FI108917B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten CD4-spesifisen yhdistelmävasta-aineen valmistamiseksi - Google Patents

Description

108917

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen CD4-spesifisen yhdistelmävasta-aineen valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää CDR-siir-5 rostettujen vasta-ainemolekyylien tuottamiseksi käyttäen yhdistelmä-DNA-menetelmiä. Uudet vasta-ainemolekyylit ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia.

Esillä olevassa patenttihakemuksessa on viitattu alan aiempiin eri viitteisiin. Näihin on viitattu numerol-10 la, joka on annettu hakasuluissa (). Viitteet on lueteltu numerojärjestyksessä kuvauksen lopussa.

Esillä olevassa patenttihakemuksessa merkkiä "Ig" käytetään kuvaamaan luonnollisia immunoglobuliineja. Luonnolliset immunoglobuliinit on tunnettu useita vuosia ja ne 15 koostuvat yleensä Y-muotoisesta molekyylistä, jolla on antigeenin sitoutumiskohta kunkin ylemmän käsivarren päässä. Rakenteen loppuosa, ja varsinkin Y:n runko-osa, välittää Ig:hin liittyneitä tehostetoimintoja. Useita erilaisia Ig:ien fragmentteja, kuten Fab-, (Fab')2-, Fv- ja Fc-frag-20 mentit, jotka voidaan saada aikaan entsymaattisella katkaisulla, tunnetaan myös.

j Luonnolliset Ig:t sisältävät kaksi raskasketjua ja ! . . kaksi kevytketjua niin, että kunkin raskas- ja kevytket- i · juparin N-päät ovat yhdessä ja muodostavat antigeenin si- • ·’ 25 toutumiskohdat. Raskasketjujen C-päät ovat yhdessä muodos- ·.· · taen Fc-osan.

• Esillä olevassa kuvauksessa ja patenttivaatimuk- ”*·: sissa annetut Ig:n kevyt- ja raskasketjujen tähteiden mer- kinnät ovat sen numerointikaavion mukaisia, jonka on ke-30 hittänyt Kabat (1) ja (2). Näin ollen tähteiden merkinnät .·. : eivät aina vastaa suoraan aminohappotähteiden lineaarista • · · .···’ numerointia. Todellinen lineaarinen aminohapposekvenssi - voi sisältää vähemmän tai enemmän aminohappotähteitä kuin • · ·.'·· täsmällinen Kabat-numerointi osoittaen näin insertioiden :,.,ϊ 35 tai deleetioiden tapahtumisen. Nämä insertiot tai deleeti- : ot voivat sijaita missä kohdassa ketjuja tahansa. Tähteiden » » • · 2 108917 oikea numerointi voidaan määrittää annetulle Ig:lle asettamalla Ig:n sekvenssi homologisten alueiden kohdalta alekkain "standardin" Kabat-numeroidun sekvenssin kanssa.

Tutkimuksen, jossa tutkittiin suuren Ig-joukon ami-5 nohapposekvenssejä, perusteella määritettiin, että variaa-belidomeenit, jotka sijaitsevat sekä raskas- että kevyt-ketjujen N-päissä, sisälsivät kolme aluetta, joissa aminohapposekvenssi oli hypervariaabeli. Näiden hypervariaabe-lien alueiden vieressä on molemmilla puolilla alueet, joi-10 den sekvenssi vaihteli oleellisesti vähemmän (1) ja (2). Otaksuttiin, että hypervariaabelit alueet ottavat osaa antigeenin sitomiseen.

Juuri äskettäin rakennetutkimukset röntgenkristal-lografiaa ja molekyylimallitusta käyttäen ovat määrittä-15 neet kolme aluetta raskas- ja kevytketjujen variaabeleido-meeneista, jotka tuntuvat ottavan osaa antigeenin sitomiseen (47). Näitä kolmea aluetta kutsutaan yleisesti komp-lementaarisuutta määrittäviksi alueiksi (CDR). Variaabeli-domeenien muut alueet tuovat nämä CDR:t yhteen muodos-20 tamaan ainakin osan antigeeniä sitovasta kohdasta. Näitä muita alueita kutsutaan yleisesti runkoalueiksi.

On ymmärrettävä, että eräät alan tutkijat ja eri-koisesti Kabat (1) ja (2), ovat viitanneet hypervariaabe-lien alueiden olevan CDR:iä. Selvyyden vuoksi tässä pa- « · 25 tenttihakemuksessa termiä hypervariaabelialue käytetään ainoastaan kuvaamaan antigeeniä sitovia alueita, jotka on • · määritetty sekvenssianalyysillä, ja termiä CDR käytetään

• I

>.;.t kuvaamaan antigeeniä sitovia alueita, jotka on määritetty • · t rakenneanalyysillä.

, t 30 Sekvenssianalyysillä määritettyjen hypervariaabe- I lien alueiden ja rakenneanalyysillä määritettyjen CDR: ien vertailu osoittaa, että näiden alueiden välillä on jonkin verran, mutta ei täydellistä, vastaavuutta.

• ·

Esillä olevassa patenttihakemuksessa termiä "vasta- .· , 35 aine" käytetään kuvaamaan Ig:ja tai mitä tahansa niiden • * | j * l i * * i i 3 108917 fragmentteja, kevytketjun tai raskasketjun monomeerejä tai dimeerejä ja yksiketjuisia vasta-aineita, kuten yksiket-juisia Fv-fragmentteja, joissa raskasketjun ja kevytketjun variaabelidomeenit ovat yhdistyneet peptidikäsivarren, 5 joko luonnollisen tai yhdistelmä-DNA-menetelmillä tai muulla tavalla tuotetun, välityksellä edellyttäen, että vasta-aine sisältää ainakin yhden antigeeniä sitovan kohdan. Vasta-aineen loppuosan ei tarvitse sisältää ainoastaan Igrsta peräisin olevia sekvenssejä. Voidaan rakentaa 10 esimerkiksi geeni, jossa DNA-sekvenssi, joka koodittaa osaa ihmisen Ig-ketjusta, on fuusioitu DNA-sekvenssiin, joka koodittaa vaikuttaja- tai reportteripolypeptidimole-kyylin aminohapposekvenssiä. Näin ollen termi "vasta-aine" sisältää hybridivasta-aineet (katso alla).

15 Lyhennettä "MAb" käytetään osoittamaan monoklonaa- lista vasta-ainetta, joka tuotetaan hybridoomalla tai so-lulinj aj ohdannaisella.

Termiä "rekombinanttivasta-aine" käytetään kuvaamaan vasta-ainetta, joka tuotetaan menetelmällä, joka si-20 sältää yhdistelmä-DNA-menetelmien käytön.

Termiä "kimeerinen vasta-aine" käytetään kuvaamaan vasta-ainetta, jossa variaabelidomeenit kokonaisuudessaan ovat peräisin ensimmäisen nisäkäslajin vasta-aineesta ja ne on fuusioitu ainakin yhteen vakiodomeeniin, joka on ·:*. 25 peräisin eri nisäkäslajin vasta-aineesta.

Termiä "hybridivasta-aine" käytetään kuvaamaan pro-teiinia, joka sisältää ainakin Ig:n antigeeniä sitovan ... alueen, joka on kiinnitetty peptidisidoksella ainakin * osittain toiseen proteiiniin. On ymmärrettävä, että tietyt 30 asiantuntijat voivat myös käyttää sanaa "kimeerinen" ku-*. n vaarnaan sellaisia rakenteita, mutta esillä olevassa pa- | ...· tenttihakemuksessa sellaisia rakenteita kutsutaan hybridi- ! j vasta-aineiksi ja termiä kimeeriset vasta-aineet käytetään .···, yllä määritellyssä tarkoituksessa.

j » » » 108917 4

Termiä "CDR-siirrostettu vasta-aine" käytetään kuvaamaan vasta-ainetta, jossa on ainakin yksi, ja suositeltavasta kaksi tai kolme, sen CDR:stä yhdessä tai molemmissa variaabeleidomeeneissa on peräisin ensimmäisen lajin 5 vasta-aineesta niin, että vasta-aineen muut Ig-peräiset osat ovat peräisin yhdestä tai useammasta eri vasta-aineesta. Variaabelidomeenit voidaan tehdä yhdistelmä-DNA-menetelmillä tai peptidisynteesillä.

Termi "ekspressiovektori" sisältää vektorit, jotka 10 kykenevät ekspressoimaan siinä olevia DNA-sekvenssejä, se on, koodittavat sekvenssit on toimivasti liitetty muihin sekvensseihin, jotka kykenevät vaikuttamaan niiden eksp-ressioon. Käyttökelpoinen, mutta ei aina välttämätön (se on, hyönteissoluissa) tehokkaan ekspressiovektorin ele-15 mentti on markkeria koodittava sekvenssi, se on sekvenssi, joka koodittaa vektorisekvenssiä, joka johtaa proteiinia sisältävien solujen fenotyyppiseen ominaisuuteen (esim. neomysiiniresistenssi,metioniinisulfoksi-imiiniresistens-si tai tryptofaaniprototrofia), joka sallii sellaisten 20 solujen helpon tunnistamisen. Lyhyesti, termille "ekspressiovektori" annetaan toiminnallinen määritelmä ja mikä tahansa DNA-sekvenssi, joka kykenee vaikuttamaan spesifi-sesti sisällytetyn DNA-koodin ekspressioon, sisällytetään kuuluvaksi tähän termiin, kun se asetetaan spesifioituun ·:·. 25 sekvenssiin. Tällä hetkellä sellaiset vektorit ovat useim-• « · miten plasmidien muodossa. Näin ollen termejä "plasmidi" ja "ekspressiovektori" käytetään usein vaihtovuoroisesti.

... Keksinnön on kuitenkin tarkoitettu sisältävän sellaiset ’·’ muut ekspressiovektorimuodot, jotka palvelevat vastaavia 30 toimintoja ja joita aika ajoin tulee alalla tunnetuksi • · « · » sisältäen retrovirukset, in vitro systeemit (48) ja niiden | kaltaiset.

Kuten aiemmin mainittiin, DNA-sekvenssit ekspres- ,··. sortuvat isäntäsoluissa sen jälkeen, kun sekvenssit on * · ·’ 35 toiminnallisesti liitetty yhteen (se on, sijoitettu niin, • » • · 5 108917 että niiden toiminta on varmistettu) ekspressiosäätelysek-venssin kanssa. Nämä ekspressiovektorit ovat tyypillisesti replikoituvia isäntäorganismeissa joko episomeina tai isännän kromosomaalisen DNA:n sisäisenä osana.

5 Termi "rekombinantti-isäntäsolut" viittaa soluihin, jotka on transformoitu vektoreilla, jotka on valmistettu käyttäen yhdistelmä-DNA-menetelmiä. Tämän transformaation johdosta isäntäsolu kykenee tuottamaan haluttua tuotetta käyttökelpoisina määrinä mieluummin kuin vähäisempinä mää-10 rinä tai yleisemmin vähäisempinä kuin tunnistettavina määrinä, kuten ei-transformoidun isännän odotetaan tuottavan. Esillä olevan keksinnön mukaista vasta-ainetta voidaan tuottaa rekombinantti-isäntäsolussa sellaisina määrinä, jotka ovat käyttökelpoisia lisäkokeiden suoritusta tai 15 kaupallisia tarkoituksia varten, kuten noin kilogramma tai enemmän.

| Vasta-aineiden eristysmenetelmien kuvauksissa re- ! kombinantti-isännistä termejä "solu" ja "soluviljelmä" käytetään vaihtovuoroisesti ilmaisemaan vasta-ainelähteen 20 ellei muutoin ole selvästi spesifioitu. Toisin sanoen, vasta-aineen talteen otto "soluista” voi tarkoittaa talteen ottoa joko sentrifugoiduista kokosoluista tai solu-! viljelmästä, joka sisältää sekä kasvatusalustan että sus- pendoidut solut tai, lisäksi, askites-viljelmästä, joka on ! 25 mahdollista myeloomasolulinjojen tapauksessa.

:*.·. Luonnollisia Ig:ja on käytetty testeissä, diagnoo- seissa ja rajallisemmassa määrin terapiassa. Sellaisia • · käyttötapoja, erikoisesti terapiakäyttöä, on kuitenkin • * · estänyt luonnollisten Igrien polyklonaalinen luonne. Mer- 30 kittävä askel sille, että ymmärrettiin Ig:ien mahdollisuu- " det terapeuttisina aineina käytettäviksi oli määritetyn • · ...' spesif iteetin omaavien monoklonaalisten vasta-aineiden ;\j valmistusmenetelmien keksiminen. Monoklonaaliset vasta- .'*·. aineet tuotetaan yleensä jyrsijän pernasolujen ja jyrsijän / ( 35 myeloomasolujen fuusioilla ja niin ollen ne ovat oleelli- • φ 6 108917 sesti jyrsijän proteiineja. On kuitenkin olemassa hyvin harvoja julkaisuja ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden onnistuneesta tuottamisesta.

Ryhmä monoklonaalisia vasta-aineita, joilla 5 on spesifisyys T-lymfosyyttien ja T-lymfosyyttien alaryhmien antigeeneille, on kuvattu patenteissa EP-A-0 017 381, EP-A-0 018 794, EP-A-0 019 195, EP-A-0 025 722, EP-A-0 030 450, EP-A-0 030 814 ja EP-A-0 033 578.

Koska useimmat saatavissa olevat monoklonaaliset 10 vasta-aineet ovat jyrsijäalkuperää, ne ovat ihmisille luonnostaan antigeenisiä ja voivat näin ollen antaa ei-toivottavan immuuniresponssin, kuten erään responssin, jota kutsutaan Human Anti-Mouse Antibody (HAMA) -respons-siksi. Sen vuoksi jyrsijän monoklonaalisten vasta-aineiden 15 käyttöä terapeuttisina aineina ihmisillä rajoittaa luonnostaan se tosiasia, että ihmiskohde voi muodostaa immunologisen responssin monoklonaaliselle vasta-aineelle ja joko poistaa sen kokonaan tai ainakin vähentää sen tehokkuutta. Näin ollen jyrsijäalkuperää olevia monoklonaalisia 20 vasta-aineita ei käytännössä yleensä suositella käytettäviksi potilaille useampaan kuin yhteen tai muutamaan käsittelyyn, koska voi kehittyä HAMA-responssi, joka tekee monoklonaalisen vasta-aineen tehottomaksi kuin myös muo-:*·*: dostaa ei-toivottavia sivureaktioita.

.’I*; 25 Sen vuoksi on tehty ehdotuksia ei-ihmisalkuperää olevien monoklonaalisten vasta-aineiden tekemiseksi vähem- • · män antigeenisiksi ihmisille. Sellaisia menetelmiä voidaan yleisesti kutsua "ihmismäistämis"menetelmiksi. Nämä mene- • · ♦ telmät sisältävät yleensä yhdistelmä-DNA-menetelmien käy- . , 30 tön sellaisten DNA-sekvenssien manipuloimiseksi, jotka • · · koodattavat vasta-ainemolekyylin polypeptidiketjuja.

··* Viime vuosina molekyylibiologian edistysaskeleet :‘\j perustuivat useiden erilaisten heterologisten polypepti- • * dien tuottamiseen transformoimalla isäntäsolut heterologi- ♦ · » 7 108917 silla DNA-sekvensseillä, jotka koodittavat haluttujen tuotteiden valmistusta.

Patentti EP-A-0 088 994 (Schering Corporation) ehdottaa sellaisten yhdistelmä-DNA-vektoreiden rakentamisen, 5 jotka sisältävät kaksijuosteisen DNA-sekvenssin, joka koo-dittaa ennaltamäärätylle ligandille spesifisen Ig:n kevyt-tai raskasketjun variaabelidomeenia. Kaksijuosteinen DNA-sekvenssi sisältää aloitus- ja lopetuskodonit sen 5'-ja 3'-päissä, vastaavassa järjestyksessä, mutta siitä 10 puuttuu kaikki sellaiset nukleotidit, jotka koodittavat variaabelidomeenille tarpeettomia aminohappoja. Kaksijuos-teista DNA-sekvenssiä käytetään bakteerisolujen transfor-moimiseen. Patenttihakemuksessa ei oteta lukuun variaabe-lidomeenin sekvenssissä olevia variaatioita.

15 Patentti EP-A-0 102 634 (Takeda Chemical Industries

Limited) kuvaa sellaisten geenien kloonauksen ja ekspression bakteeri-isäntäorganismeissa, jotka geenit koodittavat ihmisen IgE:n raskasketjun polypeptidiä kokonaisuudessaan tai osittain, mutta se ei ota lukuun polypeptidin 20 sekvenssissä olevia variaatioita.

Patentti EP-A-0 125 023 (Genentech Inc.) ehdottaa j yhdistelmä-DNA-menetelmien käytön bakteereissa niin, että tuotetaan Ig:ja, jotka ovat analogisia selkärankaisista normaalisti löydettävien kanssa, ja käyttää hyväkseen sii- • · 25 nä ehdotettuja geenimodifikaatiomenetelmiä kimeeristen vasta-aineiden tai muiden vasta-aineen modifioitujen muo-tojen rakentamiseksi.

...t Uskotaan, että yllä olevassa Genentech'in patent- } ’ tihakemuksessa kuvatut ehdotukset eivät johtaneet Ig:n 30 polypeptidiketjujen merkittävien määrien ekspressoitumi- seen, Ig-aktiivisuuden muodostumiseen eikä haluttujen ki- ! ··.’ meeristen vasta-aineiden eritykseen eikä ketjujen kokoa- - · » miseen halutuiksi kimeerisiksi vasta-aineiksi.

Viimeaikaisten menetelmien ilmestyminen, jotka me-. 35 netelmät sallivat Ig-geenin DNA:n stabiilin kuljetuksen I I · 8 108917 nisäkässolujen sisälle (3) - (5), on avannut mahdollisuuden käyttää in vitro mutageneesiä ja DNA-transfektiota uusia ominaisuuksia sisältävien rekombinanttivasta-ainei-den rakentamiseksi.

