NO336201B3

NO336201B3 - Antistoffmolekyl spesifikt for humant CD22, dets terapeutiske anvendelse og fremgangsmåte for dets fremstilling

Info

Publication number: NO336201B3
Application number: NO20044742A
Authority: NO
Inventors: Andrew George Popplewell; Simon Peter Tickle; Heather Margaret Ladyman
Original assignee: Ucb Pharma Sa
Priority date: 2002-05-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2015-06-15
Also published as: UA92580C2; BE2017C068I2; US7355011B2; CA2484420C; AU2003223007C1; RU2342401C2; US20120302739A1; CY2017045I1; ES2341708T3; CN101134779B; AU2003223007B2; KR101386376B1; IL164923A0; WO2003093320A2; HUS1700055I1; EP1504035B9; CY1110134T1; US20070059307A1; JP4486494B2; US7919606B2

Description

1

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et antistoffmolekyl med spesifisitet for antigeniske determinanter av B lymfocytt antigenet, CD22. Den foreliggende oppfinnelse vedrører også 5 de terapeutiske anvendelser av antistoffmolekylet samt en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffmolekylet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en DNA sekvens som koder for den tunge kjeden, den lette kjeden, eller den tunge kjeden og den lette kjeden til et antistoffmolekyl ifølge 10 oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en klonings- eller ekspresjonsvektor samt en vertscelle. Endelig vedrører den foreliggende oppfinnelse et terapeutisk eller diagnostisk preparat samt en fremgangsmåte for dets fremstilling.

15

I et naturlig antistoffmolekyl, er der to tunge kjeder og to lette kjeder. Hver tung kjede og hver lett kjede har i sin N-terminale ende et variabelt domene. Hvert variabelt domene er sammensatt av fire rammeregioner (FR'er) som alternerer 20 med tre hypervariable områder (CDR'er). Restene i de variable domener er konvensjonelt nummerert i henhold til et system som er funnet opp av Kabat et al. Dette system er fremsatt i Kabat et al., 1987, i Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human 25 Services, NIH, USA (heretter "Kabat et al. (supra)"). Dette nummereringssystem anvendes i den foreliggende beskrivelse unntatt der hvor annet er indikert.

Kabat rest-betegnelsene korresponderer ikke alltid direkte 30 med den lineære nummerering av aminosyrerestene. Den faktiske lineære aminosyresekvens kan inneholde færre eller ytterligere aminosyrer enn i den strenge Kabat-nummereringen som svarer til en forkortning av, eller insersjon inn i, en strukturell komponent, enten ramme eller CDR, i den grunn-35 leggende variable domenestrukturen. Den korrekte Kabatnummereringen av rester kan bestemmes for et gitt antistoff

2

ved oppstilling av rester med homologi i sekvensen til antistoffet med en "standard" Kabat-nummerert sekvens.

CDR'ene av tung kjede variabel domenet er lokalisert i rester 5 31-35 (CDR-H1), rester 50-65 (CDR-H2) og rester 95-102 (CDR-H3) i henhold til Kabat-nummereringen.

CDR'ene i lett kjede variabel domenet er lokalisert i rester 24-34 (CDR-L1), rester 50-56 (CDR-L2) og rester 89-97 (CDR-10 L3) i henhold til Kabat-nummereringen.

Konstruksjon av CDR-podede antistoffer er beskrevet i europeisk patentsøknad EP-A-0239400 som omhandler en fremgangsmåte hvori CDR'ene til et mus monoklonalt antistoff 15 podes på rammeregionene av de variable domener av et humant immunoglobulin ved seterettet mutagenese ved å anvende lange oligonukleotider. CDR'ene bestemmer antigenbindingsspesifisiteten av antistoffer og er relativt korte peptidsekvenser som bæres på rammeregionene til de variable domenene.

20

Det tidligste arbeid på humanisert monoklonale antistoffer ved CDR-poding ble gjennomført på monoklonale antistoffer som gjenkjenner syntetiske antigener, slik som NP. Eksempler hvori et mus monoklonalt antistoff som gjenkjenner lysozym og 25 et rotte monoklonalt antistoff som gjenkjenner et antigen på humane T-celler ble humanisert ved CDR-poding er imidlertid blitt beskrevet av henholdsvis Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) og Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988).

30

Riechmann et al., fant at overføringen av CDR'ene alene (som definert av Kabat (Kabat et al. (supra) og Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) ikke var tilstrekkelig til å tilveiebringe tilfredsstillende antigen bindingsaktivitet i det 35 CDR-podede produkt. Det ble funnet at en rekke rammerester må endres slik at de svarer til dem for donorrammeregionen. Foreslåtte kriterier for å velge hvilke rammerester som måtte

3

endres er beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. WO 90/ 07861.

En rekke undersøkelser som omhandler CDR-podede antistoffer 5 er blitt publisert, som inkluderer Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

LEUNG S-O et al., ”Construction and characterization of a humanized, internalizing, B-cell (CD-22)-specific,

10 leukemia/lymphoma antibody, LL2”, Molecular

Immunology, 1995, Vol. 32 (17/18), side 1413-1427; omhandler anti-CD22 antistoffet LL2, som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra aminosyresekvensen til det patentsøkte antistoffet.

15

Maligne lymfomer er en divers gruppe av neoplasmer. Majoriteten av tilfeller forekommer i eldre mennesker. Non-Hodgkins Lymphom (NHL) er en sykdom som for tiden rammer 200 000 til 250 000 pasienter i USA. Det er den nest raskest 20 økende cancer i USA, og øker med en hastighet på omtrent 55 000 nye tilfeller per år. Forekomsten øker i en hastighet som er større enn det som simpelt hen kan forklares ved den økende alderen på befolkningen og eksponering for kjente risikofaktorer.

25

Klassifiseringen av lymfom er kompleks og har blitt utviklet i de senere tiår. I 1994 ble "the Revised European-American Lymphoma" (REAL) klassifiseringen introdusert. Denne klassifisering organiserer lymfomer av B-celle (den som oftest 30 identifiseres), T-celle og av uklassifiserbar opprinnelse i avtalte sub-typer. I alminnelig praksis, vil grupperingen av NHL'er i kategorier med lav, mellomliggende og høy kvalitet på grunnlag av deres generelle histologiske tilsynekomst, reflektere i stor grad deres kliniske opptreden.

4

NHL rammer hovedsakelig lymfeknutene men, i individuelle pasienter, kan tumoren involvere andre anatomiske steder slik som lever, milt, benmarg, lunge, tarm og huden. Sykdommen fremviser vanligvis en smertefri økning av lymfeknuter.

5 Ekstranodalt lymfom rammer oftest tarmen, skjønt primært lymfom i praktisk talt ethvert organ er blitt dokumentert. Systemiske symptomer inkluderer feber, svetting, tretthet og vekttap.

10 Inntil nylig var Ann Arbor stadium systemet, som helt er basert på det anatomiske omfanget av sykdommen, den viktigste determinanten for terapi i NHL. Denne informasjon kan foredles ved å innlemme ytterligere prognostiske pekepinner, inkluderende alder, serumlaktatdehydrogenasenivåer og status 15 for opptreden. Likevel er kunnskapen om Ann Arbor stadium systemet, sammen med den histologiske og immunologiske subtypen av tumoren, fremdeles den viktigste behandlingsdeterminanten.

