KR101386376B1 - 인간 ｃｄ22 특이성 항체 및 이들의 치료학적, 진단학적 사용 - Google Patents

인간 ｃｄ22 특이성 항체 및 이들의 치료학적, 진단학적 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 마우스 단일클론 항체 유래의 CDR을 적어도 하나 포함하는 항체분자에 관한 것이다. 또한, CDRs중의 적어도 하나가 변형된 CDR인 것을 특징으로 하는 CDR 이식 항체에 관한 것이다. 또한, 항체분자의 사슬들을 인코드하는 DNA 서열, 벡터, 형질전환된 세포 및 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 치료에의 항체분자의 사용에 관한 것이다.

Description

인간 ＣＤ22 특이성 항체 및 이들의 치료학적, 진단학적 사용{ANTIBODIES SPECIFIC FOR HUMAN CD22 AND THEIR THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC USES}
본 발명은 B 림프구(lymphocyte) 항원인 CD22의 항원 결정부위(determinants)에 대한 특이성을 갖는 항체분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체분자의 치료적 사용 및 항체분자 생산방법에 관한 것이다.
천연의 항체분자에는 2개의 중쇄(heavy chains)와 2개의 경쇄(light chains)가 있다. 각 중쇄와 각 경쇄는 그 N-터미널 말단에 가변영역(variable domain)을 갖는다. 각각의 가변영역은 3개의 상보성결정부위들(complementarity determining regions:CDRs)과 교번하는 4개의 구조형성부위들(framework regions:FRs)로 구성된다. 가변영역의 잔기들(residues)은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 넘버링된다. 이 시스템은 Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "Kabat 등(상기 참조)")에 설명되어 있다. 상기의 넘버링 시스템은 다른 설명이 있는 경우를 제외하고는 본 명세서에서 사용된다.
Kabat 잔기 지정은 아미노산 잔기들의 직선형 넘버링과 항상 직접 일치하는 것은 아니다. 실제의 직선형 아미노산 서열은 엄격한 Kabat 넘버링에서 보다 더 적게 또는 부가적으로 아미노산들을 포함할 수 있고, 이는 기본적 가변영역 구조의 구조성분(구조형성부위 또는 CDR)의 단축 또는 구조성분내로의 삽입에 상응하는 것이다. 주어진 항체에 대한 잔기들의 정확한 Kabat 넘버링은 “표준”Kabat 넘버로된 서열과 항체의 서열상의 상동성 있는 잔기들을 배열, 대조하므로써 결정될 수 있다.
중쇄 가변영역의 CDRs은 Kabat 넘버링에 따라 잔기 31~35(CDR-H1), 잔기 50~65(CDR-H2)와 잔기 95~102(CDR-H3)에 위치한다.
경쇄 가변영역의 CDRs은 Kabat 넘버링에 따라 잔기 24~34(CDR-L1), 잔기 50~56(CDR-L2)과 잔기 89~97(CDR-L3)에 위치한다.
CDR-이식된 항체들의 구조는 유럽 특허출원 EP-A-0239400에 설명되어 있고, 이는 마우스의 단일클론 항체(Mab)가 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위특이성 돌연변이 유발에 의해 인간 면역글로블린의 가변영역의 구조형성부위에 이식되는 방법을 개시하고 있다. CDRs은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성부위에 의해 지탱되는 비교적 짧은 펩티드 서열이다.
CDR-이식에 의한 마우스 단일클론 항체를 인간화시키기 위한 초기의 연구는 NP와 같은 합성 항원들을 인식하는 단일클론 항체로 수행되었다. 그러나, 라이소자임(lysozyme)을 인식하는 마우스 Mab와 인간 T-세포에 있는 항원을 인식하는 쥐 Mab가 CDR-이식에 의해 인간화되는 예들은 각각 Verhoeyen 등(Science, 239, 1534~1536, 1988)과 Riechmann 등(Nature, 332, 323~324, 1988)에 의해 설명되어 있다.
Riechmann 등은 CDRs 단독의 도입(Kabat 등(상기 참조)과 Wu 등, J. Exp. Med., 132, 211~250, 1970)에 의해 정의된 바와 같음)으로는 CDR-이식된 생성물 내에서 만족스런 항원결합 활성을 제공하기에 충분치 못함을 알게 되었다. 많은 구조형성 잔기들은 이들이 공여체의 구조형성부위의 잔기들과 상응되도록 하기 위하여 변경되어야 함을 발견하였다. 변경될 필요가 있는 구조형성 잔기들을 선택하기 위해 제안된 기준은 국제특허출원번호 WO 90/07861에 설명되어 있다.
CDR-이식된 항체들을 논의하는 다수의 리뷰(reviews)들이 간행되었고, 이들은 Vaughan 등(Nature Biotechnology, 16, 535~539, 1998)을 포함한다.
악성 림프종(lymphomas)은 종양(neoplasms)의 다양한 그룹이다. 대부분의 경우는 노인에게서 발생한다. 비호지킨 림프종(Non-Hodgkins Lymphoma:NHL)은 현재 미국에서 200,000~250,000명의 환자에게 영향을 미치고 있는 질환이다. 이 질환은 매년 약 55,000건의 새로운 케이스가 발생하는 비율로 증가하며, 두번째로 빠르게 증가하는 암이다. 이 발병은 단순히 인구의 연령 증가 및 알려진 위험 요인에의 노출 증가에 의해 단순히 고려될 수 있는 것 보다 더 큰 비율로 증가하고 있다.
림프종의 분류는 복잡하고, 최근의 수십년간 발전되어 왔다. 1994년에, 개정 유럽-미국 림프종(Revised European-American Lymphoma:REAL) 분류체계가 도입되었다. 이 분류는 B세포(가장 흔히 확인됨), T세포 및 분류불가능한 세포 유래의 림프종을 협정 서브타입(agreed subtypes)으로 체계화한다. 매일의 실제에서, 이들의 일반적인 조직학적 외형에 기초하여, NHLs을 저등급, 중간등급 및 고등급 카테고리로 그룹핑하는 것은 이들의 임상적인 행동을 넓게 반영한다.
NHL은 주로 림프절에 영향을 미치나, 환자들 개인별로는, 상기 종양이 간, 이자, 골수, 폐, 장 및 피부와 같은 다른 해부부위와 관련이 있을 수 있다. 일반적으로 상기 질환은 림프절의 크기가 고통없이 증대되는 것으로 나타난다. 비록 실제로 모든 기관의 1차 림프종이 보고되었으나, 외결절 림프종(extranodal lymphoma)은 가장 자주 장에 영향을 미친다. 전신 징후로는 발열, 발한, 피로 및 체중손실을 포함한다.
최근까지, 완전히 질환의 해부학적 범주에 기초하여, 앤 아버 스테이징 시스템(Ann Arbor staging system)이 NHL에 있어서 주요한 치료 결정인자였다. 이러한 정보는 연령, 혈청 락테이트 디히드로게나제 수준 및 성능상태를 포함하여, 부가적인 징후 지표들을 포함시키므로써 결정될 수 있다. 비록 그렇다 하더라도, 종양의 해부학적 및 면역학적 서브타입과 함께, 앤 아버 스테이징 시스템에 대한 지식은, 여전히 치료의 주요한 결정인자이다.