5 Tiedetään kuitenkin, että vasta-ainemolekyylin toi minta riippuu sen kolmiulotteisesta rakenteesta, joka vuorostaan riippuu sen primaarisesta aminohapposekvenssistä. Näin ollen vasta-aineen aminohapposekvenssin muuttaminen voi vaikuttaa haitallisesti sen aktiivisuuteen. Lisäksi 10 muutos DNA-sekvenssissä, joka koodittaa vasta-ainetta, voi vaikuttaa DNA-sekvenssin sisältävän solun kykyyn ekspres-soida, erittää ja koota vasta-ainetta.

Sen vuoksi ei ole ollenkaan selvää, että on mahdollista tuottaa toimivia muutettuja vasta-aineita yhdistel-15 mä-DNA-menetelmillä. Esillä olevien keksijöiden kollegat ovat kuitenkin suunnitelleet menetelmän, jossa hybridivas-ta-aineita, joissa proteiinin molemmat osat ovat toimivia, voidaan erittää. Tämä menetelmä on kuvattu Kansainvälisessä patenttihakemuksessa numero PCT/GB85/00392. Yllä oleva 20 PCT-patenttihakemus esittää kuitenkin ainoastaan sellais-! ten hybridivasta-aineiden tuoton, joissa DNA-sekvenssin ensimmäinen osa koodittaa täydellisiä variaabelidomeeneja.

·'·] Se ei esitä hybridivasta-aineita, joissa variaabelidomee- nin sekvenssi on muutettu.

25 Patentti EP-A-0 239 400 kuvaa menetelmän, jossa :·.·. hiiren monoklonaalisen vasta-aineen CDR:t on siirrostettu ihmisen Ig:n variaabelidomeenien runkoalueisiin kohdenne-tulla mutageneesillä käyttäen pitkiä oligonukleotideja. Keksijät viittaavat mahdollisuuteen muuttaa myöskin runko-30 alueiden luonnollista aminohapposekvenssiä.

» » · ’· ’· Ensimmäinen työ, jossa muutettiin monoklonaalisia ···' vasta-aineita siirrostamalla CDR:t, suoritettiin monoklo- naalisilla vasta-aineilla, jotka tunnistivat synteettiset antigeenit, kuten NP- tai NIP-antigeenit. On kuitenkin ,· , 35 kuvattu esimerkit, joissa lysotsyymiä tunnistava hiiren I I · 9 108917 monoklonaalinen vasta-aine ja ihmisen T-soluissa olevaa antigeeniä tunnistava rotan monoklonaalinen vasta-aine on ihmismäistetty CDR-siirrostuksella (6) ja (7), vastaavassa j ärj estyksessä.

5 Viite (7) osoittaa, että CDR:ien siirrostus yksi nään (kuten siinä julkaisussa on määritetty) ei riittänyt muodostamaan tyydyttävää antigeenin sitomisaktiivisuutta CDR-siirrostetussa tuotteessa. Viite (7) osoittaa, että oli tarpeen muuttaa ihmisen sekvenssin kohdassa 27 oleva 10 seriinitähde vastaavaksi rotan fenyylialaniinitähteeksi, jotta saatiin sellainen CDR-siirrostustuote, jolla oli tyydyttävä antigeenin sitomisaktiivisuus. Tämä raskasket-jun kohdassa 27 oleva tähde sijaitsee CDRl:n vieressä olevassa rakennesilmukassa. Lisärakenteella, joka sisälsi 15 lisäksi ihmisen seriinitähteen muutoksen rotan tyrosiini-tähteeksi raskasketjun kohdassa 30, ei ollut merkittävästi muuttunutta sitomisaktiivisuutta verrattuna CDR-siirros-tettuun vasta-aineeseen, jossa oli ainoastaan seriinin muutos fenyylialaniiniksi kohdassa 27. Nämä tulokset 20 osoittavat, että CDR-siirrostetuilla vasta-aineilla, jotka tunnistavat monimutkaisempia antigeenejä, muutokset CDR-alueiden ulkopuolella oleviin ihmisen sekvenssitähtei-siin, erikoisesti CDRl:n vieressä olevaan silmukkaan, voi-vat olla tarpeellisia tehokkaan antigeenin sitomisaktiivi-25 suuden saamiseksi.

Viime aikoina on esitetty myös menetelmät, joilla » » ... · muutetaan monoklonaalinen anti-TAC-vasta-aine CDR-siirros- f · t tuksella. Valittiin ihmisen runkoalueet, jotta maksimoi- » » · tiin homologia anti-TAC-vasta-aineen sekvenssin kanssa , . 30 samalla, kun jätettiin jäljelle useita CDR:ien ulkopuolel- I i · ; ’· ’· la sijaitsevia lisäaminohappoja. Näin muutetulla anti-TAC- <·* vasta-aineella on affiniteetti ihmisen interleukiini-2- proteiinin p55 ketjulle, joka aktiivisuus on noin yksiköi- * » masosa jyrsijän anti-TAC-vasta-aineen vastaavasta (8).

» * » I » i * * 10 108917

Patentti PCT/US89/05857 kuvaa myös CDR-siirrostetut vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä IL-2-reseptorin p55 TAC-proteiinille. Siinä on esitetty, että CDR-siirroste-tussa vasta-aineessa voi olla tarpeen se, että CDRrien 5 lisäksi luovuttaja-Ig:n 3 aminohappotähdettä tai enemmän, tavallisesti ainakin yksi, joka on juuri luovuttaja-Ig:n CDR:n vieressä, täytyy muuttaa sellaiseksi, että se vastaa luovuttajavasta-aineen vastaavaa, jotta saadaan aikaan antigeenin sitomisaktiivisuus.

10 Näin ollen on helposti selvää, että ei ole yksin kertainen asia tuottaa CDR-siirrostettua vasta-ainetta. Usein ei ole riittävää ainoastaan siirrostaa luovuttaja-Ig:n CDRriä vastaanottaja-Ig:n runkoalueille. Voi olla tarpeellista myös muuttaa vastaanottajavasta-aineen runko-15 alueiden tähteitä sitomisaktiivisuuden saavuttamiseksi. Ei ole kuitenkaan mahdollista ennustaa alan aiempiin tietoihin perustuen, mitä, jos mitään, runkoalueen tähteitä pitää muuttaa.

Patentti EP-A-0 018 794 kuvaa jyrsijän monoklonaa-20 lisen vasta-aineen, joka tunnistaa ihmisen auttaja-T-so-I luille ominaisen antigeenin. Erityinen esimerkki sellai sesta monoklonaalisesta vasta-aineesta on kuvattu patent-tihakemuksessa ja sille on annettu nimi 0KT4. Antigeeniä, ; ' : jonka se tunnistaa, kutsutaan yleensä nimellä CD4-antigee- 25 ni. Monoklonaalinen vasta-aine on kaupallisesti saatavissa Ortho Diagnostic Systems Inc.'1 ta, Raritan, New Yersey, USA. Samalta valmistajalta on myös saatavissa jyrsijän monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnetaan nimellä 0KT4A. Se tunnistaa CD4-antigeenista eri epitoopin kuin minkä . . 30 OKT4 tunnistaa.

Kudoksensiirtokokeet kädellisillä ovat osoittaneet, että sekä 0KT4 että 0KT4A voivat pidentää siirrännäisen : elinkykyä ja ne voivat olla käyttökelpoisia käytettäviksi immmunomodulaattoreina ihmisillä. Kokemukset munuaissiir-.’ . 35 rospotilaiden hoitamisessa jyrsijän monoklonaalisella I > > I; | n 108917 OKT3-vasta-aineella ovat osoittaneet, että joskus ryhmä potilaita kehittää neutraloivia vasta-aineita OKT3-vasta-ainetta vastaan. Tämä immuuniresponssi estää toistuvan an-5 tamisen. Ennustetun immuuniresponssin pienentämiseksi jyrsijän monoklonaalisia anti-CD4-vasta-aineita vastaan olisi toivottavaa tuottaa OKT4A vasta-aineesta CDR-siirrostettu versio, jossa on jyrsijän CDR:t ja ihmisen runkoalue ja muut Ig:sta peräisin olevat alueet.

10 Kuitenkin, kuten yllä on kuvattu, yksinkertainen lähestymistapa rakennettaessa CDR-siirrostettua vasta-ainetta ei aina johda vasta-aineeseen, joka tehokkaasti sitoo antigeeniä. Tarkat tähteet, jotka sisältyvät CDR:iin, on vaikea määrittää eivätkä ne välttämättä vastaa kaikkia hy-15 pervariaabelialueilla olevia tähteitä. Voi myös olla olemassa kriittisiä runkoalueen tähteitä, jotka ovat tärkeitä sijoitettaessa CDR:t paikoilleen antigeenin kanssa reagoimista varten tai jotka ottavat osaa.raskas- ja kevytketju-jen välisiin interaktioihin. Voi olla tarpeellista muuttaa 20 tietyt runkoalueen tähteet niin, että ne vastaavat jyrsijän tähteitä näissä kohdissa, joka tekee CDR-siirrostetun vasta-aineen vähemmän "ihmismäiseksi" luonteeltaan.

._ . Huolimatta ongelmista, jotka kuuluvat yritykseen ,! tuottaa spesifinen CDR-siirrostettu vasta-aine, suositel- •#>|* 25 tavassa suoritustavassa esillä olevat keksijät ovat onnis- • · "·* tuneet tuottamaan CDR-siirrostetun vasta-aineen, joka pe- : rustuu ihmisen runkoalueisiin ja jolla on antigeeniä sitova alue, joka tunnistaa CD4-antigeenin. Tietyssä erikoisen .' suositeltavassa suoritustavassa CDR-siirrostetulla vasta- 30 aineella on CD4-antigeenia kohtaan affiniteetti, joka on samanlainen kuin jyrsijän monoklonaalisen vasta-aineen OKT4A vastaava.

- _· Sen vuoksi esillä oleva keksintö koskee menetelmää

* · I

’V terapeuttisesti käyttökelpoisten vasta-ainemolekyylien val- 35 mistamiseksi, jolloin vasta-ainemolekyylit ovat kuten pa- tenttivaatimuksissa 1 - 8 on määritelty.

12 108917

Vaatimusten määrittelemässä keksinnössä lähtökohtana on CDR-siirrostettu vasta-aine, jolla on ainakin yksi ketju, jossa runkoalueet ovat pääasiassa peräisin ensimmäisestä vasta-aineesta (vastaanottaja) ja ainakin yksi CDR:stä on 5 peräisin toisesta vasta-aineesta (luovuttaja) CDR-siirros-tetun vasta-aineen kyetessä sitoutumaan CD4-antigeeniin.

Suositeltavasti CDR-siirrostetun ketjun kaksi, ja suositeltavimmin kaikki kolme, CDR:ää on peräisin luovut-taj avasta-aineesta.

10 CDR-siirrostetussa ketjussa CDR tai kukin niistä koostuu edullisesti CDR-yhdistelmästä, joka sisältää kaikki tähteet CDR:stä ja kaikki tähteet luovuttajavasta-aineen vastaavasta hypervariaabelialueesta.

Suositeltavasti ainakin yksi tähde CDR-siirrostetun 15 ketjun runkoalueilla on muutettu niin, että se vastaa vasta-aineen vastaavaa tähdettä.

Suositeltavasti CDR-siirrostetun ketjun runkoalueet ovat peräisin ihmisen vasta-aineesta~ CDR-siirrostetun ketjun runkoalueet ovat edullisesti 20 peräisin ihmisen Ig:n raskasketjusta. Sellaisia raskasketju-ja varten on suositeltavaa, että tähde 35 raskasketjun runko-alueilla on muutettu niin, että se vastaa luovuttai-·, : avasta-aineen vastaavaa tähdettä.

Sellaisia raskasketjuja varten ainakin yksi CDR-yh-25 dis-telmä, joka sisältää tähteet 26 - 35, 50 - 65 tai 95 -102, vastaavassa järjestyksessä, on edullisesti siirrostettu » · · • ·' ihmisen runkoalueeseen. Tässä tapauksessa on ymmärrettävä, > ·"· että tähde 35 jo vastaa luovuttajavasta-aineen vastaavaa V · tähdettä.

30 Sellaisten raskasketjujen tähteet 23, 24 ja 49 vas- taavat suositeltavasti vasta-aineen vastaavia tähteitä. On vielä suositeltavampaa, että tähteet 6, 23, 24, 48 ja 49 - ,· sellaisissa raskasketjuissa vastaavat luovuttajavasta-ai- y netta vastaavien tähteiden sijaintien suhteen. Jos halutaan, 35 tähteet 71, 73 ja 79 voivat olla myös tällä tavalla vas- taavia.

13 1 089 1 7

Affiniteetin edelleen optimoimiseksi mikä tahansa tähteistä 57 58, 60, 88 ja 91 tai mikä tahansa näiden tähteiden yhdistelmä voi vastata luovuttajavasta-aineen vastaavaa tähdettä.

5 Raskasketju on suositeltavasta peräisin ihmisen KOL-vasta-aineen raskasketjusta. Se voi kuitenkin olla myös peräisin ihmisen NEWM- tai EU-vasta-aineen raskasketjusta.

CDR-siirrostetun ketjun runkoalueet voivat olla vaihtoehtoisesti peräisin ihmisen kappa- tai lambda-kevyt- 10 ketjusta. Sellaista kevytketjua varten ainakin yksi CDR-yhdistelmä, joka sisältää tähteet 24 - 34, 50 - 56 tai 89 - 97, vastaavassa järjestyksessä, on edullisesti siir-rostettu ihmisen runkoalueeseen. Tähde 49 vastaa myös suositeli avasti luovuttajavasta-aineen vastaavaa tähdettä.

15 Affiniteetin edelleen optimoimiseksi on suositel tavaa varmistaa, että tähteet 49 ja 89 vastaavat luovuttajavasta-aineen vastaavia tähteitä. Voi myös olla toivottavaa valita sellaiset vastaavat luovuttajatähteet, jotka muodostavat suolasiltoja.

20 Kevytketju on suositeltavasti peräisin ihmisen REI-vasta-aineen kevytketjusta. Se voi kuitenkin olla myös peräisin ihmisen EU-vasta-aineen kevytketjusta.

j . CDR-siirrostettu vasta-aine sisältää suositeltavas- • · « · ,! ti kevytketjun ja raskasketjun, joista toinen, tai suosi- • » · 25 teltavasti molemmat, on GDR-siirrostettu niiden periaattei- « i ’♦* ’ den mukaisesti, jotka yllä on kuvattu yksittäisille kevyt- : ja raskasketjuille.

Suositeltavassa tapauksessa on edullista, että !_.* : kaikki kolme CDR:ää raskasketjussa on muutettu ja että ke- 30 vytketjuun on tehty minimimäärä muutoksia. Voi olla mah- ;\j dollista, että ei voida muuttaa yhtään, voidaan muuttaa yk- .···, si tai kaksi kevytketjun CDR:stä, ja silti säilyttää sito- - / misaktiivisuus järkevällä tasolla.

'· ’! On ymmärrettävä, että joissain tapauksissa sekä | 35 raskas- että kevytketjuilla luovuttaja- ja vastaanottaja- I ;: tähteet voivat olla samanlaisia tietyssä kohdassa ja näin I » »

I I « M

14 108917 ollen mitään muutoksia vastaanottajan runkotähteeseen ei tarvita.

On myös ymmärrettävä, että CDR-siirrostetun vasta-aineen ihmisluonteen säilyttämiseksi niin pitkälle kuin mah-5 dollista, pitäisi tehdä niin pieni määrä muutoksia tähteisiin kuin mahdollista. On ajateltu, että monissa tapauksissa ei ole tarpeellista muuttaa enemmän kuin CDR:t ja pieni määrä runkoalueen tähteitä. Ainoastaan poikkeuksellisissa tapauksissa on tarpeen muuttaa suurempi määrä 10 runkoalueen tähteitä.

CDR-siirrostettu vasta-aine on suositeltavasti täydellinen Ig, esimerkiksi isotyyppiä IgGi tai IgG4.

Jos halutaan, yksi tai useampi Ig:n vakiodomeenien tähde voidaan muuttaa vakiodomeenien tehostetoimintojen 15 muuttamiseksi.

CDR-siirrostetun vasta-aineen affiniteetti CD4-an-tigeenia kohtaan on suositeltavasti välillä noin 105 - noin 1012 M”1, suositeltavammin ainakin 108- M-1 ja suositeitavimmin affiniteetti on samanlainen kuin monoklonaalisten vasta— 20 ai-neiden OKT4- tai OKT4A~affiniteetti.

CDR tai kukin niistä on edullisesti peräisin nisäkkään vasta-aineesta ja suositeltavasti peräisin jyrsijän mo-·, : noklonaalisesta vasta-aineesta.

• · i « ‘ Esillä olevan keksinnön mukaisesti CDR-siirrostettu • · * 25 vasta-aine tuotetaan käyttäen yhdistelmä-DNA-menetelmiä, • * [;*t* jolloin keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista * · · : ·' se, mitä vaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa on esitetty, ja * : keksinnön mukaisen menetelmän edullisille suoritusmuodoille V · on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 9 - 15 on 30 esitetty.

Yleisesti kuvattuna menetelmä sisältää vaiheet, • · joissa sijoitetaan ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa

4 · I

| - , ensimmäistä vasta-aineketjua, jossa runkoalueet ovat pää- I 4 · j asiassa peräisin ensimmäisestä vasta-aineesta (vastaanot- • » 35 taja) ja ainakin yksi CDR on peräisin toisesta vasta-ai-neesta (luovuttaja), sopivien ylävirran ja alavirran ele- I t Mill 15 108917 menttien säätelyn alaisuuteen; transformoidaan isäntäsolu ensimmäisellä DNA-sek-venssillä; ja viljellään transformoitua isäntäsolua niin, että 5 tuotetaan CDR-siirrostettua vasta-ainetta.

