KR100367948B1

KR100367948B1 - 백혈구부착분자vla-4에대한인체화된항체

Info

Publication number: KR100367948B1
Application number: KR1019960703987A
Authority: KR
Inventors: 매리 엠 벤디그; 올리비에 제이 레제; 조스 샐댄하; 태런 에스. 존스; 테드 에이 옛노크
Original assignee: 엘란 파마슈티칼스, 인크.
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 2003-07-12
Also published as: JP2013173738A; ES2424292T3; KR970700513A; FR06C0024I1; JP2006045237A; DE122006000043I1; NO963097L; NO319867B1; ES2270425T3; PL315634A1; PT804237E; MX9602971A; EP0804237B8; EP0804237B1; HUT75129A; DE69535133D1; JP2009235078A; AU1696095A; NL300238I2; ATE333895T1

Abstract

본 발명은 VLA-4 리간드에 특이적으로 결합하는 인체화된 면역글로불린, 및 이를 사용한 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 다발성 경화증의 치료에 특히 유용하다.

Description

백혈구 부착 분자 VLA-4에 대한 인체화된 항체

염증은 감염이나 상처에 대한 혈관형성된(vascularized) 조직의 응답반응으로, 혈관의 내피 세포에 백혈구가 부착하여 주변 조직내로 침투하여 생긴다. 정상적인 염증의 경우에서는, 침투한 백혈구가 독성 매개물질을 방출하여 침입 유기체를 사멸시키고, 잔편과 사세포를 식균작용하여, 조직 복구와 면역 응답반응에 중요한 역할을 한다. 그러나, 병리학적 염증의 경우에서는, 침투 백혈구가 과잉-응답반응성을 나타내어 심각하거나 치명적인 손상을 야기시킬 수 있다 [참조예, Hickey,Psychoneuroimmunology II(Academic Press 1990)].

내피 세포에 대한 백혈구의 부착은 내피 세포와 백혈구상의 세포-표면 리간드 및 수용체와의 특이적인 상호작용을 통해 수행된다[참조, Springer, Nature 346:425-433 (1990)]. 리간드와 수용체는 세포 아형(subtypes), 해부학적 위치 및 염증 자극에 따라 달라진다. VLA-4 백혈구 세포-표면 수용체가 유럽 특허 제 330,506 호(Hemler, 1989) (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)에서 최초로 규명되었다. VLA-4는 β1 인테그린(integrin) 부류의 세포 표면 수용체의 일종으로, 각각은 α쇄 및 β쇄로 되어 있다. VLA-4는 α4쇄 및 β1쇄를 포함한다. VLA-4는 VCAM-1이라 불리는 내피 세포 리간드에 특이적으로 결합한다[참조, Elices et al., Cell 60:577-584 (1990) (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]. VCAM-1은 활성화된 인체 제정맥 세포상에서 최초로 검출되었으나, 이 리간드는 뇌 내피 세포상에서도 검출된 바 있다[참조, 본원의 소유권자가 공동으로 권리를 가진 공계류중인 미국 특허 출원 일련번호 제 07/871,223 호(상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)].

VLA-4 같은 부착 분자는 치료제로 이용가능한 잠재적인 표적이다. VLA-4 수용체는 뇌 내피 세포상에 존재하는 리간드와 상호작용하기 때문에, 특히 중요한 표적이다. 뇌 염증으로 인해 야기된 질환과 증세는 특히 심각한 결과를 초래한다. 예를 들어, 이러한 질환의 일종인 다발성 경화증(MS)은 중증의 무력증 및 사망에 이르게 하는 만성적인 경과(악화 및 차도가 있거나 또는 없음)를 나타낸다. 이 질환은 미국에서만도 대략 250,000 내지 350,000명의 사람들이 앓고 있는 것으로 추정된다.

시험관내 및 생체내 동물 모델 모두에서 소염 가능성과 관련하여 VLA-4 수용체에 대한 항체의 시험이 이루어졌다[참조, USSN 07/871,223 및 Yednock et al., Nature 356:63-66 (1992) (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]. 시험관내 실험 결과, 항VLA-4 항체는 뇌 내피 세포에 임파구가부착하는 것을 차단하는 것으로 입증되었다. 동물 실험을 통해, 인위적으로 유도된 증세(실험목적의 자가면역 뇌척수염)를 가지며, 다발성 경화증을 나타내도록 한 동물에 미치는 항VLA-4 항체의 효과를 시험하였다. 실험 결과, 항VLA-4 항체의 투여로 동물에게서 뇌의 염증과 후속되는 마비증세가 예방되는 것으로 나타났다. 종합해서 검토해보면, 이들 실험으로, 항VLA-4 항체가 다발성 경화증 및 기타 염증 질환과 질병을 치료하는데 유용한 치료제로서 잠재성이 있는 것으로 규명되었다.

지금까지 이용되어온 항VLA-4 항체에 있어 중요한 문제점은 이들이 모두 쥐에게서 유래된 것이며, 따라서 임상용으로 인체 항마우스 응답반응(HAMA)을 발생시킬 가능성이 있다는 것이다. HAMA 응답반응은 환자에게 있어 마우스 항체의 효능을 저하시켜 지속적인 투여를 방해한다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안중 한 가지는 마우스 항체를 인체화시키는 것이다. 이 방안에서는, 공여체(donor)인 마우스의 가변 영역으로부터의 상보성 결정 영역(CDR)과 기타의 특정 아미노산을 수령체(acceptor)인 인체의 가변 영역내로 이식한후, 인체의 불변 영역에 연결시킨다[참조예, Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1998); Winter, 미국 특허 제 5,225,539 호 (1993) (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)].

인체화된 항체의 여러 일례가 생성되었으나, 쥐로부터 인체파된 항체로의 전이는 경쟁적인 고려사항들의 절충안을 포함하며, 그 해결책은 항체의 종류에 따라 다르다. 면역원성을 최소화하기 위해서는, 면역글로불린이 가능한한 많은 인체 수령체 서열을 보유하고 있어야 한다. 그러나, 원래의 결합 특성을 유지하기 위해서는, 면역글로불린 프레임워크(framework)가 인체 수령체 서열 중 충분히 치환을 포함하여 원래의 마우스 공여체 면역글로불린과 가능한한 근접한 CDR 영역의 입체 구조를 갖도록 하여야 한다. 이들 경쟁적인 고려사항들의 결과로서, 지금까지 생성된 다수의 인체화된 항체는 이것이 유래한 기원인 대응 쥐 항체와 비교하여 일부 결합친화성이 결손된 것으로 나타났다[참조예, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Shearman et al., J. Immunol. 147:4366-4373 (1991); Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Gorman et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest et al., Biotechnolology 9:266-271 (1991)].

상기한 바에 의하면, VLA-4 수용체에 강력한 친화성을 나타내면서도, 존재하더라도 인체-항마우스 응답반응을 거의 나타내지 않는 인체화된 항VLA-4 항체에 대한 요구가 있어 왔다. 본 발명은 이러한 요구 및 기타의 요구를 충족시키기 위한 것이다.

본 발명은 일반적으로 백혈구 부착 분자 VLA-4의 알파-4 서브유니트(subunit)에 특이적인 인체화된 항체(humanized antibodies)에 관한 것이다.

도 1은 마우스 21.6 경쇄 가변 영역의 DNA(서열 번호 1) 및 아미노산(서열 번호 2) 서열을 나타내는 도면이다.

도 2는 마우스 21.6 중쇄 가변 영역의 DNA(서열 번호 3) 및 아미노산(서열번호 4) 서열을 나타내는 도면이다.

도 3은 포유동물 세포에서 인체 카파 경쇄와 인체 감마-1 중쇄를 가진 키메라형 및 재구성된(reshaped) 인체 항체를 생성하는데 사용된 경쇄(A) 및 중쇄(B) 발현 벡터를 나타내는 도면이다.

도 4는 표면상에 인체 α4β1 인테그린을 발현하는 L 세포에 대한 키메라형 및 마우스 21.6 항체 결합을 ELISA 비교한 도면이다.

도 5는 마우스 21.6 항체의 가변 영역의 분자 모델을 나타내는 도면이다. 특별히 관심있는 잔기는 표시해 두었다.

도 6은 마우스 및 재구성된 인체 21.6(서열 번호 5) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 비교한 도면이다. CDR 루프 구조체의 코티아 정규(Chothia canonical) 서열의 일부인 아미노산 잔기는^*로 표시해 두었다. RE1(서열 번호 6)은 인체 RE1 경쇄의 V_L영역으로부터의 FR 및 CDR을 나타낸다. La(서열 번호 7) 및 Lb(서열 번호 8)는 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 두 변형체이다. RE1 서열에서의 것과 상이한 La의 FR에서의 잔기는 밑줄쳐져 있다. Lb에서는, RE1와 상이한 프레임워크 영역에서의 잔기만이 제시되어 있다.

도 7은 마우스 및 재구성된 인체 21.6(서열 번호 9) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 비교한 도면이다. 코티아 CDR 루프 구조체의 정규 서열의 일부인 아미노산 잔기는^*로 표시해 두었다. 2^*CL(서열 번호 10)은 인체 21/28'CL 항체의 V_H영역으로부터의 FR 및 CDR을 나타낸다. Ha(서열 번호 11), Hb(서열 번호 12) 및 Hc(서열 번호 13)은 재구성된 인체 21.6 V_H영역의 세 변형체이다. 21/28'CL 서열에서의 것과 상이한 Ha의 FR에서의 잔기는 밑줄 쳐져 있다. Hb 및 Hc에서는, 21/28'CL의 것과 상이한 프레임워크 영역에서의 잔기만이 제시되어 있다.

도 8은 재구성된 인체 21.6 경쇄 가변 영역의 변형체 "a"의 PCR에 의한 작제를 나타내는 도면이다. 점선은 프라이머 사이의 21개 이상의 염기의 상보성 서열을 나타낸다.

도 9는 재구성된 인체 21.6 중쇄 가변 영역의 변형체 "a"의 PCR에 의한 작제를 나타내는 도면이다.

도 10은 재구성된 인체 21.6 경쇄 가변 영역의 제 1 변형체("a")의 cDNA 및 아미노산 서열(서열 번호 14 및 15)을 나타내는 도면이다.

도 11은 재구성된 인체 21.6 중쇄 가변 영역의 제 1 변형체("a")의 DNA 및 아미노산 서열(서열 번호 16 및 17)을 나타내는 도면이다.

도 12는 표면상에 인체 α4β1 인테그린을 발현하는 L 세포에 대한 키메라형 및 재구성된 인체 21.6 항체 결합을 FLIAS 비교한 도면이다.

도 13은 마우스 21.6 항체를 상이한 항VLA-4 항체, L25와 비교한 도면이다. 패널 A는 Mn²⁺의 존재 및 부재하에서 정제된 VCA-1에 U937 단핵구 세포가 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체의 능력을 비교한 것이다. 패널 B는 점증하는 농도의 VCAM-1에 주캇(Jurkat) 세포가 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체의 능력을 비교한 것이다.

도 14는 마우스 또는 인체 21.6 항체로 처리한 동물에게서 체중 감량이 지연되는 것을 나타내는 도면이다.

도 15는 마우스 또는 인체 21.6 항체로 처리한 동물에서 임상적 증세가 반전되는 것을 나타내는 도면이다.

도 16은 마우스 또는 인체 21.6 항체로 처리한 동물에게서 체중 감량이 반전되는 것을 나타내는 도면이다.

<정의>

자연상에 존재하는 20개의 아미노산에 대한 약어는 통상 사용되는 것을 따른다[Immunology-A Synthesis (2nd ed., E.S. Golub & D.R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)]. 20개의 통상의 아미노산의 입체이성질체(예, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들면 α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타 비통상적인 아미노산도 또한 본 발명의 폴리펩티드의 적합한 성분이 될 수 있다. 비통상적인 아미노산의 일례로는 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티틴, 5-하이드록시리신, ω-N-메틸아르기닌 및 기타 유사 아미노산과 이미노산(예, 4-하이드록시프롤린)이 있다. 또한, 아미노산은 글리코실화, 포스포릴화 등에 의해 변형될 수도 있다.

본원 명세서에서 사용된 폴리펩티드 표기는, 표준 사용방식대로 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향이 카르복시-말단 방향이다. 마찬가지로, 특기하지 않는한, 1본쇄의 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 단부는 5' 단부이고; 2본쇄의 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭한다. 초기 RNA 전사물의 5'에서 3'로의 첨가 방향을 전사 방향으로 보며; RNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상 RNA 전사물의 5'단부에 대해 5'인 서열 영역은 "상방(upstream)서열"로 지칭하고; RNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상 RNA 전사물의 3'단부에 대해 3'인 서열 영역은 "하방(downstream) 서열"로 지칭한다.

"폴리뉴클레오티드 서열"은 5'에서 3' 단부로 읽은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 1본쇄 또는 2본쇄의 중합체를 지칭한다. 이러한 것으로는 자가 복제성 플라스미드, DNA나 RNA의 감염성 중합체 및 비작용성 DNA 또는 RNA가 있다.

다음 용어들은 2 이상의 폴리뉴클레오티드간의 서열 관계를 설명하는데 사용된 용어이다: "기준 서열", "비교 윈도우(comparison window)", "서열 동일성", "서열 동일성의 %" 및 "거의 동일", "기준 서열"이란 서열 비교에 기준으로 사용된 서열을 의미하며: 이 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트, 예를 들면 도 1 또는 도 2의 폴리뉴클레오티드 서열 같이 서열목록에 제시된 전-길이 cDNA이나 유전자 서열의 분절이거나 또는 완전한 DNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 길이가 20개 이상의 뉴클레오티드, 종종은 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드 및 가끔은 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 두 폴리뉴클레오티드가 각기 (1) 2개의 폴리뉴클레오티드간에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부분)을 포함하고, 또 (2) 2개의 폴리뉴클레오티드간에 서로 다른 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 2(또는 이상)개의 폴리뉴클레오티드간의 서열 비교는 통상 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 "비교 윈도우"에서 비교하여 서열 유사성을 규명하고 그 위치를 비교함으로써 수행된다. 본원 명세서에서 사용된 "비교 윈도우"는 20개 이상의 인접 뉴클레오티드 위치의 개념적 분절을 의미하며 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 20개 이상의 인접 뉴클레오티드의 기준 서열과 비교할 수 있으며, 또 비교 윈도우내 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부분은, 두 서열의 최상의 정렬 상에서 기준 서열(첨가 또는 결실부를 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)된 것을 포함할 수 있다. 비교 윈도우 정렬에 있어 최상의 서열 배열은 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소적 상동성 연산법에 의해, 문헌[Needleman & Wunsh, J.Mol.Bio. 48:443(1970)]의 상동성 정렬 연산법에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해(상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임), 상기 연산법의 컴퓨터 실행[GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)]에 의해, 또는 조사에 의해 실행될 수 있으며, 각종 방법에 의해 산출된 최상의 정렬(즉, 비교 윈도우에서 최고 %의 서열 유사성을 나타내는)을 선택한다. 용어 "서열 동일성"이란 비교 윈도우에서 두 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 것(즉, 뉴클레오티드-뉴클레오티드 기준)을 의미한다. 용어 "서열 동일성 %"는 비교 윈도우에서 최상으로 배열된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I)가 두 서열 모두에서 존재하는 위치의 번호를 결정하여 일치된(matched) 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 윈도우내 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나눈 후, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 구하여 산출한다. 본원 명세서에서 사용된 용어 "거의 동일"은 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 의미하는 용어로, 이 폴리뉴클레오티드는 20개 이상의 뉴클레오티드 위치의 비교 윈도우, 종종은 25-50 뉴클레오티드 위치의 윈도우에서 기준 서열과 비교하여 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것으로, 서열 동일성 %는 기준 서열을, 비교 윈도우에서 기준 서열의 총 20% 이하가 결실 또는 첨가된 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 산출한다. 기준 서열은 더 큰 서열, 예를 들면 도 1 또는 도 2에 제시된 서열의 서브세트일 수 있다.