저등급 NHL은 8~10년의 정중(median) 환자 생존성을 갖는, 무통성의 과정을 갖는다. 비록 국소 질환의 방사능법 및 전신 징후용 화학치료법이 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있을지라도, 현재 이용가능한 치료법에 의하여 생존은 거의 영향을 받지 않는다. 재발된 질환을 위해 조합 치료법이 사용될 수 있다. 중간 질환, 특히 고등급의 질환은 극히 공격성이고, 파종하는 경향이 있다. 이러한 등급의 질환은 응급치료를 필요로 한다. 방사성 치료법은 매우 덩어리성(bulky) 질환의 환자를 치료하는 데에 유용한 요소가 될 수 있다. 많은 다른 화학치료 요법이 개발되어 왔으며, 환자들의 반 이상에서 장기간 무질환 생존이 얻어질 수 있다. 줄기세포(stem cell)의 지지에 의한 고투여량 치료법이 재발성 또는 불응성 질환을 가진 환자들에게 처음 도입되었으나, 현재는 위험이 적은 질환을 가진 환자를 위한 1차 치료법으로 점점 사용되고 있다. 공격성 치료접근법에 대한 최근 몇년간의 증가적 경향은, 일반적으로 고령이고 비교적 쇠약한 많은 NHL 환자에 대하여, 그리고 치료의 유독성과 각 환자의 질환의 개별적인 예후와 매치시킬 필요성에 의해 균형이 맞추어져야 한다.
좀 더 효과적이고 좀 더 내성이 있는 향상된 치료가 필요하다. 최근 소개된 제제는 새로운 세포독성 약물을 포함하고, 점차 조합물내에 포함되며, 항체에 근거한 치료법을 포함한다. 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphoma)은 B세포 림프종의 범위를 포함한다. 따라서, B세포 항원은 항체 치료를 위한 적합한 타겟이 된다.
CD22는 시알로어드헤신(sialoadhesins)이라 불리는 시알산(sialic acid) 결합단백질 족에 속하는 135kDa의 막 당단백질이다. 이것은 B세포 발생 초기에 세포질에서 검출되고, IgD와 동시에 세표표면에 나타나며, 대부분의 성숙한 B세포에서 발견된다. B세포가 활성화되면 발현이 증가한다. CD22는 분화말기에 상실되며, 일반적으로 형질세포(plasma cell)에는 존재하지 않는 것으로 보고되었다. 따라서, 이 내면화(internalising) 항원은 전-B세포 및 성숙한 B세포의 표면에 존재하나, 줄기세포 또는 형질세포에는 존재하지 않는다.
인간의 CD22에는 2종의 동형(isoform)이 존재한다. 지배적인 형태(CD22β)는 세포외부 영역에 7개의 면역글로불린-유사(Ig-like) 도메인을 포함한다. CD22α 변이체는 Ig-유사 도메인 4가 없고, 세포질 도메인이 잘려진 형태를 가질 수 있다. 단핵구, 호중구(neutrophil), 림프구 및 적혈구에 대한 CD22의 결합을 차단하는 항체는, 첫번째 또는 두번째 Ig-유사 도메인내에 결합하는 것이 관찰되었다.
CD22의 세포질 도메인은, B세포 항원 수용체의 결합에 따라 티로신이 인산화되며, 및 Lyk, Syk 및 포스파티딜 이노시톨 3-키나제와 결합한다. CD22의 기능은 B세포 활성화 역치(threshold)를 하위조절(down-modulation)하는 것이다. 이것은 또한 적당한 시알로당접합체(sialoglycoconjugates)를 포함하는 세포와의 결합을 통해 세포결합을 매개할 수 있다.
CD22는 NHL, 급성 림프모구백혈병(acute lymphoblastic leukaemia:B-ALL), 만성 림프모구백혈병(chronic lymphocytic leukaemia:B-CLL) 및 특히 급성 비림프구 백혈병(acute non-lymphocytic leukaemia:ANLL)을 포함하는, 대부분의 B세포 백혈병 및 림프종에서 발현된다.
CD22에 대한 단일클론 항체가 종래기술에 설명되어 있다. WO 98/41641은 VH44 및 VL100 위치에 시스테인 잔기를 갖는 재조합 항-CD22 항체를 설명한다. WO 96/04925는 항-CD22 항체 LL2의 VH 및 VL 영역을 설명한다. 미국특허 제5686072호는 항-CD22 및 항-CD19 면역독소(immunotoxins)의 조합을 설명한다. WO 98/42378은 B세포 악성종양의 치료를 위한 나(naked) 항-CD22 항체의 사용을 설명한다.
많은 항체에 기초한 치료법이 최근에 라이센스 받았으며, 예로써 RITUXAN(CD20 특이성 비표지 키메라 인간 γ1(+mγ1V-영역))이 있고, 또한 상기 질환에 대한 임상시험중에 있다. 이것들은 보체(complement)-매개 또는 ADCC-매개에 의한 B세포 사멸, 또는 131I 또는 90Y와 같은 방사성소핵체의 사용에 의존하는데, 이들 방법은 제조와 사용에 있어서 임상학자와 환자에게 여러가지 문제들을 안겨주고 있다. 반복적으로 사용될 수 있고, 쉽고 효율적으로 생산될 수 있는, NHL의 치료를 위한 항체분자가 필요하다. 또한 인간에서, CD22에 대해 친화력이 높고, 면역유도성이 낮은 항체분자가 필요하다.
본 발명은 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 마우스 단일클론 항체 유래의 CDR을 적어도 하나 포함하는 항체분자를 제공하고자 한다. 또한, CDRs중의 적어도 하나가 변형된 CDR인 것을 특징으로 하는 CDR 이식 항체, 및 항체분자의 사슬들을 인코드하는 DNA 서열, 벡터, 형질전환된 세포 및 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 치료에 사용될 수 있는 항체분자를 제공하고자 한다.
첫째 관점에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대한 특이성을 갖는 항체분자를 제공하고, 상기 중쇄의 가변영역은 CDR-H1에 대해 도1에서 H1(SEQ ID NO:1)로서 나타낸 서열, CDR-H2에 대해 도1에서 H2(SEQ ID NO:2)로서 나타낸 서열, 또는 잠재적 글리코실화 부위가 제거된 H2, 또는 위치 60(Kabat 넘버링 시스템에 따름)에 있는 리신 잔기가 대체 아미노산으로 치환된 H2, 또는 위치 60에서 상기 글리코실화 부위와 반응성 리신 모두가 제거된 H2, 또는 CDR-H3에 대해 도1에서 H3(SEQ ID NO:3)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
본 발명의 첫째 관점의 항체분자는 중쇄 가변영역에 대해 H1, H2 및 H3(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3)으로부터 선택된 최소한 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게는 항체분자는 중쇄 가변영역내에 최소한 두개의 CDRs을 포함하고, 더욱 바람직하게는 3개 모두의 CDRs을 포함한다.
본 발명의 둘째 관점에서, 경쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대한 특이성을 갖는 항체분자가 제공되고, 상기 경쇄의 가변영역은 CDR-L1에 대해 도1에서 L1(SEQ ID NO:4)로서 나타낸 서열, CDR-L2에 대해 도1에서 L2(SEQ ID NO:5)로서 나타낸 서열, 또는 CDR-L3에 대해 도1에서 L3(SEQ ID NO:6)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
본 발명의 둘째 관점의 항체분자는 경쇄 가변영역에 대해 L1, L2 및 L3(SEQ ID NO:4, SEQ IN NO:5 및 SEQ IN NO:6)으로부터 선택된 최소한 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게는 항체분자는 경쇄 가변영역내에서 최소한 두개의 CDRs을 포함하고, 더욱 바람직하게는 3개 모두의 CDRs을 포함한다.
