PT1504035E - Anticorpos específicos de cd22 humano e suas utilizações terapêuticas e de diagnóstico - Google Patents

Anticorpos específicos de cd22 humano e suas utilizações terapêuticas e de diagnóstico Download PDF

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Simon Peter Tickle
Heather Margaret Ladyman
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Description

ΡΕ1504035 1 DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE CD22 HUMANO E SUAS UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS E DE DIAGNÓSTICO" O presente invento está relacionado com uma molécula de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigénicos do antigénio de linfócitos B, CD22. O presente invento também está relacionado com as utilizações terapêuticas da molécula de anticorpo e métodos para a produção da molécula de anticorpo.
Numa molécula de anticorpo natural, existem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve possuem no seu extremo N-terminal um domínio variável. Cada domínio variável é composto por quatro regiões estruturais (FRs) que alternam com três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os resíduos nos domínios variáveis são convencionalmente numerados de acordo com um sistema da autoria de Kabat et al. Este sistema está descrito em Kabat et al., 1987, in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, USA (daqui em diante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeração foi usado na presente especificação, excepto quando de outra forma indicado. 2 ΡΕ1504035
As designações de resíduos Kabat não correspondem sempre directamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear pode conter mais ou menos aminoácidos do que a numeração estrita de Kabat, correspondendo a um encurtamento ou aumento de um componente estrutural, quer seja estrutura quer seja CDR, da estrutura básica do domínio variável. A numeração correcta dos resíduos segundo Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo através do alinhamento de resíduos homólogos na sequência do anticorpo com uma sequência "convencional" numerada segundo Kabat.
As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com a numeração de Kabat.
As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão situadas nos resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com a numeração Kabat. A construção de anticorpos enxertados com CDRs está descrita no Pedido de Patente Europeia EP-A-0239400, o qual descreve um processo em que as CDRs de um anticorpo monoclonal de ratinho estão enxertadas nas regiões estruturais dos domínios variáveis de uma imunoglobulina humana através de mutagénese dirigida usando oligonucleótidos longos. As CDRs determinam a especificidade de ligação ao 3 ΡΕ1504035 antigénio dos anticorpos e são sequências peptídicas relativamente curtas inseridas nas regiões estruturais dos domínios variáveis. 0 trabalho mais antigo sobre humanização de anticorpos monoclonais através de enxertos de CDRs foi realizado em anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios sintéticos, tais como NP. No entanto, os exemplos em que um anticorpo monoclonal de ratinho que reconhece lizozima e um anticorpo monoclonal de rato que reconhece um antigénio nas células T humanas foram humanizados através do enxerto de CDRs tinham sido descritos por Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) e Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.
Riechmann et al., encontraram que a transferência das CDRs sozinhas (como definido por Kabat (Kabat et al. (supra) e Wu et al., J. exp. Med., 132, 211-250, 1970)) não era suficiente para proporcionar actividade satisfatória de ligação ao antigénio no produto com CDRs enxertadas. Encontrou-se que uma série de resíduos estruturais têm de ser alterados de forma a corresponderem aos da região estrutural dadora. Os critérios propostos para a selecção dos resíduos que necessitam de alteração estão descritos no Pedido de Patente Internacional N° 90/07861.
Foi publicada uma série de revisões que discutem os anticorpos enxertados com CDRs, incluindo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). 4 ΡΕ1504035
Os linfomas malignos são um grupo diverso de neoplasias. A maioria dos casos ocorre em pessoas mais idosas. 0 linfoma não-Hodgkin (NHL) é uma doença que actual-mente afecta 200000 a 250000 doentes nos EUA. É o segundo cancro com maior crescimento de incidência nos EUA, aumentado a uma taxa de 55000 novos casos por ano. A incidência está a aumentar a uma velocidade que é superior à devida simplesmente ao aumento da idade da população e exposição a factores de risco conhecidos. A classificação dos linfomas é complexa e tem evoluído nas últimas décadas. Em 1994, foi introduzida a classificação de linfomas Europeia-Americana Revista (Revi-sed European-American Lymphoma (REAL)). Esta classificação organiza os linfomas das células B (os mais frequentemente identificados), das células T e de origem não classificável em subtipos acordados. Na prática diária, o agrupamento de NHLs nas categorias de grau baixo, intermédio e elevado, com base no seu aspecto histológico geral, reflecte em sentido lato o seu comportamento clínico. NHL afecta predominantemente os nódulos linfáticos mas, em doentes individuais, o tumor pode envolver outros locais anatómicos tais como o fígado, o baço, a medula óssea, o pulmão, o intestino e a pele. A doença normalmente apresenta-se como um aumento indolor dos nódulos linfáticos. O linfoma extranodal mais frequentemente afecta o intestino, ainda que o linfoma primário de 5 ΡΕ1504035 virtualmente qualquer órqão tenha sido documentado. Os sintomas sistémicos incluem febre, suores, fadiga e perda de peso.
Até recentemente, o sistema de fases Ann Arbor, baseado totalmente no grau anatómico da doença, foi o principal determinante de terapia em NHL. Esta informação pode ser refinada através da incorporação de aspectos prognósticos adicionais, incluindo idade, níveis séricos da desidrogenase de lactato e estatuto de desempenho. Mesmo assim, o conhecimento do sistema de fases de Ann Arbor, juntamente com o subtipo histológico e imunológico do tumor, é ainda o principal determinante do tratamento. NHL de grau baixo tem um curso indolente, com uma sobrevivência média do doente de 8 a 10 anos. A terapia actualmente disponível tem pouco impacto na sobrevivência, ainda que a irradiação da doença localizada e a quimioterapia para os sintomas sistémicos melhore a qualidade de vida do doente. A quimioterapia de combinação pode ser reservada para a doença de relapso. A doença intermédia e, especialmente a doença de grau elevado é extremamente agressiva e tende a disseminar. A doença deste grau requer tratamento urgente. A radioterapia pode ser um componente útil do tratamento em doentes com doença muito volumosa. Têm sido empregues muito regimes diferentes de quimioterapia e a sobrevivência a longo prazo sem doença pode ser conseguida em mais de metade dos doentes. A terapia com doses elevadas com suporte de células 6 ΡΕ1504035 estaminais foi introduzida inicialmente para doentes com doença de relapso ou refractária, mas tem vindo de forma crescente a encontrar um lugar na terapia de primeira linha para doentes com doença de baixo risco. A tendência nos últimos anos para uma abordagem terapêutica cada vez mais agressiva deve ser equilibrada em função da idade mais avançada e debilidade relativa de muitos doentes com NHL e pela necessidade de conjugar a toxicidade do tratamento com o prognóstico individual de cada doença do doente. São necessários melhores tratamentos, que sejam mais eficazes e melhor tolerados. Os agentes recentemente introduzidos incluem novos fármacos citotóxicos, progressivamente incorporados em combinações e a introdução de terapias baseadas em anticorpos. 0 linfoma não-Hodgkin inclui uma gama de linfomas de células B. Os antigénios das células B representam assim alvos adequados para a terapia com anticorpos. CD22 é uma glicoproteina de membrana de 135 KDa pertencente à família das proteínas que se ligam a ácido siálico, designadas sialoadesinas. É detectado no citoplasma na fase inicial do desenvolvimento das células B, surge na superfície celular simultaneamente com IgD e encontra-se na maioria das células B maduras. A expressão é aumentada após activação das células B. CD22 perde-se com a diferenciação terminal e é geralmente descrito como estando ausente nos plasmócitos. Assim, este antigénio de inter- 7 ΡΕ1504035 nalização está presente na superfície de células pré-B mas não nas células estaminais ou plasmócitos.
No Homem existem duas isoformas de CD22. A forma predominante (ΟΌ22β) possui 7 domínios do tipo imunoglo-bulina (tipo Ig) na região extracelular. A variante CD22a não possui o domínio tipo Ig 4 e pode ter um domínio cito-plasmático truncado. Demonstrou-se que os anticorpos que bloqueiam a adesão de CD22 a monócitos, neutrófilos, linfócitos e eritrócitos se ligam ao primeiro ou segundo domínio tipo Ig. 0 domínio citoplasmático de CD22 é fosforilado em tirosina quando da ligação do receptor de antigénio das células B e associa-se a Lyk, Syk e 3-cinase de fosfatidilinositol. A função de CD22 é modular negativamente o patamar de activação das células B. Pode também mediar a adesão celular, através da interacção com células portadoras dos sialoglicoconjugados adequados. CD22 é expresso na maioria das leucemias de células B e linfomas, incluindo NHL, leucemia linfoblástica aguda (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (B-CLL) e especialmente leucemia não linfocítica aguda (ANLL).
Em trabalhos anteriores foram descritos anticorpos monoclonais contra CD22. WO 98/41641 descreve anticorpos recombinantes anti-CD22 com resíduos cisteína em Vh44 e VL100. WO 96/04925 descreve as regiões VH e VL do ΡΕ1504035 anticorpo anti-CD22 LL2. US 5686072 descreve combinações de imunotoxinas anti-CD22 e anti-CD19. WO 98/42378 descreve a utilização de anticorpos nus anti-CD22 para o tratamento de doenças malignas das células B.
Uma série de fármacos baseados em anticorpos têm sido recentemente licenciados, e.g. Rituxan (um anticorpo quimérico não marcado γΐ (região +myIV) específico para CD20) ou estão em ensaios clínicos para esta doença. Estes baseiam-se na morte de células B mediada por complemento ou por ADCC ou na utilização de radionuclidos, tais como 131I ou 90Y, os quais têm problemas associados de preparação e utilização para clínicos e doentes. Existe a necessidade de uma molécula de anticorpo para tratar NHL que possa ser usada repetidamente e produzida facilmente e eficientemente. Existe também a necessidade de uma molécula de anticorpo, o qual tenha elevada afinidade para CD22 e baixa imunogenicidade em seres humanos.
Epratuzumab é uma versão humanizada do anticorpo LL2 que se liga ao domínio extracelular de CD22 com uma afinidade (KD) de 0,7 nM (Carnahan et al., Clin. Câncer Res. 9. suplemento, 3982s-3990s, 2003).
Sumário do Invento
Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona uma molécula de anticorpo tendo especificidade para CD22 humano, compreendendo uma cadeia pesada em que o 9 ΡΕ1504035 domínio variável compreende uma CDR (como definido por kabat et al., (supra)) tendo a sequência apresentada como Hl na Figura 1 (SEQ ID N0:1) para CDR-H1, como H2 na Figura 1 (SEQ ID NO:2) ou uma H2 da qual foi removido um potencial local de glicosilação, ou uma H2 em que o resíduo lisina na posição 60 (de acordo com o sistema de numeração de Kabat) foi substituído por um aminoácido alternativo ou uma H2 em que tanto o local de glicosilação como a lisina reactiva na posição 60 foram removidos para CDR-H2 e como H3 na Figura 1 (SEQ ID NO: 3) para CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR (como definido por Kabat et al., (supra)) tendo a sequência apresentada como LI na Figura 1 (SEQ ID NO:4) para CDR-L1, como L2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 5) para CDR-L2 e como L3 na Figura 1 (SEQ ID NO:6) para CDR-L3.
As CDRs apresentadas em SEQ IDS NOS: 1 a 6 e na Figura 1 referida atrás derivam de um anticorpo monoclonal de ratinho 5/44.
As sequências completas dos domínios variáveis do anticorpo de ratinho 5/44 estão apresentadas na Figura 2 (cadeia leve) (SEQ ID NO:7) e Figura 3 (cadeia pesada) (SEQ ID NO:8). Este anticorpo de ratinho é igualmente referido abaixo como "o anticorpo dador" ou "o anticorpo monoclonal murino".
Uma realização preferida alternativa do presente invento é o anticorpo monoclonal de ratinho 5/44 tendo as 10 ΡΕ1504035 sequências do domínio variável das cadeias leve e pesada mostradas na Figura 2 (SEQ ID NO:7) e Figura 3 (SEQ ID NO:8), respectivamente. A região constante da cadeia leve de 5/44 é capa e a região constante da cadeia pesada é IgGl.