폴리펩티드에 사용된 용어 "서열 동일성"은 펩티드들이 대응 위치에서 동일한 아미노산을 공유하는 것을 의미한다. 용어 "서열 유사성"은 펩티드가 대응 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산(즉, 보존성 치환)을 가지는 것을 의미한다. 용어 "거의 동일"은 두 펩티드 서열이 최상으로 배열되었을 때, 예를 들면 기정값 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성(예, 99% 서열 동일성)을 공유하고 있는 것을 의미한다. 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 달라진 것이 바람직하다. 용어 "거의 유사"는 두 펩티드 서열이 대응 %의 서열 유사성을 공유하고 있는 것을 의미한다.

용어 "거의 정제된"은 대상 종이 존재하는 주된 종(즉, 몰 기준으로 조성물내 다른 개별 종에 비해 보다 다량인 종)인 것을 의미하며, 거의 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 고분자종의 약 50% 이상(몰 기준)을 차지하는 조성물인 것이 바람직하다. 거의 정제된 조성물이 조성물내에 존재하는 모든 고분자종의 약 80 내지 90% 이상을 차지하는 것이 일반적이다. 대상 종이 거의 동질인(통상의 검출 방법으로는 조성물에서 오염 종을 검출할 수 없는) 상태로 정제되어, 조성물이 거의 단일 고분자종으로만 이루어진 것이 가장 바람직하다.

아미노산 치환을 보존성 또는 비보존성으로 분류할 목적으로, 아미노산은 다음과 같이 구분된다: I군(소수성 측쇄): 노르류신, met, ala, val, leu, ile: II군(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr: III군(산성 측쇄): asp, glu: IV군(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg: V군(쇄 배향에 영항을 주는 잔기): gly, pro: 및 VI군(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존성 치환으로는 동일군내에 속하는 아미노산간의 치환을 포함한다. 비-보존성 치환은 이들 군의 한 일원으로부터 다른 군의 일원으로 교체하는 것을 말한다.

면역글로불린의 성숙된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산은 각각 Hx 및 Lxx으로 명시되며, 이때 x는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) and (1991) (이하, "Kabat et al."으로 총칭하며, 상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]의 방안에 따라 아미노산의 위치를 나타내는 번호이다. 문헌[Kabat et al.]은 각 아군(subclass)에 대한 항체에 대한 다수의 아미노산 서열을 제시하고 있으며, 그 아군내 각 잔기 위치에 대해 가장 보편적으로 존재하는 아미노산을 제시하고 있다. 문헌[Kabat et al.]에서는 제시된 서열내에 각 아미노산에 잔기 번호를 배정하는 방법을 사용하고 있으며, 이러한 잔기 번호 배정 방법은 당해 기술분야에서는 표준화된 것이다. 문헌[Kabat et al.]에서의 방안은 당해 항체를 상기 문헌에서의 공통 서열 중 하나와 배열함으로써 명세포에 포함되지 않은 다른 항체에까지 연장할 수 있다. 문헌[Kabat et al.]의 번호 매김 시스템을 사용하면, 상이한 항체내에 동등 위치에서의 아미노산을 규명하는 것이 용이하다. 예를 들면, 인체 항체의 L50 위치에서의 아미노산은 마우스 항체의 아미노산 위치 L50와 동등한 위치를 점유하고 있다.

상세한 설명

1. VLA-4에 특이적인 인체화된 항체

본 발명의 한 구체예에서, VLA-4의 알파-4 서브유니트에 특이적인 인체화된 면역글로불린(또는 항체)이 제공된다. 인체화된 면역글로불린은 인체 면역글로불린(수령체 면역글로불린으로 지칭됨)으로부터 대부분이 유래된 가변 프레임워크 영역 및 mu MAb 21.6으로 지칭되는 마우스 면역글로불린(공여체 면역글로불린)으로부터 대부분이 유래된 상보성 결정 영역을 가지고 있다. 또한 불변 영역(들)은, 존재하는 경우, 인체 면역글로불린으로부터 대부분 유래된다. 인체화된 항체는 VLA-4에 대해 10⁷, 10⁸, 10⁹또는 10¹⁰M^-1이상의 특이적 결합 친화력을 나타낸다. VLA-4에 대한 인체화된 항체의 결합 친화력의 상한치는 보통 mu MAb 21.6의 3또는 5배 이내(약 10⁹M^-1)이다. 결합 친화력의 하한치 또한 mu MAb 21.6의 3 또는 5배 이내이다.

A. 면역글로불린의 일반 특성

기본적인 항체 구조 유니트는 사량체(tetramer)를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각 사량체는 두개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되어 있으며, 각쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함하고 있다. 각 쇄의 카르복시-말단부는 주로 효과 인자 기능을 담당하는 불변 영역을 이룬다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이에 따라 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 항체 이소타입을 규정하고 있다. 경쇄와 중쇄에 있어, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로된 "J" 영역에 의해 연결되어 있으며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로된 "D" 영역을 포함하고 있다[참조, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N Y., 1989), Ch. 7 (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)].

각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항원 결합 부위를 형성한다. 이 쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)으로된 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 쇄로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 배열되어 있으며, 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. CDR 및 FR 잔기는 상기 문헌[Kabat et al.]의 표준 서열 정의에 따라 표시되어진다. 대안의 구조 규정 방안이 Chothia 등의 문헌[Chothia et al., J. Mol, Biol. 196:901-917 (1987); Nature 342:878-883 (1989); 및 J. Mol. Biol. 186:651-663 (1989) (이하 "Chothia et al."로 총칭하며, 상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]에서 제안된 바있다. 프레임워크 위치는 상기 문헌[Kabat et al.]에서와 같이 규정하고 구조적 루프 위치는 상기 문헌[Chothia et al.]에서와 같이 규정할때, 마우스 항체내에 존재하는 아미노산은 보통 인체화된 항체내로 통합된다.

B. 인체화된 항체의 생성

(1) 마우스 MAb 21.6

인체화된 항체를 생성하기 위한 출발 물질은 mu MAb 21.6이다. 이를 간단히 설명하면, mu MAb 21.6은 VLA-4의 알파-4 서브유니트에 특이적이며, 종양 괴사 인자로 자극된 래트 대뇌 세포의 조직 배양물에 대한 인체 임파구의 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌다. mu MAb 21.6 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호하는 cDNA의 클로닝과 서열분석에 대해서는 하기 실시예 1에 기술되어 있으며 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열은 도 1 및 도 2에 제시되어 있다. 이들 도면은 또한 아미노산 암호 서열을 프레임워크 및 상보성 결정 도메인으로 소분할하는 것을 설명하고 있다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 둘다 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함하고 있다. 각 도메인에 대한 아미노산 배열은 상기 문헌[Kavatet al.]의 통상적인 번호매김에 따른다.

(2) 프레임워크 잔기를 공급하기 위한 인체 항체의 선택

인체 가변 도메인 프레임워크내로의 마우스 CDR의 치환은 인체 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 유래한 마우스 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 입체형상을 채택할 경우 그 결과 그 올바른 공간 배향을 유지할 가능성이 가장 높다. 이는 CDR이 유래된 쥐의 가변 프레임워크 도메인과 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 프레임워크 서열을 보유한 인체 항체로부터 인체 가변 도메인을 수득함으로써 달성된다. 중쇄와 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인체 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인체 항체 서열은 자연상에 존재하는 인체 항체의 서열일 수 있거나 또는 여러 인체 항체의 공통 서열일 수 있다[참조, Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991): Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)].

적합한 인체 항체 서열은 마우스의 가변 영역의 아미노산 서열을 기지의 인체 항체 서열과 컴퓨터로 비교함으로써 규명된다. 이 비교는 중쇄와 경쇄에 대해 분리되어 시행하지만, 그 원리는 각각에 대해 유사하다. 이러한 비교 결과, mu 21.6 경쇄는 인체 경쇄의 아형 카파 1과 최대의 서열 동일성을 나타내며, mu 21.6 중쇄는 상기 문헌[Kabat et al.]에서 규명된 인체 중쇄의 아형 중 일종과 최대의 서열 동일성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 경쇄와 중쇄 인체 프레임워크 영역은 보통 이들 아형의 인체 항체로부터 유도해 내거나 또는 이러한 아형의 공통 서열로부터 유도해낸다. mu MAb 21.6으로부터의 대응 영역과 최대의 서열 동일성을나타내는 바람직한 경쇄와 중쇄 인체 가변 영역은 각각 항체 RE1과 21/28'CL로부터 유도된다.

(3) 컴퓨터 모델링

쥐의 CDR 영역을 인체 가변 프레임워크 영역에 인위적으로 근접위치시키면 부자연스러운 입체형상 제한이 이루어져, 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 보정되지 않는한 결합 친화력을 잃게되는 결과를 초래할 수 있다. 치환용 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로는 컴퓨터 모델링에 의해 결정된다. 면역글로불린 분자의 입체적 영상을 생성시키는 컴퓨터 하드웨어와 소프트웨어를 폭넓게 이용할 수 있다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 쇄나 그 도메인중 해명된 구조로부터 출발하여 산출한다. 모델링하고자 하는 쇄를 입체 구조가 분석된 쇄나 도메인과 아미노산 서열 유사성에 대해 비교하고, 최대의 서열 유사성을 나타내는 쇄나 도메인을 분자 모델의 구성에 출발점으로 선택한다. 예를 들어, mu MAb 21.6의 경쇄의 경우, 프레임 워크 영역, CDR1 및 CDR2 영역을 모델링하기 위한 출발점은 인체 경쇄 RE1이었다. CDR3 영역의 경우, 출발점은 상이한 인체 항체 HyHEL-5의 경쇄로 부터의 CDR3 영역이었다. 분석된 출발 구조체를 변형시켜 모델링하고자 하는 면역글로불린 쇄나 도메인내 실제 아미노산 및 출발 구조체내 실제 아미노산 간에 차이를 용인하도록 한다. 이후, 변형된 구조체를 복합 면역글로불린으로 어셈블리한다. 최종적으로, 에너지를 최소화함으로써 그리고 모든 원자가 서로로부터 적당한 거리이내에 있고, 또 결합 길이와 각도가 화학적으로 허용되는 한계치 이내에 있음을 입증함으로써 모델을 개선시킨다. 실시예 4는 mu MAb 21.6의 가변 영역에 대한 3차원컴퓨터 모델을 생성하기 위해 취하는 단계를 상세히 기술한 것으로, 모델은 도 5에 제시되어 있다. 이 모델은 인체 프레임워크 구조체내에 치환된 mu MAb 21.6 상보성 결정 영역을 포함하는 항체의 입체 구조체를 추정하기 위한 출발점으로 제공할 수 있다. 이하 후술되는 추가의 아미노산 치환이 도입될 때는, 이 구조체를 나타내는 추가의 모델을 구성할 수 있다.

(4) 아미노산 잔기의 치환

전술한 바와 같이, 본 발명의 인체화된 항체는 인체 면역글로불린으로부터 대부분이 유래된 가변 프레임워크 영역과 mu MAb 21.6로 불리는 마우스 면역글로불린으로부터 대부분이 유래된 상보성 결정 영역을 포함하고 있다. mu MAb 21.6의 상보성 결정 영역 및 적당한 인체 수용체 면역글로불린을 규명한 후, 그 다음 단계는 존재하는 경우 결과물인 인체화된 항체의 특성을 최상으로 하기 위해 이들 성분으로부터의 잔기를 치환해야 하는지를 결정하는 것이다. 일반적으로 쥐의 잔기를 도입하면 인체 내에서 HAMA 응답반응을 유도하는 항체의 위험성이 증가되기 때문에, 인체 아미노산 잔기를 쥐의 것으로 치환하는 것은 최소화해야 한다. 치환용 아미노산은 CDR 입체형상 및/또는 항원에 대한 결합에 미치는 가능성 있는 영향을 고려하여 선택한다 이러한 가능성 있는 영향에 대한 연구는 모델링, 특정 위치에서의 아미노산 특성의 조사 또는 특정 아미노산의 치환이나 돌연변이유발의 효과에 대한 실험적 관찰에 의해 이루어진다.

mu MAb 21.6 가변 프레임워크 영역과 동등한 인체 가변 프레임워크 영역간의 아미노산이 상이할 때, 인체 프레임워크 아미노산은 보통 동등한 마우스 아미노산으로 치환해야 하는데 그 조건은 다음과 같다:

(1) 항원에 직접 비공유 결합하는 아미노산(예, mu MAb 21.6의 위치 L49, L69에서의 아미노산),

(2) CDR 영역에 인접해 있거나, 상기 문헌[Chothia et al.]에서 제안된 바와 같이 대안의 규정하에서 CDR 영역의 일부이거나 또는 그렇지 않으면 CDR 영역과 상호작용하는 아미노산(예, CDR 영역의 약 3Å 이내인 아미노산) (예, mu MAb 21.6의 위치 L45, L58, H27, H28, H29, H30 및 H71에서의 아미노산) 또는

(3) V_L-V_H접촉면에 있는 아미노산(예, mu MAb 21.6의 위치 H44에서의 아미노산).

치환용의 다른 후보는 해당 위치에서 인체 면역글로불린에 대해 통상적이지 않은 수령체 인체 프레임워크 아미노산(예, mu MAb 21.6의 위치 L104, L105 및 L107에서의 아미노산)이다. 이들 아미노산은 보다 통상적인 인체 면역글로불린의 동등 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다, 대안의 방안으로, 마우스 MAB 21.6내 동등 위치로부터의 아미노산이 동등 위치에서 인체 면역글로불린에 통상적인 것일때 인체 프레임워크 영역내로 도입될 수 있다.

