CN104530233B - 细胞外基质蛋白的氨基酸序列rgd的特异性人源化抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体。这些抗体中的一些抑制RGD蛋白的生物功能，由此对与RGD蛋白相关的多种病症或疾病具有治疗作用，所述疾病或病症包括癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、子宫内膜异位、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克隆氏病)和自身免疫病等。
Description
本申请是申请日为2009年4月24日，题为“细胞外基质蛋白的氨基酸序列RGD的特异性人源化抗体及其应用”的中国专利申请200980114376.2的分案申请。
1.技术领域
本发明涉及免疫特异性地识别细胞外基质蛋白的氨基酸序列RGD(Arg-Gly-Asp)的人源化抗体(humanized antibody)，和该人源化抗体用于治疗和诊断包括癌症、炎症性疾病、自身免疫病、传染病和骨病等在内的多种疾病或病症的应用。
在本临时申请中引用了多个出版物(包括专利和专利申请)。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本临时申请，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
2.背景技术
细胞粘附在多细胞生物体的生命维持中发挥重要作用。多细胞生物体的细胞粘附分类为细胞-细胞外基质(下文简称为“ECM”)粘附和细胞-细胞粘附。已经阐明细胞-ECM粘附由整合素(integrin)介导，细胞-细胞粘附由钙粘蛋白(cadherin)、封闭蛋白(claudin)和柄蛋白(nectin)介导。
跨膜粘附蛋白(例如整合素)形成细胞-ECM粘附。整合素形成α链和β链的异源二聚体。目前已经鉴别并确认了至少18种类型的α链，8种类型的β链和24种类型的αβ异源二聚体。各种类型的整合素识别特异的配体。除了细胞粘附外，包括整合素在内的跨膜粘附蛋白还与从ECM至细胞的细胞内信号传导、增殖调控、移动以及分化有关(F.G.Giancotti,et.al.,Science,285,1028-1032,1999)。
已知许多蛋白都是ECM蛋白，所述ECM蛋白分类为胶原蛋白(例如I-XIX型)、非胶原糖蛋白(例如骨桥蛋白(osteopontin，OPN))、玻连蛋白(vitronectin)、纤连蛋白(fibronectin)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor)、层粘连蛋白(laminin)、腱生蛋白(tenascin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、血小板反应蛋白(thrombospondin))、弹性蛋白(elastin)和蛋白聚糖。这些ECM蛋白与相应的整合素结合并激活细胞内信号传导通路，从而调控细胞骨架形成、移动、增殖和分化等。与ECM蛋白结合的整合素根据ECM蛋白的类型传递特异信号，由此调控这些信号激活通路。在许多ECM蛋白的细胞粘附区常观察到RGD序列，该序列通过与整合素结合而具有多种功能。ECM蛋白的RGD序列已经被认为是可能的药物靶标，并且已经产生了多种小分子化合物和人工肽。
已知一些类型的整合素，例如α3β1整合素、α5β1整合素、α8β1整合素、αvβ1整合素、αvβ3整合素、αvβ5整合素、αvβ6整合素、αvβ8整合素与RGD序列结合。α5β1整合素与其特异性配体纤连蛋白之间的相互作用激发了对整合素介导的信号传导机制的研究。所述研究表明，α5β1整合素不仅调控细胞粘附和细胞移动，还调控细胞分化和细胞死亡。(S.M.Frischet al.,Curr.Opin.Cell Biol.,9,701-706,1997)。还表明，α5β1整合素在肿瘤细胞中高表达，并与癌症的恶性改变有关。各整合素介导的信号根据所结合的ECM蛋白而不同，例如，生长因子的刺激激活与纤连蛋白结合的内层细胞的生长，而抑制与层粘连蛋白-1结合的内层细胞的生长。另外，由层粘连蛋白-10/11向α3β1整合素传递的信号不同于由纤连蛋白向α5β1整合素传递的信号，前者显著增强了癌细胞的移动(J.Gu et al.,J.Biol.Chem.,276,27090-27097,2001)并通过血液饥饿有效避免凋亡(J.Gu et al.,J.Biol.Chem.,277,19922-19928,2002)。观察到与αv整合素结合的RGD序列在破骨细胞和新生血管中高表达，因此认为抑制RGD序列和αv整合素是治疗骨质疏松症和癌症的药物的靶标。已经表明，α5β1整合素在肿瘤细胞上高表达，并与癌症的恶性改变有关。根据这些发现，已经开发了抗-α5β1整合素抗体(Volocimab)、抗-α4整合素抗体(Natalizumab)和抗-αvβ3整合素抗体(Vitaxin)作为抑制整合素和ECM蛋白之间相互作用的抗-整合素抗体拮抗药。
同时，已知一些ECM蛋白，例如胶原蛋白、骨桥蛋白(OPN)、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病因子、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白包含RGD序列。另外，还已知一些病毒和一些细菌具有RGD序列，从而粘附至细胞上。OPN是具有与骨中富含的钙相结合的性质的酸性糖蛋白。据报道，OPN在细胞粘附、细胞迁移、肿瘤形成、免疫应答和补体介导的细胞裂解中发挥重要作用。OPN敲除小鼠和抗-OPN中和抗体的结果表明，OPN与肝炎、自身免疫病(例如类风湿性关节炎)和癌的转移有关。已经指出，抑制ECM蛋白与细胞结合的抑制剂可用于治疗骨质疏松症或癌症。因此，除了上述靶向整合素的拮抗药外，还开发了靶向作为整合素结合伴侣的ECM蛋白的拮抗药。
3.发明概述
虽然已经报道了诸如抑制RGD序列介导的与整合素的相互作用的小分子、抗OPN抗体和抗整合素抗体的药物，但还没有关于特异识别RGD序列的抗体的报道。由于RGD序列是ECM蛋白的保守序列之一，特异识别RGD序列的抗体可在人和治疗性模型动物中均发挥作用，并因此可以被认为是用于治疗剂开发的非常有用的活性成分。因此，需要特异识别RGD序列的此类抗体。
本发明人之前分离了免疫特异性地识别RGD序列的小鼠单克隆抗体，并通过杂交瘤克隆33E10和35B6(保藏编号分别为FERM BP-10440和FERM BP-10441)产生该抗体。在本发明中，杂交瘤克隆名称可与由所述克隆产生的单克隆抗体名称互换使用。所有这些小鼠抗-RGD抗体都为IgG1同型。观察到这些单克隆抗体通过与诸如骨桥蛋白的ECM蛋白的RGD序列结合而干扰RGD序列介导的ECM和细胞之间的结合。因此，这些抗-RGD抗体对与RGD序列相关的疾病可具有治疗或诊断作用，所述与RGD序列相关的疾病为，例如癌症，如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、传染病、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克隆氏病)、自身免疫病、骨质疏松症等。
然而，由于这些单克隆抗体都为小鼠源的，由于其免疫原性而可能在人中产生的不利作用阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗应用。为了降低免疫原性，本发明人制备了人源化抗体，该人源化抗体具有与人源化抗体所来源的原始小鼠抗-RGD抗体所表现的生物活性相应的生物活性。
因此，本发明提供了免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含部分来源于非人来源和部分来源于人来源的抗原结合区。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含来源于非人来源(供体，例如33E10和35B6单克隆抗体)的互补决定区(下文简称为“CDR”)和来源于人来源(接受体(acceptor))的框架区(下文简称为“FR”)。所述人源化抗体或其抗原结合片段可抑制RGD序列和其配体之间的结合。
在具体实施方式中，免疫特异性地识别RGD序列的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链(下文简称为“H-链”)，其包含源自人H-链的可变区(下文简称为“V-区”)的至少一个H-链FR(下文简称为“FRH”)，和源自免疫特异性地识别RGD序列的非人抗体的H-链CDR(下文简称为“CDRH”)中的至少一个的至少一个CDRH；或者(ii)轻链(下文简称为“L-链”)，其包含源自人L-链的V-区的至少一个L-链FR(下文简称为“FRL”)，和源自免疫特异性地识别RGD序列的非人抗体的L-链CDR(下文简称为“CDRL”)中的至少一个的至少一个CDRL；或者上述(i)和(ii)两者。在一个实施方式中，所述本发明的人源化抗体的CDRH中的至少一个和/或CDRL中的至少一个可以源自由选自保藏编号为FERM BP-10440和FERM BP-10441的杂交瘤产生的单克隆抗体。在优选实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)源自人FRH的至少一个FRH，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的至少一个CDRH；或者(ii)源自人FRL的至少一个FRL，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的至少一个CDRL；或者(iii)上述(i)和(ii)两者。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRH1的SEQ ID NO:1、在CDRH2的SEQ ID NO:2和在CDRH3的SEQ ID NO:3。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRL1的SEQ ID NO:4、在CDRL2的SEQ ID NO:5和在CDRL3的SEQID NO:6。优选地，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRH1的SEQ ID NO:1、在CDRH2的SEQ ID NO:2、在CDRH3的SEQ ID NO:3、在CDRL1的SEQ ID NO:4、在CDRL2的SEQID NO:5和在CDRL3的SEQ ID NO:6。
在一些具体实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自由GenBank登录号X65891(SEQ ID NO:13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由GenBank登录号X72441(SEQ ID NO:18)编码的人κ-L-链的V-区的FRL。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:14、15、16和17(分别为X65891的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:19、20、21和22(分别为X72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的H-链的V-区(下文简称为“VH”)；或者(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的L-链的V-区(下文简称为“VL”)；(iii)上述(i)和(ii)两者。
在其它实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)源自人FRH的至少一个FRH，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的至少一个CDRH；或者(ii)源自人FRL的至少一个FRL，和包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的至少一个CDRL；或者(iii)上述(i)和(ii)两者。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在CDRH1的SEQ ID NO:7、在CDRH2的SEQ ID NO:8和在SEQ ID NO:9的CDRH3。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRL1的SEQ ID NO:10、在CDRL2的SEQ ID NO:11和在CDRL3的SEQ ID NO:12。优选地，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRH1的SEQ ID NO:7、在CDRH2的SEQ ID NO:8、在CDRH3的SEQ ID NO:9、在CDRL1的SEQ ID NO:10、在CDRL2的SEQ ID NO:11和在CDRL3的SEQ ID NO:12。
在一些具体实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自由GenBank登录号X65891(SEQ ID NO:13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由GenBank登录号X72441(SEQ ID NO:18)编码的人κ-L-链的V-区的FRL。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:14、15、16和17(分别为X65891的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:19、20、21和22(分别为X72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的VH；或者(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL；或者(iii)上述(i)和(ii)两者。
