PL218433B1 - Cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego CD22, sekwencja DNA, wektor, komórka gospodarza, kompozycja, ich zastosowania terapeutyczne i sposoby wytwarzania - Google Patents

Cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego CD22, sekwencja DNA, wektor, komórka gospodarza, kompozycja, ich zastosowania terapeutyczne i sposoby wytwarzania

Info

Publication number
PL218433B1
PL218433B1 PL373277A PL37327703A PL218433B1 PL 218433 B1 PL218433 B1 PL 218433B1 PL 373277 A PL373277 A PL 373277A PL 37327703 A PL37327703 A PL 37327703A PL 218433 B1 PL218433 B1 PL 218433B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
antibody molecule
cheese
sequence
gly
Prior art date
Application number
PL373277A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373277A1 (pl
Inventor
Andrew George Popplewell
Simon Peter Tickle
Heather Margaret Ladyman
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9935990&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL218433(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of PL373277A1 publication Critical patent/PL373277A1/pl
Publication of PL218433B1 publication Critical patent/PL218433B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego CD22 - determinanty antygenowej antygenu limfocytów B, sekwencja DNA kodująca łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub ich kombinację cząsteczki przeciwciała, odpowiedni wektor, komórka gospodarza, kompozycja, ich zastosowania terapeutyczne i sposoby wytwarzania.
W naturalnej cząsteczce przeciwciała są dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie. Każdy łańcuch ciężki i każdy łańcuch lekki ma na swoim końcu N domenę zmienną. Każda domena zmienna składa się z czterech regionów zrębowych (FR, od ang. framework region), występującymi zamiennie z trzema regionami determinującymi dopasowanie (CDR, od ang. complementarity determining regions). Reszty w domenach zmiennych konwencjonalnie numeruje się według systemu opracowanego przez Kabat i wsp. System ten jest przedstawiony w Kabat i wsp., 1987, w Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (podawany dalej jako „Kabat i wsp. (jak wyżej)”). Ten system numeracji jest stosowany w niniejszym opisie o ile nie zaznaczono inaczej.
Oznaczenie reszt Kabat nie zawsze odpowiada bezpośrednio liniowej numeracji reszt aminokwasowych. Rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasowa może zawierać mniej albo dodatkowe aminokwasy niż dokładna numeracja Kabat, odpowiadające skróceniu albo wstawieniu składnika strukturalnego, czy to regionu zrębowego, czy CDR, do podstawowej struktury domeny zmiennej. Prawidłową numerację Kabat reszt można ustalić dla danego przeciwciała przez dopasowanie reszt homologicznych w sekwencji przeciwciała do „standardowej” sekwencji z numeracją Kabat.
CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego znajdują się w miejscu reszt 31-35 (CDR-H1), reszt 50-65 (CDR-H2) i reszt 95-102 (CDR-H3) zgodnie z numeracją Kabat.
CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego znajdują się w miejscu reszt 24-34 (CDR-L1), reszt 50-65 (CDR-L2) i reszt 89-97 (CDR-L3) zgodnie z numeracją Kabat.
Konstrukcja przeciwciał z przeszczepionymi CDR jest opisana w europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0239400, które ujawnia proces, w którym CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego są przeszczepione do regionów zrębowych domen zmiennych ludzkiej immunoglobuliny przez ukierunkowaną mutagenezę przy użyciu długich oligonukleotydów. CDR określają swoistość wiązania antygenu przez przeciwciała i są stosunkowo krótkimi sekwencjami peptydowymi znajdującymi się w regionach zrębowych domen zmiennych.
Najwcześniejsze prace nad humanizowaniem przeciwciał monoklonalnych przez przeszczepianie CDR prowadzono na przeciwciałach monoklonalnych rozpoznających syntetyczne antygeny, takie jak NP. Jednakże przykłady, w których mysie przeciwciało monoklonalne rozpoznające lizozym i szczurze przeciwciało monoklonalne rozpoznające antygen na ludzkich komórkach T były humanizowane przez przeszczepienie CDR zostały opisane, odpowiednio, przez Verhoeyen i wsp. (Science, 239, 1534-1536, 1988) oraz Riechmann i wsp. (Nature, 332, 323-324, 1988).
Riechmann i wsp., stwierdzili, że przeniesienie samych CDR (zdefiniowanych przez Kabat (Kabat i wsp. (jak wyżej) oraz Wu i wsp., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nie było wystarczające dla dostatecznej aktywności wiązania antygenu w produkcie z przeszczepionymi CDR. Stwierdzono, że musi być zmienionych kilka reszt zrębowych, tak aby odpowiadały one resztom w regionie zrębowym dawcy. Proponowane kryteria dla wyboru, które reszty zrębowe należy zmienić są opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 90/07861.
Opublikowano wiele prac przeglądowych dyskutujących przeciwciała z przeszczepionymi CDR, łącznie z Vaughan i wsp. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Chłoniaki złośliwe to zróżnicowana grupa nowotworów. W większości przypadków występują u starszych ludzi. Chłoniak nieziarniczy (NHL, od ang. Non-Hodgkins Lymphoma) to choroba, która dotyka obecnie 200000 do 250000 pacjentów w USA. Jest to drugi nowotwór o najszybszym tempie przyrostu w USA, przybywając z szybkością około 55000 nowych przypadków na rok. Występowalność tej choroby rośnie w tempie, które jest większe niż można wytłumaczyć podniesieniem wieku populacji i wystawianiem na działanie znanych czynników ryzyka.
Klasyfikacja chłoniaków jest skomplikowana i ewoluowała w ostatnich dziesięcioleciach. W 1994 wprowadzono zrewidowaną europejsko-amerykańską klasyfikację chłoniaków (REAL, od Revised European-American Lymphoma). Ta klasyfikacja organizuje chłoniaki z komórek B (najczęściej zidentyfikowane), komórek T i niesklasyfikowanego pochodzenia do zgodnych podtypów. W praktyce
PL 218 433 B1 codziennej grupowanie NHL na kategorie niższego, średniego i wyższego stopnia złośliwości na podstawie ich ogólnego wyglądu histologicznego szeroko odzwierciedla ich zachowanie kliniczne.
NHL dotyka głównie węzłów limfatycznych, ale u poszczególnych pacjentów, nowotwór obejmuje inne miejsca anatomiczne, takie jak wątroba, śledziona, szpik kostny, płuca, jelito i skórę. Choroba często objawia się jako bezbolesne powiększenie węzłów limfatycznych. Chłoniak pozawęzłowy najczęściej dotyka jelita, jakkolwiek udokumentowane zostały pierwotne chłoniaki w zasadzie wszystkich narządów. Ogólnoustrojowe objawy obejmują gorączkę, pocenie się, zmęczenie i utratę wagi.
Do niedawna, system ustalania stadium Ann Arbor, oparty w całości na zakresie anatomicznym choroby, był głównym wyznacznikiem terapii przy NHL. Informacja ta może być uściślona poprzez włączenie dodatkowych wskaźników prognostycznych, włączając w to wiek, poziomy dehydrogenazy mleczanowej w surowicy i status czynnościowy. Nawet wówczas, wiedza z systemu ustalania stadium Ann Arbor, łącznie z histologicznym i immunologicznym podtypem nowotworu jest głównym wyznacznikiem leczenia.
NHL niskiego stopnia złośliwości ma niebolesny przebieg, ze średnią przeżywalności pacjentów od 8 do 10 lat. Na przeżywalność ma niewielki wpływ dostępna obecnie terapia, jakkolwiek napromieniowanie miejscowej choroby i chemioterapia dla objawów ogólnoustrojowych poprawia jakość życia pacjentów. Chemioterapię łączoną można zachować dla choroby nawracającej. Choroba pośredniego stopnia złośliwości, a w szczególności choroba wysokiego stopnia jest niezwykle agresywna z tendencją do rozsiewania. Choroba tego stopnia złośliwości wymaga natychmiastowego leczenia. Radioterapia może być przydatnym składnikiem leczenia u pacjentów z bardzo rozległą chorobą. Stosuje się bardzo różne tryby chemioterapii, a długotrwałe przeżycie wolne od choroby można uzyskać u ponad połowy pacjentów. Wysokodawkową terapię ze wspomaganiem przez komórki macierzyste wprowadzono wyjściowo u pacjentów z nawracającą albo oporną na leczenie chorobą, ale teraz coraz częściej znajduje miejsce na pierwszej linii leczenia pacjentów z niskim ryzykiem. Tendencja ostatnich lat stosowania coraz bardziej agresywnych podejść terapeutycznych musi być równoważona ze względu na generalnie starszy wiek i stosunkowe osłabienie wielu pacjentów z NHL oraz potrzebę dopasowania toksyczności leczenia do indywidualnej prognozy choroby każdego pacjenta.
Istnieje zapotrzebowanie na ulepszone leczenie, które jest bardziej skuteczne i lepiej tolerowane. Obecnie wprowadzane czynniki obejmują nowe leki cytotoksyczne, stopniowo włączane do kompozycji oraz wprowadzanie terapii opartych o przeciwciała.
Chłoniak nieziarniczy obejmuje szereg chłoniaków z komórek B. Antygeny komórek B reprezentują zatem odpowiednie cele dla leczenia przeciwciałami.
CD22 to glikoproteina błonowa o wielkości 135 kDa należąca do rodziny białek wiążących kwas sialowy nazywanych sialoadhezynami. Jest ona wykrywana w cytoplazmie wcześnie w rozwoju komórek B, pojawia się na powierzchni komórek jednocześnie z IgD i znajduje się większości dojrzałych komórek B. Ekspresja wzrasta po aktywacji komórek B. CD22 jest tracona wraz z ostatecznym różnicowaniem i generalnie jest opisywana jako nieobecna na komórkach plazmatycznych. A zatem ten internalizujący się antygen jest obecny na powierzchni komórek pre-B i dojrzałych komórek B, ale nie komórkach macierzystych lub komórkach plazmatycznych.
U człowieka istnieją dwie izoformy CD22. Przeważająca postać (CD223) zawiera 7 domen immunoglobulino-podobnych (Ig-podobnych) w regionie zewnątrzkomórkowym. W wariancie CD22a brakuje domeny Ig-podobnej 4 i może on mieć skróconą domenę cytoplazmatyczną. Pokazano, że przeciwciała, które blokują adhezję CD22 do monocytów, krwinek białych obojętnochłonnych, limfocytów i erytrocytów wiążą się w obrębie pierwszej i drugiej domeny Ig-podobnej.
Domena cytoplazmatyczna CD22 jest fosforylowana w pozycji tyrozyny po połączeniu się z receptorem antygenu komórek B i jest połączona z Lyk, Syk i kinazą fosfatydyloinozytolu 3. Funkcją CD22 jest obniżanie poziomu granicy aktywacji komórek B. Może ono również pośredniczyć w przyleganiu komórek poprzez oddziaływanie z komórkami niosącymi odpowiednie sialoglikokoniugaty.
CD22 jest wyrażany w większości białaczek i chłoniaków z komórek B, włączając w to NHL, ostrą białaczkę limfoblastyczną (B-ALL, od ang. acute lymphoblastic leukaemia), przewlekłą białaczkę Iimfocytarną (B-CLL, od ang. chronic lymphocytic leukaemia), a w szczególności ostrą białaczkę limfocytarną (ANLL, od ang. acute non-lymphocytic leukaemia).
Przeciwciała monoklonalne wobec CD22 zostały opisane uprzednio. WO 98/41641 opisuje zrekombinowane przeciwciała anty-CD22 z resztami cysteinowymi w pozycjach VH44 i VL100. WO 96/04925 opisuje regiony VH i VL przeciwciała anty-CD22 LL2. US5686072 opisuje kombinację
PL 218 433 B1 immunotoksyn anty-CD22 i anty-CD19. WO 98/42378 opisuje stosowanie nagich przeciwciał anty-CD22 do leczenia nowotworów z udziałem komórek B.
Wiele leków w oparciu o przeciwciała zostało ostatnio dopuszczonych, np. Rituxan (niewyznakowane chimerowe ludzkie γ| (region V +myl) swoiste wobec CD20) albo są w trakcie testów klinicznych dla tej choroby. Ich działanie polega na zabijaniu komórek B za pośrednictwem dopełniacza,
131 90 bądź ADCC albo zastosowaniu radionuklidów, takich jak lub 131I lub 90Y, czemu towarzyszą problemy z wytwarzaniem i stosowaniem dla lekarzy i pacjentów. Istnieje zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała do leczenia NHL, która może być stosowana wielokrotnie i wytwarzana łatwo i wydajnie. Istnieje również zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała, która ma wysokie powinowactwo wobec CD22 i niską immunogenność u ludzi.