본 발명의 첫째 및 둘째 관점의 항체분자들은 바람직하게는 상보성 경쇄 또는 상보성 중쇄를 각각 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 첫째 또는 둘째 관점의 항체분자는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 가변영역은 CDR-H1에 대해 도1에서 H1(SEQ ID NO:1)로서 나타낸 서열, CDR-H2에 대해 도1에서 H2(SEQ ID NO:2)로서 나타낸 서열, 잠재적 글리코실화 부위가 제거된 H2, 또는 위치 60(Kabat 넘버링 시스템에 따름)에 있는 리신 잔기가 대체 아미노산으로 치환된 H2, 또는 위치 60에서 상기 글리코실화 부위와 반응성 리신 모두가 제거된 H2, 또는 CDR-H3에 대해 도1에서 H3(SEQ ID NO:3)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함하고, 그리고 상기 경쇄의 가변영역은 CDR-L1에 대해 도1에서 L1(SEQ ID NO:4)로서 나타낸 서열, CDR-L2에 대해 도1에서 L2(SEQ ID NO:5)로서 나타낸 서열, 또는 CDR-L3에 대해 도1에서 L3(SEQ ID NO:6)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
상기의 SEQ ID NOS:1~6 및 도1에서 나타낸 CDRs은 마우스 단일클론 항체 5/44로부터 유래된 것이다.
마우스 5/44 항체의 가변영역의 전체 서열은, 도2에 경쇄를 SEQ ID NO :7로서, 도3에 중쇄를 SEQ ID NO :8로서 나타내었다. 상기 마우스 항체는 또한 하기의 "공여체 항체" 또는 "쥐의 단일클론 항체"로 명명된다.
본 발명의 첫째 또는 둘째 관점의 첫번째의 선택적인 바람직한 구체예는, 각각 도2(SEQ ID NO :7) 및 도3(SEQ ID NO :8)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변영역 서열을 갖는 마우스 단일클론 항체이다. 5/44의 경쇄 불변영역(constant region)은 카파(kappa)이고, 중쇄 불변영역은 IgG1이다
두번째의 선택적인 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫째와 둘재 관점들 중의 어느 것에 따르는 항체는 키메릭 마우스/인간 항체분자이고, 이는 여기에서 키메릭 VR165 항체분자로 표현된다. 키메릭 5/44 항체분자는 마우스 단일클론 항체 5/44(SEQ ID NOS:7 및 8)의 가변영역과 인간 불변영역을 포함한다. 바람직하게는, 키메릭 5/44 항체분자는 선택적으로 위치 241의 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된, 경쇄내에 인간 C 카파영역(Hieter 등, Cell, 22, 197~207, 1980;Genebank accession NO. J00241)과 중쇄내에 인간 감마 4 영역(Flanagan 등, Nature, 300, 709~713, 1982)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, 잠재적 글리코실화 부위 서열이 제거되고, CD22 항원에 대해 키메라 5/44의 예상밖의 증가된 친화력을 가지며, 바람직하게는 CDR-H2로서 H2'로 주어진 서열(SEQ ID NO :13)을 갖는, H2'를 포함하는 중쇄를 포함한다.
선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, CDR-H2내의 노출된 위치에 존재하며, 접합제(conjugation agents)와 반응하여 항원 결합 친화력이 감소될 가능성이 있는 것으로 여겨지는 위치 60의 리신 잔기가 대체 아미노산으로 치환되어 보존성 치환이 생긴, H2"를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CDR-H2는 H2"로서 나타낸 서열(SEQ ID NO :15)을 갖는다.
선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, 잠재적 글리코실화 부위와 위치 60의 리신 잔기 모두가 대체 아미노산으로 치환된, H2'''를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CDR-H2는 H2'''로서 나타낸 서열(SEQ ID NO :16)을 갖는다.
세번째의 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫째와 둘째 관점들 중의 어느 것에 따르는 항체는 CDR-이식 항체분자이다. 여기에서 사용된 용어 “CDR-이식 항체분자”는, 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체 항체(예, 인간항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 구조형성부위내로 이식된 공여체 항체(예, 쥐(murine) 단일클론 항체)로부터 유래된 하나 이상의 CDRs(원한다면, 변형된 CDR을 포함)을 포함하는 항체분자를 뜻한다.
바람직하게는, 이러한 CDR-이식 항체는 상기의 하나 이상의 공여체 CDRs 뿐만 아니라 인간 수용체 구조형성부위를 포함하는 가벽영역을 갖는다.
CDRs이 이식될 때, 어떤 적절한 수용체 가변영역 구조형성부위 서열은 마우스, 영장류 및 인간 구조형성부위를 포함하는, CDRs이 유도되는 공여체 항체의 류/형(class/type)을 고려하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 인간 구조형성부위의 예들은 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(Kabat 등(상기 참조) )이다. 예를 들면, KOL과 NEWM은 중쇄를 위해 사용 가능하고, REI는 경쇄를 위해 사용 가능하며, EU, LAY 및 POM은 중쇄와 경쇄 모두를 위해 사용 가능하다. 또는, 인간 생식세포(germline) 서열이 사용될 수 있다. 경쇄를 위한 바람직한 구조형성부위는 도5에 도시된 인간 생식세포 하위그룹 서열(DPK9+JK1)(SEQ ID NO :17)이다. 중쇄를 위한 바람직한 구조형성부위는 도6에 도시된 인간 하위그룹 서열(DP7+JH4)(SEQ ID NO :21)이다.
본 발명의 CDR-이식 항체에 있어서, 수용체 항체로서는 공여체 항체의 사슬들과 상동성이 있는 사슬을 갖는 것을 사용함이 바람직하다. 수용체 중쇄와 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 원한다면 상이한 사슬들로부터 유래된 구조형성부위를 갖는 혼성 사슬을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에 있어서, 구조형성부위는 수용체 항체의 구조형성부위와 완전히 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 특수한 잔기들이 수용체 사슬 류 또는 형을 위해 더 자주 존재하는 잔기들로 전환될 수 있다. 또는, 수용체 구조형성부위내에서 선택된 잔기들은 공여체 항체내에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기, 또는 공여체 항체내에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기로의 보존성 치환이 된 잔기에 상응하도록 전환될 수 있다. 이러한 전환은 공여체 항체의 친화력을 회복하기에 필요한 최소한으로 유지되어야만 한다. 전환될 필요가 있는 수용체 구조형성부위내 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO 91/09967에 설명되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 CDR-이식 항체분자에서, 수용체 경쇄가 인간 하위그룹 DPK9+JK1 서열(도5에 도시)(SEQ ID NO:17(DPK9) + SEQ ID NO:18(JK1))을 가지고 있다면, 수용체 경쇄의 구조형성부위는 (Kabat 등(상기 참조)에 따라) 위치 2, 4, 37, 38, 45 및 60에 공여체 잔기들을 포함하며, 위치 3에 공여체 잔기를 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 CDR-이식 항체분자에서, 수용체 중쇄가 인간 DP7+JH4 서열(도6에 도시)(SEQ ID NO:21(DP7) + SEQ ID NO:22(JH4))을 가지고 있다면, 수용체 중쇄의 구조형성부위는 하나 이상의 공여체 CDRs 이외에, (Kabat 등(상기 참조)에 따라) 위치 1, 28, 48, 71 및 93에 공여체 잔기들을 포함하며, 위치 67 및 69에 공여체 잔기를 추가적으로 포함할 수 있다.