Numa outra realização preferida, o anticorpo de acordo com o presente invento é uma molécula de anticorpo quimérica ratinho/humano, aqui referida como molécula de anticorpo quimérica 5/44. A molécula de anticorpo quimérica compreende os domínios variáveis do anticorpo monoclonal de ratinho 5/44 (SEQ ID NOS: 7 e 8) e domínios constantes humanos. De preferência, a molécula de anticorpo quimérica 5/44 compreende o domínio capa C humano (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; GeneBank número de acesso J00241) na cadeia leve e os domínios gama 4 humanos (Flanagan et al.r Nature, 300, 709-713, 1982) na cadeia pesada, facultativamente com o resíduo de serina na posição 241 substituído por um resíduo de prolina.
De preferência, o anticorpo do presente invento compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por Kabat et al. (supra)) uma H2' em que uma potencial sequência de local de glicosilação foi removida e que inesperadamente aumentou a afinidade do anticorpo quimérico 5/44 relativamente ao antigénio CD22 e que, de preferência, possui como CDR-H2 a sequência apresentada como H2' (SEQ ID NO:13). 11 ΡΕ1504035
Como alternativa ou adicionalmente, o anticorpo do presente invento pode compreender uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por Kabat et al., (supra)) uma H2" em que um resíduo de lisina na posição 60, que está situado numa posição exposta dentro de CDR-H2 e que é considerado como tendo potencial para reagir com agentes de conjugação resultando numa redução da afinidade de ligação ao antigénio, é substituído por um resíduo de aminoácido alternativo para resultar numa substituição conservada. De preferência, CDR-H2 tem a sequência apresentada como H2" (SEQ ID NO:15).
Como alternativa ou adicionalmente, o anticorpo do presente invento pode compreender uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por Kabat et al., (supra)) uma H2"' em que tanto a potencial sequência do local de glicosilação como o resíduo na posição 60, são substituídos por aminoácidos alternativos. De preferência, CDR-H2 tem a sequência apresentada como H2"' (SEQ ID NO:16).
Numa terceira realização preferida alternativa, o anticorpo de acordo com o presente invento é uma molécula de anticorpo enxertada com CDRs. O termo "molécula de anticorpo enxertada com CDRs" como aqui usado refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contem uma ou mais CDRs (incluindo, caso se pretenda, uma CDR modificada) de um anticorpo dador (e.g., um anticorpo 12 ΡΕ1504035 monoclonal murino) enxertado numa região estrutural variável da cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (e.g. um anticorpo humano).
De preferência, tal anticorpo enxertado com CDRs possui um domínio variável compreendendo regiões estruturais aceitadoras humanas assim como uma ou mais CDRs dadoras referidas atrás.
Quando as CDRs são enxertadas, qualquer sequência da região estrutural variável aceitadora adequada pode ser usada tendo em consideração a classe/tipo do anticorpo dador a partir do qual derivam as CDRs, incluindo regiões estruturais de ratinho, primata e humana. Exemplos de regiões estruturais humanas que podem ser usadas no presente invento são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al. (supra)) . Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM pode ser usadas para a cadeia pesada e para a cadeia leve. Como alternativa, podem ser usadas as sequências germinais humanas. A região estrutural preferida para a cadeia leve é a sequência do subgrupo germinal humano (DPK9+JK1) mostrado na Figura 5 (SEQ ID N0:17). A região estrutural preferida para a cadeia pesada é a sequência do subgrupo humano (DP7+JH4) mostrado na Figura 6 (SEQ ID N0:21).
Num anticorpo enxertado com CDRs do presente invento, prefere-se usar como anticorpo aceitador um que 13 ΡΕ1504035 possua cadeias homólogas das cadeias do anticorpo dador. As cadeias pesada e leve aceitadoras não necessitam necessariamente de derivar do mesmo anticorpo e podem, caso se pretenda, compreender cadeias compostas tendo regiões estruturais derivadas de diferentes cadeias.
Igualmente, num anticorpo enxertado com CDRs do presente invento, as regiões estruturais não necessitam de ter exactamente a mesma sequência das do anticorpo aceitador. Por exemplo, os resíduos invulgares podem ser alterados para resíduos mais frequentes para a classe ou tipo de cadeia aceitadora. Como alternativa, os resíduos seleccionados nas regiões estruturais aceitadoras podem ser alterados de forma a corresponderem ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo dador ou a um resíduo que é uma substituição conservada para o resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo dador. Tais alterações deverão ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo dador. Um protocolo para a selecção dos resíduos nas regiões estruturais aceitadoras que possam necessitar de ser alterados está descrito em WO 91/09967.
De preferência, numa molécula de anticorpo enxertada com CDRs de acordo com o presente invento, se a cadeia leve aceitadora possuir a sequência humana do subgrupo DPK9+JK1 (mostrado na Figura 5) (SEQ ID NO:17 (DPK9) mais SEQ ID N0:18(JK1)) então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia leve compreendem os resíduos dadores nas posições 2, 4, 37, 38, 45 e 60 e podem adicionalmente compreender um 14 ΡΕ1504035 resíduo dador na posição 3 (de acordo com Kabat et al. (supra)).
De preferência, numa molécula de anticorpo enxertado com CDRs do presente invento, se a cadeia pesada aceitadora possuir a sequência humana DP7+JH4 (mostrado na Figura 6 (SEQ ID N0:21 (DP7) mais SEQ ID NO:22 (JH4) ) , então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs dadoras, resíduos dadores nas posições 1, 28, 48, 71 e 93 e podem ainda compreender resíduos dadores nas posições 67 e 69 (de acordo com Kabat et al. (supra)).
Os resíduos dadores são resíduos derivadas do anticorpo dador, i.e. o anticorpo de onde as CDRs derivam originalmente.
De preferência, o anticorpo do presente invento compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por Kabat et al., (supra)) uma H2' em que uma sequência do potencial local de glicosilação foi removida de forma a aumentar a afinidade do anticorpo quimérico 5/44 para o antigénio CD22 e que, de preferência, possui como CDR-H2 a sequência apresentada como H2' (SEQ ID NO:13).
Como alternativa ou adicionalmente, o anticorpo do presente invento pode compreender uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como 15 ΡΕ1504035 definido por Kabat et al., (supra)) uma H2" em que um resíduo de lisina na posição 60, que está situado numa posição exposta dentro de CDR-H2 e que se considera ter potencial para reagir com agentes de conjugação, resultando numa redução da afinidade de ligação ao antigénio, é substituído por um aminoácido alternativo. De preferência, CDR-H2 tem a sequência apresentada como H2" (SEQ ID N0:15).
Como alternativa ou adicionalmente, o anticorpo do presente invento pode compreender uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definido por kabat et al., (supra)) uma H2"' em que a sequência do potencial local de glicosilação e o resíduo de lisina na posição 60, são substituídos por aminoácidos alternativos. De preferência, CDR-H2 tem a sequência apresentada como H2"' (SEQ ID NO:16). A molécula de anticorpo do presente invento pode compreender: uma molécula de anticorpo completa, tendo cadeias pesada e leve de tamanho completo; um seu fragmento, como seja o fragmento Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 ou Fv; um monómero ou dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada; um anticorpo de cadeia simples, e.g. uma cadeia simples Fv em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são ligados por um elemento de ligação peptídico. De forma semelhante, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem ser combinadas com outros domínios de anticorpo conforme adequado. 16 ΡΕ1504035 A molécula de anticorpo do presente invento pode ter ligada uma molécula efectora ou repórter. Por exemplo, pode ter ligado, através de uma estrutura de ligação covalente, um macrociclo, para quelatação de um átomo de metal pesado ou uma toxina, como seja rícino. Como alternativa, os procedimentos da tecnologia de DNA recombinante podem ser usados para produzir uma molécula de anticorpo em que o fragmento Fc (domínios CH2, CH3 e de charneira) , os domínios CH2 e CH3 ou o domínio CH3 de uma molécula de imunoglobulina completa Foi (foram) substituídos ou foi (foram) ligados através de ligação peptídica, uma proteína funcional não imunoglobulina, como seja uma enzima ou molécula de toxina. A molécula de anticorpo do presente invento, de preferência, possui uma afinidade de ligação de pelo menos 0,85 x 1CT10M, mais de preferência pelo menos 0,75xlCT10M e mais de preferência pelo menos 0,5xl010M.
De preferência, a molécula de anticorpo do presente invento compreende o domínio variável da cadeia leve 5/44-gLl (SEQ ID NO:19) e o domínio variável da cadeia pesada 5/44-gH7 (SEQ ID NO:27). As sequências dos domínios variáveis destas cadeias leve e pesada estão apresentadas nas Figuras 5 e 6, respectivamente. São igualmente descritas variantes da molécula de anticorpo do presente invento, as quais possuem maior afinidade para CD22. Tais variantes podem ser obtidas por 17 ΡΕ1504035 uma série de protocolos de maturação de afinidade, incluindo mutação das CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), baralhamento de cadeias (Marks et ai., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), utilização de estirpes mutadoras de E. coli (Low et ai., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), baralhamento de DNA (Patten et ai., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), apresentação fágica (Thompson et ai., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et ai., Nature, 391, 288-291, 1988). Vaughan et al. (supra) discute estes métodos de maturação de afinidade. 0 presente invento também proporciona uma sequência de DNA codificadora de cadeias pesada e/ou leve da molécula de anticorpo do presente invento.
De preferência, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou leve da molécula de anticorpo do presente invento. A sequência de DNA do presente invento pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido por processamento químico, cDNA, DNA genómico ou qualquer combinação dos mesmos. 0 presente invento também está relacionado com um vector de clonagem ou de expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA do presente invento. De preferência, o vector de clonagem ou de expressão compreende duas 18 ΡΕ1504035 sequências de DNA, codificadoras da cadeia leve e da cadeia pesada da molécula de anticorpo do presente invento, respectivamente.
Os métodos gerais pelos quais os vectores podem ser construídos, os métodos de transfecção e os métodos de cultura são conhecidos dos familiarizados com a matéria. Neste aspecto é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999 F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e o Manual Maniatis produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.
As sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo do presente invento podem ser obtidas por métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, as sequências de DNA codificadoras de parte ou da totalidade das cadeias pesada e leve de anticorpo podem ser sintetizadas como se pretender a partir de sequências de DNA determinadas ou com base nas correspondentes sequências de aminoácidos. O DNA codificador das sequências estruturais aceitadoras está largamente disponível aos familiarizados com a matéria e pode ser facilmente sintetizado com base nas suas sequências de aminoácidos conhecidas. Técnicas convencionais de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo do presente invento. 19 ΡΕ1504035
As sequências de DNA pretendidas podem ser sintetizadas, completamente ou em parte, usando técnicas de síntese de oligonucleótidos. As técnicas de mutagénese dirigida e da reacção da polimerase em cadeia (PCR) podem ser usadas conforme adequado.
Pode ser usado qualquer sistema célula hospe-deira/vector para a expressão de sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo do presente invento. Podem ser usados sistemas bacterianos, por exemplo E. coli e outros sistemas microbianos, em parte, para a expressão de fragmentos de anticorpos tais como os fragmentos Fab e F(ab')2 e especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpos de cadeia simples, por exemplo, Fvs de cadeia simples. Podem ser usados sistemas de expressão de células hospedeiras eucarióticas, e.g. de mamífero, na produção de moléculas de anticorpo maiores, incluindo moléculas de anticorpo completas. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, mieloma ou hibridoma. O presente invento também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com o presente invento compreendendo a cultura de uma célula hospedeira, contendo um vector do presente invento, em condições adequadas para levar à expressão de proteína a partir do DNA codificador da molécula de anticorpo do presente invento e isolamento da molécula de anticorpo.