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22 zawierająca łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje SEK NR ID: 1 dla CDR-H1,
SEK NR ID: 2 lub SEK NR ID: 13 lub SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16 lub sekwencję GINPGNNYATYRRKFQG w gH7 na Fig 6 dla CDR-H2, SEK NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje SEK NR ID: 4 dla CDR-L1, SEK NR ID: 5 dla CDR-L2 i SEK NR ID: 6 dla CDR-L3.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała według wynalazku zawiera sekwencję GINPGNNYATYRRKFQG dla CDR-H2.
Ponadto korzystnie cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest cząsteczką przeciwciała z przeszczepionym CDR, a korzystniej zawiera domenę zmienną obejmującą ludzkie akceptorowe regiony zrębowe i inne niż ludzkie donorowe CDR.
W korzystnej postaci wykonania ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego cząsteczki według wynalazku są oparte na SEK NR ID: 21 i 22 oraz zawierają reszty donorowe w pozycjach 1, 28, 48, 71 i 93, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom 1, 28, 48, 72 i 97, odpowiednio, w SEK NR ID: 8. Korzystniej cząsteczka przeciwciała według wynalazku dodatkowo zawiera reszty donorowe w pozycjach 67 i 69, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom 68 i 70, odpowiednio, w SEK NR ID: 8.
Korzystnie ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego cząsteczki przeciwciała według wynalazku są oparte na SEK NR ID: 17 i 18 i zawierają reszty donorowe w pozycjach 2, 4, 37, 38, 45 i 60, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom w pozycjach 2, 4, 42, 43, 50 i 65, odpowiednio, w SEK NR ID: 7. Korzystniej cząsteczka przeciwciała według wynalazku dodatkowo zawiera resztę donorową w pozycji 3, zgodnie z numeracją Kabata, która odpowiada reszcie w tej pozycji w SEK NR ID: 7.
Najkorzystniej cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22 według wynalazku obejmuje łańcuch ciężki i łańcuch lekki określone powyżej.
W innej korzystnej postaci wykonania cząsteczka przeciwciała według wynalazku zawiera SEK NR ID: 19 (region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1) i SEK NR ID: 27 (region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7).
Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22, która zawiera łańcuch lekki obejmujący, lub korzystnie składający się z sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący, lub korzystnie składający się z sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza cząsteczki przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22 zawierającej łańcuch lekki obejmujący, lub korzystnie składający się z reszt 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący, lub korzystnie składający się z reszty 20 do 466 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22, która zawiera łańcuch lekki obejmujący, lub korzystnie składający się z reszt 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący, lub korzystnie składający się z reszt 20 do 467 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22, która zawiera łańcuch lekki obejmujący, lub korzystnie składający się z sekwencji aminokwasowej powstałej w wyniku ekspresji SEK NR ID: 29 i łańcuch ciężki obejmujący, lub korzystnie składający się z sekwencji aminokwasowej powstałej w wyniku ekspresji SEK NR ID: 31 w komórce ssaka.
PL 218 433 B1
Korzystnie cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest mysim przeciwciałem monoklonalnym 5/44 anty-CD22, w którym domena zmienna łańcucha lekkiego ma sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 7, a domena zmienna łańcucha ciężkiego ma sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 8.
Ponadto korzystnie cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest cząsteczką przeciwciała chimerowego zawierającą sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała monoklonalnego określonego powyżej, przedstawione odpowiednio w SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8.
Niniejszym ujawniono ponadto cząsteczki przeciwciała wykazujące swoistość wobec ludzkiego CD22, zawierające łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera CDR (zdefiniowany przez Kabat i wsp. (jak wyżej)) zawierający sekwencję przedstawioną jako H1 na Fig. 1 (SEK NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEK NR ID: 2) albo H2, z którego potencjalne miejsce glikozylacji zostało usunięte albo H2, w którym reaktywna reszta lizyny w pozycji 60 (zgodnie z systemem numeracji Kabat) została zastąpiona alternatywnym aminokwasem albo H2, z którego zarówno miejsce glikozylacji, jak i reaktywna reszta lizyny w pozycji 60 zostały usunięte, dla CDR-H2, albo jako H3 na Fig. 1 (SEK NR ID: 3) dla CDR-H3.
Cząsteczka przeciwciała tu opisana zawiera co najmniej jeden CDR wybrany spośród H1, H2 i H3 (SEK NR ID: 1, SEK NR ID; 2 i SEK NR ID: 3) dla domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Korzystne jest, jeżeli cząsteczka przeciwciała zawiera co najmniej dwa lub korzystniej wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego, jak ma to miejsce w przypadku przeciwciała według wynalazku.
Niniejszym ujawniono także cząsteczkę przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22, zawierającą łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (zdefiniowany przez Kabat i wsp. (jak wyżej)) zawierający sekwencję przedstawioną jako L1 na Fig. 1 (SEK NR ID: 4) dla CDR-L1, L2 na Fig. 1 (SEK NR ID: 5) dla CDR-L2 albo L3 na Fig. 1 (SEK NR ID: 6) dla CDR-L3.
Cząsteczka przeciwciała opisana powyżej zawiera co najmniej jeden CDR wybrany spośród L1, L2 i L3 (SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 5 i SEK NR ID: 6) dla domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Korzystne jest, jeżeli cząsteczka przeciwciała zawiera co najmniej dwa lub korzystniej wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha lekkiego, jak ma to miejsce w przypadku przeciwciała według wynalazku.
Niniejszym ujawniono także cząsteczkę przeciwciała zawierającą komplementarny łańcuch lekki lub komplementarny łańcuch ciężki.
Opisana powyżej cząsteczka przeciwciała zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera CDR (zdefiniowany przez Kabat i wsp. (jak wyżej)) zawierający sekwencję przedstawioną jako H1 na Fig. 1 (SEK NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEK NR ID: 2) albo H2, z którego potencjalne miejsce glikozylacji zostało usunięte albo H2, w którym reszta lizyny w pozycji 60 (zgodnie z systemem numeracji Kabat) została zastąpiona alternatywnym aminokwasem, albo H2, z którego zarówno miejsce glikozylacji, jak i reaktywna reszta lizyny w pozycji 60 zostały usunięte dla CDR-H2, albo jako H3 na Fig. 1 (SEK NR ID: 3) dla CDR-H3 oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (zdefiniowany przez Kabat i wsp. (jak wyżej)) zawierający sekwencję przedstawioną jako L1 na Fig. 1 (SEK NR ID: 4) dla CDR-L1, jako L2 na Fig. 1 (SEK NR ID: 5) dla CDR-L2 lub jako L3 na Fig. 1 (SEK NR ID: 6) dla CDR-L3.
CDR podane w SEK NR ID: 1 do 6 i na Fig. 1, do której odnoszono się powyżej, pochodzą w mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.
Pełne sekwencje domen zmiennych mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44 są pokazane na Fig. 2 (łańcuch lekki) (SEK NR ID: 7) i Fig. 3 (łańcuch ciężki) (SEK NR ID: 8). To mysie przeciwciało jest również określane poniżej jako „przeciwciało donorowe” albo „mysie przeciwciało monoklonalne”.
Niniejszym opisano mysie przeciwciało monoklonalne 5/44 zawierające sekwencje domeny zmiennej łańcucha lekkiego i ciężkiego pokazane, odpowiednio, na Fig. 2 (SEK NR ID: 7) i Fig. 3 (SEK NR ID: 8). Regionem stałym łańcucha lekkiego 5/44 jest kappa, a regionem stałym łańcucha ciężkiego jest IgG1.
Przeciwciało według wynalazku stanowi korzystnie cząsteczka chimerowego mysio/ludzkiego przeciwciała, określana tu jako cząsteczka chimerowego przeciwciała 5/44. Cząsteczka chimerowego przeciwciała zawiera domeny zmienne mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44 (SEK NR ID: 7 i 8) i ludzkie domeny stałe. Korzystnie cząsteczka chimerowego przeciwciała 5/44 zawiera ludzką domenę C kappa (Hieter i wsp., Cell, 22, 197-207, 1980; nr dostępu Genebank J00241) w łańcuchu lekkim i ludzkie domeny gamma 4 (Flanagan i wsp., Nature, 300, 709-713, 1982) w łańcuchu ciężkim, ewentualnie z resztą serynową w pozycji 241 zastąpioną przez resztę prolinową.
PL 218 433 B1
Korzystnie przeciwciało według niniejszego wynalazku zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2', z którego potencjalne miejsce glikozylacji zostało usunięte, co nieoczekiwanie zwiększało powinowactwo chimerowego przeciwciała 5/44 wobec antygenu CD22, i który zawiera korzystnie jako CDR-H2 sekwencję podaną jako H2' (SEK NR ID: 13).
Przeciwciało według wynalazku zawiera również łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2'', w którym reszta lizyny w pozycji 60, która znajduje się na eksponowanym miejscu w obrębie CDR-H2 i która, jak się uważa, może reagować z czynnikami łączącymi, co prowadzi do zmniejszenia powinowactwa wiązania, jest zastąpiona alternatywnym aminokwasem, czego wynikiem jest konserwatywne podstawienie. Korzystnie CDR-H2 ma sekwencję podaną jako H2''(SEK NR ID: 15).
Alternatywnie albo dodatkowo, przeciwciało według wynalazku może zawierać łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2''', w którym zarówno sekwencja potencjalnego miejsca glikozylacji, jak i reszta lizyny w pozycji 60, zostały zastąpione alternatywnymi aminokwasami. Korzystnie CDR-H2 ma sekwencję podaną jako H2''' (SEK NR ID: 16).
Stosowany tu termin „przeciwciało z przeszczepionym CDR” dotyczy cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch lekki i/lub ciężki zawiera jeden albo większą liczbę CDR (włączając w to, jeśli to pożądane CDR zmodyfikowany) z przeciwciała donorowego (np. mysiego przeciwciała monoklonalnego) przeszczepionych do zrębu regionu zmiennego łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała akceptorowego (np. przeciwciała ludzkiego).
Korzystnie takie przeciwciało z przeszczepionym CDR ma domenę zmienną zawierającą ludzkie akceptorowe regiony zrębowe, jak również jeden albo większą liczbę CDR omawianych powyżej.
Przy przeszczepianiu CDR, można zastosować dowolną odpowiednią sekwencję zrębową akceptorowego regionu zmiennego pod względem klasy/typu przeciwciała donorowego, z którego pochodzą CDR, włączając w to regiony zrębowe mysie, naczelnych i ludzkie. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można zastosować są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i wsp. (jak wyżej)). Przykładowo, KOL i NEWM można zastosować dla łańcucha ciężkiego, REI można zastosować dla łańcucha lekkiego, a EU, LAY i POM można zastosować zarówno dla łańcucha ciężkiego, jak i łańcucha lekkiego. Alternatywnie, można zastosować ludzkie sekwencje linii płciowej. Korzystnym regionem zrębowym dla łańcucha lekkiego jest sekwencja podgrupy ludzkiej linii płciowej (DPK9 + JK1) pokazana na Fig. 5 (SEK NR ID: 17). Korzystnym regionem zrębowym dla łańcucha ciężkiego jest sekwencja ludzkiej podgrupy (DP7 + JH4) pokazana na Fig. 6 (SEK NR ID: 21).
W przeciwciele z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku, korzystne jest zastosowanie jako przeciwciała akceptorowego takiego, które ma łańcuchy ciężkie, które są homologiczne do łańcuchów przeciwciała donorowego. Akceptorowe łańcuchy ciężkie i lekkie nie muszą koniecznie pochodzić z tego samego przeciwciała i mogą, jeśli to pożądane, zawierać łańcuchy złożone, o regionach zrębowych pochodzących z różnych łańcuchów.
Także, w przeciwciele z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku, regiony zrębowe nie muszą mieć dokładnie tej samej sekwencji, jak te z przeciwciała akceptorowego. Przykładowo, nietypowe reszty mogą być zmienione na reszty częściej występujące dla takiej klasy lub typu łańcucha akceptorowego. Alternatywnie, wybrane reszty w akceptorowych regionach zrębowych mogą zostać zmienione, tak, że odpowiadają one reszcie znajdującą się w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym albo reszcie, która jest konserwatywnym podstawieniem resztą znajdującą się w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym. Takie zmiany powinny być sprowadzone do minimum niezbędnego do odzyskania powinowactwa przeciwciała donorowego. Protokół do wybierania reszt w akceptorowych regionach zrębowych, których zmiana może być niezbędna, jest przedstawiony w WO 91/09967.