Menetelmä sisältää lisäksi suositeltavasti vaiheet, joissa sijoitetaan toinen DNA-sekvenssi, joka koo-dittaa toista vasta-aineketjua, joka on komplementaarinen ensimmäiselle ketjulle, sopivien alavirran ja ylävirran 10 elementtien säätelyn alaisuuteen; ja transformoidaan isäntäsolu sekä ensimmäisellä että toisella DNA-sekvenssillä.

Toinen DNA-sekvenssi koodittaa edullisesti toista vasta-aineketjua, jossa runkoalueet ovat pääasiassa pe-15 räisin ensimmäisestä vasta-aineesta (vastaanottaja) ja ainakin yksi CDR on peräisin toisesta vasta-aineesta (luovuttaja).

Ensimmäinen ja toinen DNA-sekvenssi voivat olla läsnä samassa vektorissa. Tässä tapauksessa sekvenssit 20 voivat olla samojen tai eri ylävirran ja/tai alavirran elementtien säätelyn alaisuudessa.

Ensimmäinen ja toinen DNA-sekvenssi voivat vaihto- ·.; ehtoisesti olla läsnä eri vektoreissa.

/ Esillä oleva keksintö koskee myös nukleotidisek-

• I

25 venssiä, joka koodittaa edellä määriteltyä vasta-aine- • « *;"/ molekyyliä.

• · • ·* On ajateltu, että esillä olevan keksinnön mukai- " : sesti valmistetut CDR-siirrpstetut vasta-aineet voivat : olla erikoisen käyttökelpoisia terapiassa, erikoisesti 30 hoidettaessa kudossiirrännäisten hyljintää tai hoidet- taessa auttaja-T-solujen häiriötiloja.

i

• I I

• · i I I * · ! » * » * I » » 108917 Ιο

Esillä olevan keksinnön mukaisesti CDR-siirros-tettuja vasta-aineita voidaan tuottaa eri menetelmillä ekspression transfektoiduissa soluissa, kuten hiiva-, hyönteis-, CHO- tai myeloomasoluissa, ollessa suositelta-5 va. Suositeltavammin isäntäsolu on CHO-isäntäsolu.

CDR-siirrostetun vasta-aineen suunnittelemiseksi on ensiksi tarpeen ottaa selville halutut sitomisominai-suudet omaavan vasta-aineen variaabelidomeenin sekvenssi. Sopivat lähdesolut sellaisille DNA-sekvensseille sisältä-10 vät lintu-, nisäkäs- tai muut selkärankaislähteet, kuten kanat, hiiret, rotat ja kanit, ja suositeltavasti hiiret. Variaabelidomeenin sekvenssit (VH ja VL) voidaan määrittää raskas- ja kevytketjun cDNA:sta, syntetisoida vastaavasta mRNA:sta menetelmillä, jotka ovat alalla yleisesti tunnet-15 tuja. Hypervariaabelit alueet voidaan sitten määrittää käyttäen Kabafin menetelmää (2). CDR:t voidaan määrittää rakenneanalyysillä käyttäen röntgenkristallografia- tai molekyylimallitusmenetelmiä. Sitten voidaan määritellä yh-distelmä-CDR, joka sisältää kaikki yhdessä CDR:ssä olevat 20 tähteet ja kaikki tähteet vastaavassa hypervariaavelissa alueessa. Nämä yhdistelmä-CDR:t yhdessä tiettyjen valittu-! jen runkoalueen tähteiden kanssa siirretään suosi- \ : teltavasti "antigeeniä sitoviksi kohdiksi" samalla, kun • « | | ,! .* loppuosa vasta-aineesta, kuten raskas- ja kevytketjun va- 25 kiodomeenit ja loppuosa runkoalueista, voivat perustua ih- ♦ · " misen eri luokan vasta-aineisiin. Vakiodomeenit voidaan * · · : ·’ valita niin, että niillä on halutut tehostetoiminnot, jot- ka sopivat näin rakennetulle vasta-aineelle tarkoitettuun j : käyttöön. Ihmisen IgG-isotyypit IgGi ja IgG3 ovat esimer- j 30 kiksi tehokkaita komplementin sitomiseen ja soluvälittei- ! seen hajotukseen. Muita tarkoituksia varten voivat muut isotyypit, kuten IgG2 ja IgG4 tai muut luokat, kuten IgM - . ja IgE, olla sopivampia.

' Ihmisterapiaa varten on erikoisen toivottavaa käyt- j '···* 35 tää ihmisen isotyyppejä antiglobuliiniresponssin minimoi- 17 10891 7 miseksi terapian aikana. Ihmisen vakiodomeenin DNA-sek-venssit, suositeltavasti yhdessä niiden variaabelidomeenin perusrunkoalueiden kanssa, voidaan valmistaa hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti. Esimerkki tästä on CAMPATH 5 1H, joka on saatavissa Burroughs Wellcome Ltd.'stä.

Esillä olevan keksinnön suositeltavien suoritustapojen mukaisesti esitetään tietyt CDR-siirrostetut vasta-aineet, jotka sisältävät valitut muutokset ihmismäisessä runkoalueessa (toisin sanoen, variaabelidomeenien CDRrien 10 ulkopuolella), joka johtaa tyydyttävän sitomisaffiniteetin sisältävään CDR-siirrostettuun vasta-aineeseen. Sellainen sitomis-affiniteetti on suositeltavasti noin 105 - noin 1012 M-1 ja on suositeltavammin ainakin noin 108 M-1. Suositeltavammin sitomisaffiniteetti on suurinpiirtein samanlainen 15 kuin jyrsijän monoklonaalisen vasta-aineen OKT4A-af- finiteetti.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti CDR-siirrostet- tujen vasta-aineiden rakennuksessa VH- ja/tai VL-geeniseg- menttejä voidaan muuttaa mutageneesillä. Alan asiantuntija 20 ymmärtää myös, että useita eri nukleotideja, jotka koodit- tavat vasta-aineen Fc-osassa tai muilla alueilla olevia aminohappotähteitä tai sekvenssejä, voidaan muuttaa samalla ' *, ; tavalla (katso esimerkiksi PCT/US89/00297).

« · * ·

Esimerkkimenetelmät sisältävät eri nukleotidien 4 · · * 25 raioitetun määrän lisäyksen, deleetion tai ei-konservatii- • i '·’ * visen substituution tai useiden nukleotidien konservatii- « t * t · · ·' .* visen substituution edellyttäen, että sopiva lukuraami säi- ! · lytetään.

tai V '· Lopullisen rakenteen saavuttamiseksi voidaan käyt- 30 tää substituutioita, deleetioita, insertioita tai mitä tahansa näiden yhdistelmää. Koska on olemassa 64 mahdol- t » lista kodonisekvenssiä, mutta ainoastaan 20 tunnettua * a · » , aminohappoa, geneettinen koodi on degeneroitunut siinä mie- i * » *·’’ lessä, että eri kodonit voivat koodittaa samaa aminohappoa.

* * '···* 35 Koodi on tarkka kuitenkin kullekin aminohapolle. Näin > » ta* 4 · 4

( I I I « I

18 108917 ollen on olemassa ainakin yksi kodoni kullekin aminohapolle, se on, kukin kodoni koodittaa yhtä aminohappoa eikä mitään muita. On ilmeistä, että translaation aikana täytyy pitää yllä sopiva lukuraami sopivan aminohapposekvenssin 5 aikaan saamiseksi lopullisesti tuotettuun polypeptidiin.

Menetelmät lisäyksille, deleetioille tai substituutioille ennalta määrätyissä aminohappokohdissa, joissa on tunnettu sekvenssi, ovat hyvin tunnettuja. Esimerkkimene-telmät sisältävät oligonukleotidivälitteisen kohdennetun 10 mutageneesin ja polymeraasiketjureaktion.

Oligonukleotidivälitteinen kohdennettu mutageneesi pitää pohjimmiltaan sisällään haluttua mutaatiota koodattavan oligonukleotidin hybridisoimisen yksijuosteiseen DNA:hän, joka sisältää mitätöitävän alueen, ja juosteen 15 käyttämisen templaattina oligonukleotidin pidennyksessä mutaation sisältävän juosteen tuottamiseksi. Tämä menetelmä sen eri muodoissa on kuvattu viitteissä (9) - (12).

Polymeraasiketjureaktio (PCR) pitää pohjimmiltaan sisällään DNA:n eksponentiaalisen monistamisen in vitro 20 käyttäen sekvenssispesifisiä oligonukleotideja. Oligonuk- leotideihin voidaan sisällyttää sekvenssin muutoksia, jos , . halutaan. Polymeraasiketjureaktiomenetelmä on kuvattu • · · · .) .1 viitteessä (13). Esimerkit PCR:ää käyttävistä mutagenee- • · · simenetelmistä on kuvattu viitteissä (14) - (17).

V ’ 25 Esillä olevan keksinnön mukaiset nukleotidisekvens- • · · : sit, jotka kykenevät lopulta ekspressoimaan haluttuja '·"· CDR-siirrostettuja vasta-aineita, voidaan muodostaa monisti ί ta eri polynukleotideista (genominen DNA, cDNA, RNA tai synteettiset oligonukleotidit). Tällä hetkellä suositel-30 laan, että polynukleotidisekvenssi sisältää cDNA:n ja ge- • 1 i nomisen DNA:n fuusion. Polynukleotidisekvenssi voi koodit- i ··1 taa eri Ig-komponentteja (esim. V-, J-, D- ja C-domeene- « · · ’· ’· ja). Ne voidaan rakentaa useilla eri menetelmillä. Sopi- vien genomisten ja cDNA-sekvenssien yhdistäminen on tällä

• · I

• · · » ia 1 0891 7 hetkellä yleisin tuottomenetelmä, mutta cDNA-sekvenssejä voidaan myös käyttää (katso EP-A-0 239 400 ja (7)).

Tiettyjä sopivia ekspressiovektoreita ja isäntäso-luja on kuvattu patentissa US-A-4 816 567.

5 Tässä kuvatut vektorit ja menetelmät ovat sopivia käytettäviksi isäntäsoluilla, joihin kuuluu laaja ryhmä prokaryoottisia ja eukaryoottisia organismeja.

Yleisesti tietysti prokaryootit ovat suositeltavia DNA-sekvenssien kloonaamiseksi keksinnössä käyttökelpois-10 ten vektorien rakentamiseksi. Esimerkiksi E. coli-kanta DN5alfa on erikoisen käyttökelpoinen. Tämän esimerkin on tietysti tarkoitettu olevan kuvaava mieluummin kuin rajoittava.

Prokaryootteja voidaan käyttää myös ekspressioon.

15 Aiemmin mainittuja E. coli-kantoj a, basilleja, kuten Bacillus subtilus-kantaa ja muita Enterobacteriaceae-hei-mon lajeja, kuten Salmonella typhimurium-kantaa tai Serra-tia marcesans-kantaa ja eri Pseudomonas-lajeja, voidaan käyttää.

20 Yleisesti näiden isäntien yhteydessä käytetään plasmidivektoreita, jotka sisältävät replikonin ja kont- . rollisekvenssit, jotka ovat peräisin isäntäsolun kanssa .) yhteensopivista lajeista. Tavallisesti vektori sisältää • · · 1 replikaatiokohdan kuin myös merkkisekvenssit, jotka sai-• · ’·' ‘ 25 livat transformoitujen solujen fenotyyppisen selektion.

: E. coli-bakteeri esimerkiksi transformoidaan tyypillisesti '·"· käyttäen yhtä plasmidin pBR322 monista johdannaisista, ·.·' · joka plasmidi on peräisin E. coli-lajista (18). Plasmidi pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasykliinire-30 sistenssille ja näin muodostaa helpot keinot transformoi- * · tuneiden solujen tunnistamiseksi. Plasmidi pBR322, sen ,· , johdannaiset tai muut mikrobien plasmidit voivat myös si- sältää tai voidaan modifioida sisältämään promoottorit, joita mikrobiorganismi voi käyttää rekombinanttiproteii-35 nien ekspressoimiseen. Promoottorit, joita yleisesti käy- 20 1 0891 7 tetään yhdistelmä-DNA-rakenteissa, sisältävät laktoosipro-moottorisysteemit (19) - (21) ja tryptofaanipromoottori-systeemit (trp) (22) ja EP-A-0 036 776. Samalla, kun nämä ovat tavallisimmin käytettyjä, muitakin mikrobipromootto-5 reita on löydetty ja käytetty ja niiden nukleotidisekvens-sien yksityiskohdat on julkaistu, joka tekee alan asiantuntijalle mahdolliseksi ligoida ne toimivasti plasmidi-vektoreihin (23).

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös euka-10 ryoottimikrobeita, kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae, tai yleinen leipomohiiva, on yleisimmin käytetty eukaryoottisista mikro-organismeista, vaikkakin useita muita kantoja on yleisesti saatavissa. Saccharomyces -kannassa ekspressoimiseksi käytetään yleisesti esi-15 merkiksi plasmidia YRp7 (24) - (26). Tämä plasmidi sisältää jo trpl-geenin, joka muodostaa selektiomerkkigeenin sellaiselle mutanttihiivakannalle, esimerkiksi kannalle ATCC-numero 44076 tai PEP4-1 (27), jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänillä. Tällöin trpl-geenin vaurion läsnä-20 olo hiivaisäntäsolun genomin ominaisuutena muodostaa tehokkaan ympäristön transformaation tunnistamiseksi kasvat-. . tamalla tryptofäänin poissa ollessa.

· Sopivat hi iva vektorien promoottorisekvenssit sisäl- : ·* tävät 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottorin (28) tai * 25 muiden glykolyyttisten entsyymien, kuten enolaasin, gly- : ’.· seraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin, heksokinaasin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaasin, glukoosi- : i : 6-fosfaatti-isomeraasin, 3-fosfoglyseraattimutaasin, pyru- vaattikinaasin, trioosifosfaatti-isomeraasin, fosfoglukoo- j'. j 30 si-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorit (29) ja (30).

• *

Sopivien ekspressioplasmidien rakentamisessa näihin geeneihin liittyvät terminaatiosekvenssit ligoidaan myös *· ’·' ekspressiovektoriin ekspressoitavaksi halutun sekvenssin ’...· 3 '-puolelle niin, että saadaan aikaan mRNA:n polyadenylaa- ;’* · 35 tio ja terminaatio. Muut promoottorit, joilla on se lisä- ! 21 1 0891 7 etu, että niiden transkriptiota säätelee kasvatusolosuhteet, ovat alkoholidehydrogenaasi-2:n, isosytokromi C:n, happaman fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien hajottavien entsyymien ja aiemmin mainitun glyseraldehydi-3-5 fosfaattidehydrogenaasin, joka on entsyymi, joka on vastuussa maltoosin ja galaktoosin käytöstä (30), promoottorialueet. Mikä tahansa vektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, replikaation aloituskohdan ja terminaatiosekvenssit, on sopiva.

10 Mikro-organismien lisäksi voidaan isäntinä käyttää myös monisoluisista organismeista peräisin olevia soluviljelmiä. Periaattessa mikä tahansa sellainen soluviljelmä on käyttökelpoinen riippumatta siitä, onko se selkärankaisesta vai selkärangattomasta organismista. Tähän mennessä 15 mielenkiinto on kuitenkin ollut suurinta selkärankaisten soluja kohtaan ja selkärankaisten solujen kasvattamisesta viljelmässä (soluviljely) on tullut rutiinitoimenpide viime vuosina (31). Esimerkit sellaisista käyttökelpoisista isäntäsolulinjoista ovat VERO-, HeLa-, kiinanhamsterin 20 munasolu- (CHO), W138-, BHK-, C0S-7-, MDCK- ja myelooma-solulinjat. Ekspressiovaktorit sellaisia soluja varten ·, ; voivat sisältää (jos tarpeellista) sopivan replikaation .! .’ aloituskohdan kuin myös promoottorin, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin edessä yhdessä tarpeellisten ribo-25 somin sitoutumiskohtien, RNA silmukointikohtien, polyade- « · · : ·' nylaatiokohtien ja transkription terminaattorisekvenssien * ‘ kanssa.

’ Nisäkässoluissa käytettävien ekspressiovektorien säätelytoiminnat ovat usein peräisin virusmateriaalista.

30 Yleisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin ihmisen sytomegaloviruksesta (HCMV), polyoomaviruksesta, .* . adenovirus 2:sta ja useimmiten Simian virus 40:stä (SV40).

SV40 viruksen varhaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erikoisen käyttökelpoisia, koska ne molemmat saadaan 35 helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös

» » * t I

* » 108917 22 SV40-viruksen replikaation aloituskohdan (32). Lisäksi on myös mahdollista ja usein toivottavaa käyttää promoottoria tai säätelysekvenssejä, jotka ovat normaalisti liittyneet haluttuun geenisekvenssiin edellyttäen, että sellaiset 5 säätelysekvenssit ovat yhteensopivia isäntäsolusysteemin kanssa.

Replikaation aloituskohta voidaan saada rakentamalla vektori niin, että se sisältää ulkoa tuodun aloitus-kohdan, joka voi olla peräisin SV40-viruksesta tai muusta 10 viruslähteestä (esim. polyomaviruksesta, adenoviruksesta, VSV:stä tao BPVista), tai se voidaan saada isäntäsolun kromosomin replikaatiomekanismista. Jos vektori integroidaan isäntäsolun kromosomiin, jälkimmäinen on yleensä riittävä.

15 Vektorit, jotka sisältävät tutkittavat DNA-segmen- tit (esim. raskas- ja kevytketjua koodittavat sekvenssit ja ekspression säätelysekvenssit), voidaan siirtää isäntä-soluun hyvin tunnetuilla menetelmillä, jotka vaihtelevat riippuen isäntäsolun tyypistä. Kalsiumkloriditransfektio 20 on esimerkiksi yleisesti käytetty prokaryoottisille so luille, kun taas kalsiumfosfaattikäsittelyä, lipofektiota s tai elektroporaatiota voidaan käyttää muille isän- • täsoluille (33) .

