症度のスコアを付けるためのパラメータとして、体重増加/体重減少という不全を用いる。対照マウスにはPBMCを投与しなかった。データについては図3を参照のこと。
ヒトPBMC(ヒトPBMCの分離は2.1.1に従って行う)1x107〜3x107個の腹腔内注入により誘発された、生後3〜6日齢のNOD-ScidマウスにおけるGVHD疾患を予防するために、ヒト調節性T細胞(ヒト調節性T細胞の分離は2.1.4に従って行う)をさらに2,5x106個腹腔内に注入する(Treg対PBMC比1:4)。ヒトPBMCとヒト調節性T細胞との同時移植(Treg比の増大)は、GVHD発症の予防および非処理マウスの体重減少に類似した発症の予防をもたらす。GVHDの重症度のスコアを付けるためのパラメータとして、体重増加/体重減少という不全を用いる。対照マウスにはPBMCを投与しなかった。データについては図3を参照のこと。
ヒトPBMC(ヒトPBMCの分離は2.1.1に従って行う)1x107〜3x107個の腹腔内注入により誘発された、生後3〜6日齢のNOD-Scidマウスにおいて誘発されたGVHD疾患を予防するために、ヒトPBMCの注入に加えて、HIV-1 gp120またはHIV-1 gp120結合に干渉できる物質を投与する。HIV-1 gp120またはHIV-1 gp120結合に干渉できる物質の投与は、PBMC画分におけるヒト調節性T細胞の活性化を誘発し、臓器の炎症の予防ならびにヒトPBMCおよびさらなるヒト調節性T細胞で処理したマウスまたは非処理マウスと類似した成長停止/体重減少の予防をもたらす。GVHDの重症度のスコアを付けるためのパラメータとして、体重増加/体重減少という不全を用いる。対照マウスにはPBMCを投与しなかった。データについては図4を参照のこと。
生後3〜6日齢のNOD-Scidマウスの腹腔内に、ヒトCD25枯渇PBMC(ヒトCD25枯渇PBMCの分離は2.1.7に従って行う)を1x107個注入する。GVHDは、NOD-Scidマウスへヒト非CD25枯渇PBMCを1x107個移植した場合と同じ程度に、ヒトCD25枯渇PBMC 1x107個により誘発される(データについては、図5および図3および図4を参照のこと)。CD25枯渇PBMCを投与し、HIV gp120をさらに投与したマウスにおいては、GVHDおよび体重減少の発症を防げない。HIV gp120またはHIV-1 gp120結合に干渉できる物質によるGVHDの予防は調節性T細胞に依存する。GVHDの重症度のスコアを付けるためのパラメータとして、体重増加/体重減少という不全を用いる。データについては図5を参照のこと。
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Claims (3)
- CD4のHIV-1 gp120結合部位との相互作用により物質がTreg細胞を活性化できるかどうかを測定する方法であって、
(a)CD4のHIV-1 gp120結合部位と相互作用できる物質を事前選択し、
(b)Treg細胞を含む溶液を用意し,
(c)(a)記載の事前選択された物質とTreg細胞との相互作用を可能にする条件下で前記物質を加え、
(d)Treg細胞が活性化されたかどうかを測定し、ここで活性化Treg細胞の存在によりTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定されることを含む前記方法。 - 請求項1の(d)において、Treg細胞が活性化されたかどうかの測定が、細胞内cAMP量を測定することにより測定され、ここで細胞内cAMP量の増加が活性化Treg細胞の存在を示し、それと共にTreg細胞アクチベーターとして前記物質が同定される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1のステップ(a)が、
(a)CD4を含む第1溶液を用意し、
(b)CD4を含む第2溶液を用意し、
(c)HIV-1 gp120とCD4との結合を可能にする条件下で被験物質およびHIV-1 gp120を第1溶液に加え、
(d)HIV-1 gp120とCD4との結合を可能にする(c)と同様な条件下でHIV-1 gp120を第2溶液に加え、
(e)第1および第2溶液において、HIV-1 gp120がCD4に結合したかどうかを測定し、ここで第1溶液における結合HIV-1 gp120量の低下が、前記物質がCD4のHIV-1 gp120結合部位と相互作用できることを示すことを含む、請求項1記載の方法。
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