Korzystnie w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku akceptorowy łańcuch lekki ma sekwencję ludzkiej podgrupy DPK9+JK1 (pokazaną na Fig. 5) (SEK NR ID: 17 (DPK9) plus SEK NR ID: 18 (JK1)), następnie akceptorowe regiony zrębowe łańcucha lekkiego zawierają reszty donorowe w pozycjach 2, 4, 37, 38, 45 i 60 i mogą zawierać dodatkowo resztę donorową w pozycji 3 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Korzystnie w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku akceptorowy łańcuch ciężki ma sekwencję ludzkiej podgrupy DP7+JH4 (pokazaną na Fig. 6) (SEK NR ID: 21 (DP7) plus SEK NR ID: 22 (JH4)), następnie akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego
PL 218 433 B1 zawierają reszty donorowe w pozycjach 28, 48, 71 i 93 i mogą zawierać dodatkowo reszty donorowe w pozycji 67 i 69 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Reszty donorowe to reszty z przeciwciała donorowego, tj. przeciwciała, z którego CDR wyjściowo pochodziły.
Korzystnie przeciwciało według niniejszego wynalazku zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2', z którego potencjalne miejsce glikozylacji zostało usunięte w celu zwiększenia powinowactwa chimerowego przeciwciała 5/44 wobec antygenu CD22 i który ma korzystnie jako CDR-H2 sekwencję podaną jako H2' (SEK NR ID: 13).
Alternatywnie lub dodatkowo, przeciwciało według niniejszego wynalazku zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2'', w którym reszta lizyny w pozycji 60, która znajduje się na eksponowanym miejscu w obrębie CDR-H2 i która, jak się uważa, może reagować z czynnikami łączącymi, co prowadzi do zmniejszenia powinowactwa wiązania, jest zastąpiona alternatywnym aminokwasem. Korzystnie CDR-H2 ma sekwencję podaną jako H'' (SEK NR ID: 15).
Alternatywnie lub dodatkowo, przeciwciało według niniejszego wynalazku zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera jako CDR-H2 (zdefiniowany przez Kabat i wsp., (jak wyżej)) H2''', w którym zarówno sekwencja potencjalnego miejsca glikozylacji, jak i reszta lizyny w pozycji 60, zostały zastąpione alternatywnymi aminokwasami. Korzystne jest, jeżeli CDR-H2 ma sekwencję podaną jako H''' (SEK NR ID: 16).
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może obejmować: cząsteczkę pełnego przeciwciała, zawierającego łańcuchy ciężkie i lekkie pełnej długości; jego fragmenty, takie jak fragment Fab, zmodyfikowany Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv; monomer lub dimer łańcucha lekkiego lub ciężkiego; przeciwciało jednołańcuchowe, np. przeciwciało jednołańcuchowe Fv, w którym domeny zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich są połączone łącznikiem peptydowym. Podobnie, regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich mogą być połączone jak trzeba z innymi domenami przeciwciała.
Do cząsteczki przeciwciała według wynalazku może być przyłączona cząsteczka efektorowa albo reporterowa. Przykładowo, cząsteczka przeciwciała może mieć grupę makrocykliczną do chelatowania atomu metalu ciężkiego albo toksynę, taką jak rycyna, przyłączoną przez kowalencyjną strukturę mostka. Alternatywnie, można zastosować procedury rekombinowania DNA w celu wytworzenia cząsteczki przeciwciała, w której fragment Fc (CH2, CH3 i domeny zawiasowe), domeny CH2 i CH3 lub domena CH3 pełnej cząsteczki immunoglobuliny została(y) zastąpiona(e) przez albo ma(mają) przyłączoną(e) przez wiązanie peptydowe funkcjonalne białko inne niż immunoglobulina, takie jak cząsteczka enzymu lub toksyny.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku ma powinowactwo wiązania -10 -10 co najmniej 0,85 x 10-10 M, korzystniej co najmniej 0,75 x 10-10 M, a najkorzystniej co najmniej 0,5 x 10-10 M.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEK NR ID: 19) i domenę zmienną łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEK NR ID: 27). Sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego są przedstawione, odpowiednio, na Fig. 5 i 6.
Niniejszym opisano także warianty cząsteczki przeciwciała według wynalazku, które mają zwiększone powinowactwo wobec CD22. Takie warianty można otrzymać przy zastosowaniu wielu protokołów dojrzewania powinowactwa, włączając w to mutowanie CDR (Yang i wsp., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), tasowanie łańcuchów, (Marks i wsp., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), zastosowanie szczepów mutatorowych E. coli (Low i wsp., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), tasowanie DNA (Patten i wsp., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), prezentację na fagach (Thompson i wsp., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i seksualny PCR (Crameri i wsp., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan i wsp. (jak wyżej) omawia te sposoby dojrzewania powinowactwa.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sekwencji DNA kodującej łańcuch(y) ciężki i/lub lekki przeciwciała według wynalazku. Korzystnie sekwencja DNA koduje łańcuch ciężki lub lekki cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku.
Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku może obejmować DNA syntetyczny, na przykład wytwarzany przez obróbkę chemiczną, cDNA, DNA genomowy albo dowolną ich kombinację.
Niniejszy wynalazek dotyczy również wektora do klonowania lub ekspresji zawierającego jedną lub większą liczbę sekwencji DNA według wynalazku. Korzystnie wektor do klonowania lub ekspresji
PL 218 433 B1 zawiera dwie sekwencje DNA, kodujące odpowiednio, łańcuch lekki i łańcuch ciężki cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku.
Ogólne metody, przy zastosowaniu których można skonstruować wektory, sposoby transfekcji i sposoby hodowania są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie. W tym względzie dokonuje się odniesienia do „Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (wyd.), Wiley Interscience, New York oraz podręcznika Maniatisa wydanego przez Cold Spring Harbor Publishing.
Sekwencje DNA, które kodują cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można otrzymać przy zastosowaniu metod dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie. Przykładowo, sekwencje DNA kodujące część albo całość łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała można zsyntetyzować jeśli to pożądane z określonych sekwencji DNA albo na podstawie odpowiadających im sekwencji aminokwasowych.
DNA kodujący akceptorowe sekwencje zrębowe jest szeroko dostępny dla specjalisty w dziedzinie i można go łatwo zsyntetyzować na podstawie ich znanych sekwencji aminokwasowych.
Standardowe techniki biologii molekularnej można zastosować do wytworzenia sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku. Pożądane sekwencje DNA można zsyntetyzować w całości albo w części przy zastosowaniu technik syntezy oligonukleotydów. Jeśli trzeba, można zastosować techniki ukierunkowanej mutagenezy i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca wektor do klonowania lub ekspresji według wynalazku.
Dowolny odpowiedni system komórka gospodarza/wektor można zastosować do ekspresji sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku. Można użyć po części systemu bakteryjnego, na przykład E. coli, i innych systemów mikrobiologicznych do ekspresji fragmentów przeciwciała, takich jak fragmenty Fab i F(ab'), a w szczególności fragmentów Fv i fragmentów przeciwciała jednołańcuchowego, na przykład jednołańcuchowych Fv. Eukariotyczne, np. ssacze systemy komórek gospodarzy można zastosować do wytwarzania większych cząsteczek przeciwciała, włączając w to cząsteczki całych przeciwciał. Odpowiednie ssacze komórki gospodarzy obejmują komórki CHO, szpiczaka lub hybrydomy.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania cząsteczki przeciwciała według wynalazku obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku zawierającej wektor według wynalazku w warunkach odpowiednich do doprowadzenia do wyrażenia białka z DNA kodującego cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku i wyizolowanie cząsteczki przeciwciała.
Cząsteczka przeciwciała może zawierać jedynie polipeptyd łańcucha ciężkiego lub lekkiego, w którym to przypadku należy transferować komórkę gospodarza jedynie sekwencją kodującą polipeptydu łańcucha lekkiego albo polipeptydu łańcucha ciężkiego. Do wytwarzania produktów zawierających zarówno łańcuchy ciężkie, jak i lekkie, linię komórkową można transfekować dwoma wektorami, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd łańcucha lekkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd łańcucha ciężkiego. Alternatywnie, można użyć pojedynczego wektora, wektora zawierającego sekwencje polipeptydów łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.
Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji terapeutycznej albo diagnostycznej zawierającej cząsteczkę przeciwciała lub sekwencję DNA według wynalazku w połączeniu z dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką, rozcieńczalnikiem albo nośnikiem.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania kompozycji terapeutycznej albo diagnostycznej obejmującego mieszanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku razem z dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką, rozcieńczalnikiem albo nośnikiem.
Cząsteczka przeciwciała może być jedynym składnikiem aktywnym w kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej albo mogą jej towarzyszyć inne składniki aktywne, włączając w to inne składniki będące przeciwciałami, na przykład przeciwciała przeciwko komórkom T, przeciwciał anty-IFNy lub anty-LPS, i/lub składniki inne niż przeciwciała, takie jak ksantyny.
Korzystne jest, jeżeli kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała według wynalazku. Stosowany tu termin „skuteczna terapeutycznie ilość” dotyczy ilości czynnika terapeutycznego niezbędnej do leczenia, łagodzenia albo przeciwdziałania docelowej chorobie lub stanowi albo do wykazywania wykrywalnego efektu leczniczego lub zapobiegawczego. Dla dowo l nego przeciwciała, skuteczną terapeutycznie dawkę można oszacować wyjściowo najpierw w testach w hodowli komórkowej albo na modelach zwierzęcych, zwykle gryzoni, królików, psów, świń lub naczelnych. Model zwierzęcy można również zastosować do określenia odpowiedniego zakresu stężeń
PL 218 433 B1 i drogi podawania. Takich informacji można następnie użyć do określenia przydatnych dawek i dróg podawania ludziom.
Precyzyjna skuteczna ilość dla człowieka będzie zależała od ostrości stanu chorobowego, ogólnego stanu zdrowia, wieku, wagi i płci osobnika, diety, czasu i częstości podawania, kombinacji leków, reakcji wrażliwości i tolerancji/odpowiedzi na leczenie. Ilość tę można określić przez rutynowe doświadczenia i jest to w zakresie możliwości oceny przez lekarza. Generalnie, skuteczna dawka będzie wynosić od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, korzystnie 0,1 mg/kg do 20 mg/kg, korzystniej około 15 mg/kg.
Kompozycje można podawać pacjentowi indywidualnie albo można je podawać w połączeniu z innymi czynnikami, lekami lub hormonami.
Dawka, w której cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku jest podawana zależy od natury stanu, który ma być leczony, stopnia złośliwości chłoniaka lub białaczki i od tego, czy cząsteczka przeciwciała ma być stosowana profilaktycznie, czy do leczenia istniejącego stanu.
Częstość dawki będzie zależała od okresu półtrwania cząsteczki przeciwciała i czasu trwania jego efektu. Jeżeli cząsteczka przeciwciała ma krótki okres półtrwania (np. 2 do 10 godzin) może być konieczne podawanie jednej albo większej liczby dawek dziennie. Alternatywnie, jeżeli cząsteczka przeciwciała ma długi okres półtrwania (np. 2 do 15 dni) może być niezbędne podawanie dawki jedynie raz dziennie, raz na tydzień, a nawet raz na 1 lub 2 miesiące.
Kompozycja farmaceutyczna może również zawierać dopuszczalny farmaceutycznie nośnik do podawania przeciwciała. Nośnik sam nie powinien indukować wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Odpowiednimi nośnikami mogą być duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, polikwasy mlekowe, polikwasy glikolowe, polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i nieaktywne cząstki wirusowe.
Można zastosować dopuszczalne farmaceutycznie sole, na przykład sole kwasów mineralnych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany albo sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, maloniany i benzoesany.
Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki w kompozycji terapeutycznej mogą dodatkowo zawierać ciecze, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol i etanol. Dodatkowo, w takiej kompozycji mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające lub emulgujące albo substancje buforujące pH. Takie nośniki umożliwiają wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żeli, syropów, rzadkich zawiesin i zawiesin do połykania przez pacjenta.
Korzystne postaci do podawania obejmują postaci odpowiednie do podawania pozajelitowego, np. poprzez wstrzyknięcie albo wlew, na przykład poprzez duży zastrzyk albo ciągły wlew. Tam, gdzie produkt jest do wstrzyknięcia albo wlewu, może przybrać postać zawiesiny, roztworu albo emulsji w nośniku olejowym albo wodnym i może zawierać czynniki do wytwarzania, takie jak czynniki zawieszające, konserwujące, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, cząsteczka przeciwciała może być w postaci suchej, do przygotowania przed zastosowaniem przy użyciu odpowiedniego jałowego płynu.
Po wytworzeniu, kompozycje według wynalazku można podawać bezpośrednio osobnikowi. Osobnikami, które mają być leczone mogą być zwierzęta. Jednakże, korzystnie kompozycje są dostosowane do podawania ludziom.