20 Lav-grad NHL har et indolent forløp, med en gjennomsnittlig pasientoverlevelse på 8 til 10 år. Overlevelse er lite påvirket av den nå tilgjengelige terapi, skjønt bestråling av lokal sykdom og kjemoterapi for systemiske symptomer forbedrer pasientens livskvalitet. Kombinasjons-kjemoterapi kan 25 reserveres for residiv sykdom. Mellomstadiumsykdom og særlig høy-grad sykdom er ekstremt aggressiv og har en tendens til disseminasjon. Sykdom av denne grad krever akutt behandling. Radioterapi kan være en nyttig komponent i behandling av pasienter med en svært omfangsrik sykdom. En rekke forskjel-30 lige kjemoterapi-kurer er blitt anvendt, og langtids sykdomsfri overlevelse kan oppnås i mere enn halvdelen av pasientene. Høydoseterapi med stamcellestøtte ble først innført for pasienter med residiv eller refraktær sykdom, men blir nå i økende grad anvendt ved "first line" terapi for pasienter med 35 lav-risiko sykdom. Tendensen i de senere årene mot en økende aggressiv terapeutisk innstilling må avveies mot den generelt økende alderen og relative svakhet hos en rekke pasienter med

5

NHL, og av behovet for å matche toksisiteten av behandlingen mot den individuelle prognosen til hver pasients sykdom.

Forbedrede behandlinger, som er mere effektive og bedre tole-5 rerte, behøves. Midler som nylig er introdusert inkluderer nye cytotoksiske legemidler, som progressivt er forenet i kombinasjoner, og introduksjon av antistoff-baserte terapier.

Ikke-Hodgkins lymfom omfatter en rekke B-celle lymfomer. B-10 celle antigener representerer derfor passende mål for antistoffterapi.

CD22 er et 135 kDa membranglykoprotein som tilhører en familie av sialinsyre-bindingsproteiner betegnet siaload-15 hesiner. Det er detektert i cytoplasmaet tidlig i B-celle utvikling, fremkommer på celleoverflaten samtidig med IgD og er funnet på de fleste modne B-celler. Ekspresjon økes etter B-celle aktivering. CD22 tapes med terminal differensiering og er generelt rapportert til å være fraværende på plasmacel-20 ler. Dette internaliseringsantigen er således tilstede på overflaten av pre-B-celler og modne B-celler men ikke stamceller eller plasmaceller.

To isoformer av CD22 eksisterer i mennesket. Den dominerende 25 formen (CD22K) inneholder 7 immunoglobulin-lignende (Iglignende) domener i den ekstracellulære region. CD22L varianten mangler Ig-lignende domene 4 og kan ha et trunkert cytoplasmisk domene. Antistoffer som blokkerer CD22 adhesjon til monocytter, neutrofiler, lymfocytter og erytrocytter er 30 blitt vist til å binde innen det første eller andre Iglignende domenet.

Det cytoplasmiske domenet i CD22 er tyrosinfosforert ved ligering av B-celle antigenreseptoren og assosierer med Lyk, 35 Syk og fosfatidylinositol-3-kinase. Funksjonen til CD22 er å nedmodulere B-celle aktiverings-grenseverdien. Det kan også mediere celleadhesjon gjennom interaksjon med celler som bærer de passende sialoglykokonjugater.

6

CD22 er uttrykt ved de fleste B-celle leukemier og lymfomer, inkluderende NHL, akutt lymfoblastisk leukemi (B-ALL), kronisk lymfocyttisk leukemi (B-CLL) og særlig akutt ikke-5 lymfocyttisk leukemi (ANLL).

Monoklonale antistoffer mot CD22 er tidligere blitt beskrevet. WO 98/41641 beskriver rekombinante anti-CD22 antistoffer med cysteinrester i VH44 og VL100. WO 96/04925 beskriver VH10 og VLregionene av anti-CD22 antistoffet LL2. US 5686072 beskriver kombinasjoner av anti-CD22 og anti-DC19 immunotoksiner. WO 98/42378 beskriver anvendelsen av nakne anti-CD22 antistoffer for behandlingen av B-celle maligniteter.

15 En rekke antistoff-baserte terapeutika er enten blitt bevilget nylig, f.eks. Rituxan (en umerket kimær human

Ml (+mMlV-region) spesifikk for CD20), eller er i kliniske forsøk for denne sykdom. Disse er avhengig av enten komplement- eller ADCC-mediert dreping av B-celler eller anvendel-<90>20 sen av radionuklider, slik som<131>I eller Y, som har assosiert fremstillings- og brukerproblemer for lege og pasienter. Der er et behov for et antistoffmolekyl for å behandle NHL som kan anvendes gjentatte ganger og som kan produseres lett og effektivt. Der er også et behov for et antistoff-25 molekyl som har høy affinitet for CD22 og lav immunogenitet i mennesker.

I et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et antistoffmolekyl med spesifisitet for humant CD22

30 ifølge krav 1.

Antistoffmolekylet omfatter en tung kjede hvori det variable domenet omfatter et CDR som definert av Kabat et al., (supra)) med sekvensen gitt som H1 i figur 1 (SEQ ID NO:1) 35 for CDR-H1, som H2 i figur 1 (SEQ ID NO:2) eller en H2 hvorfra et potensielt glykosyleringssete er blitt fjernet, eller en H2 hvori lysinresten i stilling 60 (i henhold til Kabat-nummereringssystemet) er blitt erstattet med en

7

alternativ aminosyre, eller en H2 hvori både glykosyleringssetet og det reaktive lysin i stilling 60 er blitt fjernet for CDR-H2 og som H3 i figur 1 (SEQ ID NO:3) for CDR-H3 og en lett kjede hvori det variable domenet omfatter et CDR (som 5 definert av Kabat et al., (supra)) med sekvensen gitt som L1 i figur 1 (SEQ ID NO:4) for CDR-L1, som L2 i figur 1 (SEQ ID NO:5) for CDR-L2 og som L3 i figur 1 (SEQ ID NO:6) for CDR-L3.

10 CDR'ene gitt i SEQ ID NO:1 til 6 og i figur 1 som omtalt over er avledet fra et mus monoklonalt antistoff 5/44.

De fullstendige sekvenser av de variable domener for mus 5/44 antistoffet er vist i figur 2 (lett kjede) (SEQ ID NO:7) og 15 figur 3 (tung kjede) (SEQ ID NO:8). Dette museantistoffet er under også omtalt som "donorantistoffet" eller "det murine monoklonale antistoff".

En alternativ foretrukket utførelsesform av den foreliggende 20 oppfinnelse er det monoklonale musantistoff 5/44 med lett og tung kjede variabel domene-sekvenser vist i henholdsvis figur 2 (SEQ ID NO:7) og figur 3 (SEQ ID NO:8). Lett kjede konstant regionen av 5/44 er kappa og tung kjede konstant regionen er IgG1.

25

I en ytterligere foretrukket utførelsesform, er antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse et kimært mus/humant antistoffmolekyl, betegnet heri som det kimære 5/44 antistoffmolekylet. Det kimære antistoffmolekylet omfatter 30 de variable domener av mus monoklonalt antistoffet 5/44 (SEQ ID NO:7 og 8) og humane konstante domener. Det kimære 5/44 antistoffmolekyl omfatter foretrukket det humane C kappa domenet (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; Genebank accession number J00241) i den lette kjeden og de humane 35 gamma 4 domenene (Flanagan et al., Nature 300, 709-713, 1982) i den tunge kjeden, eventuelt med serinresten i stilling 241 erstattet med en prolinrest.