本发明还提供了包含编码免疫特异性地识别RGD序列的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。具体而言，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码包含选自SEQ ID NO:1、2、3、7、8和9的至少一个氨基酸序列的人源化H-链的核苷酸序列，或者包含编码包含选自SEQ ID NO:4、5、6、10、11和12的至少一个氨基酸序列的人源化L-链的核苷酸序列，或者包含所述人源化H-链的核苷酸序列和所述人源化L-链的核苷酸序列两者。在优选的具体实施方式中，此分离的核酸分子包含编码VH的核苷酸序列SEQID NO:23，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:24的核苷酸序列。在一些优选的具体实施方式中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷酸序列SEQ ID NO:25，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的核苷酸序列。优选地，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQID NO:23和SEQ ID NO:25两者。在优选的具体实施方式中，本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体来源的信号肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO:32和34)或者异源来源的信号肽的核苷酸序列。
在其它优选的具体实施方式中，此分离的核酸分子包含编码VH的核苷酸序列SEQID NO:27，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:28的核苷酸序列。在一些优选的具体实施方式中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷酸序列SEQ ID NO:29，或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:30的核苷酸序列。优选地，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQID NO:27和SEQ ID NO:29两者。在优选的具体实施方式中，本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体来源的信号肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO:36和38)或者异源来源的信号肽的核苷酸序列。
本发明进一步提供了载体，例如表达载体，其包含编码免疫特异性地识别RGD序列的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的H-链或L-链或两者的核苷酸序列。在此载体中，本发明的核苷酸序列可操作地连接一个或多个调控元件。本发明的核苷酸序列可以包括编码作为CDR来自的非人供体抗体的天然信号肽的核苷酸序列，或者编码异源来源的信号肽的核苷酸序列。
此外，本发明还提供了包含本发明的核酸分子的宿主细胞，其含有包含本发明核酸分子的载体。在一个实施方式中，本发明提供了分离的宿主细胞，其包含编码本发明的人源化H-链的第一核酸分子和编码本发明的人源化L-链的第二核酸分子，所述第一核酸分子和第二核酸分子均以表达具有生物学功能的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的方式可操作地连接调控元件。
因此，本发明还提供了本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括在使所述人源化抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本发明的宿主细胞，和收集所产生的人源化抗体。
本发明还提供了包含本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段的组合物。此外，本发明提供了用于预防或治疗与RGD-蛋白相关的病症或疾病的药物组合物，其包含本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。所述两种组合物中的任一种均可以进一步包含可以加和或协同地改善所述病症或疾病的另一种活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化疗化合物等。所述活性化合物还包括小分子化合物和抗体或其抗原结合片段，例如人α4结合素特异性抗体或人α9结合素特异性抗体。
另一方面，本发明提供了用于预防或治疗与RGD-蛋白相关或涉及RGD-蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施予预防有效量或治疗有效量的本发明的至少一种人源化抗体或其抗原结合片段。对于此类应用，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可以与增强所述人源化抗体或其抗原结合片段的生物学作用的治疗分子(moiety)结合。此类治疗分子的实例包括另一种抗体、抑制细胞生长或杀死细胞的细胞毒素、放射性元素和/或包括抗炎剂和抗生素等在内的其它治疗剂。
在本发明的再一个实施方式中，本发明提供了用于诊断受试者的与RGD-蛋白相关或涉及RGD-蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检查受试者施予诊断有效量的本发明的人源化抗体或其抗原结合片段。对于此类应用，本发明的人源化抗体可以用可检测的标记物(例如放射性元素)进行标记。
3.1.定义
本发明使用的术语“抗体”是指能够免疫特异性地结合目标抗原或目标序列(例如RGD序列)的抗体分子，并涵盖完整的抗体分子或其片段，包括其抗原结合片段。
本发明使用的术语“抗原结合片段”是指保留了免疫特异性地结合目标多肽、蛋白或序列(尤其为RGD序列)的能力的任何抗体片段，其包括单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fvs和包含VL和/或VH中任一种的片段或包含特异结合目标多肽、蛋白或序列的CDR的片段。因此，人源化抗体的此抗原结合片段可以包括或可以不包括部分或全长的人恒定区。本领域熟知获得上述抗体片段的各种方法。
本发明使用的术语“免疫特异性地识别”是指抗体或其抗原结合片段特异性地结合目标多肽、蛋白或序列(尤其为人RGD序列)的能力。该抗体不非特异性地与其它多肽或蛋白结合。然而，免疫特异性地结合目标多肽或蛋白(例如RGD-蛋白)的抗体或其抗原结合片段可以与其它抗原交叉反应。例如，免疫特异性地识别人RGD-蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以与鼠(murine)RGD-蛋白交叉反应。优选地，免疫特异性地识别人RGD-蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原交叉反应。
本发明使用的术语“源自人来源”或“源自非人来源”分别是指其氨基酸序列源自人抗体或非人抗体的相应部分的抗体部分。
本发明使用的术语“接受体序列”是指来自人抗体VH或VL的FR的核苷酸序列或氨基酸序列，其作为来自通常为非人抗体的供体抗体的CDR的接受体。
4.附图说明
图1显示利用鼠OPN的部分肽对单克隆抗体4P11、11M6、25H15和35B6表位分析的结果。
图2显示利用鼠OPN和人OPN的部分肽对单克隆抗体29R5、30C7、33E10和38I8表位分析的结果。
图3显示利用包含RGD序列的鼠OPN的部分肽对单克隆抗体33E10和35B6表位分析的结果。
图4显示利用鼠OPN的部分肽对单克隆抗体33E10和35B6表位分析的结果。
图5显示利用鼠OPN的部分肽(CGDSLAYGLR；SEQ ID NO:79)对单克隆抗体33E10和35B6表位分析的结果。
图6显示抗RGD单克隆抗体的CDRH分析结果。在该图中，33E10的第99位的氨基酸(F)与35B6的第98位的氨基酸(F)可以为K或R。
图7显示抗RGD单克隆抗体的CDRL分析结果。
图8显示抗RGD抗体与包含RGD序列的多种ECM蛋白的结合亲和性结果。
图9显示抗RGD抗体对mOPN N-末端片段(mOPN N-half)与癌细胞(NIH3T3细胞)结合的抑制结果。
图10A-10C显示抗RGD抗体对多种ECM蛋白与癌细胞(NIH3T3细胞)结合的抑制结果。
图11显示抗RGD抗体对肝炎的抑制作用的结果。
图12A-12B显示抗RGD抗体对试验性转移模型中的肺转移的抑制作用的结果。图12A显示转移细胞的数量，图12B显示重量变化。
图13A-13C显示抗RGD抗体对自发转移模型中的肺转移的抑制作用的结果。图13A显示癌体积，图13B显示转移细胞的数量，图13C显示重量变化。
图14显示抗RGD抗体在类风湿性关节炎模型中的治疗作用的研究结果。
图15显示小鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码显示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(E)以双下划线表示。根据Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication No.91-3242,U.S.Department of Health and HumanServices,1991)定义的CDR序列以下划线表示。
图16显示小鼠33E10VL cDNA的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。
图17显示所设计的侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的33E10 VH基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(E)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图18显示所设计的侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的33E10 VL基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图19显示pCh33E10和pHu33E10(统称表达载体(collectively ExpressionVector))的结构示意图。从上部的SalI位点顺时针开始，所述质粒包含从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始以起始抗体重链基因的转录的重链转录单元。CMV启动子之后为VH外显子、包含含有人γ-1重链恒定区(所述人γ-1重链恒定区包含具有插有内含子的CH1、铰链、CH2和CH3外显子)的基因组序列以及CH3外显子之后的聚腺苷酸位点。轻链转录单元在重链基因序列之后，该轻链转录单元以CMV启动子起始，之后为VL外显子和包含人κ链恒定区外显子(CL)和在CL之前的部分内含子的基因组序列，以及CL外显子之后的聚腺苷酸位点。所述轻链基因之后为SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位点(SV40聚腺苷酸位点)的片段。最后，所述质粒包含质粒pUC19的含有细菌复制起点(pUC ori)和β-内酰胺酶基因(β-内酰胺酶)的一部分。
图20显示33E10 VH、人源化33E10(Hu33E10)VH和人接受体U03400(GenBank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据Kabatet al.(1991)的位置。Kabat et al.(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterests,Fifth edition,NIH Publication No.91-3242,U.S.Department of Healthand Human Services,1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下划线表示的残基与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该图中省略了U03400中的CDR残基。
图21显示33E10 VL、人源化33E10(Hu33E10)VL和人接受体X72452(GenBank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据Kabatet al.(1991)的位置。Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。在该图中省略了X72452中的CDR残基。
图22显示用于构成Hu33E10 VH基因的寡核苷酸。
图23显示用于构成Hu33E10 VL基因的寡核苷酸。
图24显示用于构成Hu33E10 VH基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。