Po wytworzeniu, kompozycje według wynalazku można podawać dowolną z wielu dróg obejmujących między innymi drogi doustne dożylne, domięśniowe, dotętnicze, doszpikowe, dooponowe, dokomorowe, przezskórne (na przykład, patrz WO98/20734), podskórne, dootrzewnowe, donosowe, dojelitowe, miejscowe, podjęzykowe, dopochwowe albo doodbytnicze. Do podawania kompozycji według wynalazku można również zastosować rozpylacze podciśnieniowe. Typowo kompozycje farmaceutyczne można wytworzyć w postaci wstrzykiwanej, bądź jako roztwory płynne, bądź zawiesiny. Można również wytworzyć postaci stałe odpowiednie do rozpuszczenia w albo zawieszenia w płynnych nośnikach przed wstrzyknięciem.
Bezpośrednie dostarczanie kompozycji można generalnie uzyskać poprzez wstrzyknięcie podskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe albo dostarczyć do przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Kompozycje można również podawać do uszkodzeń. Sposobem dawkowania może być tryb pojedynczej dawki albo tryb wielokrotnych dawek.
Będzie oczywiste, że czynnikiem aktywnym w kompozycji będzie cząsteczka przeciwciała. Jako taka, będzie ona podatna na rozkład w przewodzie pokarmowym. A zatem, jeżeli kompozycja ma być
PL 218 433 B1 podawana drogą wykorzystującą przewód pokarmowy, kompozycja powinna zawierać czynniki, które chronią przeciwciało przed rozkładem, ale które uwalniają przeciwciało po jego wchłonięciu z przewodu pokarmowego.
Szczegółowe omówienie dopuszczalnych farmaceutycznie nośników jest dostępne w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N. J. 1991).
Bierze się również pod uwagę, że przeciwciało według wynalazku może być podawane poprzez zastosowanie terapii genowej. W celu dokonania tego, sekwencje DNA kodujące łańcuchy ciężkie lub lekkie cząsteczki przeciwciała pod kontrolą odpowiednich składników DNA wprowadza się do pacjenta w taki sposób, że łańcuchy przeciwciała są wyrażane z sekwencji DNA i składane in situ.
Niniejszy wynalazek dostarcza również cząsteczki przeciwciała lub sekwencji DNA według wynalazku do zastosowania w leczeniu choroby, w której pośredniczą komórki wyrażające CD22.
Niniejszy wynalazek dostarcza również zastosowania cząsteczki przeciwciała lub sekwencji DNA według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby, w której pośredniczą komórki wyrażające CD22.
Cząsteczkę przeciwciała według wynalazku można zastosować w dowolnym leczeniu, gdzie pożądane jest zmniejszenie poziomu komórek wyrażających CD22, które są obecne w ciele człowieka lub zwierzęcia. Te komórki wyrażające CD22 mogą być krążącymi w ciele albo mogą być obecne na niepożądanie wysokim poziomie zlokalizowanym w konkretnym miejscu ciała. Przykładowo, podwyższone poziomy komórek wyrażających CD22 będą obecne w chłoniakach z komórek B i białaczkach. Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować w leczeniu chorób, w których pośredniczą komórki wyrażające CD22.
Korzystne jest stosowanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku do leczenia złośliwych chłoniaków i białaczek, najkorzystniej chłoniaka nieziarniczego (NHL).
Niniejszym opisano sposób leczenia ludzi i zwierząt cierpiących na albo narażonych na ryzyko choroby, w której pośredniczą komórki wyrażające CD22, obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku.
Cząsteczkę przeciwciała według wynalazku można stosować do diagnozowania, na przykład diagnozowania in vivo i obrazowania stanów chorobowych z udziałem komórek, które wyrażają CD22.
Niniejszy wynalazek jest dalej opisany jedynie jako ilustracja w następujących przykładach, które odnoszą się do towarzyszących im Figur, gdzie:
Fig. 1 przedstawia sekwencję aminokwasową CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44 (SEK NR ID: 1 do 6);
Fig. 2 przedstawia pełną sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44;
Fig. 3 przedstawia pełną sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44;
Fig. 4 przedstawia strategię usuwania miejsc glikozylacji i reaktywnej lizyny w CDR-H2;
Fig. 5 przedstawia wzór przeszczepiania CDR dla sekwencji łańcucha lekkiego 5/44;
Fig. 6 przedstawia wzór przeszczepiania CDR dla sekwencji łańcucha ciężkiego 5/44;
Fig. 7 przedstawia wektory pMRR-14 i pMRR10.1;
Fig. 8 przedstawia wyniki testu Biacore dla chimerowych mutantów 5/44;
Fig. 9 przedstawia oligonukleotydy do składania genów 5/44gH1 i gL1;
Fig. 10 przedstawia wektory pośrednie pCR2.1(544gH1) i pCR2. 1(544gL1);
Fig. 11 przedstawia kasety oligonukleotydowe użyte do dokonania dalszych przeszczepów;
Fig. 12 przedstawia test współzawodnictwa pomiędzy wyznakowanym fluorescencyjnie mysim przeciwciałem 5/44 i wariantami z przeszczepionymi CDR; i
Fig. 13 przedstawia pełną sekwencję DNA i białka łańcucha ciężkiego i lekkiego z przeszczepionymi CDR.
P r z y k ł a d 1:
Wytwarzanie przeciwciał-kandydatów
Zestaw przeciwciał wobec CD22 wybrano spośród hybrydoma przy zastosowaniu następujących kryteriów selekcji: wiązanie się z komórkami Daudi, internalizacja przez komórki Daudi, wiązanie się z jednojądrzastymi komórkami z krwi obwodowej (PBMC, ang, peripheral blood mononuclear cells), internalizacja przez PBMC, powinowactwo (większe niż 10-9M), mysia γ1 i tempo wytwarzania. 5/44 wybrano jako korzystne przeciwciało.
PL 218 433 B1
P r z y k ł a d 2:
Klonowanie i ekspresja genu dla cząsteczki chimerowego przeciwciała 5/44
Wytwarzane komórek hybrydoma 5/44 i otrzymywanie z nich RNA
Hybrydoma 5/44 wytwarzano przy zastosowaniu konwencjonalnej technologii hybrydom po immunizacji myszy ludzkim białkiem CD22. RNA wytworzono z komórek hybrydomy 5/44 przy użyciu zestawu RNEasy (Qiagen, Crawley, UK; nr katalogowy 74106). Otrzymany RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA, jak opisano poniżej.
Występowanie CD22 w nowotworach NHL
Podjęto badania immunohistochemiczne w celu zbadania występowania i rozkładu barwienia przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-CD22 5/44. Do badań włączono przeciwciała kontrolne anty-CD20 i anty-CD79a w celu potwierdzenia powierzchni z komórek B w guzach nowotworowych.
Badano w sumie 50 nowotworów i zostały one podzielone na następujące kategorie przy użyciu systemów klasyfikacji roboczych (Working Formulation) i REAL:
• 7 białaczek/chłoniaków limfoblastycznych B (wysoka złośliwość/1) • 4 B-CLL/chłoniaków limfocytarnych z małych komórek (niska złośliwość/A) • 3 limfoplasmacytoid/immunocytoma (niska złośliwość/A).
• 1 z komórek płaszcza (ang. Mantle cell)(średnia złośliwość/F) • 14 chłoniaków z grudkowym wnętrzem (niska do średniej złośliwość/D) • 13 rozlanych chłoniaków z dużych komórek (średnia do wysokiej złośliwość/G,H) • 6 nie dających się sklasyfikować (K) • 2 chłoniaki z komórek T chłoniaków z komórek T było dodatnich pod względem antygenu CD22 przy zastosowaniu przeciwciała 5/44 w stężeniu 0,1 μg/ml, a dalszych 6 stawało się dodatnimi, kiedy stężenie wzrastało do 0,5 μg/ml. Dla pozostałych 2 nowotworów z komórek B, które były ujemne przy stężeniu 0,1 μg/ml pozostawała niedostateczna ilość tkanki do przeprowadzenia testu przy wyższych stężeniach. Jednakże, wynikiem równoległych testów z innym przeciwciałem Celltech anty-CD22 6/13, które dawało silniejsze barwienie niż 5/44, było dodatnie barwienie się pod kątem CD22 wszystkich 48 chłoniaków z komórek B.
A zatem, możliwe jest wyciągniecie wniosku, że antygen CD22 jest szeroko wyrażany na chłoniakach z komórek B, a zatem stanowi odpowiedni cel dla immunoterapii przy NHL. Klonowanie VH i VL 5/44 przez PCR
Sekwencje cDNA kodujące domeny zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego 5/44 zsyntetyzowano przy użyciu odwrotnej transkryptazy w celu wytworzenia jednoniciowych kopii cDNA z mRNA obecnego w całkowitym RNA. Tego użyto następnie jako matrycy do powielenia sekwencji mysiego regionu V stosując swoiste startery oligonukleotydowe w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
a) synteza cDNA cDNA zsyntetyzowano w objętości 20 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej następujące odczynniki: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KC1, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 20 jednostek RNAzyny, 75 ng losowego startera heksanukleotydowego, 2 μg RNA 5/44 i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy z mysiego wirusa białaczki Moloneya. Po inkubacji w 42°C przez 60 minut, reakcję zatrzymywano poprzez ogrzewanie w 95°C przez 5 minut.
b) PCR
Próbki cDNA poddano PCR stosując kombinację starterów specyficzną dla łańcuchów ciężkich i lekkich. Pulę zdegenerowanych starterów zaprojektowanych do przyłączenia do konserwowanych sekwencji peptydu sygnałowego zastosowano jako startery lewe. Wszystkie te sekwencje zawierają, kolejno, miejsce restrykcyjne (VL Sful; VH HindIII) zaczynające się 7 nukleotydów od ich końców 5', sekwencję GCCGCCACC (SEK NR ID: 50) dla umożliwienia optymalnej translacji otrzymanego w rezultacie mRNA, kodon inicjacyjny i 20-30 nukleotydów opartych o sekwencje peptydu liderowego znanych mysich przeciwciał (Kabat i wsp., Sequences of proteins of immunological interest, wydanie 5, 1991, U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
Startery 3' są zaprojektowane tak, aby obejmowały styk regionów zrębowych 4 J-C przeciwciała i zawierały miejsce restrykcyjne dla enzymu BsiWI dla ułatwienia klonowania fragmentu PCR VL. Startery 3' dla łańcucha ciężkiego są mieszaniną zaprojektowaną tak, aby obejmowały styk J-C przeciwciała. Starter 3' obejmuje miejsce restrykcyjne ApaI dla ułatwienia klonowania. Region 3' starterów
PL 218 433 B1 zawiera sekwencję mieszaną opartą o sekwencje znajdywane w znanych mysich przeciwciałach (Kabat i wsp., 1991, jak wyżej).
Opisana powyżej kombinacja starterów umożliwia bezpośrednie sklonowanie produktów PCR dla VH i V1 w odpowiednim wektorze ekspresyjnym (patrz niżej) w celu wytworzenia chimerowych (mysio-ludzkich) łańcuchów ciężkich i lekkich dla tych genów i ekspresję tych genów w komórkach ssaczych w celu wytworzenia przeciwciał chimerowych o pożądanym izotypie.
Mieszaniny do reakcji PCR (100 μΐ) sporządzono jak następuje. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 10 pmoli mieszaniny starterów 5', 10 pmoli startera 3', 1 μl cDNA i 1 jednostkę polimerazy Taq. Reakcje inkubowano w 95°C przez 5 minut, a następnie poddawano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym.
Dla regionu V łańcucha ciężkiego powielony fragment DNA otrzymano jedynie wtedy, kiedy pulę starterów przyłączonych do początku regionu zrębowego I zastąpion o przez pulę starterów dla peptydu sygnałowego. Fragmenty sklonowano w wektorach do sekwencjonowania DNA. Określono sekwencję DNA i przeprowadzono translację dla uzyskania wydedukowanej sekwencji aminokwasowej. Tę wydedukowaną sekwencję zweryfikowano poprzez porównanie z N-końcową sekwencją białkową określoną eksperymentalnie. Fig. 2 i 3 przedstawia sekwencję DNA/białka regionów V dojrzałych łańcuchów, odpowiednio, lekkiego i ciężkiego mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.
c) Klonowanie molekularne fragmentów PCR
Mysie sekwencje regionu V sklonowano następnie w wektorach ekspresyjnych pMRR10.1 i pMRR14 (Fig. 7). Wektory te są do ekspresji łańcucha lekkiego i ciężkiego i zawierają, odpowiednio, DNA kodujący regiony stałe ludzkiego łańcucha lekkiego kappa i ludzkiego łańcucha ciężkiego gamma-4. Region VL sklonowano następnie w wektorze ekspresyjnym poprzez trawienie i ligację, z wektora do sekwencjonowania, przy użyciu miejsc restrykcyjnych SfuI i Siwi, z wytworzeniem plazmidu pMRR10(544cL). Łańcuch ciężki DNA powielono poprzez PCR stosując starter 5' w celu wprowadzenia peptydu sygnałowego, ponieważ nie był on otrzymany przy tej strategii klonowania - wykorzystano lider z łańcucha ciężkiego przeciwciała mysiego z innej posiadanej hybrydomy (zwanej 162). Starter 5', miał następującą sekwencję:
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCAT TCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3' (SEK NR ID:51).