Para a produção de produtos compreendendo as 20 ΡΕ1504035 cadeias pesada e leve, a linha celular pode ser transfec-tada com dois vectores, um primeiro vector codificador de um polipéptido da cadeia leve e um segundo vector codificador de um polipéptido da cadeia pesada. Como alternativa, pode ser usado um único vector, o vector incluindo sequências codificadoras dos polipéptidos da cadeia leve e da cadeia pesada. 0 presente invento também proporciona uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo uma molécula de anticorpo do presente invento em combinação com um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 presente invento também proporciona um processo para a preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo a mistura da molécula de anticorpo do presente invento juntamente com um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente activo na composição terapêutica ou de diagnóstico ou pode ser acompanhada de outros ingredientes activos incluindo outros ingredientes do tipo anticorpos, por exemplo anticorpos anti-células T, anti-IFNy ou anti-LPS ou ingredientes não anticorpos, tais como xantinas.
As composições farmacêuticas, preferencialmente, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do 21 ΡΕ1504035 anticorpo do invento. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição determinada, ou apresentar um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de culturas de células ou em modelos animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. 0 modelo animal pode também ser usado para determinar a gama de concentrações adequadas e a via de administração. Tal informação pode então ser usada para determinar doses úteis e vias de administração em seres humanos. A quantidade eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinações de fármacos, sensibilidades de reacção e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro da capacidade de avaliação do clínico. De um modo geral, uma dose eficaz será entre 0,01 mg/Kg e 50 mg/Kg, de preferência 0,1 mg/Kg a 20 mg/Kg, mais de preferência cerca de 15 mg/Kg.
As composições podem ser administradas individualmente a um doente ou podem ser administradas em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas. 22 ΡΕ1504035 A dose a que a molécula de anticorpo do presente invento é administrado depende da natureza da condição a ser tratada, do grau de malignidade do linfoma ou leucemia e se a molécula de anticorpo é usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente. A frequência da dose dependerá da semi-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tiver uma semi-vida curta (e.g. 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Como alternativa, se a molécula de anticorpo possuir uma semi-vida maior (e.g. 2 a 15 dias) pode ser apenas necessário dar uma dose uma vez por dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez cada 1 ou 2 meses.
Uma composição farmacêutica pode também conter um veiculo farmaceuticamente aceitável para administração do anticorpo. 0 veiculo não deverá induzir a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição e não deverá ser tóxico. Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipéptidos, lipossomas, polissa-cáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, amino-ácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inactivas.
Podem ser usados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais de ácidos minerais, tais como hidrocloretos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, ou sais 23 ΡΕ1504035 de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem ainda conter líquidos tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Ainda, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes ou substâncias tamponantes do pH, podem estar presentes em tais composições. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo doente.
As formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parenteral, e.g. por injecção ou infusão, por exemplo pela injecção de bolus ou infusão contínua. Sempre que o produto for para injecção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, como sejam agentes de suspensão, conservantes, estabilizadores e/ou agentes de dispersão. Como alternativa, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril adequado.
Uma vez formuladas, as composições do invento podem ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. No entanto, prefere-se que as composições sejam adaptadas para administração a indivíduos humanos. 24 ΡΕ1504035
As composições farmacêuticas deste invento podem ser administradas por qualquer uma de uma série de vias incluindo, mas não estando limitado às vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intra-tecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver WO98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal ou rectal. Podem ser também usados hidrovaporizadores para administrar as composições farmacêuticas do invento. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões liquidas. Podem igualmente ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A entrega directa das composições será, de uma forma geral, conseguida por injecção, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente ou intramuscularmente ou entregue no espaço intersticial de um tecido. As composições podem também ser administradas numa lesão. A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla.
Será óbvio que o ingrediente activo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será susceptível de degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição for administrada por uma via que usa o trato gastrointestinal, a composição necessitará de conter agen- 25 ΡΕ1504035 tes que protegem o anticorpo da degradaçao mas que entregam o anticorpo uma vez absorvido no trato gastrointestinal.
Uma discussão exaustiva dos veículos farmaceuti-camente aceitáveis está disponível em "Remington's Pharma-ceutical Sciences" (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Também é considerado que o anticorpo do presente invento será administrado através do uso de terapia génica. De forma a conseguir isto, as sequências de DNA codificadoras das cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob o controlo de componentes de DNA adequados são introduzidas num doente de forma que as cadeias de anticorpo sejam expressas a partir das sequências de DNA e montadas in situ. O presente invento também proporciona a molécula de anticorpo do presente invento para usar no tratamento de uma doença mediada por células que expressam CD22. 0 presente invento ainda proporciona a utilização da molécula de anticorpo de acordo com o presente invento na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença mediada pelas células que expressam CD22. A molécula de anticorpo do presente invento pode ser utilizada em qualquer terapia sempre que se pretenda reduzir o nível de células que expressam CD22 que estão presentes no corpo humano ou animal. Estas células que 26 ΡΕ1504035 expressam CD22 podem ser circulantes no corpo ou estar presentes num nível elevado indesejável num local particular no corpo. Por exemplo, níveis elevados de células que expressam CD22 estarão presentes em linfomas e leucemias de células B. A molécula de anticorpo do presente invento pode ser usada na terapia de doenças mediada pelas células que expressam CD22. A molécula de anticorpo do presente invento é, preferencialmente, usada no tratamento de linfomas malignos e leucemias, mais preferencialmente NHL.
Existe descrito um método de tratamento de indivíduos humanos ou animais que sofram ou estejam em risco de uma perturbação mediada pelas células que expressam CD22, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo do presente invento. A molécula de anticorpo do presente invento pode também ser usada no diagnóstico, por exemplo no diagnóstico in vivo e na imagiologia dos estados de doença envolvendo células que expressam CD22. 0 presente invento é ainda descrito apenas como ilustração nos exemplos que se seguem, os quais se referem às Figuras juntas, em que: 27 ΡΕ1504035
Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos das CDRs do anticorpo monoclonal de ratinho 5/44 (SEQ ID NOS:1 a 6);
Figura 2 mostra a sequência completa do domínio variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal de ratinho 5/44;
Figura 3 mostra a sequência completa do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal de ratinho 5/44;
Figura 4 mostra a estratégia para a remoção do local de glicosilação e da lisina reactiva em CDR-H2;
Figura 5 mostra o desenho de enxertos para a sequência da cadeia leve de 5/44;
Figura 6 mostra o desenho de enxertos para a sequência da cadeia pesada de 5/44;
Figura 7 mostra os vectores pMRR14 e pMRRIO.l;
Figura 8 mostra os resultados do ensaio Biacore dos mutantes quiméricos 5/44;
Figura 9 mostra os oligonucleótidos para as montagens dos genes gH e gLl de 5/44;
Figura 10 mostra os vectores intermediários pCR2.1 (544gHl) e pCR2.1 (544gLl); 28 ΡΕ1504035
Figura 11 mostra as cassetes de oligonucleótidos usadas para fazer mais enxertos;
Figura 12 mostra o ensaio de competição entre o anticorpo de ratinho 5/44 marcado com fluorescência e variantes enxertadas; e
Figura 13 mostra a sequência completa de DNA e proteica das cadeias pesada e leve enxertadas.
Descrição detalhada do invento
Exemplo 1: Geração de anticorpos candidatos
Um painel de anticorpos contra CD22 foi seleccio-nado a partir de hibridomas usando os seguintes critérios de selecção: ligação a células Daudi, internalização nas células Daudi, ligação a células mononucleadas do sangue periférico (PBMC), internalização em PBMC, afinidade (mais de 10-9M) , γΐ de ratinho e taxa de produção. 5/44 foi seleccionado como anticorpo preferido.
Exemplo 2: Clonagem do gene e expressão de uma molécula de anticorpo quimérico 5/44
Preparação de células de hibridoma 5/44 e preparação de RNA a partir das mesmas 0 hibridoma 5/44 foi gerado por tecnologia 29 ΡΕ1504035 convencional de hibridomas, após imunização de ratinhos com proteína CD22 humana. Preparou-se RNA a partir de células de hibridoma 5/44 usando um kit RNEasy (Qiagen, Crawley, UK; Catalogue n° 74106). 0 RNA obtido foi sujeito a transcrição reversa em cDNA, como descrito abaixo.
Distribuição de CD22 em tumores NHL
Um estudo de imuno-histoquímica foi realizado para examinar a incidência e distribuição da coloração usando os anticorpos monoclonais anti-CD22 5/44. Os anticorpos controlos anti-CD22 e anti-CD79a foram incluídos no estudo para confirmar as áreas de células B dos tumores.
Um total de 50 tumores foram estudados e estes foram classificados como se segue usando os sistemas de classificação "Working Formulation" e REAL: - 7 leucemia linfoblástica B/linfoma (Elevado/I) - 4 B-CLL/linforna linfocítico pequeno (Baixo/A) - 3 linfoplasmacitóide/imunocitoma (Baixo/A) - 1 célula Mantle (Int/F) - 14 linfoma dos centros foliculares (Baixo a Int/D) - 13 linfornas das células grandes difuso (Int a Elevado/G,H) - 6 não classificáveis (K)
- 2 linfomas de células T 40 linfomas de células B foram positivos para o antigénio CD22 com o anticorpo 5/44 a 0,1 pg/ml e mais 6 30 ΡΕ1504035 foram positivos quando a concentração foi aumentada para 0,5 μρ/ιηΐ. Para os restantes 2 tumores das células B que eram negativos a 1 μρ/ιηΐ, o tecido remanescente foi insuficiente para testar uma concentração mais elevada. No entanto, os testes paralelos com um outro anticorpo anti-CD22 Celltech 6/13, o qual deu uma coloração mais forte do que 5/44, resultaram em coloração positiva para CD22 em todos os 48 linfomas de células B.
Assim, é possível concluir que o antigénio CD22 é largamente expresso em linfomas de células B e assim proporciona um alvo adequado para imunoterapia em NHL.
Clonagem por PCR de VH e VL de 5/44
As sequências de cDNA codificadoras dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve de 5/44 foram sintetizadas usando transcriptase reversa para produzir cópias de cDNA de cadeia simples do mRNA presente no RNA total. Este foi então usado como matriz para a amplificação das sequências da região V murina usando oligonucleótidos iniciadores específicos pela Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR).
a) Síntese de cDNA
Sintetizou-se cDNA num volume de reacção de 20 μΐ contendo os seguintes reagentes: Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KC1 75 mM, ditiotreitol 10 mM, MgCl2 3 mM, trifosfato de 31 ΡΕ1504035 desoxinucleósidos 0,5 mM cada, 20 unidades de RNAsina, 75 ng de hexanucleót idos ao acaso, 2 μg de RNA 5/44 e 200 unidades da transcriptase reversa do virus da leucemia murina de Moloney. Após incubação a 42°C durante 60 minutos, a reacção foi terminada por aquecimento a 95°C durante 5 minutos.
b) PCR
Aliquotas do cDNA foram sujeitas a PCR usando combinações de sequências iniciadoras especificas para as cadeias pesada e leve. Os lotes de sequências iniciadoras degeneradas projectados para emparelhar com as sequências conservadas do péptido sinal foram usados como sequências iniciadoras directas. Estas sequências possuem todas, por ordem, um local de restrição (VL Sful; VH HindIII) começando 7 nucleótidos a partir dos extremos 5', a sequência GCCGCCACC (SEQ ID NO:50), para permitir a tradução óptima dos mRNAs resultantes, um codão de iniciação e 20-30 nucleótidos baseados nas sequências de péptido líder de anticorpos de ratinho conhecidos (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health).
As sequências iniciadoras 3' foram projectadas para abranger a junção estrutural 4 J-C do anticorpo e conter um local de restrição para a enzima BsiWI, de modo a facilitar a clonagem do fragmento de PCR VL. As sequências 32 ΡΕ1504035 iniciadoras 3' da cadeia pesada são uma mistura projectada para abranger a junção J-C do anticorpo. A sequência iniciadora 3' inclui um local de restrição Apal para facilitar a clonagem. A região 3' das sequências iniciadoras possui uma sequência mista baseada nas encontradas nos anticorpos de ratinho conhecidos (Kabat et al., 1991, supra).