일반적으로, 모두 또는 대부분이 상기 기준을 만족시키는 아미노산으로 치환되는 것이 요망된다. 그러나, 종종은 특정 아미노산이 상기 기준을 충족시키는지의 여부가 다소 모호할때가 있으며, 하나는 특정 치환을 가지나, 다른 것은 그렇지 않은 또다른 변이체 면역글로불린이 생성된다. 본 발명의 인체화된 항체는 일반적으로는 위치 L45, L49, L58 및 L69중 1, 2 또는 3개 이상 및 더욱 일반적으로는 4개 위치에서 대응 mu MAb 21.6 잔기로 인체 경쇄 프레임워크 잔기가 치환된 것을 포함한다. 인체화된 항체는 또한 일반적으로는 위치 H27, H28, H29, H30, H44 및 H71중 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상 및 가끔은 6개 위치에서 인체 중쇄 프레임워크 잔기가 치환된 것을 포함한다. 선택적으로는, H36이 치환될 수도 있다. 인체 경쇄 수령체 면역 글로불린이 RE1인 바람직한 구체예에 있어, 경쇄는 또한 위치 L104, L105 및 L107중 1 또는 2개 이상 및 더욱 일반적으로는 3개 위치에서 치환된 것을 포함한다. 이들 위치는 보다 통상적인 아미노산 잔기를 가진 인체 면역글로불린의 동등 위치로부터의 아미노산으로 치환된다. 치환에 적합한 아미노산이 도 6 및 도 7에 제시되어 있다.

인체화된 항체내 CDR 영역은 mu MAb 21.6 항체내 대응 CDR 영역과 일반적으로는 거의 동일하며, 더욱 일반적으로는 동일하다. 그러나, 종종은 CDR 영역내 잔기중 하나를 교체하는 것이 요구된다. 예를 들어, 실시예 5는 mu MAb 21.6 CDR3과 VCAM-1 리간드간의 아미노산 유사성을 규명하기 위한 것이다. 이 실시예에서는 인체화된 항체의 결합 친화력이 VCAM-1과 더욱더 가깝게 유사하도록 중쇄 CDR3 영영을 재고안함으로써 향상될 수 있음을 제시하고 있다. 따라서, CDR3 도메인으로부터의 하나 이상의 아미노산을 VCAM-1 결합 도메인으로부터의 아미노산으로 치환할 수 있다. 보통은 바람직하지 않지만, 종종은 결과물인 인체화된 면역글로불린의 결합 친화성에 크게 영향을 미치지 않으면서 CDR 잔기를 하나 이상의 보존성 아미노산으로 치환하는 것이 가능하다.

전술한 특정 아미노산 치환외에도, 인체화된 면역글로불린의 프레임워크 영역은 이것이 유래한 인체 항체의 프레임워크 영역과 일반적으로는 거의 동일하고, 더욱 일반적으로는 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내 다수의 아미노산은 항체의 특이성이나 친화성에 직접적인 영향을 거의 또는 전혀 주지 않는다. 따라서, 프레임 워크 잔기의 다수 개별적인 보존성 치환은 결과물인 인체화된 면역글로불린의 특이성이나 친화성을 크게 변화시키지 않으면서 허용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이러한 치환은 바람직하지 않다.

(5) 가변 영역의 생성

인체화된 면역글로불린의 CDR 및 프레임워크 성분을 개념적으로 선택하고, 이러한 면역글로불린을 제조하는데 각종 방법이 이용가능하다. 암호의 축퇴성 때문에, 다양한 핵산 서열이 각 면역글로불린의 아미노산 서열을 암호하게 된다. 목적하는 핵산 서열은 고체상 DNA 합성에 의해 새로이 합성하거나 또는 사전에 제조한 목적하는 폴리뉴클레오티드 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드-매개성 돌연변이유발은 표적 폴리펩티드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하는 바람직한 방법이다[참조, Adelman et al., DNA 2:183 (1983)]. 간단히 설명하면, 표적 폴리펩티드 DNA는 목적하는 돌연변이를 암호하는 올리고뉴클레오티드를 1본쇄의 DNA 주형에 하이브리드화시켜 변형시킨다. 하이브리드화후, DNA 폴리머라제를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 통합되고 표적 폴리펩티드 DNA내 선택된 변형을 암호하는, 주형의 제 2 상보성 가닥 전체를 합성한다.

(6) 불변 영역의 선택

전술한 바와 같이 생성된 인체화된 항체의 가변 분절은 면역글로불린 불면 영역(Fc)의 최소한 일부분, 통상적인 인체 면역글로불린의 최소한 일부분에 통상의 방법으로 결합시킨다. 인체 불변 영역 DNA 서열은 각종 인체 세포, 바람직하게는 무한 증식 B 세포로부터 공지 절차에 따라 분리할 수 있다[참조, 상기 Kabat et al.] 문헌 및 WO 87/02671) (상기 문헌 각각의 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]. 보통, 항체는 경쇄와 중쇄 불변 영역을 둘다 포함하고 있다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함하고 있다.

인체화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 모든 종류의 불변영역과 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 이소타입을 가진 항체를 포함하고 있다. 인체화된 항체가 세포독성 활성을 나타내는 것을 원하는 경우, 불변 도메인은 일반적으로 보체 고착 불변 도메인이며, 이 부류는 통상 IgG₁이다. 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우는, 불변 도메인은 IgG₂부류로 할 수도 있다. 인체화된 항체는 하나 이상의 부류나 이소타입으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.

(7) 발현 시스템

인체화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호하는 핵산을 때로는 불변 영역에 결합하여 발현 벡터내로 삽입한다. 경쇄와 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터내에 클로닝할 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호하는 DNA 분절을 면역글로불린 폴리 펩티드의 발현이 확실히 되도록 발현 벡터(들)내의 제어 서열에 작동가능 하도록 결합시킨다. 이러한 제어 서열로는 시그날 서열, 프로모터, 인헨서(enhancer) 및 전사 종결 서열이 포함된다. 발현 벡터는 통상 에피좀(episome)이나 숙주 염색체 DNA의 구성 부분으로서 숙주 유기체내에서 복제가능하다. 보편적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출할 수 있도록 선별 마커, 예를 들면 테트라사이클린이나 네오마이신을 포함하게 된다[참조, 미국 특허 제 4,704,362호].

이. 콜리(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 특히 유용한 원핵 세포 숙주의 일종이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주에는 바실러스[예, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus)] 및 장내세균[예, 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia)] 및 기타 슈도모나스(Pseudomonas)]종이 있다. 이들 원핵 세포 숙주의 경우에는, 통상 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열(예, 복제 기점)을 포함하는 발현 벡터를 제조할 수도 있다. 또한, 다수의 잘 알려진 각종 프로모터, 예를 들면 락토즈 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다 유래의 프로모터 시스템이 존재하게 된다. 통상 이들 프로모터는 선택적으로 오퍼레이터(operator) 서열과 함께 발현을 제어하며, 전사와 해독을 개시하고 완결하기 위해 리보좀 결합 부위 서열 등을 가지고 있다.

효모 같은 다른 미생물을 또한 발현에 사용할 수도 있다. 사카로마이세스(Saccharmyces)는 바람직한 숙주로, 바람직하게도 3-포스포글리세레라이트 키나제 또는 기타 해당작용 효소를 포함하는 프로모터, 및 복제 기점, 종결서열 등과 같은 발현 제어 서열을 갖는다.

미생물외에, 본 발명의 폴리펩티드를 발현 및 생성하는데 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하는 것도 가능하다[참조, Winnacker, From Genes to Clones(VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)]. 당해 기술분야에서 원형그대로의 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주 개발되었기 때문에 실제로는 진핵 세포가 바람직하며, 이러한 것으로는 CHO 세포주, 각종 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 미엘로마 세포주 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마가 포함된다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예를들면 복제기점, 프로모터 및 인헨서[Queen et al., Immunol. Rev, 89:49-68 (1986)], 및 필수 프로세싱 정보 부위, 예를 들면 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래한 프로모터이다.

관심있는 폴리뉴클레오티드 서열(예, 중쇄와 경쇄 암호 서열 및 발현 제어 서열)을 포함하는 벡터를 잘 알려진 방법(세포성 숙주의 유형에 따라 좌우됨)에 의해 숙주 세포내로 전달시킬 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에는 보편적으로 염화 칼슘 형질감염을 이용하는 반면, 다른 세포성 숙주에는 인산 칼슘 처리나 전기천공을 이용할 수 있다[참조, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) (상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]. 중쇄와 경쇄를 별개의 발현벡터상에클로닝하는 경우에는 벡터를 동시형질감염시켜 완전한 면역글로불린을 발현 및 어셈블리시킨다.

일단 발현되면, 본 발명의 완전한 항체, 그 이량체, 개별적인 경쇄와 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태를 황산 암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토 그래피, 겔 전기영동 등 당해 기술분야의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다[참조, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)]. 약학적 용도에 있어서는 균질성이 약 90 내지 95% 이상으로서 거의 정제된 면역글로불린이 바람직하며, 균질성이 98 내지 99% 이상인 것이 가장 바람직하다.

C. 인체화된 항체의 단편

본 발명의 다른 구체예에 있어서는, 인체화된 항체의 단편이 제공된다. 이들 단편은 VLA-4 항원에 대해, 통상 10⁷M^-1이상 및 더욱 통상적으로는 10⁸또는 10⁹M^-1의 친화력으로 특이적 결합을 나타낸다. 인체화된 항체 단편으로는 분리된 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc 및 Fv가 있다. 단편들은 재조합 DNA 기술에 의해서나 또는 완전한 면역글로불린의 효소 또는 화학적 분리에 의해 생성된다.

II. 핵산

인체화된 항체 및 그 단편은 일반적으로 핵산의 발현에 의해 생성된다. 본 출원에 기술된 인체화된 항체나 그 단편을 암호하는 모든 핵산은 본 발명내에 포함된다.

III. 컴퓨터

본 발명의 다른 양태에 의하면, 모니터상에 항체의 입체적 영상을 제시하도록 프로그래밍된 컴퓨터가 제공된다. 예를 들면, UNIX 작동 체계하에서 작동되고 분자 모델링 패키지 QUANTA(Polygen Corp. USA)를 이용하는 실리콘 그래픽스 IRIS 4D 워크스테이션이 적합하다. 인체화된 항체의 변이체 모델을 가시화하는 데에는 컴퓨터가 유용하다. 일반적으로 본 발명의 항체는 만족스러운 결합 친화성을 제공한다. 그러나, 특정 아미노산 잔기를 추가로 변이시킴으로써 보다 강력한 결합 친화성을 가진 항체를 동정할 수 있을 것으로 보인다. 또한 입체적 영상을 통해 다수의 중요하지 않은 아미노산을 규명할 수 있으며, 이러한 아미노산은 항체의 결합 친화성에 크게 영향을 미치지 않으면서 보존성 치환을 하는 대상이 될 수 있다. 총체적으로, 보존성 치환이라 하더라도 면역글로불린의 특성에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 다수의 개별적인 보존성 치환은 면역글로불린의 특성을 크게 손상시키지 않는 것으로 보인다.

IV. 인체화된 항체의 시험

본 발명의 인체화된 항체를 각종 분석에 의해 시험한다 이러한 것으로는 VLA-수용체를 보유한 세포에 대한 항체 결합의 존재나 강도를 검출하는 단순 결합 분석법이 있다. 또한, VLA-4 수용체를 보유한 세포가 VCAM-1 리간드를 발현하는 내피 세포와 상호작용하는 것을 차단할 수 있는 능력에 대해 항체를 시험한다. 내피 세포는 배양물에서 성장 및 자극시킬 수 있거나 또는 자연상에 존재하는 뇌 조직 절편의 성분일 수 있다[참조, Yednock et al., supra 및 USSN 07/871,223]. 또한, 인체화된 항체를 실험용 자가면역 뇌척수염(EAE)을 가진 실험실 동물에서 염증과후속 마비를 예방하거나 저하시킬 수 있는 능력에 대해 시험한다. EAE는 실험실 동물에게 미엘린 기저 단백질(myelin basic protein)에 특이적인 CD4⁺T-세포를 주사하거나 동물을 미엘린 기저 단백질로 직접 면역시킴으로써 유발된다. 이 단백질은 중추 신경계내에 위치하며, 반응성 T-세포는 다발성경화증에서 자가면역 응답반응을 유발시키는 방식으로 이 단백질을 포함하는 초(sheath)의 파괴를 야기한다[참조, Yednock et al., supra 및 공계류중인 USSN 07/871,223].

V. 약학 조성물

본 발명은 활성 치료제 즉, 인체화된 21.6 항체나 그 결합 단편, 및 각종 기타 성분을 포함하는 예방약 또는 치료약으로 사용되는 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용 방식에 따라 좌우된다. 조성물은 목적하는 제형에 따라, 동물이나 인체 투여용 약학 조성물을 제형화하는데 보편적으로 사용되는 부형제로 정의된 약학적으로-허용되는, 무-독성의 담체나 희석제를 포함할 수도 있다. 희석제는 배합물의 생체 활성에 영향을 주지 않도록 선택한다. 이러한 희석제의 일례로는 증류수, 생리 인산염-완충 식염수, 링게르액, 덱스트로즈액 및 행크스액이 있다. 또한, 약학 조성물이나 제형은 기타 담체, 보조제 또는 무독성의, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등이 포함될 수 있다.

VI. 진단 방법

인체화된 항체와 그 결합 단편은 VLA-4 수용체를 보유한 세포의 존재를 검출하는데 유용하다. 뇌 내 이러한 세포의 존재는 염증 응답반응을 진단하는 것으로후술되는 치료 방법의 시행이 필요함을 신호하는 것일 수 있다. 진단은 환자로부터 세포 샘플을 분리해냄으로써 달성될 수 있다. 이후, 샘플의 개별적인 세포내에서 발현된 VLA-4 항원의 양은 예를 들면 고착된 세포를 면역조직화학적으로 염색하거나 또는 세포 추출물을 인체화된 MAb 21.6 항체나 그 결합 단편으로 웨스턴 블로팅함으로서 측정한다.

진단은 또한 표지시킨 인체화된 MAb 21.6(또는 그 결합 단편)을 생체내로 투여하고 생체내 영상화에 의해 검색함으로써 달성될 수 있다. 인체화된 MAb 21.6의 투여 농도는 표적 항원을 가진 세포에 대한 결합이 배경 시그날과 비교하여 검출가능할 정도로 충분해야 한다. 진단 시약은 카메라 영상화용 방사선동위원소 또는 자기 공명이나 전자 스핀 공명 영상화용 상자성 동위원소로 표지할 수 있다.