:*·*: Ekspressoitumisensa jälkeen CDR-siirrostetut vas- j': 25 ta-aineet voidaan puhdistaa alan standardien menetelmien ;·.·. mukaisesti, jotka menetelmät sisältävät ammoniumsulfaatti- saostuksen, affiniteettipylväät, pylväskromatografian ja ... geelielektroforeesin (34) . Näin ekspressoitujen rakentei- ’ den sitomisaffiniteetit voidaan varmistaa alalla tunne- 30 tuilla menetelmillä, kuten on yksityiskohtaisemmin kuvattu ’· tämän patenttihakemuksen esimerkkiosassa.

...: Farmaseuttisia käyttöjä varten suositellaan oleel- « - lisesti puhtaita CDR-siirrostettuja vasta-aineita, jotka .·*·. ovat ainakin 90 - 95 % homogeenisiä ja suositeltavimpia 35 ovat sellaiset, jotka ovat 98 - 99 % homogeenisiä. Puhdis- tili* 23 1 0891 7 tuksen, joko osittaisen tai homogeeniseksi asti, kuten halutaan, jälkeen CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan sitten käyttää diagnostisesti tai terapeuttisesti (sisältäen kehon ulkopuolisen käytön) tai kehitettäessä ja suo-5 ritettaessa testimenetelmiä, immunofluoresenssivärjäyksiä ja sen kaltaisia (35).

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan tyypillisesti käyttää hoidettaessa T-soluvälitteisiä tautitiloja. Hoi-10 toon sopivat tyypilliset tautitilat sisältävät esimerkiksi käänteishyljintätaudin ja kudossiirrännäisen hyljinnän potilailla, joille on tehty elimen, kuten sydämen, keuhkon, munuaisen tai maksan, siirros. Muut taudit sisältävät autoimmuunitaudit, kuten tyypin I sokeritaudin, multippeli-15 skleroosin, nivelreuman, systeemisen punahukan ja lihasheikkouden .

T-solut ovat klonaalisia laajentumia yksittäisistä soluista, jotka ekspressoivat ainoastaan yhtä T-solun an- tigeenireseptoria, joka kykenee tunnistamaan erikoistu- 20 neissa antigeeniä edustavissa soluissa, kuten makrofaa- | geissa ja muissa kudoksissa, spesifiseen HLA-molekyyliin ! sitoutuneen peptidin. Näiden T-solujen aktivoitumisen voi » · ·;*·· estää vasta-aineet, jotka tunnistavat T-solureseptorikom- :*·*: pieksin tai peptidi-HLA-kompleksin. 0KT3 tunnistaa CD3-mo- 25 lekyylin, joka koostuu useista alayksiköistä, jotka ovat fyysisesti kompleksoituneina T-solureseptorin kanssa. Use-at muut molekyylit T-solussa, sisältäen CD4- ja CD8-mole-kyylit, ottavat myös osaa T-solun aktivoitumiseen sitoutumalla HLA-molekyyleihin kohdilla, jotka ovat erillisiä 30 T-solureseptorin sitoutumiskohdasta.

! '· CD4 löytyy T-solujen alaryhmästä, joissa on luokan ...* II HLA-molekyylit tunnistavat T-solureseptorit. Sen vuoksi | - ;\j yksi immunosuppression lähestymistapa sisältää monoklonaa- I .···. listen vasta-aineiden, kuten 0KT4 ja OKT4A, käytön, jotka 35 vasta-aineet ovat immunosuppressiivisia, koska ne inhiboi- »III* 24 108917 vat CD4-molekyylin interaktion luokan II HLA-molekyylin kanssa. CD4-molekyyliin sitoutuva vasta-aine. voi johtaa immunosuppressioon monella eri tavalla sisältäen normaalin aktivaatiosignaalin inhibition, sen tuoton vähentymistä 5 säätelevän signaalireitin päällemenon tai tämän reseptorin moduloimisen solun pinnalla. Se voi myös indusoida sellaisen T-solun alaryhmän, joka kykenee suppressoimaan muita alloreaktiivisia tai autoreaktiivisia alaryhmiä. Anti-CD4-vasta-aineet voivat myös toimia indusoimalla komplementis-10 ta tai vasta-aineesta riippuvaista T-solun hajoamista tai poistamalla T-solut verenkierrosta tai tulehduskohdalta. Sen vuoksi kunkin vasta-aineen Fc-reseptorin sitoutumis-ominaisuudet voivat olla tärkeitä niiden toiminnalle. Vaihtoehtoiset strategiat sisältävät sellaisten anti-CD4-15 vasta-aineiden käytön, jotka on radioaktiivisesti leimattuja tai kiinnitettyjä toksiineihin.

Näiden anti-CD4-vasta-aineiden nämä immunosuppres-siiviset ominaisuudet suovat terapeuttisen käytön sellaisten aktivoitujen T-lymfosyyttien suppressoimiseksi, jotka 20 välittävät tauteja, jotka liittyvät kudossiirroksiin ja autoimmuniteettiin. CD4-molekyyli on myös reseptori HIV-viruksen gpl20-alayksikölle. Koska OKT4A inhiboi ·: *: gpl20:n sitoutumista CD4:ään, tämä vasta-aine tai sen ; fragmentit voivat estää virusinfektion.

. : : 25 CD4-molekyyli ottaa normaalisti osaa kostimulato- risen signaalin muodostamiseen T-solulle, kun tämä solu on sitoutunut luokan II HLA-molekyyliin. Sen vuoksi on myös .·;·. mahdollista, että anti-CD4-vasta-aineet voivat sisältää kostimulatorisen toiminnan yhdessä muiden signaaleja indu- . . 30 soivien aineiden kanssa. Tämä terapeuttinen strategia voi • · · olla käyttökelpoinen hoidettaessa immuunialtisteisia poti- • · ···’ laita.

: ·.: Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan myös käyttää yh-. 35 dessä muiden vasta-aineiden kanssa, erikoisesti sellaisten • · · » · 25 108917 monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka reagoivat muiden markkereiden kanssa taudeista vastuussa olevissa ihmisen soluissa. Sopivat T-solumarkkerit voivat sisältää esimerkiksi ne, jotka on ryhmitelty niin sanottuun "Clus-5 ters of Differentiation" ryhmään, kuten tämän nimesi First International Leukocyte Differentiation Workshop (36).

Yleisesti esillä olevia CDR-siirrostettuja vasta-aineita käytetään puhdistetussa muodossa yhdessä farmakologisesti sopivien kantajien kanssa. Nämä kantajat sisäl-10 tävät tyypillisesti vesipohjaiset tai alkoholi/vesipohjäiset liuokset, emulsiot tai suspensiot, sisältäen suolaliuos- ja puskuroidut alustat. Parenteraaliset liuokset sisältävät natriumkloridiliuoksen, Ringer'in dekstroosin, dekstroosin ja natriumkloridin ja maitohapon suolaa sisäl-15 tävän Ringer'in. Sopivat fysiologisesti hyväksyttävät adjuvant it, jos niitä tarvitaan pitämään kompleksi suspensiossa, voidaan valita sellaisten sakeutusaineiden, kuten karboksimetyyliselluloosan, polyvinyylipyrrolidonin, gelatiinin ja alginaattien, joukosta.

20 Laskimon sisäiset liuokset sisältävät neste- ja ravintotäyteaineita ja elektrolyyttitäyteaineita, kuten I sellaisia, jotka perustuvat Ringer'in dekstroosiin. Säi- löntäaineita ja muita lisäaineita, kuten mikrobien vastai-: siä aineita, antioksidantteja, kelatoivia aineita ja 25 inerttejä kaasuja, voi myös olla läsnä (37) .

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan käyttää erikseen §...t annettavina koostumuksina tai yhdessä muiden aineiden • · · kanssa. Nämä voivat sisältää eri immunoterapeuttisia lääk-30 keitä, kuten syklosporiinin, metotreksaatin, adriamysiinin tai kisplatiinin, ja immunotoksiineja. Farmaseuttiset ...· koostumukset voivat sisältää eri sytotoksisten tai muiden - aineiden "sekoituksia" yhdessä CDR-siirrostettujen vas- .··. ta-aineiden tai jopa CDR-siirrostettujen vasta-aineiden t· t 35 yhdistelmien kanssa ja eri spesifisyyksiä omaavien 26 1 0891 7 CDR-siirrostettujen vasta-aineiden kanssa.

Farmaseuttisten koostumusten antoreitti voi olla mikä tahansa alan asiantuntijoiden yleisesti tuntema. Terapiaa, sisältäen ilman rajoituksia immunoterapian, varten 5 esillä olevan keksinnön mukaisia CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan antaa mille tahansa potilaalle standardien menetelmien avulla. Anto voi tapahtua millä tahansa sopivalla tavalla sisältäen parenteraalisen, laskimon sisäisen, lihaksen sisäisen, vatsaontelon sisäisen ja myös 10 sopivasti katetrilla tapahtuvan suoran infuusion. Annos-määrä ja antojen tiheys riippuu potilaan iästä, sukupuolesta ja kunnosta, muiden lääkkeiden samanaikaisesta annosta, vastaindikaatioista ja muista parametreistä, jotka lääkärin on otettava huomioon.

15 CDR-siirrostetut vastaaineet voidaan lyofilisoida säilytystä varten ja liuottaa uudelleen sopivaan kantajaan ennen käyttöä. Tämän menetelmän on osoitettu olevan tehokas tavanomaisilla immunoglobuliineilla ja alalla tunnettuja lyofilisaatio- ja uudelleenliuotusmenetelmiä voidaan 20 käyttää. Alan asiantuntijoiden on ymmärrettävä, että lyofilisaatio ja uudelleen liuotus voi johtaa eriasteisiin vasta-aineaktiivisuuden menetyksiin (esim. tavanomaisilla immunoglobuliineilla IgM-vasta-aineiden aktiivisuuden me- • netetys tuntuu olevan suurempi kuin IgG-vasta-aineiden) ja . 25 että käyttötasot täytyy ehkä säätää tämän kompensoimisek- ·1·1; si.

....: CDR-siirrostettuja vasta-aineita tai niiden sekoi- tuksen sisältävät koostumukset voidaan antaa profylaktisia

t » I

ja/tai terapeuttisia hoitoja varten. Tietyissä terapeutti-. . 30 sissa sovellutuksissa riittävän määrän, jotta·saavutetaan ; ainakin osittainen valitun soluryhmän inhibitio tai tappo, • · ···1 määritetään olevan "terapeuttisesti tehokas annos". Mää- - rät, joita tarvitaan tämän annoksen saamiseksi, riippuvat • · taudin vakavuudesta ja potilaan oman immuunisysteemin .1 . 35 yleistilasta, mutta vaihtelevat yleensä 0,005 - 5,0 mg t · · • » · • · < 27 108917 CDR-siirrostettua vasta-ainetta per kilogramma kehon painoa niin, että annokset 0,05 - 2,0 mg/kg/annos ovat yleisemmin käytettyjä. Profylaktisia sovellutuksia varten koostumuksia, jotka sisältävät esillä olevaa CDR-siirros-5 tettua vasta-ainetta tai sen sekoituksia, voidaan myös antaa samoina tai hiukan alempina annoksina.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua CDR-siirrostettua vasta-ainetta sisältävää koostumusta voidaan käyttää profylaktisia ja terapeuttisia tarkoituk-10 siä varten auttamaan valitun T-solukohderyhmän muuttamista, inaktivointia, tappoa tai poistamista nisäkkäällä.

Toisessa suoritustavassa tässä kuvattuja rakenteita voidaan käyttää kehon ulkopuolisesti tai in vitro koh-desoluryhmän selektiiviseksi tappamiseksi, vähentämiseksi 15 tai muuten sen tehokkaaksi poistamiseksi heterogeenisestä solukokoelmasta. Veri nisäkkäästä voidaan yhdistää kehon ulkopuolella CDR-siirrostettujen vasta-aineiden kanssa, jolloin ei-toivotut solut tapetaan .tai muutoin poistetaan verestä, joka palautetaan nisäkkääseen standardien mene-20 telmien mukaisesti.

Terapeuttisten käyttöjen lisäksi CDR-siirrostettu-ja vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa testeissä. CDR-siirrostetut vasta-aineet voidaan leimata alalla tun-netuilla menetelmillä. CDR-siirrostetut vasta-aineet sopi-25 vat myös muihin in vivo tarkoituksiin. CDR-siirrostettuja vasta-aineita voidaan käyttää esimerkiksi perifeerisen ve-| ren solujen selektiiviseen käsittelyyn, jossa halutaan ... poistaa ainoastaan kohteena olevat T-lymfosyytit tai sa malla tavalla soluviljelmien käsittelyyn ei-toivottujen 30 T-lymfosyyttien poistamiseksi.

* · '· Esillä oleva keksintö kuvataan nyt ainoastaan esi- merkkinä viitaten mukana oleviin piirroksiin, joissa: - : Kuvio 1 kuvaa OKT4A-vasta-aineen raskasketjun va- riaabelidomeenin nukleotidisekvenssin; 28 1 0891 7

Kuvio 2 kuvaa OKT4A-vasta-aineen kevytketjun vari-aabelidomeenin nukleotidisekvenssin;

Kuvio 3 kuvaa OKT4A-vasta-aineen raskasketjun vari-aabelidomeenin aminohapposekvenssin, jossa CDR:t on alle-5 viivattu;

Kuvio 4 kuvaa OKT4A-vasta-aineen kevytketjun vari-aabelidomeenin aminohapposekvenssin, jossa CDRrt on alleviivattu;

Kuvio 5 kuvaa KOL vasta-aineen alekkain vertailun 10 0KT4A-vasta-aineen CDR-siirrostetun raskasketjun aminohap posekvenssin kanssa, jossa CDR:t on alleviivattu, ihmisen sekvenssit on merkitty isoilla kirjaimilla ja jyrsijän sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla;

Kuvio 6 kuvaa REI-vasta-aineen alekkain vertailun 15 0KT4A-vasta-aineen CDR-siirrostetun kevytketjun aminohap posekvenssin kanssa, jossa CDR:t on alleviivattu, ihmisen sekvenssit on merkitty isoilla kirjaimilla ja jyrsijän sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla;

Kuvio 7 kuvaa CDR-siirrostetun raskasketjun 20 DNA-sekvenssin ja aminohappotranslaation;

Kuvio 8 kuvaa CDR-siirrostetun kevytketjun DNA-sek- ·, : venssin ja aminohappotranslaation;

Kuvio 9 kuvaa CDR-siirrostetun 0KT4A-raskasketjun ekspressiovektorin rakentamisen; ·' ' 25 Kuvio 10 kuvaa kimeerisen 0KT4A-raskasketjun kanssa • · · : ·' yhdessä olevien CDR-siirrostettujen 0KT4A-kevytketjuraken- « ’ ' teiden sitomis- ja estämiskokeet; V · Kuvio 11 kuvaa 0KT4A-kevytketjun kanssa yhdessä olevien 0KT4A-raskasketjurakenteiden HCDR1, HCDR2 ja HCDR3 30 sitomis- ja estämiskokeet; ·”*: Kuvio 12 kuvaa REI-vasta-aineen alekkain vertailun .* , 0KT4A-vasta-aineen CDR-siirrostettujen kevytketjujen LCDR1 - » * * ;<t: ja LCDR2 ja jyrsijän OKT4A-kevytketjun aminohapposekvens- sien kanssa, joissa CDRrt on alleviivattu, ihmisen » » · » · · I I I » * 29 1 0 8 9 1 7 sekvenssit on merkitty isoilla kirjaimilla ja jyrsijän sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla;

Kuvio 13 kuvaa KOL vasta-aineen alekkain vertailun OKT4A-vasta-aineen CDR-siirrostettujen raskasketjujen 5 HCDR1 - HCDR10 ja jyrsijän OKT4A-raskasketjun aminohappo-sekvenssien kanssa, joissa CDR:t on alleviivattu, ihmisen sekvenssit on merkitty isoilla kirjaimilla ja jyrsijän sekvenssit on merkitty pienillä kirjaimilla;

Kuvio 14 kuvaa CDR-siirrostetun kevytketjun LCDR2 10 kanssa yhdessä olevien CDR-siirrostettujen raskasketjura-kenteiden HCDR1, HCDR2 ja HCDR3 sitomis- ja estämiskokeet;

Kuvio 15 kuvaa kevytketjun LCDR2 kanssa yhdessä olevien CDR-siirrostettujen raskasketjurakenteiden HCDR4 -HCDR10 sitomis- ja estämiskokeet; 15 Kuvio 16 (A & B) kuvaa kevytketjurakenteiden LCDR2, LCDR3, LCDR2Q, LCDR3Q ja LCDR4Q ja kimeerisen OKT4A-muodon kanssa yhdessä olevien OKT4A-raskasketjurakenteiden HCDR5, HCDR6 ja HCDR10 estämiskokeet;

Kuvio 17 kuvaa kevytketjurakenteen LCDR2 ja OKT4A

20 vasta-aineen kimeerisen ja jyrsijämuodon kanssa yhdessä olevien OKT4A-raskasketjurakenteiden HCDR5 ja HCDR10 suh- ·. : teelliset affiniteettikokeet käyttäen OKT3-vasta-aineen » » · · ;.f.* jyrsijän ja kimeeristä muotoa negatiivisina kontrolleina; *.,! Kuvio 18 kuvaa niiden kokeiden tulokset, joissa . 25 inhiboitiin MLRrää eri vasta-aineilla käyttäen T6:tta ne- * ·’ gatiivisena kontrollina; ja * * · * »

Kuvio 19 kuvaa niiden kokeiden tulokset, joissa I ·" * * · V ' inhiboitiin kasvua eri vasta-aineilla.

0KT4A-vasta-aineen ihmismäistäminen 30 OKT4A on jyrsijän monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa CD4-antigeenin, joka sijaitsee pääasiassa autta-/ . ja-T-lymfosyyteissä. Rakennettiin CDR-siirrostetut vasta-

i * I

aineet, joissa sekä raskas- että kevytketjujen variaabeli- > i

» I

;* domeenien. CDR:t olivat peräisin jyrsijän OKT4A-vasta-ai- * » 35 neen sekvenssistä. Variaabelidomeenin runkoalueet ja va- • nm t · j 30 1 0 8 9 1 7 kiodomeenit olivat peräisin ihmisen vasta-ainesekvens-seistä.