공여체 잔기들은 공여체 항체 즉, CDR들이 최초로 유래된 항체 유래의 잔기들이다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, CD22 항원에 대해 키메라 5/44의 친화력을 증가시키기 위하여 잠재적 글리코실화 부위 서열이 제거된 H2', 바람직하게는 CDR-H2로서 H2'로 주어진 서열(SEQ ID NO :13)을 갖는, H2'를 포함하는 중쇄를 포함한다.
선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, CDR-H2내의 노출된 위치에 존재하며, 접합제(conjugation agents)와 반응하여 항원 결합 친화력이 감소될 가능성이 있는 것으로 여겨지는 위치 60의 리신 잔기가 대체 아미노산으로 치환된 H2"를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CDR-H2는 H2"로서 나타낸 서열(SEQ ID NO :15)을 갖는다.
선택적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 항체는 가변영역이 CDR-H2(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)로서, 잠재적 글리코실화 부위와 위치 60의 리신 잔기 모두가 대체 아미노산으로 치환된 H2'''를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CDR-H2는 H2'''로서 나타낸 서열(SEQ ID NO :16)을 갖는다.
본 발명의 항체분자는 다음을 포함할 수 있다: 전장(full length) 중쇄와 경쇄를 갖는 완전한 항체분자; Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편과 같은 그들의 단편; 경쇄 또는 중쇄 단량체 또는 이량체; 단일쇄 항체, 예로서 중쇄와 경쇄 가변영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv. 유사하게, 중쇄와 경쇄 가변영역은 적절하게 다른 항체 영역들과 결합될 수 있다.
본 발명의 항체분자는 그것에 효과인자(effector) 또는 보고인자(reporter) 분자가 부착될 수 있다. 예를 들면, 중금속 원자를 킬레이트하기 위하여 마크로사이클(macrocycle), 또는 리신(ricin)과 같은 독소가 공유 가교구조(covalent bridging structure)에 의해 결합될 수 있다. 또는, 재조합 DNA 기술의 과정이, Fc 단편(CH2, CH3 및 힌지(hinge) 도메인), 전체 면역글로불린 분자의 CH2 및 CH3 도메인들, 또는 CH3 도메인이 효소 또는 독소 분자와 같은 기능적인 비면역글로불린 단백질로 대체되거나 또는 이들에 상기 기능적인 비면역글로불린 단백질이 펩티드 결합에 의해 부착된, 항체분자를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체분자는 결합력이 적어도 0.85×10-10M인 것이 바람직하고, 적어도 0.75×10-10M인 것이 좀 더 바람직하고, 적어도 0.5×10-10M인 것이 가장 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 항체분자는 경쇄 가변영역 5/44-gL1(SEQ ID NO :19) 및 중쇄 가변영역 5/44-gH7(SEQ ID NO :27)을 포함한다. 이들 경쇄 및 중쇄의 가변영역의 서열은 각각 도5 및 도6에 도시하였다.
또한, 본 발명은 CD22에 대하여 증가된 친화력을 가지는 본 발명의 항체분자의 변이체(variant)에 관한 것이다. 이러한 변이체들은 CDRs을 돌연변이법(Yang 등, J. Mol. Biol., 254, 392~403, 1995), 사슬 셔플링법(chain shuffling)(Marks 등, Bio/Technology, 10, 779~783, 1992), E. coli의 돌연변이 유발(mutator) 종 사용법(Low 등, J. Mol. Biol., 250, 359~368, 1996), DNA 셔플링법(Patten 등, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724~733, 1997), 파아지 발현법(phage display)(Thompson 등, J. Mol. Biol., 256, 77~88, 1996) 및 유성 PCR법(sexual PCR)(Crameri 등, Nature, 391, 288~291, 1998)을 포함하는 다수의 친화도 증진법에 의해 얻어질 수 있다. Vaughan 등(상기 참조)은 친화도 증진을 위한 상기 방법들을 설명하고 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 항체분자의 중쇄 및/또는 경쇄(들)를 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다.
바람직하게는, 상기 DNA 서열은 본 발명의 항체분자의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩한다.
본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 화학 공정에 의해 제조된 합성 DNA, cDNA, 게놈 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열들을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터는 본 발명의 항체분자의 경쇄와 중쇄를 각각 인코딩하는 두개의 DNA 서열을 포함한다.
벡터 제조를 위한 일반적인 방법, 트랜스팩션법(transfection) 및 배양방법들은 당업자 들에게는 잘 알려져 있다. 이점에 관하여, 참고문헌은 "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York 및 the Maniatis Manual produced by Cold Sping Harbor Publishing이 있다.
본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA 서열들은 당업자들에 잘 알려진 방법들에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열들은 결정된 DNA 서열들로부터 또는 상응하는 아미노산 서열들을 기초로 하여 원하는 대로 합성 가능하다.
수용체 구조형성 서열을 코딩하는 DNA는 당업자들에게 널리 이용가능하고, 이들의 공지된 아미노산 서열들을 기초로 하여 쉽게 합성할 수 있다.
*분자생물학의 표준기술들은 본 발명의 항체분자를 코딩하는 DNA서열을 제조하는 데 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열들은 올리고뉴클레오티드 합성기술을 사용하여 전체 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 위치특이적 돌연변이유발법과 PCR(polymerase chain reaction) 기술은 적절히 사용될 수 있다.
어떠한 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. E. coli와 같은 박테리아 및 다른 미생물 시스템이 Fab 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편, 및 단일쇄 Fvs과 같은 단일쇄 항체 단편과 같은 항체 단편의 발현을 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 포유류와 같은 진핵 숙주세포 발현시스템이 완전한 항체분자를 포함하는 더 큰 항체분자들의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 적당한 포유류 숙주세포들은 CHO, 골수종(myeloma) 또는 융합세포주(hybridoma)를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 그리고 항체분자의 분리를 포함하는 본 발명에 따르는 항체분자의 제조방법을 제공한다.
항체분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 숙주세포를 트랜스펙션하는데 사용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄 양쪽 모두를 포함하는 생성물의 제조를 위하여, 세포주는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 첫번째 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 두번째 벡터로 된 두개의 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 또는, 단일 벡터가 사용될 수 있는데, 이 벡터는 경쇄와 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 서열들을 포함한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여, 본 발명의 항체분자를 포함하는 치료 조성물 또는 진단 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체분자를 혼합하는 것을 포함하는 치료 또는 진단용 조성물의 제조방법을 제공한다.
항체분자는 치료 또는 진단용 조성물 내에서 유일한 활성성분이거나, 또는 예를 들면, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체와 같은 다른 항체성분들, 또는 크산틴과 같은 비항체 성분들을 포함하는 다른 활성성분들과 함께 사용 가능하다.
약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질환상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01~50mg/kg, 바람직하게는 0.1~20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체분자가 투여되는 투여량은 치료될 상태의 성질, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 항체분자가 질환 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다.
투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다. 만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2~10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2~15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 투여량을 제공할 필요가 있다.
*또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 안되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄 산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)(예를 들면, 환괴(bolus) 주사 또는 연속적 주입)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예, WO 98/20734 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 어떤 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 데 하이포스프레이(hypospray)가 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
조성물내의 활성성분은 항체분자일 수 있다. 그 자체로, 위장관내에서 분해에 민감할 수 있다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되면, 조성물은, 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 위장관으로부터 흡수된 항체를 방출시키는 제제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약제학적으로 허용가능한 담체의 완벽한 논의는 레밍톤 약제학지(Remington's Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Company, N.J, 1991)를 이용할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 치료법의 사용에 의해 투여될 수 있다는 사실 또한 예견된다. 이를 위하여, 적절한 DNA 성분의 조절하에서 항체분자의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열들이 환자에게 도입되고, 그 결과 항체 사슬은 DNA 서열로부터 발현되고, 현장(in situ) 조립된다.
