MXPA04010787A - Productos biologicos. - Google Patents

Productos biologicos.

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MXPA04010787A
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antibody
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Abstract

Se describen las moleculas de anticuerpo que contiene al menos una CDR derivada de un anticuerpo monoclonal de raton que tiene especificidad para CD22 humano. Se describe tambien un anticuerpo injertado con CDR, en donde al menos una de las CDRs es una CDR modificada. Se describen ademas las secuencias de ADN que codifican para las cadenas de las moleculas de anticuerpo, los vectores, las celulas hospederas transformadas y los usos de las moleculas de anticuerpo en el tratamiento de las enfermedades mediadas por las celulas que expresan CD22.

Description

PRODUCTOS BIOLOGICOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para determinantes antigénicos del antígeno de linfocitos B, CD22. La presente invención también se refiere a los usos terapéuticos de la molécula de anticuerpo y a los métodos de producción de la molécula de anticuerpo. En una molécula de anticuerpo natural,' existen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. . Cada cadena pesada y cada cadena ligera tiene su extremo N-terminal y un dominio variable . Cada dominio variable está compuesto de cuatro regiones estructurales (F s por sus siglas en inglés) que alternan con tres regiones de determinación de la complernentariedad (CDRs - por- - sus siglas · en -inglés) .— -Los residuos en los dominios variables son convencionales numerados de acuerdo a un sistema considerado por Kabat et al. Este sistema es descrito en Kabat et al, 1987 , en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EUA (de aquí en adelante "Kabat et al (supra)") . El sistema de numeración es utilizado en la presente especificación excepto donde se indica de otro modo. La designaciones de residuos de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los Ref.: 159843 residuos de aminoácidos. La secuencia efectiva lineal de aminoácidos puede contener menos o más aminoácidos que en la numeración estricta de Kabat, correspondiente a un acortamiento de, o inserción dentro de, un componente estructural, ya sea el esqueleto o COR, de la estructura del dominio variable básica. La numeración correcta de Kabat de los residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado por alineamiento de los residuos y homología en la secuencia del anticuerpo, con una secuencia numerada de Kabat "estándar" . Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1) , los residuos 50-65 (CDR-H2) y los residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo a la numeración de Kabat. Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada están . localizadas - en -los - residuos- 24 34· (CDR.-L1) , ---Ios-residuos 50-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo a la numeración de Kabat. . La construcción de los anticuerpos injertados con CDR es descrita en la Solicitud de Patente Europea EP-A-0239400, la cual describe un proceso en el cual las CDRs de un anticuerpo monoclonal de ratón son injertadas dentro de las regiones estructurales de los dominios variables de una inmunoglobulina humana mediante mutagénesis dirigida al sitio, utilizando oligonucleótidos largos. Las CDRs determinan la especificidad de enlace al antígeno de los anticuerpos, y son secuencias peptídicas relativamente cortas llevadas sobre las regiones estructurales de los dominios variables . El primer trabajo sobre la humanización de anticuerpos monoclonales mediante injerto de CDR, fue llevada a cabo sobre anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos sintéticos, tales como NP. No obstante, los ejemplos en los cuales un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la lisozima y un anticuerpo monoclonal de rata que reconoce un antígeno sobre las células T humanas, fueron humanizados por injerto de CDR han sido descritos por Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) y Riechmann et al. (Nature, 332 , 323-324, 1988) , respectivamente. Riechmann et al., encontraron . que la transferencia de - las CDRs - solas -(como—se define ^por-'-Kabat - (-Kabat - et— al -(supra) y u et al, J. Exp . Med. , 132 , 211-250, 1970)) no fue suficiente para proporcionar actividad satisfactoria de enlace al antígeno en el producto injertado con CDR. Se encontró que un número de residuos estructurales tiene que ser alterado de modo que estos corresponden a aquellos de la región estructural donadora. Los criterios propuestos para seleccionar cuáles residuos estructurales necesitan ser alterados, se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. O 90/07861.
Han sido publicadas un número de revisiones que discuten los anticuerpos injertados con CDR, incluyendo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Los linfornas malignos son un grupo diverso de neoplasmas. La mayoría de los casos ocurren en gente anciana. El linforna no Hodgkins (NHL) es una enfermedad que actualmente afecta de 200,000 a 250,000 pacientes en los i Estados Unidos. Es el segundo cáncer de más rápida elevación en los Estados Unidos, elevándose a una tasa de aproximadamente 55,000 nuevos casos por año. La incidencia se está elevando a una tasa que es mayor que la que puede ser explicada simplemente por la edad cada vez mayor de la población y exposición a factores de riesgo conocidos. La clasificación del linforna es compleja, y ha evolucionado en décadas recientes. En 1994, se introdujo la - —clasificación . de. Linforna -Europeo-Americano Revisado - (REAL por- - sus siglas en inglés) . Esta clasificación organiza los linfornas de células B (los más frecuentemente identificados) , las células T y de origen no clasificable, en subtipos ordenados. En la práctica diaria, el agrupamiento de los NHLs en categorías de grado bajo, intermedio y alto con base en su apariencia histológica general, refleja ampliamente su comportamiento clínico. NHL afecta predominantemente los nodulos linfáticos pero, el individuo en pacientes individuales, el tumor puede involucrar otros sitios anatómicos tales como el hígado, el bazo, la médula ósea, el pulmón, el intestino y la piel. La enfermedad comúnmente se presenta como un agrandamiento sin dolor de los nodulos linfáticos. El linfoma extranodal más frecuentemente afecta el intestino, aunque ha sido documentado el linfoma primario virtualmente de cada órgano. Los síntomas sistémicos incluyen fiebre, sudoración, cansancio y pérdida de peso. Hasta fechas recientes, el sistema de clasificación de Ann Arbor, basado completamente en el grado anatómico de enfermedad era el determinante mayor de la térapia en NHL. Esta información puede ser refinada por la incorporación de señaladores de pronóstico adicionales, que incluye la edad, los niveles de lactato-deshidrogenasa en suero y en estado de funcionamiento. Incluso así, el conocimiento del "sistema de clasificación de Ann Arbor junto con el subtipo inmunológico e histológico., del .tumor, es -todavía—el— determinante mayor de tratamiento. NHL de grado bajo tiene un curso indolente, con una supervivencia media del paciente de 8 a 10 años. La supervivencia es poco impactada por la terapia actualmente disponible, aunque la irradiación de la enfermedad local y la quimioterapia para síntomas sistémicos mejora la calidad de vida de los pacientes. La quimioterapia en combinación puede ser reservada para la enfermedad transcurrida. La enfermedad intermedia y, especialmente, la enfermedad de grado alto, es extremadamente agresiva y tiende a diseminarse. La enfermedad de este grado requiere tratamiento urgente. La radioterapia puede ser un componente útil de tratamiento en pacientes con enfermedad muy voluminosa. Muchos diferentes regímenes de quimioterapia han sido empleados, y la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo puede ser obtenida en más de la mitad de los pacientes. La terapia de alta dosis con apoyo de células madre fue introducida inicialmente para pacientes con enfermedad en recaída o refractaria,' pero se está encontrando ahora cada vez más un lugar en la terapia de primera línea para pacientes con pobre riesgo de enfermedad. La tendencia en años recientes para un procedimiento terapéutico cada vez más agresivo, debe ser balanceada contra la edad en general más vieja y la debilidad relativa de muchos pacientes con NHL, y por la necesidad para desopesar la toxicidad del . _ tratamiento - al- - pronóstico individual de la enfermedad de cada paciente. Tratamientos mejorados, que son más efectivos y mejor tolerados, son necesarios. Los agentes introducidos recientemente incluyen nuevos fármacos citotóxicos, progresivamente incorporados en combinaciones, y la introducción de terapias basadas en anticuerpos. El Linfoma no Hodgkin abarca una gama de linfomas de células B. Los antígenos de células B representan por lo tanto objetivos adecuados para la terapia con anticuerpos.