Starter odwrotny był identyczny jak ten zastosowany w klonowaniu wyjściowego VH. Otrzymany produkt PCR strawiono enzymami HindIII i ApaI, subklonowano i potwierdzono jego sekwencję, z wytworzeniem plazmidu pMRR14 (544cH). Przejściowa jednoczesna transfekcja obydwoma wektorami ekspresyjnymi komórek CHO doprowadziła do wytworzenia chimerowego przeciwciała 5/44. Uzyskano to stosując odczynnik Lipofectamine, zgodnie z protokołem producenta (InVitrogen: Life Technology, Groningen, Holandia, nr katalogowy 11668-027).
Usunięcie miejsca glikozylacji i reaktywnej lizyny
W CDR-H2 zauważono potencjalne miejsce glikozylacji poprzez N, mające sekwencję aminokwasową N-Y-T (Fig. 3). SDS-PAGE, analiza Western i barwienie żeli z 5/44 i jego fragmentami (włączając w to Fab) pod kątem węglowodanów wykazało, że miejsce to jest rzeczywiście glikozylowane (nie pokazano). Dodatkowo, na eksponowanej pozycji w obrębie CDR-H2 zaobserwowano resztę lizyny, która ma potencjał zmniejszania powinowactwa wiązania przeciwciała poprzez dostarczenie dodatkowego miejsca dla połączenia z czynnikiem, z którym przeciwciało może zostać połączone.
Strategię PCR zastosowano do wprowadzenia podstawień aminokwasowych do sekwencji CDR-H2 w celu usunięcia miejsca glikozylacji i/lub reaktywnej lizyny, jak pokazano na Fig. 4. Startery lewe kodujące mutacje N55Q, T57A lub T57V zastosowano w celu usunięcia miejsca glikozylacji (Fig. 4), a czwarty starter odwrotny zawierający podstawienie K60R, wytworzono w celu usunięcia reaktywnej reszty lizynowej (Fig. 4). Starter do przodu dla regionu zrębowego 4 użyto w każdej z tych amplifikacji PCR. Produkty PCR strawiono enzymami XbaI i ApaI i wstawiono do pMRR14(544cH) (również strawionego XbaI i Apal) W celu wytworzenia plazmidów ekspresyjnych kodujących te mutanty. Mutacje N55Q, T57A i T57V usuwają miejsce glikozylacji poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej w stosunku do sekwencji najwyższej zgodności N-X-T/S, podczas gdy mutacja K60R zastępuje potencjalnie reaktywną lizynę podobnie dodatnio naładowaną resztą argininy. Otrzymane w rezultacie plazmidy z wariantami cH były transferowane jednocześnie z plazmidem cL w celu uzyskania ekspresji wariantów chimerowego przeciwciała.
PL 218 433 B1
Ocena aktywności chimerowych genów
Aktywności chimerowych genów oceniano po przejściowej transfekcji do komórek CHO. c) Ustalenie stałych powinowactwa poprzez analizę BiaCore.
Powinowactwa chimerowego 5/44 lub jego wariantów, które mają usunięte potencjalne miejsce glikozylacji lub reaktywną lizynę, badano przy zastosowaniu technologii BIA pod kątem wiązania się z konstruktami CD22-mFc. Wyniki te są pokazane na Fig. 8. Wszystkie pomiary wiązania przeprowadzono w urządzeniu BIAcore™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja). Test przeprowadzono poprzez wyłapanie CD22mFc za pośrednictwem unieruchomionych Fe anty-mysz. Przeciwciało było w fazie płynnej. Próbki, standard i kontrole (50 μΙ) wstrzykiwano na unieruchomione Fe anty-mysz, a następnie dodawano przeciwciało w fazie płynnej. Po każdym cyklu powierzchnię regenerowano przy użyciu 50 μl 40 mM HCl w tempie 30 pl/min. Analizę kinetyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania BIAevaluation 3.1 (Pharmacia).
Usunięcie miejsca glikozylacji w konstrukcje T57A doprowadziło do nieco szybszego tempa wiązania i nieco wolniejszego tempa odłączania się w porównaniu z chimerowym 5/44, dając około 5-krotne polepszenie powinowactwa. Mutacja N55Q nie miała wpływu na powinowactwo. Wynik ten był nieoczekiwany, ponieważ sugerował, że usunięcie samego węglowodanu nie ma wpływu na wiązanie (jak przy zmianie N55Q). Zwiększone powinowactwo obserwowano jedynie w przypadku zmiany T57A. Jednym z możliwych wytłumaczeń jest to, że niezależnie od obecności węglowodanu, treonina w pozycji 57 wywiera ujemny wpływ na wiązanie, który jest usuwany przy zamianie treoniny na alaninę. Hipoteza, że mały rozmiar alaniny jest ważny, oraz że negatywny wpływ treoniny jest związany z jej rozmiarem, jest poparty przez wynik otrzymany z użyciem mutacji T57V: że zastąpienie waliny w pozycji 57 nie daje korzyści (wyniki nie pokazane).
Usunięcie lizyny przez mutację K60R ma wpływ neutralny na powinowactwo, tj. wprowadzenie argininy usuwa potencjalne miejsce reaktywne bez wpływu na powinowactwo.
Zarówno mutacje usuwające miejsce glikozylacji, jak i usuwające reaktywną lizynę zostały zatem uwzględnione przy przeprowadzaniu humanizacji.
P r z y k ł a d 3:
Przeszczepianie CDR 5/44
Klonowanie molekularne genów dla regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała 5/44 i ich zastosowanie do wytworzenia chimerowych (mysio/ludzkich) przeciwciał 5/44 zostało opisane powyżej. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe domen VL i VH mysiego 5/44 są pokazane, odpowiednio, na Fig. 2 i 3 (SEK NR ID: 7 i 8). Przykład ten opisuje przeszczepianie CDR przeciwciała 5/44 do ludzkiego regionu zrębowego w celu zmniejszenia potencjalnej immunogenności u ludzi, zgodnie z metodą Adair i wsp., (WO91/09967).
Przeszczepianie CDR łańcucha lekkiego 5/44
Porównanie sekwencji białkowej z sekwencjami najwyższej zgodności z regionu V łańcucha lekkiego kappa ludzkiej podgrupy I wykazało 64% identyczności sekwencji. W konsekwencji do skonstruowania łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR, wybrane akceptorowe regiony zrębowe odpowiadały sekwencji VK ludzkiej linii płciowej podgrupy I 012,DPK9. Sekwencja akceptorowego regionu zrębowego 4 pochodziła z sekwencji regionu J ludzkiej linii płciowej, JK1.
Porównanie sekwencji aminokwasowych regionów zrębowych mysiego 5/44 i sekwencji akceptorowej jest przedstawione na Fig. 5 i pokazuje, że istnieje 27 różnic pomiędzy łańcuchami donorowymi i akceptorowymi. W każdej pozycji dokonano analizy potencjalnych mysich reszt, które uczestniczą w wiązaniu antygenu, bądź bezpośrednio, bądź pośrednio, poprzez wpływ na upakowanie albo powierzchnię styku VH/VL. Jeżeli mysia reszta była uważana za ważną dostatecznie różniącą się reszty ludzkiej z punktu widzenia rozmiaru, polarności ładunku, wówczas mysia reszta była zachowywana. W oparciu o tę analizę skonstruowano dwie wersje łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR, mające sekwencje podane w SEK NR ID: 19 i SEK NR ID: 20 (Fig. 5).
Przeszczepianie CDR łańcucha ciężkiego 5/44
Przeszczepianie CDR łańcucha ciężkiego 5/44 przeprowadzono przy zastosowaniu tej samej strategii jak opisano dla łańcucha lekkiego. Stwierdzono, że domena V łańcucha ciężkiego 5/44 jest homologiczna do ludzkich łańcuchów ciężkich należących do podgrupy I (70% identyczności sekwencji), a zatem sekwencja regionu zrębowego podgrupy I linii płciowej VH1-3,DP7 została zastosowana jako zrębowy region akceptorowy. Sekwencje regionu akceptorowego 4 pochodziły z sekwencji regionu J ludzkiej linii płciowej, JH4.
PL 218 433 B1
Porównanie łańcucha ciężkiego 5/44 z regionami zrębowymi jest pokazane na Fig. 6, gdzie można zobaczyć, że łańcuch ciężki 5/44 różni się od sekwencji akceptorowej w 22 pozycjach. Analiza udziału, jaki każdy z nich może mieć w wiązaniu antygenu prowadzi do skonstruowania 5 wersji łańcuchów ciężkich z przeszczepionymi CDR, mających sekwencje podane w SEK NR ID: 23, SEK NR
ID: 24, SEK NR ID: 25, SEK NR ID: 26 i SEK NR ID: 27 (Fig. 6).
Konstrukcja genów dla przeszczepionych sekwencji
Zaprojektowano geny tak, aby kodowały przeszczepione sekwencje gH1 i gL1, oraz zaprojektowano i skonstruowano serię zachodzących na siebie oligonukleotydów (Fig. 9). Zastosowano technikę składania z zastosowaniem PCR w celu skonstruowania genów z regionem V z przeszczepionymi CDR. Sporządzono mieszaniny reakcyjne o objętości 100 μl zawierające 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,001% żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 1 pmol każdego z „wewnętrznych” starterów (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmoli każdego z „zewnętrznych” starterów (F1, R1) i 1 jednostkę polimerazy (AmpliTaq, Applied BioSystems, nr katalogowy N808-0171). Parametry cyklu PCR były: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę, dla 30 cykli. Produkty reakcji puszczono następnie na 1,5% żel agarozowy, wycięto i odzyskano z żelu przy użyciu kolumn do wirowania QIAGEN (QIAquick gel extraction kit, nr kat 28706). DNA wymywano w objętości 30 pi. Próbki (1 μθ DNA gH1 i gL1 sklonowano następnie w wektorze do klonowania InVitrogen TOPO TA pCR2.1 TOPO (nr katalogowy K4500-01) zgodnie z instrukcjami producenta. Ten nieekspresyjny wektor służy jako pośrednik do klonowania w celu ułatwienia sekwencjonowania dużej liczby klonów. Sekwencjonowanie DNA z zastosowaniem starterów specyficznych wobec wektora zastosowano do zidentyfikowania prawidłowych klonów zawierających gH1 i gL1, z wytworzeniem plazmidów pCR2.1 (544gH1) i pCR2.1 (544gL1) (Fig, 10).
Metodę zastępowania z użyciem kasety oligonukleotydowej zastosowano do wytworzenia humanizowanych przeszczepów gH4, 5, 6 i 7 oraz gL2. Fig. 11 pokazuje projekt kaset oligonukleotydowych. W celu skonstruownia każdego wariantu, wektor (pCR2.1 (544gH1) lub pCR2.1 (544gL1)) przecięto pokazanymi enzymami restrykcyjnymi (XmaI/SacII dla łańcucha ciężkiego, XmaI/BstEII dla łańcucha lekkiego). Duży fragment wektora oczyszczono z agarowy i użyto w ligacji z kasetą oligonukleotydową. Te kasety składają się z 2 komplementarnych oligonukleotydów (pokazanych na Fig. 11), zmieszanych w stężeniu 0,5 pmoli/pl w objętości 200 pl ul 12,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioerytritolu. Łączenie przeprowadzano poprzez ogrzewanie do 95°C przez 3 minuty w łaźni wodnej (objętość 500 pl), a następnie umożliwienie mieszaninie reakcyjnej powolne schłodzenie do temperatury pokojowej. Połączoną kasetę oligonukleotydową rozcieńcza się następnie 10-krotnie w wodzie przed ligacją z odpowiednio przeciętym wektorem. Sekwencjonowanie DNA stosuje się do potwierdzenia prawidłowej sekwencji, z wytworzeniem plazmidów pCR2.1 (5/44-gH4-7) i pCR2.1 (5/44-gL2). Zweryfikowane przeszczepione sekwencje subklonuje się następnie do wektorów ekspresyjnych pMRR14 (łańcuch ciężki) i pMR10.1 (łańcuch lekki).