또한, 본 발명은 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환을 치료하는데 사용하기 위하여 본 발명의 항체분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에, 본 발명에 따른 항체분자를 사용하는 것을 제공한다.
본 발명의 항체분자는 인간 또는 동물체내에 존재하는 CD22를 발현하는 세포의 수준을 감소시키는 것이 필요한 어떤 치료법에 사용될 수 있다. 이들 CD22를 발현하는 세포는 체내에서 순환할 수 있고, 또는 체내의 특정 부위에서 바람직하지 못한 고수준으로 존재할 수도 있다. 예를 들면. CD22를 발현하는 세포 수준의 증가 현상은 B세포 림프종 및 백혈병에 존재할 수 있다. 본 발명의 항체분자는 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체분자는 악성 림프종 및 백혈병, 가장 바람직하게는 NHL의 치료에 사용된다.
또한, 본 발명은 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 위험으로부터 고통받는 또는 위험에 있는 인간 또는 동물 환자들의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체분자의 유효량을 환자들에게 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 항체분자는 진단, 예를 들면, CD22를 발현하는 세포와 관련된 질환상태의 생체내 진단 및 예견에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 마우스 단일클론 항체 유래의 CDR을 적어도 하나 포함하는 항체분자; CDRs중의 적어도 하나가 변형된 CDR인 것을 특징으로 하는 CDR 이식 항체; 항체분자의 사슬들을 인코드하는 DNA 서열, 벡터, 형질전환된 세포; 및 CD22를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 치료에 사용될 수 있는 항체분자가 제공된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 다음의 실시예들에서 단지 예시를 위한 목적으로 더욱 설명된다:
도1은 마우스 단일클론 항체 5/44(SEQ ID NOS: 1~6)의 CDRs의 아미노산 서열을 나타낸다.
도2는 마우스 단일클론 항체 5/44의 경쇄 가변영역의 전체 서열을 나타낸다.
도3은 마우스 단일클론 항체 5/44의 중쇄 가변영역의 전체 서열을 나타낸다.
도4는 CDR-H2내의 글리코실화 부위 및 반응성 리신의 제거를 위한 전략도이다.
도5는 5/44의 경쇄 서열에 대한 이식 설계도이다. DPK-9는 인간 생식세포 수용체 구조형성부위 서열이다. 수직선은 마우스와 인간 잔기들 사이의 차이를 나타낸다. 하선표시된 서열들은 이식형에서 유보된 공여체 잔기들이다. CDRs은 블루로 표시된다(DPK-9에서 생략). 이식형 gL1은 6개의 공여체 구조형성부위 잔기들을 가지며, gL2는 7개의 공여체 구조형성부위 잔기들을 갖는다.
도6은 5/44의 중쇄 서열에 대한 이식 설계도이다. DP7은 인간 생식세포 수용체 구조형성부위 서열이다. 수직선은 마우스와 인간 잔기들 사이의 차이를 나타낸다. 하선표시된 서열들은 이식형에서 유보된 공여체 잔기들이다. CDRs은 블루로 표시된다(DP7에서 생략). 이식형 gH4 및 gH6은 6개의 공여체 구조형성부위 잔기들을 가지며, 이식형 gH5 및 gH7은 4개의 공여체 구조형성부위 잔기들을 갖는다.
도7은 벡터 pMRR14 및 pMRR10.1을 나타낸다.
도8은 키메라 5/44 돌연변이의 바이오코어 분석 결과를 나타낸다.
도9는 5/44 gH1 및 gL1 유전자 집합체(assembly)를 위한 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도10은 중간 벡터 pCR2.1(544gH1) 및 PCR2.1(544gL1)을 나타낸다.
도11은 이식체를 더 만들기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 카세트를 나타낸다.
도12는 형광 표지된 마우스 5/44 항체 및 이식된 변이체간의 경쟁분석을 나타낸다.
도13은 이식된 중쇄 및 경쇄의 전장 DNA 및 단백질 서열을 나타낸다.
실시예 1: 후보항체의 제조
CD22에 대한 항체의 후보는 다음의 선택 범주를 이용하여 하이브리도마로부터 선택되었다: 다우디 세포(Daudi cells)에 결합, 다우디 세포에서 내부화, 말초혈 단핵구(PBMC)에 결합, PBMC에서 내부화, 친화력(10-9M 초과), 마우스 γ1 및 생성율. 5/44는 바람직한 항체로서 선택되었다.
실시예 2: 키메라 5/44 항체분자의 유전자 클로닝 및 발현
5/44 하이브리도마 세포의 제조 및 그로부터의 RNA 제조
하이브리도마 5/44는 인간 CD22 단백질로 마우스를 면역화하는 통상의 하이브리도마 기술에 의하여 제조되었다. RNA는 RNEasy 키트(Qiagen, Crawley, UK; Catalogue No. 74106)를 사용하여 5/44 하이브리도마 세포로부터 준비하였다. 얻어진 RNA는 다음과 같이 cDNA로 역전사하였다.
NHL 종양에서의 CD22 의 분포
염색의 발생 및 분포를 조사하기 위하여, 5/44 항-CD22 단일클론 항체를 사용하여 면역조직화학 연구를 수행하였다. 종양의 B세포 영역을 확인하기 위하여, 대조군 항-CD20 및 항-CD79a 항체가 본 연구에 포함되었다.
총 50개의 종양이 연구되었고, 이들은 워킹 포뮬레이션(Working Formulation) 및 REAL 분류 시스템을 사용하여 다음과 같이 분류되었다:
* 7 B 림프모구 백혈병/림프종(고등급/1)
* 4 B-CLL/소림프구 림프종(저등급/A)
* 3 임파형질세포형(lymphoplasmacytoid)/면역종(Immunocytoma)(저등급/A)
* 1 외투막 세포(Mantle cell)(중등급/F)
* 14 소포센터림프종(Follicle center lymphoma)(저등급~중등급/D)
* 13 비만성 대형 세포 림프종(Diffuse large cell lymphoma)(중등급~고등급/G, H)
* 6 미분류(K)
* 2 T 세포 림프종
40개의 B세포 림프종은 0.1㎍/㎖의 5/44 항체로 처리시 CD22 항원에 대해 양성이었고, 6개는 상기 농도를 0.5㎍/㎖으로 증가시켰을 경우에 양성이었다. 나머지 2개의 B세포 종양은 0.1㎍/㎖에서 음성이었기 때문에, 조직이 불충분하여 더 높은 농도로 시험할 필요가 있었다. 그러나, 5/44보다 염색이 더 강하게 되는 다른 셀테크(Celltech) 항-CD22 항체인 6/13으로 시험시, 48개의 B세포 림프종 모두가 CD22에 대하여 양성으로 염색되었다.
따라서, CD22 항원은 B세포 림프종에서 폭넓게 발현되고, 따라서 NHL의 면역치료에 적합한 타겟으로 제공된다.