CD22 es una glucoproteína membranal de 135 kDa que pertenece a una familia de proteínas que se enlazan al ácido siálico llamadas sialoadhesinas . Esta es detectada en el citoplasma tempranamente en el desarrollo de células B, aparece sobre la superficie celular simultáneamente con IgD, y es encontrada en la mayoría de las células B maduras. La expresión es incrementada después de la activación de las células B. CD22 se pierde con la diferenciación terminal, y se reporta en general que esté ausente en las células plasmáticas. De este modo, este antígeno de internalizacion está presente sobre la superficie de las células pre-B y las células B maduras, pero no las células madre o las células plasmáticas . Existen en el ser humano dos isoformas de CD22. La forma predominante (??22ß) contiene 7 dominios similares a_ int^noglobulina...(.similares . a~ Ig)- en -la región- extracélular : ~ La variante CD22a carece del dominio 4 similar a Ig, y puede tener un dominio citoplásmico truncado. Los anticuerpos que bloquean la adhesión de CD22 a los monocitos, neutrófilos, linfocitos y eritrocitos han mostrado que se enlazan dentro del primero o segundo dominios similar a Ig. El dominio citoplásmico de CD22 es la tirosina fosforilada después de la ligadura del receptor de antígeno de células B y se asocia con Lyk, Syk y la 3-cinasa de fosfatidil-inositol . La función de CD22 es submodular el umbral de activación de células B. Esta puede también mediar la adhesión celular a través de la interacción con células que poseen los sialoglucoconjugados apropiados. CD22 es expresada en la mayoría de las leucemias y linfomas de células B incluyendo NHL, leucemia linfoblástica aguda (B-ALL por sus siglas en inglés) , leucemia linfocítica crónica (B-CLL por sus siglas en inglés) , y especialmente leucemia no linfocítica aguda (ANLL por sus siglas en inglés) . Los anticuerpos monoclonales contra CD22 han sido descritos en la técnica anterior. El documento WO 98/41641 describe los anticuerpos anti-CD22 recombinantes con residuos de cisteína en VH44 y VL100. El documento WO 96/04925 describe las regiones de VH y VL del anticuerpo LL2 anti-CD22. La Patente de los Estados Unidos US 5686072 describe las "combinaciones de las inmunotoxinas _anti-jCD22-,y..anti-CD,19.- - El documento WO 98/42378 describe el uso de anticuerpos anti- CD22 desnudos para el tratamiento de malignidades de células B . Un número de terapéuticos basadas en anticuerpos han sido también recientemente licenciados, por ejemplo, Rituxan (un ?? humano quimérico, no marcado (región V de +myl) específica para CD20) , o están en pruebas clínicas para esta enfermedad. Estos confían ya sea en la muerte de las células B mediadas por el complemento o por ADCC, o el uso de radionúclidos , tales como 131I o 90Y, que tienen problemas asociados de preparación y uso para los clínicos y los pacientes. Existe una necesidad para una molécula de anticuerpo para tratar NHL, , que puede ser utilizado repetidamente y producida fácil y eficientemente. Existe también una necesidad para una molécula de anticuerpo, la cual tenga alta afinidad por CD22 y baja inmunogenicidad en humanos . En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, que comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una CDR (como se define por Kabat et al, (supra)), que tiene la secuencia dada como Hl en la Figura 1 (SEQ ID No. : 1) para CDR-H1, como H2 en la Figura 1 (SEQ ID No. : 2) o una H2 de la cual ha sido ¿-"emóvido un sitio potencial de gljacosilación,— O - -un -H2 -en el— cual el residuo de lisina en la posición 60 (de acuerdo al sistema de numeración de Kabat) ha sido reemplazado por un aminoácido alternativo, o H2 en el cual el sitio de glucosilación y la lisina reactiva en la posición 60 han sido removidas para CDR-H2 o como H3 en la Figura 1 (SEQ ID No. : 3) para CDR-H3. La molécula de anticuerpo del primer aspecto de la presente invención comprende al menos una CDR seleccionada de Hl, H2 y H3 (SEQ ID No.: 1; SEQ ID No.: 2 y SEQ ID No.: 3) para cada dominio variable de cadena pesada . Preferentemente, la cadena de anticuerpo comprende al menos dos y más preferentemente las tres CDRs en el dominio variable de cadena pesada. En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de anticuerpo que tiene una especificidad por CD22 humano, que comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una CDR (como se define por Kabat et al, (supra) ) que tiene la secuencia dada como Ll en la Figura 1 (SEQ ID No. : 4) para CDR-L1, L2 en la Figura 1 (SEQ ID No.: 5) para CDR-L2 ó L3 en la Figura 1 (SEQ ID No.: 6) para CDR-L3. La molécula de anticuerpo del segundo aspecto de la invención comprende al menos una CDR seleccionada de Ll , L2 y L3 (SEQ ID No.: 4; SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No.: 6) para el "'"dominio variable de_ cadena ^ligera. .: .Preferentemente,-- -la- molécula de anticuerpo comprende al menos dos y al menos más preferentemente al menos tres CDR en el dominio variable de cadena ligera. Las moléculas de anticuerpo del primero y segundo aspectos de la presente invención tienen preferentemente una cadena ligera complementaria o una cadena pesada complementaria, respectivamente. Preferentemente, la molécula de anticuerpo del primero o segundo aspecto de la presente invención comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una CDR (como se define por Kabat et al., (supra)) que tiene la secuencia dada como Hl en la Figura 1 (SEQ ID No. : 1) para CDR-H1, como H2 en la Figura 1 (SEQ ID No.: 2) o una H2 a 5 partir de la cual ha sido removido un sitio potencial de glucosilación, o una H2 en la cual el residuo de lisina en la posición 60 (de acuerdo al sistema de numeración de Kabat) ha sido reemplazado por un aminoácido alternativo, o una H2 en la cual el sitio de glucosilación o la lisina reactiva en la 0 posición 60 han sido removidas para CDR-H2 o como H3 en la Figura 1 (SEQ ID No.: 3) para CDR-H3 y una cadena ligera, en donde el dominio variable comprende una CDR (como se define por Kabat et al, (supra)) que tiene la secuencia dada como Ll en la Figura 1 (SEQ ID No. : 4) para CDR-L1, como L2 en la 5 Figura 1 (SEQ ID No. : 5) para CDR-L2 ó como L3 en la Figura 1 ~^SECTID~ No G: ' ) 'pa afcDR-L3_. Las CDRs dadas en las SEQ ID Nos. : 1 a 6 y en la Figura 1, a las que hace referencia anteriormente, son derivadas de un anticuerpo monoclonal 5/44 de ratón. 0 Las secuencias completas de los dominios variables del anticuerpo 5/44 de ratón se muestran en la Figura 2 (cadena ligera) (SEQ ID No.: 7) y la Figura 3 (cadena pesada (SEQ ID No. : 8) . Este anticuerpo de ratón es también denominado más adelante como "el anticuerpo donador" o el 5 "anticuerpo monoclonal murino" .