8

Antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter foretrukket en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., (supra)) en H2' hvori en potensiell glykosylerings-sete-sekvens er blitt 5 fjernet og som uventet økte affiniteten av det kimære 5/44 antistoffet for CD22 antigenet og som foretrukket har som CDR-H2 sekvensen gitt som H2' (SEQ ID NO:13).

Alternativt eller i tillegg kan antistoffet ifølge den fore-10 liggende oppfinnelse omfatte en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., (supra)) en H2'' hvori en lysinrest i stilling 60, som er lokalisert i en eksponert posisjon innen CDR-H2 og som betraktes til å ha potensiale til å reagere med konjugerings-15 midler resulterende i en reduksjon av antigenbindingsaffinitet, er substituert for en alternativ aminosyre til å resultere i en konservert substitusjon. CDR-H2 er foretrukket sekvensen gitt som H2'' (SEQ ID NO:15).

20 Alternativt eller i tillegg kan antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatte en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., (supra)) en H2''' hvori både den potensielle glykosyleringssete-sekvensen og lysinresten i stilling 60 er substituert 25 for alternative aminosyrer. CDR-H2 har foretrukket sekvensen gitt som H2''' (SEQ ID NO:16).

I en tredje alternativ foretrukket utførelsesform, er antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse et CDR-30 podet antistoffmolekyl. Betegnelsen "et CDR-podet antistoffmolekyl" som anvendt heri refererer til et antistoffmolekyl hvor den tunge og/eller lette kjeden inneholder ett eller flere CDR'er (inkluderende, om ønsket, et modifisert CDR) fra et donorantistoff (f.eks. et murint 35 monoklonalt antistoff) podet inn i en tung og/ eller lett kjede variabel region ramme av et akseptor-antistoff (f.eks. et humant antistoff).

9

Et slikt CDR-podet antistoff har foretrukket et variabelt domene omfattende humane akseptor-rammeregioner såvel som ett eller flere av donor CDR'ene som omtalt over.

5 Når CDR'ene er podet, kan en hvilken som helst passende akseptor variabel region rammesekvens anvendes med hensyn til klassen/typen av donorantistoffet hvorfra CDR'ene er avledet, inkluderende mus, primat og humane rammeregioner. Eksempler på humane rammer som kan anvendes i den foreliggende oppfin-10 nelse er KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY og POM (Kabat et al., (supra)). KOL og NEWM kan f.eks. anvendes for den tunge kjeden, REI kan anvendes for den lette kjeden og EU, LAY og POM kan anvendes for både den tunge kjeden og den lette kjeden. Alternativt kan humane "germline" sekvenser an-15 vendes. Den foretrukne rammeregion for den lette kjeden er den humane "germline" sub-gruppesekvens (DPK9+JK1) vist i figur 5 (SEQ ID NO:17). Den foretrukne rammeregion for den tunge kjeden er den humane subgruppesekvensen (DP7+JH4) vist i figur 6 (SEQ ID NO:21).

20

I et CDR-podet antistoff ifølge oppfinnelsen er det foretrukket å anvende, som akseptor-antistoffet, ett med kjeder som er homologe med kjedene til donorantistoffet. Tunge og lette kjeder for akseptor behøver ikke nødvendigvis å være avledet 25 fra det samme antistoff og kan om ønsket omfatte komposittkjeder med rammeregioner avledet fra forskjellige kjeder.

I et CDR-podet antistoff ifølge oppfinnelsen behøver heller ikke rammeregionene å ha eksakt den samme sekvens som dem til 30 akseptor-antistoffet. Uvanlige rester kan f.eks. forandres til mere hyppig forekommende rester for denne akseptorkjedeklasse eller -type. Alternativt kan valgte rester i akseptor-rammeregionene forandres slik at de svarer til resten funnet i den samme posisjonen i donorantistoffet eller 35 til en rest som er en konservativ substitusjon for resten funnet i den samme posisjon i donorantistoffet. Slike forandringer bør holdes til det minimum som er nødvendig for å gjenvinne affiniteten av donorantistoffet. En protokoll for

10

valgt av rester i akseptor-rammeregionene som kan ha behov for å bli forandret, er angitt i WO 91/09967.

I et CDR-podet antistoffmolekyl ifølge den foreliggende opp-5 finnelse, dersom akseptor lettkjeden har den humane sub-gruppe DPK9-JK1 sekvensen (vist i figur 5) (SEQ ID NO:17 (DPK9) pluss SEQ ID NO:18 (JK1)), da omfatter foretrukket akseptorrammeregionene av den lette kjeden donorrester i posisjoner 2, 4, 37, 38, 45 og 60 og kan i tillegg omfatte en donorrest 10 i posisjon 3 (i henhold til Kabat et al., (supra)).

I et CDR-podet antistoffmolekyl ifølge den foreliggende oppfinnelse, dersom akseptor tungkjeden har den humane DP7+JH4 sekvensen (vist i figur 6) (SEQ ID NO:21 (DP7) pluss SEQ ID 15 NO:22 (JH4)), da omfatter foretrukket akseptor-rammeregionen av den tunge kjeden, i tillegg til ett eller flere donor CDR'er, donorrester i posisjoner 1, 28, 48, 71 og 93 og kan i tillegg omfatte donorrester i posisjoner 67 og 69 (i henhold til Kabat et al., (supra)).

20

Donorrester er rester fra donorantistoffet, dvs. antistoffet hvorfra CDR'ene ble avledet opprinnelig.

Antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter 25 foretrukket en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., (supra)) en H2' hvori en potensiell glykosylerings-sete-sekvens er blitt fjernet for å øke affiniteten av det kimære 5/44 antistoffet for CD22 antigenet og som foretrukket har som CDR-H2 sekven-30 sen gitt som H2' (SEQ ID NO:13).

Alternativt eller i tillegg, kan antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatte en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., 35 (supra)) en H2'' hvori en lysinrest i stilling 60, som er lokalisert i en eksponert posisjon innen CDR-H2 og som betraktes til å ha potensiale til å reagere med konjugeringsmidler resulterende i en reduksjon av antigen bindingsaffini

11

tet, er substituert for en alternativ aminosyre. CDR-H2 har foretrukket sekvensen gitt som H2'' (SEQ ID NO:15).

Alternativt eller i tillegg, kan antistoffet ifølge den fore-5 liggende oppfinnelse omfatte en tung kjede hvori det variable domenet omfatter som CDR-H2 (som definert av Kabat et al., (supra)) en H2''' hvori både den potensielle glykosyleringssete-sekvens og lysinresten i posisjon 60 er substituert for alternative aminosyrer. CDR-H2 har foretrukket sekvensen 10 gitt som H2''' (SEQ ID NO:16).

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan omfatte: et komplett antistoffmolekyl med full lengde tunge og lette kjeder; et fragment derav, slik som et Fab, modifi-15 sert Fab, Fab', F(ab')2eller Fv fragment; en lett kjede eller en tung kjede monomer eller dimer; et enkeltkjedeantistoff, f.eks. et enkeltkjede Fv hvori tung og lett kjede variable domener er sammenføyet ved hjelp av en peptidlinker. Likeledes kan tung og lett kjede variable regioner være kom-20 binert med andre antistoffdomener som passende.