Aktywność wiązania CD22 sekwencji z przeszczepionymi CDR
Wektory kodujące przeszczepione warianty transfekowano jednocześnie do komórek CHO w rozmaitych kombinacjach, łącznie z łańcuchami wyjściowego chimerowego przeciwciała. Powinowactwo wiązania porównywano w teście współzawodnictwa, w którym miało miejsce współzawodnictwo wiązania wyjściowego mysiego przeciwciała 5/44 o wiązanie się z komórkami Ramos (otrzymanymi z ATCC, limfoblastyczna ludzka linia komórek chłoniaka Burkitta wyrażająca powierzchniowe CD22). Test ten był uważany za najlepszą drogę porównywania przeszczepów pod względem ich zdolności do wiązania się z CD22 na powierzchni komórek. Wyniki są pokazane na Fig. 8. Jak można zobaczyć istnieje bardzo mała różnica pomiędzy przeszczepami, przy czym wszystkie wykazują większą skuteczność niż chimerowe we współzawodnictwie z mysim przeciwciałem rodzicielskim. Wprowadzenie 3 dodatkowych ludzkich reszt na końcu CDR-H3 (gH5 i gH7) nie wydaje się mieć wpływu na wiązanie.
Wybrano kombinację przeszczepu z mniejszą liczbą mysich reszt, gL1gH7. Przeszczep łańcucha lekkiego gL1 ma 6 reszt donorowych. Reszty V2, V4, L37 i Q45 są potencjalnie ważnymi resztami dla upakowania. Reszta H38 jest na styku VH/VL. Reszta D60 to reszta na powierzchni, blisko CDR-L2 i może ona bezpośrednio uczestniczyć w wiązaniu antygenu. Spośród tych reszt, V2, L37, Q45 i D60 znajdują się w sekwencji linii płciowych genów ludzkiego łańcucha kappa z innych podgrup. Przeszczep łańcucha ciężkiego gH7 ma 4 reszty donorowego regionu zrębowego (resztę R28 uważa się za część CDR-H1 zgodnie z definicją strukturalną używaną przy przeszczepianiu CDR (patrz Adair i wsp. (1991 WO91 /09967)). Reszty E1 i A71 to reszty powierzchniowe blisko CDR. Reszta I48 to
PL 218 433 B1 potencjalna reszta upakowywania. Reszta T93 jest obecna na styku VH/VL. Spośród tych reszt, E1 i A71 znajdują się w innych genach linii płciowej ludzkiej podgrupy I. Reszta I48 znajduje się podgrupie 4 ludzkiej linii płciowej, a reszta T73 znajduje się podgrupie 3 ludzkiej linii płciowej.
Pełna sekwencja DNA i białka zarówno dla łańcucha lekkiego jak i ciężkiego przeciwciała, włączając w to przybliżone położenie intronów w obrębie genów dla regionów stałych dostarczone w wektorach są przedstawione na Fig. 13 i są podane, odpowiednio, w SEK NR ID: 29 i SEK NR ID: 28, dla łańcucha lekkiego oraz, odpowiednio, SEK NR ID: 31 i SEK NR ID: 30, dla łańcucha ciężkiego.
DNA kodujący te geny łańcucha lekkiego i ciężkiego wycięto z tych wektorów. DNA łańcucha ciężkiego strawiono w miejscu 5' HindIII, a następnie traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA E. coli w celu wytworzenia tępego końca 5'. Cięcie w miejscu EcoRI po stronie 3' dało fragment łańcucha ciężkiego, który został oczyszczony z żelu agarozowego. W ten sam sposób wytworzono fragment łańcucha lekkiego, z wytępionym końcem 5' SfuI i miejscem EcoRI po stronie 3'. Obydwa fragmenty sklonowane w wektorach ekspresyjnych opartych o DHFR i użyto do wytworzenia stabilnych linii komórkowych w komórkach CHO.
PL 218 433 B1
Lista sekwencj i <110> Celltech R4D Limited <120> Produkty biologiczne <160>
SeqWin99, wersja 1.02 <17O>
<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H1 <400> 1
Asn Tyr Trp Ile His
5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H2 <400> 2
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 15 10 15
Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <2i3> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-H3 <400> 3
Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L1 <400> 4
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser 15 10 15
PL 218 433 B1 <210> 5 <2Η> 7 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L2 <400> 5
Gly Ile Sec Asn Arg Phe Ser
5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <2i3> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 CDR-L3 <400> 6
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr
5 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 domena VL <400> 7
Asp 1 Val Val Val Thr 5 Gin Thr Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Ser Phe 15 Gly
Asp Gin Val Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gin Ser Leu Ala 30 Asn Ser
Tyr Gly Asn 35 Thr Phe Leu Ser Trp 40 Tyr Leu His Lys Pro 45 Gly Gin Ser
Pro Gin 50 Leu Leu Ile Tyr Gly 55 Ile Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Val Pro
Asp Arg 65 Phe Thr Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80
Ser Thr Ile Lys Pro 85 Glu Asp Leu Gly Met 90 Tyr Tyr Cys Leu Gin 95 Gly
Thr His Gin Pro 100 Tyr Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys Leu Glu 110 Ile Lys
Arg <210> 8 <211> 121
PL 218 433 B1 <212> PRT <213> mysz <220>
<221> mysie monoklonalne 5/44 domena VH <400> 8
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Yal Thr Yal Ser Ser
115 120
<210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<22 0>
<221> cH <400> 9
Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly
10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT
<213> sekwencj a sztuczna
<220>
<223>
<220>
<221> N55Q
<400> 10
Gly Asn Gin Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
PL 218 433 B1 <210 11 <211> 13 <212> PRT
<213> sekwencja sztuczna
<220> <223>
<220> <221> T57A
<400 11
Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
<210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna
<220>
<223>
<220
<221> T57V
<400> 12
Gly Asn Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
<210 13
<211> 17
<212> PRT
<213>
<220>
<221> CDR-H2 (T57A) H*
<400> 13
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<22 3>
<220>
<221> K60R
<400 14
Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly
1 5 10
<210 15
PL 218 433 B1 <211> 17 <212> PRT <213>
<220>
<221> CDR-H2 (K60R) Η** <400> 15
Gly Ile Asn Pro Gly Ssn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn leu lys 15 10 15
Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213>
<220>
<221> CDR-H2 (T57A K60R) H’ <400> 16
Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys 15 10 15
Gly <210> 17 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> DPK9 <400> 17
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala
20 25 30
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp
50 55 60
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> JK1
PL 218 433 B1
«00> 18
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> sekwencj a sztuczna
<220>
<223>
<220>
<221> gLl <400> 19
Asp Val 1 Gin Val Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ser 25 Ser Gin Ser Leu Ala 30 Asn Ser
Tyr Gly Asn 35 Thr Phe Leu Ser Trp Tyr 40 Leu His Lys Pro 45 Gly Lys Ala
Pro Gin 50 Leu Leu Ile Tyr Gly 55 Ile Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Val Pro
Asp Arg 65 Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Thr Ile 80
Ser Ser Leu Gin Pro 85 Glu Asp Phe Ala Thr 90 Tyr Tyr Cys Leu Gin 95 Gly
Thr His Gin Pro 100 Tyr Thr Phe Gly Gin 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile Lys
Arg <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<22 3>
<220>
<221> gL2
<400> 20
Asp Val Val Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
PL 218 433 B1
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly
85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210 21
<211> 80
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220
<221> DP7
<400> 21
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val
20 25 30
Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Phe Gin Gly
35 40 45
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp. Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75 80
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220
<221> JH4
<400 22
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
PL 218 433 B1 <221> gHl <400> 23
Glu Val Gin Leu 1 Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cye Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gin Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223>
<220>
<221> gH4
<400> 24
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
PL 218 433 B1
115 120
<2io> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223>
<220>
<221> gH5
<400 25
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Het Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210 26
<211> 121
<212> PRT
<213> sekwencj a sztuczna
<220>
<223>
<220
<221> gH6
<400> 26
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe
50 55 60
PL 218 433 B1
Gin 65 Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223>
<220>
<221> gB7
<400> 27
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Giy Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Giy Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <22 0>
<223>
<221> Pełna sekwencja DNA przeszczepionego łańcucha lekkiego <4O0> 28
PL 218 433 B1
Met Lys 1 Leu Pro Val 5 Arg Leu Leu Val Leu 10 Leu Leu Phe Trp Ile 15 Pro
Ala Ser Arg Gly Asp 20 Val Gin Val Thr 25 Gin Ser Pro Ser Ser 30 Leu Ser
Ala Ser Val 35 Gly Asp Arg Val Thr 40 Ile Thr Cys Arg Ser 45 Ser Gin Ser
Leu Ala 50 Asn Ser Tyr Gly Asn 55 Thr Phe Leu Ser Trp 60 Tyr Leu His Lys
Pro 65 Gly Lys Ala Pro Gin 70 Leu Leu Ile Tyr Gly 75 Ile Ser Asn Arg Ehe 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg 85 Phe Ser Gly Ser 90 Gly Ser Gly Thr Asp 95 Phe
Thr Leu Thr Ile 100 Ser Ser Leu Gin Pro 105 Glu Asp Phe Ala Thr 110 Tyr Tyr
Cys Leu Gin 115 Gly Thr His Gin Pro 120 Tyr Thr Phe Gly Gin 125 Gly Thr Lys
Val Glu 130 Ile Lys Arg Thr Val 135 Ala Ala Pro Ser Val 140 Phe He Phe Pro
Pro 145 Ser Asp Glu Gin Leu 150 Lys Ser Gly Thr Ala 155 Ser Val Val Cys Leu 160
Leu Asn Asn Phe Tyr 165 Pro Arg Glu Ala Lys 170 Val Gin Trp Lys Val 175 Asp
Asn Ala Leu Gin 180 Ser Gly Asn Ser Gin 185 Glu Ser Val Thr Glu 190 Gin Asp
Ser Lys Asp 195 Ser Thr Tyr Ser Leu 200 Ser Ser Thr Leu Thr 205 Leu Ser Lys
Ala Asp 210 Tyr Glu Lys His Lys 215 Val Tyr Ala Cys Glu 220 Val Thr His Gin
Gly 225 Leu Ser Ser Pro Val 230 Thr Lys Ser Phe Asn 235 Arg Gly Glu Cys
<210> 29 <211> 781 <212> DNA <213>
<220> _ , <221> Pełna sekwencja przeszczepionego łańcucha lekkiego <400> 29 ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt 60 cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta 120 ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180 acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga 240 atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag tggtactgat 300 ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa 360 ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta 420
PL 218 433 B1 gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaąc 720 aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt 780
C 781 <210> 30 <211> 467 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<22l> Pełna sekwencja przeszczepionego łańcucha ciężkiego <400> 30
Met 1 Asp Phe Gly Phe 5 Ser Leu Val Phe Leu' 10 Ala Leu Ile Leu Lys 15 Gly
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Val Gin 25 Ser Gly Ala Glu Val 30 Lys Lys
Pro Gly Ala 35 Ser Val Lys Val Ser 40 Cys Lys Ala Ser Gly 45 Tyr Arg Phe
Thr Asn 50 Tyr Trp Ile His Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Gin Gly Leu
Glu 65 Trp Ile Gly Gly Ile 70 Asn Pro Gly Asn Asn 75 Tyr Ala Thr Tyr Arg 80
Arg Lys Phe Gin Gly Arg 85 Val Thr Met Thr 90 Ala Asp Thr Ser Thr 95 Ser
Thr Val Tyr Met 100 Glu Leu Ser Ser Leu 105 Arg Ser Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Thr Arg Glu Gly Tyr 120 Gly Asn Tyr Gly Ala 125 Trp Phe Ala
Tyr Trp 130 Gly Gin Gly Thr Leu 135 Val Thr Val Ser Ser 140 Ala Ser Thr Lys
Gly 145 Pro Ser Val Phe Pro 150 Leu Ala Pro Cys Ser 155 Arg Ser Thr Ser Glu 160
Ser Thr Ala Ala Leu 165 Gly Cys Leu Val Lys 170 Asp Tyr Phe Pro Glu 175 Pro
Val Thr Val Ser 180 Trp Asn Ser Gly Ala 185 Leu Thr Ser Gly Val 190 His Thr
Phe Pro Ala 195 Val Leu Gin Ser Ser 200 Gly Leu Tyr Ser Leu 205 Ser Ser Val
Yal Thr 210 Yal Pro Ser Ser Ser 215 Leu Gly Thr Lys Thr 220 Tyr Thr Cys Asn
PL 218 433 B1
Val 225 Asp His Lys Pro Ser 230 Asn Thr Lys Val Asp 235 Lys Arg Val Glu Ser 240
Lys Tyr Gly Pro Pro 245 Cys Pro Pro Cys Pro 250 Ala Pro Glu Phe Leu 255 Gly
Gly Pro Ser Val 260 Phe Leu Phe Pro Pro 265 Lys Pro Lys Asp Thr 270 Leu Met
Ile Ser Arg 275 Thr Pro Glu Val Thr 280 Cys Val Val Val Asp 285 Val Ser Gin
Glu Asp 290 Pro Glu Val Gin Phe 295 Asn Trp Tyr Val Asp 300 Gly Val Glu Val
His 305 Asn Ala Lys Thr Lys 310 Pro Arg Glu Glu Gin 315 Phe Asn Ser Thr Tyr 320
Arg Val Val Ser Val 325 Leu Thr Val Leu His 330 Gin Asp Trp Leu Asn 335 Gly
Lys Glu Tyr Lys 340 Cys Lys Val Ser Asn 345 Lys Gly Leu Pro Ser 350 Ser Ile
Glu Lys Thr 355 Ile Ser Lys Ala Lys 360 Gly Gin Pro Arg Glu 365 Pro Gin Val
Tyr Thr 370 Leu Pro Pro Ser Gin 375 Glu Glu Met Thr Lys 380 Asn Gin Val Ser