Kolme CDR:ää, jotka sijaitsevat sekä raskas- että kevytketjuissa, koostuvat niistä tähteistä, joiden raken-5 netutkimukset ovat osoittaneet olevan tekemisissä antigeenin sitomisen kanssa. Teoreettisesti, jos jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen CDR:t siirrostettaisiin ihmisen runko-alueisiin muodostamaan CDR-siirrostettu variaabelidomeeni ja tämä variaabelidomeeni kiinnitettäisiin ihmisen vakio-10 domeeneihin, tuloksena syntynyt CDR-siirrostettu vasta-aine olisi oleellisesti ihmisen vasta-aine, jolla olisi jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen spesifiteetti sitoa ihmisen CD4-antigeenia. Tämän vasta-aineen korkeasta "ihmismäisestä" luonteesta johtuen sen odottaisi olevan paljon vähem-15 män immunogeeninen kuin jyrsijän OKT4A-vasta-aine, kun sitä annetaan potilaille.

Kun testattiin CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen, jossa vain CDR:t oli istutettu ihmisen runkoalueeseen, antigeenin sitomista osoitettiin, että tämä ei tuottanut 20 CDR-siirrostettua vasta-ainetta, jolla olisi ollut kohtuullinen affiniteetti CD4-antigeenille. Sen vuoksi pää-j . . tettiin, että jotkin CDR:ien vieressä olevat lisätähteet ! .* / ja kriittiset runkoalueen tähteet täytyi muuttaa ihmisen tähteistä jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen vastaaviksi tähteik- V ‘ 25 si toimivan vasta-aineen saamiseksi.

< · · : .* 0KT4A-vasta-aineen raskas- ja kevytketjun cDNA:n '*'*· eristys ja variaabelidomeenin DNA-sekvenssianalyysi ί CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen suunnittele miseksi täytyi ensin määrittää jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen 30 raskas-ja kevytketjujen variaabelidomeenin sekvenssi. Sek- ·'*·. venssi määritettiin raskas- ja kevytketjun cDNArsta, joka .* , oli syntetisoitu vastaavasta mRNA:sta.

**' · · · mRNA valmistettiin OKT4A-vasta-ainetta tuottavista * t hybridoomasoluista guanidiniumtiosyanaattiuutolla, jonka 35 jälkeen suoritettiin kesiumkloridigradienttipuhdistus » > MM» 31 1 0891 7 (38). Syntetisoitiin cDNA ja kirjastot valmistettiin ja seulottiin tohtori J. Rosen'in laboratoriossa The R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute'ssa, La Jolla, Kalifornia. cDNA syntetisoitiin mRNArsta, liitettiin 5 EcoRI-linkkerit ja sitten se ligoitiin lambdagtlO kloo-nausvektorin EcoRI-kohtaan. Rekombinanttifaagi pakattiin infektiivisiksi partikkeleiksi, joita käytettiin infektoimaan E. coli C600 -solut.

Tämä kirjasto seulottiin OKT4A-vasta-aineen raskas-10 ketjusekvenssien suhteen käyttäen oligonukleotidikoettimia Cg ja FR3. Koettimella Cg (Pharmacia Biotechnologies, Inc. valmistama mRNA sekvensointialuke) on sekvenssi 5' GGCCAGTGGATAGAC 3' 15 ja se sitoutuu jyrsijän IgG:n vakiodomeeniin. Koettimella FR3 on sekvenssi 5' GGCCGTGTCCTCAGACCT 3' 20 ja se sitoutuu jyrsijän raskasketjujen variaabelidomeenin kolmanteen runkoalueeseen. Viisi positiivista kloonia ar-vioitiin Southern-siirrolla ja hybridisoimalla koettimiin Cg, FR3 ja hiiren IgG2a CH3:n cDNArhan. Yksi klooni, jossa . 25 oli kaikkiin kolmeen koettimeen hybridisoituva 1 600 emäs- ’ *, parin pituinen EcoRI-insertti, valittiin.

t M M

I Kirjasto seulottiin 0KT4A-vasta-aineen kevytketju- ! ’ sekvenssin suhteen käyttäen oligonukleotidikoetinta Ck (Pharmacia'n valmistama mRNA sekvensointialuke), jolla on * » 30 sekvenssi • » 5' GGCTCCAGGTTGCTGATGCTGAAGG 3' ja joka sitoutuu hiiren kappaketjun vakiodomeeniin. Kuusi 35 positiivista kloonia lisäarvioitiin Southern-siirrolla ja

Iitit 32 1 0891 7 hybridisoimalla oligonukleotidikoettimiin T4AK, jonka sekvenssi on 5' GGCTCCAGGTTGCTGATGCTGAAGG 3' 5 ja joka sitoutuu hiiren kappaketjun runkoalueeseen 3, ja Ck. Yksi klooni, joka sisälsi molempiin koettimiin hybri-disoituvan 900 emäsparin pituisen EcoRI-insertin, valittiin.

10 1 600 emäsparin pituinen raskasketjun cDNA jatko- kloonattiin pBluescript plasmidivektorin (Stratagene Cloning Systems) ja M13mp8 sekvensointivektorin (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc.) EcoRI-kohtiin. 900 emäsparin pituinen kevytketjun cDNA jatkokloonattiin pUC8 plasmidi-15 vektorin (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc.) ja M13mpl9 sekvensointivektorin EcoRI-kohtiin.

Sekä yksijuosteisten (M13) että kaksijuosteisten (plasmidi) templaattien sekvenssin määrittämiseen käytettiin dideoksinukleotidivälitteiseen ketjulopetukseen pe-20 rustuvaa DNA-sekvensointianalyysiä (39). 5'-puoleisten transloimattomien alueiden, signaalisekvenssien, variaa-•< : belidomeenien ja vakiodomeenien osien sekvenssi määritet- .! .* tiin sekä raskas- että kevytketjun cDNA:lie. Raskas- ja kevytketjun DNA-sekvenssi on kuvattu kuvioissa 1 ja 2.

' 25 Raskasketjun variaabelidomeenisekvenssin aminohappotrans- « · * • ·* laatio on esitetty kuviossa 3. Kevytketjun variaabelido- ' ' meenin translaatio on esitetty kuviossa 4.

V : On huomattava, että kevytketjulle annetussa nukleo- tidisekvenssissä on A-tähde kohdassa 163 CDRl:stä koodit-30 tavan sekvenssin alkukohdan lähellä (katso kuvio 2). Tämän sekvenssin translaatio muodostaa glutamiinitähteen kevyt-, ketjun kohtaan 27 (katso kuviota 4).

’; * Kun 0KT4A-vasta-aineen kevytketjun sekvensointi '*··’ alunperin suoritettiin, nukleotiditähteen 163 ajateltiin 35 olevan C-tähde, joka muodostaisi proliinitähteen kevytket-

1 t I » I

33 1 0 8 91 7 jun kohtaan 27. Esillä olevien keksijöiden tuottamat ensimmäiset CDR-siirrostetut vasta-aineet rakennettiin sen oletuksen pohjalta, että kevytketjun tähde 27 oli prolii-nitähde. Tämä voidaan havaita kuvista 6, 8 ja 12.

5 CDR-siirrostetun OKT4A-vasta-aineen suunnittelu CDR-siirrostetun OKT4A-vasta-aineen suunnittelemiseksi oli tarpeellista määrittää, mitkä jyrsijän OKT4A-vasta-aineen tähteet muodostavat kevyt- ja raskas-ketjujen CDR:t. Vasta-aineen röntgenkristallografiällä 10 saatujen rakenteiden tutkiminen osoittaa, että antigeeniä sitova pinta sijaitsee kolmen silmukan ryhmässä, joka työntyy ulos variaabelidomeenin b-tynnyrimuodon sisältävästä runkoalueesta. Näitä silmukoita voidaan näin ollen käyttää CDRrien määrittämiseen. Koska jyrsijän OKT4A-vas-15 ta-aineen kiderakennetta ei ole saatavissa, käytettiin silmukoiden tähteiden määrittämiseen samanlaista jyrsijän vasta-ainerakennetta, jonka kiderakenne on tunnettu.

Sekä kevyt- että raskasketjuista löytyy kolme hy-pervariaabelia aluetta vähemmän variaabelien runkosekvens-20 sien keskeltä (2). Useimmissa tapauksissa nämä hyperva-riaabelit alueet vastaavat, mutta voivat ulottua yli, ·, : CDR:iä. Päätettiin, että näiden jyrsijän 0KT4A-vasta-ai- ;.’t/ neen CDRiissä ja hypervariaabeleilla alueilla olevien täh- • · teiden yhdistelmä muodostaa yhdistelmä-CDR:t, jotka siir- • · * · · , 25 rostetaan ihmisen vasta-aineen runkoalueeseen. Jyrsijän I I < * ·’ 0KT4A-vasta-aineen raskas- ja kevytketjujen aminohapposek venssit esitetään kuvissa 3 ja 4 niin, että valitut yhdis- I Mt · telmä-CDR:t on alleviivattu.

Ihmisen vasta-aineen runkoaluesekvenssi raskas- » i :/.{ 30 ketjulle on ihmisen KOL-vasta-aineen runkoaluesekvenssi.

i ·"*: KOL-vasta-aine valittiin, koska sen röntgenkristallogra- » » * / . fiarakenne oli määritetty korkealla resoluutiotasolla.

» 1 I

I,,' Tämän pitäisi mahdollistaa vasta-aineen tarkan molekyyli- *;* mallituksen. Samasta syystä ihmisen kevytketjudimeerisen i · !/·· 35 REI-vasta-aineen runkoalueen sekvenssiä käytettiin kevyt- » : » i i » i » j j 108917 34 ketjurunkoalueiksi. KOL- ja REI-vasta-aineiden aminohappo-sekvenssit on esitetty kuvissa 5 ja 6 verrattuna CDR-siir-rostettujen 0KT4A-vasta-aineen raskas- (HCDR1) ja kevyt-ketjun (LCDR1) variaabelidomeenien aminohapposekvenssei-5 hin.

CDR-siirrostettu raskasketju suunniteltiin niin, että se sisälsi ihmisen IgG4:n vakioalueen. IgG4-alaluokka valittiin perustuen kokemukseen, joka oli saatu jyrsijän monoklonaalisella anti-CD3 vasta-aineella OKT3, jota käy-10 tetään hoidettaessa munuaissiirroksen hyljintää. OKT3-vas-ta-aineella on jyrsijän IgG2a-isotyyppi eikä se sido komplementtia ihmisissä. Ihmisen IgG4-isotyyppi ei myöskään sido komplementtia. CDR-siirrostettu OKT4A-vasta-aineen kevytketju rakennettiin ihmisen kappaketjun vakiodomee-15 nilla.

CDR-siirrostettujen 0KT4A-geenien rakennus CDR-siirrostetut raskas- ja kevytketjun variaabe-lidomeenit rakennettiin ligoimalla synteettiset kaksijuos-teiset DNA-oligomeerit, jotka olivat samanlaisia kuin käy-20 tettiin viitteen (40) menetelmässä. Variaabelidomeenien .!·,· 5' -pää sisältää jyrsijän monoklonaalisen vasta-aineen B27.3 (41) kevyt- ja raskasketjujen signaalisekvenssit.

• * ·:*. Signaalisekvenssi ohjaa vasta-aineen eritystä nisäkässo- luista. Juuri ennen AUG aloituskodonia sijaitseva Kozak'in • · ‘ 25 sekvenssi (42) tehostaa translaatiota. Sitten variaabeli- ... domeenit ligoitiin DNA:han, joka koodittaa ihmisen vakio- ’·’ ’ domeeneja, CDR-siirrostettujen raskas- ja kevytketjugee- nien luomiseksi.

” CDR-siirrostetun 0KT4A-raskasketjun rakennus *...· 30 Suunniteltiin kahdeksan noin 30 emäsparin pituista : komplementaarista oligomeeriparia niin, että niillä oli ,··, päällekkäin menevät päät ja joissa variaabelidomeeni ulot- *' # · | · tui runkoalueessa 2 sijaitsevasta Xhol-kohdasta ensimmäi- ! *. " sen vakiodomeenin alussa sijaitsevaan Hindlll-kohtaan.

i · ! 35 Nämä kahdeksan oligomeeriparia syntetisoitiin, ligoitiin 108917 35 yhteen vaiheittain ja sitten ligoitiin ihmisen IgG4:n va-kiodomeenin DNA:n 5'-pään Hindlll-kohtaan. IgG4-DNA hankittiin Celltech, Ltd.'stä (Slough, UK) genomisena DNA:na. Se on 2153 emäsparin pituinen insertti M13 faagivektorissa 5 niin, että siinä on 5'-päässä EcoRI-entsyymin ja 3'-päässä BamHI-entsyymin restriktiokohta. CH1-, sarana-, CH2- ja CH3-domeeneja ympäröi neljä intronia. Geeni modifioitiin Celltech'ssä niin, että siinä oli CHl-eksonin viimeistä edellisessä emäksessä C:n muutos A:ksi niin, että muodos-10 tui uusi HindiII-kohta CDR-siirrostetun geenin rakennus-tarkoituksia varten.

Variaabelidomeenin 5'-pää rakennettiin ligoimalla yhteen kaksi komplementaarista synteettistä oligomeeripa-ria, joista kumpikin oli pituudeltaan noin 90 emäsparia.

15 Tämä fragmentti, jolla oli 5'-päässään EcoRI-kohta ja 3'-päässään Xhol-kohta, ligoitiin yllä kuvatun fragmentin Xhol-kohtaan niin, että saatiin täydellinen CDR-siirros-tettu raskasketjugeeni. Tämä geeni on 2364 emäsparin pituinen ja sillä on 5'-päässä EcoRI-kohta ja 3'-päässä 20 BamHI-kohta. DNA-sekvenssi geenin aminohappotranslaation t)·.· kanssa on esitetty kuviossa 7. Mielenkiintoiset alueet, :\\ jotka on määritelty nukleotidinumerolla, ovat: • * * * * . 1-14 EcoRI-kohta ja Kozak'in sekvenssi

; « · · W

’ 25 15 - 71 signaalisekvenssi 72 - 146 runkoalue 1 V ** 147 - 176 CDR1 | 177 - 218 runkoalue 2 | V·! 219 - 254 CDR2 ‘ "i 30 255 - 362 runkoalue 3 .·! : 363 - 392 CDR3 * t · 393 - 431 runkoalue 4 • '!* 432 - 727 CHl-domeeni * · 728 - 1117 introni 35 1118 - 1153 saranadomeeni 36 1 089 1 7 1154 - 1271 introni 1272 - 1599 CH2-domeeni 1600 - 1698 introni 1699 - 2016 CH3-domeeni 5 2017 - 2366 3'-puoleinen transloimaton alue CDR-siirrostetun kevytketjugeenin rakennus 12 komplementaarista synteettistä oligonukleotidi-paria, joissa oli päällekkäin menevät päät, ligoitiin yh-10 täaikaa niin, että muodostettiin CDR-siirrostettu kevyt-ketjun variaabelidomeeni. Tässä fragmentissä oli 5'-päässä EcoRI-kohta ja 3'-päässä Narl-kohta. Tämä ligoitiin ihmisen kappaketjun vakiodomeenin DNA:n 5'-pään Narl-kohtaan. Ihmisen kappaketjun vakiodomeenin cDNA:ta modifioitiin 15 Celltech'ssä niin, että siihen sisällytettiin kolmanteen ja neljänteen kodoniin Narl-entsyymin restriktiokohta. Tuloksena syntynyt CDR-siirrostettu kevytketjugeeni oli 754 emäsparin pituinen ja siinä oli päissä EcoRI-kohdat. DNA-sekvenssi aminohappotranslaation kanssa on esitetty 20 kuviossa 8. Mielenkiintoiset alueet, jotka on määritelty .!·.· nukleotidinumerolla, ovat: • · • · 1-8 EcoRI-kohta ja Kozak1 in sekvenssi 9-68 signaalisekvenssi 25 69 - 143 runkoalue 1 144 - 164 CDR1 » 1 · | 1 165 - 215 runkoalue 2 216 - 236 CDR2 | ’· " 237 - 338 runkoalue 3 30 339 - 356 CDR3 357 - 404 runkoalue 4 .···. 405 - 710 kappaketjun vakiodomeeni 711-754 transloimatonta * · · * · · · 37 1 0891 7 CDR-siirrostetun OKT4A-vasta-aineen ekspressointi Raskasketjun ekspressiovektorin rakennus CDR-siirrostetun raskasketjun ekspressiovektori rakennettiin insertoimalla raskasketjugeeni ekspressio-5 plasmidiin pEe6HCMVBgl2 ja lisäämällä GS-fragmentti, joka koostuu SV40-origosta ja glutamiinisyntetaasi-mini-geenistä. Nämä vaiheet on kuvattu kuviossa 9. Plasmidi pEe6HCMVBgl2 ja GS-fragmentti hankittiin Celltech, Ltd.'stä.

10 Plasmidi pEe6HCMV digestoitiin EcoRI- ja BclI-koh- dista. Plasmidin pEe6HCMVBgl2 DNA:sta oli poistettu mety-lointi viemällä se DAM':n E. coli-kannan GM242 läpi, jolta puuttuu deoksiadenosiinimetylaasi. BclI-entsyymi katkaisee ainoastaan DNA:ta, joka ei sisällä N6-metyloitua deoksi-15 adenosiinia entsyymin tunnistuskohdassa. BclI-katkai- susta syntynyt ylimenevän juosteen pää on yhteensopiva BamHI-katkaisun ylimenevän juosteen pään kanssa. Sitten EcoRI/BamHI-päät sisältävä CDR-siirrostettu raskasketju-geeni (HDCR1) ligoitiin EcoRI/BclI-päät sisältävän plas-20 midin pEe6HCMVBgl2 kanssa muodostaen plasmidin pEe6HCDRl.