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan ha et effektor- eller et reportermolekyl festet dertil. Det kan f.eks. ha et makromolekyl, for chelatdannelse av et tung-25 metallatom, eller et toksin, som ricin, festet dertil ved hjelp av en kovalent forbindelsesstruktur. Alternativt kan prosedyrer for rekombinant DNA-teknologi anvendes for å fremstille et antistoffmolekyl hvori Fc fragmentet (CH2, CH3 og hengseldomener), CH2 og CH3 domenene eller CH3 domenet av et 30 komplett immunoglobulinmolekyl er blitt erstattet med, eller har festet dertil ved hjelp av peptidkobling, et funksjonelt ikke-immunoglobulinprotein, slik som et enzym eller toksinmolekyl.

35 Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse har foretrukket en bindingsaffinitet på minst 0,85x10<-10>M, mere foretrukket minst 0,75x100<-10>M og mest foretrukket minst 0,5x10<-10>M.

12

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter foretrukket lettkjedens variable domene 5/44-gL1 (SEQ ID NO:19) og tungkjedens variable domene 5/44 gH7 (SEQ ID NO: 5 27). Sekvensene til de variable domener av disse lette og tunge kjeder er vist i henholdsvis figurer 5 og 6.

Også beskrevet er varianter av antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen, som har en forbedret affinitet for CD22. Slike 10 varianter kan oppnås ved en rekke affinitetsmaturasjonsprotokoller som inkluderer mutering av CDR'ene (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), kjede-shuffling (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), anvendelse av mutatorstammer av E. coli (Low et al., J. Mol. Biol, 250, 15 359-368, 1996), DNA-shuffling (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), fag-display (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) og kjønns-PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) omtaler disse metoder for affinitetsmaturasjon.

20

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en DNA-sekvens som koder for de tunge og/eller lette kjeder til antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen.

25 DNA-sekvensen koder foretrukket for den tunge eller den lette kjeden til antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse.

DNA-sekvensen ifølge den foreliggende oppfinnelse kan omfatte 30 syntetisk DNA, f.eks. fremstilt ved kjemisk prosessering, cDNA, genomisk DNA eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en klonings- eller 35 ekspresjonsvektor omfattende en eller flere DNA-sekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelse. Klonings- eller ekspresjonsvektoren omfatter foretrukket to DNA-sekvenser som koder

13

for henholdsvis den lette kjeden og den tunge kjeden til antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Generelle metoder som kan anvendes for å konstruere vektor-5 ene, transfeksjonsmetoder og dyrkingsmetoder er vel kjent for de fagkyndige på området. I denne forbindelse skal det vises til "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York og the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

10

DNA-sekvenser som koder for antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved metoder som er vel kjent for de fagkyndige på området. DNA-sekvenser som koder for noe av eller hele antistoffets tunge og lette kjeder kan 15 f.eks. om ønsket syntetiseres fra de bestemte DNA-sekvensene eller på grunnlag av de tilsvarende aminosyresekvensene.

DNA som koder for akseptor-rammesekvenser er allment tilgjengelige for de fagkyndige på området og kan lett synteti-20 seres på grunnlag av deres kjente aminosyresekvenser.

Standardteknikker innen molekylær biologi kan anvendes for å fremstille DNA-sekvenser som koder for antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse. Ønskede DNA-sekvenser 25 kan syntetiseres helt eller delvis ved å anvende oligonukleotid-synteseteknikker. Seterettet mutagenese og polymerasekjede-reaksjon (PCR) teknikker kan passende anvendes.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en vertcelle som 30 omfatter en klonings- eller ekspresjonsvektor ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Et hvilket som helst passende vertscelle/vektorsystem kan anvendes for ekspresjon av DNA-sekvensene som koder for anti-35 stoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse. Bakterier, f.eks. E. coli, og andre mikrobielle systemer kan delvis anvendes for ekspresjon av antistoffragmenter slik som Fab og F(ab')2fragmenter, og særlig Fv-fragmenter og enkeltkjede

14

antistoffragmenter, f.eks. enkeltkjede Fv'er. Eukaryotiske, f.eks. pattedyr, vertscelleekspresjonssystemer kan anvendes for fremstilling av større antistoffmolekyler, som inkluderer komplette antistoffmolekyler. Passende pattedyr-vertsceller 5 inkluderer CHO, myelom- eller hybridom-celler.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl ifølge den foreliggende oppfinnelse som omfatter dyrking av en verts-10 celle som inneholder en vektor ifølge den foreliggende oppfinnelse under betingelser som er egnet for å føre til ekspresjon av protein fra DNA som koder for antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse, og isolering av antistoffmolekylet.

15

For fremstilling av produkter omfattende både tunge og lette kjeder, kan cellelinjen transfekteres med to vektorer, en første vektor som koder for et lett kjede polypeptid og en andre vektor som koder for et tung kjede polypeptid.

20 Alternativt kan en enkeltvektor anvendes, idet vektoren inkluderer sekvenser som koder for lett kjede og tung kjede polypeptider.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et terapeu-25 tisk eller diagnostisk preparat omfattende et antistoffmolekyl ifølge den foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, fortynningsmiddel eller bærer.

30 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk eller diagnostisk preparat som omfatter blanding av antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse sammen med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens, fortynningsmiddel eller bærer. 35

Antistoffmolekylet kan være den eneste aktive bestanddel i det terapeutiske eller diagnostiske preparat eller kan være sammen med andre aktive bestanddeler som inkluderer andre

15

antistoffbestanddeler, f.eks. anti-T-celle, anti-IFNM eller anti-LPS-antistoffer, eller ikke-antistoffbestanddeler slik som xantiner.

5 De farmasøytiske preparater omfatter foretrukket en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen. Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" som anvendt heri refererer til en mengde av et terapeutisk middel som er nødvendig for å behandle, bedre eller forebygge en utpekt sykdom 10 eller tilstand, eller for å fremvise en detekterbar terapeutisk eller preventiv effekt. For et hvilket som helst antistoff kan den terapeutiske effektive dosen initielt estimeres enten i cellekulturanalyser eller i dyremodeller, vanligvis i gnagere, kaniner, hunder, griser eller primater.

15 Dyremodellen kan også anvendes for å bestemme det passende konsentrasjonsområdet og administreringsruten. Slik informasjon kan deretter anvendes for å bestemme anvendbare doser og ruter for administrering i mennesker.

20 Den nøyaktige effektive mengden for et humant individ vil avhenge av alvorligheten av sykdomstilstanden, individets generelle helse, alder, vekt og kjønn, diett, tidspunkt og hyppighet for administrering, legemiddelkombinasjon/kombinasjoner, reaksjonsfølsomheter og toleranse/respons på terapi.

25 Denne mengde kan bestemmes ved rutineforsøk og er innenfor en leges fagområde. Generelt vil en effektiv dose være fra 0,01 mg/kg til 50 mg/kg, foretrukket fra 0,1 mg/kg til 20 mg/kg, mere foretrukket omtrent 15 mg/kg.

30 Preparater kan administreres individuelt til en pasient eller kan administreres i kombinasjoner med andre midler, legemidler eller hormoner.

Dosen som antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfin-35 nelse administreres i avhenger av naturen til den tilstand som behandles, graden av malignt lymfom eller av leukemi og om antistoffmolekylet anvendes profylaktisk eller for å behandle en eksisterende tilstand.

16

Hyppigheten av dosen vil avhenge av antistoffmolekylets halveringstid og av varigheten av dets effekt. Dersom antistoffmolekylet har en kort halveringstid (f.eks. 2 til 10 timer) 5 kan det være nødvendig å gi en eller flere doser per døgn.