As combinações das sequências iniciadoras descritas atrás permitiram que os produtos de PCR para VH e VI fossem clonados directamente num vector de expressão adequado (ver abaixo) para produzir cadeias quiméricas (ratinho-humano) pesadas e leves e para estes genes serem expressos em células de mamífero para produzir anticorpos quiméricos do isotipo pretendido.
As incubações (100 μΐ) para o PCR foram estabelecidas como se segue. Cada uma das reacções continha Tris-HC1 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,01% de gelatina, trifosfato de desoxinucleósidos 0,25 mM cada, 10 pmoles da mistura de sequências iniciadoras 5', 10 pmoles da sequência iniciadora 3' , 1 μΐ de cDNA e 1 unidade de polimerase Taq. As reacções foram incubadas a 95°C durante 5 minutos e depois sujeitas a ciclos de 94°C durante 1 minutos, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, as alíquotas de cada reacção foram analisadas por electroforese num gel de agarose.
Para a região V da cadeia pesada, um produto de DNA amplificado foi apenas obtido quando o conjunto de 33 ΡΕ1504035 sequências iniciadoras que emparelham com o início da região estrutural I substituiu o conjunto de sequências iniciadoras do péptido sinal. Os fragmentos foram clonados nos vectores de sequenciação. A sequência de DNA foi determinada e traduzida para dar uma sequência de amino-ácidos deduzida. Esta sequência deduzida foi verificada por referência à sequência proteica N-terminal determinada experimentalmente. As Figuras 2 e 3 mostram a sequência de DNA/proteína das regiões V maduras da cadeia leve e pesada do monoclonal 5/44 de ratinho respectivamente.
c) Clonagem molecular dos fragmentos de PCR
As sequências da região V murina foram então clonadas nos vectores de expressão pMRRIO.l e pMRR14 (Figura 7) . Estes são vectores para a expressão da cadeia leve e pesada respectivamente contendo DNA codificador das regiões constantes da cadeia leve capa humana e da cadeia pesada gama-4 humana. A região VL foi subclonada no vector de expressão por digestão de restrição e ligação a partir do vector de sequenciação, usando os locais de restrição Sful e BsiWI, criando o plasmídeo pMRRIO (544cL) . O DNA da cadeia pesada foi amplificado por PCR usando uma sequência iniciadora 5' para introduzir um péptido sinal, uma vez que este não foi obtido na estratégia de clonagem - foi empregue um líder da cadeia pesada de anticorpo de ratinho derivado de um hibridoma obtido no nosso laboratório (designado 162). A sequência iniciadora 5' tinha a seguinte sequência: ΡΕ1504035 34 5'j r 1DN0:51). A sequência iniciadora reversa foi idêntica à usada na clonagem do gene VH original. 0 produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas HindIII e Apal, foi subclonado e a sua sequência de DNA foi confirmada, criando o plasmideo pMRR14(544cH). A cotransfecção transitória de ambos os vectores de expressão em células CHO gerou o anticorpo quimérico c5/44. Isto foi conseguido usando o reagente Lipofectamine de acordo com os protocolos do fabricante (InVitrogen:Life Technology, Groningen, The Netherlands. Catalogue n° 11668-027).
Remoção do local de glicosilação e da lisina reactiva
Uma sequência de um potencial local de glicosilação ligada em N foi observada em CDR-H2, tendo a sequência de aminoácidos N-Y-T (Figura 3). SDS-PAGE, transferências para membranas Western e coloração de açúcares nos géis de 5/44 e seus fragmentos (incluindo Fab) indicou que este local estava de facto glicosilado (não apresentado). Ainda, um resíduo de lisina foi observado numa posição exposta dentro de CDR-H2, o qual tinha o potencial de reduzir a afinidade de ligação do anticorpo ao proporcionar um local adicional para conjugação com um agente com o qual o anticorpo pode ser conjugado. 35 ΡΕ1504035
Uma estratégia de PCR foi usada para introduzir substituições de aminoácidos na sequência CDR-H2 numa tentativa para remover o local de glicosilação e/ou a lisina reactiva, como se mostra na Figura 4. As sequências iniciadoras directas codificadoras das mutações N55Q, T57A ou T5V foram usadas para remover o local de glicosilação (Figura 4) e uma quarta sequência iniciadora directa contendo a substituição K60R, foram projectadas para remover o resíduo de lisina reactivo (Figura 4). A sequência iniciadora reversa da região estrutural 4 foi usada em cada um destas amplificações por PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas Xbal e Apal e foram inseridos em pMRR14(544cH) (também clivados com Xbal e Apal) para gerar plasmídeos de expressão codificadores destes mutantes. As mutações N55Q, T57A e T57V eliminam o local de glicosilação ao alterarem a sequência de aminoácidos relativamente ao consenso N-X-T/S, enquanto a mutação K60R substitui a lisina potencialmente reactiva com o resíduo de arginina semelhante positivamente carregado. Os plasmídeos resultantes das variantes de cH foram cotransfectados com o plasmídeo cL para gerar variantes de anticorpos quiméricos expressos.
Avaliação das actividades de genes quiméricos
As actividades de genes quiméricos foram avaliadas após transfecção transitória de células CHO. 36 ΡΕ1504035 c) Determinação das constantes de afinidade por análise BiaCore As afinidades de 5/44 quimérico ou das suas variantes, as quais tinham removido o seu local de glicosilação ou a sua lisina reactiva, foram estudadas com tecnologia ΒΙΑ para a ligação a construções a CD22-mFc. Os resultados estão apresentados na Figura 8. Todas as medições de ligação foram realizadas no aparelho BIAcore™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). O ensaio foi realizado por captura de CD22mFc através de anti-Fc de ratinho imobilizado. O anticorpo estava na fase solúvel. As amostras, padrões e controlos (50 μΐ) foram injectados sobre anti-Fc de ratinho imobilizado seguido do anticorpo na fase solúvel. Após cada ciclo a superfície foi regenerada com 50 μΐ de HC1 40 mM a 30 μΐ/min. A análise cinética foi realizada usando o programa informático BIAevaluation 3.1 (Pharmacia). A remoção do local de glicosilação na construção T57A resultou numa velocidade de associação ligeiramente mais rápida e numa velocidade de dissociação significativamente mais lenta comparativamente com 5/44 quimérico, dando uma melhoria da afinidade de aproximadamente 5 vezes. A mutação N55Q não teve efeito na afinidade. Este resultado foi inesperado uma vez que sugere que a remoção do próprio açúcar aparentemente não tem qualquer efeito na ligação (tal como a alteração N55Q) . A melhoria da afinidade foi observada apenas com a alteração T57A. Uma possível 37 ΡΕ1504035 explicação é que, independentemente da presença de açúcar, a treonina na posição 57 exerce um efeito negativo na ligação que é removida na conversão de treonina em alanina. A hipótese de que o tamanho pequeno da alanina é importante e de que o efeito negativo da treonina está relacionado com o seu tamanho, é suportada pelo resultado obtido usando a mutação T57V: aquela substituição com valina na posição 57 não é benéfica (resultados não apresentados). A remoção da lisina pela mutação K60R teve um efeito neutro na afinidade, i.e. a introdução de arginina remove um potencial local reactivo sem comprometer a afinidade.
As mutações para remoção do local de glicosilação e para remoção da lisina reactiva foram portanto ambos incluídos na projecção da humanização.
Exemplo 2; Enxerto de CDRs em 5/44 A clonagem molecular dos genes das regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 5/44 e a sua utilização para produzir anticorpos quiméricos (ratinho-humano) 5/44 foram descritas atrás. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos dos domínios VL e VH de 5/44 de ratinho estão apresentadas nas Figuras 2 e 3 (SEQ ID NOS:7 e 8), respectivamente. Este exemplo descreve o enxerto de CDRs do anticorpo 5/44 em regiões estruturais humanas para reduzir a potencial imunogenicidade em seres 38 ΡΕ1504035 humanos, de acordo com o método de Adair et al., (WO91/09967).
Enxertos de CDRs na cadeia leve de 5/44 0 alinhamento de sequências de proteína com sequências de consenso da região V da cadeia leve capa humana subgrupo I indicou 64% de identidade de sequências. Consequentemente, para a construção da cadeia leve com enxertos de CDRs, as regiões estruturais aceitadoras escolhidas corresponderam às da sequência germinal 012,DPK9 de VK humana subgrupo I. A sequência aceitadora da região estrutural 4 derivou da sequência germinal JK1 da região J humana.
Uma comparação das sequências de aminoácidos das regiões estruturais do anticorpo murino 5/44 e da sequência aceitadora está apresentada na Figura 5 e mostra que existem 27 diferenças entre as cadeias aceitadora e dadora. Em cada posição, foi feita uma análise do potencial do resíduo murino para contribuir para a ligação ao antigénio, directamente ou indirectamente, através de efeitos na montagem ou na interface VH/VL. Se um resíduo murino for considerado importante e suficientemente diferente do resíduo humano em termos de tamanho, polaridade ou carga, então esse resíduo murino é mantido. Com base nesta análise, foram construídas duas versões da cadeia leve com enxertos de CDRs, tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20 (Figura 5). 39 ΡΕ1504035
Enxertos de CDRs na cadeia pesada de 5/44
Os enxertos de CDRs na cadeia pesada de 5/44 foram conseguidos usando a mesma estratégia descrita para a cadeia leve. O domínio V da cadeia pesada 5/44 encontrou-se ser homólogo das cadeias pesadas humanas pertencentes ao subgrupo I (70% de identidade de sequências) e assim a sequência da região estrutural germinal VH1-3,DP7 do subgrupo I humano foi usado como uma estrutura aceitadora. As sequências aceitadoras da região estrutural 4 derivaram da sequência germinal JH4 da região J humana.
Uma comparação da cadeia pesada 5/44 com as regiões estruturais está apresentada na Figura 6, onde se pode observar que a cadeia pesada de 5/44 difere da sequência aceitadora em 22 posições. A análise da contribuição que qualquer uma destas possa ter na ligação ao antigénio conduziu a 5 versões das cadeias pesadas com enxertos de CDRs a serem construídas, tendo as sequências apresentadas em SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27 (Figura 6).
Construção dos genes para sequências enxertadas
Os genes foram projectados para codificarem as sequências enxertadas gHl e gLl, e uma série de oligonu-cleótidos sobreponíveis foram projectados e construídos 40 ΡΕ1504035 (Figura 9) . Uma técnica de montagem por PCR foi empregue para construir os genes da região V com enxertos de CDRs. Prepararam-se volumes de reacção de 100 μΐ contendo Tris-HC1 10 mM, pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,001% de gelatina, trifosfatos de desoxinucleósidos 0,25 mM cada, 1 pmole das sequências iniciadoras "internas" (Tl, T2, T3,
Bl, B2, B3), 10 pmoles de cada sequência iniciadora "externa" (Fl, Rl) e 1 unidade de polimerase Taq (AmpliTaq, Applied Biosystems, catalogue n° N808-0171). Os parâmetros dos ciclos de PCR foram 94°C durante 1 minutos, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, durante 30 ciclos. Os produtos de reacção foram então corridos num gel de 1,5% de agarose, excisados e recuperados usando colunas de centrifugação QIAGEN (QIAquick gel extraction kit, cat. N° 28706) . O DNA foi eluído num volume de 30 μΐ. As aliquotas (1 μΐ) de DNA de gHl e gLl foram então clonadas no vector de clonagem pCR2 . 1 TOPO da InVitrogen TOPO TA (Catálogo n° K4500-01 ) de acordo com as instruções do fabricante Este vector, que não é de expressão, serviu como intermediário de clonagem para facilitar a sequenciação de um grande número de clones. A sequenciação de DNA usando sequências iniciadoras especificas do vector foi usada para identificar os clones correctos contendo gHl e gLl, criando plasmídeos pCR2.1 (544gHl) e pCR2.1 (544gLl) (Figura 10).