图25显示用于构成Hu33E10 VL基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。
图26显示侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的Hu33E10 VH基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(E)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图27显示侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的Hu33E10 VL基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图28显示小鼠35B6 VH cDNA的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(Q)以双下划线表示。根据Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication No.91-3242,U.S.Department of Health and HumanServices,1991)定义的CDR序列以下划线表示。
图29显示小鼠35B6 VL cDNA的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。
图30显示所设计的侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的35B6 VH基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(Q)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图31显示所设计的侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的35B6 VL基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图32显示pCh35B6和pHu35B6(统称表达载体)的结构示意图。从上部的SalI位点顺时针开始，所述质粒包含从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始以起始抗体重链基因的转录的重链转录单元。CMV启动子之后为VH外显子、包含含有人γ-1重链恒定区(所述人γ-1重链恒定区包含具有插入内含子的CH1、铰链、CH2和CH3外显子)的基因组序列以及CH3外显子之后的聚腺苷酸位点。轻链转录单元在重链基因序列之后，该轻链转录单元以CMV启动子起始，之后为VL外显子和包含人κ链恒定区外显子(CL)和在CL之前的部分内含子的基因组序列，以及CL外显子之后的聚腺苷酸位点。然后，所述轻链基因之后为SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位点(SV40聚腺苷酸位点)的片段。最后，所述质粒包含质粒pUC19的含有细菌复制起点(pUC ori)和β-内酰胺酶基因(β-内酰胺酶)的一部分。
图33显示35B6 VH、人源化335B6(Hu35B6)VH和人接受体Z47230(GenBank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据Kabat etal.(1991)的位置。Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下划线表示的残基与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该图中省略了Z47230中的CDR残基。
图34显示35B6 VL、人源化335B6(Hu35B6)VL和人接受体X72479(GenBank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母密码表示。序列上方的数字表示根据Kabat etal.(1991)的位置。Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。预测双下划线表示的残基与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上小鼠残基被保留。在该图中省略了X72479中的CDR残基。
图35显示用于构成Hu35B6 VH基因的寡核苷酸。
图36显示用于构成Hu35B6 VL基因的寡核苷酸。
图37显示用于构成Hu35B6 VH基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。
图38显示用于构成Hu35B6 VL基因的寡核苷酸。箭头指示各寡核苷酸的位置和方向(由5’至3’)。氨基酸残基以单字母密码表示。
图39显示侧翼具有SpeI和HindIII位点(下划线表示)的Hu35B6 VH基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VH的N-末端氨基酸残基(Q)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图40显示侧翼具有NheI和EcoRI位点(下划线表示)的Hu35B6 VL基因的核苷酸序列与推测的氨基酸序列一起显示。氨基酸残基以单字母密码表示。信号肽序列以斜体表示。成熟的VL的N-末端氨基酸残基(D)以双下划线表示。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列以下划线表示。内含子序列以斜体表示。
图41A-41B显示通过ELISA对嵌合35B6抗体和人源化35B6抗体与hOPN-BSA的结合进行分析的结果。以起始浓度2.5μg/ml(图41A)或1.0μg/ml(图41B)和一系列两倍稀释对各个抗体进行测试。实验一式三份。各抗体浓度的平均吸收值和标准偏差显示在图41A-41B中。
5.发明详述
5.1.针对RGD序列的抗体的制备
可以通过本领域任何适合的方法产生免疫特异性地识别RGD序列的抗体。
在本发明中，包含细胞粘附“RGD”序列的RGD-蛋白或肽(下文简称为“RGD-肽”)可以为(1)源自表达RGD蛋白的人ECM或者源自具有ECM的所有组织，(2)通过向细菌、酵母、诸如动物细胞的细胞系等中转染编码RGD-蛋白或RGD-肽的DNA(优选为cDNA)而表达获得的重组蛋白或肽，或者(3)合成的蛋白或肽。
在本发明中，用作抗原的RGD-肽能够通过免疫产生针对RGD序列的抗体。所述RGD-肽包括氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:71)(其为鼠ECM蛋白的细胞粘附序列)的RGD-肽。所述RGD-蛋白或RGD-肽包括，例如OPN、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病因子、胶原蛋白、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原、血小板反应蛋白和包括其片段的RGD。可以将人工或天然变化，例如氨基酸的取代、缺失、修饰和添加应用于所述蛋白或所述肽，只要所述蛋白或所述肽包含RGD-序列。所述变体蛋白或肽可以包含其中的多个氨基酸，优选1-10个氨基酸，更优选1-几个(例如1-5个)氨基酸被取代、缺失、修饰、添加或插入的氨基酸序列。
在本发明中，所述RGD-肽包含至少约5个氨基酸，优选约5-50个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。可以利用本领域熟知的方法，例如化学合成法、细胞培养法、基因重组法及其正确修饰产生在本发明中作为抗原的RGD-蛋白或RGD-肽。例如，可以利用蛋白酶对ECM蛋白进行适当切割，从而获得RGD-肽。所述RGD-蛋白或所述RDG-肽可源自哺乳动物，例如鼠(murine)、大鼠、兔、猪、牛、猴和人。可以使用本领域熟知的任何方法制备可用于制备抗-RGD抗体的RGD-蛋白或RGD-肽。
用于产生所述变体多肽的方法的实例包括合成寡核苷酸定点突变法(缺口双链体法)、涉及利用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理随机引入点突变的点突变法、涉及利用Bal31酶或其它酶制备缺失突变的方法、盒式突变、连接子扫描法、错掺入法(miss incorporationmethod)、错配引物法和DNA片段合成法等。
所述RGD-肽可以与其它生物大分子，例如甲状腺球蛋白(thyrogloblin)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，优选甲状腺球蛋白结合。通过使用偶联剂，例如具有活性酯基团和马来酰亚胺基团的结合试剂(所述活性酯基团与蛋白或肽的氨基基团结合，并且所述马来酰亚胺基团与蛋白或肽的巯基基团结合；S.Yoshirake et al.,Eur.J.Biochem.,101,395-399,1979)，通过使用混合酐法(B.F.Erlanger et al.,J.Biol.Chem.,234,1090-1094,1954)，或者通过使用活性酯法(A.E.Karu et al.,J.Agric.Food Chem.,42,301-309,1994)，可以获得RGD-肽和生物大分子结合的方法。优选通过使用偶联剂获得RGD-肽和生物大分子结合的方法。
还可以使用自身过表达RGD-蛋白或RGD-肽的细胞作为抗原。自身过表达RGD-蛋白或RGD-肽的细胞可以通过本领域熟知的重组DNA技术制备。
可以利用按照上述制备的适当抗原，通过本领域熟知的多种方法制备特异于RGD序列的抗体。可以通过本领域熟知的多种方法产生针对RGD序列的抗体。例如，可以将目标抗原施予包括但不限于兔、小鼠、大鼠等在内的多种宿主动物，从而诱导产生包含特异于所述抗原的多克隆抗体的抗血清。可以根据宿主种类使用多种佐剂提高免疫应答，所述佐剂包括，但不限于弗氏(完全或不完全)佐剂，矿物胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚，和用于人的潜在有用的佐剂，例如BCG(卡介菌，Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领域熟知的。
可以使用本领域已知的包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术或其组合在内的多种技术制备单克隆抗体。例如，可以通过使用包括本领域已知的以及例如Harlow etal.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nded.1988)；Hammerling,et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,pp.563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(两者均通过引用整体并入本文)中教导的杂交瘤技术，产生单克隆抗体。本发明使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指源自单个克隆的抗体，并包括真核、原核或噬菌体克隆，但不限于产生该单克隆抗体的方法。
利用杂交瘤技术产生并筛选特异抗体的方法是常规方法，且为本领域所熟知。在非限制性实例中，可以利用目标抗原或表达此抗原的细胞免疫小鼠。检测到免疫应答(例如在小鼠血清中检测到特异于所述抗原的抗体)后，收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后，通过熟知的技术将所述脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如，P3U1、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8-653等)融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后，通过本领域已知的方法检测所述杂交瘤克隆，获得分泌能够与所述抗原结合的抗体的细胞。可以通过对小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆来产生腹水液，该腹水液通常包含高水平的抗体。
可以通过已知技术产生识别特异表位的抗体片段。例如，可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割，利用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)的酶产生Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段包含完整的L-链和H-链的V区、CH1区和铰链区。
可以通过本领域已知的任何用于合成抗体的方法，尤其是通过化学合成或者优选通过重组表达技术，产生本发明的抗体或其抗原结合片段。
可以根据本领域技术人员可利用的任何信息(例如来自Genbank的信息、文献或者通过常规克隆和序列分析)，获得编码抗体的核苷酸序列。如果不能获得包含编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆，而抗体分子或其表位结合片段的序列已知，则可以化学合成编码所述免疫球蛋白的核酸，或者从合适的来源(例如抗体cDNA文库，或者由表达所述抗体的任何组织或细胞，例如所筛选的表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸，优选poly A+RNA，或由其产生的cDNA文库)利用与序列的3’和5’末端杂交的合成引物通过PCR扩增获得编码所述免疫球蛋白的核酸或通过克隆利用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针以鉴定例如来自cDNA文库的编码所述抗体的cDNA克隆从而获得编码所述免疫球蛋白的核酸。然后，可以利用本领域熟知的任何方法，将通过PCR扩增产生的核酸克隆至可复制的克隆载体内。