Dersom antistoffmolekylet har en lang halveringstid (f.eks. 2 til 15 døgn) kan det alternativt kun være nødvendig å gi en dosering en gang per døgn, en gang per uke eller til og med en gang hver 1 eller 2 måneder.

10

Et farmasøytisk preparat kan også inneholde en farmasøytisk aksepterbar bærer for administrering av antistoffet. Bæreren bør ikke selv indusere fremstillingen av antistoffer som er skadelige for individets mottakelse av preparatet og bør ikke 15 være toksisk. Passende bærere kan være store, sakte metaboliserte makromolekyler, slike som proteiner, polypeptider, liposomer, polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyrekopolymerer og inaktive viruspartikler.

20

Farmasøytisk aksepterbare salter kan anvendes, f.eks. salter av mineralsyrer, slik som hydroklorider, hydrobromider, fosfater og sulfater, eller salter av organiske syrer som acetater, propionater, malonater og benzoater.

25

Farmasøytisk aksepterbare bærere i terapeutiske preparater kan i tillegg inneholde væsker slik som vann, saltvann, glyserol og etanol. I tillegg kan hjelpesubstanser slik som fuktemidler eller emulgeringsmidler eller pH buffersubstanser 30 være tilstede i slike preparater. Slike bærere gjør at de farmasøytiske preparater kan formuleres til tabletter, piller, drasjéer, kapsler, væsker, geler, siruper, slurrier og suspensjoner, for pasientinntak.

35 Foretrukne former for administrering inkluderer former som er egnet for parenteral administrering, f.eks. ved injeksjon eller infusjon, f.eks. ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Der hvor produktet er for injeksjon eller infusjon

17

kan det være i form av en suspensjon, oppløsning eller emulsjon i en oljeaktig eller vandig vehikkel og det kan inneholde formuleringsmidler slik som suspensjonsmidler, preserveringsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergerings-5 midler. Alternativt kan antistoffmolekylet være i tørr form for rekonstituering før bruk med en passende steril væske.

Etter formulering kan preparatene ifølge oppfinnelsen administreres direkte til individet. Individene som skal behandles 10 kan være dyr. Det er imidlertid foretrukket at preparatene er tilpasset for administrering til humane individer.

De farmasøytiske preparater ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres ved hjelp av en rekke ruter som in-15 kluderer, men som ikke er begrenset til, oral, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intramedulær, intratekal, intraventrikulær, transdermal, transkutan (f.eks. se WO98/ 20734), subkutan, intraperitoneal, intranasal, interal, topisk, sublingval, intravaginal eller rektal. Hyposprayer 20 kan også anvendes for å administrere de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen. De terapeutiske preparater kan typisk fremstilles som injiserbare preparater, enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner. Faste former som er egnet for oppløsning i, eller suspensjon i, flytende

25 vehikler før injeksjon, kan også fremstilles.

Direkte avlevering av preparatene vil generelt gjennomføres ved injeksjon, subkutant, intraperitonalt, intravenøst eller intramuskulært, eller ved avlevering til det interstitielle 30 rom av et vev. Preparatene kan også administreres inn i en lesjon. Doseringsbehandling kan være en enkeltdose-plan eller en multippel-dose-plan.

Det vil forstås at den aktive bestanddel i preparatet vil 35 være et antistoffmolekyl. Det vil som sådan være tilbøyelig til nedbrytning i gastrointestinalkanalen. Dersom preparatet skal administreres ved en rute hvor man anvender gastrointestinalkanalen, vil det således være nødvendig at preparatet

18

inneholder midler som beskytter antistoffet mot nedbrytning men som frigjør antistoffet når det er blitt absorbert fra gastrointestinalkanalen.

5 En inngående omtale av farmasøytisk aksepterbare bærere er tilgjengelig i Reminton's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Man forestiller seg også at antistoffet ifølge den forelig-10 gende oppfinnelse kan administreres ved anvendelse av genterapi. For å oppnå dette, blir DNA-sekvenser som koder for de tunge og lette kjeder til antistoffmolekylet under kontrollen av passende DNA-komponenter innført i en pasient slik at antistoffkjedene uttrykkes fra DNA-sekvensene og samles in 15 situ.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffmolekylet ifølge oppfinnelsen for anvendelse i behandling av sykdommer som er mediert ved hjelp av celler som uttrykker 20 CD22.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom som 25 er mediert ved hjelp av celler som uttrykker CD22.

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en hvilken som helst terapi hvor det er ønskelig å redusere nivået av celler som uttrykker CD22 som er tilstede 30 i et menneske eller dyr. Disse CD22-uttrykkende celler kan sirkuleres i kroppen eller de kan være tilstede i et uønsket høyt nivå som er lokalisert på et spesielt sted i kroppen. Økte nivåer av celler som uttrykker CD22 vil f.eks. være tilstede i B-celle lymfomer og leukemier. Antistoffmolekylet 35 ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes i terapi av sykdommer som er mediert ved hjelp av celler som uttrykker CD22.

19

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes foretrukket for behandling av maligne lymfomer og leukemier, mest foretrukket NHL.

5 Det er også beskrevet en metode for å behandle mennesker eller dyr som lider av eller som har en risiko for en lidelse som er mediert ved hjelp av celler som uttrykker CD22, idet metoden omfatter at det til individet administreres en effektiv mengde av antistoffmolekylet ifølge den foreliggende 10 oppfinnelse.

Antistoffmolekylet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ved diagnose, f.eks. ved in vivo diagnoser og avbildning av sykdomstilstander som involverer celler som ut-15 trykker CD22.

Den foreliggende oppfinnelse skal videre beskrives, kun i illustrerende hensikt, ved hjelp av de etterfølgende eksempler, som refererer til de vedlagte tegninger, hvori:

20

Figur 1 viser aminosekvensen til CDR'ene til mus monoklonalt antistoff 5/44 (SEQ ID NO:1 til 6);

Figur 2 viser den komplette sekvens av lettkjedens variable domene til mus monoklonalt antistoff 5/44;

25 Figur 3 viser den komplette sekvens av tungkjedens variable domene til mus monoklonalt antistoff 5/44;

Figur 4 viser strategien for fjerning av glykosyleringssetet og reaktivt lysin i CDR-H2;

Figur 5 viser pode-designen for 5/44 lett kjede sekvensen; 30 Figur 6 viser pode-designen for 5/44 tung kjede sekvensen;

Figur 7 viser vektorene pMRR14 og pMRR10.1;

Figur 8 viser Biacore-analyseresultater for de kimære 5/44 mutantene;

Figur 9 viser oligonukleotidene for 5/44 gH1 og gL1 gen-35 sammenstillinger;

Figur 10 viser de mellomliggende vektorer pCR2.1(544gH1) og pCR2.1(544gL1);

20

Figur 11 viser oligonukleotidkassettene som anvendes for å danne ytterligere podinger;

Figur 12 viser konkurranseanalysen mellom fluorescens-merket mus 5/44 antistoff og podede varianter; og

5 Figur 13 viser fullstendig DNA og protein-sekvens for de podede tunge og lette kjeder.

Eksempel 1: Dannelse av kandidatantistoffer

10 Et panel av antistoffer mot CD22 ble valgt fra hybridomer ved å anvende de etterfølgende seleksjonskriterier: binding til Daudi-celler, internalisering på Daudi-celler, binding til mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), internalisering på PBMC, affinitet (større enn 10<-9>M), mus M1 og produksjons-15 rate. 5/44 ble valgt som det foretrukne antistoff.