세포 샘플내 또는 개체로부터 영상화된 VLA-4 단백질 농도의 변화(통상 증가)는 임상용으로 설정된 정상 농도 범위 밖이며, 샘플을 취한 개체내에서 원치않는 염증성 응답 반응이 존재함을 나타내는 것이고/것이거나 이 개체가 상기한 반응을 발생(또는 프로세싱)시키는 성향이 있음을 나타내는 것일 수 있다. VLA-4 단백질은 또한 특정 계통 및 발생 기원의 세포를 규명하고 분류하기 위한 분별 마커로서 사용할 수도 있다. 이러한 세포-유형의 특이적 검출은 원치않는 면역 응답반응의 조직 병리학적 진단에 사용할 수 있다.

VII. 치료 방법

본 발명은 또한 VLA-4 수용체의 α4-의존성 상호작용을 차단할 수 있는 인 체화된 MAb 21.6의 능력을 유도하는 치료 방법을 제공한다. VLA-4 수용체와 내피세포상의 VCAM-1 리간드와의 α4-의존성 상호작용은 다수의 염증성 응답반응, 특히 중추 신경계에서의 반응에서 초기에 일어나는 현상이다. 중추 신경계의 염증으로 인해 야기되는 원치않는 질환과 증세로는 발작 및 기타 대뇌 손상 같은 급성 질환, 및 다발성 경화증, 수막염 및 척수염 같은 만성 질환이 있다. 다발성 경화증은 미국에서만도 대략 250,000 내지 350,000명의 인구가 앓고 있는 진행성 신경적 자가면역 질환이다. 다발성 경화증은 특정 백혈구가 미엘린 즉, 신경 섬유를 덮고 있는 절연성 초의 파괴를 공격하고 개시하는 특이적인 자가면역 반응의 결과인 것으로 판단된다. 다발성 경화증의 동물 모델에 있어, 알파-4-베타-1 인테그린 지향성 쥐의 모노클로날 항체는 내피에 백혈구가 부착하는 것을 차단하여, 동물내에서 중추 신경계의 염증과 후속되는 마비를 예방하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 인체화된 MAb 21.6 항체는 동물 모델에서 효과적인 것으로 이미 밝혀진 마우스 항체보다 다음과 같은 측면에서 여러 잇점을 제공한다:

1) 인체 면역계는 외래물로서 인체화된 항체의 프레임워크나 불변 영역을 인식하지 않으며, 따라서 주입된 항체에 대한 항체 응답반응은 전적으로 외래의 마우스 항체나 또는 부분적으로 외래인 키메라형 항체 보다 작다.

2) 인체화된 항체의 효과인자 부분은 인체의 것이기 때문에, 인체 면역계의 기타 부분과 더 잘 상호작용할 수 있다.

3) 주입된 마우스 항체는 정상적인 인체 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 인체 순환내 반감기를 가지는 것으로 보고되었다[Shaw et al., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987)]. 주입한 인체화된 항체는 자연상에 존재하는 인체 항체와거의 같은 반감기를 가지며, 이는 더욱 작은 투여량 및 투여회수를 가능하게 한다.

전술한 약학 조성물은 다발성 경화증 또는 기타 염증성 질환, 특히 중추 신경체의 질환의 예방 및/또는 치료용으로 투여할 수 있다. 치료용으로 사용하는 경우는 조성물을 다발성 경화증 같은 질환을 이미 앓고 있거나 의심되는 환자에게, 상기 질환의 증세와 그 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 경감시키기에 충분한 양으로 투여한다. 이를 달성하는데 적합한 양을 치료 유효량 또는 약학 유효량으로 정의한다.

예방용으로 사용하는 경우는, 약학 조성물을 특정 질환에 걸리기 쉽거나 또는 그렇지 않으면 걸릴 위험성이 있는 환자에게, 질환의 위험성을 배제시키거나 저하시키거나 그 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양을 예방 유효량으로 정의한다. 증세의 차도가 있는 다발성 경화증 환자에게 있어, 그 위험성은 NMR 영상화에 의해 또는 몇몇 경우에 있어서는, 환자에 의해 관찰된 전조에 의해 평가할 수 있다.

약학 조성물은 예방약 및/또는 치료약으로서 에어로졸과 같은 것에 의해서 비경구, 국소, 정맥내, 경구 또는 피하, 근육내 또는 경피로 국소 투여한다. 약학 조성물은 투여 방법에 따라 각종 단위 투여형으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 투여형에는 분말, 정제, 환제, 캅셀 및 로젠지가 있다.

전술한 증세 치료를 위한 본 발명 조성물의 유효량은 투여 방식, 목표 부위, 환자의 생리적 상태 및 다른 투여 약제를 비롯하여 다수의 상이한 요인에 따라 달라진다. 따라서, 치료약 투여량은 안전성과 효능을 최상으로 하도록 조절할 필요가있다. 이들 조성물은 포유동물에게 수의용으로 그리고 인체에게 임상용으로 기타 치료제와 유사한 방식으로, 즉 생리적으로 허용되는 담체중에 넣어 투여할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 숙주의 체중 1 Kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 0.5 mg의 범위이다.

VIII. 기타 용도

또한, 인체화된 항체는 VLA-4 수용체의 친화성 정체에 유용하다. 항체를 고형 지지체에 고정시키고, 분산된 단백질 용액을 지지체에 통과시킨다. VLA-4가 지지체에 결합되며, 이에 의해 다른 단백질로부터 분리된다. 이 방법에 의해 이용가능한 정제된 VLA-4 또는 그 단편은 추가 항체를 생성하기 위한 면역원이나 백신으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 인체화된 항체는 예를 들면 동물을 인체화된 항체로 면역시킴으로써 이디오타입 항체를 생성시키는데 이용가능하기도 하다. 인체 항체와 결합이 VLA-4 또는 그 단편에 의해 억제되는 항-이디오타입 항체를 선별한다. 항-이디오타입 항체와 VLA-4 또는 그 단편 모두 인체화된 면역글로불린에 결합하기 때문에, 항-이디오타입 항체는 에피토프의 "내부 영상"을 나타낼 수 있으며, 따라서 VLA-4 수용체의 리간드 즉, VCAM-1을 치환할 수 있다.

본 발명은 VLA-4 리간드에 특이적으로 결합하는 인체화된 면역글로불린을 제공한다. 인체화된 항체는 인체화된 경쇄 및 인체화된 중쇄를 포함한다. 일체화된 경쇄는 마우스 21.6 면역글로불린 경쇄 중 대응하는 상보성 결정 영역으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 위치 L45, L49, L58 및 L69로 구성된 제 1 군중에서 선택된 하나 이상의 위치를 제외하고 인체 카파 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열로부터 유래한 가변 영역 프레임 워크를 포함하며, 이때 상기 아미노산 위치는 마우스 21.6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 프레임워크의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유되어 있다. 인체화된 중쇄는 마우스 21.6 면역글로불린 중쇄 중 대응하는 상보성 결정 영역으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 위치 H27, H28, H29, H30, H44 및 H71로 구성된 군중에서 선택된 하나 이상의 위치를 제외하고는 인체 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열로부터 유래한 가변 영역 프레임워크로 이루어져 있으며, 이때 상기 아미노산 위치는 마우스 21.6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유되어 있다. 면역글로불린은 약 10⁷M^-1의 하한치 및 마우스 21.6 면역글로불린 친화력의 약 5배 친화력의 상한치로 VLA-4에 특이적으로 결합한다.

보통은, 인체화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역 프레임워크는 각각 RE1 및 21/28' CL 가변 영역 프레임워크 서열로부터 유래한다. 인체화된 경쇄 가변 영역 프레임워크가 RE1로부터 유래한 경우는, 2개 이상의 프레임워크 아미노산이 치환된다. 하나의 아미노산은 전술한 제 1 군 위치로부터 유래된다. 다른 아미노산은 위치 L104, L105 및 L107로 구성된 제 3 군으로부터 유래된다. 이 위치는 RE1 이외의 인체 면역글로불린으로부터의 카파 경쇄의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유된다.

몇몇 인체화된 면역글로불린은 도 6에서 La 또는 Lb로 명시된 성숙된 경쇄 가변 영역 서열 또는 도 7에서 Ha, Hb 또는 Hc로 명시된 성숙된 중쇄 가변 영역서열을 가진다. 바람직한 인체화된 면역글로불린은 La 경쇄 및 Ha, Hb 또는 Hc 중쇄를 가지는 것이다.

본 발명은 또한 전술한 VLA-4에 대한 인체화된 면역글로불린의 결합 단편을 제공한다.

다른 양태에 있어, 본 발명은 전술한 VLA-4에 대한 인체화된 면역글로불린을 암호하는 핵산을 제공한다.

또한 전술한 마우스 21.6 항체 또는 인체화된 면역글로불린의 입체적 영상을 나타내도록 프로그램된 컴퓨터가 제공된다.

다른 양태에 의하면, 본 발명은 약학 조성물 및 이를 사용한 치료 방법을 제공한다. 이 약학 조성물은 전술한 인체화된 면역글로불린 또는 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 몇몇 치료 방법에서는, 치료 유효량의 약학 조성물을 다발성 경화증 같은 염증성 질환을 앓고 있는 환자에게 투여한다.

또한 전술한 인체화된 면역글로불린 및 결합 단편을 이용하여 VLA-4 항원을 검출하는 방법도 제공된다. 이 방법에서는, 인체화된 항체나 결합 단편을 환자 또는 환자의 조직 샘플에 투여한다. 항체나 단편과 샘플내에 존재하는 VLA-4간의 특이적 결합에 의해 형성된 복합체를 검출한다.

실시예 1: 마우스 21.6 가변 영역의 클로닝 및 서열분석

마우스 항-VLA 항체 21.6은 공계류중인 출원 USSN 07/871,223에 기술되어 있다. 마우스 21.6 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 분리했다. 키트(파마시아 바이오시스템스 리미티드)를 사용하여 제 1 가닥의 cDNA를 합성했다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 그 가변 영역들을 암호하는 서열의 외측에 인접해있는 서열에 하이브리드화하도록 고안된 PCR 프라이머를 사용하여 수득했고. 이로써 마우스 21.6 항체 가변 영역의 전체 암호 서열을 클로닝할 수 있게 되었다. 마우스 카파 경쇄 리더 서열 및 마우스 중쇄 리더 서열의 5'-말단에 하이브리드화하는 센스 PCR 프라이머는 42종의 마우스 카파 경쇄 리더 서열 및 55종의 마우스 중쇄 리더 서열[Johns & Bendig. Bio/Technology 9:88-89 (1991)(상기 문헌 전문은 모든 목적에 대해 본원 명세서에 참고로 인용된 것임)]로된 데이타베이스를 기초로 하여 디자인했다. 이 프라이머들은 마우스 불변 영역(카파 또는 감마)의 3'-말단에 하이브리드화하는 안티-센스 PCR 프라이머와 함께 사용했다.

일반적으로 100mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 200μM dNTP, 1.5mM MgCl₂, 1 유니트의 AmpliTaq(퍼킨 엘머 세투스) DNA 폴리머라제, 1μl cDNA 주형, 0.25μM MKV 프라이머 및 0.25μM 마우스 카파 경쇄 안티-센스 PCR 프라이머를 함유하는 반응액 50μ1중에서 마우스 21.6 카파 V_L영역을 PCR-증폭시켰다(도 1). 마우스 21.6 V_H영역은 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역에 특이적인 안티-센스 PCR 프라이머 및 MHVH프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 PCR-증폭시켰다(도 2). 각 PCR 반응물을 94℃에서 5분동안초기 용융시킨후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및, 72℃에서 2분간의 사이클로 25회 순환시켰다. 마지막 사이클을 완료한후, 72℃에서 10분동안 최종 신장단계를 수행했다. 프라이머-어니일링 단계와 신장 단계사이의경가 시간은 2.5분이었다. PCR 증폭 후, 각 반응물로부터 분취한 10μl를 에티디움-브로마이드 염색된 1.5% 아가로스 겔로 분석했다.

PCR 생성물은 "TA 클로닝 시스템"(인비트로겐 코포레이션)을 사용하여 클로닝했다. 정확한 크기의 삽입부를 함유하는 벡터를, 이중 가닥의 플라스미드 DNA 및 시쿼나제(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코포레이션)를 사용하여 서열분석 했다. PCR 증폭단계 중에 도입되었을 수도 있는 오류를 피하기 위해, 독립적으로 PCR-증폭 및 클로닝된 2 이상의 DNA 단편을 각각의 가변 영역에 대해 서열분석 했다.

PCR 생성물의 서열을 다른 마우스 경쇄 및 중쇄 가변 영역과 비교했다(참조, 표 1 및 표 2). 비교 결과, MKV2 및 MKV4 프라이머로부터 유래된 PCR 생성물이 본래의 마우스 21.6 카파 가변 영역을 나타내고, MHV1 및 MHV2 프라이머로부터의 PCR 생성물이 본래의 마우스 V_H영역을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 따라서, 그 생성물들의 서열들이 마우스 21.6 항체 가변 영역의 서열이라는 결론을 얻을 수 있었다. 마우스 21.6 V_L및 V_H영역을 암호하는 cDNA의 DNA 및 아미노산 서열은 도 1 및 도 2에 제시되어 있다.

[표 1]

마우스 21.6 경쇄 가변 영역과 다른 경쇄 가변 영역들의 비교

¹유사성 %는 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹의 "GAP" 프로그램을 사용하여 측정했다.

²공통 서열은 상기 문헌[Kabat et al.]의 것을 인용했다.

³RE1는 문헌[Palm et al., Hoppe-Seyler's Z. Physical. Chem. 356:167-191 (1975)]의해 서열분석된 바와 같다.

[표 2]

마우스 21.6 중쇄 가변 영역과 다른 중쇄 가변 영역들의 비교

²공통 서열은 상기 문헌[Kabat et al.]의 것을 인용했다.

³21/28'CL은 문헌[Dersimonian et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)]에 의해 서열분석된 바와 같다.

실시예 2: 키메라형 21.6 항체의 작제

키메라형 경쇄 및 중쇄는 마우스 21.6 V_L및 V_H영역의 PCR-클로닝된 cDNA를 인체 불변 영역에 연결시키므로써 작제했다. 마우스 cDNA 서열이 5'- 및 3'-말단을 특별히 고안된 PCR 프라이머를 사용하여 변형시켰다. 리더 서열의 개시부를 암호하는 DNA 서열에 하이브리드화하는 5'-말단 PCR-프라이머(표 3)를 고안하여 효과적인 해독에 필수적인 DNA 서열[Kozak J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)] 및 발현 벡터내로 클로닝시킬 수 있도록 하는 HindIII 제한부위를 생성시켰다. J 영역의 말단을 암호하는 DNA 서열에 하이브리드화하는 3'-말단 프라이머(표 3)를 고안하여 불변 영역에 스플라이싱시키는데 필수적인 DNA 서열을 형성시키고 발현 벡터내에 클로닝시킬 수 있도록 하는 BamHI 부위를 생성시켰다. PCR 증폭 생성물을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고 pUC19 벡터내로 클로닝시킨 뒤, 서열분석하여 PCR 증폭반응중에 어떠한 오류도 발생하지 않았음을 확인했다. 그 다음 채택된 마우스 21.6 가변 영역을 인체의 카파 또는 감마-1 불변영역을 함유하는 포유동물 세포 발현 벡터내로 서브클로닝시켰다(도 3).