5.2.重组抗体的制备
可以利用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点突变和PCR等(参见，例如Sambrook et al.,见上文；和Ausubel et al.,eds.,1998,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,描述的技术，其均通过引用整体并入本文)，对所述抗体的核苷酸序列进行处理。可以向抗体中引入突变，例如在表位结合结构域区或者在任意部分引入氨基酸取代、缺失和/或插入，从而增强或降低生物活性。
可以使用包含编码抗体的核苷酸序列的表达载体用于抗体或其抗原结合片段的重组表达。可以利用之前节段中讨论的本领域熟知的技术，通过重组DNA技术产生包含编码抗体分子、抗体的H-链和/或L-链或其用于产生抗体或其抗原结合片段的部分的核苷酸序列的载体。可以利用本领域技术人员熟知的方法构建包含抗体或其抗原结合片段的编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可以将编码VH、VL、VH和VL两者、VH和/或VL的抗原结合片段或者抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列克隆至此载体中用于表达。此序列可以与编码可以是天然的或与原始抗体异源的信号肽的多核苷酸融合。然后，可以将由此制备的表达载体引入到适合表达所述抗体的宿主细胞中。因此，本发明包括包含编码免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的宿主细胞。
可以利用本发明的两种表达载体共转染所述宿主细胞，其中，第一载体编码源自H-链的多肽，第二载体编码源自L-链的多肽。所述两种载体可以包含能够均等表达H-链和L-链多肽的同一选择标记物，或者不同的选择标记物，从而确保两种质粒的维持。或者，可以使用编码并能够同时表达H-链和L-链多肽的单个载体。H-链和L-链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
在另一个实施方式中，还可以利用本领域已知的各种噬菌体展示法产生抗体。在噬菌体展示法中，功能抗体结构域被展示在具有编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在具体的实施方式中，可以利用此噬菌体来展示由库(repertoire)或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合域，例如Fab和Fv或者通过二硫键稳定的Fv。可以利用抗原，例如利用标记抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原，选择或鉴定表达与目标抗原结合的抗原结合域的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常为包括fd和M13在内的丝状噬菌体。所述抗原结合域作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的重组融合蛋白表达。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的实例包括在Brinkman et al.,J.Immunol.Methods,182:41-50,1995；Ames et al.,J.Immunol.Methods,184:177-186,1995；Kettleborough et al.,Eur.J.Immunol.,24:952-958,1994；Persic et al.,Gene,187:9-18,1997；Burton et al.,Advances in Immunology,57:191-280,1994；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中描述的方法，其均通过引用整体并入本文。
如上述参考文献中的描述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生包括人抗体或其它任何目标片段在内的所有抗体，并按照例如以下详述在包括例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌在内的任何期望宿主中表达。例如，也可以利用本领域已知的方法，例如在PCT公开WO 92/22324；Mullinax et al.,BioTechniques,12(6):864-869,1992；和Sawai et al.,AJRI,34:26-34,1995；和Betteret al.,Science,240:1041-1043,1988(均通过引用整体并入本文)中公开的方法，采用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术。可用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston et al.,Methods in Enzymology,203:46-88,1991；Shu et al.,PNAS,90:7995-7999,1993；和Skerra et al.,Science,240:1038-1040,1988中描述的技术。
在通过上述任一方法产生本发明的抗体分子后，可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任一方法对其进行纯化，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析(尤其是在蛋白A或蛋白G纯化后针对特异抗原的亲和层析)和根据体积的柱层析)、离心、差异溶解度或通过用于蛋白纯化的其它标准技术对其进行纯化。此外，本发明的抗体或其片段可以与本文描述的异源多肽序列或本领域已知的其它物质融合，以便于纯化。
对于包括抗体在人体内的应用和体外检测试验在内的一些应用，可以优选使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在下文5.3节中将详细讨论嵌合抗体和人源化抗体。
与其它化合物或异源多肽融合或结合的抗体可用于体外免疫试验、纯化方法(例如亲和层析)以及体内治疗应用或诊断应用中。参见，例如PCT公开号WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.,Immunol.Lett.,39:91-99,1994；美国专利号5,474,981；Gillieset al.,PNAS,89:1428-1432,1992；和Fell et al.,J.Immunol.,146:2446-2452,1991，其均通过引入整体并入本文。例如，可以使用已知方法或商业化试剂盒(例如生物素标记、FITC标记、APC标记)通过各种方式对抗体进行标记。作为另一种实例，抗体也可以与增强该抗体在体内的生物学作用的治疗分子结合。此治疗分子的实例包括另一种抗体、抑制细胞生长或杀细胞的细胞毒素、放射性元素和/或包括抗炎剂和抗生素等在内的其它治疗剂。在本发明中，所述人源化抗-RGD抗体可以与另一种抗体结合，形成双特异性抗体。作为另一种实例，本发明的人源化抗体可以用可检测标记物，例如放射性元素进行标记，从而用于体内诊断应用。
5.3.嵌合抗体和人源化抗体
嵌合抗体是该抗体的不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的V-区和源自人免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如Morrison,Science,229:1202,1985；Oi et al.,BioTechniques,4:2141986；Gillies et al.,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397，其均通过引用整体并入本文。
人源化抗体是结合目标抗原的分子，所述分子包含含有一个或多个源自非人物种的CDR和一个或多个源自人免疫球蛋白分子的FR的V-区。许多文献都已经对使非人抗体人源化的常规方法进行了描述，例如Queen et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033和美国专利号5,585,089和5,693,762；Riechmann et al.,Nature,332:323,1988；和Tsurushita et al.,Methods 36:69-83,2005，所有都通过引用整体并入本文。例如，Tsurushita et al.的参考文献(2005，见上文，以下称为“Tsurushita”)提供了基于Queen et al.(1989，见上文)最初开发的抗体人源化方法对小鼠单克隆抗体进行人源化的实践指导方案。以下对Tsurushita中公开的一般方案进行概述。
5.3.1.用于制备人源化抗体的一般方案
小鼠V基因的克隆和测序
可获得的用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体的VH和VL的cDNA的方法有多种。例如，利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences,CA)或GeneRacer试剂盒(Invitrogen,CA)的5’RACE(cDNA末端快速扩增)法已经被广泛使用。用于5’RACE的基因特异性引物可以根据目标单克隆抗体的H-链和L-链的表位进行制备，从而使该引物能够直接(immediately)结合VH和VL的下游。因此，经设计5’RACE引物可以特异于小鼠的各个亚型，例如γ1、γ2a、γ2b或γ3。或者，可以根据各亚型间的共有区域或高度同源的区域设计用于所有亚型的通用引物。在Tsurushita中，公开了以下5’RACE引物作为实例：
(i)5’-GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO:82)(用于克隆小鼠γ1、γ2a、γ2b或γ3H-链)
(ii)5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO:83)(用于克隆小鼠κL-链)。
可以利用例如，Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR扩增的V-区基因片段直接克隆至质粒载体，并对DNA序列进行确定。应该通过，例如，将其编码的氨基酸序列与利用例如Model 241蛋白测序仪(Hewlett-Packard,CA)通过N-末端氨基酸测序确定的目标单克隆抗体的氨基酸序列进行比较，验证所获得的序列。通常，通过例如Edman降解验证目标抗体N-末端的至少15-20个氨基酸残基就足以确定所克隆的DNA序列的可靠性。Tsurushita告诫，当N-末端氨基酸为谷氨酸(其是小鼠中最常见的两个N-末端氨基酸之一)时，其可能被转化为焦谷氨酸并阻碍N-末端的测序。在这种情况下，必须对N-末端进行去阻碍(deblock)，以获得所述序列。
V-区的三维模建(Three-dimensional
modeling)
根据VH和VL的序列，通过例如R.Levy et al.,1989,Biochemistry 28:7168-7175；和B.Zilber et al.,1990,Biochemistry 29:10032-10041描述的方法首先对目标抗体中可能对维持CDR构象结构重要的框架残基进行鉴定。通常地，将VH和VL各分成14个在结构上有意义的片段，这些片段为包含免疫球蛋白超家族的结构域结构的β-折叠和环状结构。将来自目标抗体的所述各片段的氨基酸序列与PDB数据库中结构已知的抗体的相应片段进行比对(参见H.M.Berman et al.,2000,Nucleic Acids Res.28:235-342)。通过多序列比对选择与各目标片段的序列同源性最高的相应片段，并构建V-区的三维模型。为了优化结构，对所述模型进行多轮共轭梯度能量最小化(例如，利用ENCAD或者如Press et al.,1990,“Numerical Recipes,Cambridge University Press,Cambridge所述；Weiner etal.,1981,J.Comp.Chem.2:287-303所述的AMBER；可从BioMolecularModelling或英国癌症研究中心(Cancer Research UK)经营的”BMM”网站获得的3D-JIG-SAW；或者可从日内瓦的瑞士生物信息所(Swiss Institute of Bioinformatics,Geneva)经营的ExPASyProteomics Server网站获得的SWISS-MODEL)。
人框架的选择