Eksempel 2:Genkloning og ekspresjon av et kimært 5/44

antistoffmolekyl

20 Fremstilling av 5/44 hybridomceller og RNA fremstilling derfra

Hybridom 5/44 ble dannet ved konvensjonell hybridomteknologi etter immunisering av mus med humant CD22 protein. RNA ble fremstilt fra 5/44 hybridomceller ved å anvende et RNEasy kit 25 (Qiagen, Crawley, UK; Katalog nr. 74106). Det oppnådde RNA ble revers transkribert til cDNA, som beskrevet under.

Fordeling av CD22 på NHL-tumorer

Et immunohistokjemi-studie ble gjennomført for å undersøke 30 forekomsten og fordelingen av farging ved å anvende 5/44 anti-CD22 monoklonale antistoffer. Kontroll anti-CD20 og anti-CD79a antistoffer var inkludert i studiet for å bekrefte B-celle områder av tumorer.

35 Totalt 50 tumorer ble studert og disse ble kategorisert som følger ved å anvende the Working Formulation og REAL klassifiseringssystemene:

!7 B lymfoblastisk leukemi/lymfom (høy/I)

21

!4 B-CLL/lite lymfocyttisk lymfom (lav/A)

!3 lymfoplasmacytoid/immunocytom (lav/A)

!1 mantelcelle (Int/F)

!14 follikel senter lymfom (lav til Int/D)

5 !13 diffus storcellelymfom (Int til høy/G,H)

!6 uklassifiserbar (K)

!2 T-celle lymfomer

40 B-celle lymfomer var positive for CD22 antigen med 5/44 10 antistoffet i 0,1 Tg/ml og ytterligere 6 ble positive når konsentrasjonen ble økt til 0,5 Tg/ml. For de gjenværende 2 B-celle tumorer som var negative ved 0,1 Tg/ml, var der utilstrekkelig vev tilbake for å teste ved den høyere konsentrasjon. Parallell testing med et annet Celltech anti-CD22 15 antistoff 6/13, som ga sterkere farging enn 5/44, resulterte imidlertid i at alle 48 B-celle lymfomer farget positivt for CD22.

Det er således mulig å konkludere med at CD22 antigenet er 20 omfattende uttrykt på B-celle lymfomer og tilveiebringer således et passende target for immunoterapi i NHL.

PCR-kloning av 5/44 VHog VL

cDNA-sekvenser som koder for de variable domenene av 5/44 25 tunge og lette kjeder ble syntetisert ved å anvende revers transskriptase for å produsere enkelttrådede cDNA-kopier av mRNA tilstede i det totale RNA. Dette ble deretter anvendt som templatet for amplifikasjon av de murine V-region sekvensene ved å anvende spesifikke oligonukleotidprimere ved 30 hjelp av polymerasekjede reaksjon (PCR).

a)cDNA-syntese

cDNA ble syntetisert i et 20 Tl reaksjonsvolum inneholdende de etterfølgende reagenser: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 35 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 20 enheter RNAsin, 75 ng random heksanukleotidprimer, 2 Tg 5/44 RNA og 200 enheter Moloney Murine Leukemia Virus revers transkriptase. Etter inkubasjon ved

22

42<o>C i 60 minutter ble reaksjonen terminert ved oppvarming ved 95<o>C i 5 minutter.

b)PCR

5 Prøver av cDNA ble underkastet PCR ved å anvende kombinasjoner av primere som er spesifikke for de tunge og lette kjeder. Degenererte primer-pooler designet til å anneale med de konserverte sekvenser av signalpeptidet ble anvendt som fremover primere. Disse sekvenser inneholder alle, i rekkefølge, et 10 restriksjonssete (VLSfuI; VHHindIII) som starter 7 nukleotider fra deres 5' ender, sekvensen GCCGCCACC (SEQ ID NO:50), for å tillate optimal translasjon av de resulterende mRNA'er, et initieringskodon og 20-30 nukleotider basert på lederpeptidsekvensene til kjente museantistoffer (Kabat et al., 15 Sequences of proteins of immunological interest, 5<th>Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).

3' primerne er designet til å strekke seg over ramme 4 J-C 20 koblingen av antistoffet og inneholder et restriksjonssete for enzymet BsiWI for å forenkle kloning av VLPCR fragmentet. Tung kjede 3' primerne er en blanding som er designet til å strekke seg over J-C koblingen av antistoffet. 3' primeren inkluderer et ApaI restriksjonssete for å forenkle 25 kloning. 3' regionen av primerne inneholder en blandet sekvens basert på dem funnet i kjente museantistoffer (Kabat et al., 1991, supra).

Kombinasjonene av primere som beskrevet over muliggjør at PCR 30 produktene for VHog VLkan klones direkte inn i en passende ekspresjonsvektor (se under) for å danne kimære (mus-human) tunge og lette kjeder og muliggjør at disse gener kan uttrykkes i pattedyrceller for å produsere kimære antistoffer av den ønskede isotypen.

35

Inkubasjoner (100 Tl) for PCR ble satt opp som følger. Hver reaksjon inneholdt 10 mM TrisHCl pH 8,3, 1,5 mm MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% vekt/volum gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribo

23

nukleosidtrifosfat, 10 pmol 5' primerblanding, 10 pmol 3' primer, 1 Tl cDNA og 1 enhet Taq polymerase. Reaksjonene ble inkubert ved 95<o>C i 5 minutter og deretter cyklisert gjennom 94<o>C i 1 minutt, 55<o>C i 1 minutt og 72<o>C i 1 minutt. Etter 30 5 cykluser ble prøver av hver reaksjon analysert ved hjelp av elektroforese på en agarosegel.

For tung kjede V-regionen, ble et amplifisert DNA-produkt kun oppnådd når en primer-pool som annealer innen starten av ram-10 me I erstattet signalpeptid-primerpoolen. Fragmentene ble klonet inn i DNA-sekvenseringsvektorer. DNA-sekvensen ble bestemt og translatert til å gi en utledet aminosyresekvens. Denne utledede sekvens ble verifisert ved referanse til N-terminal protein-sekvensen bestemt eksperimentelt. Figurer 2 15 og 4 viser DNA/protein-sekvensen til henholdsvis de modne lett og tung kjede V-regioner av mus monoklonalt 5/44.

c)Molekylær kloning av PCR-fragmentene

De murine v-region sekvensene ble deretter klonet inn i eks-20 presjonsvektorene pMRR10.1 og pMRR14 (figur 7). Disse er vektorer for ekspresjonen av henholdsvis lett og tung kjede inneholdende DNA som koder for konstante regioner av human kappa lett kjede og human gamma-4 tung kjede. VLregionen ble sub-klonet inn i ekspresjonsvektoren ved restriksjons-25 kutting og ligering fra sekvenseringsvektoren, ved å anvende SfuI og BsiWI restriksjonsseter, med dannelse av plasmid pMRR10(544cL). Tung kjede DNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av en 5' primer for å introdusere et signalpeptid, da dette ikke ble oppnådd ved kloningsstrategien, ble en mus 30 tung kjede antistoff-leder fra et forskjellig "in-house" hybridom (betegnet 162) benyttet. 5' primeren hadde den etterfølgende sekvens:

Den reverse primer var identisk med den som anvendes i den 35 opprinnelige VHgen kloningen. Det resulterende PCR produkt

24

ble kuttet med enzymer HindIII og ApaI, ble sub-klonet og dets DNA-sekvens ble bekreftet, med dannelse av plasmid pMRR14(544cH). Transient ko-transfeksjon av begge ekspresjonsvektorer inn i CHO-celler dannet kimært c5/44 antistoff.