Leu 385 Thr Cys Leu Val Lys 390 Gly Phe Tyr Pro Ser 395 Asp Ile Ala Val Glu 400
Trp Glu Ser Asn Gly 405 Gin Pro Glu Asn Asn 410 Tyr Lys Thr Thr Pro 415 Pro
Val Leu Asp Ser 420 Asp Gly Ser Phe Phe 425 Leu Tyr Ser Arg Leu 430 Thr Val
Asp Lys Ser 435 Arg Trp Gin Glu Gly 440 Asn Val Phe Ser Cys 445 Ser Val Met
His Glu 450 Ala Leu His Asn His 455 Tyr Thr Gin Lys Ser 460 Leu Ser Leu Ser
Leu Gly Lys
465 <210> 31 <211> 2160 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<22l> Pełna sekwencja DNA przeszczepionego łańcucha ciężkiego <400> 31
PL 218 433 B1 aagcttgccg ccaccatgga cttcggattć tctctcgtgt tcctggcact ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc cgcatacagg ggeaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac eactgccctg <210> 32 <211> 94 <212> DNA <2ł3> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544gHl Tl <400> 32 agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac <210> 33 <211> 96 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22Q>
<223>
<220>
cattctcaag 60
gcctggtgct 120
gattcattgg ISO
cgggaataac 240
cacctccaca 300
gtactattgt 360
gggtacccta 420
gccctgctcc 480
cttccecgaa 540
cttcccggct 600
ctccagcagc 660
caaggtggac 720
ccaggctcag 780
aggcatgccc 840
agagggtctt 900
ceaggccctg 960
gaggaccctg 1020
agacaccttc 1080
tatggtcccc 1140
aggcgggaca 1200
cgcatccacc 1260
gttcccccca 1320
ggtggtggac 1380
ggaggtgcat 1440
ggtcagegtc 1500
ggtctccaac 1560
gacccacggg 1620
gagtgaccgc 1680
ccctgceccc 1740
aaggcttcta 1800
actacaagac 1860
taaccgtgga 1920
aggctctgca 1980
cagggccggc 2040
accccgtcta 2100
gctcgaattc 2160
gcttccgtca 60 94
PL 218 433 B1 <2Z1> 544gHl Τ2 <400> 33 gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaag ggcagagcaa 60 cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 96 <210> 34 <211> 95 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22 0>
<223>
<22 0>
<221> 544gHl T3 <400> 34 agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc 60 acagtctcct cagcttctae aaagggccca agaaa 95 <210 35 <211> 94 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223>
<220 <221> 544 gHl BI <400 35 ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga 60 atccgaagtc catggtggog gcaagctttt attc 94 <210> 36 <211> 97 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223>
<220 <221> 544gHl B2 <400> 36 gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc 60 aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 97 <210> 37 <211> 93 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544gHl B3
PL 218 433 B1 <400> 37 cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag 60 atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 93 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544gHl FI <400> 38 gaataaaagc ttgccgccac c 21 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22 0>
<22 3>
<220>
<221> 544gHl Rl <400> 39 tttcttgggc cctttgtaga ag 22 <21Q> 40 <211> 87 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544 gLl Tl <400> 40 gcttcccggg gtgacgttca agtgacccag agcccatcca gcctgagcgc atctgtagga 60 gaccgggtca ccatcacttg tagatcc 87 <210> 41 <211> 90 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544 gLl T2 <400> 41 tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt 60
PL 218 433 B1 agtggtgtac cagacaggtt cagcggttcc 90
<210> <211> <212 > <213> 42 91 DNA sekwencja sztuczna
<220> <223>
<220 <221> 54 4gl*l T3
<400> 42
agatttcgcc acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat tcggtcaggg 60 tactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c 91 <210> 43 <211> 88 <212> DNA <213>
<220>
<221> 544gll BI <400> 13 gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag cacoaacagc ctaacaggca 60 acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc 88 <210> 44 <211> 88 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220 <221> 544gLl B2 <400> 44 ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac 60 tctgactgga tctacaagtg atggtgac 88 <210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220 <221> 544gLl B3 <400> 45 aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag 60 taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg 90 <210> 46 <21ł> 20
PL 218 433 B1 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
<220>
<221> 544gLl FI <400> 46 ggatgattcg aagccgccac 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213>
<220>
<221> 544gLl R1 <400> 47 gcacgccgta cgtttgattt c 21 <210> 48 <211> 339 <212> DNA <213> mysz <220>
<221> sekwencja DNA mysiego monoklonalnego 5/44 VL <400> 48 gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt gctttggaga ggaacacctt atgggatttc cagatttcae tacaaggtac tcaagtttct tttgtcttgg caacagattt actcaagatc acatcagccg
120
180
240
300
339 <210> 49 <211> 363 <212> DNA <213> mysz <221> sekwencja DNA mysiego monoklonalnego 5/44 VH <400> 49 gaggtccaac tgcagcagtc tcctgcaagg cttctggcta cctgggcagg gtctagaatg aagaggaact tgaagggcaa atggacctca gcagcctgac tatggtaact acggggcctg tca tgggactgta caggtttacc gattggtggt ggccacactg aagtgaggac gtttgcttac ctggcaaggc aactactgga attaatcctg actgcagtca tctgcggtct tggggccagg ctggggcttc ttcactgggt gaaataatta catccgccag attactgtac ggactctggt cgtgaagatg aaaacagagg tactacgtat cactgcctac aagagagggc caccgtctcc
120
180
240
300
360
363 <210> 50 <211> 9 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna
PL 218 433 B1 <220>
<223> sekwencja w starterze oligonukleotydu <400> 50 gccgccacc g <210> 51 <211> 101 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> , , . , <223> starter 5' oligonukleotydu <400> 51 gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60 ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g 101

Claims (35)

1. Cząsteczka przeciwciała wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22, znamienna tym, że zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje SEK NR ID: 1 dla CDR-H1, SEK NR ID; 2 lub SEK NR ID: 13 lub SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16 lub sekwencję GINPGNNYATYRRKFQG w gH7 na Fig. 6 dla CDR-H2, SEK NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje SEK NR ID: 4 dla CDR-L1, SEK NR ID: 5 dla CDR-L2 i SEK NR ID: 6 dla CDR-L3.
2. Cząsteczka przeciwciała według zatrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję GINPGNNYATYRRKFQG dla CDR-H2.
3. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest cząsteczką przeciwciała z przeszczepionym CDR.
4. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 3, znamienna tym, że domena zmienna obejmuje ludzkie akceptorowe regiony zrębowe i inne niż ludzkie donorowe CDR.
5. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 4, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na SEK NR ID: 21 i 22 oraz zawierają reszty donorowe w pozycjach 1, 28, 48, 71 i 93, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom 1, 28, 48, 72 i 97, odpowiednio, w SEK NR ID: 8.
6. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 5, znamienna tym, że dodatkowo zawiera reszty donorowe w pozycjach 67 i 69, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom 68 i 70, odpowiednio, w SEK NR ID: 8.
7. Cząsteczka przeciwciała według z zastrz. od 4 lub 5, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego są oparte na SEK NR ID: 17 i 18 i zawierają reszty donorowe w pozycjach 2, 4, 37, 38, 45 i 60, zgodnie z numeracją Kabata, które odpowiadają resztom w pozycjach 2, 4, 42, 43, 50 i 65, odpowiednio, w SEK NR ID: 7.
8. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 7, znamienna tym, że dodatkowo zawiera resztę donorową w pozycji 3, zgodnie z numeracją Kabata, która odpowiada reszcie w tej pozycji w SEK NR ID: 7.
9. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje łańcuch ciężki określony w zastrz, 5 i łańcuch lekki określony w zastrz. 7.
10. Cząsteczka przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 5, 7 i 9, znamienna tym, że zawiera SEK NR ID: 19 (region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1) i SEK NR ID: 27 (region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7).
11. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 30.
12. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki składający się z sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki składający się z sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
13. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki obejmujący reszty 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący reszty 20 do 466 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
14. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
15. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki obejmujący reszty 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki obejmujący reszty 20 do 467 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
16. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 28 i łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 467 sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 30.
17. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową powstałą w wyniku ekspresji SEK NR ID: 29 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową powstałą w wyniku ekspresji SEK NR ID: 31 w komórce ssaka.
18. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki składający się z sekwencji aminokwasowej powstałej w wyniku ekspresji SEK NR ID: 29 i łańcuch ciężki
PL 218 433 B1 składający się z sekwencji aminokwasowej powstałej w wyniku ekspresji SEK NR ID: 31 w komórce ssaka.
19. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że jest mysim przeciwciałem monoklonalnym 5/44 anty-CD22, w którym domena zmienna łańcucha lekkiego ma sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 7, a domena zmienna łańcucha ciężkiego ma sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 8.
20. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że jest cząsteczką przeciwciała chimerowego zawierającą sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 19, przedstawione odpowiednio w SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8.
21. Sekwencja DNA kodująca łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub łańcuch ciężki i łańcuch lekki cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 20.
22. Wektor do klonowania lub ekspresji zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 21.
23. Komórka gospodarza zawierająca wektor do klonowania lub ekspresji określony w zastrz. 22.
24. Cząsteczka przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 20 albo sekwencja DNA według zastrz. 21 do zastosowania w terapii.
25. Cząsteczka przeciwciała według dowolnego z zastrz. od 1 do 20 albo 24, wykazująca swoistość wobec ludzkiego CD22 albo sekwencja DNA według zastrz. 21 lub 24 do zastosowania w leczeniu patologii, w której pośredniczą komórki wyrażające CD22.
26. Cząsteczka przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 20, 24 albo 25 lub sekwencja DNA według zastrz. 21, 24 albo 25 do zastosowania w leczeniu chłoniaka złośliwego.
27. Cząsteczka przeciwciała albo sekwencja DNA według zastrz. 26, znamienne tym, że chłoniakiem złośliwym jest chłoniak nieziarniczy.
28. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. od 1 do 20, wykazującej swoistość wobec ludzkiego CD22 albo zastosowanie sekwencji DNA określonej w zastrz. 21 do wytwarzania leku do leczenia patologii, w której pośredniczą komórki wyrażające CD22.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że patologią jest chłoniak złośliwy.
30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że chłoniakiem złośliwym jest chłoniak nieziarniczy.
31. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę przeciwciała określoną w dowolnym z zastrz. 1 do 20 albo sekwencję DNA określoną w zastrz. 21.
32. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna według zastrz. 31, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, rozcieńczalnik albo nośnik.
33. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna według zastrz. 31 albo 32, znamienna tym, że zawiera dodatkowo przeciwciała skierowane przeciwko limfocytom T, IFNy albo LPS lub składniki inne niż przeciwciała, takie jak ksantyny.
34. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała określonego w dowolnym z zastrz. 1 do 20, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 23 w warunkach odpowiednich do doprowadzenia do ekspresji białka z DNA kodującego taką cząsteczkę przeciwciała i wyizolowania takiej cząsteczki przeciwciała.
35. Sposób wytwarzania kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej określonej w dowolnym z zastrz. 31 do 33, znamienny tym, że obejmuje zmieszanie cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. od 1 do 20 z dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką, rozcieńczalnikiem albo nośnikiem.