[표 3]

키메라형 21.6 항체 작체용 PCR 프라이머

A. 경쇄 가변 영역

1. 5'-말단 재작제용 프라이머 (37량체) (서열 번호 18)

2. 3'-말단 재작제용 프라이머 (35량체) (서열 번호 19)

B. 중쇄 가변 영역

1. 5'-말단 작제용 프라이머 (37량체) (서열 번호 20)

2. 3'-말단 작제용 프라이모 (33량체) (서열 번호 21)

실시예 3 : 21.6 키메라형 항체의 발현 및 분석

키메라형 21.6 경쇄 및 중쇄를 암호하는 2개의 플라스미드 DNA를 Cos 세포내로 동시형질감염시켰다. 2일 또는 3일후, Cos 세포를 배양한 배지를, (1) 인체 IgG-형 항체 생산 및 (2) 상기 인체-형 항체가 인체 α4β1 인테크린을 표면상에 발현하는 L 세포에 결합하는 결합력에 대해 ELISA로 분석했다. 도 4 및 도 12는 정제된 마우스 21.6 항체 대조군을 비교용으로 하여 키메라형 21.6 항체의 정제되지 않은 샘플 및 단백질-A 정제된 샘플이 인체 α4β1 인테그린에 결합하는지의 분석 결과를 제시한 것이다. 이 도면들은 키메라형 21.6 항체가 항원에 잘 결합함을 나타내고 있고, 따라서 제대로된 마우스 21.6 V_L및 V_H영역이 클로닝되었음을 확인해주고 있다.

실시예 4: 마우스 21.6 가변 영역 구조의 모델링

마우스 21.6 항체의 V_L및 V_H영역의 분자 모델을 제작했다. 이 모델은 UNIX 작동 시스템하에서 작동하고 분자 모델링 패키지 QUANTA(미국에 소재하는 폴리겐 코포레이션 제품)를 사용하는 실리콘 그래픽스(Silicon Graphics) IRIS 4D 워크스테이션에서 제작했다. 마우스 21.6 V_L영역의 FR 구조는 분석된 인체 벤스-존스 면역글로불린 RE1[Epp et al., Biochemistry 14:4943-4952 (1975)]의 구조를 기초로 한 것이고, 마우스 21.6 V_H영역의 FR 구조는 분석된 마우스 항체 Gloop 2 구조를 기초로 한 것이다. FR 내의 동일한 잔기는 유지시켰고; 동일하지 않은 잔기는 QUANTA 내의 설비를 이용하여 치환시켰다. 마우스 21.6 V_L영역의 CDR1 및 CDR2는 각각 정규 구조 2군 및 1군에 속하는 것으로서 확인되었다[Chothia et al., 상기 문헌]. RE1의 CDR1 및 CDR2가 동일한 정규 군에 속하므로, 마우스 21.6 V_L영역의 CDR1 및 CDR2 구조는 RE1의 CDR1 및 CDR2의 구조 상에서 설계되었다. 마우스 21.6 V_L영역의 CDR3은 V_L영역의 CDR3에 대해 어떠한 정규 구조 군에도 대응하지 않는것으로 나타났다. 그러나, 데이타베이스를 조사한 결과, 마우스 21.6 V_L영역내의 CDR3가 마우스 HyHEL-5 V_L영역내의 CDR3과 유사한 것으로 나타났다[Sheriff er al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8075-8079 (1987)]. 따라서, 마우스 21.6 V_L영역의 CDR3은 마우스 HyHEL-5 V_L영역내의 CDR3의 구조 상에서 설계되었다. 마우스 21.6 V_H영역의 CDR1 및 CDR2는 각각 정규 구조 1군 및 2군에 속하는 것으로서 확인되었다. 마우스 21.6 V_H영역의 CDR1은 V_H영역의 CDR1에 대해 정규 1군의 일원들과 매우 유사한 Gloop2 V_H영역의 CDR1 상에서 설계되었다. 마우스 21.6 V_H영역의 CDR2는 또한 V_H영역의 CDR2에 대해 정규 2군의 일원이기도 한 마우스 HyHEL-5[Sheriff et al., 상기 문헌]의 CDR2 상에서 설계되었다. V_H영역의 CDR3에 대해서는 어떠한 정규 구조도 없었다. 그러나, 마우스 21.6 V_H영역내의 CDR3은 마우스 R19.9 V_H영역내의 CDR3과 유사하였고[Lascombe et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:607-61:1 (1989)], 따라서 마우스 R19. 9 V_H영역의 CDR3 루프의 정상에 존재하는 과잉의 세린 잔기를 제거하고 그 갭을 어니일링 및 정련하므로써 상기 CDR3 상에서 설계되었다. 마지막으로, 바람직하지 못한 원자 접촉을 줄이고 반데르 발스 및 정전기 상호작용을 최적화 하기 위해 QUANTA에서 수행되었던 바와 같이, CHARMM 전위[Brooks et al., J. Comp. Chem. 4:187-217 (1983)]를 사용하여 상기 모델에대해 급강하 및 컨쥬게이트 구배 에너지를 최소화 하는 처리를 했다.

마우스 21.6 가변 영역의 구조적 모델은 도 5에 제시되어 있다. 이 모델을 사용하면 인체화된 21.6 항체 가변 영역의 고안을 정련하는데 도움을 준다.

실시예 5: 재구성된 인체 21-6 가변 영역의 고안

(1) 프레임워크 서열용으로 상동성인 인체 항체의 선택

마우스 21.6의 FR과 높은 동일성 비율을 나타내는 FR을 지닌 인체 가변 영역을 아미노산 서열 비교로 규명하였다. 표 4 및 5는 마우스 21.6 가변 영역을 모든 공지의 마우스 가변 영역과 비교한 다음 모든 공지의 인체 가변 영역과 비교한 것이다 마우스 21.6 V_L영역은 상기 문헌[Kabat et al.]에서 정의된 바와 같은 마우스 카파 V_L영역 아군 5에 속하는 것으로 확인되었다. 개개의 마우스 카파 V_L영역은 마우스 21.6 카파 V_L영역(38C13V'CL 및 PC613'CL)과 93.4% 정도의 높은 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 마우스 21.6 V_L영역은 상기 문헌[Kabat et al.]에서 정의된 바와 같은 인체 카파 V_L영역의 아군 1과 가장 유사하였다. 개개의 인체 카파 V_L영역은 마우스 21.6 카파 V_L영역과 72.4% 정도의 높은 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 가장 유사한 인체 가변 영역들중의 일종인 RE1로부터의 프레임워크 영역(FR)을 사용하여 재구성된 인체 21.6 V_L영역을 고안하였다. 마우스 21.6 V_H영역은 상기 문헌[Kabat et al.]에서 정의된 바와 같은 마우스 V_H영역 아군 2c에 속하는 것으로 확인되었다. 개개의 마우스 중쇄 가변 영역들은 마우스 21.6 V_H영역(17.2.25'CL 및 87.92.6'CL)과 93.3% 정도의 높은 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 마우스 21.6 V_H영역은 상기 문헌[Kabat et al.]에서 정의된 바와 같은 인체 V_H영역의 아군 1과 가장 유사하였다. 개개의 인체 V_H영역은 마우스 21.6 V_H영역과 64.7% 정도의 높은 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 가장 유사한 인체 가변 영역들중의 일원인 21/28'CL로부터의 FR을 사용하여 재구성된 인체 21.6 V_H영역을 고안하였다.

(2) 프레임워크 영역내 아미노산의 치환

(a) 경쇄

재구성된 인체 21.6 V_L영역을 고안하는 과정에 있어서의 다음 단계는 마우스 21.6 V_L영역으로부터의 CDR을 인체 RE1으로부터의 FR에 연결시키는 것이었다[Palm et al., 상기 문헌]. 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 1 변형체(La)의 경우, 인체 FR내에서 7 변화가 이루어졌다(표 4, 도 6).

FR4내의 위치 104, 105, 및 107에 있는, RE1 유래의 아미노산이 다른 인체 카파 경쇄로부터 유래한 보다 일반적인 인체 J 영역의 아미노산으로 치환되었다[Riech mann et al., Nature 332:323-327 (1988)].

FR2내의 위치 45에서, RE1내에 정상적으로 존재하는 리신은 마우스 21.6 V_L영역내의 해당 위치에서 발견되는 아르기닌으로 변화되었다. 이 위치의 아미노산잔기는 마우스 21.6 V_L영역의 CDR2 루프를 지지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

FR2내의 위치 49에서, RE1중에 정상적으로 존재하는 티로신은 마우스 21.6 V_L영역내의 해당 위치에서 발견되는 히스티딘으로 변화되었다. 마우스 21.6 V_L영역내의 해당 위치에 있는 히스티딘은 모델내에서 결합 부위치 중간에 위치하는 것으로 관찰되었으며, 따라서 항체-항원 결합중에 항원과 직접 접하는 것으로 보인다.

FR3내의 위치 58에서, RE1내에 정상적으로 존재하는 발린은 마우스 21.6 V_L영역내의 해당 위치에서 발견되는 이소로이신으로 변화되었다. 이 위치의 아미노산 잔기는 마우스 21.6 V_L영역의 CDR2 루프를 지지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

FR3내의 위치 69에서, RE1중에 정상적으로 존재하는 트레오닌은 마우스 21.6 V_L영역내의 해당 위치에서 발견되는 아르기닌으로 변화되었다. 마우스 21.6 V_L영역내의 상기 위치에 있는 아르기닌은 모델내에서 마우스 21.6 V_L영역의 CDR1 루프에 인접하여 위치하는 것으로 관찰되었고, 따라서 항체-항원 결합중에 항원과 직접 전하는 것으로 보인다.

재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 2 변형체(Lb라고 지칭함)는 RE1의 FR2내의 위치 49가 변화되지 않는 것을 제외하고는 전술한 바와 동일한 치환을 함유하는 것으로 고안했다(도 6).

(b) 중쇄

재구성된 인체 21.6 V_H영역을 고안하는 과정에 있어서의 다음 단계는 마우스 21.6 V_H영역으로부터의 CDR을 21/28'CL으로부터의 FR과 결합시키는 것이었다[Dersimonian et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)]. 재구성된 인체 21.6 V. 영역의 제 1 변형체(Ha)의 경우, 인체 프레임워크 영역 내에서 5 변화가 이루어졌다(표 5, 도 7). 인체 FR내에 있어서 5 변화는 위치 27, 28, 29, 30 및 71에서 이루어졌다.

FR1내의 위치 27, 28, 29 및 30에서, 인체 21/28'CL 내에 존재하는 아미노산은 마우스 21.6 V_H영역내의 그 위치들에서 발견되는 아미노산으로 변화되었다. 이 위치들은 FR1내에 존재하는 것으로 나타나고 있지만(Kabat et al. 상기 문헌), 위치 26 내지 30은 V_H영역의 CDR1 루프를 형성하는 루프 구조의 일부분이다. 따라서, 이 위치들의 아미노산은 항원으로의 결합에 직접 관여하는 것으로 보인다. 게다가, 위치 27 내지 30은 상기 문헌[Chothia et al.]에서 정의된 바와 같은 V_H영역의 CDR1의 정규 구조의 일부분이다.

FR3내의 위치 71에서, 인체 21/28'CL 내에 존재하는 아르기닌은 마우스 21.6 V_H영역내의 해당 위치에서 발견되는 알라닌으로 변화되었다. 위치 71은 상기 문헌[Chothia et al.]에서 정의된 바와 같은 V_H영역의 CDR2의 정규 구조의 일부분이다. 마우스 21.6 가변 영역의 모델로부터 확인되는 바와 같이, 위치 71에 있는 알라닌은 V_H영역의 CDR2 루프를 지지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이 위치에 있는 알라닌을 아르기닌으로 치환시키면 CDR2 루프의 배치를 붕괴시킬 가능성이 높다.

재구성된 인체 21.6 V_H영역의 제 2 변형체(Hb)는 전술한 변형체 Ha의 5 변화외에도 FR2내에 하나의 추가적인 변화가 이루어졌다.

FR2내의 위치 44에서, 인체 21/28'CL 내에 존재하는 아르기닌은 마우스 21.6 V_H영역내의 해당 위치에서 발견되는 글리신으로 변화되었다. V_L-V_H영역의 패킹 및 마우스 21.6 가변 영역의 모델에 대해 공개된 정보를 기초로 하여 살펴볼 때, 위치 44의 아미노산 잔기는 V_L-V_H영역의 패킹에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다[Chothia et al. 상기 문헌](도 5).

재구성된 인체 21.6 V. 영역이 변형체 Hc는 인체 VCAM-1과 보다 유사한 CDR3 루프 외형을 갖도록 고안했다. 마우스 21.6 항체 및 인체 VCAM-1은 둘다 α4β1 인테그린에 결합한다. 항체의 V_H영역의 CDR3 루프는 6개의 CDR 루푸중에서 가장 다양하고 일반적으로 항체-항원 상호작용에 있어 항체의 가장 중요한 단일 성분이다[Chothia et al., 상기 문헌: Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457-4461 (1992)]. 마우스 21.6 V_H영역의 CDR3과 인체 VCAM-1의 아미노산 86 내지 94 사이,특히 CDR3 루프내의 YSN(티로신-글리신-아스파라긴) 서열과 VCAM-1내의 FGN(페닐알라닌-글리신-아스파라긴) 서열 사이에 약간의 서열 유사성이 확인되었다. 이 서열들은 각종 세포 부착에 중요한 RGD(아르기닌-글리신-아스파르트산) 서열과 관련이 있는 것으로 사료된다[Main et al., Cell 71:671-678 (1992)]. 따라서, CDR3내의 위치 98에서, 마우스 21.6 V_H영역내에 존재하는 티로신은 인체 VCAM-1의 서열내에서 발견되는 페널알라닌으로 변화되었다.