5 Dette ble oppnådd ved å anvende Lipofectamin-reagenset i henhold til produsentens protokoller (In Vitrogen: Life Technology, Groningen, The Netherlands. Katalog nr. 11668/ 027).

10 Fjerning av glykosyleringssete og reaktivt lysin

En potensiell N-koblet glykosyleringssetesekvens ble observert i CDR-H2, med aminosyresekvensen N-Y-T (figur 3). SDS-PAGE, Western blotting og karbohydratfarging av geler av 5/44 og dets fragmenter (inkluderende Fab) indikerte at dette 15 setet faktisk var glykosylert (ikke vist). I tillegg ble en lysinrest observert i en eksponert posisjon innen CDR-H2, som hadde potensiale til å redusere bindingsaffiniteten av antistoffet ved å tilveiebringe et ytterligere sete for konjugering med et middel hvormed antistoffet kan konjugeres.

20

En PCR strategi ble anvendt for å introdusere aminosyresubstitusjoner inn i CDR-H2 sekvensen i et forsøk på å fjerne glykosyleringssetet og/eller det reaktive lysin, som vist i figur 4. Fremover-primere som koder for mutasjonene N55Q, 25 T57A eller T57V ble anvendt for å fjerne glykosyleringssetet (figur 4) og en fjerde fremover-primer inneholdende substitusjonen K60R, ble dannet for å fjerne den reaktive lysinrest (figur 4). En ramme 4 revers primer ble anvendt i hver av disse PCR amplifikasjoner. PCR produktene ble kuttet med 30 enzymene XbaI og ApaI og ble innført i pMRR14(544cH) (også kuttet med XbaI og ApaI) for å danne ekspresjonsplasmider som koder for disse mutanter. N55Q, T57A og T57V mutasjonene fjerner glykosyleringssetet ved å forandre aminosyresekvensen bort fra konsensus N-X-T/S mens K60R mutasjonen erstatter det 35 eventuelt reaktive lysin med den tilsvarende positivt ladede rest arginin. De resulterende cH variantplasmidene ble kotransfektert med cL plasmidet for å danne uttrykte kimære antistoffvarianter.

25

Evaluering av aktiviteter av kimære gener

Aktivitene av de kimære genene ble evaluert etter transient transfeksjon inn i CHO-celler.

5

c)Bestemmelse av affinitetskonstanter ved BiaCore analyse Affiniteten til kimær 5/44 eller dets varianter, som har fått deres glykosyleringssete eller deres reaktive lysin fjernet, ble undersøkt ved å anvende BIA teknologi for binding til 10 CD22-mFc konstrukter. Resultatene er vist i figur 8. Alle bindingsmålinger ble utført i BIAcore 200 instrumentet (Pharmacia Biosensor AB. Uppsala, Sweden). Analysen ble utført ved fanging av CD22mFc via det immobiliserte anti-mus Fc. Antistoffet var i den oppløselige fasen. Prøver,

15 standard og kontroller (50 Tl) ble injiserte over immobilisert anti-mus Fc etterfulgt av antistoff i den oppløselige fase. Etter hver cyklus ble overflaten regenerert med 50 Tl 40 mM HCl ved 30 Tl/min. Kinetikkanalyser ble utført ved å anvende BIAevaluation 3.1 software (Pharmacia).

20

Fjerning av glykosyleringssetet i konstrukt T57A resulterte i en noe raskere "on-rate" og en signifikant sakte "off-rate" sammenlignet med det kimære 5/44, som gir en affinitetsforbedring på omtrent 5-ganger. N55Q mutasjonen hadde ingen 25 effekt på affinitet. Dette resultat var uventet da det foreslår at fjerningen av selve karbohydratet tilsynelatende har ingen effekt på binding (som med N55Q forandringen). Den forbedrede affinitet ble kun observert med T57A forandringen. En mulig forklaring er at, uavhengig av tilstedeværelsen av 30 karbohydrat, utviser treoninet i posisjon 57 en negativ effekt på binding som er fjernet ved omdannelsen av treonin til alanin. Hypotesen om at den lille størrelsen til alanin er viktig, og at den negative effekt av treonin er relatert til dens størrelse, er understøttet ut fra resultatet oppnådd 35 ved å anvende T57V mutasjonen: at erstatning med valin i posisjon 57 ikke er fordelaktig (resultater ikke vist).

26

Fjerning av lysinet ved K60R mutasjonen hadde en nøytral effekt på affinitet, dvs. at introduksjon av arginin fjerner et potensielt reaktivt sete uten å kompromittere affinitet.

5 Mutasjoner for fjerning av glykosyleringssetet og for fjerning av det reaktive lysin ble derfor begge inkludert i humaniserings-designen.

Eksempel 2: CDR-poding av 5/44

10 Den molekylære kloning av gener for de variable regioner av de tunge og lette kjeder til 5/44 antistoffet og deres anvendelse for å produsere kimære (mus/human) 5/44 antistoffer er blitt beskrevet over. Nukleotidet og aminosyresekvensene til mus 5/44 VLog VHdomenene er vist i henholdsvis figurer 15 2 og 3 (SEQ ID NO:7 og 8). Dette eksempel beskriver CDR-poding av 5/44 antistoffet på humane rammer for å redusere potensiell immunogenitet i mennesker, i henhold til metoden til Adair et al., (WO91/09967).

20 CDR-poding av 5/44 lett kjede

Protein-sekvens-oppstilling med konsensussekvenser fra human sub-gruppe I kappa lett kjede V region indikerte 64% sekvensidentitet. Følgelig, for å konstruere den CDR-podede lette kjede, korresponderer de valgte akseptor-rammeregionene til 25 dem av den humane VK-sub-gruppe I "germline" O12,DPK9 sekvensen. Ramme 4 akseptor-sekvensen ble avledet fra den humane J-region "germline" sekvensen JK1.

En sammenligning av aminosyresekvensene til rammeregionene av 30 murint 5/44 og akseptor-sekvensen er gitt i figur 5 og viser at der er 27 forskjeller mellom donor- og akseptor-kjedene. I hver posisjon, ble en analyse gjennomført av den murine restens potensiale til å bidra til antigenbinding, enten direkte eller indirekte, gjennom effekter på pakking eller i 35 VH/VLgrenseflaten. Dersom en murin rest ble betraktet som viktig og tilstrekkelig forskjellig fra den humane rest når det gjelder størrelse, polaritet eller ladning, da ble denne murine rest bibeholdt. Basert på denne analyse, ble to ver

27

sjoner av den CDR-podede lette kjeden, med sekvensene gitt i SEQ ID NO:19 og SEQ ID NO:20 (figur 5), konstruert.

CDR-poding av 5/44 tung kjede

5 CDR-poding av 5/44 tung kjede ble gjennomført ved å anvende den samme strategi som beskrevet for den lette kjeden. V-domenet av 5/44 tung kjede ble funnet til å være homologt med humane tunge kjeder som tilhører sub-gruppe I (70% sekvensidentitet) og derfor ble sekvensen av den humane sub-gruppe I 10 "germline" ramme VH1-3,DP7 anvendt som en akseptor-ramme. Ramme 4 akseptor-sekvensene ble avledet fra human J-region "germline" sekvens JH4.