Una primera modalidad alternativamente preferida del primero y segundo aspectos de la presente invención, es el anticuerpo monoclonal de ratón 5/44. que tiene las secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada 5 mostradas en la Figura 2 (SEQ ID No. : 7) y la Figura 3 (SEQ ID No. : 8) respectivamente. La región constante de cadena ligera de 5/44 es kappa y la región constante de cadena pesada es IgGl . En una segunda - modalidad alternativamente 10 preferida, el anticuerpo de acuerdo al primero y segundo aspectos de la presente invención, es una molécula de anticuerpo quimérico ratón/humano, denominada en la presente , como la molécula de anticuerpo quimérico 5/44. La molécula de anticuerpo quimérico comprende los dominios variables del molécula de anticuerpo 5/44 quimérica comprende el dominio kappa C humano (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; Genebank acceso número J00241) en la cadena ligera y los 20 dominios gamma 4 humanos (Flanagan et al., Nature, 300, 709- 713, 1982) en la cadena pesada, opcionalmente con el residuo de serina en la posición 241 reemplazado por un residuo de prolina . Preferentemente, el anticuerpo de la presente 25 invención comprende una cadena pesada en donde el dominio variable que comprende como CDR-H2 (como se define por Kabat et al., (supra)) un H2 ' en el cual una secuencia potencial del sitio de glucosilación ha sido removida y que inesperadamente incrementó la afinidad del anticuerpo 5 quimérico 5/44 para el anticuerpo CD22, y que tiene preferentemente como CDR-H2 la secuencia dada como H2 ' (SEQ ID No. : 13) . Alternativa o adicionalmente , el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en 10 donde el dominio variable comprende como CDR-H2 (como se define por Kabat et al., (supra)) un H2" en el cual un residuo de lisina en la posición 60, que está localizado en una posición expuesta dentro de CDR-H2 y que se considera tiene el potencial para reaccionar con los agentes de 15 conjugación, dando como resultado una reducción de la "^"^" a"fiñidad' ' de ' enlace" ¾G " antígéño7 está sustituido por un aminoácido alternativo para dar como resultado una sustitución conservada. Preferentemente CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2" (SEQ ID No. : 15) . 20 Alternativa o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en donde el dominio variable comprende como CDR-H2 (como se define por Kabat et al., (supra)) un H2 ' " en el cual la secuencia potencial del sitio de glucosilación y el residuo 25 de lisina en la posición 60, están sustituidos por aminoácidos alternativos. Preferentemente, CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2 ' " (SEQ ID No. : 16). En una tercera modalidad alternativamente preferida, el anticuerpo de acuerdo al primero y segundo aspectos' de la presente invención es una molécula de anticuerpo injertada con CDR. El término "una molécula de anticuerpo injertada con CDR" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDRs (incluyendo, si se desea, una CDR modificada) proveniente de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertado dentro de una estructura de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo un anticuerpo humano) . Preferentemente, tal anticuerpo injertado con CDR tiene" ~ "dominio "~ variable que comprende las regiones estructurales aceptoras humanas, así como una o más CDRs donadoras referidas anteriormente. Cuando las CDRs son injertadas, cualquier secuencia estructural, de la región variable aceptora, apropiada, puede ser utilizada respetando la clase/tipo del anticuerpo donador del cual se derivan las CDRs incluyendo las regiones estructurales de ratón, primate y humano. Los ejemplos de estructuras humanas que pueden ser utilizadas en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y PONI (Kabat et al., (supra)) . Por ejemplo, KOL y NEWM pueden ser utilizadas para la cadena pesada, REI puede ser utilizada para la cadena ligera y, EU, LAY POM pueden ser utilizadas para la cadena pesada y la cadena ligera. Alternativamente, 5 pueden ser utilizadas secuencias humanas de lineal germinal. La región estructural preferida para la cadena ligera es la secuencia del subgrupo de línea germinal humana (DPK9 + JK1) mostrada en la Figura 5 (SEQ ID No. : 17) . La región estructural preferida para la cadena pesada es la secuencia 10 del subgrupo humano (DP7 + JH4) mostrada en la Figura 6 (SEQ ID No. : 21) . En un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, se prefiere utilizar como anticuerpo aceptor uno que tenga las cadenas que son homologas a las cadenas del 15 anticuerpo donador. Las cadenas pesada y ligera aceptoras no ~~ ~ "'necesa ia"mérít¾~néce"si'tañ ser derivadas del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones estructurales ' derivadas de diferentes cadenas. También, en un anticuerpo injertado con CDR de la 20 presente invención, las regiones estructurales no necesitan tener exactamente la misma secuencia que aquellas del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden ser cambiados a residuos que aparecen más frecuentemente para esa clase o tipo de cadena aceptora . 25 Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones estructurales aceptoras pueden ser cambiados de modo que éstos correspondan al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador y a un residuo que es una sustitución conservadora para el residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador. Tales cambios deben ser mantenidos al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donador. Un protocolo para seleccionar residuos en las regiones estructurales aceptoras que pueden necesitar ser cambiadas, se describe en WO 91/09967. Preferentemente, en una molécula de anticuerpo injertada con CDR de acuerdo a la presente invención, si la cadena ligera aceptora tiene la secuencia DPK9 + JK1 del subgrupo humano (mostrada en la Figura 2) (SEQ ID No.: 17) entonces las regiones estructurales aceptoras de la cadena ligera comprenden residuos donadores en las posiciones 2, 4, '377 ~'3'8 "45 "y "60 y pueden comprender adicionalmente un residuo donador en la posición 3 (de acuerdo a Kabat et al., (supra) ) . Preferentemente, en una molécula de anticuerpo injertada con CDR de la presente invención, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia DP7 + JH4 humana (mostrada en la Figura 3) (SEQ ID No.: 21), entonces las regiones estructurales aceptoras de la cadena pesada comprenden, además de una o más CDRs donadoras, residuos donadores en las posiciones 1, 28, 48, 71 y 93 y pueden comprender adicionalmente residuos donadores en las posiciones 67 y 69 (de acuerdo a Kabat et al., (supra) ) . Los residuos donadores son residuos provenientes del anticuerpo donador, por ejemplo el anticuerpo del cual fueron derivadas originalmente las CDRs . Preferentemente, el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada en donde el dominio variable como CDR-H2 (como se define por Kabat et al., (supra)) un H2 ' en el cual una secuencia del sitio de glucosilación potencial ha sido removida con el fin de incrementar la afinidad del anticuerpo 5/44 quimérico por el antígeno CD22, y que tiene preferentemente como CDR-H2 la secuencia dada como H2 ' (SEQ ID No.: 13) . Alternativa o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en ¾óndé~ "éí~~dóminio 'variable como "CDR-H2 (cómo se define por Kabat et al . , (supra) ) una H2" en la cual un residuo de lisina en la posición.60, que está localizado en una posición expuesta dentro de CDR-H2, y que se considera tiene el potencial para reaccionar con los agentes de conjugación que dan como resultado una reducción de la afinidad de enlace al antígeno, está sustituido por un aminoácido alternativo. Preferentemente, la CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2" (SEQ ID No. : 15) . Alternativa o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en donde el dominio variable como CDR-H2 (como se define por Kabat et al., (supra) ) una H2" en la cual la secuencia potencial del sitio de glucosilación y el residuo de lisina en la posición 60, están sustituidos por aminoácidos 5 alternativos. Preferentemente, la CDR-H2 tiene la secuencia dada cómo H2 ' " (SEQ ID No.: 16) . La molécula de anticuerpo de la presente invención puede comprender: una molécula de anticuerpo completo, que tiene las cadenas pesada y ligera de longitud completa; un 10 fragmento de las mismas; tal como Fab, Fab modificada, Fab' , F(ab' ) 2 o Fv; un monómero o dímero de cadena ligera o de cadena pesada; un anticuerpo de cadena simple, por ejemplo una Fv de cadena simple en la cual los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un ligador peptídico. 15 Similarmente, las regiones variables de cadena pesada y ¦~~lTg"elrá==rrpueden ser " combinadas" " '"con otros™ dominios de anticuerpo, como sea apropiado. La molécula de anticuerpo de la presente invención . puede tener un efector o una molécula reportera enlazada a 20 ésta. Por ejemplo, ésta puede tener un macrociclo, para quelar un átomo de metal pesado, o una toxina, tal como ricina, enlazada a ésta por una estructura de puente covalente . Alternativamente, pueden ser utilizados procedimientos de tecnología de ADN recombinante para 25 producir una molécula de anticuerpo en la cual el segmento Fe (dominios CH2 , CH3 y de bisagra), los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina completa ha (han) sido reemplazadas por, o tiene (tienen) enlazada a ésta por enlace peptídico, una proteína no inmunoglobulina funcional, tal como una enzima o molécula de toxina. La molécula de anticuerpo de la presente invención tiene preferentemente una afinidad de enlace de al menos 0.85 X 10"10 M, más preferentemente al menos 0.75 x 10"10 M y más preferentemente al menos 0.5 x 10~10 M. Preferentemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención comprende el dominio variable de cadena ligera 5/44 -gLl (SEQ ID No. : 19) y el dominio variable de cadena pesada 5/44-gH7 (SEQ ID No.: 27). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas ligeras y pesadas se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente. rr ¿'a" presenté"" invención también se refiere a las, variantes de la molécula de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada por CD22. Tales variantes pueden ser obtenidas por un número de protocolos de maduración de afinidad e incluyen la mutación de las CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254 , 392-403, 1995), entremezclado de cadenas (Marks et al, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras, de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol. 250 , 359-368, 1995), entremezclado de ADN (Pattern et al., Curr . Opin. Biotechnol . , 8, 724-733, 1977), representación visual de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256 , 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391 , 288-291, 1998) . Vaughan et al. (supra) discuten estos métodos de maduración por afinidad. 5 La presente invención también proporciona una secuencia de ADN que codifica para la o las cadenas pesada y/o ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención. Preferentemente, la secuencia de ADN codifica para 10 la cadena pesada o la cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender el ADN sintético, por ejemplo producido por procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier 15 combinación de los mismos. vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Preferentemente, el vector de clonación o de expresión comprende dos 20 secuencias de ADN, que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente. Los métodos generales mediante los cuales pueden ser construidos los vectores, los métodos de transfección y 25 los métodos de cultivo, son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocls in Molecular Biology" , 1999, F.M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience , Nueva York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing. Las secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención, pueden ser obtenidas mediante métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican para parte o todas las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, pueden ser sintetizadas como se desee a partir de las secuencias determinadas de ADN, o con base en la secuencias de aminoácidos correspondientes. El ADN que codifica para las secuencias estructurales aceptoras es ampliamente disponible para aquellos expertos en la técnica y puede ser fácilmente s intetfi'zada^ " con " " base""" ~en sus secuencias" conocidas de aminoácidos. -Las técnicas estándares de biología molecular pueden ser utilizadas para preparar secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de AD deseadas pueden ser sintetizadas completamente o en parte utilizando las técnicas de síntesis de oligonucleótidos . Pueden ser utilizadas las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y reacción en cadena de polimerasa (PCR) como sea apropiado.