FR2내의 위치 36에서의 치환 가능성 또한 고려되었다. 마우스 21.6 V_H쇄는 FR2내의 위치 36에 있는 비통상적인 시스테인 잔기를 함유하고 있다. FR2내의 이 위치는 보통 관련 마우스 및 인체 서열내에서는 트립토판이다(표 5). 시스테인 잔기는 종종 항체의 입체형상에 중요한 역할을 하기도 하지만, 마우스 21.6 가변 영역의 모델에 따르면 이 시스테인 관기는 항원 결합에 직접 또는 간접적으로 관여하지 않으므로, 인체 21/28'CL V_H영역의 FR2내에 존재하는 트립토판은 인체화된 21.6 항체의 3가지 모든 변형체내에서 치환되지 않은 상태로 두었다.

실시예 6: 재구성된 인체 21.6 항체의 작제

재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 1 변형체(resh21.6VLa)는 대부분 문헌[Daugherty et al., Nucleic Acids Res. 19:2471-2476 (1991)]에 기술된 바에 따라, PCR 단편들을 중첩시키므로써 작제했다(참조, 도 8). 실시예 2에 기술된 바와 같이 채택되고 pUC19내로 삽입된 마우스 21.6 V_L영역을 주형으로 사용했다. 4쌍의 프라이머, APCR1-vla1, vla2-vla3, vla4-vla5 및 vla6-vla7을 합성했다(표 6 및 도 8). 인접 염기 쌍들은 21개 이상의 염기들로 중첩되어 있었다. APCR1 프라이머는 pUC19 벡터에 상보적이다. 적절한 프라이머 쌍(0.2 μmoles)을 10ng의 주형 DNA 및 1 유니트 AmpliTaq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머 세투스)와 함께, 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 200μM dNTP 및 1.5mM MgCl₂를 함유하는 PCR 완층약 50μl중에서 혼합했다. 각 반응을 25 사이클 실시했다. 94℃에서 5분동안 초기 용융시킨 후, 반응 사이클은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분이었고, 마지막으로 72℃에서 추가 10분동안 항온처리했다. 프라이머-어니일링 단계 및 신장 단계사이의 경과시간은 2.5분이었다. 1차 PCR 반응으로부터의 4개 반응의 생성물(A, B, C 및 D)을 페놀 추출하고 에탄올 침전시켰다.

[표 6]

재구성된 인체 21.6 가변 영역 작제용 PCS 프라이머

A. 경쇄 가변 영역

1. 변형체 "a" 합성용 프라이머

2. 변형체 "b" 합성용 프라이머

B. 중쇄 가변 영역

1. 변형체 "a" 합성용 프라이머

C. 중쇄 및 경쇄 가변 영역

PCR 생성물 A와 B, 및 C와 D를 2차 PCR 반응에서 연결했다. PCR 생성물 A와 B, 및 C와 B(각각 50ng)를 50μl의 PCR 반응물(전술한 것)에 첨가하고 전술한 바와같이 20 사이클로 증폭시켰으며, 단 어니일링 온도는 60℃로 상승시켰다. 이 반응의 생성물을 E및 F라 지칭한다. 사용된 PCR 프라이머 쌍은 각각 APCR1-vla3 및 vla4-vla7 이었다. PCR 생성물 E 및 F를 페놀 추출하고 에탄올 침전시킨 다음, 말단 프라이머로서 APCR1 및 vla7을 사용하여 전술한 것과 유사한 2단계 PCR 반응으로 그 자체의 상보성에 따라 3차 PCR 반응으로 어셈블리시켰다. 리더 서열을 함유하는 재구성된 인체 21.6 V_L영역 전체를 나타내는 완전하게 어셈블리된 단편을 HindIII 및 BamHI으로 절단해시키고 pUC19내로 클로닝시켜 서열분석했다. 정확한 서열을 갖는 클론을 resh21.6VLa로 명명하였다.

재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 2 변형체(Lb)는 문헌[Kamman et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)]에 기술된 방법에 따라 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 1 변형체(La)내에서 소폭 변형만 이루어지도록 PCR 프라이머를 사용하여 작제했다. 2 세트의 프라이머를 합성했다(표 6). 각 PCR 반응은 전술한 것과 동일한 조건하에서 대부분 실시되었다. 1차 PCR 반응에서, 돌연변이유발 프라이머 21.6VLb2를 사용하여 StyI 부위를 파괴시켜(Thr-ACC-97이 Thr-ACA-97로 됨), resh21.6VLa2를 생성시켰다. 그 다음, 2차 PCR 반응에서는, 돌연변이유발 프라이며 21.6VLb1 (His-49가 Tyr-49로 됨)를 주형 DNA로서의 pUC-resh21.6VLa2와 함께 사용했다. PCR 생성물을 StyI 및 BamHI으로 절단하고 pUC-resh21.6VLa2내로 서브클로닝하고 동일한 제한 효소로 절단했다. 정확한 서열을 지닌 클론을 pUC-resh21.6VLb로 명명했다.

재구성된 인체 21.6 V_H영역의 변형체 "a"는 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 변형체 "a"의 작제에 대해 기술한 것과 동일한 방법으로 작제했다(표 6 및 도 9). 재구성된 인체 425 V_H영역의 변형체 "g"[Kettleborough et al., 상기 문헌] 및 재구성된 인체 AUK12-20 V_H영역의 변형체 "b"를 암호화하는 HindIII-BamHI DNA 단편들을 PUC19 벡터내로 서브블로닝하여 각각 pUC-resh425g 및 pUC-reshAUK12-20b를 생성시켰다 (AUK12-20의 변형체 "b"는 문헌[Kettleborough et al., 상기 문헌]에 기술된 단편 V_Ha425의 PCR 돌연변이유발에 의해 유도되며, 다음과 같은 아미노산 서열(서열 번호 41)을 암호한다.

(스페이스는 FR 및 CDR 영역을 분리함).

플라스미드 pUC-resh425g 및 pUC-reshAUK12-20b, 뿐만 아니라 키메라형 21.6 중쇄를 작제하는데 사용하기 위해 변형시킨 마우스 21.6 V_H영역을 함유하는 pUC 벡터(PUC-chim21.6VH)를 후속 PCR 반응에서 주형 DNA로 사용했다. PCR 프라이머는 재구성된 인체 21.6 V_H영역의 변형체 "a"의 작제용으로 고안되고 합성되었다(표 6).PCR 생성물 A(도 9)는 DNA 주형으로서 pUC-reshAUK12-20b를 사용하고, PCR 프라이머 쌍으로서 APCR1-vha1을 사용하여 수득했다. PCR 생성물 B 및 D는 DNA 주형으로서 pUC-chim21.6VH를 사용하고 PCR 프라이머 쌍으로서 각각 vha2-vha3 및 vha6-APCR4를 사용하여 수득했다. 마지막으로, PCR 생성물 C는 DNA 주형으로서 pUC-resh425g를 사용하고 PCR 프라이머 쌍으로서 vla4-vla5를 사용하여 수득했다. 최종 PCR 생성물을 HindIII-BamHI 단편으로서 pUC19내로 서브클로닝하여 DNA 서열분석했다. 정확한 DNA 서열을 지닌 클론을 pUC-resh21.6VHa로 명명했다. 재구성된 21.6 가변 영역의 제 1 변형체의 DNA 및 아미노산 서열은 도 10에 제시되어 있다.

재구성된 인체 21.6 V_H영역의 나머지 변형체는 대부분 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 변형체 "b"의 작제에 대해 전술한 바와 같이 작제했다. 2 세트의 프라이머를 합성했다(표 6). 제 2 변형체(Hb) 및 제 3 변형체(Hc)는, 주형 DNA로서의 pUC-resh21.6VHa와 함께 각각 돌연변이유발 프라이머 21.6VHb(Arg-44가 Gly-44로 치환됨) 및 21.6VHc(Tyr-98이 Phe-98로 치환됨)를 PCR 반응에 사용하였다. PCR 생성물 VHb 및 VHc를 제한 효소로 절단하여, 각각 MscI-BamHI 및 PstI-BamHI 단편으로서 pUC 벡터 pUC-resh21.6VHa내로 서브클로닝하여, pUC-resh21.6VHb 및 pUC-resh21.6VHc 를 수득했다.

재구성된 인체 21.6 V_H영역의 제 1 변형체(Ha)는 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 제 1 변형체(La) 작제에 사용된 방법과 유사한 방법으로 작제했다. 그러나, 이 경우에서는 PCR 프라이머를 3가지 다른 주형 DNA 즉 키메라형 21.6 중쇄의 발현용으로 이전에 변형된 마우스 21.6 V_H영역. 인체화된 425 V_H영역 변형체 "g"[Kettleborough et al. 상기 문헌) 및 인체화된 AUK12-20 변형체 "b" V_H영역(표 6, 도 9)과 함께 사용했다. 인체화된 21.6 중쇄 가변 영역의 제 1 변형체의 DNA 및 아미노산 서열은 도 11에 제시되어 있다. 인체화된 21.6 V_H영역의 제 2 및 제 3 변형체(Hb 및 Hc)는 인체화된 21.6 V_H영역의 제 1 변형체(Ha)에서 소폭의 변형만이 이루어지도록 PCR 프라이머를 사용하여 작제했다(표 6).

실시예 7: 인체화된 항체의 발현 및 분석

1. 발현 벡터내에서의 불변 영역과 가변 영역의 결합

키메라형 및 재구성된 21.6 V_L및 V_H영역을 암호화하는 DNA 단편을, 포유류 세포내에서 인체 카파 경쇄 또는 인체 감마-1 중쇄를 발현하도록 고안된 HCMV 벡터내로 서브클로닝시켰다[참조, 도 3 및 Maeda et al., Hum. Antibod. Hydridomas 2:124-134 (1991)]. 두 백터 모두 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 고수율로 전사시키는 인체 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터 및 인헨서를 함유하고 있다. 경쇄 발현 벡터는 상기 문헌[Maeda et al.]에 기술된 것과 완전 동일한 것으로, 인체 카파 불변 영역을 암호하는 게놈 DNA를 함유하고 있다[Rabbitts et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)]. 중쇄 발현 벡터는 상기 문헌[Maeda et al.]에 기술된 것과 거의 동일하지만, 단 인체 감마-1 불변 영역을 암호하는 게놈 DNA가 cDNA로 대체된 점은 상이하다. 인체 감마-1 불변 영역을 암호하는 cDNA는 인체 감마-1 항체를 분비하는 인체 세포주로부터 PCR을 사용하여 클로닝했다. 발현 벡터내로 편리하게 서브클로닝하기 위해, cDNA의 각 말단에 BamHI 부위를 생성시켰다. 또한, cDNA 서열의 5'-말단에 스플라이스 수용체 부위 및 65 bp 인트론(intron) 서열을 생성시켰다. 인체감마-1 cDNA 스플라이스 수용체 부위와 인트론 서열을 함유하는 BamHI 단편(1176bp)으로 기존의 중쇄 벡터[Maeda et al. 상기 문헌]내의 BamHI 단편(약 2.0 kb)을 치환시켰다. 그 다음 인체 감마-1 불변 영역 중 BamHI 부위에서 3'-말단까지를 클레노우 폴리머라제로 제거했다.

2. 발현 벡터의 형질감염

발현 벡터를, 진 펄서(Gene Pulsar) 장치(Biorad)를 사용하여 전기천공법으로 Cos 세포내로 도입시켰다. DNA(각 벡터 10㎍)를 PBS중의 1 × 10⁷세포수/ml 분액 0.8ml에 첨가했다. 1,900 볼트, 25μF 전기용량의 펄스를 전달했다. 실온에서 10분의 회복 기간 후, 전기천공된 세포를 5% 열-불활성화된 감마 글로불린-부재 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM(GIBCO) 8ml에 첨가했다. 72시간 동안 항온배양한 후, 배지를 수거하고 원심분리하여 세포 잔편을 제거한 뒤, 단기간용으로 4℃의 멸균 조건하에 보관하거나, 또는 장기간용으로 -20℃에 보관했다.

3. 인체화된 항체의 정제

Cos 세포 형질감염으로부터의 상층액을 모아 고정된 단백질 A[이뮤노퓨어(ImmunoPure) IgG 정제용 키트, Pierce]상에서 정제했다. 상층액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과 살균했다. 동부피의 이뮤노퓨어 IgG 결합 완충액(pH 8.0)과 혼합한 후, 희석 샘플을 1ml 단백질 A 컬럼에 가한 후, 겔내로 완전히 유동하도록 하였다. 15ml의 이뮤노퓨어 IgG 결합 완충액으로 세정한후, 결합된 항체를 이뮤노퓨어 IgG 용출 완충액(pH 2.8) 5ml로 용출시키고 1ml 분획을 수거했다. 제 1 분획 및 제 2 분획의 pH는 약 8.0 이었다. 제 3 분획의 pH는 이뮤노퓨어 결합 완충액 100μl를 첨가하여 생리적 pH로 조정했다. 그 다음 단백질 A-정제된 항체를 함유하는 5개의 1ml 분획을 ELISA로 분석하여 각 분획내에 존재하는 인체 IgG 항체의 양을 측정하였다. 항체를 염소의 알칼리성 인산염-축합된 항-인체 IgG(전체 분자, Sigma)를 사용하여 검출했다.

4. 결합 친화력의 측정

α4β1 인테그린에 대한 재구성된 인체 21.6 항체의 결합성은 마우스 및 키메라형 항체를 비교용으로 사용하여 ELISA로 분석했다. 간단히 설명해보면, 세포 표면상에 α4β1 인테그린을 발현하도록 형질전환시킨 L 세포를 평판배양하고 96-웰 조직 배양 평판내에서 전면 성장시켰다. 시험할 샘플(미정제 상층액 또는 단백질-A-정제물)을 순차적으로 희석하여 각 웰에 첨가했다. 얼음위에서 1시간동안 항온 배양하고 아주 조심스럽게 세정한 후, 염소 항-마우스 또는 항-인체(감마 쇄 특이적) 퍼옥시다제 축합체(Sigma)를 첨가했다. 얼음위에서 추가로 1시간동안 항온배앙하고 아주 조심스럽게 세정한 후, 기질(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, Sigma)을 첨가했다. 실온에서 30분동안 항은배양한 후, 1M H₂SO₄을 첨가하여 반응을 중지시키고, A₄₉₀을 측정했다.

재구성된 인체 21.6 중쇄의 변형체 Ha와 함께 재구성된 인체 21.6 경쇄의 두 변형체(La 및 Lb)의 미정제 상층액을 분석한 결과, 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 La 변형체는 변형체 Lb보다 약간 우수한 항원 결합성을 제공하는 것으로 나타났다. 따라서, La 변형체를 후속 실험에 사용하였다. 인체화된 21.6 경쇄의 변형체 La와 함께, 인체화된 21.6 중쇄(Ha 및 Hb)의 미정제 상층액을 분석한 결과, 재구성된 인체 V_H영역의 두 변형체(Ha 및 Hb)사이에는 큰 차이가 없었다. 따라서, 인체 Hb내에는 6개의 변화가 있는데 반해, 인체 FR내에는 단지 5개의 변화가 있었기 때문에 추가 실험에 사용하기 위해서 변형체 Ha를 선택했다.