Um método de substituição com cassetes oligonu-cleotidicas foi usado para criar os enxertos humanizados 41 ΡΕ1504035 gH4, 5, 6 e 7 e gL2. A Figura 11 mostra o desenho das cassetes oligonucleotídicas. Para construir cada variante, o vector (pCR2.1 (544gHl) ou pCR2.1(544gLl)) foi cortado com as enzimas de restrição mostradas (Xmal/SacII para a cadeia pesada, Xmal/BstEll para a cadeia leve). 0 fragmento grande do vector foi purificado em gel a partir de agarose e foi usado na ligação com a cassete oligonucleotidica. Estas cassetes são compostas por 2 oligonucleótidos complementares (apresentado na Figura 11), misturados numa concentração de 0,5 pmoles/μΐ num volume de 200 μΐ de Tris-HC1 12,5 mM pH 7,5, MgCl2 2,5 mM, NaCl 25 mM, ditiotreitol 0,25 mM. O emparelhamento foi conseguido por aquecimento a 95°C durante 3 minutos num banho-maria (volume 500 ml) depois deixando a reacção arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. A cassete oligonucleotidica emparelhada foi então diluída dez vezes em água antes da ligação no vector adequadamente cortado. A sequenciação de DNA foi usada para confirmar a sequência correcta, criando os plasmídeos pCR2.1 (5/44-gH4-7) e pCR2.1 (5/44-gL2). As sequências enxertadas confirmadas foram então subclonadas nos vectores de expressão pMRR14 (cadeia pesada) e pMRlO.l (cadeia leve).
Actividade de ligação a CD22 das sequências enxertadas com CDRs
Os vectores codificadores das variantes enxertadas foram cotransfectados em células CHO numa variedade 42 ΡΕ1504035 de combinações, juntamente com as cadeias de anticorpos quiméricos originais. A actividade de ligação foi comparada num ensaio de competição, fazendo competir a ligação do anticorpo 5/44 original de ratinho para a ligação a células Ramos (adquiridas à ATCC, uma linha de células linfoblásticas de linfoma de Burkitt expressando na superfície CD22). Este ensaio foi considerado a melhor forma de comparar enxertos na sua capacidade para se ligarem a CD22 na superfície celular. Os resultados estão apresentados na Figura 8. Como pode ser observado, existe muito pouca diferença entre qualquer um dos enxertos, todos com melhor desempenho que o anticorpo quimérico na competição contra o parental murino. A introdução de 3 resíduos adicionais humanos no extremo de CDR-H3 (gH5 e gH7) não parece ter afectado a ligação.
Foi seleccionada a combinação de enxertos com o menor número de resíduos murino, gLlgH7. 0 enxerto da cadeia leve gLl tem 6 resíduos do dador. Os resíduos V2, V4, L37 e Q45 têm resíduos de montagem potencialmente importantes. 0 resíduo H38 está na interface VH/VL. 0 resíduo D60 é um resíduo da superfície perto da CDR-L2 e pode directamente contribuir para a ligação do antigénio. Destes resíduos, V2, L37, Q45 e D60 são encontrados nas sequências germinais dos genes capa humanos de outros subgrupos. 0 enxerto da cadeia pesada gH7 tem 4 resíduos estruturais dadores (Resíduo R28 é considerado como sendo parte de CDR-Hl na definição estrutural usada nos enxertos 43 ΡΕ1504035 de CDRs (ver Adair et al. (1991 WO91/09967) ) . Os resíduos EI e A71 são resíduos da superfície perto das CDRs. 0 resíduo 148 é um potencial resíduo de montagem. O resíduo T93 está presente na interface VH/VL. Destes resíduos, EI e A71 são encontrados noutros genes germinais do subgrupo I humano. O resíduo 148 é encontrado no subgrupo 4 germinal humano e T73 encontra-se no subgrupo 3 germinal humano.
As sequências completas de DNA e proteica da cadeia leve e da cadeia pesada, incluindo a posição aproximada de intrões dentro dos genes da região constante pelos vectores, estão apresentadas na Figura 13 e estão descritas em SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:28 respectivamente para a cadeia leve e SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:30 respectivamente para a cadeia pesada. 0 DNA codificador destes genes da cadeia leve e pesada foi removido destes vectores. O DNA da cadeia pesada foi digerido no local HindIII 5', depois foi tratado com o fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli para criar um extremo 5' cego. A clivagem no local EcoRI 3' resultou no fragmento da cadeia pesada que foi purificado a partir de géis de agarose. Na mesma forma, foi produzido um fragmento da cadeia leve, dotado de extremos cerses no local Sful 5' e com um local EcoRI 3'. Ambos os fragmentos foram clonados nos vectores de expressão baseados em DHFR e usados para gerar linhas celulares estáveis em células CHO. 44 ΡΕ1504035
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Celltech R&D Limited <120> BIOLOGICAL PRODUCTS <160> 51 <170> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211> 5
<212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-H1 <400> 1
Asa Tyr Trp Ile Hi$ 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-H2 <400> 2
Gly Ile hsn Pro Gly Asn &sn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 1 5 10 15
Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-H3 <400> 3
Glu Gly Tyr Gly Asa Tyr Gly Ala Trp Pha Ala Tyr 1 ' 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-L1 <400> 4
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asa Ser Tyr Gly Aso Thr Phe Leu Ser 1 3’ 10 15 45 ΡΕ1504035 < 210 > 5 <211> 7 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-L2 <400> 5
Gly XXe Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 CDR-L3 <400> 6
Lau GXn Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 domínio VL <400> 7
Asp Vai Vai Vai Thr Gin Thr Pro Leu. Ser Leu Pro Vai Ser Phe Gly 1 S 10 15 Asp Gin Vai Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala As r Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gin Ser 35 4 0 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55- 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie es 70 75 80 Ser Thr ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 35 Thr His Glo Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Slu Ile Lys 100 105 110
Arg <210> 8 <211> 121 46 ΡΕ1504035 <212> PRT <213> ratinho <220> <221> monoclonal de ratinho 5/44 domínio VH <400> 8 d!u Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Vai Leu Ala Arg Pro Gly Ala l 5 10 15 Ser Vai Lys JSet Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyx Arg Phe Thr Âsn Tyr 20 25 30 Trp Ile Eis Trp Vai LyS Gin Arg Pr o Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 10 4 5 Gly Gly 11® Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Vai Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 6S 70 75 80 Mst Asp Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys «5 30 95 Thr Arg Gxu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ssr 115 120 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> cH <400> 9
Gly Asn Asn Tyr fhx Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys «'’ν 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> N55Q <400> 10
Giy Asn 6Xn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lyg ^v 1 5 10 * - 47 - ΡΕ1504035
<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> Τ57Α <40 0> 11
Gly Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asrt Leu Lys Gly 1 5 10
<210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> T57V <400> 12
Gly Asn Asn Tyr Vai Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Ly.$ Gly 1 5 10
<210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> CDR-H2(T75A)H' <400> 13
Gly 11 e Asn Pro Gly Asn Asrs Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 1 5 ' 10· * ~ 15
Gly
<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> K60R <400> 14
Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 <210> 15 48 ΡΕ1504035
<211> 17 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> CDR-H2 (K60R)Κ" <40 0> 15
Gly lie Asn Prο Gly Asπ Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <221> CDR-H2 (T75A K60R)H"' <400> 16
Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys 1 5 10 " 15
Gly
<210> 17 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DPK9 <400> 17
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys frp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys .Ala 20 25 30
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Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai <31u Ile Lys Arg 15 io
<210> 19 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> gLl <400> 19
Asp Vai Gin Vai Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 .10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30
Tyr Gly Asa Thr Fbè Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pxo Gly Lys Ala 35 40 45
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Ser Ser Leu Gin Pro <&lu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 20 95
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Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly 1 5 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 20 Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 Arg Vai Thr Met Thr Arg ASp Thr 50 55 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 65 70'
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Arg <210> 21 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DP 7 <400> 21
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Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Gltt Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Síis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 4Õ 45 Gly Gly 11· &5Π Frc Gly Asn Asn Tyr Alá Thr Tyr Arg Arg Aso Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gru Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 05 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Aso Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu vai Thr Val Ser Ser ΡΕ1504035 52 ns iga <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência <220> <221> gH5 <400> 25
Glu Vai Gin leu Vai Gin Sar Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly 15 Ala 1 5 10 Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Sex Gly Tyr Arg Phe Thr Asn. Tyr 20 25 30 Trp, 11® His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp IXe 35 40 45 Gly Gly lie Agn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu 50 55 60 lys Gly Arg Vai Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80 tíefc Glu leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 SO S>5 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> gH6 <400> 26
Glu Vai Gin Leu Vai Gin Se* Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Giy Ala 15 1C 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Trp lie Hia Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lee Glu Trp Ile 35 40 35
Gly Gly Ile Asm Pro Gly Asm Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe S0 55 6° 53 ΡΕ1504035
Gin Gly Arg Ala Th* Leu Thr Ala hap Thr Sei' Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80
Met Glu Levj Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 SO 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 ' 105 110
Vai Ser Ser 120
Gin Gly Thr leu Vai Thr 115
<210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> gH7 <400> 27
Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser siy Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Fhe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ué His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ue 35 40 45 Gly Gly 118 Asn Pr o Gly Asn Agft Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg vai Thr mt Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80 Mét Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu ASp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Bar Ser 115 120
<210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> Sequência completa da cadeia leve enxertada <400> 28 54 ΡΕ1504035
Lys Leu Pr» Vai Aro Leu Leu Vai L«\s Leu Leu Ph® Trp Ile Pr» 1 S 10 13
Ala Ser ftrg 61y Asp Vai Gin Vai Tfcr Gin Ser Pr» Sei Ser Leu Ser 20· 25 30
Ala Ser Vai Gly Asp Axg Vai Thr lie Thr Cye Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Ala Asn Ser Tyx 61y Ase Thr Fhe Leu Ser frp Tyr Leu aie Lye 50 55 êo"
Pro Gly Lys Ala Pr» Gin Leu Leu tis Tyr Gly He Sar A*n Arg Fh® 65 70 75 80
Ser Sly Vai Pro ASfc Aatg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 55 $ΰ 35 fhr Leu tíw Ile 8*x Ser Leu Gin Pro 61a Asp Pb® Ala thr Tyr Tyr ISO '105 110
Cye Leu Sln Gly Thr Sis <*ln Pr® tyx thr Phe Siy Gin Gly thr Lys 1X3 120 125
Vai Glu Ile Lys Arg thr Vai Alá Ala Pro Ser Vai Phe 11« Sfc# Pr® 130 135 140
Pr® Ser Asp Glu Gin Leu Ay* Ser Gly Thx Ala Ser Vai Vai Cys Leu