Cualquier sistema adecuado de célula hospedera/vector puede ser utilizado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Pueden ser utilizados sistemas bacterianos, por ejemplo de E. coli y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de los fragmentos de anticuerpo tales como los fragmentos Fab y F(ab')2/ y especialmente los fragmentos Fv y los fragmentos de anticuerpos de cadena simple, por ejemplo, los Fvs de cadena simple. Pueden ser utilizados los sistemas de expresión de célula hospedera eucariótica, por ejemplo de mamífero, para la producción de moléculas de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas completas de anticuerpo. Las células hospederas de mamífero adecuadas incluyen CHO, células de mieloma o de hibridoma. - L"a~ presente" '"' invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención, que comprende el cultivo de una célula hospedera que contiene un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir del ADN que codifica para la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislando la molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo puede comprender únicamente un polipéptido de cadena pesada y ligera, en cuyo caso únicamente una secuencia de codificación del polipeptido de cadena pesada o de cadena ligera necesita ser utilizada para transfectar las células hospederas. Para la producción de productos que comprenden cadenas pesadas y ligeras, la 5 línea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica para un polipeptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica para un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un vector simple, incluyendo el vector las secuencias que 10 codifican para los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada . La presente invención también proporciona una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en 15 combinación con un excipiente, diluyente o portador - " ' " farmacéütíÍ^am¾ñTe~_aceptabÍ"é".'' La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende el mezclado de la molécula de 20 anticuerpo, de la presente invención junto con un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición terapéutica o de diagnóstico, o puede estar acompañada por otro ingrediente 25 activo incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo, los anticuerpos anti-células T( anti-IFNy o anti-LPS, ingredientes no anticuerpos tales como xantinas. Las composiciones farmacéuticas comprenden preferentemente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad y a un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la dosis terapéu icamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayos de cultivos de células o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal puede ser también utilizado para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Tal información puede se utilízada_entqnces _para. determinar- las dosis y rutas útiles para la administración en humanos. La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, de la edad, del peso y del género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones con medicamentos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del clínico. En general, una dosis efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferentemente 0.1 mg/kg a 20 mg/kg, más preferentemente aproximadamente 15 mg/kg. Las composiciones pueden ser administradas individualmente a un paciente o pueden ser administradas en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. La dosis a la cual se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención, depende de la naturaleza de la condición que se trate, el grado del linfoma o leucemia maligna, y si la molécula de anticuerpo está siendo utilizada profilácticamente o para tratar una condición existente. La frecuencia de dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. 51 la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por .ejemplo 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis ser únicamente necesario dar una dosis por día, una vez por semana o incluso una vez cada uno o dos meses. Una composición farmacéutica puede también contener un portador farmacéuticamente aceptable para la administración del anticuerpo. El portador debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos para el individuo que recibe la composición, y no debe ser tóxica. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas lentamente metabolizadas , grandes, tales como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. 5 Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizadas, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos, tales como los clorhidratos, bromhidratos , fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos . 10 Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas, pueden contener además líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol . Adicionalmente, pueden estar presentes en tales composiciones sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o 15 emulsificantes , o sustancias amortiguadoras del pH. Tales --•"—portadoreJ" haicen" posible "que las composiciones farmacéuticas^ sean, formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes y suspensiones 'para la ingestión por el paciente. Las formas preferidas de administración incluyen 20 las formas adecuadas para la administración parenteral , por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección de bolo o infusión continua. Donde el producto es para inyección o infusión, éste puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión, en un vehículo aceitoso o 25 acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes suspensores, conservadores, -estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en una forma anhidra, para la reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado. 5 Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales. No obstante, se prefiere que las composiciones sean adaptadas para la administración a sujetos humanos. 10 Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas mediante cualquier número de rutas incluyendo, pero no limitadas a, las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial , intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, ver el 15 documento WO 08/20734) , subcutánea, intraperitoneal, intranasal, ¦—^j-stjsrs.-.^•¦-•-enei^T^tópica', subiingual " añtrávagirial o rectal . Los porrocíos. pueden también ser utilizados para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como 20 soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas, adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección, pueden ser también preparadas. La distribución directa de las composiciones en general será lograda mediante inyección, subcutáneamente, 25 intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente , o administrada al espacio interticial de un tejido. Las composiciones pueden ser también administradas a una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis simples o un esquema de dosis múltiples. 5 Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, ésta será susceptible a la degradación en tracto gastrointestinal . De este modo, si la composición va a ser administrada por una ruta utilizando el tracto gastrointestinal, la composición 10 necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que éste ha sido absorbido desde el tracto gastrointestinal. Una discusión completa de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington' s 15 Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991) . presente invención será administrado mediante el uso de .terapia génica. Con el fin de lograr esto, las secuencias de i ADN que codifican para las cadenas pesada y ligera de la 20 molécula de anticuerpo, bajo el control de los componentes de ADN apropiados son introducidos dentro de un paciente tal que las cadenas de anticuerpos son expresadas a partir de las secuencias de ADN y ensambladas in situ. La presente invención también proporciona la 25 molécula de anticuerpo de la presente invención para el uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por células que expresan CD22. La presente invención proporciona además el uso de la molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención 5 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por células que expresan CD22. La molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser utilizada en cualquier terapia donde se desee reducir el nivel de -células que expresan CD22 que están 10 presentes en el cuerpo humano o animal. Estas células que expresan CD22 pueden estar en circulación en el cuerpo o estar presentes en un nivel indeseablemente alto localizadas en un sitio particular en el cuerpo. Por ejemplo, los niveles elevados de las células que expresan CD22 estarán 15 presentes en linfornas y leucemias de células B. La molécula -.. ---~de~antTcuerpo ' de "la "préseríte^invención puede ser utilizada.; en la terapia de enfermedades mediadas por células que expresan CD22. La molécula de anticuerpo de la presente invención 20 es preferentemente utilizada para el tratamiento de linfomas y leucemias malignas, más preferentemente NHL. La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que sufren de o están en riesgo de un desorden mediado por células que expresan 25 CD22, el método comprende administrarle al sujeto una cantidad efectiva de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser también utilizada en diagnóstico, por ejemplo, en el diagnóstico in vivo y en la formación de imagen de estados de enfermedad que involucran células que expresan CD22. La presente invención es además descrita a manera de ilustración únicamente en los siguientes ejemplos que se refieren a las Figuras anexas, en las cuales: La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las CDRs del anticuerpo monoclonal 5/44 de ratón (SEQ ID Nos . : 1 a 6) ; La Figura 2 muestra la secuencia completa del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo ¦monoclonal 5/44 de ratón; ""'LaT'Figura" *3~ "muestra la secuencia, completa _ del, dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 5/44 de ratón; La Figura 4 muestra la estrategia para la eliminación del sitio de glucosilación y la lisina reactiva en CDR-H2 ; La Figura 5 muestra el diseño de injerto para la secuencia de cadena ligera de 5/44, en donde: DPK-9 es la secuencia estructural aceptora de línea germinal humana; las líneas verticales indican diferencias entre los residuos de ratón y de humano; las secuencias subrayadas indican residuos donadores que han sido retenidos en el injerto; las CDRs son indicadas en azul (no mostradas para DPK-9) ; el injerto gLl tiene seis residuos estructurales donadores, gL2 tiene siete; 5 La Figura 6 muestra el diseño de injerto para la secuencia de cadena pesada de 5/44, en donde: DP7 es la secuencia estructural aceptora de línea germinal humana; las líneas verticales indican diferencias entre los residuos de ratón y de humano; las secuencias subrayadas indican residuos 10 donadores que han sido retenidos en el injerto; las CDRs son indicadas en azul (no mostradas para DPu7) ; el injerto gH4 y gH6 tiene seis residuos estructurales donadores; los injertos gH5 y gH7 tienen 4 ; La Figura 7 muestra los vectores pMRR14 y pMRRlO.l; 15 La Figura 8 muestra los resultados del ensayo de La Figura 9 muestra los oligonucleótidos para los ensambles de los genes gHl y gLl de 5/44; La Figura 10 muestra los vectores intermediarios 0 pCR2.1 (544gHl) y pCR2.1 (544gll) ; La Figura 11 muestra los casetes oligonucleotídicos utilizados para realizar injertos adicionales; La Figura 12 muestra el ensayo de competencia entre el anticuerpo 5/44 de ratón, fluorescentemente marcado, y 5 variantes injertadas; y La Figura 13 muestra la secuencia de ADN completo y de proteína de las cadenas pesada y ligera injertadas. Ejemplo 1: Generación de Anticuerpos Candidatos. Se seleccionaron un panel de anticuerpos contra CD22 seleccionados de los hibridomas, utilizando los siguientes criterios de selección: el enlace a las células Daudi, la internalización sobre las células Daudi, el enlace a las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , la internalización sobre PBMC, afinidad (mayor de 10"9 M) , yl de ratón y velocidad de producción. 5/44 se seleccionó como el anticuerpo preferido. Ej emplo 2 : Clonación y Expresión del Gen de una Molécula Quimérica de Anticuerpo 5/44 Preparación de Células de Hibridoma de 5/44 y Preparación de ARN a partir de las mismas " ~* ~~"É1 hibridoma^ 5/44 fue generado.- mediante - -la-tecnología de hibridoma convencional después de la inmunización de los ratones con proteínas CD22 humana. El ARN fue preparado a partir de células de hibridoma 5/44 utilizando un equipo ' RNEasy (Qiagen, Crawley, Reino Unido; Catálogo No. 74106) . El ARN obtenido fue transcrito inversamente al ADNc, como se describe más adelante. Distribución de CD22 sobre tumores de NHL Se emprendió un estudio de inmunohistoquímica para examinar la incidencia y distribución de la tinción utilizando anticuerpos monoclonales 5/44 anti-CD22. Los anticuerpos control anti-CD20 y anti-CD79a fueron incluidos en el estudio para confirmar las áreas de células B de los tumores . Un total de 50 tumores fueron estudiados y éstos fueron categorizados como sigue mediante el uso de los sistemas de clasificación Working Formulation y REAL: • 7 B de leucemia/linforna linfoblástica B (Alta/1) • 4 linfornas linfoblásticos pequeños de B-CLL (Baja/A) • 3 linfoplasmacitoide/Inmunocitoma (Baja/A) • 1 célula del' Manto (Int/F) • 14 linfomas del centro folicular (Baja a Int/D) • 13 linfomas difusos de células grandes (Int a Alta/G,H) • 6 no clasificables (K) •-=r-- --2 - linfomas-'de-'celülas T 40 linfomas de células B fueron positivos para el antígeno CD22 con el anticuerpo 5/44 a 0.1 µg/ml y 6 adicionales se volvieron positivos cuando la concentración se incrementó a 0.5 µg/ml. Para los 2 tumores de células B restantes que fueron negativos a 0.1 µg/ml, existió insuficiente tejido remanente para la prueba a mayor concentración. No obstante, la prueba paralela con otro anticuerpo 6/13 anti-CD22 Celltech, el cual dio la tinción más fuerte que 5/44, dio como resultado que los 48 linfomas de células B se tiñeran positivos para CD22. De este modo, ' es posible concluir que el antígeno CD22 es ampliamente expresado sobre el linfoma de células B y de este modo proporciona un blanco adecuado para la 5 inmunoterapia en NHL. Clonación por PCR de VH y VL de 5/44 Las secuencias de ADNc que codifican para los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de 5/44 fueron sintetizadas utilizando transcriptasa inversa para 10 producir copias de ADNc de una sola hebra de la ARNm presente en el ARN total. Este fue luego utilizado como la plantilla para la amplificación de las secuencias de la región V murina utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos por la reacción en cadena de polimerasa (PCR)-. 15 a) Síntesis de ADN ——-c-*- ~-~ ~ Él~"ADÑc"" fue"sintetizado en un volumen ,d _ ^reacGión^. de 20 µ? que contenía los siguientes reactivos: Tris-HCl 50 mM pH 8.3, cloruro de potasio 75 mM, ditiotreritol 10 mM, cloruro de magnesio 3 mM, 0.5 mM de cada trifosfato de 20 desoxirribonucleósido, 20 unidades de RNAsin, 75 ng de cebador hexanucleotídico aleatorio, 2 g de ARN de 5/44 y 200 unidades de la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney. Después de la incubación a 42 °C por 60 minutos, la reacción fue terminada mediante calentamiento a 25 95°C por 5 minutos. b) PCR Alícuotas del ADNc se sometieron a PCR utilizando combinaciones de cebadores específicos para las cadenas pesadas y ligeras. Combinados de cebadores degenerados 5 diseñados para recocerse con las secuencias conservadas del péptido de señal se utilizaron como cebadores delanteros. Estas secuencias contienen todas, en orden, un sitio de restricción (VL Sful; VH HindIII) comenzando 7 nucleótidos desde su extremo 5', la secuencia GCCGCCACC (SEQ ID No.: 50), 10 para permitir la traducción óptima de los ARNms resultantes, un codón de inicio y 20-30 nucleótidos "basados en las secuencias de péptido guía de anticuerpos de ratón conocidos (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a. Edición, 1991,· U.S. Department of Health and Human Services, Public 15 Health Service, National Institutes of Health) . ^-r ^ -. ^="~Los~~ céHadores" ~3 ' " _són " diseñados para abarcar .la. unión J-C de la estructura 4 del anticuerpo, y contienen un sitio de restricción para la enzima BsiWI para facilitar la clonación del fragmento de PCR de VL. Los cebadores 3' de 20 cadena pesada son una mezcla diseñada para abarcar la unión J-C del anticuerpo. El cebador 3' incluye un sitio de restricción Apal para facilitar la clonación. La región 3' de los cebadores contiene una secuencia mixta basada en aquellas encontradas en los anticuerpos de ratón conocidos 25 (Kabat et al., (supra) .