·;'·· 5 500 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisälsi | : ·*: glutamiinisyntetaasi-minigeenin ja SV40-viruksen replikaa- tion aloituskohdan ja aikaiset ja myöhäiset promoottorit, • insertoitiin plasmidin pEeöHCDRl BamHI-kohtaan muodostaen • « 25 plasmidin pEeöHCDRlgs. GS-fragemtin oikea orientaatio var-mistettiin restriktioanalyysillä. Plasmidi pEeöHCDRlgs • · · valmistettiin nisäkässolutransfektiota varten alkalisella . . lyysimenetelmällä ja kesiumkloridigradienttipuhdistuksel- » · · la (43).

·;·’ 30 Plasmidi pEeöHCDRlgs kykenee ekspressoimaan OKT4A-vasta-aineen CDR-siirrostettua raskasketjua COS- ja CHO-soluissa. HCMV-promoottori sijaitsee raskasketjugeenin • » « , 5'-puolella ja ohjaa sen transkriptiota. SV40-viruksen * * t » I · ‘ ; polyadenylaatiosignaalisekvenssi, joka sijaitsee geenin 35 3'-puolella, toimii transkription terminaattorina.

108917 38 COS-soluissa tapahtuvaa lyhytaikaista ekspressiota varten SV40-viruksen replikaation aloituskohta on läsnä 5 500 emäsparin pituisessa GS-fragmentissa. GS-minigeeni on läsnä selektiomerkkigeeninä käytettäväksi CHO-solujen 5 transfektion jälkeen. Glutamiinisyntetaasi-minigeenin ekspressiota ohjaa SV40-viruksen myöhäinen promoottori. GS-fragmentti sijaitsee niin, että SV40-viruksen myöhäinen promoottori ohjaa transkriptiota samaan suuntaan kuin HCMV-promoottori.

10 CDR-siirrostetun raskasketjun tuotossa tapahtuu useita transkription jälkeisiä tapahtumia. Tumassa IgG4 vakioalueen kolme välisekvenssiä poistetaan ja eksonit silmukoidaan yhteen muodostamaan kypsä mRNA. Translaation jälkeen 19 aminohapon pituinen signaalisekvenssi poiste-15 taan karkeassa endoplasmisessa retikulumissa (ER). ER:ssä ja Golgi'n laitteessa kunkin ketjun CH2-domeeniin liitetään yksi hiilihydraatti. Kukin ketju sisältää myös neljä ketjun sisäistä disulfidisidosta. Kun kevytketjun peptidi tuodaan paikalle yhtäaikaa transfektoidun kevytketjun 20 ekspressiovektorin avulla, kootaan kypsä vasta-aine sito- maila disulfidisidosten avulla kaksi raskas- ja kaksi ke-vytketjua yhteen.

/j‘. CDR-siirrostetun OKT4A-kevytketjun ekspressiovekto- rin rakennus 25 0KT4A-vasta-aineen CDR-siirrostetun kevytketjun ... ekspressiovektori rakennettiin insertoimalla CDR-siirros- tettu kevytketjugeeni ekspressioplasmidiin pEe6HCMVBgl2 ja sitten lisäämällä GS-fragmentti, joka koostuu SV40-origos-ta ja glutamiinisyntetaasi-minigeenistä. Kevytketjun ...’ 30 ekspressiovektori rakennettiin oleellisesti samalla me- netelmällä, jota käytettiin raskasketjun ekspressio- vektorin rakentamiseen, kuten on kuvattu kuviossa 9.

,· , Kevytketjugeeni ligoitiin plasmidin pEe6HCMVBgl2 ’· "i EcoRI-kohtaan muodostaen plasmidi pEeöLCDRl. Kevytketju- 35 geenin oikea orientaatio varmistettiin restriktioanalyy- 108917 39 sillä. 5 500 emäsparin pituinen GS-fragmentti insertoitiin BamHI-kohtaan muodostaen plasmidi pEeöLCDRlgs. GS-fragmen-tin oikea orientaatio varmistettiin restriktioanalyysillä. Plasmidi pEe6LCDRlgs valmistettiin nisäkässolutransfektio-5 ta varten alkalisella lyysimenetelmällä (43) ja kesiumklo-ridigradienttipuhdistuksella.

Kuten CDR-siirrostetun raskasketjugeenin tapauksessa, CDR-siirrostetun kevytketjugeenin transkriptiota plas-midissa pEeöLCDRgs ohjaa HCMV-promoottori ja transkription 10 terminaatiota ohjaa SV40-viruksen polyadenylaatiosignaali- sekvenssi. GS-fragmentissa sijaitseva SV40-viruksen repli-kaation aloituskohta sallii tämän rakenteen autonomisen replikaation COS-soluissa. GS-fragmentin glutamiinisynte-taasi-minigeeni antaa mekanismin CHO-solujen selektoimi-15 seksi ja amplifioimiseksi.

CDR-siirrostetun kevytketjun mRNA:n transkription jälkeistä prosessointia ei tarvita ennen translaatiota, koska geenissä ei ole introneita. Translaation jälkeen "leader"-sekvenssi poistetaan karkeassa ER:ssä. Kaksi 20 ketjun sisäistä disulfidisidosta muodostuu. Kypsän vas- ·:*· ta-aineen kokoamisesta keskusteltiin aiemmassa osassa.

: * : CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen lyhytaikainen ekspressio COS-l-soluissa j J'.‘. CDR-siirrostettujen geenien lyhytaikainen ekspres- 25 sio COS-l-soluissa muodostaa nopean ja helpon systeemin CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen ekspression ja toiminnan testaamiseksi. COS-l-solut ekspressoivat konstitutii-. . visesti SV40-viruksen isoa T-antigeeniä, joka pitää yllä sellaisten episomien lyhytaikaista replikaatiota, jotka ·;·' 30 sisältävät SV40-viruksen replikaation aloituskohdan (44).

CDR-siirrostettujen geenien ekspressiovektorit pEeöHCDRlgs j’”: ja pEeöLCDRlgs sisältävät SV40-viruksen replikaation aloi- . tuskohdan osana GS-fragmenttia. Kun transfektoidaan C0S-1- • soluihin, ekspressiovektorit replikoituvat tumassa korkei- • | 108917 40 siin kopiomääriin johtaen suhteellisen korkeisiin ekspres-siotasoihin.

COS-l-solut saatiin American Type Culture Collection -kokoelmasta (CRL 1650) ja niitä viljeltiin Dul-5 becco's Modified Eagle Medium -alustassa (GIBCO'n valmistama DMEM), jossa oli 10 % vasikan sikiön seerumia. CDR-siirrostettujen geenien ekspressiovektorit transfek-toitiin COS-soluihin käyttäen DEAE-dekstraanimenetelmää, jonka jälkeen suoritettiin DMSO-shokki (45). Lyhyesti, 10 0,2 ml puskuria, jossa oli DEAE-dekstraania 1 mg/ml lisättiin 15 mg vektori-DNA:ta 0,8 ml:ssa DMEM/Tris-liuosta . Tämä lisättiin 1 - 1,5 x 106 solun joukkoon 60 mm:n kudosviljelymaljalla ja inkuboitiin noin 6 tuntia. DEAE-dekstraani/DNA-kompleksi poistettiin ja maljalle li-15 sättiin 10 % DMSOrta puskurissa 2 minuutin ajaksi. Tämä poistettiin, solut pestiin kerran DMEM-liuoksella ja sitten inkuboitiin DMEM-liuoksessa, joka sisälsi 10 % vasikan sikiön seerumia, 3-4 vuorokautta. Sen jälkeen kuoppien supernatantti kerättiin ja tutkittiin vasta-ainetasojen 20 suhteen ja kyvyn suhteen sitoa CD4-positiivisia lymfosyyt- .!·.! tejä.

Vasta-ainetasot määritettiin ELISA-testillä. Kuopat *:*. päällystettiin vuohen anti-ihmis-Fc-spesifisellä vasta- aineella. Lisättiin eri laimennokset eristettyä vasta-ai-25 netta sisältävää COS-solun supernatanttia, inkuboitiin • · ... yksi tunti huoneenlämpötilassa kosteassa kammiossa ja pes- * tiin. Lisättiin piparjuuriperoksidaasiin kiinnitettyä vuo hen anti-ihmis-kappaketjun vasta-ainetta, inkuboitiin yksi • · · tunti huoneenlämpötilassa ja pestiin. Lisättiin pipar juu- • · ...* 30 riperoksidaasin substraattia tunnistusta varten. CDR-siir- j :*·.· rostettujen 0KT4A-vasta-aineiden tasot plasmidien i · · pEeöHCDRlgs ja pEe6LCDRlgs yhteistransfektion jälkeen ovat ,· , välillä 200 - 1200 ng/ml COS-solun supernatanttia.

[ * i 4i 1 0891 7

Antigeenin sitomistutkimukset CDR-siirrostettua OKT4A vasta-ainetta tuottavat COS-solut testattiin niiden kyvyn suhteen sitoutua ihmisen perifeerisen veren lymfosyytteihin (PBL:t) tai CD4-posi-5 tiiviseen HPBALL- (ihmisen perifeerisen veren akuutti lym-fosyyttinen leukemia) solulinjaan. Se testattiin myös sen kyvyn suhteen estää jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen sitoutuminen näihin soluihin. Sitoutuminen mitattiin seuraavalla menetelmällä- PBL:t eristettiin seerumista tai HPBALL-so-10 lut kerättiin kudosviljelmästä. Soluja 1 inkuboitiin 4 °C:ssa yhden tunnin ajan testattavan vasta-aineen, positiivisen kontrollivasta-aineen tai negatiivisen kontrolli-vasta-aineen eri laimennosten kanssa. Solut pestiin kerran ja niitä inkuboitiin 4 °C:ssa yhden tunnin ajan vuohen 15 FITC-leimatun anti-ihmis-IgG:n (Fc-spesifinen, hiirellä absorboitu) kanssa. Solut pestiin kahdesti ja analysoitiin sytofluorografiällä. Kimeeristä 0KT4A-vasta-ainetta (kuvattu alla) käytettiin positiivisena kontrollina. FITCleimattua jyrsijän 0KT4A-vasta-ainetta käytettiin po-20 sitiivisena kontrollina suoraan sitoutumiseen. Solut, joi- • · ta inkuboitiin valetransfektoidun COS-solun supernatantin ·*·’: kanssa, jonka jälkeen suoritettiin inkubointi vuohen • « .‘|*j FITC-leimatulla anti-ihmis-IgG:llä, muodostivat negatii- visen kontrollin.

• · • · 25 Kun testattiin CDR-siirrostetun OKT4A-vasta-aineen • · kykyä estää jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen sitoutuminen, • ♦ · PBLriä tai HPBALL-soluja inkuboitiin 4 °C:ssa yhden tunnin , ajan testattavan vasta-aineen tai kontrollivasta-aineen • » · eri laimennosten kanssa. Lisättiin sovittu kyllästävä mää-...· 30 rä FITC-0KT4A-vasta-ainetta. Näytteitä inkuboitiin yhden tunnin ajan 4 °C:ssa, pestiin kahdesti ja analysoitiin • · sytofluorograf iällä. Positiivisina kontrolleina käytettiin “ * » * j , FITC-leimattua OKT4A-vasta-ainetta maksimisitoutumisen · · * * · • | määrittämiseksi ja leimaamatonta jyrsijän OKT4A-vasta-ai- j 35 netta eston viitestandardina. Negatiiviset kontrollit oli- 108917 42 vat värjäämättömiä soluja joko valetransfektoidun solusu-pernatantin kanssa tai ilman.

CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen kevytketjun kykyä sitoa CD4-positiivisia soluja ja estää jyrsijän 5 OKT4A-vasta-aineen sitoutuminen testattiin alunperin yhdessä kimeerisen OKT4A-vasta-aineen raskasketjun kanssa. Kimeerinen OKT4A-vasta-aineen raskasketju koostuu jyrsijän OKT4A vasta-aineen variaabelidomeenista ja ihmisen IgG4 vasta-aineen vakioalueesta. Kimeeristä raskasketjugeeniä 10 ' ekspressoidaan samassa ekspressiovektorissa, jota käytet tiin CDR-siirrostettujen geenien ekspressioon. CDR-siirrostetun kevytketjugeenin ekspressiovektori ja kimeerisen raskasketjun ekspressiovektori transfektoitiin yhdessä COS-soluihin. Täydellisen kimeerisen 0KT4A-vasta-aineen 15 (kimeerinen kevytketju ja kimeerinen raskasketju) havaittiin olevan täysin kykenevä sitoutumaan CD4-positiivisiin soluihin ja estämään jyrsijän OKT4A-vasta-aineen sitoutuminen näihin soluihin.

Kuten kuvio 10 esittää, CDR-siirrostettu OKT4A-vas-20 ta-aineen kevytketju LCDR1 yhdessä kimeerisen 0KT4A-vasta-I 1;1·· aineen raskasketjun kanssa ei kyennyt sitoutumaan CD4-po- ! : ·'; sitiivisiin soluihin tai estämään jyrsijän 0KT4A-vasta- aineen sitoutumista näihin soluihin.

Kuvio 11 esittää sitoutumis- ja estämiskokeet, jot-I 25 ka tehtiin CDR-siirrostetulla 0KT4A-vasta-aineen raskas- t · ketjulla HCDRl yhdessä kimeerisen 0KT4A-vasta-aineen ke-

« I I

vytketjun kanssa. Kimeerinen 0KT4A-vasta-aineen kevytketju . , koostuu jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen variaabelidomeenista • · · ja ihmisen kappaketjun vakiodomeenista. Myös sitä ekspres- i · ···1 30 soidaan samassa ekspressiovektorissa, jota käytettiin CDR-siirrostettujen vasta-aineiden ekspressioon. COS-solut transfektoitiin yhtäaikaa CDR-siirrostetun raskasketjun | .1 , ekspressiovektorilla ja kimeerisen kevytketjun ekspressio- » · » ; vektorilla.

Il··· i 1 · 108917 43 CDR-siirrostettu OKT4A-vasta-aineen raskasketju HCDR 1 yhdessä kimeerisen OKT4A-vasta-aineen kevytketjun kanssa ei myöskään kyennyt sitoutumaan CD4-positiivisiin soluihin tai estämään jyrsijän OKT4A-vasta-aineen sitou-5 tumista näihin soluihin.

CDR-siirrostetun vasta-aineen modifioiminen Sitoutumis- ja estämiskokeiden tulokset osoittivat selvästi, että alunperin suunniteltu CDR-siirrostettu OKT4A-vasta-aine ei kyennyt tunnistamaan CD4-antigeenia.

10 Vasta-aineen lisämodifikaatio oli tarpeen. Joko jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen CDR:iä täytyi laajentaa lisää tai CDRrien sijoittelussa, domeenien pakkauksessa tai kevyt-ja raskasketjun välisissä interaktioissa kriittisiä runko-alueen tähteitä täytyi muuttaa ihmisen kaltaisista hiiren 15 kaltaisiksi.

Molekyylimallitusta käytettiin tunnistettaessa tähteet, jotka tuntuivat olevan kriittisimpiä onnistuneelle interaktiolle antigeenin kanssa. Mallitus suoritettiin Celltech, Ltd.'ssa käyttäen HYDRA-ohjelmistoa Silicon-20 Graphics-laitteistolla.

• · ·;’·* CDR-siirrostetun kevytketjun modifikaatio - * * i * : OKT4A-vasta-aineen kiderakennetta ei ole määritet- * » ty, joten 0KT4A-vasta-aineen itsensä molekyylimallia ei voitu käyttää analyysissä. CDR-siirrostetun kevytketjun

• K

25 tähteiden analysoimiseksi verrattiin ihmisen REI-vasta-aineen kevytketjun molekyylimallia hiiren MOPC 603 » · ♦

Fab-fragmenttiin. MOPC 603-vasta-aineen kevytketju on sa-. . maalainen aminohapposekvenssiltään kuin 0KT4A-vasta-ai- • i « • » | neen. Tehtiin myös tutkimukset, joissa ihmisen REI-vasta- * · ·;·’ 30 aineen kevytketjua ja ihmisen KOL-vasta-aineen raskasket- : jua pienennettiin. Tehtiin päätökset, joilla laajennet- tiin CDRlrstä muuttamalla tähteet 33 ja 34 ihmisen leu- ja * * » , asp-tähteistä jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen ile- ja ala-täh- * * * 1 ; teiksi. Ihmisen-REI vasta-aineen tähteen glu38 havaittiin • t t * t 35 ottavan osaa raskasketjun ja kevytketjun pakkaukseen. Tä- 1 089Ί 7 44 män tähteen muuttaminen jyrsijän OKT4A-vasta-aineen his38 tähteeksi voi olla edullista. CDR2:n aminopään reunalla sijaitseva tähde 49 vaikuttaa suoraan CDR2:een ja muodostaa myös kontaktin raskasketjun CDR3:n kanssa. CDR3:n ami-5 nopään lähellä oleva tähde 89 reagoi tähteen phe98 kanssa i kevytketjun CDR3:ssa ja muodostaa myös kontaktin raskas-ketjun CDR3:n kanssa. REI-vasta-aineen tähteet tyr49 ja gln89 muutettiin jyrsijän OKT4A-vasta-aineen tähteiksi his49 ja leu89.

10 Uusi CDR-siirrostetun OKT4A-vasta-aineen kevytket- jugeeni, joka muodostettiin yllä olevin muutoksin, nimettiin LCDR2:ksi. Ihmisen REI-, LCDR1-, LCDR2-vasta-aineen ja oletetun jyrsijän OKT4A-vasta-aineen kevytketjun va-riaabelidomeenien aminohapposekvenssin vertailu on esitet-15 ty kuviossa 12. Muutokset suoritettiin muuttamalla kodonit kohdennetulla mutageneesillä (46). Stratagene Cloning Systems'n Bluescript-faagimidivektoria käytettiin muodostettaessa yksijuosteinen templaatti mutageneesiä varten. Ekspressiovektori pEe6LCDR2gs rakennettiin samalla tavalla 20 kuin LCDR1 varten. COS-solut transfektoitiin yhtäaikaa plasmidilla pEe6LCDR2gs ja kimeerisen raskasketjun eks- • · * · | pressiovektorilla.