5/44 V H 및 V L 의 PCR 클로닝
전체 RNA중의 mRNA의 단일가닥 cDNA 복사체를 제조하기 위하여, 역전사 효소를 사용하여 5/44 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 코드하는 cDNA 서열을 합성하였다. 그 다음, 이것을 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 쥐의 V-영역 서열을 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다.
a) cDNA 합성
cDNA를 다음의 시약을 포함하는 20㎕의 반응액에서 합성하였다: 50mM의 트리스-HCl pH8.3, 75mM의 KC1, 10mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol), 3mM의 MgC12, 각각 0.5mM의 디옥시리보뉴클레오시드3인산, 20유니트의 RNAsin, 75ng의 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머, 2㎍의 5/44 RNA 및 200유니트의 몰로니쥐 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사 효소. 42℃에서 60분간 반응시킨 후, 상기 반응액을 95℃에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
b) PCR
cDNA 분액에 대하여 중쇄 및 경쇄에 특이적인 프라이머의 조합을 사용하여 PCR을 수행하였다. 시그널 펩티드의 보존서열과 어닐링(annealing)하도록 고안된 디제너레이트(Degenerate) 프라이머 풀(pool)을 정방 프라이머(forward primers)로 사용하였다. 이들 서열은 모두 차례로, 5' 말단으로부터 7번째 뉴클레오티드에서 시작되는 제한부위(VL SfuI; VH HindⅢ), 얻어지는 mRNA들의 최적의 번역을 위한 서열 GCCGCCACC(SEQ ID NO:50), 개시코돈 및 알려진 마우스 항체의 리더 펩티드 서열(Kabat 등, 원하는 면역 단백질의 서열, 제5판, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health)에 기초한 20~30개의 뉴클레오티드를 포함한다.
3' 프라이머는 항체의 구조형성부위 4 J-C 연결부를 포함하도록 고안되었고, BsiWI 효소에 대한 제한부위를 포함하여, VL PCR 단편의 클로닝을 용이하게 한다. 중쇄의 3' 프라이머는 항체의 J-C 연결부를 포함하도록 고안된 혼합물이다. 상기 3' 프라이머는 ApaI 제한부위를 포함하여 클로닝을 용이하게 한다. 상기 프라이머의 3' 부위는 알려진 마우스 항체에서 발견되는 서열(Kabat 등, 1991, 상기 참조)에 기초한 혼합된 서열을 포함한다. 상기의 프라이머 조합체는 VH 및 VL에 대한 PCR 산물을 적당한 발현벡터(하기 참조)에 직접 클로닝시켜, 키메라(마우스-인간) 중쇄 및 경쇄를 생성시킬 수 있고, 이들 유전자가 포유류 세포에서 발현되어 원하는 동형 키메라 항체를 생성하도록 할 수 있다.
PCR을 위한 반응액(100㎕)은 다음과 같다. 각 반응액은 10mM의 트리스-HCl pH 8.3, 1.5mM의 MgCl2, 50mM의 KCl, 0.01%(w/v)의 젤라틴, 0.25mM의 각각의 데옥시리보뉴클레오시드3인산, 10pmole의 5' 프라이머 혼합물, 10pmole의 3' 프라이머, 1㎕의 cDNA 및 1유니트의 Taq 폴리머라제가 함유되어 있다. 상기 반응액을 95℃에서 5분간 반응시킨 다음, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30사이클 수행하였다. 그 다음, 각 반응액의 분액을 아가로즈겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 분석하였다.
중쇄 V-영역에 대하여, 증폭된 DNA 산물은 시그널 펩티드 풀 대신 구조형성부위 I의 시작점 내에 어닐링하는 프라이머 풀을 사용하였을 때만 얻어졌다. 상기 단편들은 DNA 서열분석 벡터에 클로닝되었다. 상기 DNA 서열을 분석, 번역하여 아미노산 서열을 유추하였다. 이와 같이 유추된 서열을 실험적으로 결정된 N-터미널 단백질 서열을 참조하여 확인하였다. 도2와 도3은 각각 마우스 단일클론 5/44의 성숙한 경쇄 및 중쇄 V-영역의 DNA/단백질 서열을 나타낸다.
c) PCR 단편의 분자 클로닝
쥐 V-영역 서열을 발현벡터 pMRR10.1과 pMRR14(도7)에 클로닝하였다. 이들 벡터는 인간 카파 경쇄와 감마-4 중쇄에 대한 불변영역 유전자를 인코드하는 DNA를 포함하는, 각각 경쇄와 중쇄의 발현을 위한 벡터들이다. VL 영역을 SfuI 및 BsiWI 제한부위를 사용하여, 서열분석 벡터로부터 절개, 연결시키므로써 발현벡터에 서브-클로닝하여, 플라스미드 pMRR10(544cL)를 제조하였다. 중쇄 DNA는 시그널 펩티드를 도입하기 위하여 5' 프라이머를 사용, PCR에 의해 증폭되었고, 이는 클로닝 전략으로는 얻어지지 않기 때문에, 다른 인하우스 하이브리도마(162라 함) 유래의 마우스 중쇄 항체 리더(leader)를 사용하였다. 5' 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: 5'- GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGC
AGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG-3'(SEQ ID NO:51).
역방 프라이머(reverse primer)는 원래의 VH 유전자 클로닝에서 사용했던 것과 동일하였다. 얻어진 PCR 산물은 효소 HindIII 및 ApaI로 절단하여, 서브-클로닝되었고, 이것의 DNA 서열은 확인되었고, 플라스미드 pMRR14(544cH)를 생성하였다. 상기 발현벡터 2개 모두를 CHO 세포에 일시적으로 동시-형질도입(co-transfection)시켜 키메라 c5/44 항체를 생산하였다. 이것은 제조사의 프로토콜(InVitrogen: Life Technology, Groningen, The Netherlands. Catalogue NO. 11668~027)에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 시약을 사용하여 수행되었다.
글리코실화 부위 및 반응성 리신의 제거
아미노산 서열 N-Y-T(도3)를 갖는, 잠재적 N-연결 글리코실화 부위 서열이 CDR-H2에서 발견되었다. 5/44와 이것의 단편(Fab 포함)에 대한 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏팅 및 겔의 탄수화물 염색법을 통하여, 상기 글리코실화 부위가 실제로 글리코실화되었음을 밝혔다(데이터 생략). 또한, 리신 잔기가 CDR-H2내의 노출 위치에서 발견되었으며, 상기 리신 잔기는 항체가 결합될 수 있는 어떤 물질과 결합하기 위한 추가적인 부위를 제공하므로써 항체의 결합력을 감소시킬 가능성이 있었다.
도4에 나타낸 바와 같이, 글리코실화 부위 및/또는 반응성 리신을 제거하기 위하여, CDR-H2 서열내에 아미노산 치환을 도입하는 데에 PCR 전략이 사용되었다. 돌연변이 N55Q, T57A 또는 T57V를 인코드하는 정방 프라이머들이 글리코실화 부위를 제거하는 데에 사용되었고(도4), 치환체 K60R를 포함하는 제4 정방 프라이머가 반응성 리신을 제거하기 위해 제조되었다(도4). 구조형성부위 4 역방 프라이머가 각각의 이들 PCR 증폭에 사용되었다. PCR 산물은 효소 XbaI 및 ApaI로 절단, pMRR14(544cH)내로 삽입되어(pMRR14(544cH) 또한 XbaI 및 ApaI로 절단), 이들 돌연변이를 인코드하는 발현벡터를 생성하였다. N55Q, T57A 및 T57V 돌연변이는 콘센서스(consensus) N-X-T/S로부터 아미노산 서열을 변경하므로써 글리코실화 부위를 제거하는 반면, K60R 돌연변이는 잠재적 반응성 리신을, 유사한 양전하를 띄는 잔기인 아르기닌으로 대체한다. 그 결과 생기는 cH 변이체 플라스미드를 cL 플라스미드와 함께 동시-형질도입시켜, 키메라 항체 변이체를 발현시켰다.