PL373277A 2002-05-02 2003-05-02 Cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego CD22, sekwencja DNA, wektor, komórka gospodarza, kompozycja, ich zastosowania terapeutyczne i sposoby wytwarzania PL218433B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0210121.0A GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-05-02 Biological products

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373277A1 PL373277A1 (pl) 2005-08-22
PL218433B1 true PL218433B1 (pl) 2014-12-31

Family

ID=9935990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373277A PL218433B1 (pl) 2002-05-02 2003-05-02 Cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego CD22, sekwencja DNA, wektor, komórka gospodarza, kompozycja, ich zastosowania terapeutyczne i sposoby wytwarzania

Country Status (35)

Country Link
US (8) US7355011B2 (pl)
EP (1) EP1504035B9 (pl)
JP (3) JP4486494B2 (pl)
KR (3) KR101386376B1 (pl)
CN (3) CN100384878C (pl)
AT (1) ATE462729T3 (pl)
AU (1) AU2003223007C1 (pl)
BE (1) BE2017C068I2 (pl)
CA (1) CA2484420C (pl)
CO (1) CO5631451A2 (pl)
CY (3) CY1110134T1 (pl)
DE (1) DE60331910D1 (pl)
DK (1) DK1504035T6 (pl)
EC (1) ECSP045470A (pl)
ES (1) ES2341708T7 (pl)
FR (1) FR17C1062I2 (pl)
GB (1) GB0210121D0 (pl)
HK (2) HK1071762A1 (pl)
HU (2) HUS1700055I1 (pl)
IL (1) IL164923A (pl)
LT (2) LTPA2017043I1 (pl)
LU (2) LUC00057I2 (pl)
MX (1) MXPA04010787A (pl)
NL (1) NL300920I2 (pl)
NO (3) NO336201B3 (pl)
NZ (1) NZ536757A (pl)
PL (1) PL218433B1 (pl)
PT (1) PT1504035E (pl)
RU (1) RU2342401C2 (pl)
SG (1) SG161744A1 (pl)
SI (1) SI1504035T1 (pl)
TW (1) TWI324161B (pl)
UA (1) UA92580C2 (pl)
WO (1) WO2003093320A2 (pl)
ZA (1) ZA200408851B (pl)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE468348T1 (de) 2001-09-26 2010-06-15 Government Of The Us Secretary Mutierte anti-cd22-antikörper mit erhöhter affinität zu cd22-exprimierenden leukämiezellen
US20110045005A1 (en) 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
AU2003224624B2 (en) 2002-02-21 2008-08-28 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
ES2916174T3 (es) 2002-05-02 2022-06-28 Wyeth Holdings Llc Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GT200500283A (es) * 2004-10-08 2006-05-08 Inmunoterapia de desordenes autoinmunes
EP3673919A1 (en) 2005-06-14 2020-07-01 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
EP1998799B8 (en) * 2006-03-06 2014-03-05 Medlmmune, LLC Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP1999148B8 (en) * 2006-03-06 2014-03-05 Medlmmune, LLC Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
TWI523864B (zh) * 2006-05-30 2016-03-01 建南德克公司 抗體及免疫接合物及其用途
US8481683B2 (en) 2006-12-01 2013-07-09 Medarex, Inc. Human antibodies that bind CD22 and uses thereof
US8591889B2 (en) 2008-04-04 2013-11-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for CD22
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
US9238878B2 (en) * 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
EP2473637B1 (en) 2009-09-03 2017-03-29 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
CN103415621A (zh) 2011-01-14 2013-11-27 雷德伍德生物科技股份有限公司 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法
JP6271254B2 (ja) 2011-02-28 2018-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アンタゴニストに対する生物学的マーカー及び応答を予測するための方法
KR20150008080A (ko) 2012-04-26 2015-01-21 바이오아트라, 엘엘씨 항-cd22 항체
SG11201408626YA (en) 2012-07-03 2015-03-30 Univ Washington Antibodies to tau
IN2015DN00552A (pl) 2012-07-19 2015-06-26 Redwood Bioscience Inc
BR112015009003B1 (pt) 2012-10-24 2023-01-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Receptores de antígeno quiméricos que se ligam especificamente a cd22, ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, microrganismo transgênico, composição farmacêutica, e uso dos mesmos
CN103214578B (zh) * 2013-05-10 2014-05-28 北京东方百泰生物科技有限公司 一种新型的人源化抗cd22抗体
CN105828841A (zh) 2013-11-04 2016-08-03 辉瑞大药厂 抗-efna4抗体-药物缀合物
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
TW202136296A (zh) 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
ES2923894T3 (es) * 2015-04-08 2022-10-03 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
KR20180102065A (ko) 2015-11-09 2018-09-14 알.피.쉐러 테크놀러지즈 엘엘씨 항-cd22 항체-메이탄신 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CN109071634A (zh) 2016-04-26 2018-12-21 R.P.谢勒技术有限责任公司 抗体偶联物及其制备和使用方法
GB201610512D0 (en) * 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
SG11201903521XA (en) 2016-10-21 2019-05-30 Amgen Inc Pharmaceutical formulations and methods of making the same
CA3095595A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting cd22 and uses thereof
WO2021197483A1 (zh) * 2020-04-02 2021-10-07 南京驯鹿医疗技术有限公司 全人源抗人cd22的嵌合抗原受体及其应用
US20230331840A1 (en) * 2020-08-27 2023-10-19 Fapon Biotherapy Inc. Cd22 antibody and application thereof
WO2022262783A1 (zh) * 2021-06-16 2022-12-22 西安宇繁生物科技有限责任公司 抗cd22的全人源抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用
JP2024534148A (ja) * 2021-08-27 2024-09-18 ペプトロン インコーポレイテッド 新規抗ｍｕｃ１抗体およびその用途
US20240166705A1 (en) 2022-11-07 2024-05-23 Xencor, Inc. Il18-fc fusion proteins

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3957362A (en) * 1972-10-02 1976-05-18 Corneal Sciences, Inc. Hydrogels and articles made therefrom
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5134075A (en) * 1989-02-17 1992-07-28 Oncogen Limited Partnership Monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ATE207075T1 (de) * 1990-06-27 2001-11-15 Univ Princeton Sonden für die detektion der p53 mutante
DK0531472T3 (da) * 1991-03-06 2003-12-01 Merck Patent Gmbh Humaniserede monoklonale antistoffer
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5686072A (en) 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5714340A (en) * 1992-12-22 1998-02-03 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay elements having a receptor zone
US6180377B1 (en) * 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) * 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
ES2270425T3 (es) * 1994-01-25 2007-04-01 Elan Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanizados contra la molecula de adhesion leucocitaria vla-4.
JP3053873B2 (ja) * 1994-08-12 2000-06-19 イムノメディクス，インコーポレイテッド Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に特異的な免疫結合体およびヒト化抗体
ES2158048T5 (es) 1994-08-12 2009-11-04 The University Of Utah Research Foundation Mutaciones del gen ligado al cromosoma 17q, de susceptibilidad al cancer de mama y de ovario.
US5712374A (en) * 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7147851B1 (en) * 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US20020141990A1 (en) * 1996-11-01 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Anti-RSV human monoclonal antibodies
EP0977590A4 (en) * 1996-11-01 2001-03-14 Smithkline Beecham Corp HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
ATE383430T1 (de) 1997-03-20 2008-01-15 Us Gov Health & Human Serv Rekombinante antikörper und immunkonjugate gezielt auf cd22-tragende zellen und tumoren
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DK0999853T3 (da) 1997-06-13 2003-04-22 Genentech Inc Stabiliseret antostofformulering
AT408613B (de) * 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
KR100345463B1 (ko) * 1998-11-19 2003-01-08 주)녹십자 B형간염바이러스의표면항원프리-s1에대한인간화항체및이의제조방법
EP2289551A1 (en) * 1999-06-09 2011-03-02 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
CN1382259A (zh) * 1999-10-12 2002-11-27 康奈科斯优化研究和发展有限公司 检测粪便中抗酸微生物的改进方法
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
SG136804A1 (en) * 2000-07-12 2007-11-29 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
CN1205479C (zh) * 2000-10-31 2005-06-08 杨梦甦 免疫学诊断蛋白芯片制备方法
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
ES2916174T3 (es) 2002-05-02 2022-06-28 Wyeth Holdings Llc Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
EP1999148B8 (en) * 2006-03-06 2014-03-05 Medlmmune, LLC Humanized anti-cd22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003093320A3 (en) 2004-02-05
KR20050025167A (ko) 2005-03-11
NL300920I2 (nl) 2021-04-15
CA2484420C (en) 2014-09-16
NL300920I1 (pl) 2018-01-03
AU2003223007C1 (en) 2019-08-08
US7919606B2 (en) 2011-04-05
SG161744A1 (en) 2010-06-29
SI1504035T1 (sl) 2010-07-30
EP1504035B8 (en) 2018-02-28
LUC00058I2 (pl) 2018-02-26
US20030235869A1 (en) 2003-12-25
NO336201B1 (no) 2015-06-15
CN100384878C (zh) 2008-04-30
EP1504035A2 (en) 2005-02-09
LUC00057I1 (pl) 2017-12-27
FR17C1062I2 (fr) 2020-05-29
EP1504035B3 (en) 2017-12-20
CO5631451A2 (es) 2006-04-28
NZ536757A (en) 2006-06-30
LTC1504035I2 (lt) 2022-04-11
US20210371547A1 (en) 2021-12-02
LTPA2017043I1 (lt) 2018-01-10
NO2017068I1 (no) 2017-12-21
TWI324161B (en) 2010-05-01
EP1504035B1 (en) 2010-03-31
PT1504035E (pt) 2010-06-07
US20120302739A1 (en) 2012-11-29
US20110165659A1 (en) 2011-07-07
LUC00058I1 (pl) 2017-12-27
UA92580C2 (ru) 2010-11-25
WO2003093320A2 (en) 2003-11-13
ZA200408851B (en) 2006-01-25
US8895714B2 (en) 2014-11-25
IL164923A (en) 2012-03-29
DK1504035T3 (da) 2010-06-07
AU2003223007A1 (en) 2003-11-17
CY1110134T1 (el) 2015-01-14
CY2017046I1 (el) 2018-12-12
KR101156796B1 (ko) 2012-06-21
ES2341708T7 (es) 2018-04-11
CN103172742A (zh) 2013-06-26
US7355011B2 (en) 2008-04-08
CA2484420A1 (en) 2003-11-13
FR17C1062I1 (pl) 2018-02-16
JP2013230158A (ja) 2013-11-14
HUS1700055I1 (hu) 2018-07-30
LTPA2017044I1 (lt) 2018-01-10
JP2010022372A (ja) 2010-02-04
CN101134779A (zh) 2008-03-05
HK1071762A1 (en) 2005-07-29
DK1504035T6 (en) 2018-03-12
NO2017069I1 (no) 2017-12-21
CY2017046I2 (el) 2018-12-12
KR101386376B1 (ko) 2014-04-16
BE2017C068I2 (pl) 2022-08-09
US20170145114A1 (en) 2017-05-25
ATE462729T3 (de) 2010-04-15
LUC00057I2 (pl) 2018-02-26
RU2342401C2 (ru) 2008-12-27
GB0210121D0 (en) 2002-06-12
MXPA04010787A (es) 2005-03-07
JP5377173B2 (ja) 2013-12-25
CY2017045I1 (el) 2019-11-27
DE60331910D1 (de) 2010-05-12
JP2006506955A (ja) 2006-03-02
US20100021995A1 (en) 2010-01-28
JP5920934B2 (ja) 2016-05-18
TW200307690A (en) 2003-12-16
KR20120127513A (ko) 2012-11-21
NO336201B3 (no) 2015-06-15
KR101238970B1 (ko) 2013-03-04
NO20044742L (no) 2004-12-22
US20070059307A1 (en) 2007-03-15
JP4486494B2 (ja) 2010-06-23
KR20110004463A (ko) 2011-01-13
AU2003223007B2 (en) 2009-07-16
ES2341708T3 (es) 2010-06-25
HUS1700056I1 (hu) 2018-07-30
CN103172742B (zh) 2016-05-11
CN101134779B (zh) 2013-03-13
CY2017045I2 (el) 2019-11-27
IL164923A0 (en) 2005-12-18
PL373277A1 (pl) 2005-08-22
ECSP045470A (es) 2005-01-28
US20160326247A1 (en) 2016-11-10
CN1662558A (zh) 2005-08-31
HK1186479A1 (zh) 2014-03-14
EP1504035B9 (en) 2018-10-17
RU2004135103A (ru) 2005-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101156796B1 (ko) 인간 ｃｄ22 특이성 항체 및 이들의 치료학적, 진단학적 사용
BRPI0309730B1 (pt) Molécula de anticorpo possuindo especificidade para cd22 humana, sequência de dna, vetor de expressão ou clonagem, célula hospedeira, uso da molécula de anticorpo ou da sequência de dna, composição diagnóstica ou terapêutica, processo para a produção de uma molécula de anticorpo, processo para a preparação de uma composição diagnóstica ou terapêutica