V-区结构模建的同时，将分别由小鼠VH和VL的cDNA克隆推测的氨基酸序列与数据库(例如Kabat数据库(参见Johnson et al.,2000,Nucleic Acids Res.28:214-218.)和GenBank等)中的人V-区序列进行比较。利用，例如Smith-Waterman算法(Gusfield,1997,in“Algorithms on Strings,Trees,and Sequences”,Cambridge University Press,Cambridge)或者BLAST(Karlin et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268)等可以寻找到与所述小鼠序列的整体序列同一性为至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％同一性的人FR。这些人序列可以基于基于cDNA的序列和蛋白衍生序列，然而，由于胚系(germline)可用于除去基于cDNA的序列、蛋白衍生序列中与体细胞超突变有关的潜在致免疫性，因此通常优选使用胚系。或者，如Queenet al.(1989，见上文)所述，也可以使用共有框架序列鉴定并除去由基于cDNA的序列或蛋白衍生序列获得的框架中的此种超突变残基。在使用胚系VH片段作为接受体框架的情况下，应使用第14条染色体上而非第15和16条染色体上编码的VH片段，因为仅有在第14条染色体上的VH片段产生功能性VH。
人源化V-区的设计
根据Queen et al.(1989，见上文)，需要对CDR的约以内的框架氨基酸进行鉴定，因为认为这些残基是支持正确CDR结构的潜在主要框架残基。可以利用计算原子坐标的原子间距离的计算机程序，例如从National Science Foundation(NSF)支持的Molecular Visualization Freeware网站上获得的RASMOL或者通过计算机模型的人工检查，实现此过程。如果小鼠供体和人接受体序列在主要框架位置的氨基酸不同，则小鼠供体的氨基酸通常代替人氨基酸残基。然而，如果此残基对支持CDR结构具有很小的贡献，则通常使用相应的人残基。此外，如果所选择的人接受体包含“非典型的”氨基酸(其存在于小于约10-20％的V-区序列中)，则该“非典型的”氨基酸可能是亲和力成熟过程中体细胞超突变的结果，并且为了避免在人体中的潜在免疫原性而应使用供体残基代替。
此外，为了设计人源化V区，需要认真考虑诸如潜在N-连接糖基化信号的其它因素(详见Tsurushita)。
取决于治疗应用所需要的或要消除的效应子功能(effector function)，人源化抗体可以包含人恒定区或其部分，所述人恒定区或其部分来自人抗体的人κ或λL-链和/或γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或εH-链或其变体。例如，含有突变的恒定区的Fc部分可以与本发明的嵌合抗体或人源化抗体的V-区融合，从而降低所述抗体与Fc受体的结合和/或降低其固定(fix)补体的能力(参见，例如Winter et al.,GB 2,209,757B；Morrison et al.,WO 89/07142,Morgan et al.,WO 94/29351)。可以通过如第5.2节描述的重组DNA技术进行抗体分子的这些处理。
优选地，所产生的嵌合抗体或人源化抗体具有与非人供体抗体相同的特异性和与非人供体抗体类似的亲和性或所述非人供体抗体至少约1/3，至少约1/2或至少约2/3的亲和性。另一方面，所产生的嵌合抗体或人源化抗体的亲和常数为至少约1×107M-1，优选至少约1×108M-1，最优选至少约1×109M-1。
除了上述一般方案外，还可以利用本领域已知的多种技术对抗体进行人源化，所述技术包括，例如CDR-移植法(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶饰法(veneering)或表面重塑法(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology,28(4/5):489-498,1991；Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805-814,1994；Roguska et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA,91:969-973,1994)和链置换法(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所有内容均通过引用整体并入本文。
5.3.2.制备作为药物的人源化抗体需要额外考虑的问题
为了提供作为药物的人源化抗体，需要制备高效而恒定的生产系统。例如，通过插入H-链和L-链序列制备用于人源化抗体的适当表达载体，并且可以获得转染了该表达载体的高产量细胞系作为主细胞库(MCB)的种细胞，所述主细胞库可作为工作细胞库(WCB)的稳定且半永久来源。然后，可以通过培养来自WCB的工作细胞并收集培养液获得人源化抗体。
可以使用具有合适调节基因的各种表达载体制备此生产细胞系。作为宿主细胞，可以使用通常用于表达哺乳动物蛋白的宿主细胞用于人源化抗体的表达。此宿主细胞的实例包括，但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0-Ag14.19细胞和NSO细胞等。可以通过选择表达载体和宿主细胞的最佳组合使人源化抗体的产量最大化。此外，为了从各种不含血清的培养基和补充物中选择合适的培养基，应对培养基的组成进行研究，从而可以优化宿主细胞对人源化抗体的表达。
可以根据效率和终产率使用本领域熟知的各种方法，包括亲和层析、离子交换层析和疏水相互作用层析等，从培养上清液中纯化由宿主细胞产生的人源化抗体。
5.4.药物组合物和治疗应用
本发明提供了包含上述免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的药物组合物。包含作为活性成分的本发明人源化抗体的药物组合物可用作预防和/或治疗与RGD蛋白相关的病症或疾病的药剂，所述病症或疾病包括，但不限于癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克隆氏病)和自身免疫病等。
包含本发明的人源化抗体的药物组合物还可以用于治疗器官移植后的慢性排斥和自身免疫病，例如全身自身免疫病、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞氏病、多肌炎、增殖性肾小球肾炎和结节病等。
用于预防或治疗上述病症或疾病的包含本发明人源化抗体的预防和/或治疗剂的毒性低，且可以通过混合在合适的溶剂中而直接作为液体制剂或作为适当剂型的药物组合物经口或肠胃外给人施用。
用于上述施用的药物组合物包含前述抗体或其盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。以适合经口或肠胃外给药的剂型提供此组合物。
剂量可以根据待施用受试者的年龄和大小、目标疾病、病况和给药途径等而改变。例如，当所述抗体用于预防和/或治疗成人患者的类风湿性关节炎时，通常以约0.01mg/kg体重-约20mg/kg体重，优选约0.1mg/kg体重-约10mg/kg体重且更优选约0.1mg/kg体重-约5mg/kg体重的单剂量，每天大约1-5次，优选每天大约1-3次，经静脉内施用本发明的抗体是有利的。在其它肠胃外给药和口服给药中，可以以与上述剂量对应的剂量施用所述抗体。当病况非常严重时，可根据病况增加剂量。
已知多种递送系统且均可用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体包封、微颗粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞(参见，例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429 4432)。引入方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。所述化合物可以通过任何便利途径施用，例如通过输注或推注(bolus injection)，通过经上皮或皮肤粘膜内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收的途径施用，并且所述化合物可以与其它生物活性剂一起施用。给药可以是全身的或局部的。还可以采用例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有雾化剂的制剂进行肺部给药。
在具体实施方式中，可能期望将本发明的药物组合物局部施用在需要治疗的区域，这可以通过，例如(但不限于)以下方式实现：手术期间的局部输注、表面涂敷(topicalapplication)(例如与手术后的伤口敷料结合)，通过注射，通过导管的方式，通过栓剂的方式，通过鼻喷雾的方式，或者通过植入物的方式，所述植入物为包括膜(例如硅胶模)或纤维在内的多孔、无孔或凝胶状物质。在一个实施方式中，所述施用可以通过在组织感染部位(或前部位)的直接注射进行。
在另一个实施方式中，可以在囊泡中，尤其在脂质体中递送所述药物组合物(参见，Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat et al.,in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同前,pp.317-327；一般参见同前)。
在再一个实施方式中，可以在控释系统中递送所述药物组合物。在一个实施方式中，可以使用泵(参见，Langer，见上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507；和Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料(参见，Medical Applications ofControlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolenand Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy et al.,1985,Science228:190；During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105)。在再一个实施方式中，可以将控释系统放置在组合物靶标的附近，由此仅需要全身剂量的一部分。(参见，例如Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。在Langer(Science 249:1527-1533(1990))的综述中对其它控释系统进行了讨论。
经口施用组合物的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂(包括糖锭剂和薄膜衣片)、丸剂、粒剂、粉状制剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述组合物通过公众已知的方法制造，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的实例为乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸镁等。
所述可注射的制剂可以包括用于静脉内注射、皮下注射、皮内注射和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射的制剂可以通过公知的方法制备。所述可注射制剂可以通过，例如将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规注射用无菌含水介质或油性介质中而制备。所述注射用含水介质可以为，例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂为例如醇(如，乙醇)、多元醇(如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[如，聚山梨糖醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述抗体或其盐与栓剂用常规基料混合而制备。
有利地，将上述用于经口或肠胃外施用的药物组合物制备成适合固定活性成分的剂量的单位计量剂型。此类单位剂量剂型包括，例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。上述抗体的含量通常为每单位剂量剂型约5mg-500mg；尤其对于注射剂剂型，上述抗体的含量优选为约5mg-100mg，而其它剂型为约10mg-250mg。
除了配方引起与上述抗体的任何不利相互作用的情况外，上述各组合物还可以包含其它活性组分。
本发明还涉及用于细胞和/或组织重塑的抑制剂和/或促进剂，其包含作为活性成分的结合RGD序列的功能分子(例如整合素等)；和用于抑制和/或促进细胞和/或组织重塑的方法，其包括使表达RGD蛋白的细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与结合RGD蛋白的功能分子接触。可以参考以上对包含本发明的人源化抗体的药物的描述，适当确定此治疗剂中活性成分的剂量、给药方法、药物制备等。
如上所述，本发明进一步提供了用于预防或治疗与RGD蛋白有关或涉及RGD蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体。
5.5.诊断应用
包含本发明的人源化抗体的药物组合物可作为诊断剂用于癌症(例如癌细胞的生长或转移)和/或炎症性疾病(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿等)，或者作为诊断剂用于器官移植后的慢性排斥和自身免疫病，例如全身自身免疫病、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞氏病、多肌炎、增殖性肾小球肾炎和结节病等。本发明的人源化抗体能够特异性识别RGD序列，并由此可以用于定量测试液中的RGD蛋白，尤其用于通过夹心免疫测定法、竞争性测定法、免疫测定法、散色比浊法(nephrometry)等，或免疫染色等的定量。在将上述免疫学方法用于本发明的测定方法时，不需要对任何特定条件、步骤等进行说明。通过在常规条件和步骤中加入本领域的常规技术考虑足以构建测试体系。对于上述一般技术方法的细节，可以参见综述或教科书等。