키메라 유전자의 활성 평가
CHO 세포내로 일시 형질도입한 후, 상기 키메라 유전자의 활성을 평가하였다.
c) 바이오코어 분석( BiaCore analysis )에 의한 결합상수( affinity constants)의 결정
키메라 5/44 또는 이들의 글리코실화 부위 또는 이들의 반응성 리신이 제거된 이것의 변이체의 결합력은 CD22-mFc 구조체의 결합에 대한 BIA 기술을 사용하여 조사되었다. 그 결과를 도8에 나타내었다. 모든 결합 측정은 BIAcore(등록상표) 2000 장치(파마시아 바이오센서 AB, Uppsala, Sweden)로 수행되었다. 상기 분석은 고정화된 항-마우스 Fc를 통하여 CD22-mFc의 포착에 의하여 수행되었다. 항체는 가용상(soluble phase)이었다. 샘플, 표준액, 대조군(50ul)을 고정화된 항-마우스 Fc에 대하여 주입한 후, 가용상의 항체를 주입하였다. 각 사이클 후, 표면을 30ul/min의 속도로 50ul의 40mM HC1로 재발생시켰다. 동역학 분석(kinetic analysis)은 BIAevaluation 3.1 소프트웨어(파마시아)를 사용하여 수행되었다.
구조체 T57A에서 글리코실화 부위를 제거한 결과, 키메라 5/44에 비하여 약간 더 빠른 속도 개시(on-rate) 및 약간 더 느린 속도 종결(off-rate)을 나타내었으며, 약 5배의 결합력이 증대되었다. N55Q 돌연변이는 결합력에 영향이 없었다. 이러한 결과는 탄수화물 자체의 제거가 분명히 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미하므로(N55Q가 변경되었기 때문에), 예상밖의 결과였다. 결합력의 증대는 단지 T57A 변경에만 관찰되었다. 하나의 가능성 있는 설명은, 탄수화물의 존재에도 불구하고, 위치 57에서 트레오닌이 트레오닌의 알라닌으로의 전환시 제거된 결합에 부정적인 영향을 미친다는 것이다. 작은 사이즈의 알라닌이 중요하고, 트레오닌의 부정적인 영향이 그것의 사이즈와 관련이 있다는 가설은 T57V 돌연변이를 사용하여 얻어진 결과로부터 뒷받침된다: 위치 57에서 발린으로의 대체는 유용하지 않다(결과 생략).
* K60R 돌연변이에 의한 리신의 제거는 결합력에 중립적인 영향을 미치는데, 즉, 아르기닌의 도입이 결합력을 손상시키지 않고, 잠재적 반응부위를 제거한다. 따라서, 글리코실화 부위의 제거 및 이들의 반응성 리신의 제거를 위한 돌연변이는 모두 인간화 디자인에 포함되었다.
실시예 3: 5/44의 CDR -이식
5/44 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부위에 대한 유전자의 분자 클로닝 및 이들을 키메라 (마우스/인간)5/44 항체를 제조하는 데에 사용하는 것은 상기한 바와 같다. 마우스 5/44 VL 및 VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도2 및 도3(SEQ ID NOS: 7 및 8)에 각각 나타내었다. 본 실시예는 Adair 등의 방법(W091/09967)에 따라, 인간 구조형성부위에 5/44 항체의 CDR-이식을 하여, 인간에서 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 설명한다.
5/44 경쇄의 CDR -이식
인간 서브-그룹 I 카파 경쇄 V 영역의 컨센서스 서열과 단백질 서열 비교를 한 결과, 64% 서열 동일성을 나타내었다. 결과적으로, CDR-이식성 경쇄를 제조하기 위하여, 선택된 수용체 구조형성부위가 인간의 VK 서브-그룹 I 생식세포 O12, DPK9 서열의 것과 대응하였다. 구조형성부위 4 수용체 서열은 인간의 J-영역 생식세포 서열 JK1에서 유래되었다.
쥐의 5/44의 구조형성부위의 아미노산 서열과 수용체 서열의 비교를 도5에 나타내었고, 이는 공여체와 수용체 사슬간에는 27개의 서열이 다른 것을 나타낸다. 각 위치에서, 포장(packing) 또는 VH/VL 계면에서의 영향을 통하여 직접 또는 간접적으로 항원 결합에 기여하는 가능성 있는 쥐의 잔기를 밝히기 위한 분석을 실시했다. 만약, 쥐의 잔기가 사이즈, 극성 또는 전하의 측면에서 인간 잔기와 중요하게 그리고 충분히 차이가 있다고 가정한다면, 그 쥐의 잔기는 유보되었다. 이러한 분석에 기초하여, SEQ ID NO : 19 및 SEQ ID NO : 20(도5)으로 나타낸 서열을 갖는 CDR-이식성 경쇄의 2가지 버전이 제조되었다.
*5/44 중쇄의 CDR -이식
5/44 중쇄의 CDR-이식은 경쇄에 대하여 설명한 전략과 같은 것을 사용하여 수행되었다. 5/44 중쇄의 V-영역은 서브-그룹 I에 속하는 인간의 중쇄와 상동성(70% 서열 상동성)이 있는 것이 발견되었고, 따라서, 인간 서브-그룹 I 생식세포 구조형성부위 VH1-3, DP7의 서열이 수용체 구조형성부위로서 사용되었다. 구조형성부위 4 수용체 서열은 인간의 J-영역 생식세포 서열 JH4에서 유래되었다.
5/44 중쇄와 구조형성부위의 비교를 도6에 나타내었고, 5/44 중쇄는 수용체 서열의 22개의 위치에서 다름을 알 수 있었다. 이들중의 어느 것이 항원과 결합하는 데에 기여할 수 있는지에 대한 분석 결과, 5개 버전의 CDR-이식성 중쇄가 제조되었고, 이는 SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26 및 SEQ ID NO : 27(도6)의 서열을 갖는다.
이식 서열을 위한 유전자의 제조
이식 서열 gH1과 gL1을 인코드하도록 유전자가 고안되었고, 일련의 겹치는 올리고뉴클레오티드가 고안, 제조되었다(도9). CDR-이식성 V-영역 유전자를 제조하기 위하여, PCR 어셈블리(assembly) 기술이 사용되었다. 100㎕의 반응액에는 10mM 트리스-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.001% 젤라틴, 0.25mM 각각의 데옥시리보뉴클레오시드3인산, "내부(internal)" 프라이머(T1, T2, T3, B1, B2, B3) 각각 1pmole, "외부(external)" 프라이머(F1, R1) 각각 10pmole 및 1 유니트의 Taq 폴리머라제(AmpliTaq, Applied BioSystems, catalogue no, N808-0171)가 함유되어 있다. PCR 사이클 조건은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30사이클 수행하였다. 그 다음, 반응 생성물을 1.5% 아가로즈겔 상에서 전기영동, 절개 및 QIAGEN 스핀 컬럼(QIAquick gel 추출키트, cat no. 28706)을 사용하여 회수하였다. DNA를 30㎕의 부피로 용출하였다. 그 다음, gHl과 gLl DNA의 분액(aliquot)(1㎕)을 프로토콜에 따라 InVitrogen TOPO TA 클로닝 벡터 pCR2.1 TOPO(cat. no. K4500-01)에 클로닝하였다. 이 비발현벡터는 다수의 클론들의 서열분석을 용이하게 하기 위한 클로닝 중간체로서의 역할을 하는 것이다. 벡터 특이성 프라이머를 사용한 DNA 서열분석은 gH1과 gLl을 포함하는 플라즈미드 pCR2.1(544gH1)과 pCR2.1(544gL1)(도10)을 갖는 올바른 클론을 동정하는데 사용되었다.