145 150 155 ' ISO
Leu &»» Asn Phe Tyr Fro Arg Glu Ala Lys Vai -Gln Trp Lys Vai Aap 165 170 175 ASft Ala Leu Gls:s Ser Gly As® Ser Gin Glu Ser V*1 thr Glu Gin Asp 180 185 190
Ser Lys Asp Ser 'Thr Tyr Ser Leu Ser Ser thr Leu thr Leis Ser Lye 195 200 205
Ale Asp Tyr Glu Ly« Sie Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai thr Hia Sln 210 SIS 220·
Gly Léu. Ser Ser Pro Vai thr hys Ser Phe «® Arg Giy Glu Cys 225 2:30 235
<210> 29 <211> 781 <212> DNA <213> Sequência de DNA completa da cadeia leve enxertada <220> <221> Sequência completa da cadeia leve enxertada <400> 29 ttcgaagecg ccaecatgaa gttgeçtgtt aggctgttgg cctgcttccc ggggtgacgt fceaagtgecc caqsgcceat ggagaccggg tcaccafccsc ttçtagatcc agteagagtc aectttttgt cttggtatct geaeaaacca ggtaaagccc atctctaaca gatttagtgg tgtaccagsc aggttcagcg ttcaccctea cgatctcgtc tetceagcca gaagatttcg ggtacacatc agcegtaeae atteggtcag ggtaetaaag tgctietgtt ccagectgag ttgcaâscag eaeaattgct gttccggaag ecacttatta tagaastcaa gttetggatt cgeatstgta ttatgggsac catctacgga fcggtáctgat cfcgtttacae aogtaeggts' 60 120 180 240 300 360 420 55 ΡΕ1504035 geggcec.cat tetgttgtgt çataacgcce agcacctaca gtctacgcct aggggagagt e ctgtcttcat gcctgetgaa tccaatcggg gcctcagcag gcyaaçjtcac gttágaggga çtteccgeca taacttctat taactcccag caccctgacg ccatcagggc gaagtgcccc tctgafcgagc eccagagagg gagagtgtea cfgageaaag ctgágetcgc cacctgctcc agttgaaafcc eeaaagtaca cagagcagga cagactacga ecgtoacaaa tcagttccag tggaacfcgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaaacacaaa gagcttcaac cctgggaatt 480 540 600 660 720 780 781
<210> 30 <211> 467 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> Sequência completa da cadeia pesada enxertada <400> 30
Met Asp Phs Gly Phe Ser Leu Vai Phe Leu Ala Leii Ile Leu Lys Gly -i- 5 10 15 Vai Gin Cys Giu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Trp lie HXs Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lêu 50 55 60 Glu Trp 11« Gly Gly 11e Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg 65 ?Õ 75 80 Arg Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser as 90 95 Thr Vai Tyr Met Giu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 1X0 Tyr Tyr Cys Thr Ar g 51 li Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala 115 120 125 Tyr Txp Gly . Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 ISO Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Sar Ser Val 155 200 205
Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Giy Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 ' 220 56 ΡΕ1504035
Vai Asp Bis Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240 Lys Tyr Gly Feo Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255 Gly ?ro Ser Val Phé Leu Phe Fro Fro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Het 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Fro Glu val Thr Cys Val Val Val Asp. . Val Ser Gin 275 28D 283 Glu Asp F.ro Glu Val Gin Phe Am Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 2 30 295 300 His &sn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr 38S .310 315 320 Ar g Vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu Bis Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 33S Lys Glu Tyr lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 340 34S 350 Glu Lys Thr 11® Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glrt Pro Gin Val 355 360 365 Tyr Th.t: Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Kefc Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 38 S 300 395 400 Trp Glu Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn Bis Tyr Thr Gin Lys Ser Ser Leu Ser 450 455 460 Léu Gly Lys 465
<210> 31 <211> 2160 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> Sequência completa da cadeia pesada enxertada <400> 31 57 ΡΕ1504035 aagcttgccg ecaccatgga cttcggattc tctctcgtgt ccctggcact cattctcaag 60 ggagtgcsgt çtgaggfcgca attggtecag teaggsgeag aggfctaagaa gcctggtgct 120 tccgtesaag tttegtgtsa ggetagcggc tacaggtfccs çaaatfcafcfcg gattcattqg 180 gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggafccggtg gcâttaatcc cgggaataac 240 tacgctacat ataggagaaa attecaggge agagttaega tgaccgcgga cacctccaca 300 agcactgtefc a«&tggaget gtcatctctg agatcegagg acaccgcagt gtaetattgt 360
sctagagaag gctacggtaa fctacggagcc tggttcgcct actggggcca. gggtacccta 42G gteacagtct ectcagcttc tacaaagggc ecatccgtct tccccctggc gccotgctcc 480 aggagcacct ccgagagcac agccgccetg ggctgcotgg tcaaggacta cttecccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ct.caggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cctcccggct 600 gtcctacagt cctcaggset cfcactecetc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggeaega agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacse caaggtggac 720 aagagagttg gtgagaggcc agcsscaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780 ccctcctgcc tggacgcscQ çcggctgtgc agccccagec cagggoagca aggcstgccc 840
catctgtctc ctcacccgga ggcctctgao eaecccacfce atgeccaggg agagggtctt SOO ctggattttt ccaccagget ccgggcagcc acaggctgga t.gcccctacc ccaggccctg S60 cgcataosgg ggcaggtgcfc gcgctcagac ctgccaagag ceatafcecgg gsggaccctg 1020 cccctganct aagcccaccc caaaggccaâ actetccact ccctcagctc agacaccttc 1080 tcfccctccca gatgtgagta aetccrcaate ttctctctgc agagtocaaa tatggtcccc 1X40
Gatgcccacc atgcceaggt aagccaaecc aggcctcgee ctccagctca aggcgggaca 1200 ggtgccctag agtagcctgc ateeaçjggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1250 tceatctctfc cctcagcaec tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gftcccccca 1320 aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgfc ggtggtggac 1380 gtgagccagg aagaccccga ggtccagfctc sactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcsacàgea cgfcaecgtgfc ggtcagcgtc 1500 ctcacegtcc tgcaecagga ctggctgaac ggeaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1550 aaaggeetee egtcciccat cgsgaaaacc atctecsaag ceaaaggtgg gacccacggg 1620 gtgcgagggc cacatggaca gaggtcaget cggcecaccc tctgcccfcgg gagtgaccgc 3,680 tgtgccaacG tetgteeeta cagggcagcc oogagagcca caggtgtaca cccfegcccec 1740 atcccaggag gagatgacca agaaccaggfc cagcctgacc tgcctggtca aaggctlcta 1800 ceecaçegac ategccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca gctacaagac 1860 cacgcctccc gtgctggact ccgacggete ettcttectc tacagcaggc taaccgtgga 1920 eaagagcagg fcgçeaggagg ggaatgtctt cteafcgctcc gtgãtgcâfcg aggctctgGia 1980 caaccactac aca&sgaaga gcctctcect gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc 2040 a&geecccgc tccccggget ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcâCgt aecocgtcts 2100 catacttccc aggcscceag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaatlc 2160
<210> 32 <211> 94 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl TI <400> 32 60 9-1 agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaãgectggt. gcttccgtca aagttfccglg tasggctagc ggctacsggt tcac
<210> 33 <211> 96 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> <220> 58 ΡΕ1504035 <221> 544gHl Τ2 <400> 33 gtggcattaa tcccgggaat cagtacaota cafcataaasg aaatctaaag ggcagagcaa cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg fcetacs.
<210> 34 <211> 95 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl T3 <400> 34 agagaaggct acggtaatta cggagccfcgg ttcgcctacfe ggggceaggg taccctagte acsgtcfeccfc cagcttotac aaagggccca agaaa
<210> 35 <211> 94 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl BI <400> 35 ggaccaaitg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga atccgaagtc catggtggcg gcaagct ctfc attc
<210> 36 <211> 97 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl B2 <400> 36 gattcccggg attaatgc.ca ccgatccatt ccaggccttg tc.c.cggagcc tgccfcgacee aatgeatcca ataatttgtg aacctgfcage cgctagc
<210> 37 <211> 93 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl B3 59 ΡΕ1504035 <400> 37 cgtaattacc gtagccttct etagtacaat agtaeactge ggtgtcctcg gatctcagag afcgacagctc catgtagaea gtgcttgfcgg agg
<210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl F1 <400> 38 gaataaaagc tíggcgccac c 21
<210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gHl Ri <400> 39 titctigggc ectítgtaga ag 22
<210> 40 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gLl Ti <400> 40 gcttcccggg gtgacgttca agfcgacccag agcceatcca gcctgagcgc atctgtsgga gaccgggtca çgatcaettç tagatec
<210> 41 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gLl T2 <400> 41 tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt 60 ΡΕ1504035 agtggtgtac cagacaggtt çageggfctcc
<210> 42 <211> 91 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> <220> <221> 544gLl T3 <400> 42 agatfcfccgac acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat teggtcaggg tacfcaaagta gaaatcaaac gfcacggcgtg c <210> 43 <211> 88 <212> DNA <213> <220> <221> 544gLl BI <400> 43 gaaegtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc cfcaacaggca acttcatggt ggcggcttcg aatcatçc <210> 44 <211> 88 <212> DNA <213> <220> <23 0> <220> <221> 544gLl B2 <400> 44 ctttacctgg ttfcgtgeags taecsagaea aaaaggtgtt eceatsactg ittgcaagsc tctgsctgga tctacaagtg atgçtgac <210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> <220> <223> <220> <221> 544gLl B3 <400> 45 aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcâg taccacttcc ggaaccgetg aaeetgtefcg 61 ΡΕ1504035 <212> DNA <213> <220> <223> <220> <221> 544gLl F1 <400> 46 ggaígattcg aagccgctae 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> <220> <223> <220> <221> 544gLl R1 <400> 47 gcacgccgta cgfflgatS c 21 <210> 48 <211> 339 <212> DNA <213> ratinho <220> <221> Sequência de DNA de VL do anticorpo monoclonal 5/44 <400> 48 gafcgtfcgtgg tgactcaase tceactctcc ctgcctgtoa gctttggaga tcaagtttct 60 atctettgca ggtetagtoa gagfccttgca aacagtfcatg ggascãocfcfc fcttgfccfctgg 120 tacctgcacsa agcctggcca gtctccsic&q ctcctcatct atgggatttc csacsgattf 180 tçtggggtgc eagacaggtt cactggcagt. çgttcaggga c&qátttcac actcaaçatc 240 agcacaataa agcctgagga cttgggaafcg tattactgct tacaaggtac aeateagceg 300 tacaogttcg gaggggggao caagotggaa ataaaacgt 339 <210> 49 <211> 363 <212> DNA <213> ratinho <220> <221> Sequência de DNA de VL do anticorpo monoclonal 5/44 <400> 49 gaggtccaac tçcagcsgfcc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60 tcctgeaagg ettctggefca caggfcfctacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120 cctgggcagg gtctag&atg gafctggtggt attaatcetg gaaataatta tactacgtat 180 aagaggaact tgaagggçaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240 atggacctca gcagcctgae aagtgaggac fcctgcggfcct attactgtac aagagagggc 300 tatggtaact «cggggcctg gtfctgettac tggggccagg ggactctggt caccgtctoc 360 tca -363
<210> 50 <211> 9 <212> DNA <213> sequência artificial 62 ΡΕ1504035 <220>
<221> Sequência dentro da sequência iniciadora oligonucleotidica <400> 50 gccgccacc <210> 51 <211> 101 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <221> sequência iniciadora oligonucleotidica 5' <400> 51 gegcgcaage ttgccgeeac catggactte ggattctcto fccgtgitoct. ggcactcaft ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagete gtcgagtctg g
Lisboa, 31 de Maio de 2010

Claims (31)

  1. ΡΕ1504035 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de anticorpo tendo especificidade para CD22 humano, compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende SEQ ID N0:1 para CDR-H1, a sequência GINPGNNYATYRRKFQG de gH7 na Figura 6 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16 para CDR-H2 e SEQ ID NO:3 para CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende SEQ ID NO:4 para CDR-L1, SEQ ID NO:5 para CDR-L2 e SEQ ID NO:6 para CDR-L3.
  2. 2. A molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 compreendendo a sequência GINPGNNYATYRRKFQG de gH7 na Figura 6 para CDR-H2.
  3. 3. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, que é uma molécula de anticorpo com CDRs enxertadas.
  4. 4. A molécula da reivindicação 3, em que o domínio variável compreende regiões estruturais aceitadoras humanas e CDRs dadoras não humanas.
  5. 5. A molécula de anticorpo da reivindicação 4, em que as regiões estruturais humanas aceitadoras do domínio variável da cadeia pesada são baseadas em SEQ ID Nos:21 e 22 e compreendem resíduos dadores nas posições 1, 28, 48, 71 e 93, numerados segundo Kabat, que correspondem 2 ΡΕ1504035 aos resíduos 1, 28, 48, 72 e 97, respectivamente, em SEQ ID NO: 8 .
  6. 6. A molécula de anticorpo da reivindicação 5 compreende ainda resíduos dadores nas posições 67 e 69, numerados segundo Kabat, que correspondem aos resíduos 68 e 70, respectivamente, em SEQ ID NO:8.