Las combinaciones de los cebadores descritos anteriormente hacen posible que los productos de PCR para VH y VI sean clonados directamente dentro de un vector de expresión apropiado (ver más adelante) para producir cadenas ligeras y pesadas quiméricas (ra ón-humano) y para que estos genes sean expresados en células de mamífero para producir anticuerpos quiméricos del isotipo deseado. Se establecieron como sigue incubaciones de 100 µ? para la PCR. Cada región contenía Tris HC1 10 mM, pH 8.3, cloruro de magnesio 1.5 mM, cloruro de potasio 50 mM, 0.01% p/v de gelatina, 0.25 mM de cada trifosfato de desoxirribonucleósido , 10 pmoles de mezcla de cebador 5' , 10 pmoles de cebador de 3', 1 µ? de ADNc y 1 unidad de polimerasa Taq. Las reacciones fueron incubadas a 95 °C por 5 minutos y luego sometidas a ciclos de 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto. . Después, de 30 ciclos, - las alícuotas de cada reacción fueron analizadas mediante electroforesis sobre un gel de agarosa. Para la región V de cadena pesada, un producto de ADN amplificado fue únicamente obtenido cuando un combinado de cebadores que se recose dentro del inicio de la estructura 1, reemplazó el combinado de cebador peptídico de señal. Los fragmentos fueron clonados dentro de los vectores de secuenciamiento de ADN. La secuencia de ADN fue determinada y traducida para dar una secuencia deducible de aminoácidos.
Esta secuencia deducida fue verificada por referencia a la secuencia de la proteína N-terminal determinada experimentalmente. Las Figuras 2 y 3 muestran la secuencia de ADN/proteína de las regiones V de cadena ligera y pesada, maduras, del anticuerpo 5 monoclonal 5/44 de ratón, respectivamente. c) Clonación Molecular de los Fragmentos de PCR Las secuencias de la región v murina fueron luego clonadas dentro de los vectores de expresión pMRRIO.l y pMRR14 (Figura 17) . Estos son vectores para la expresión de 10 la cadena ligera y pesada respectivamente, que contiene el ADN que codifica para las regiones constantes de la cadena ligera kappa humana y la cadena pesada gamma-4 humana. La región VL fue sub-clonada dentro del vector de expresión mediante digestión de restricción y ligadura a partir del 15 vector de secuenciamiento, utilizando los sitios de utilizando un cebador 5' para introducir un péptido de. señal, ya que éste no fue obtenido en la estrategia de clonación - 20 una guía de anticuerpo de cadena pesada de ratón- proveniente de un hibridoma diferente doméstico (denominado 162) fue empleado. El cebador 5' tuvo la siguiente secuencia: 5 ' -GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGC ACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3 (SEQ ID 25 No. : 51) El cebador inverso fue idéntico a aquel utilizado en la clonación del gen de VH original . El producto de PCR resultante fue digerido con las enzimas HindIII y Apal, fue sub-clonado, y su secuencia de ADN fue confirmada, creando el plásmido pMRR14 (544cH) . La co-transfección transitoria de ambos vectores de expresión dentro de las células CHO, generó el anticuerpo quimérico c5/44. Esto fue logrado utilizando el reactivo de Lipofectamine de acuerdo a los protocolos del fabricante (InVitrogen: Life Technology, Groningen, Holanda. Catálogo no. 11668-027) . Eliminación del Sitio de Glucosilación y Lisina Reactiva Una secuencia potencial del sitio de glucosilación N-enlazado, fue observada en CDR-H2, teniendo la secuencia de aminoácidos N-Y-T (Figura 3) . SDS-PAGE, transferencia de Western y tinción con carbohidrato de geles 5/44 y sus fragmentos— "( incluyendo "Fabj* Tridicó~qúe este sitio fue más bien glucosilado (no mostrado) . Además, se observó un residuo de lisina en una posición expuesta dentro de CDR-H2 , que tuvo el potencial para reducir la afinidad de enlace del anticuerpo mediante la provisión de un sitio adicional para la conjugación con un agente con el cual el anticuerpo puede ser conjugado. Se utilizó una estrategia de PCR para introducir las sustituciones de aminoácido dentro de la secuencia de CDR-H2 en un intento para eliminar el sitio de glucosilación y/o la lisina reactiva, como se muestra en la Figura 4. Los cebadores delanteros que codifican para las mutaciones N55Q, T57A o T57V fueron utilizados para remover el sitio de glucosilación (Figura 4) y un cuarto cebador delantero que contenía la sustitución K60R, fue generado para remover el residuo de lisina reactiva (Figura 4) . Se utilizó un cebador inverso de estructura 4 en cada una de estas amplificaciones de PCR. Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas Xbal y Apal y fueron insertados dentro de pMRR14 (544cH) (también escindido con Xbal y Apal) para generar los plásmidos de expresión que codifican para estos mutantes. Las mutaciones N55Q, T57A y T57V abrogan el sitio de glucosilación mediante el cambio de la ' secuencia de aminoácidos lejos del consenso N-X-T/S, mientras que la mutación K60R reemplaza la lisina potencialmente reactiva con el residuo de arginina similarmente cargado positivamente. Los^^ lrásmidos ~vari:antes~~' ""cH resultantes fueron co-transfectados con el plásmido cL para generar las variantes de anticuerpo quimérico, expresadas. Evaluación de las Actividades de Genes Quiméricos Las actividades de los genes quiméricos fueron evaluadas después de la transfeccion transitoria de las células CHO. c) Determinación de las constantes de Afinidad por análisis BiaCore. Las afinidades de 5/44 quiméricos o sus variantes, que han tenido su sitio de glucosilación o sobre su lisina reactiva removida, fueron investigadas utilizando biotecnología BIA para el enlace a las construcciones CD22-mFc . Los resultados se muestran en la Figura 8. Todas las mediciones de enlace fueron realizadas en un instrumento BIAcoreMR 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) . El ensayo fue realizado por captura de CD22mFc vía el Fe antiratón inmovilizado. El anticuerpo está en la fase soluble. Las muestras, el estándar, y los controles (50 µ?) fueron inyectados sobre Fe anti-ratón inmovilizado, seguido por el anticuerpo en la fase soluble. Después de cada ciclo la superficie fue regenerada con 50 µ? de HC1 40 mM a 30 µ?/minuto. El análisis cinético fue realizado utilizando el software BIAevaluation 3.1 (Pharmacia). La eliminación del sitio de glucosilación en la construcción T57A dio como resultado una velocidad de. encendido ligeramente . más .rápida, y una velocidad -de -apagado significativamente más lenta, en comparación el 5/44 quimérico, dando un mejoramiento de afinidad de aproximadamente 5 veces. La mutación N55Q no tuvo efecto sobre la afinidad. Este resultado fue inesperado ya que sugiere que la eliminación del carbohidrato del mismo aparentemente no tiene efecto sobre el enlace (como con el cambio N55Q) . La afinidad mejorada fue observada únicamente con el cambio T57A. Una posible explicación es que, no obstante de la presencia del carbohidrato, la treonina en la posición 57 ejerce un efecto negativo sobre el enlace que es removido después de la conversión de la treonina a alanina. La hipótesis de que el tamaño pequeño de la alanina es importante y que el efecto negativo de la treonina está relacionado a su tamaño, es apoyado del resultado obtenido utilizando la mutación T57V: ese reemplazo con valina en la posición 57 no es benéfico (resultados no mostrados) . La eliminación de lisina por la mutación K60R tuvo un efecto neutro sobre la afinidad por ejemplo la introducción de la arginina elimina un sitio reactivo potencial sin comprometer la afinidad. Las mutaciones para la eliminación del sitio de glucosilación y para la eliminación de la lisina reactiva fueron por lo tanto inc^idas ambas en el diseño de humani zación .