도 12는 키메라형 21.6 항체와 인체화된 21.6 항체(La + Ha)의 결합정도를 비교한 것이다. 이 데이터는 재구성된 인체 21.6 항체(La + Ha)가 항원에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 키메라형 21.6 항체보다도 약간 더 잘 결합한다는 것을 제시하고 있다 키메라형 21.6 항체는 완전한 마우스 21.6 가변 영역을 함유하고 있기 때문에 항원 결합 특성면에서 마우스 21.6 항체와 동등한 것으로 추정된다. 재구성된 인체 21.6 항체(La + Ha)는 또한 원래의 마우스 21.6 항체 및 키메라형 항체와 비교할만한 효능으로 인체 α4β1 인테그린에 대한 결합을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 재구성된 인체 21.6 항체(La + Ha)가 마우스 21.6 항체와 거의 동등한 특이적인 결합 친화성을 갖는다는 결론을 내릴 수 있다. 또한, 인체 FR내에 있어서의 단지 소폭의 변형만이 인체 가변 영역내에 있는 마우스 21.6 항체의 항원 결합 부위를 재창조하는데 필요하기 때문에, 재구성된 인체 21.6 항체는 본래의 인체 항체와 같이 작용하는 것으로 예상된다.

또한, 재구성된 인체 21.6 VL 영역의 변형체 La 및 재구성된 인체 21.6 VH 영역의 변형체 Hc를 함유하는 재구성된 인체 21.6 항체를 표면상에 인체 α4β1 인테그린을 발현하는 L 세포에 대한 결합성에 대해 키메라형 21.6 항체와 비교하여 시험했다. 그 결과, 재구성된 인체 21.6 항체(La + Hc)는 항원에 잘 결합하는 것으로 나타났다. V_H영역의 CDR3내에 있어서의 변화가 항원에 대한 결합성을 손상시키지 않았다. 이것은 CDR3내에 있어서의 변화가 항원에 대한 결합성을 약간 증가시킬 수 있다는 것을 부분적으로 나타내는 것이다(도 12). 아마도, 이러한 개선점은 작용기 차단 분석법에 의해 보다 현저하게 밝혀질 수 있다.

실시예 8: Mu 21.6 항체의 차단 특성

Mu 21.6를 L25라고 불리는 α4 인테그린에 대한 또 다른 항체와 비교시험했다. L25는 벡톤 디킨슨에 의해 시판되는 것으로, 문헌을 통해 α4β1 인테그린 부착 기능의 억제제로서 우수한 것으로 보고된바 있다. 도 13(패널 A)에 도시된 바와 같이, Mu 21.6 및 L25는 둘다 Mn⁺²의 부재하에서 정제된 VCAM-1에 인체 단핵 세포가 α₄β₁인테그린-의존방식으로 부착하는 것을 완전히 억제했다. 그러나, Mn⁺²(1 mM)(α4β1 인테그린의 여러 활성인자들중 일종)의 존재하에서는, L25는 더 이상 효과적인 억제제가 아니었다. 이와 유사한 결과가 α4β1 인테그린이 다른 자극물질에 의해 활성화되었을때 관찰되었다. 활성화된 α4β1 인테그린을 차단하는 능력은 다발성 경화증과 같은 염증성 질환을 치료하는데 중요한 것으로 사료된다.

Mu 21.6 및 L25 간의 또다른 차이를 추가 비교한 것으로서, 점증량의 VCAM-1에 인체 T 세포가 부착하는 것을 억제하는 항체의 능력을 측정했다. 이 실험에서는, 점증량의 VCAM-1을 96웰 분석판의 플라스틱 웰상에 피복하고, 이 피복 웰에 인체 T 세포주, 쥬캇(다량의 α4β1 인테그린을 발현함)이 결합하는 능력을 측정했다. Y-축의 수치는 웰을 4회 세정한 후에도 결합한채로 남아있는 각 웰에 최초 첨가된 주긴 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다(도 13(패널 B)). 이 실험 결과, L25가 소량의 VCAM-1과 접촉한 경우에는 우수한 세포 추착 억제제인데 반해, 다량의 VCAM-1에서는 완전히 비효과적이 된다는 것이 입증되었다. 반면, Mu 21.6은 VCAM-1의 존재량에 관계없이 세포 부착을 완전히 억제한다. 염증 부위에서는 VCAM-1의 농도가 상향조절되기 때문에 고농도의 VCAM-1에서의 차단 능력은 치료 분야에 있어 바람직한 것이다.

실시예 9: 동물 모델에 있어서의 인체화된 21.6 항체의 효능

본 실시예는 인체내의 다발상 경화증을 모방한 동물 모델에 있어 EAE를 예방적 및 치료적 처치하는데 있어서의 인체화된 21.6 항체의 효능을 입증한 것이다.

(a) 방법

(1) EAE의 유도

CO₂마취로 안락사시킨 5마리의 기니아 피그 각각으로부터 뇌 및 척수를 분리했다. 이 조직을 무게측정하고 PBS 1ml당 조직 1g의 농도로 균질화할 때까지 빙수상에서 PBS중에 놓아 두었다. 이 조직을 전기 수동식 균질기를 사용하여 완전하게 균질화시키고, 이어서 동부피의 프로인트 완전 보조액(FCA)과 혼합했다. FCA는 프로인트 불완전 보조액(Sigma, F-5506) 10ml에 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37 RA (DIFCO, 3114-33-8) 100mg을 첨가하여 제조했다. 이 혼합물을 2 방향 스톱코크로 연결된 2개의 주사기 사이로 용액을 통과시키므로써 마요네즈와 같은 점조도로 유화시켰다. 각 기니아 피그에게 600μ1 유화액을 3부위에 분할하여 투여하므로써 면역시켰다.

(2) 각 동물의 질병 증상에 대한 등급결정

질병 증상은 각 동물을 걷게 하여 그 등급을 다음과 같은 일반적으로 허용되는 기준에 따라 정함으로써 평가했다:

0 질병 없음

1 후지(hind limb) 약화

2 후지 완전 마비

3 후지 완전 마비 및 일부 전지(fore limb) 마비

4 빈사 또는 사망

(3) 혈청 및 조직 수거

메톡시플루란-마취된 기니아 피그로부터 심장 천공으로 샘플을 수거했다. 약 300 내지 400μ1의 혈액을 채혈하여 미량용기 혈청 분리기에 넣고 실온에서 20 내지 30분동안 응혈되도록 하였다. 이후, 튜브를 실온에서 5분동안 회전시켰다. 혈청을 에펜도르프 튜브에 담아, 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의한 후속 항체역가분석에 사용하기 위해 -20℃에 보관했다.

혈액 분석을 위해, 혈액을 에틸렌디아민테트라아세트산-피복된 미량용기 튜브내로 수거했다. 100μl 분취량을 아크리딘-피복된 헤마토크리트 튜브에 흡인시켰다. 이 튜브에 캡을 씌우고 튜브를 15회 조심스럽게 전회시키므로써 혈액을 아크리딘 오렌지와 함께 혼합했다. 부유물을 헤마토크리트 튜브에 넣고 샘플을 5분동안 원심분리했다. 헤마토크리트 튜브를 완충 피복물 정량 분석용으로 고안된 예비눈금 조정된 Indexx QBC Vet 자동판독기에 배치했다. 산출되는 수치를 호오스 눈금조정 시스템하에서 판독하고 사전측정된 전환 계수를 사용하여 기니아 피그 등가량으로 조정했다.

실험 말기에, 기니아 피그를 CO₂마취로 치사시키고 뇌와 척수를 분리했다. 모든 기니아 피그로부터 분리된 뇌와 척수중 절반을 드라이아이스(-20 내지 -40℃)상의 2-메틸 부탄 중에서 급속 동결시켰다. 이 조직을 절단하고 팬(pan) 대식세포 마커(Serotec MCA-518) 및 T-임파구 마커(Serotec MCA-751)와 함께 아비딘-비오틴 결합 퍼옥시라제 분석법(캘리포니아 버링검에 소재하는 벡터 래보러토리즈, 인코오포레이티드) 및 염색제로서 디아미노벤지딘을 사용하여 면역염색시켰다. 이 조직을 다음과 같은 시스템에 따라 세포 침투에 대한 등급을 정하였다:

0 침투성이 전혀 없는 세포

0.5 극미량의 염색; 인위적인 것일 수도 있음; 보통 용기와 결합된 것임

1 보통 용기 부근의 몇몇 세포(15 세포 이하)를 염색

2 보통 용기로부터 방사상의 많은 세포들(20 내지 50 세포)을 염색

3 조직을 통해 분산된 많은 세포들(> 50)을 염색; 많은 커프화된 용기

(b) 예방 치료

이 실험은 임상적 증상의 개시를 지연시키는데 있어서의 인체화된 21.6 항체의 효능을 평가하기 위해 고안된 것이다. 종래 데이타에 의하면, EAE 기니아 피그의 뇌와 척수내로의 백혈구의 유입은 보통 7일 내지 8일사이에 개시된다고 증명된 바 있다. 따라서, 항체를 면역후 7일 및 10일째에 투여했다. 마우스 및 인체화된 21.6 항체를 비교하기 위해, 각 항체를 동 투여량(3.0, 0.30 및 0.03 mg/kg)으로 투여했다. 예비적인 약물 속도 연구 결과, 피하 투여후 24시간내에 마우스 21.6 항체의 혈액내 포화량에 도달하고 최대 48시간까지 상승 상태를 유지하는 것으로 밝혀졌다.

11일째에, 2차 항체 투여 24시간 후 각 군에서 무작위로 선별한 3마리의 동물로부터 혈액 샘플을 채취했다. 각 처치군에 있어서, 각 기니아 피그가 1의 임상적 등급에 도달하는데 걸리는 일수의 평균값을 산출했다(표 7). 이 실험에서 PBS-처치군의 평균값은 면역후 11일(통상적인 종래 결과임)이었다. 인채화된 항체 및 마우스 항체 최대 투여량으로 처치한 결과, 각 질병이 4.6일(P=0.000) 및 3일(p=0.007)까지 상당히 지연되었다. 이보다 낮은 항체 투여량으로는 질병 경과에 어떤 효과도 나타나지 않았다.

[표 7]

임상 등급 1에 도달하는데 걸리는 면역 후 시간에 미치는 마우스 또는 인체화된 21.6 항체의 효과

^@H는 인체화된 항체임;^#M은 마우스 항체임.

^**p=0.000 및^*p=0.007(PBS 대비).

기니아 피그의 매일의 체중은 고 투여량의 인체화된 항체 및 마우스 항체의 유사한 효과를 반영하였다(도 14). 이 처치군 중의 동물은 지속적으로 체중이 증가하였다. 모든 다른 처치군내의 기니아 피그는 질병 개시일 직전부터 체중이 감소했다.

항체의 혈청 역가를 11일째, 2차 처치 약 24시간 후, 각 군으로부터 무작위로 선별한 동물을 심장 천공시켜 샘플을 수득하여 측정했다. 질병을 지연시키는 항체의 효능은 혈청량과 밀접한 관련이 있었다. 인체화된 항체 및 마우스 항체가 모두 최대 투여량으로 주입된 모든 동물의 순환계에는 약 20 ㎍/ml의 혈청 항체가 존재하였다. 이러한 농도는 시험관내에서 VLA-4 부위를 포화시키는데 펄요한 21.6 항체 농도와 같은 수준이었다. 이와 달리, 모든 다른 군으로부터의 동물들은 감지할만한 혈청 항체를 전혀 갖고 있지 않았다.

(c) 질환 진행의 반전

약 60마리의 기니아 피그를 면역시키고 EAE의 임상적 증상을 발병시켰다. 13일째에, 1의 임상적 등급을 얻은 모든 기니아 피그를 하나의 처치군으로 무작위로 배정했다. 도 15는 3 mg/kg의 인체화된 항체로 처치한 동물이 처치 48시간내에 후지 기능을 회복하기 시작함을 나타낸 것이다. 2차 투여후 1일 및 2일째인 17일 및 18일째에는, 모두 8마리의 동물이 질병으로부터 회복되었다. 각 처치군의 곡선 수치아래 면적의 ANOVA에 따르면, 3 mg/kg의 인체화된 항체 처치군의 수치만이 PBS 대조군보다 통계적으로 낮았다(P=0.042). 이 동물들은 1차 투여후 24시간내에 본 실험이 끝나는 19일째까지 체중이 점진적으로 증가하였다(도 16).

항체 혈청 역가는 1차 주입(14일)후 24시간째와 치사(19일)후 채취한 샘플을 FACS 분석하여 측정했다. 마우스 21.6 항체로 처치한 후 수폭되는 혈청 항체 역가는 인체화된 21.6 항체로 처치한후 얻어지는 역가보다 다소 낮았다(9.1 대 12.6 ㎍/ml). 이러한 차이는 검측가능한 혈청 마우스 항체가 거치 없는 2차 투여 후 3일째인 19일째에 현저해진 반면, 19일째 인체화된 항체의 양은 포화농도 이하로 저하되었으나, 여전히 검측가능한 양이었다(6.1 ㎍/ml). 이 데이타는 혈장내 항체 양과 생리적 효능간에 상관관계가 있음을 입증한 것으로, 효과적인 순환 항체량은 기니아 피그에 있어서 10 내지 20 ㎍/ml임을 제시하고 있다.

뇌 및 척수로의 백혈구 침투는 19일째 치사시킨 동물로부터 채취한 조직을 사용하여 평가했다. 표 8은 항체 처치의 함수로서 침투정도에 있어서의 상당한 차이를 나타낸 것이다. 뇌 및 척수로의 T 세포 침투 및 척수로의 대식세포 침투에 있어서의 감소는 3mg/kg으로 처치한 후 현저하게 나타났다. 이보다 적은 투여량은 침투를 감소시키는 경향이 있으나, 현저한 것은 아니었다. 어떤 투여량에서든지 척수내로 대식세포가 세포나 침투하는데에는 큰 차이가 없었다. 대식세포를 평가하는데 사용된 면역조직화학적 기법은 침투 세포로부터 상주하고 있는 세포를 구별하지 못하므로, 대식세포에 대한 미흡한 효과는 상주하는 대식세포 및 소신경세포의 지속적인 존재를 의미한다.

질병에 걸린후 항체 투여에 의해 뇌 조직 내에 T-세포 및 단핵세포가 감소하는 것은 세포의 왕래가 축적 과정으로 이루어지는 것이 아니라, CNS 조직내 및 조직밖으로 세포가 역동적으로 이동하는 과정임을 암시한다. 이 데이타가 실질 조직내로 백혈구의 유입이 중지되면 CNS에 의해 침투된 병리학적 인자가 제거될 수 있다는 것을 암시한다는 점이 중요하다.