如上所述，可以通过使用本发明的抗体对RGD蛋白进行高灵敏度定量。通过采用体内定量RGD蛋白的方法，本发明的人源化抗体尤其可用于诊断与RGD蛋白相关的各种疾病。例如，当检测到RGD蛋白的表达水平提高或降低时，可以诊断目前患有与RDG蛋白相关的疾病(例如癌症或炎症性疾病)的可能性高，或者将来要患这些疾病的可能性高。因此，本发明还提供了用于诊断受试者中与RGD蛋白相关或涉及RGD蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体或将两种都施予有此需要的受试者。此体内诊断所需要的剂量可以小于治疗应用所需的剂量，并且可以由本领域技术人员通过常规步骤确定。
本发明的人源化抗体还可以用于特异检测测试液例如体液、组织等中存在的RGD蛋白。所述人源化抗体还可以用于制备用于纯化RGD蛋白的抗体柱，用于检测纯化后各部分含有的RGD蛋白或用于分析RGD蛋白在待测细胞中的行为。
6.实施例
以下实施例举例说明了免疫特异性识别RGD序列的单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体的V-区的测序，表位作图和所述抗体的其它表征和此抗体的嵌合和人源化，以及所产生的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应解释为是对本发明范围的限制。
6.1.针对RGD序列的小鼠抗体的制备
根据消减免疫法(Williams C.V.,et al.,1992,Biotechniques 12:842-847)制备针对RGD序列的小鼠单克隆抗体。制备氨基酸序列为CVDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:71)的合成肽作为抗原，所述氨基酸序列包含RGD序列和氨基酸序列SLAYGLR(SEQ ID NO:72)，该RGD序列和氨基酸序列SLAYGLR(SEQ ID NO:72)是ECM蛋白的细胞粘附序列。通过EMCS(Dojin)将抗原肽与甲状腺球蛋白偶联，并作为抗原与佐剂一起免疫小鼠。通过本领域熟知的方法制备杂交瘤(参见，例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling,et al.,in:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,pp.563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。免疫4次后，收集脾细胞，并与骨髓瘤细胞X63-Ag8-653融合。然后，通过使用HAT培养基并通过ELISA(抗原肽固相)筛选培养上清液，选择产生免疫特异性地与RGD序列反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆。随着产生免疫特异性地识别RGD序列的单克隆抗体的杂交瘤克隆被分离，建立了8株杂交瘤克隆4P11、11M6、25H15、29R5、30C17、33E10、35B6和38I8。利用通过使用巯基琼脂糖珠(Amasham Bioscience)制备的抗原肽柱从杂交瘤上清液纯化得到抗体。
6.2.抗-RGD序列的单克隆抗体的表位分析
通过EMCS(Dojin)将氨基酸序列为CLPVKTDSGSSEEKLY(mOPN1)(SEQ ID NO:73)、CVDVPNGRGDSLAYGLR(mOPN5)(SEQ ID NO:71)、CVDVPNGRGDS(SEQ ID NO:74)、CPNGRGD(SEQID NO:75)、CGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:76)CGDSLAYG(SEQ ID NO:77)、CGDSLAUGLR(SEQ IDNO:78)和CSLAYGLR(SEQ ID NO:72)的包含源自鼠OPN的部分肽的肽，氨基酸序列为CVDTYDGRGDSVVYGLRS(SEQ ID NO:79)和CSVVYGLR(SEQ ID NO:80)的包含源自人OPN的部分肽的肽，以及氨基酸序列为CGRGDS(SEQ ID NO:81)的包含人OPN和鼠OPN的共同肽序列的肽偶联至BSA(Sigma corporation)并用于ELISA。
通过在37℃培养1小时将肽(10μg/ml)或蛋白(5μg/ml)固定在96孔板上，用0.1％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封闭，然后在37℃与多种浓度的抗体反应1小时。然后，使该板与作为二抗的标记有HRP的抗-鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)在37℃反应30分钟，加入OPD作为发色团，加入1N H2SO4终止反应，然后测定在490nm的吸收值。
如图1、图2、图3、图4和图5所示，单克隆抗体4P11、11M6、25H5、35B6和33E10与mOPN5和hOPN5结合，并识别鼠和人的RGD蛋白的部分肽。单克隆抗体33E10识别GRGDS(SEQID NO:81)、VDVPNGRGDS(SEQ ID NO:74)和PNGRGD(SEQ ID NO:75)，但不识别包含OPN的RGD之后的序列的SLAYGLR(SEQ ID NO:72)或SVVYGLR(SEQ ID NO:80)。单克隆抗体33E10识别GRGDS(SEQ ID NO:81)、VDVPNGRGDS(SEQ ID NO:74)和PNGRGD(SEQ ID NO:75)中共同含有的RGD序列，并能够与人肽和鼠肽两者结合。单克隆抗体35B6识别GRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:76)、GDSLAYG(SEQ ID NO:77)和GDSLAYGLR(SEQ ID NO:78)，但不能识别GRGDS(SEQ ID NO:81)、VDVPNGRGDS(SEQ ID NO:74)或PNGRGD(SEQ ID NO:75)。单克隆抗体35B6识别包含GD的RGD序列之后的序列。单克隆抗体29R5、30C17和38I8与GRGDS(SEQ ID NO:81)、SLAYGLR(SEQID NO:72)和SVVYGLR(SEQ ID NO:80)有轻微反应，但仅与mOPN5反应，提示这些单克隆抗体识别鼠OPN的VDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO:71)。
6.3.抗-RGD抗体的CDR分析
通过以下步骤确定单克隆抗体33E10和35B6的CDR的氨基酸序列。利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)从相应的杂交瘤中提取RNA，并利用First-strand cDNA合成试剂盒制备cDNA。利用重链引物扩增试剂盒(Amasham Bioscience)通过PCR延伸所述抗体的H-链cDNA，将其克隆至pCRII-TOPO载体(invitrogen)中，然后测定cDNA序列和氨基酸序列。通过ABG：抗体3D结构目录(http://www.ibt.unam.mx/vir/structure/structures.html)确定CDR。V-链和L-链的CDR如以下所示(也在图6和图7中显示)。
(H-链)
[CDRH1]
33E10：GFTFTDYYMI(SEQ ID NO:1)
35B6：GYTFTNYWMH(SEQ ID NO:7)
[CDRH2]
33E10：WLGFIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
35B6：WIGNINPRNGDSNYNEKFRS(SEQ ID NO:8)
[CDRH3]
33E10：GAY(SEQ ID NO:3)
35B6：GYFDV(SEQ ID NO:9)
(L-链)
[CDRL1]
33E10：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:4)
35B6：KASQDINSYLS(SEQ ID NO:10)
[CDRL2]
33E10：RVSNRFS(SEQ ID NO:5)
35B6：RANRLVD(SEQ ID NO:11)
[CDRL3]
33E10：GSFVPW(SEQ ID NO:6)
35B6：YDEFPF(SEQ ID NO:12)
在本实施例中，通过ABG确定CDR。然而，本领域熟知其它程序也可以用于确定CDR，并且在一定程度上可能产生不同的序列。
6.4.具有RGD序列的ECM蛋白的结合能力
利用抗-OPN抗体柱从分别引入hOPN基因或mOPN基因的CHO-K1细胞的培养上清液中纯化各个人OPN(hOPN)或鼠OPN(mOPN)。通过AGC TECHNO GLASS Co.,Ltd获得人玻连蛋白(下文简称为“VN”)。从Sigma Corporation获得人纤维连接蛋白(下文简称为“FN”)、人血小板反应蛋白和鼠层粘连蛋白。
利用固定有以上获得的hOPN、mOPN、FN、VN或层粘连蛋白的96孔板，通过ELISA检测单克隆抗体33E10和35B6与ECM蛋白的结合能力。通过在37℃培养1小时将肽(10μg/ml)或蛋白(5μg/ml)固定在96孔板上，用0.1％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封闭，然后在37℃与多种浓度的抗体反应1小时。然后，使该板与作为二抗的标记有HRP的抗-鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.)在37℃反应30分钟，加入OPD作为发色团，加入1NH2SO4终止反应，然后测定在490nm的吸收值。
结果示于图8。单克隆抗体33E10与所检测的所有ECM蛋白产生交叉反应，但显示与层粘连蛋白具有低的反应性。单克隆抗体35B6与hOPN和mOPN反应，但不与层粘连蛋白反应。
6.5.抑制细胞粘附的活性
由于已知细胞粘附涉及RGD蛋白与其配体即整合素等的结合，测定所分离的抗-RGD抗体对细胞粘附的抑制活性。利用抗-OPN抗体柱从分别引入hOPN基因或mOPN基因的CHO-K1细胞的培养上清液中纯化各个人OPN(hOPN)或鼠OPN(mOPN)。通过从大肠杆菌分离将mOPN N-末端片段(N-half)以经凝血酶切割的mOPN的N-末端部分与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白进行纯化。从Sigma Corporation获得人FN和人VN。
向96孔板的各个孔中加入50μl所述蛋白，在37℃温育1小时，并固定在所述板上。在利用封闭溶液(0.5％BSA/PBS)封闭板并利用PBS洗涤1次后，将NIH3T3细胞悬浮在0.25％BSA-极限必需培养基(MEM)中并以1.0×105细胞/ml的终浓度与所分离的单克隆抗体混合，以200μl/孔加入到该板中，并在5％CO2下在37℃温育1小时。利用PBS洗除未粘附的细胞，固定粘附细胞并用0.5％结晶紫(WAKO,Osaka,日本)/20％甲醇染色。使经染色的细胞在室温下放置30分钟。利用蒸馏水洗涤该板，并向其中加入20％乙酸溶液以实现溶解。通过测定在590nm处的OD对粘附活性进行定量。
向固定有mOPN N-末端片段的96孔板中加入NIH3T3细胞和单克隆抗体33E10或35B6的混合物，并检测抗体对NIH3T3细胞与mOPN N-末端片段的结合的影响。向固定有mOPNN-末端片段、FN或VN的各96孔板中加入NIH3T3细胞和单克隆抗体33E10的混合物，并检测抗体对NIH3T3细胞与各蛋白的结合的影响。
如图9和图10A-10C所示，NIH3T3细胞与mOPN N-末端片段粘附，并且抗-RGD抗体抑制了该粘附。与单克隆抗体35B6相比，单克隆抗体33E10显示强的抑制活性。NIH3T3细胞与所检测的所有ECM蛋白粘附。单克隆抗体33E10抑制了细胞与mOPN N-末端片段的粘附，但没有抑制细胞与FN或VN的粘附。因此，证明单克隆抗体33E10特异性地抑制OPN与细胞的粘附。
6.6.抗-RGD抗体的治疗作用
在小鼠体系内检测抗-RGD抗体的治疗作用。以与制备抗-RGD抗体基本相同的方式制备抗-RGD单克隆抗体(4P11、11M6、29R5、30C17、38I8、33E10和35B6)(参见6.1部分，见上文)。
6.6.1.对肝炎的治疗作用
WO 02/081522公开了可以通过抑制OPN的功能治疗肝炎。因此，可以利用小鼠抗-RGD抗体(4P11、11M6、29R5、30C7、38I8、33E10和35B6)在小鼠肝炎模型中研究抗-RGD抗体的治疗作用。在静脉注射200μg刀豆蛋白A(Con A)(Vector)后12小时，用GPT/ALT-PIII和GOT/AST-PIII(Fuji Film)测定小鼠(每组5只小鼠)血液中AST和ALT的水平。在注射Con A前3小时，施用200μg所述抗体。利用鼠IgG作为对照抗体。
如图11所示，单克隆抗体25H15不显示任何治疗作用，但单克隆抗体4P11、11M6、29R5、30C17和38I8显示治疗作用。施用了单克隆抗体33E10或35B6的小鼠的AST和ALT水平没有提高。因此，该结果证明可以利用单克隆抗体33E10或35B6治疗肝炎。
6.6.2.抗-RGD抗体对小鼠癌细胞系的转移的影响
在小鼠肺转移实验模型和自发模型中研究抗-RGD抗体对转移的影响。
在所述试验模型中，将混合有400μg/小鼠单克隆抗体的鼠黑色素瘤细胞系B16-Luc细胞(1×105细胞/小鼠)注射到C57BL/6小鼠的尾静脉，并在注射后14天计算肺转移数。利用同型抗体(mIgG1)作为对照。