Ha sido descrita anteriormente la clonación molecular de los genes para las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo 5/44 y su uso para producir los anticuerpos quiméricos (ratón/humano) 5/44. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios VL y VH 5/44 de ratón se muestran en las Figuras 2 y 3 (SEQ ID Nos.: 7 y 8) , respectivamente. Este ejemplo describe el injerto de CDR del anticuerpo 5/44 sobre las estructuras humanas para reducir la inmunogenicidad potencial en humanos, de acuerdo al método de Adair et al . , (documento WO 91/09967) . Injerto de CDR de la Cadena Ligera de 5/44 El alineamiento de la secuencia de proteína con las 5 secuencias de consenso proveniente de la región V de cadena ligera kappa del sub-grupo I humano, indicó 64% de identidad secuencial . En consecuencia, para construir la cadena ligera injertada con CDR, las regiones estructurales aceptoras elegidas correspondieron a aquellas de la secuencia 012, DPK9 10 de línea germinal del sub-grupo I de VK humano. La secuencia aceptora de la estructura 4 fue derivada de la secuencia de línea germinal JK1 de la región J humana. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de 5/44 murino, y la secuencia 15 aceptora se da en la Figura 5, y muestra que existen 27 posición, se realizó un análisis del potencial del residuo murino para contribuir al enlace del antígeno, ya sea directamente o indirectamente, a través de los efectos sobre 20 el empaquetamiento o en la interfaz VH/VL. Si un residuo murino fue considerado importante y suficientemente diferente del residuo humano en términos del tamaño, polaridad o carga, entonces el residuo murino fue conservado. Con base en este análisis, se construyeron dos versiones de la cadena ligera 25 injertada con CDR, que tiene las secuencias dadas en la SEQ ID No. : 19 y SEQ ID No. : 20 (Figura 5) . Injerto de CDR de la Cadena Pesada de 5/44 El injerto de CDR de la cadena pesada de 5/44 fue realizada utilizando la misma estrategia que se describe para la cadena ligera. El dominio V de la cadena pesada de 5/44 se encontró que era homólogo a las cadenas pesadas humanas que pertenecen al sub-grupo I (70% de identidad secuencial) y por lo tanto la secuencia de la estructura VH1-3, DP7 de línea germinal del sub-grupo I, fue utilizada como una estructura aceptora. Las secuencias aceptoras de la estructura 4 fueron derivadas de la secuencia JH4 de línea germinal de la región J humana. Una comparación de la cadena pesada 5/44 con las regiones estructurales es mostrada en la Figura 6, donde se puede observar que la cadena pesada 5/44 difiere de la secuencia—aceptora~éñ~22_ posíciones". ?? análisis de la contribución de que cualquiera de éstas puede realizar el enlace al antígeno condujo a 5 versiones de las cadenas pesadas injertadas con CDR que son construidas, teniendo las secuencias dadas en la SEQ ID No.: 23, SEQ ID No. : 24, SEQ ID No.: 25, SEQ ID No.: 26 y SEQ ID No.: 27 (Figura 6). Construcción de los genes para secuencias injertadas. Fueron diseñados los genes para codificar las secuencias injertadas gHl Y gLl, y una serie de oligonucleótidos traslapados fueron diseñados y construidos (Figura 9) . Se empleó una técnica de ensamble de PCR para construir los genes de la región V injertados con CDR. Los volúmenes de reacción de 100 µ? fueron ajustados conteniendo Tris-HCl 10 mM pH 8.3, cloruro de magnesio 1.5 mM, cloruro de potasio 50 mM, 0.001% de gelatina, 0.25 mM de cada trifosfato de desoxirribonucleósido, 1 pmol de cada uno de los cebadores "internos" (TI, T2 , T3 , Bl, B2 , B3), 10 pmol de cada uno de los cebadores "externos" (Fl, Rl) , y 1 unidad de la polimerasa Taq (AmpliTaq, Applied BioSystems, catálogo no. N808-0171) . Los parámetros del ciclo de PCR fueron 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto, por 30 ciclos. Los productos de reacción fueron luego corridos en un gel de agarosa 1.5%, extirpado y recuperado utilizado las columnas de centrifugación QIAGEN (equipo de extracción de gel QIAquick, catálogo no. 28706) . El ADN fue eluido en un Volumen"" de 30 µ1. Se clonaron luego, alícuotas, .de-, 1 µ? - del ADN de gHl y gLl dentro del vector de clonación pCR2.1 TOPO de InVitrogen TOPO TA (catálogo no. K4500-01) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El vector de no expresión sirvió como un intermediario de clonación para facilitar el secuenciamiento de un gran número de clones. El secuenciamiento de ADN utilizando cebadores específicos del vector, se utilizó para identificar los clones correctos que contenían gHl y gLl, creando los plásmidos pCR2.1 (544gHl) y pCR2.1 (544gLl) (Figura 10).
Se utilizó un método de reemplazo de c sete oligonucleotídico para crear injertos humanizados gH4, 5, 6 y 7 y gL2. La Figura 11 muestra el diseño de los casetes oligonucleotídicos . Para construir cada variante, el vector 5 pCR2.1 (544gHl) o pCR2.1 (544gLl) fue cortado con las enzimas de restricción mostradas (Xmal/SacII para la cadena pesada, Xmal/BstEII para la cadena ligera) . El fragmento del vector grande fue purificado en gel a partir de la agarosa y se utilizó en la ligadura con el cásete oligonucleotídico. 10 Estos casetes están compuestos de 2 oligonucleótidos complementarios (mostrados en la Figura 11) , mezclados a una concentración de 0.5 pmoles/µ? en un volumen de 200 µ? de Tris-HCl de 12.5 mM pH 7.5, cloruro de magnesio 2.5 mM, cloruro de sodio 25 mM, ditioerititrol 0.25 mM. El recosido 15 fue logrado mediante el calentamiento a 95 °C por 3 minutos en ^^~'uñ''¾añó" de' agua""" (volumen 500 mi) permitiendo luego_ que_ la reacción se enfriara lentamente hasta la temperatura ambiente. El cásete oligonucleotídico recosido fue luego diluido a un décimo en agua antes de la ligadura dentro del 20 vector apropiadamente cortado. El secuenciamiento de ADN fue utilizado para confirmar la secuencia correcta, creando los plásmidos pCR2.1 (5/44gH4-7) y pCR2.1 (5/44gL2). Las secuencias injertadas, verificadas, fueron luego sub-clonadas dentro de los vectores de expresión pMRR14 (cadena pesada) , 25 pMRlO.l (cadena ligera) Actividad de enlace de CD22 de las secuencias injertadas con CDR Los vectores que codifican para las variantes injertadas fueron co-transíectados dentro de las células CHO 5 en una variedad de combinaciones junto con las cadenas de anticuerpo quiméricas originales. La actividad de enlace fue comparada en un ensayo de competencia, compitiendo por el enlace del anticuerpo 5/44 de ratón, original, para el enlace a células Ramos (obtenidas de ATCC, una línea celular humana 10 de linfoblastos/linforna de Bukitt que expresan CD22 en la superficie) . Este ensayo fue considerado la mejor manera para comparar los injertos en la habilidad para enlazarse a CD22 de la superficie celular. Los resultados son mostrados en la Figura 8. Como se puede observar existe poca 15 diferencia entre cualquiera de los injertos, funcionando contra e pa re mur no. La ntro ucc n e os 3 res uos humanos adicionales en el extremo de CDR-H3 (gH5 y gH7) no parece haber afectado el enlace. 20 La combinación de injerto con el menor número de residuos murinos fue seleccionada, gLlgH7. El injerto gLl de cadena ligera tiene 6 residuos donadores. Los residuos V2 , V4 , L37 y Q45 son residuos de empaquetamiento potencialmente importante. El residuo H38 está en la interfaz VH/VL. El 25 residuo D60 es un residuo superficial cercano a CDR-L2 y puede contribuir directamente al enlace al antígeno. De estos residuos, V2 , L37, Q45 y D60 son encontrados en las secuencias de línea germinal de los genes kappa humanos provenientes de otros sub-grupos. El injerto gH7 de cadena pesada tiene 4 residuos estructurales donadores (el residuo R28 es considerado como parte de CDR-H1 bajo la definición estructural utilizada en el injerto de CDR (ver Adair et al (1991 O 91/09967) . Los residuos El y A71 son residuos superficiales cercanos a las CDRs . El residuo 148 es un residuo de empaquetamiento potencial . El residuo T93 está presente en la interfaz VH/VL. De estos residuos, El y A71 son encontrados en otros genes de línea germinal del sub- grupo I humano. El residuo 148 es encontrado en el sub-grupo 4 de línea germinal, y T73 es encontrado en el sub-grupo 3 de línea germinal humano. aproximada de los intrones dentro de los genes de la región constante, proporcionados por los vectores, se muestran en la Figura 13 y se dan en la SEQ ID No.: 29 y SEQ ID No.: 28, respectivamente para la cadena ligera y SEQ ID No.: 31 y SEQ ID No. : 30 respectivamente, para la cadena pesada. El ADN que codifica para estos genes de la cadena ligera y pesada fue extirpado de estos vectores. El ADN de cadena pesada fue digerido en el sitio 5' HindIII, luego fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN-polimerasa de E. coli para crear un extremo romo 5'. La escisión del sitio 3' EcoRI dio como resultado el fragmento de cadena pesada que fue purificada a partir de geles de agarosa. De la misma manera, se produjo un fragmento de cadena ligera, enromado en el sitio 5' Sful y con el sitio 3' EcoRI . Ambos fragmentos fueron clonados dentro de los vectores de expresión basados en DHFR y utilizados para generar líneas celulares estables en las células CHO. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula de anticuerpo que tiene una especificidad para CD22 humano, caracterizada porque comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias dadas como Hl (SEQ ID No.: 1) para CDR-H1, como H2 (SEQ ID No.: 2) o H2' (SEQ ID No. : 13) o H2'" (SEQ ID No. : 15) oH2"' (SEQ ID NO. : 16) para CDR-H2 o como H3 (SEQ ID No. : 3) para CDR-H3. ' 2. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizada porque comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias -dadaS"Como~Elr~"('SEQ-ID~Ñó T~4' como L2 (SEQ.JD. No.: 5) para CDR-L2 o como L3 (SEQ ID No.: 6) para CDR-L3. 3. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una CDR que tiene al ¦ menos una de las secuencias dadas en la SEQ ID No.: 1 para CDR-H1, SEQ ID No.: 2 o SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No . : 15 o SEQ ID No.: 16 para CDR-H2 o SEQ ID No. : 3 para CDR-H3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una CDR que tiene al menos una de las secuencias dadas en la SEQ ID No.: 4 para CDR-L1, SEQ ID No. : 5 para CDR-L2 o SEQ ID No. : 6 para CDR-13. 4. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende la SEQ ID 5 No. : 1 para CDR-H1, SEQ ID No . : 2 o SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No. : 15 o SEQ ID No. : 16 para CDR-H2 o SEQ ID No. : 3 para CDR-H3, SEQ ID No.: 4 para CDR-L1, SEQ ID No.: 5 para CDR-L2 y SEQ ID No.: 6 para CDR-L3. 5. La molécula de anticuerpo de conformidad con 10 cualquiera de las reivindicaciones 1. a 4, caracterizada porque es una molécula de anticuerpo injertada con CDR. 6. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el dominio variable comprende las regiones estructurales aceptoras humanas y las 15 CDRs donadoras no humanas. ^t?-^=^tt-~- ~ -— --^=-7 "—La^moTécul"a" d~e~ "anticuerpo de conformidad _ con la reivindicación 6, caracterizada porque las regiones estructurales aceptoras humanas del dominio variable de la cadena pesada están basadas en una secuencia de consenso del 20 sub-grupo I humano y comprenden residuos donadores en las posiciones 1, 28, 48, 71 y 93 que corresponden a los residuos de esas posiciones en la SEQ ID No.: 8. 8. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende además 25 residuos donadores en las posiciones 67 y 69 que corresponden a los residuos en esas posiciones en la SEQ ID No. : 8. 9. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque las regiones estructurales aceptoras humanas del 5 dominio variable de la cadena ligera, están basadas en una secuencia de consenso del sub-grupo I humano y comprenden residuos donadores en las posiciones 2, 4, 37, 38, 45 y 60 que corresponden a los residuos en esas posiciones en la SEQ ID No. : 7. 10. La molécula de anticuerpo de conformidad con 10 la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende un residuo donador en la posición 3, que corresponde al residuo en esa posición en la SEQ ID No. : 7. 11. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizada porque comprende una 15 cadena pesada de conformidad con la reivindicación 7 o la reivindicaci n 9 o la reivindicaci n 10. 12. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada 20 porque comprende la región variable de cadena ligera 5/44-gLl (SEQ ID No.: 19) y la región variable de cadena pesada 5/44- gH7 (SEQ ID No. : 27) . 13. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizado porque 25 comprende una cadena ligera, donde la secuencia de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 28. 14. Una molécula de' anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizado porque comprende una cadena ligera, donde la secuencia de la cadena ligera que 5 consiste de la secuencia dada en la SEQ ID No. : 28. 15. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizado porque comprende una cadena pesada, donde la secuencia de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 30. 10 16. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para CD22 humano, caracterizado porque comprende una cadena pesada, donde la secuencia de la cadena ligera que consiste de la secuencia dada en la SEQ ID No. : 30. 17. Una molécula de anticuerpo que tiene dada en la SEQ ID No. : 30. 18. Una molécula de anticuerpo que tiene 20 especificidad para CD22 humano, caracterizado porque tiene una cadena ligera que consiste de la secuencia dada en la SEQ ID No. : 28 y una cadena pesada que consiste de la secuencia dada en la SEQ ID No.: 30. 19. Una variante de la molécula de anticuerpo de 25 conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque tiene una afinidad mejorada para CD22. 20. La variante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque es obtenida mediante un protocolo de maduración por afinidad. 5 21. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es el anticuerpo monoclonal murino 5/44 anti-CD22, en donde el dominio variable de la cadena ligera tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 7 y el dominio variable de la cadena pesada 10 tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 8 . 22. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque es una molécula de anticuerpo quimérico que comprenden las secuencias de los dominios variables de cadena ligera y 15 pesada del anticuerpo monoclonal de conformidad con la 23. Una molécula de anticuerpo que comprende una CDR híbrida, caracterizada porque comprende una secuencia de CDR 20 donadora truncada, en donde la porción faltante de la CDR donadora es reemplazada por una secuencia diferente y forma una CDR funcional. 24. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la parte faltante de la secuencia de CDR es del anticuerpo del cual se derivan 25 las regiones estructurales de la molécula de anticuerpo. 25. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la parte faltante de la secuencia de CDR es derivada de un anticuerpo de línea germinal que tiene las regiones estructurales de consenso. 5 26. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque CDR-H2 de la cadena pesada es híbrida en la molécula de anticuerpo. 27. La molécula de anticuerpo de conformidad con 10 cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizada porque el truncamiento de la CDR donadora es de 1 a 8 aminoácidos. 28. La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el truncamiento es 15 de 4 a 6 aminoácidos. ——·-- _-r-=r^r —29:. ~ "La" molécula de anticuerpo^ de conformidad.-con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, caracterizada porque el truncamiento es realizado' en el extremo C de la CDR. 30. Una secuencia de ADN caracterizada porque 20 codifica para la cadena pesada y/o la cadena ligera de una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29. 31. Un vector de clonación o expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de 25 conformidad con la reivindicación 30. 32. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende un vector de clonación o de expresión de conformidad con la reivindicación 31. 33. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, o una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque es para el uso en terapia. 34. La molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 o 33, caracterizada porque tiene especificidad para CD22 humano, o una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 30 para el uso en el tratamiento de una patología mediada por células que expresan CD22. 35. Una molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33 ó la reivindicación 34, o una secuencia -de—ADN51--'de ·~'conformidad con la reivindicación. 33 ...o -la reivindicación 34, caracterizada porque es para el uso en el tratamiento del linfoma maligno. 36. La molécula de anticuerpo o la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el linfoma maligno es el linfoma no Hodkin. 37. El uso de la molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, que tiene especificidad por CD22 humano, o el uso de una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 30, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología mediada por células que expresan CD22. 38. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la patología es el linfoma maligno. 39. El uso de conformidad con la reivindicación 38, en donde el linfoma maligno es el linfoma no Hodgkin. 40. Una composición terapéutica o de diagnóstico, caracterizada porque comprende la molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 o la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 30. 41. Una composición terapéutica o de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque comprende un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. 42. Una composición terapéutica o de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 40 ó la reivindicación 41, caracterizada porque comprende adicionalmente anticuerpos anti-células T, anti-IFNy o anti-LPS o ingredientes no anticuerpos tales como xantinas. 43. Un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque comprende el cultivo de una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica
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