Sitoutumis- ja estämiskokeiden tulokset on esitetty kuviossa 10. CDR-siirrostetun 0KT4A-vasta-aineen kevytket-! 25 jun versio LCDR2 yhdessä kimeerisen 0KT4A-vasta-aineen raskasketjun kanssa kykenee sitoutumaan CD4-positiivisiin • % soluihin ja estämään jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen sitoutuminen. Nämä tulokset osoittavat, että LCDR2 on toimiva . . CDR-siirrostettu 0KT4A-vasta-aineen kevytketju.

• · · 30 CDR-siirrostetun raskasketjun modifikaatio • · ··' Raskasketjun mallitustutkimuksia varten käytettiin ihmisen KOL-vasta-aineen molekyylimallia. Kaikki tähteiden

·' » I

muutokset suoritettiin kohdennetulla mutageneesillä kodo-. nien muuttamiseksi. Päätettiin muuttaa KOL-vasta-aineen • ; 35 tähteet glu57 ja his58 jyrsijän 0KT4A-vasta-aineen täh- 45 1 0891 7 teiksi thr57 ja tyr58. Tämä muutettu CDR-siirrostettu ras-kasketju nimettiin HCDR2:ksi. Tähteiden 57 ja 58 muutoksien lisäksi tähde 24 sijaitsee lähellä CDRlrstä ja voi ottaa osaa CDR1 sijoittamiseen. Myös tähteet 88 ja 91 ot-5 tavat osaa raskasketjun variaabelidomeenin pakkaukseen ja raskas-ja kevytketjun yhteen liittymiseen. Nämä kolme tähteiden lisämuutosta KOL vasta-aineen tähteistä jyrsijän OKT4A-vasta-aineen tähteiksi sisällytettiin raskasketju-versioon HCDR3. KOL, HCDRl, HCDR2, HCDR3, jyrsijän 10 OKT4A-vasta-aineen raskasketjun ja alla kuvattujen versioiden variaabelidomeenien aminohapposekvenssiver-tailut on kuvattu kuviossa 13.

Ekspressiovektorit pEe6HCDR2gs ja pEe6HCDR3gs transfektoitiin COS-soluihin joko yhdessä kimeerisen 15 0KT4A-vasta-aineen kevytketjun ekspressiovektorin tai plasmiöin pEeöLCDR2gs kanssa. Sitoutumis- ja estämiskokei-den tulokset on esitetty kuvissa 11 ja 14. HCDR2 ja HCDR3 eivät kumpikaan kyenneet tehokkaasti reagoimaan antigeenin kanssa, kun ne oli yhdistetty kimeerisen tai CDR-siirros-20 tetun 0KT4A-vasta-aineen kevytketjun kanssa.

Tutkittiin CDR-siirrostetun raskasketjun lisämodi- • · ·;*·: fikaatioita. Päätettiin muuttaa KOL-vasta-aineen tähde « ♦ · ! · *,· tyr35 jyrsijän OKT4A vasta-aineen tähteeksi ser35. Mole- j . : : kyylimallitus osoitti, että tähde 42 otti osaa CDR2:n si- 25 joittamiseen. Tähde 44 ottaa osaa kevytketjun kontaktei- • « • j..j hin. Voi olla edullista muuttaa KOL-vasta-aineen tähteet gly42 ja gly44 jyrsijän OKT4A-vasta-aineen tähteiksi glu42 ja arg44. KOL-vasta-aineen tähde alaöO muutettiin myös . jyrsijän OKT4A vasta-aineen tähteeksi pro60. Nämä muutok- • · · 30 set sisällytettiin eri yhdistelminä samalla jättäen jäi- • · ;·* jelle muutokset, jotka oli tehty tähteisiin 24, 57, 58, 88 • * ί/.j ja 91 aiemmissa versioissa. Nämä jälkimmäiset versiot ni- : mettiin HCDR4: ksi, HCDR5:ksi, HCDR6: ksi, . HCDR7:ksi ja HCDR8:ksi. Kussakin suoritetut tähteiden muu- ; 35 tokset on kuvattu kuviossa 13. Käytettiin samaa ekspres- 46 1 0891 7 siovektoria kuin muidenkin rakenteiden kanssa. COS-solut transfektoitiin yhdessä uusien raskasketjun ekspressiovek- torien ja plasmidin pEe6LCDR2gs kanssa.

Sitoutumis- ja estämiskokeiden tulokset yhdessä 5 LCDR2:n kanssa (kuvio 15) osoittavat positiiviset reaktiot CD4-antigeenin kanssa kaikilla näillä versioilla paitsi HCDR8:lla. Ilmeisesti tyr35 tähteen muutos jyrsijän ser35 tähteeksi on kriittinen muutos. Muutos jyrsijän tähteeksi kohdalla 60 tuntuu parantavan reaktiota antigeenin kanssa 10 (vertaa HCDR6:tta HCDR4:ään) samalla, kun muutos kohdalla 44 tuntuu olevan hiukan inhibitorinen (vertaa HCDR5:ttä HCDR4:ään ja HCDR7:ää HCDR6:een).

Sen määrittämiseksi, olisiko muutokset tähteissä 35 ja 60 riittäviä antigeenin sitomiselle, muodostettiin 15 HCDR9 (jyrsijän tähteet kohdilla 24, 35, 57, 58, 88, 91) ja HCDR10 (jyrsijän tähteet kohdilla 24, 35, 57, 58, 60, 88, 91) kohdennetulla mutageneesillä. Näitä CDR-siirros- tettuja raskasketjun versioita varten käytettiin samaa ekspressiovektorisysteemiä. Ne transfektoitiin COS-solui- 20 hin yhdessä plasmidin pEe6LCDR2gs kanssa.

Sitoutumis- ja estämiskokeiden tulokset on esitetty ·;'·· kuviossa 15 yhdessä CDR-siirrostetun raskasketjun aiempien ! versioiden kanssa. Muutokset tähteissä 42 ja 44, jotka j tehtiin aiempiin versioihin, eivät selvästikään olleet i j*.\ 25 tarpeellisia, joka tulos on päinvastainen niiden tulosten i kanssa, jotka on kuvattu patentissa PCT/US89/05857. Muutos • · tähteessä 60, joka muutos on läsnä versiossa HCDR10, mutta • · · ei versiossa HCDR9, on suotuisa.

. . Yhteenveto CDR-siirrostetuista 0KT4A-raskasket juis- • · · 30 ta ja niiden aktiivisuuksista sitoutumis- ja estämisko- • · ·;·* keissa on esitetty taulukossa 1. Aktiivisin CDR-siirros- tettu 0KT4A-vasta-aine, joka sisältää vähiten jyrsijän tähteitä, on HCDR10:n ja LCDR2:n yhdistelmä.

• · · • · 47 10891 7

•H

P

-P

\ O

to o 3 -P .

3 *H -f. + m + + + -* lii o ί I 1 }+ + -*·+' + +

X .M

m <o c

•rH

* *H

CO •H

•Ρ <u

M-P + + + + + + ^ JS

| $ I 1 · ^ ti c

P > <D

O -P · -h 4J -P +> f—i 7.

cu ;p -¾ σ> «

T3 W Λ3 ^ Q

§ rl B H ^ UI H ffi o Cl h σ> » - « o

> - CO O CO

H H ΙΟ Π VO 03 rP ~ !μ tn ® - - - <* .5 X O CD O -p ra co co vo ΙΛ vO 1-1 ® en

m lO » .... 03 CO -P

CC . _. CU

Qi m »P " (-0 C CO «4J

rS -o σ,αΓ'ΐηιηιηίοο „ Λ -H -H -te ^ιΛΙΛ » » »COB ΓΜ!(ΰ

*H G) * £Q * * fs. fs. ^ "-- -P

’p c t !2 coi^^invineoco

rG P «A ^ 1Λ ΙΛ 3 C

o 3 :rÖ :rö ^ *» ^ rH O) ^ -r-i +j :fö co ' rs rv) ^ ** “ rHd; ε e o 3 3 -p cw ifög) . % ^inin ph H 3 ·3 **H '3 ia ^ «* ΐΛ »rs fsj *. *» 0 3 3 V ^ o £ .tnioiomo^jncn §o E-ι a) tnc >, r- »ori .. - »nri cc M ^ Λ -M3 .. ίβ £.2 m (M'y^'NINCN'V’tf ..·.: x ™ in <n (n .g c * · U) 3 3 • * · 3 O *γη 3

: · : p φ HP

. . e to CO

··· e a; _ r-, _ r-, im

• . (1)¾ r-(«tfO^O 4JO

·.·· (U JS e en TT Ό V Ό (DC

C im !lti » w . ,Q -P

: ' : 'm V *ω CO CO r* CS e* r* *r O m ro • Π3 * CO) x Tie r'Tj-mmininfMinin ω> en ic-Htnrvjreooorvno 'o ra ... ra d E cd -nra

• : ; > -m 4J

. I e +j (3) *r-{

<* >1 -H

E-ι +> > « 4-> . ·, : o -h -p ... P X <v • · XX PO) ... a x mx ' .' -p eu £ us ... 0) X :ra . x en e e +j . . W O -Γ-l o • · · 0 P -P e .. .” ρ ρ a> x =ra p -p .V O ^ _ΓΛ

> ·η -h en _ z. Q) -P

·· .h tnratPrMr-i^invO^eOOjr-j +jw

j ”‘ en i X aKttciliKItKdiK JSP

i ‘ i Λ m qdoqQDDDQQ rra>, ... nnpOOUUOUUUUU & *s> 0υΜχχΐΧΧΧΧΧΧΧ*ί j 48 1 O 8 91 7

Vaihtoehtoiset kevytketjurakenteet

Kuten yllä on mainittu, esillä olevat kevytketjurakenteet tuotettiin sillä oletuksella, että 0KT4A-vasta-aineen kevytketjun kohdassa 27 oli proliinitähde. Kun ha-5 vaittiin, että kohdassa 27 tulisi olla glutamiinitähde, tuotettiin ja ekspressoitiin kolme uutta kevytketjuraken-netta. Nämä nimettiin LCDR2Q:ksi, LCDR3Q:ksi ja LCDR4Q:ksi ja ne ovat samanlaisia kuin LCDR2, LCDR3 ja LCDR4, vastaavassa järjestyksessä paitsi, että kohdassa 27 on glutamii-10 nitähde (Q) proliinitähteen (P) sijasta. On osoitettu, että näillä kevytketjuilla on jäljellä täysi aktiivisuus. Tämän osoittavat tulokset on esitetty kuviossa 16.

On huomattava, että proliini on merkittävästi erilainen kuin kaikki muut aminohapot siinä mielessä, että 15 sillä on litteä rakenne. Sen vuoksi se yleensä löydetään peptidisekvensseistä sellaisista kohdista, joissa tapahtuu ketjun orientaation muutos. Sen vuoksi on todennäköistä, että proliinin kohdassa 27 sisältävän kevytketjun CDRl:n rakenne on merkittävästi erilainen kuin sellaisen kevyt-20 ketjun CDRlrn, jolla on kohdassa 27 glutamiini. Tästä huolimatta on osoitettu, että kaksi kevytketjua ovat saman-·;’·· laisia toiminnallisesta näkökulmasta katsottuna. Tämä tu- kee tässä esitettyä oletusta, että ei ole tarpeellista muuttaa vasta-aineen kaikkia kuutta CDR:ää toimivan 25 CDR-siirrostetun vasta-aineen tuottamiseksi.

CDR-siirrostettujen kevyt- ja raskasketjujen vaih- | toehtoiset modifikaatiot • · ·

Myöhempiin CDR-siirrostettujen kevyt- ja raskas- j , . ketjujen versioihin tehdyt tähteiden muutokset tehtiin * / 30 perustuen REI, KOL ja niille läheisen hiiren vasta-aineen * · *;·’ MOPC 603 molekyylimallitukseen mieluummin kuin CDR-siir- : rostettujen vasta-aineiden itsensä molekyylimallitukseen.

Jotkin muutoksista voivat olla tarpeettomia sitoutumisen . kannalta, erikoisesti matalammilla sitoutumisaktiivisuuk- * * · j · : 35 silla. Olemme rakentaneet useita CDR-siirrostettujen ke vyt- ja raskasketjujen geenejä, joissa jotkin runkoalueen 49 108917 tähteet, jotka aiemmin oli vaihdettu hiiren tähteitä vastaaviksi, vaihdettiin takaisin ihmisen tähteiden kaltaisiksi. Yleisesti ne tähteet, jotka eivät suoraan ota osaa CDRrien pidennykseen tai CDR:ien sijoittamiseen, on muu-5 tettu takaisin ihmisen tähteiksi eri yhdistelmissä. Taulukossa 2 luetellaan nämä kevyt- ja raskasketjugeenit niiden tähteiden numeroiden kanssa, jotka on muutettu hiiren tähteistä takaisin ihmisen tähteiksi. Kohdennettua mutage-neesiä käytettiin näiden geenien rakentamiseen. Niitä eks-10 pressoidaan COS-soluissa ja niiden kyky tunnistaa CD4-an-tigeeni testataan sitoutumis- ja estämiskokeilla. Toivottavin CDR-siirrostettu vasta-aine on sellainen, jossa on vähiten jyrsijän tähteitä, joka kykenee tunnistamaan CD4-antigeenin sellaisella affiniteetilla, joka on saman-15 lainen kuin jyrsijän OKT4A-vasta-aineen affiniteetti.

Taulukko 2

Modifikaatiot CDR-siirrostettuihin kevyt- ja raskasket-juihin 20 Tähteen Jyrsijän tähteiden koko-

Rakenne muutos* naismäärä**__ ·;'·· Kevytketju: LCDR3 38 33,34,49,89 LCDR4 49 33,34,38,89 ! 25 LCDR5 89 33,34,38,49 ! ....: LCDR6 38,49,89 33,34 • · ·

Raskasketju: . . HCDR11 88,91 24,35,47,58,60 *;./ 30 HCDR12 24,88,91 35,37,58,60 *Tähteet on merkitty niiden Kabat-sijaintinumerolla (2). Merkityt tähteet muutetaan jyrsijän tähdesekvenssistä ih-. misen sekvenssin mukaiseksi.

t · * » * $ » | * t 35 **Jyrsijän tähteet viittaavat runkoalueiden tähteisiin, ei CDR:ien tähteisiin.

j so 1 0891 7

Suhteellisen sitomisaffiniteetin määritys CDR-siirrostettujen monoklonaalisten anti-CD4-vas-ta-aineiden suhteelliset sitomisaffiniteetit määritettiin kilpailevalla sitomistestillä (8) käyttäen ihmisen HPB-ALL 5 T-solulinjaa CD4-antigeenin lähteenä ja fluoreskeiinikon-jugoitua jyrsijän OKT4A-vasta-ainetta (F1-OKT4A), jonka sitomisaffiniteetti on tunnettu, merkkiainevasta-aineena. Fl-0KT4A-merkkiainevasta-aineen sitomisaffiniteetti määritettiin suoralla sitomistestillä, jossa kohoavaa määrää 10 Fl-OKT4A-vasta-ainetta inkuboitiin yhdessä HPB-ALL-solujen (5 x 105) kanssa PBSrssä 5 % vasikan sikiön seerumin läsnä ollessa 60 minuuttia 40 °C:ssa. Solut pestiin ja fluoresenssin vahvuus määritettiin FACScan-virtaussytometrillä, joka oli kalibroitu kvantitatiivisilla mikrohelmistandar-15 deilla (Flow Cytometry Standards, Research Triangle Park, NC). Fluoresenssin vahvuus per vasta-ainemolekyyli (F/P-suhde) määritettiin käyttäen mikrohelmiä, joissa oli ennalta määritetty määrä hiiren IgG vasta-aineen sitoutumiskohtia (Simply Cellular Beads, Flow Cytometry Stan-20 dards). F/P on yhtä suuri kuin Fl-OKT4A-vasta-aineella kyllästettyjen helmien fluoresenssin vahvuus jaettuna hei- • « :’·· missä olevilla sitoutumiskohtien määrällä. Sitoutuneen ja : vapaan Fl-0KT4A-vasta-aineen määrä laskettiin solun keski- .*·*: määräisestä fluoresenssin vahvuudesta ja sitoutuneen/va- ·*·*; 25 paan vasta-aineen suhde esitettiin graafisesti sitoutuneen vasta-aineen moolimäärän funktiona. Lineaarisovellutusta käytettiin sitoutumisaffiniteetin määrittämiseksi (kulma- » · · kertoimen absoluuttinen arvo).

. . Kilpailevaa sitoutumista varten lisättiin F1-OKT4A- • « · 30 vasta-aineen ei-kyllästävään määrään kohoavat määrät kil- • · ·;*’ pailevaa vasta-ainetta ja inkuboitiin 5 x 105 HPB-ALL-solun kanssa 200 ul:ssa PBS:ää 5 % vasikan sikiön seerumin läsnä - » · ollessa 60 minuuttia 4 °C:ssa. Solujen fluoresenssin vah-. vuudet mitattiin FACScan-virtaussytometrillä, joka oli i » » * ; 35 kalibroitu kvantitatiivisilla mikrohelmistandardeilla.

► · 51 1 0891 7

Laskettiin sitoutuneen ja vapaan Fl-OKT4A-vasta-aineen konsentraatiot. Kilpailevien vasta-aineiden affiniteetit laskettiin kaavasta (X) - (OKT4A) = (1/Kx) - (1/Ka), jossa Ka on jyrsijän OKT4A-vasta-aineen affiniteetti, Kx on kil-5 pailijan affiniteetti, (X) on kilpailevan vasta-aineen se konsentraatio, jossa sitoutunut/vapaa -sitoutumismäärä on R/2 ja R on maksimaalinen sitoutumis/vapaa -sitoutumismäärä.