在所述自发模型中，将鼠黑色素瘤细胞系B16-BL6细胞(4×105细胞/小鼠)经皮下注射到C57BL/6小鼠的左足垫中。注射后19天，手术切除原始瘤，并在切除后14天(注射B16-BL6细胞后33天)计算所处死的小鼠肺中肿瘤集落的数量。在注射肿瘤细胞后3、5、7、9、11、13、15和17天，以每只小鼠200μg经腹膜内施用单克隆抗体，共8次。直到手术切除时测量原始瘤的体积。手术切除后14天，计算肺内的肿瘤集落数。利用同型抗体(mIgG1)作为对照。
所述小鼠实验模型的结果示于图12A-12B。与对照相比，施予单克隆抗体33E10或35B6的小鼠的平均肺转移数是低的。单克隆抗体35B6显著抑制了肺转移。
图13A-13C以以下方式显示了所述小鼠自发模型的结果：原始瘤体积每天的变化、肺转移集落的数量和体重变化。与对照小鼠相比，施予单克隆抗体33E10或35B6中任一种的小鼠的原始瘤体积较小。因此，该结果证明，可以利用单克隆抗体33E10或35B6抑制肿瘤生长。由于对照组的5只小鼠中有2只显示太多的肺转移集落，因此对于35B6在统计学上的显著性差异没有显示。然而，与对照抗体相比，施予单克隆抗体33E10或35B6的小鼠的平均肺转移数是低的，由此证明单克隆抗体33E10或35B6抑制肿瘤转移。
6.6.3.抗-RGD抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中的治疗作用
根据厂商的方案利用II型胶原蛋白特异性单克隆抗体(IBL，日本)的鸡尾酒(cocktail)诱导小鼠的类风湿性关节炎。即，向小鼠(Balb/c)注射II型胶原蛋白特异性单克隆抗体的鸡尾酒，注射3天后，注射LPS，从而形成类风湿性关节炎。从注射胶原蛋白抗体前一天至注射胶原蛋白日后6天，以200μg/小鼠/天经腹膜内施予抗-RGD单克隆抗体或正常仓鼠IgG(NHG)，共8次。从注射胶原蛋白抗体日开始，每天观察小鼠，并通过根据关节的红(erythema)和肿从0-4对各个爪的分级来对关节炎的水平进行打分(0＝没有红或肿；1＝一个小关节(例如脚趾)出现红或肿；2＝两个以上小关节出现红或肿，或者较大关节(例如腕关节或踝节部)出现红或肿；3＝整个爪出现红或肿；4＝整个爪完全红或肿；一只小鼠(4只爪)的最高分为16)。
该结果示于图14。用对照NHG注射的小鼠的分数高，且发展成了类风湿性关节炎，而用抗-RGD抗体33E10或35B6中任一种注射的小鼠的分数低，且完全阻止了类风湿性关节炎的发生。因此，该结果证明抗-RGD抗体对类风湿性关节炎具有预防和治疗作用。
6.6.4.抗-RGD抗体在小鼠子宫内膜异位模型中的治疗作用
子宫内膜异位症的症状指示通过子宫内膜上皮细胞异位生长而有囊肿形成、基质周围内有炎症、平滑肌组织变形、神经细胞生成(neuropoiesis)和血管生成。已报导，通过免疫组化法证明骨桥蛋白(OPN)在人子宫内膜异位和大鼠子宫内膜异位模型中高表达。因此，将抗-RGD抗体(33E10)对动物模型的治疗作用作为子宫内膜异位的新疗法进行了研究。
使用C57BL/6J雌性小鼠(9周龄)。使用18只小鼠用于制备子宫内膜异位模型。摘除右侧子宫，并向腹部自体移植2片2mm x 2mm的正方形子宫片。左侧子宫作为对照，而不进行处理。将小鼠抗-RGD抗体(500μg/只，腹膜内注射)施予9只小鼠(治疗组)，每周2次，共4周(施用8次，总施用量：4000μg/只)。不向对照组(9只小鼠)施用抗体。施用后，检查所形成的囊肿的数量，并通过组织学观察病理变化。
结果示于表1。两组动物的体重没有差异。与对照组相比，治疗组出现子宫内膜异位的数量显著减少。治疗组中所形成的囊肿的重量明显降低，治疗组的囊肿重量平均是对照组的约1/3。通过免疫组化研究能够证明，抗体处理抑制了子宫内膜上皮细胞中OPN的表达。治疗组的基质中平滑肌的厚度比对照组降低1/2。
证明了施用抗-RGD抗体对小鼠子宫内膜异位模型具有治疗作用。
表1
| 对照组 | 治疗组 | |
| 移植总数 | 18 | 18 |
| 出现子宫内膜异位的数量 | 13 | 6 |
| 囊肿重量(mg)1) | 21.00±4.04 | 7.06±2.55 |
| 囊肿体积(mm2)2) | 4.17±0.92 | 1.22±0.51 |
| 平滑肌厚度(μm)3) | 10.00±1.95 | 5.00±1.78 |
1)p＝0.0437
2)p＝0.0144
3)p＝0.0787
6.7.非人抗体的人源化
6.7.1.小鼠33E10可变区基因的克隆和测序
将小鼠33E10杂交瘤细胞培养在含10％胎牛血清(FBS；HyClone,Logan,UT)的TILMedia I(Immuno-Biological Laboratories,Gunma,日本)中，置于37℃、含7.5％CO2的培养箱中。根据厂商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从大约3×106个杂交瘤细胞中提取总RNA。按照厂商的说明书使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)合成以Oligo dT引导的cDNA。利用分别与小鼠γ-1链和κ链恒定区发生退火的3’引物以及GeneRacer试剂盒提供的GeneRacer 5’引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’)(SEQ IDNO:84)，通过聚合酶链式反应(PCR)和Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)扩增33E10重链和轻链的可变区cDNA。用于VH的PCR扩增的3’引物序列为5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(SEQ ID NO:85)。用于VL的PCR扩增的3’引物序列为5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(SEQ ID NO:86)。将所扩增的VH和VL cDNA克隆至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中，用于测序。在Tocore(Menlo Park,CA)进行所述可变区的DNA测序。对数个重链和轻链克隆进行了测序，并鉴定出与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。33E10 VH和VL的共有cDNA序列以及所推测的氨基酸序列分别示于图15和16。
6.7.2.33E10 IgG1/κ嵌合抗体的构建
利用33E10 VH cDNA作为模板，5’-GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT-3’(下划线表示SpeI位点)(SEQ ID NO:87)作为5’引物，和5’-GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’(下划线表示HindIII位点)(SEQ ID NO:88)作为3’引物，通过PCR产生编码33E10 VH的基因，该基因作为外显子包含剪接供体信号和适当的侧翼限制性酶位点(图17)。同样，利用33E10 VL cDNA作为模板，5’-GGGGCTAGCACCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’(下划线表示NheI位点)(SEQ ID NO:89)作为5’引物，和5’-GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3’(下划线表示EcoRI位点)(SEQ ID NO:90)作为3’引物，通过PCR产生编码33E10 VL的基因，该基因作为外显子包含剪接供体信号和适当的侧翼限制性酶位点(图18)。所述33E10VH和VL外显子的剪接供体信号分别源自小鼠胚系JH3和Jκ1序列。PCR扩增的片段利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行凝胶纯化，用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化，并克隆至携带有人γ-1和κ恒定区的哺乳动物表达载体中，用于产生3E10IgG1/κ嵌合抗体。所产生的表达载体pCh33E10的图示结构示于图19。
6.7.3.人源化33E10 VH和VL基因的产生
根据Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033,1989)的描述，进行33E10可变区的人源化。首先，借助于计算机程序构建33E10可变区的分子模型。接着，根据针对人可变区序列的同源性检索，选择与33E10 VH的同源性高的人氨基酸序列U03400(GenBank登录号)作为接受体，用于提供人源化33E10 VH的框架。同样，选择人氨基酸序列X72452(GenBank登录号)作为用于33E10 VL的人源化的接受体。
在计算机模型提示与CDR具有明显接触的框架位置，用小鼠33E10可变区的氨基酸取代人框架氨基酸。在第30位和第48位进行此取代，产生人源化33E10(Hu33E10)VH(图20)。对于轻链，不需要取代即产生人源化33E10(Hu33E10)VL(图21)。对于33E10、所设计的Hu33E10和人接受体氨基酸序列的比对示于图20(VH)和图21(VL)。
将编码Hu33E10 VH和VL每一个的基因设计为包含信号肽、剪接供体信号和用于之后亚克隆至哺乳动物表达载体中的适当地限制性酶位点的外显子。所述Hu33E10 VH和VL外显子的剪接供体信号分别源自人胚系JH4和Jκ1序列。SIG-Pred信号肽预测软件(http:// bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html)表明，小鼠33E10 VL基因的信号肽序列是用于准确切割次最佳的。因此，在Hu33E10 VL外显子中使用小鼠单克隆抗体35B6(Gene Techno Science)的VL基因的信号肽，SIG-Pred软件预测该信号肽可以被高效而准确地切割。Hu33E10 VH外显子中的信号肽序列源自相应的小鼠33E10 VH序列。SIG-Pred软件表明，Hu33E10 VH基因的信号肽可以被高效而准确地切割。
根据He et al.(J.Immunol.160:1029-1035,1998)所述，利用Phusion DNA聚合酶，通过数个重叠的合成寡核苷酸引物(SEQ ID NO：91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和123)的延伸和PCR扩增构建Hu33E10 VH和VL基因。所述用于构建Hu33E10 VH和VL基因的寡核苷酸分别示于图22和图23。所述寡核苷酸在Hu33E10 VH和VL基因中的位置分别示于图24和图25。PCR扩增的片段利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化，并克隆至pCR4Blunt-TOPO载体中，用于测序。用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化后，将Hu33E10 VH和VL基因亚克隆至哺乳动物表达载体中的相应位点用于产生人IgG1/κ形式。所产生的表达载体pHu33E10的图示结构示于图19。所获得的Hu33E10 VH和VL基因的核苷酸序列以及所推测的氨基酸序列分别示于图26(SEQ ID NO:52)和图27(SEQ ID NO:54)。
6.7.4.嵌合和人源化33E10 IgG1/κ的瞬时表达
根据Durocher et al.(Nucl.Acids Res.30:e9,2002)的描述，利用聚乙烯亚胺分别将pCh33E10和pHu33E10质粒DNA转染到HEK293细胞中，瞬时表达嵌合和人源化33E10IgG1/κ抗体。瞬时转染的HEK293细胞在包含10％FBS的DMEM中于37℃、7.5％CO2的培养箱中保持2天。通过夹心ELISA测定培养上清液中Ch33E10和Hu33E10 IgG1/κ各抗体的表达水平。利用1/2,000稀释在PBS中的山羊抗-人IgG Fcγ-链特异性多克隆抗体(SouthernBiotech,Birmingham,AL)以100μl/孔在4℃对ELISA板包被过夜，利用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤，并在室温下利用封闭缓冲液(含2％脱脂奶粉和0.05％吐温20的PBS)以300μl/孔封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将适当稀释在ELISA缓冲液(含1％脱脂奶粉和0.025％吐温20的PBS)中的样本以100μl/孔应用于ELISA板。将从人骨髓瘤血清(SouthernBiotech)中纯化的人IgG1/κ抗体作为标准。将所述ELISA板在室温下温育2小时并用洗涤缓冲液洗涤后，利用1/2,000稀释的结合有HRP的山羊抗-人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)以100μl/孔对所结合的抗体进行检测。在室温下温育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，以100μl/孔加入ABTS底物(bioWORLD,Dublin,OH)进行显色。以100μl/孔加入2％草酸终止显色。读取在405nm的吸收值。
6.7.5.人源化35B6的表征