En sammenligning av 5/44 tung kjede med rammeregionene er 15 vist i figur 6 hvor det kan ses at den 5/44 tunge kjeden avviker fra akseptor-sekvensen i 22 posisjoner. Analyse av bidraget som hvilket som helst av disse vil kunne gi til antigenbinding førte til at det ble konstruert 5 versjoner av de CDR-podede tunge kjeder, som har sekvensene gitt i SEQ ID NO: 20 23 og SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, og SEQ ID NO:

27 (figur 6).

Konstruksjon av gener for podede sekvenser

Gener ble designet for å kode for de podede sekvenser gH1 og 25 gL1, og en serie av overlappende oligonukleotider ble designet og konstruert (figur 9). En PCR sammenstillingsteknikk ble benyttet for å konstruere CDR-podet V-region genene. Reaksjonsvolumer på 100 Tl ble satt opp inneholdende 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,001%

30 gelatin, 0,25 mM av hvert deoksyribonukleosidtrifosfat, 1 pmol av hver av de "interne" primere (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmol av hver av de "eksterne" primere (F1, R1), og 1 enhet Taq polymerase (AmpliTaq, Applied BioSystems, katalog nr. N808-0171). PCR cyklusparametere var 94<o>C i 1 minutt,<o>35 55<o>C i 1 minutt og 72 C i 1 minutt, i 30 cykluser.

Reaksjonsproduktene ble deretter kjørt på en 1,5% agarosegel, skåret ut og utvunnet ved å anvende QIAGEN spinn-kolonner (QIAquick gel ekstraksjonskit, kat. nr. 28706). DNA ble

28

eluert i et volum på 30 Tl. Prøver (1 Tl) av gH1 og gL1 DNA ble deretter klonet inn i InVitrogen TOPO TA kloningsvektoren pCR2.1 TOPO (katalog nr. K4500-01) i henhold til produsentens instruksjoner. Denne ikke-ekspresjonsvektoren tjente som et 5 klonings-mellomprodukt for å forenkle sekvensering av et større antall kloner. DNA-sekvensering ved å anvende vektorspesifikke primere ble anvendt for å identifisere korrekte kloner inneholdende gH1 og gL1, med dannelse av plasmider pCR2.1 (544gH1) og pCR2.1(544gL1) (figur 10).

10

En oligonukleotid-kassett erstatningsmetode ble anvendt for å danne de humaniserte podinger gH4,5,6 og 7 og gL2. Figur 11 viser designen av oligonukleotidkassettene. For å konstruere hver variant, ble vektoren (pCR2.1(544gH1) eller

15 pCR2.1(544gL1)) kuttet med restriksjonsenzymene som vist (XmaI/SacII for den tunge kjeden, XmaI/BstEII for den lette kjeden). Det store vektorfragmentet ble gelrenset fra agarose og ble anvendt i ligering med oligonukleotidkassetten. Disse kassetter er sammensatt av 2 komplementære oligo-20 nukleotider (vist i figur 11), blandet i en konsentrasjon på 0,5 pmol/Tl i et volum på 200 Tl 112,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioerytritol. Annealing ble oppnådd ved oppvarming til 95<o>C i 3 minutter i et vannbad (volum 500 ml) hvorpå reaksjonen fikk avkjøle seg sakte til 25 romtemperatur. Den annealede oligonukletidkassetten ble deretter fortynnet ti-ganger i vann før ligering inn i den passende kuttede vektor. DNA-sekvensering ble anvendt for å bekrefte den korrekte sekvens, med dannelse av plasmider pCR2.1 (5/44-gH4-7) og pCR2.1(5/44-gL2). De verifiserte podede se-30 kvenser ble deretter sub-klonet inn i ekspresjonsvektorene pMRR14 (tung kjede) og pMR10.1 (lett kjede).

CD22 bindingsaktivitet av CDR-podede sekvenser

Vektorene som koder for de podede varianter ble ko-transfek-35 tert inn i CHO-celler i en rekke kombinasjoner, sammen med de opprinnelige kimære antistoffkjeder. Bindingsaktivitet ble sammenlignet i en konkurranseanalyse, idet bindingen av det opprinnelige mus 5/44 antistoff konkurrerer om binding til

29

Ramos-celler (oppnådd fra ATCC, Burkitts lymfom lymfoblast human cellelinje som uttrykker overflate CD22). Denne analyse ble betraktet som den beste måte til å sammenligne podinger for deres evne til å binde til celleoverflate CD22.

5 Resultatene er vist i figur 8. Som det fremgår, er der svært liten forskjell mellom hvilken som helst av podingene, idet alle opptrer mere effektivt enn kimæren ved konkurranse mot den murine moderen. Introduksjonen av de 3 ytterligere humane rester på slutten av CDR-H3 (gH5 og gH7) synes ikke å 10 ha påvirket binding.

Podekombinasjonen med det minste antall murine rester ble valgt, gL1gH7. Lett kjede podingen gL1 har 6 donorrester. Rester V2, V4, L37 og Q45 er potensielle viktige pakkerester.

15 Rest H38 er i VH/VLgrenseflaten. Rest D60 er en overflaterest nær CDR-L2 og kan bidra direkte til antigenbinding. Av disse rester, er V2, L37, Q45 og D60 funnet i "germline" sekvenser til humane kappa-gener fra andre sub-grupper. Tung kjede podingen gH7 har 4 donorrammerester (rest R28 betraktes 20 til å være del av CDR-H1 under den strukturelle definisjon anvendt i CDR-poding (se Adair et al (1991 WO91/09967)).

Rester E1 og A71 er overflaterester nær CDR'ene. Rest I48 er en potensiell pakkerest. Rest T93 er tilstede i VH/VLgrenseflaten. Av disse rester, er E1 og A71 funnet i andre 25 "germline" gener av human sub-gruppe I. Rest I48 er funnet i human "germline" sub-gruppe 4, og T73 er funnet i human "germline" sub-gruppe 3.

Det fullstendige DNA- og protein-sekvensen av både den lette 30 kjeden og tunge kjeden, inkluderende omtrentlig posisjon av introner innen konstant region genene tilveiebrakt ved vektorene, er vist i figur 13 og er gitt i henholdsvis SEQ ID NO:29 og SEQ ID NO:28 for den lette kjeden og henholdsvis SEQ ID NO:31 og SEQ ID NO:30 for den tunge kjeden.

35

DNA som koder for disse lett og tung kjede genene ble skåret ut fra disse vektorer. Tung kjede DNA ble kuttet i 5' HindIII setet, deretter behandlet med Klenow-fragmentet til

30

E. coli DNA polymerase I for å danne en 5' buttende. Kutting av 3' EcoRI setet resulterte i tung kjede fragmentet som ble renset fra agarosegeler. På samme måte, ble lett kjede fragmentet produsert, gjort buttendet i 5' SfuI setet og med 5 et 3' EcoRI sete. Begge fragmenter ble klonet inn i DHFR baserte ekspresjonsvektorer og anvendt for å danne stabile cellelinjer i CHO-celler.

Claims

insufficientOCRQuality for page 33 insufficientOCRQuality for page 34 insufficientOCRQuality for page 35 insufficientOCRQuality for page 36 insufficientOCRQuality for page 37