[표 8]

129일째 뇌 및 척수 내로의 T-세포 및 대식세포 침투에 있어서의 현저한 차이

NS = 유효치 부족

혈액 데이타 결과, 마우스 또는 인체화된 21.6 항체의 처치가 전 백혈구 세포 계수치, 단핵세포 및 과립세포 수 또는 적혈구 세포 계수치에 있어서 차이를 유발시키지는 않는 것으로 밝혀졌다. 고 투여량의 마우스 또는 인체화된 항체는 PBS처리된 동물과 비교해 볼 때 혈소판 계수치에 있어서 상당한 증가를 나타냈다(표 9). 정상적인 기니아 피그에 있어서 혈소판 계수치는 755±103 세포수/ml 였고, 이는 PBS 처리된 EAS 동물에 비해 약 2배였다. 따라서, 효과적으로 질병을 반전시킨 마우스 및 인체화된 항체 투여량으로의 처리는 또한 혈소판의 계수치를 정상 수준으로 복원시켰다.

[표 9]

EAE 동물내 혈소판 계수치에 대한 항체 처치의 효과

⁺⁺비-EXE 기니아 피그에 있어서의 혈소판 계수치는 별도의 실험으로 측정했다.

^*p=0.05 (PBS 대비)

결론적으로, 인체화된 21.6 항체 및 마우스 21.6 항체는 인체의 다발성 경화증을 모의실험한 동물 모델내에서 임상적 증후를 지연시키고 반전시키는데 효과적이었다. 동일한 투여량인 경우, 증후를 반전시키는데 있어서 마우스 항체보다 인체화된 항체가 더욱 효과적이었다.

이상, 본 발명을 명백히 이해하도록 상세히 기술하였지만, 첨부되는 청구의 범위내에서 특정의 변형이 실시될 수 있다는 것은 자명한 것이다. 전술한 모든 문헌 및 특허 서류는 개별적으로 표시되었을지라도 동일한 정도로 모든 목적을 위해 본원에 그 전문이 참고로 인용된 것이다.

[표 4]

재구성된 인체 21.6 경쇄 가변 영역의 고안을 유도하는 아미노산 서열의 배열

범래 : (kabat) 상기 문헌[Kabat et al.]에 따라 번호 매김 ; (#) 분자 모델링에서 사용된 것과 같은 일련번호 : (마우스 21.6) 마우스 21.6 항체 유래의 V_L영역의 아미노산 서열 ; (마우스 카파 5) 아군 5[Kabat et al., 상기 문헌] 유래의 마우스 카파 V_L영역의 공통 서열; (인체 카파 1) 아군 1[Kabat et al., 상기 문헌] 유래의 인체 V_L영역의 공통 서열; (인체 RE1) 인체 V_L영역[Palm et al. (1975) 상기 문헌]의 아미노산 서열; (RH V_L21.6) 재구성된 인체 21.6 V_L영역의 변형체 L1의 아미노산 서열; (^*) CDR 루프[Chothia et al., 상기 문헌]의 정규 구조의 일부인 잔기; (_) 아미노산 잔기가 변화된 인체 FR내의 잔기.

[표 5]

재구성된 인체 21.6 중쇄 가변 영역 고안을 유도하는 아미노산 서열의 배열

범래 : (Kabat) 문헌[Kabat et al. 상기 문헌]에 따라 번호 매김 ; (#) 분자 모델링에 사용된 것과 같은 일련 번호 ; (마우스 21.6) 마우스 21.6 항체 유래의 V_H영역의 아미노산 서열 ; (마우스 2C) 아군 2C[Kabat et al., 상기 문헌] 유래의 마우스 V_H영역의 공통 서열; (인체 1) 아군 1[Kabat et al,, 상기 문헌] 유래의 인체 V_H영역의 공통 서열; (인체 21/28'CL) 인체 V_H영역[Dersimonian et al (1987), 상기 문헌]의 아미노산 서열; (RH V_H21.6) 재구성된 21.6 V_H영역의 변형체 H1의 아미노산 서열; (^*) CDR 루프[Chothia et al., 상기 문헌]의 정규 구조의 일부분인 잔기; (_) 아미노산 잔기가 변화된 인체 FR내의 잔기.

본 발명의 인체화된 면역글로불린은 다발성 경화증과 같은 염증성 질환을 치료하는데 유용하다.

서열목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 매리 엠, 벤디그

올리비에 제이, 레제

조즈 샐댄하

태런 에스, 존스

(ii) 발명의 명칭 : 백혈구 부착 분자 VLA-4에 대한 인체화된 항체

(iii) 서열의 수 : 45

(iv) 서신 주소 :

(A) 수신인 : 타운센드 앤드 타운센드 쿠리 앤드 크류

(B) 거리명 : 슈트 2000 스튜어트 타워 원 마켓 플라자

(C) 도시명 : 센 프란시스코

(D) 주명 : 캘리포니아

(E) 국가명 : 미국

(F) 우편번호 : 94105

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25

(vi) 현행 출원 자료 :

(A) 출원 번호 : US 08/186,269

(B) 출원 일자 : 1994년 1월 25일

(C) 분류 기호 :

(viii) 대리인에 관한 정보 :

(A) 성명 : 월리암 엘, 스미쓰

(B) 등록 번호 : 30,223

(C) 참조/열람 번호 : 15270-14

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화 번호 : 415-543-9600

(B) 팩시밀리 번호 : 415-543-5043

(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 483 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : cDNA

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재 위치 : 53..430

(xi) 서열 번호 1 의 서열 :

(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 126 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 2 의 서열 :

(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 470 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : cDNA

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재 위치 : 1..420

(xi) 서열 번호 3 의 서열 :

(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 140 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 4 의 서열 :

(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 106 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 쇄의수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 5 의 서열 :

(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 107 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 6 의 서열 :

(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 106 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 7 의 서열 :

(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 107 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 8 의 서열 :

(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 123 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 9의 서열 :

(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 119 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 10 의 서열 :

(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 123 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 11 의 서열 :

(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 119 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 12 의 서열 :

(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 119 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 13 의 서열 :

(2) 서열 번호 14 예 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 406 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : cDNA

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재 위치 : 16..393

(xi) 서열 번호 14 의 서열 :

(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 126 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 15의 서열 :

(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 454 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : cDNA

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재 위치 : 16..441

(xi) 서열 번호 16 의 서열 :

(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 142 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 17 의 서열 :

(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 37 염기쌍

(B) 서열의 종류 ; 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 18 의 서열 :

(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 19 의 서열 :

(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 37 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

그림 37

(xi) 서열 번호 20 의 서열 :

(2) 서열 번호 21 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 21 의 서열 :

(2) 서열 번호 22 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 39 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 22 의 서열 :

(2) 서열 번호 23 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 23 의 서열 ;

(2) 서열 번호 24 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 39 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 24 의 서열 :

(2) 서열 번호 25 예 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 41염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 25 의 서열 :

(2) 서열 번호 26 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 40 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 26 의 서열 :

(2) 서열 번호 27 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 서열의 종류 :핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 27 의 서열 :

(2) 서열 번호 28 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 59 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 28 의 서열 :

(2) 서열 번호 29 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 29 의 서열 :

(2) 서열 번호 30 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 30 의 서열 :

(2) 서열 번호 31 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 51 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 31 의 서열 :

(2) 서열 번호 32 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 67 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 32 의 서열 :

(2) 서열 번호 33 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(Xi) 서열 번호 33 의 서열 :

(2) 서열 번호 34 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 66 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 34의 서열 :

(2) 서열 번호 35 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 64 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 35 의 서열 :

(2) 서열 번호 36 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 63염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 36 의 서열 :

(2) 서열 번호 37 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 37 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이며)

(xi) 서열 번호 37 의 서열 :

(2) 서열 번호 38 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 시열 번호 38 의 서열 :

(2) 서열 번호 39 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 17 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(Xi) 서열 번호 39 의 서열 :

(2) 서열 번호 40 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 18 염기쌍

(B) 서열의 종류 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : DNA (프라이머)

(xi) 서열 번호 40 의 서열 :

(2) 서열 번호 41 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 116 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 41 의 서열 :

(2) 서열 번호 42 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 109 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 42 의 서열 :

(2) 서열 번호 43 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 114 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 43 의 서열 :

(2) 서열 번호 44 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 125 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 44 의 서열 :

(2) 서열 번호 45 에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 길이 : 129 아미노산

(B) 서열의 종류 : 아미노산

(C) 가닥수 : 1본쇄

(D) 토폴로지 : 직선

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 45 의 서열 :

Claims

(1) 마우스 21.6 면역글로불린 경쇄 가변 영역(서열번호 2)의 대응 상보성 결정 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과, L45, L49, L58 및 L69로 구성된 제1 군(여기서, Lx는 면역글로불린의 성숙된 경쇄의 가변 영역으로부터 나온 아미노산을 의미하며, 이때 x는 아미노산의 위치를 나타내는 번호임) 중에서 선택된 하나 이상의 위치를 제외하고는 인체의 카파 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열로부터 유래된 가변 영역 프레임 워크(상기 아미노산 위치는 마우스 21.6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 프레임워크의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유됨)를 포함하는 인체화된 경쇄; 및

(2) 마우스 21.6 면역글로불린 중쇄 가변 영역(서열번호 4)의 대응 상보성 결정 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 H27, H28, H29, H30, H44 및 H71로 구성된 제2 군(여기서, Hx는 면역글로불린의 성숙된 중쇄의 가변 영역으로부터 나온 아미노산을 의미하며, 이때 x는 아미노산의 위치를 나타내는 번호임) 중에서 선택된 하나 이상의 위치를 제외하고는 인체의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열로부터 유래된 가변 영역 프레임워크(상기 아미노산 위치는 마우스 21.6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유됨)를 포함하는 인체화된 중쇄를 포함하며,

약 10⁷M^-1의 결합 친화력 하한치와 마우스 21.6 면역 글로불린 결합 친화력의 약 5배의 상한치로 VLA-4 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 인체화된 경쇄 가변 영역 프레임워크가 상기 제1 군중에서 선택된 하나 이상의 위치와, 또 위치 L104, L105 및 L107로 구성된 제3 군(여기서, Lx는 면역글로불린의 성숙된 경쇄의 가변 영역으로부터 나온 아미노산을 의미하며, 이때 x는 아미노산의 위치를 나타내는 번호임) 중에서 선택된 하나 이상의 위치를 제외하고는 RE1 가변 영역 프레임워크 서열(서열번호 6)로부터 유래되고, 상기 아미노산 위치는 RE1 이외의 인체 면역글로불린으로부터의 카파 경쇄의 동등 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산에 의해 점유되는 것온 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제2항에 있어서, 상기 인체화된 중쇄 가변 영역 프레임워크가 21/28'CL 가변 영역 프레임워크 서열(서열번호 10)로부터 유래된. 것임을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제3항에 있어서, 상기 인체화된 경쇄 가변 영역 프레임워크가 제1 군의 위치에 마우스 21.6 면역글로불린으로부터 유래된 최소 3개의 아미노산을, 그리고 제3군의 위치에 RE1 이외의 인체 면역글로불린으로부터의 카파 경쇄고부터 유래된 3개의 아미노산을 포함차고, 또 인체화된 중쇄 가변 영역 프레임워크가 제2 군의 위치에 마우스 21.6 면역글로불린으로부터 유래된 최소 5개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제4항에 있어서, 상기 인체화된 경쇄 가변 영역 프레임워크가 제1 군으로부터의 최소 3개의 위치 및 제3 군으로부터의 3개의 인치를 제외하고는 REI 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열과 동일하며, 중쇄 가변 영역 프레임워크가 제2 군으로부터의 최소 5개의 위치를 제외하고는 21/28'CL 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제5항에 있어서, 상기 제1 군으로부터의 최소 3개의 위치가 위치 L45, L58 및 L69 이고, 제2 군으로부터의 최소 5개의 위치가 위치 H27, H28, H29, H30 및 H71인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제6항에 있어서, 상기 인체화된 경쇄가 마우스 21.6 중쇄의 대응 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 인체화된 중쇄가 마우스 21.6 중쇄의 대응 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하며, 단 상기 인체화된 중쇄의 CDR3 영역이 위치 H98에 페닐알라닌 잔기를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수도 있는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제7항에 있어서, 상기 인체화된 중쇄의 CDR3이 위치 H98(여기서, Hx는 면역글로불린의 성숙된 중쇄 가변 영역으로부터 나온 아미노산을 의미하며, 이때 x는 아미노산의 위치를 나타내는 번호임)에 페널알라닌 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 성숙된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 6에서 La로 명시된 서열(서열 번호 7)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 성숙된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 6에서 Lb로 명시된 서열(서열 번호 8)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Ha로 명시된 서열(서열 번호 11)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Hb로 명시된 서열(서열 번호 12)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Hc로 명시된 서열(서열 번호 13)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제9항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Ha로 명시된 서열(서열 번호 11)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제9항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Hb로 명시된 서열(서열 번호 12)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제9항에 있어서, 상기 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Hc로 명시된 서열(서열 번호 13)인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 기재된 인체화된 면역글로불린의 항원 결합 단편으로서, 성숙된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 6에서 La로 명시된 서열(서열 번호 7)이고, 성숙된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 7에서 Ha로 명시된 서열(서열 번호 11) 또는 Hc로 명시된 서열(서열 번호 13)인 것을 특징으로 하는 항원 결합 단편.
제14항 또는 제16항에 있어서, 불변 영역 도메인을 가지는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제18항에 있어서, 상기 불변 영역 도메인이 효과인자 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 인체화된 면며역글로불린.
제18항에 있어서, 상기 불변 영역 도메인에 효과인자 기능이 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제19항에 있어서, 상기 효과인자 기능이 보체 고착이나 항체 의존성 세포 독성을 나타낼 수 있는 기능인 것을 특징으로 하는 인체화된 면역글로불린.
제1항에 기재된 일체화된 면역글로불린의 중쇄 또는 그 항원 결합 단편을 암호하는 핵산으로서, 상기 중쇄 및 그 항원 결합 단편의 가변 영역 아미노산 서열이 서열 번호 17인 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 기재된 민체화된 면역글로불린의 경쇄 또는 그 항원 결합 단편을 암호하는 핵산으로서, 상기 경쇄 및 그 항원 결합 단편의 가변 영역 아미노산 서열이 서열 번호 15인 것을 특징으로 하는 핵산.
제14항 또는 제16항에 기재된 인체화된 항체나 그 항원 결합 단편, 및 이에 대해 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 염증질환 치료용 약학 조성물.