올리고뉴클레오티드 카세트 치환법(cassette replacement method)이 인간화된 이식체 gH4, 5, 6과 gL2를 제조하는데 사용되었다. 도11은 올리고뉴클레오티드 카세트의 디자인을 나타낸다. 각 변이체를 제조하기 위하여, 벡터(pCR2.1(544gH1) 또는 pCR2.1(544gL1))를 도시된 제한효소(중쇄는 XmaI/SacII로, 경쇄는 XmaI/BstEII)로 절단하였다. 큰 벡터 단편은 아가로즈로부터 겔정제하여, 올리고뉴클레오티드 카세트에 연결하는 데에 사용하였다. 이들 카세트는 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드(도11)로 구성되며, 12.5mM 트리스-HCl pH7.5, 2.5mM MgCl2, 25mM NaCl, 0.25mM 디티오에리스리톨을 포함하는 200㎕의 부피내에, 0.5pmoles/㎕의 농도로 함께 혼합하였다. 어닐링은 수조(500ml)에서 3분간 95℃로 가열하므로써 수행되었고, 그 후 반응액을 실온까지 서서히 식혔다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 카세트는 연결하기 전에 물로 10배 희석한 후, 적절하게 절단된 벡터에 연결하였다. 그 결과 생기는 플라즈미드 pCR2.1(5/44-gH4-7)와 pCR 2.1(5/44-gL2)에 대한 올바른 서열을 확인하기 위하여, DNA 서열분석을 하였다. 그 다음, 확인된 이식 서열은 발현벡터 pMRR14(중쇄)과 pMRR10.1(경쇄)내로 서브클로닝하였다.
CDR -이식 서열의 CD22 결합 활성
이식 변이체를 인코드하는 벡터들을 원래의 키메라 항체 사슬들과 함께 다양한 조합으로 CHO 세포에 동시-형질도입하였다. 결합 활성은, 라모스 세포(Ramos cells)(표면 CD22를 발현하는 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 림프모구 인간 세포주, ATCC로부터 입수) 결합에 대하여 원래의 마우스 5/44 항체의 결합과 경쟁시키는, 경쟁 분석으로 비교되었다. 이 분석법은 세포 표면 CD22에 대한 이들의 결합력에 있어서, 이식형들을 비교할 수 있는 가장 좋은 방법으로 여겨졌다. 결과를 도8에 나타내었다. 도8에 나타낸 바와 같이, 이식형간에는 거의 차이가 없었으며, 이들 모두가 쥐의 부모에 대하여 키메라형보다 더 효과적으로 경쟁하였다. CDR-H3(gH5 및 gH7)의 말단에 3개의 부가적인 인간 잔기들의 도입은 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
최소한의 쥐의 잔기로 조합된 이식형인 gL1gH7이 선별되었다. 경쇄 이식형 gL1은 6개의 공여체 잔기를 갖는다. 잔기 V2, V4, L37 및 Q45는 중요한 잠재적 포장 잔기이다. 잔기 H38은 VH/VL 계면에 존재한다. 잔기 D60은 CDR-L2에 가까이 존재하는 표면 잔기이고, 항원 결합에 직접적으로 기여할 수 있다. 이들 잔기중에서, V2, L37, Q45 및 D60은 다른 서브-그룹 유래의 인간 카파 유전자의 생식세포 서열에서 발견된다. 중쇄 이식형 gH7은 4개의 공여체 구조형성부위 잔기(잔기 R28은 CDR-이식에서 사용되는 구조적 정의(se Adair 등(1991, W091/09967))하에 CDR-H1의 일부로 여겨짐)를 갖는다. 잔기 E1 및 A71은 CDR에 가까이 존재하는 표면 잔기이다. 잔기 I48은 잠재적 포장 잔기이다. 잔기 T93은 VH/VL 계면에 존재한다. 이들 잔기중 E1 및 A71은 인간 서브-그룹 I의 다른 생식세포 유전자에서 발견된다. 잔기 I48은 인간 생식세포 서브-그룹 4에서 발견되고, T73은 인간 생식세포 서브-그룹 3에서 발견된다.
벡터에 의해 제공되는 불변영역 유전자내의 대략적인 인트론 위치를 포함하여, 경쇄와 중쇄의 전장 DNA 및 단백질 서열을 도13에 나타내었고, 각각 경쇄에 대하여는 SEQ ID NO : 29 및 SEQ ID NO : 28, 중쇄에 대하여는 SEQ ID NO : 31 및 SEQ ID NO : 30으로 나타내었다.
이들 경쇄와 중쇄 유전자를 인코드하는 DNA를 이들 벡터로부터 절단하였다. 중쇄 DNA는 5' HindⅢ 부위에서 절단되었으며, 5' 평활 말단(blunt end)을 만들기 위하여 E. coli DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편(Klenow fragment)으로 처리하였다. 3' EcoRI 부위에서의 절단 결과, 중쇄 단편을 얻었고, 이를 아가로스 겔에서 분리하였다. 같은 방식으로, 5' SfuI 부위가 평활화되고, 3' EcoRI 부위를 가진 경쇄 단편을 제조하였다. 상기 단편 모두를 DHFR 기초의 발현 벡터에 클로닝하였으며, CHO 세포의 안정한 세포주를 제조하는 데에 사용하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. SEQ ID NO:28로 나타낸 서열의 잔기 21~239를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:30으로 나타낸 서열의 잔기 20~466을 포함하는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  2. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:28로 나타낸 서열의 잔기 21~239로 구성되는 경쇄 및 SEQ ID NO:30으로 나타낸 서열의 잔기 20~466으로 구성되는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  3. SEQ ID NO:28로 나타낸 서열의 잔기 21~239를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:30으로 나타낸 서열의 잔기 20~467을 포함하는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  4. 제 3항에 있어서, SEQ ID NO:28로 나타낸 서열의 잔기 21~239로 구성되는 경쇄 및 SEQ ID NO:30으로 나타낸 서열의 잔기 20~467로 구성되는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  5. 포유류 세포 내에서 SEQ ID NO:29의 발현에 의한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:31의 발현에 의한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  6. 제 5항에 있어서, 포유류 세포 내에서 SEQ ID NO:29의 발현에 의한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 및 SEQ ID NO:31의 발현에 의한 아미노산 서열로 구성되는 중쇄를 포함하는, 인간 CD22에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  7. 제 1항에 따른 항체분자의 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 DNA 서열.
  8. 제 7항에 따른 DNA 서열을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
  9. 제 8항에 따른 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제 1항에 따른 항체분자의 제조방법으로서, 상기 항체분자를 인코드하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서 상기 항체분자의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 DNA 서열이 포함된 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 상기 항체분자를 분리하는 것을 포함하는, 항체분자의 제조방법.
  11. 제 5항에 따른 항체분자의 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 DNA 서열.
  12. 제 11항에 따른 DNA 서열을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
  13. 제 12항에 따른 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제 5항에 따른 항체분자의 제조방법으로서, 상기 항체분자를 인코드하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서 상기 항체분자의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 DNA 서열이 포함된 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 상기 항체분자를 분리하는 것을 포함하는, 항체분자의 제조방법.
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