Affiniteettitulokset 10 Ihmismäistettyjen vasta-aineiden suhteelliset af- finiteettivakiot määritettiin (kuvio 17, taulukko 3) ja HCDR10:n kanssa yhdistetty LCDR2 säilytti 68 % emovasta-aineen aktiivisuudesta. LCDR2/HCDR5 (taulukko 1) säilytti ainoastaan 13 % jyrsijän vasta-aineen affiniteetista. Nämä 15 tulokset ovat yhtäpitäviä niiden tulosten kanssa, jotka saatiin estämiskokeissa (kuviot 16 a & b). HCDR5:n vertailu HCDR7:n kanssa (kuvio 15) antaa olettaa, että tähde 60, vaikka ei olekaan kriittinen aktiivisuuden kannalta, on suotuisa, kun se muutetaan luovuttajasekvenssin kaltaisek-20 si. Samassa kuviossa voidaan havaita myös kohdassa 44 olevan luovuttajatähteen tuhoisa vaikutus (HCDR4 verrattuna HCDR5:een).

• · · ,* .·' Taulukko 3 | I . : : CDR-siirrostettujen vasta-aineiden suhteelliset affini- | ·*·*: 25 teettivakiot i · · • ·

Vasta-aine- Kilpailijan log kons. Af f initeettiva- rakenteet (pM) 50 % inhibitiossa kio (Kx) » · • · » 30 Jyrsijän 0KT4A 2,4 3 x 109 ”* Kimeerinen •’.‘•I OKT4A 2,9 1,1 x 109 | LCDR2/HCDR10 2,6 2,1 x 109 I X : LCDR2/HCDR5 3,4 0,4 x 109 • · « ’ ! 35 Kimeerinen 0KT3 Ei inhibitiota

Jyrsijän 0KT3 Ei inhibitiota 52 '089 I 7

Toimintatutkimukset

Uskotaan, että CD4-antigeeni, jonka tunnistavat 0KT4A vasta-aine ja sen kimeeriset ja CDR-siirrostetut vastikkeet, ottaa osaa interaktioihin, jotka johtavat 5 CD4-antigeenia sisältävien T-lymfosyyttien biologisiin toimintoihin. Erikoisesti uskotaan, että CD4-antigeeni ottaa osaa sekalymfosyyttireaktioon (MLR) ja perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) kasvuun. Sen osoittamiseksi, että esillä olevan keksinnön mukaisilla 10 CDR-siirrostetuilla vasta-aineilla on todennäköisesti sama biologinen aktiivisuus kuin jyrsijän 0KT4A-vasta-aineella, suoritettiin seuraavat toimintatutkimukset.

MLR:ien inhibitio

Ihmisen PBMC:t eristettiin tiheysgradienttisentri-15 fugaatiolla käyttäen Ficoll'ia ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen DMEM-alustaan, joka sisälsi 1 % vasikan sikiön seerumia (FCS). 96-kuoppaisen kudosviljelymaljan kuhunkin kuoppaan lisättiin 2 x 105 respondoivaa PBMC:tä ja 1 x 105 säteilytettyä (2 Mrad) allogeenista PBMCrtä, jonka j 20 jälkeen lisättiin sarjassa laimennetun puhdistetun anti- CD4 vasta-aineen laimennokset. Soluja viljeltiin 6 vuoro-• * , •'· kautta, pulssileimattiin H-tymidiinillä 24 tuntia ja ke- i · * · I : rättiin. 3H-tymidiinin inkorporaatio mitattiin nestetuike- ; » · · : laskijalla.

j j ’/· 25 Negatiivisena kontrollina käytettiin säteilytettyjä f ! :··· respondoivia soluja säteilytettyjen allogeenisten PBMC:den ;*',· sijasta eikä yhtään vasta-ainetta lisätty. Positiivisena kontrollina suoritettiin koe ilman vasta-aineen lisäystä.

: Kokeessa käytetyt vasta-aineet olivat jyrsijän 0KT4A, ki- t>’./ 30 meerinen 0KT4A ja jyrsijän 0KT4A F(ab')2 fragmentti.

Kokeen tulokset on esitetty kuviossa 18. Sekä ki- V*i meerisellä OKT4A vasta-aineella että jyrsijän 0KT4A vasta- aineella oli samanlainen inhibitio MLR:ien suhteen.

: Kasvun inhibitio

* I I

53 1 0 8 9 1 7 OKT3 (20 ng/ml), jyrsijän monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa CD3-antigeenin T-lymfosyyteissä, im-mobilisoitiin 96-kuoppaisille polystyreenikudosviljelymal-joille 4 tunnin ajan 20 °C:ssa. Maljat pestiin kolme ker-5 taa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 1 x 105 PMBCrtä. Sen jälkeen lisättiin anti-CD4 vasta-aineen sarjalaimennokset. Soluja viljeltiin 72 tuntia, pulssileimattiin 3H-tymidiinillä 24 tuntia ja kerättiin. 3H-tymidiinin inkorporaatio mitattiin 10 nestetuikelaskimella.

Negatiivisena kontrollina kasvu mitattiin sekä 0KT3-vasta-aineen että anti-CD4-vasta-aineiden poissa ollessa. Positiivisena kontrollina kasvu mitattiin ainoastaan 0KT3-vasta-aineen ollessa läsnä. Tässä kokeessa käy-15 tetyt vasta-aineet olivat jyrsijän OKT4A, kimeerinen 0KT4A ja jyrsijän 0KT4A F(ab')2 fragmentti.

Tulokset on esitetty kuviossa 19, joka osoittaa, että kimeerisellä 0KT4A vasta-aineella on oleellisesti sama kyky inhiboida kasvua kuin jyrsijän OKT4A-vasta-ai-20 neella.

Yllä olevat toimintatutkimukset osoittavat, että ” kimeerisellä 0KT4A-vasta-aineella on samanlaiset biologi- • ’.· set ominaisuudet kuin jyrsijän 0KT4A-vasta-aineella. Koska * « » ’ CDR-siirrostetuilla anti-CD4-vasta-aineilla on oleelli- • : * : 25 sesti sama affiniteetti CD4-antigeenia kohtaan kuin ki- ·;··; meerisellä 0KT4A-vasta-aineella ja koska kimeerisellä ;'j*: 0KT4A-vasta-aineella on samat vakiodomeenit kuin CDR-siir- rostetuilla 0KT4A-vasta-aineilla, voidaan odottaa, että ; CDR-siirrostetuilla 0KT4A-vasta-aineilla on samat biologi- 30 set toiminnat kuin jyrsijän 0KT4A-vasta-aineella ja niitä Ί' voidaan näin ollen käyttää terapiassa.

< » •, ’ · · Yhteenveto :t>>: Useita erilaisia CDR-siirrostettuja 0KT4A-vasta- ; aineita on muodostettu. Olennaisesti, jyrsijän 0KT4A-vas- • i >

\ 35 ta-aineen raskas- ja kevytketjujen CDRriä koodittava DNA

108917 54 on istutettu ihmisen KOL-vasta-aineen raskasketjun ja REI-vasta-aineen kevytketjun geenien runkoalueisiin. Nämä variaabelidomeenit on ligoitu DNA:hän, joka koodittaa ihmisen kappakevytketjun ja IgG4:n raskasketjun vakioaluet-5 ta. Tuloksena syntyneitä CDR-siirrostettuja geenejä eks-pressoidaan COS-l-soluissa. Kudosviljelyalustaan erittynyt vasta-aine kerätään, määrä määritetään ELISA-testillä ja niiden kyky sitoutua CD4-positiivisiin soluihin ja kyky estää jyrsijän OKT4A-vasta-aineen sitoutumista testataan.

10 Alunperin suunniteltu CDR-siirrostettu vasta-aine ei kyennyt reagoimaan CD4-antigeenin kanssa. Kevytketjuun tehtiin monia muutoksia, jossa REI-vasta-aineen sekvenssissä olevat kriittiset ihmisen runkoalueen tähteet, jotka tunnistettiin molekyylimallituksella, muutettiin jyrsijän 15 0KT4A-vasta-aineen tähteiksi. Tämä kevytketjun uusi versio LCDR2 kykeni tunnistamaan CD4-antigeenin. Samalla tavalla muutettiin useita raskasketjun ihmisen runkoalueen tähteitä jyrsijän tähteiksi eri yhdistelmissä HCDR2 - HCDR10:ien muodostamiseksi. Useat näistä raskasketjuista kilpailivat 20 yhdessä LCDR2:n kanssa hyvin jyrsijän OKT4A-vasta-aineen kanssa CD4-antigeenista. Tällä hetkellä paras CDR-siirros- • · I tettu OKT4A-vasta-aine on LCDR2Q:n ja HCDR10:n yhdistelmä.

• ’.· Tällä hetkellä ollaan muodostamassa lisäversioita kevyt- : ja raskasket juista, joissa runkoalueen tähteet, jotka ί’·1: 25 aiemmin muutettiin jyrsijän tähteiksi, muutetaan takaisin ·;··· ihmisen tähteiksi. Nämä ihmismäistetymmät CDR-siirrostetut vasta-aineet testataan niiden kyvyn suhteen tunnistaa [ · CD4-antigeeni.

• 9 • « · • 1 • · • · · • · · * · · • > * · * 1 1 • · · ! « » · t > · ! 0891 7

Kirjallisuusviitteet: (1) Kabat et ai., teoksessa Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Ser- 5 vices, 1987.

(2) Wu ja Kabat, J. Exp. Med., 132, 211, 1970.

(3) Oi et ai., PNAS-USA, 80, 825, 1983.

(4) Neuberger, EMBO J., 2, 1373, 1983.

(5) Ochi et ai., PNAS-USA, 80, 6351, 1983.

10 (6) Verhoeyen et ai., Science, 239, 1534, 1988.

(7) Reichmann et ai., Nature, 332, 323, 1988.

(8) Queen et ai., PNAS-USA, 86, 10029, 1989.

(9) Zoller ja Smith, Nuc. Acids Res., 10, 6487, 1982.

(10) Norris et ai., Nuc. Acids Res., l/l, 5103, 1983.

15 (11) Zoller ja Smith, DNA, 3, 479, 1984.

(12) Kramer et ai., Nuc. Acids Res., 1C), 6475, 1982.

(13) Mullis ja Faloona, Meth. Enz., 155, 335, 1987.

(14) Higuchi et ai., Nuc. Acids Res., 16, 7351, 1988.

(15) Ho et ai., Gene, 77, 51, 1989.

20 (16) Ho et ai., teoksessa Engineering Hybridisation • . Restriction Genes without the Use of Restriction Enzymes: • · « · .* Gene Splicing by Overlap Extension.

* · · ·.;* (17) Horton et al., Gene, 77, 61, 1989.

* (18) Bolivar et al., Gene, 2, 95, 1977.

* * · — • .* 25 (19) Chang et al., Nature, 275, 615, 1978.

'·”* (20) Itakura et al., Science, 198, 1056, 1978.

V *' (21) Goedell et al., Nature, 281, 544, 1979.

(22) Goedell et al., Nuc. Acids Res., 8, 4057, 1980.

:*,· (23) Siebenlist et al., Cell, 20, 269, 1980.

* · 30 (24) Stinchcomb et al., Nature, 282, 39, 1979.

,·, (25) Kingsman et al., Gene, 7, 141, 1979.

- ’’ ’·’ (26) Tschemper et al., Gene, 19, 157, 1980.

I ’···* (27) Jones, Genetics, 85, 12, 1977.

(28) Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 2073, 1980.

* · ·;··· 35 (29) Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149, 1968.

108917 (30) Holland et al., Biochemistry, 17, 4900, 1978.

(31) Kruse ja Patterson, teoksessa Tissue Culture, Academic Press, 1973.

(32) Fiers et ai., Nature, 273, 113, 1978.

5 (33) Maniatis et ai., teoksessa Molecular Cloning: A Labo ratory Manual, 2. painos, Cold Spring Harbor Press, 1990.

(34) Scopes, teoksessa Protein Purification, Springer Ver-lag, NY, 1982.

(35) Lefkovite ja Pernis, teoksessa Immunological Methods, 10 osat I ja II, Academic Press, NY, 1979 ja 1981.

(36) Bernhard et ai., teoksessa Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY, 1984.

(37) Mack, teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. painos, 1982.

15 (38) Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979.

(39) Sanger et al., PNAS-USA, 74, 5463, 1977.

(40) Jones et al., Nature, 321, 522, 1986.

(41) Whittle et al., Protein Engineering, 1, 499, 1987.

(42) Kozak et al., J. Mol. Biol., 196, 947, 1987.

20 (43) Birnboim ja Doly, Nuc. Acids Res., 14, 1513, 1979.

(44) Gluzman, Cell, 23, 175, 1981.

! (45) Lopata et al., Nuc. Acids Res., 14, 5707, 1984.

* · (46) Kunkel, PNAS-USA, 82, 488, 1985.

(47) Chotia ja Lesk, J. Mol. Biol., 96^, 4, 901, 1987.

...,: 25 (48) Baranov et al., Gene, 84, 2, 463, 1989.

I · · * t 1 i · * · · * · · • « · • # • · t I · · • ·

• t I

• I I

• I

I 1 · · • · » · · • · » · · · • ·

Claims (16)

55 108917

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vas-ta-ainemolekyylin valmistamiseksi, joka kykenee sitoutu-5 maan CD4-antigeeniin ja joka käsittää (i) yhdistetyn ras-kasketjun ja komplementaarisen kevytketjun, jolloin mainitun yhdistetyn raskasketjun vaihtelevalla alueella runko-alueet ovat pääasiassa peräisin ihmisvasta-aineesta (vastaanottaja) ja ainakin tähteet 23, 24, 26 - 35, 49 -10 65 ja 95 - 102 (Kabatin numerointisysteemin mukaan) vas taavat hiiren monoklonaalisen vasta-aineen OKT4A (luovuttaja) vastaavia tähteitä, kuten piirustusten kuviossa 3 on esitetty, tai (ii) yhdistetyn kevytketjun ja komplementaarisen 15 raskasketjun, jolloin mainitun yhdistetyn kevytketjun vaihtelevalla alueella runkoalueet ovat pääasiassa peräisin ihmisvasta-aineesta (vastaanottaja) ja ainakin tähteet 24 - 34, 49 - 56 ja 89 - 97 (Kabatin numerointisysteemin mukaan) vastaavat hiiren monoklonaalisen vasta-aineen 20 0KT4A (luovuttaja) vastaavia tähteitä, kuten piirustusten " ” kuviossa 4 on esitetty, • · · ·*. tunnettu siitä, että viedään ensimmäinen f · t • l : DNA-sekvenssi, joka koodittaa edellä kohdassa (i) määri- 1 :*·*: teltyä yhdistettyä raskasketjua tai edellä kohdassa (ii) 25 määriteltyä kevytketjua, sopivien ylävirran ja alavirran elementtien säätelyn alaisuuteen; transformoidaan isän-täsolu ensimmäisellä DNA-sekvenssillä; ja viljellään . . transformoitua isäntäsolua niin, että tuotetaan edellä • · · • t * määriteltyä vasta-ainetta. » · ·;·’ 30

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistetyn raskasketjun täh-I teet 6 ja 48 lisäksi vastaavat luovuttaj a-vasta-aineen | .* , vastaavia tähteitä.

| ’· 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että yhdistetyn raskasketjun täh- 56 108917 teet 71, 73 ja 79 lisäksi vastaavat luovuttaja-vasta-ai-neen vastaavia tähteitä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistetyn raskasket- 5 jun mikä tahansa tähteistä 57, 58, 60, 88 ja 91 tai mikä tahansa näiden tähteiden yhdistelmä vastaa luovuttaja-vas-ta-aineen vastaavia tähteitä.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistetyn ras- 10 kasketjun vastaanottajatähteet vastaavat ihmisen KOL-ras-kasketjun vastaavia tähteitä, kuten piirustusten kuviossa 5 on esitetty.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että komplementaarinen ke- 15 vytketju on yhdistetty kevytketju, jolloin mainitun yhdistetyn kevytketjun vaihtelevalla alueella runkoalueet ovat pääasiassa peräisin ensimmäisestä vasta-aineesta (vastaanottaja) ja ainakin tähteet 24 - 34, 49 - 56 ja 89 - 97 (Kabatin numerointisysteemin mukaan) vastaavat hiiren mo- 20 noklonaalisen vasta-aineen OKT4A (luovuttaja) vastaavia tähteitä, kuten piirustusten kuviossa 4 on esitetty. • '_·*

7. Patenttivaatimukset 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistetyn kevytketjun tähde I ·*·’; 89 lisäksi vastaa luovuttaja-vasta-aineen vastaavaa täh- ....: 25 dettä.

,··/, 8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että yhdistetyn kevytket-. , jun vastaanottajatähteet vastaavat ihmisen REI-kevytketjun *; ’· vastaavia tähteitä, kuten piirustusten kuviossa 6 on esi- ···’ 30 tetty.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen mene- » · - telmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi viedään .· . toinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa vasta-aineen kevyt- ’· " tai raskasketjua, joka on komplementaarinen ensimmäiselle ' ' 35 ketjulle, sopivien ylävirran ja alavirran elementtien sää- i 57 1 0891 7 j telyn alaisuuteen; ja transformoidaan isäntäsolu sekä en- ! simmäisellä että toisella DNA-sekvenssillä. j

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, | tunnettu siitä, että toinen DNA-sekvenssi koodit- ! 5 taa yhdistettyä vasta-aineketjua.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA ovat läsnä samassa vektorissa.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että sekvenssit ovat samojen ylävirran ja/tai alavirran elementtien säätelyn alaisuudessa.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekvenssit ovat eri ylävirran ja/tai alavirran elementtien säätelyn alaisuudessa.

14. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA ovat läsnä eri vektoreissa.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on CHO-20 solu.

• · ·;**: 16. Nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, • · · j että se koodittaa missä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 8 määriteltyä yhdistettyä vasta-aineket jua. i i · · ! i i \\ j * » • * j 58 1 089 1 7