  7. 7. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que as regiões estruturais humanas aceitadoras do domínio variável da cadeia leve são baseadas em SEQ ID NOs: 17 e 18 e compreendem resíduos dadores nas posições 2, 4, 37, 38, 45 e 60, numerados segundo Kabat, que correspondem aos resíduos 2, 4, 43, 43, 50 e 65, respectivamente, em SEQ ID NO:7.
  8. 8. A molécula de anticorpo da reivindicação 7, compreendendo ainda um resíduo dador na posição 3, numerado segundo Kabat, que corresponde ao resíduo naquela posição em SEQ ID NO:7.
  9. 9. Uma molécula de anticorpo com especificidade para CD22 humano, compreendendo uma cadeia pesada de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6 e uma cadeia leve de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8.
  10. 10. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, compreendendo SEQ ID NO:19 (a região variável da cadeia leve de 5/44-gLl) e SEQ ID NO:27 (a região variável da cadeia pesada de 5/44-gH7). 3 ΡΕ1504035
  11. 11. Uma molécula de anticorpo tendo especificidade para CD22 humano, tendo uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:28 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:30.
  12. 12. Uma molécula de anticorpo tendo especificidade para CD22 humano, tendo uma cadeia leve consistindo na sequência apresentada em SEQ ID NO:28 e uma cadeia pesada consistindo na sequência apresentada em SEQ ID NO:30.
  13. 13. 0 anticorpo da reivindicação 1, que é o anticorpo monoclonal 5/44 de ratinho anti-CD22, em que o dominio variável da cadeia leve tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:7 e o dominio variável da cadeia pesada tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:8.
  14. 14. A molécula de anticorpo da reivindicação 1, que é uma molécula de anticorpo quimérica, compreendendo as sequências dos domínios variáveis da cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal da reivindicação 18, descritas em SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respectivamente.
  15. 15. Uma sequência de DNA codificadora da cadeia pesada de uma molécula de anticorpo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
  16. 16. Uma sequência de DNA codificadora da cadeia leve de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14. 4 ΡΕ1504035
  17. 17. Uma sequência de DNA codificadora da cadeia pesada e da cadeia leve de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
  18. 18. Um vector de clonagem ou de expressão compreendendo uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
  19. 19. Uma célula hospedeira compreendendo um vector de clonagem ou de expressão de acordo com a reivindicação 18.
  20. 20. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17 para usar em terapia.
  21. 21. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou 20, tendo especificidade para CD22 humano, ou uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17 ou 20 para usar no tratamento de uma patologia mediada pelas células que expressam CD22.
  22. 22. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 20 ou 21 ou uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, 20 ou 21 para usar no tratamento de linfoma maligno. 5 ΡΕ1504035
  23. 23. A molécula de anticorpo ou sequência de DNA da reivindicação 22, em que o linfoma maligno é linfoma não-Hodgkin.
  24. 24. Utilização da molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, tendo especificidade para CD22, ou utilização de uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17 na produção de um medicamento para o tratamento de uma patologia mediada pelas células que expressam CD22.
  25. 25. A utilização da reivindicação 24, em que a patologia é linfoma maligno.
  26. 26. A utilização da reivindicação 25, em que o linfoma maligno é linfoma não-Hodgkin.
  27. 27. Uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo a molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a sequência de DNA de qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
  28. 28. Uma composição terapêutica ou de diagnóstico de acordo com a reivindicação 27, compreendendo um exci-piente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
  29. 29. Uma composição terapêutica ou de diagnóstico de acordo com a reivindicação 27 ou reivindicação 28, compreendendo ainda anticorpos anti-células T, anti-IFNy ou 6 ΡΕ1504035 anti-LPS ou ingredientes que nao são anticorpos, tais como xantinas.
  30. 30. Um processo para a produção de uma molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 19 em condições adequadas para que ocorra expressão da proteína a partir do DNA codificador da referida molécula de anticorpo e isolamento da referida molécula de anticorpo.
  31. 31. Um processo para a preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, compreendendo a mistura de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 juntamente com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 31 de Maio de 2010 ΡΕ1504035 1/19 Figura 1 Sequência das CDR de monoclonal de ratinho 5/44 Hl NY$ riH (SEQ ID mo H2 Glt IPGKÉKYTTYK EMLKG (SEQ ID m H3 Ef-o' j fGNYGAWFAY (SEQ ID mo ΡΕ1504035 2/19 Figura 2 Sequência de DNA/Proteína de 5/44 VL so 30 i É0 a a gat STf 6¾¾ oto ACT CRA ACT cc» OTO TSC CTO CC? OTC Mc ttt GÇA GAT cm STT CTA CS» c&c ÇAÇ ?ç» GTT Tsm CCT cm MS MC ss» CÃS TOS AAA CCT om αττ CAA P V V V T 0 τ P 1· 8 Ϊ, 2 tf 0 F c .0 Q Χή* ϊδ 80 m xeo XX 6 w MC TCT toc TOT mt CAS ast eçA A&C MT mr •CSC AAS ACG m *?TO Mm. « Mm. TOS ASA Kà ®TO TOA SM CGT TTS TCA ATA cee TOS TOS PAk AAC o I s c A s Q S A δϊ § y « » f i' LA aae 1.30 im ÍM 3S0 l'?0 TC? TOS ac CTO e&s A»® CCf esc CftS ?er CCA CM cto CTC ATO TM OSQ ATT TOC AS» aoc ATO SAC STO ??c SSA CCS ASA •y&*4 STC s»s ®s TAS ATA. CCS TAA MS o m ¥ Sí li K Ψ s 0 § ψ Q 0 b I Y « X S> XiD ISO 208 ?J0 220 AM mk TTT TOT sss GTO> cc» SM‘ A®& YTO MT esc MT CÍ5TT TOA •MS ACA cm TTO TOÇ TvT AAA ASA CCC oac mt CTO YCC AAS TGà TOS TCA SCA MT TOC TOT cm AAS ;s A r A e V 0 « r T m S é s Q T o F> 230 £40 250 200 27Q 280 «CA CTO MS ATO MC ACA ATA SRS CC? mc TTS CSA ATO TAT mc TSC TTA ÇAS Tí3T cm Tf« ms TO* TST tm rrc SCA CTC OTS AAC CCT TAC ATA hm AOS SM- SfT T & ¥. I 8 T I £ F ε b 1» 6 ÍS ¥ Ί C i, 2S0 300 J.U< 320 330 sm ac» cm cm CCS ms ACS W <3GA ees eee &CC ma CTS S&A ATA mh CCT CCA TGT ST A 07C CSC ATO TOC AS® ©CT TOC CCS TSS T?C SAC CTT TAT TTV SCI sS T Q P Y T £ s e e T K A E 3 E :b> ΡΕ1504035 3/19 Figura 3 Sequência de DNA/Proteína de 5/44 VH m 30 30 40 30 SA6 qtc CM í» cm cm TO SCO ACT om ÇTS CCA AGE CCF GGG CCF fce QTC AACí CTÇ cm GTf me <21« SFC AO» c«e tsa CAT S&C €«T FCC CCA CSC AOS cm TTÇ W> V Q 1.' & S c τ ¥ & m s A s V K> 60 ?5 00 90 10í> Π D **« TO ftftâ ser TO ÍSSC TO AOS TFT ACC AAC TAC TO ATT CAC TO- CTA AAA T AC Τ&£\ί*ι f?C OSA asa CCS ATS iccr AM 'TO ΪΤ6 ATS acc ma SFS aos CÂf TTF M s C K A a s Ϊ & T T N ¥ I B ’2 ¥ K> os 130 140 ISO iso 170 CAS .ME CCS GGG CAfâ GSSt CTA S&A. TOS ATT S«¥ SST ATT AAF CCT Mf WT TAF S'iC TCC ssa ccc gtc ce& (SAT «ff JUX FM cm OCR im Fm SSA ÇÇf a"Íà TTA AFA Q R F s S i & Ϊ « s :T; c A ¥» rso im 200 210 320 ΜΦ M« TAT Mg &©s me TO AAC /v'r \<wV mc SCC ^Cà CTS ACT GCA TO AÇA ΨVÚ ÇCC TKA FSC asa TTC tcc Tm &&C mi CCS FFC aos FSF SAC TSS CST cm tst AíSS CSC f f t K K n L K s K A T li T A v T s A> 330 240 250 zm 270 200 MC ACT occ ac a®s SAC CSC mc w om ACA ACT SAS @AC FCT TO CTC TAF mc TO TO TO ATO cm TO &%â TO fCS mc TO FCà €TC CTS ASA TO TO AFA AfC 3 F a Ύ n 0 li s s 1. F S ϋ G $ A V ¥ T> soo »o 310 3.2Θ 33® 3^0 OT ΜΆ ACA í5Scf3: \?Γτ\ν ase TO SST AAC TM asc SCO '"SE TTT GCT mc TO sec CStó I3SS MS. FSF fcf CFG CCS MA SXA cr« ATS ccc TO ÀCC MS. TO ATS MC TO 4. V CSC C Ί R 1 ® f 0 M ¥ 0 A TS F k ¥ »í s α s> 3LV0 3S0 ACT em STC ACÇ ETC FCC TCA 1 1 cas tos CSC &ss ΜίΤ f h V ψ V $ â> ΡΕ1504035 4/19 Figura 4 Remoção do Local de Glicosilação e da Lisina Reactiva Estratégia de PCR para mutar CDR-H2 em vector cH