通过ELISA比较人源化35B6 IgG1/κ和嵌合33E10 IgG1/κ的亲和性。利用结合有牛血清白蛋白(hOPN5-BSA)的合成寡肽(Cys-Val-Asp-Thr-Tyr-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu-Arg-Ser)作为抗原。在一般试验中，利用含1μg/ml hOPN-BSA的PBS以100μl/孔在4℃对ELISA板包被过夜，用洗涤缓冲液洗涤，并在室温下利用封闭缓冲液以300μl/孔封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将适当稀释在ELISA缓冲液中的样本以100μl/孔应用于ELISA板。将所述ELISA板在4℃温育过夜并用洗涤缓冲液洗涤后，利用1/2,000稀释的结合有HRP的山羊抗-人γ链多克隆抗体(SouthernBiotech)以100μl/孔对所结合的抗体进行检测。在室温下温育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，以100μl/孔加入ABTS底物(bioWORLD,Dublin,OH)进行显色，并利用100μl/孔的2％草酸终止显色。读取在405nm的吸收值。
6.7.6.小鼠35B6可变区基因的克隆和测序
将小鼠35B6杂交瘤细胞培养在含10％胎牛血清(FBS；HyClone,Logan,UT)的TILMedia I(Immuno-Biological Laboratories,Gunma,日本)中，置于37℃、含7.5％CO2的培养箱中。根据厂商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从大约3×106个杂交瘤细胞中提取总RNA。按照厂商的说明书使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)合成以Oligo dT引导的cDNA。利用分别与小鼠γ-1链和κ链恒定区发生退火的3’引物以及GeneRacer试剂盒提供的GeneRacer 5’引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’)(SEQ IDNO:84)，通过聚合酶链式反应(PCR)和Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)扩增35B6重链和轻链的可变区cDNA。用于VH的PCR扩增的3’引物序列为5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(SEQ ID NO:124)。用于VL的PCR扩增的3’引物序列为5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(SEQ ID NO:125)。将所扩增的VH和VL cDNA克隆至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中，用于测序。在Tocore(Menlo Park,CA)进行所述可变区的DNA测序。对数个重链和轻链克隆进行了测序，并鉴定出与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。35B6 VH和VL的共有cDNA序列以及所推测的氨基酸序列分别示于图28和29。
6.7.7.35B6 IgG1/κ嵌合抗体的构建
利用35B6 VH cDNA作为模板，5’-GGGACTAGTACCACCATGGGATGGAGCTGTATCCTC-3’(下划线表示SpeI位点)(SEQ ID NO:126)作为5’引物，和5’-GGGAAGCTTAAAAAAAGCCAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3’(下划线表示HindIII位点)(SEQ ID NO:127)作为3’引物，通过PCR产生编码35B6 VH的基因，该基因作为外显子包含剪接供体信号和适当的侧翼限制性酶位点(图30)。同样，利用35B6 VL cDNA作为模板，5’-GGGGCTAGCACCACCATGAGGACCCCTGCTCAGTTTCTT-3’(下划线表示NheI位点)(SEQ ID NO:128)作为5’引物，和5’-GGGGAATTCGCAAAAGTCTACTTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCG A-3’(下划线表示EcoRI位点)(SEQ ID NO:129)作为3’引物，通过PCR产生编码35B6 VL的外显子基因，该基因包含剪接供体信号和适当的侧翼限制性酶位点(图31)。所述35B6 VH和VL外显子的剪接供体信号分别源自小鼠胚系JH1和Jκ4序列。PCR扩增的片段利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行凝胶纯化，用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化，并克隆至携带有人γ-1和κ恒定区的哺乳动物表达载体中，用于产生35B6 IgG1/κ嵌合抗体。所产生的表达载体pCh35B6的图示结构示于图32。
6.7.8.人源化35B6 VH和VL基因的产生
根据Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033,1989)的描述，进行35B6可变区的人源化。首先，借助于计算机程序构建35B6可变区的分子模型。接着，根据针对人可变区序列的同源性检索，选择与35B6 VH的同源性高的人氨基酸序列Z47230(GenBank登录号)作为接受体，用于产生人源化35B6 VH的框架。同样，选择人氨基酸序列X72479(GenBank登录号)作为用于35B6 VL的人源化的接受体。
在计算机模型提示与CDR具有明显接触的框架位置，用小鼠35B6可变区的氨基酸取代人框架氨基酸。在第48、66、67、68、69和71位进行此取代，产生人源化35B6(Hu35B6)VH(图33)。对于轻链，在第46位和第69位进行取代，产生人源化35B6(Hu35B6)VL(图34)。对于35B6、所设计的Hu35B6和人接受体氨基酸序列的比对示于图33(VH)和图34(VL)。
将编码Hu35B6 VH和VL每一个的基因设计为包含信号肽、剪接供体信号和用于亚克隆至哺乳动物表达载体的适当地限制性酶位点的外显子。所述Hu35B6 VH和VL外显子的剪接供体信号分别源自人胚系JH6和Jκ1序列。SIG-Pred信号肽预测软件(http:// bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html)表明，小鼠35B6 VH基因的信号肽序列是用于准确切割次最佳的。因此，在Hu35B6 VH外显子中使用小鼠单克隆抗体33E10(GeneTechno Science)的VH基因的信号肽，SIG-Pred软件预测该信号肽可以被高效而准确地切割。人源化Hu35B6 VL外显子中的信号肽序列源自相应的小鼠35B6 VL序列。SIG-Pred软件表明，Hu35B6 VL基因的信号肽被高效而准确地切割。
根据He et al.(J.Immunol.160:1029-1035,1998)的描述，利用Phusion DNA聚合酶，通过数个重叠的合成寡核苷酸引物(SEQ ID NO：91、92、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、107、108、144、145、146、147、148、149,150、151、152、153、154和155)的延伸和PCR扩增构建Hu35B6 VH和VL基因。所述用于构建Hu35B6 VH和VL基因的寡核苷酸分别示于图35和图36。所述寡核苷酸在Hu35B6 VH和VL基因中的位置分别示于图37和图38。PCR扩增的片段利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化，并克隆至pCR4Blunt-TOPO载体中，用于测序。用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化后，将Hu35B6 VH和VL基因亚克隆至哺乳动物表达载体中的相应位点用于产生人IgG1/κ形式。所产生的表达载体pHu35B6的图示结构示于图32。所获得的pHu35B6 VH和VL基因的核苷酸序列以及所推测的氨基酸序列分别示于图39(SEQ ID NO:68)和图40(SEQ IDNO:70)。
6.7.9.嵌合和人源化35B6 IgG1/κ的瞬时表达
根据Durocher et al.(Nucl.Acids Res.30:e9,2002)的描述，利用聚乙烯亚胺分别将pCh35B6和pHu35B6质粒DNA转染到HEK293细胞中，瞬时表达嵌合和人源化35B6 IgG1/κ抗体。瞬时转染的HEK293细胞在包含10％ FBS的DMEM中于37℃、7.5％ CO2的培养箱中保持2天。通过夹心ELISA测定培养上清液中各Ch35B6和Hu35B6 IgG1/κ抗体的表达水平。利用1/2,000稀释在PBS中的山羊抗-人IgG Fcγ-链特异性多克隆抗体(SouthernBiotech,Birmingham,AL)以100μl/孔在4℃对ELISA板包被过夜，利用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤，并在室温下利用封闭缓冲液(含2％脱脂奶粉和0.05％吐温20的PBS)以300μl/孔封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将适当稀释在ELISA缓冲液(含1％脱脂奶粉和0.025％吐温20的PBS)中的样本以100μl/孔应用于ELISA板。将从人骨髓瘤血清(SouthernBiotech)中纯化的人IgG1/κ抗体作为标准。将所述ELISA板在室温下温育2小时并用洗涤缓冲液洗涤后，利用1/2,000稀释的结合有HRP的山羊抗-人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)以100μl/孔对所结合的抗体进行检测。在室温下温育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，以100μl/孔加入ABTS底物(bioWORLD,Dublin,OH)进行显色。通过以100μl/孔加入2％草酸终止显色。读取在405nm的吸收值。
6.7.10.人源化35B6的表征
通过ELISA比较人源化35B6 IgG1/κ和嵌合35B6 IgG1/κ的亲和性。利用结合有牛血清白蛋白(hOPN5-BSA)的合成寡肽(Cys-Val-Asp-Thr-Tyr-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu-Arg-Ser)(SEQ ID NO:79)作为抗原。在一般试验中，利用含1μg/mlhOPN-BSA的PBS以100μl/孔在4℃对ELISA板包被过夜，用洗涤缓冲液洗涤，并在室温下利用封闭缓冲液以300μl/孔封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将适当稀释在ELISA缓冲液中的样本以100μl/孔应用于ELISA板。将所述ELISA板在4℃温育过夜并用洗涤缓冲液洗涤后，利用1/2,000稀释的结合有HRP的山羊抗-人γ链多克隆抗体(SouthernBiotech)以100μl/孔对所结合的抗体进行检测。在室温下温育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，以100μl/孔加入ABTS底物(bioWORLD,Dublin,OH)进行显色，并利用100μl/孔的2％草酸终止显色。读取在405nm的吸收值。如图41A-41B所示，人源化35B6 IgG1/κ与hOPN5-BSA的结合与嵌合35B6IgG1/κ类似(图41A)或没有差别(图41B)。该结果表明，小鼠35B6抗体的人源化是成功的。
7.保藏
根据微生物保藏布达佩斯条约，于2005年10月27日将本发明中称为33E10和35B6的产生小鼠抗-RGD单克隆抗体的杂交瘤保藏在位于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566)的产业技术综合研究所国际专利微生物保藏中心，保藏编号分别为FERM BP-10440和FERM BP-10441，所有内容均通过引用整体并入本文。
8.工业应用性
本发明的人源化单克隆抗体抑制了RGD蛋白的功能，从而对癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎症性肠病(溃疡性结肠炎和克隆氏病)和自身免疫病等具有治疗作用。包含本发明的抗-RGD抗体和抗-整合素抗体两者的药物组合物对癌症和炎症性疾病具有更好的治疗作用。
9.序列表
本文所指的序列总结如下。
Claims (4)
1.免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体，其包含：
(i)H-链，其包含人抗体的VH的FRH1-4和分别作为CDRH1、CDRH2和CDRH3的SEQ ID NO：1、2和3；和
(ii)L-链，其包含人抗体的VL的FRL1-4和分别作为CDRL1、CDRL2和CDRL3的SEQ ID NO：4、5和6，
其中，所述FRH1-4分别由氨基酸序列SEQ ID NO：14、15、16和17组成，所述FRL1-4分别由氨基酸序列SEQ ID NO：19、20、21和22组成。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其中，所述VH为SEQ ID NO:24的氨基酸序列，所述VL为SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
3.药物组合物，所述药物组合物用于治疗子宫内膜异位，且包含权利要求1或2所述的人源化抗体和药学上可接受的载体。
4.权利要求1或2所述的人源化抗体在制备用于预防或治疗子宫内膜异位的药物中的用途。
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