    CBR-H! ísioilt- CDR-H2 CDM 3 CDR-H2 55 «6 65 4 * * cM GMMYTTYRRNLICG N55Q 02” GNQYTTYKMNLKG TS7A 12’ GMNYATYMRI^LEG T57V GNNYVTYKRNLKG ΡΕ1504035 5/19 Figura 5 Desenho de Enxertos para a Sequência da Cadeia Leve de 5/44 10 20 40 Vi, PWWOTLS&PVSF&DQVSISC RS$Q$I*MSYGHTFLS S?¥IdÍKFÇ0SFOJJ*SY II ! I ! Π I I i I n ! I J ®m oio^TQapssiíS^vsBswiTC ^yq&kpckafklliy | ! III gU DVQVTaSPSSLSÃSVGBRVTITC RSSQSLftHSYSSTELS &'£L B KPGKA F QLL1Y $$ DfWfaSPSSI.SãSWSiDmrriTC RSSQSLRIlStfSSTFLS MYLHKPÇK&PgíiMY 60 70 80 90 &ISNRFS {SVPOEFTâSÔSâfDFfLlISfIII?£DL«yC I^THQPW t i I m m evpsiiFâes^efpra.fxssi.QfEDFATyYC &y «L3 GISMPFS GVPfRFEe§©^Ti5FTLTISSLQPEDFATYYC IéQSTHQPYT gisnws gvpdefsgs-gsgydftltisseqpeofatyyc L:Qstmqpyt xoo Vi. FSGGTILBIKR I 1 JK1 FSQSTKyEIKR «M FSQSSKVEXISt gtf FSQGTIVBIER DPK-9 é a sequência estrutural aceitadora germinal humana As linhas verticais indicam diferenças entre os resíduos de ratinho e humanos As sequências sublinhadas indicam resíduos dadores que foram mantidos no enxerto. As CDRs estão indicadas a azul (não apresentado para DPK-9). O enxerto gL1 tem 6 resíduos estruturais dadores, gL2 tem 7. ΡΕ1504035 6/19 Figura 6 Desenho do Enxerto da Sequência da Cadeia Pesada 5/44 10 20 30 40 50 V» E¥QlíQSSG1T¥:0&EPSESV'KMSÇKaSG¥RFT NYWIH WVKQRPGQGLSSI9 GlISR i t m π ι μ i tm QVQLVQSG&EVKKPGAS VK.VS€KftSGYTFY WVRQãPSOGLSWMG mt nywih w¥eqa.pgogle¥^g gihp ιμ&φ BVQLvos^EVKKe<msvKvscKÃgGYRFT nwm mm S0 70 80 50 100 v» GNtíOTYiaRííitío »»T^mvfSMmmf>i>ssOTEpm¥5fycTR mmms i 1111 I I I i I í am KFQG RVfMfRDtBfSfVYllELSãmSlDmVYlCAB ottmnmnKNOKe GOTMYmtlEKS S»YÂTYRREm* <^*TYfcTYRRKFQG gmíyatyrrkfog §10 ίΗϊ SH6 PATYT.ABTS Y STV YEIELS BLRS EDT&YΥΎCTR RGYG1SYS BATSmor 3T3?wmwh% S LRSEDY&VYYCTR EGYSHYS RVYMmDYSTSY¥YMBI.SSLESiOm¥YYCYE BGYSKYG E^mOYSTSY¥YÍÍEI.SSlÈESEOm¥YYCTR EGYC.MYG EVYMfABYSTSYYYMEESSEESEDYAYYYCYR BGYGHYG 110 SGQGTLVTVSS v„ hmkY «roQGfLVfvoa gHJ ÃSífAY WGQGTLVYVSS gm,w μχαχ «ecHsriiVYVss DP7 é a sequência estrutural aceitadora germinal humana As linhas verticais indicam diferenças entre os resíduos de ratinho e humanos As sequências sublinhadas indicam resíduos dadores que foram mantidos no enxerto. As CDRs estão indicadas a azul (não apresentado para DP7). O enxerto gH4 e gH6 têm 6 resíduos estruturais dadores. Os enxertos gH5 e gH7 possuem 4. ΡΕ1504035 7/19 Figura 7 Mapas de pMRR14 e pMRR10.1
    ΡΕ1504035 8/19 Figura 8 Ensaio Biacore de 5/44 quimérico e mutantes sm m -KB aM cl jM 23 3.93 04 TS7A 7.8 U 0,51 3.27 0.i ,3 0.07 0,2 9/19 ΡΕ1504035 Figura 9 Oligonucleótidos para as montagens dos genes gH1 e gL1 de 5/44 Cadeia Pesada 544gHl Tt AaTOTeAaGTíK^TTCK51€€AemMíGA<X;AtMGOTrAA<3ÂAO€CTOOTGClTCCOTCA itóGTnCCrrGTAÁGeCTAQCCíGCTACAGG^rTCAC 544gH1 T2 Gl^GC^TTAATaXGO<3^TCACTAC^CTACATATAAAAOAAAt€rAAAOGOC^04GCA ACGCTGACCCCGeACA€CfCCACAA.etCACrOTCXACA AGAGAAGGCTACGC3mÃTrÁCCt0AG€CTGGTrCGCCTAGTO3GaCCAGGGTACCCrAGTC ACAGItntXrTCAOCITCTACÁ^GGGCCCAAGAAA 544 gHJ BI GGACCAAlTGCACCTeACACTG€A€TCCCTlBAGAÁfGAOTOCCAGGAACACGAGAOAG AATCCOAAOTCCATGGTOGCGOCAAGCTnTATrC GAlT€CC0ÍKjAlTAATGCCACCGA'K-CATIX^AG<KvCTTGTCO3GGAGCCfGCCrGA€CC AATOAAlt^CAATAATrTGTGAAÇCTGTAGCCOCTAGC 544gHI B3 CGtAAimCCGmOCCIT€TCTAGTACAATAGTACA€fG€OGTGTCCTCGGATCTCAGAG ATôÂC4GCTCCAT<tlAGAC5ÀGTGCTrOTGrGAGG 544gHl Fl GAA.TAAAACCTfGCCGC^ACC 34%H1 RI TrrcTTOGGCCCirrGTAGAAG ΡΕ1504035 10/19 Figura 9 (continuação) Cadeia Leve $44 g.U TI Ο(ΙΓΤ€€ΟΟ«ίαΤθΛ€Ο^€ΑΑ0ΤθΑ«€ΑαΑΟ€€€ΑΤΟ€Α<5€€ΤΟΛΐ3€<ί€ΑΤ<σΓ<?ΓΑβΟΑ ÚÁC&OQCfltCÂGCÁTCÂCTT&TAQATQC 544 gUT2 TATCTQCACAAÁCCAGQTÂAAÚCCCCÂCAATTGCTCA’TCTACGGAATCT'CTÀACAOÁTI~r AOTOGTOTACCAGACAOGTTCAODGOTTtíC AOATTrCOCCACTTATTACÍOTmACAAam^ACACATCAGCCOTACÃCATTCOGTCAGOG TACTAAAGTÁÍSAAATCAAACÔTACiGGCÍiTGC 54%Ll Bi GAA:C<mmCCOOGGGAA0CA^GÂÂT€CAOAACAACAOAAGCACCAAOAGC:CTAACAaO CAA.CTTCATGGTGGCOGCTT€GAÂl'CA'FCC CTTTACCTCGTTTGTGCAGATÂCCAAGACÀAAv4kA(XjTGTTCCCATAACTGTTTGCAAGAC TCTGACTGCSATCTACÂAGItlATOGTGAC 544gLl m AACAGTAATAAGTC3GCGAAAIUritnGGCrQOÀGAGACGÂGAT(^TGAG<XíTGAAATCA OlMXiACri^CíMAACCGCTGAÂCCJGTCTG GGATGATTCCiAAGCCGCCAC 544gLI Ri <X^CGCCGTA€X5TTTeATTTC ΡΕ1504035 11/19 Figura 10 Mapas de plasmídeos vectores intermediários pCR2.1 (544gH1) e pCR2.1(544gL1)
    \ . ΡΕ1504035 12/19 Figura 11 Cassetes oligonucleotídicas usadas para preparar outros enxertos sã ss 3$ *s s«as ec ees jhm? mc tac ser acs. *»r *ss » s*r mtt &sc -¾¾ «ca «a css *Εëà c ws im *se ca» swr xcs «er tsa «x* «e ses *e* «®r «se s*s τββ F S 8 R í X * S & * 8 X. * S R Λ Ϊ 1, T * ...SííEiai 18 18 :k> 3Q SC' SájfcI3 cg mz AfcT »1 tm <sc? xcs TftT ASK3 AWf £*& ftSSfl srt· XCG &TS: MC SC z XTft ΤΓ8 ma OÇ3 j-sr ft»t XCC scr m: ccs 3¾¾1 CÃ& '+m S? íí & 8 y & T ¥ :¾ 3¾ & F 3 s R T 8 X A ap Sfi *8 SiíS ,...JMM-· çç fm *ÃX &rc íftlC CCS? TA? AÈS m rre ÍÍë stsc AESR CÇí. 8CS CXS XvC SC g TOS ΑΦΒ CKft· m XCC XX sw ARG STE 'XX 8« ft£® «&!í íí>§· P g « ΚΓ Ϊ Λ T ¥ •R R » P Q 3 s fc T i, ΐ S 4« 20 20- *0 8S 3:»CTI cc S3C C xat1 mi ãsjg: x?s 3fAC AX« SÇf? Í5Sà TA? ASA TS? m TXT TTC MS 8Ά8 :S588 8TÇ SSS5 JSSft ΪΌΤ 8>}-T ÃÍ5S cm sise A1Í8 ?*Ç SfcCC: XÊS 8 5? H ¥ A n * £ Q S S ¥ T SJ T .A -••JsaaL *« s» « ^ *« ..... c oes θβϊ srg rara «*c #*8 àéa <au$ im «s» tsa *âc »6 isê <ssx í«* em es* «sc ese «sé*. e*s êsx este «se *ss ®ws m ser sm wa ws *ee <m zm &m «ser *rs eax sms ss 8. fiBt?»V¥Sí » S 8 3< 8 S 8 V β δ 8 V S> ΡΕ1504035 13/19 Figura 12 Cassetes oligonucleotídicas usadas para preparar outros enxertos
    ΡΕ1504035 14/19 Figura 13 Sequência completa de DNA das cadeias pesada e leve enxertadas a) Cadeia Pesada 15 t0 36 *8 so se aascttsixs es&se ,*®s <s»c ttc sea ysc tct ctc sre otc cm «ca esc *pr crc ass ssesKfe&see ssyss tsc e?s ras orar ase aefc «e cac sas esc cor «ss ím sas tsc & t) r c 5 5. Y r í» Ά íi Ϊ X, ?Q ?E3 so itSÔ 31S ssa STS cag ®ST Sfcfíi st® c«. rio ®?e CRS ma se;a GÇA mo e-íT AMÍ MS CCT «AT t-CÍ CSC Sc AOS. cm c»c srr MC C:S'3 STC AÍTF CCT CST CTC cm TTC TSC SSA CCS S ¥ Ô c ? 0 & ¥ e $ s A s V K X £ ISO 140 15.0 ISO 173 δ&Τ TCC STft asa §TT YC« ffiST AÍS SCT mc scc TSC ASS TTC ACS AÃT 5¾¾ T®S ATT SSR ASG CM fW CSA asc acs. TFC ca TCG CCS STG -ooc AAG T*m am see TAA A £ V :K V s c £ A s « Y s S‘ •Ϊ Y T> isa ISO soo sis 320 330 CA? TSQ ®PC aos sm se? cs® «3A CA& 3GC cts «SA TSS ASC- «ST s«c ATT «T oec STA ACC CAS scc taxe cm mo. ©o: ST? ÇÇÇ «SC ÇTT aíx: ϊ·Α(3 CCã CCS TAS Tm «AÍ5 a » V a s A 5? V Q G li ε x í Q s 1 P> 240 2 ao 209 í?íj aso «HS aat AAÇ me se? SCft m? 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Λ P c s s s t s s s s A A « O ΡΕ1504035 15/19 Figura 13 (continuação) S.S3 S38 643 S38 ses 370 CTO ®TÇ MS «AC TAG ??C eee SA& CCS «7iS ma Ç7C tos AS« TOA 5«C sec CTO ®AC CMs HC CTS At« ft&S «8« CTF «oc CAC TSC CAC .«.se ACC -rts mt CCS OS«: «AC s. 7 K β ¥ f 8 S F V 7 V s w s k L> sm 5'61 6U0 SIS «s 630 SCO ASC sse ®M3 eae ACC OTPC. CCS «ÇF :iTC cm CftS TCO 7'CA «SS. CTC Tm TCC 0TC KsS 3¾¾ cee CSC OT TOS ÃAS 6SSC e&s c&e «AI ssc &«ϊ ccr mr· ATO AOS CAS T s c V 5J ϊ F F A V i s s 8 a h F 8 !>> 648 653 6«=0 S7Q mo ftSC ASC §K «Γ8 ACC «TS o:x: TCC ASC ase »C ffiãC .6.03 .SSS ácc mc ACC Tse AAC fCS TCS cm CAC TS3 ç&e sc-e AS38 TC8 KS ASC CCS •fac ttç 70S MO ‘FS« AOS Tm s a V V F V F S S a s T í: T t F 0 Í3> 706 i !10 jm 730 7«Ô 0'J'A GA7 CAC AftS cee mz mc Ά0Ζ AAC $1« «AC MíS ASA «77 o smM&ssce ÇAT C?A CFS W ess rcxz Tm TGO, 7TC CSC CFG tTC ιοί CAA C «A07Í71ÇÇSG ¥ β s :K F 3 T :s: F 8 K s V> ?sõ 788 770 7SS 7» 880 8.10 ascacasssa easasssmr zmsmms ccmsz?cm tx&tGemsc w®M3swx ecosewFsc TCGfSTKGCT «ccreasAS* «sícsagcttc «sfccsrsíc «ssassacss saccefccace 828 «38 S4& 85® 8SS 8?8 988 «sccccrsco c&ssGe&sc» msc&tsccc twfcmrGEc ctcsccos^ escape*®»® ernsecaesc tcgsssícss «scccstcs? içfismcssG sxM&Cáâ&& sAfâressíxs? ccssaoscts fgt&s&srssie $m AOS 818 §20 938 948 958 &¥8CèG®í3©3 jASASSSTCTl? dTSSMlTTT iXACCM^f SCSQÍ3CWCG ÃÇÁOâeTSSA TSCSCCS&GC «MSSGGTCec TCT0CC&SA& SACCSAAMA 6®TSSÍC«m SGOSSSSTCSG TSTCM!»ee? 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