NO319867B1 - Humaniserte antistoffer mot leukocytt-adhesjonsmolekyl VLA-4, bindingsfragment derav, farmasoytisk preparat omfattende det humaniserte antistoffet eller et bindingsfragment derav, samt anvendelser av det humaniserte antistoff. - Google Patents
Humaniserte antistoffer mot leukocytt-adhesjonsmolekyl VLA-4, bindingsfragment derav, farmasoytisk preparat omfattende det humaniserte antistoffet eller et bindingsfragment derav, samt anvendelser av det humaniserte antistoff. Download PDFInfo
- Publication number
- NO319867B1 NO319867B1 NO19963097A NO963097A NO319867B1 NO 319867 B1 NO319867 B1 NO 319867B1 NO 19963097 A NO19963097 A NO 19963097A NO 963097 A NO963097 A NO 963097A NO 319867 B1 NO319867 B1 NO 319867B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- humanized
- mouse
- human
- immunoglobulin
- variable region
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 36
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 title description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 70
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 61
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 61
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 52
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 17
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 10
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 8
- 108700004676 Bence Jones Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 claims 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 claims 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 claims 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 claims 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 claims 1
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 138
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 74
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 33
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 32
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 18
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 9
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 7
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 6
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001002508 Homo sapiens Immunoglobulin-binding protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 3
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 3
- 102100021042 Immunoglobulin-binding protein 1 Human genes 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 2
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-NAOJVREFSA-N (4s,4as,5as,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2C(O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-NAOJVREFSA-N 0.000 description 1
- MNRDNGRAKFSUSO-KHEUVVEUSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid Chemical group NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MNRDNGRAKFSUSO-KHEUVVEUSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101710125089 Bindin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 101000926206 Homo sapiens Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102100034060 Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010041332 Very Late Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025698 brain inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007894 caplet Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001983 electron spin resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012333 histopathological diagnosis Methods 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 1
- 101150030901 mab-21 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår generelt humaniserte antistoffer som er spesifikke mot alfa-4 subenheten til leukocytt-adhesjonsmolekyl VLA-4, bindingsfragment derav, farmasøytisk preparat omfattende det humaniserte antistoffet eller et bindingsfragment derav, samt anvendelser av humanisert antistoff.
Inflammasjon er en respons i vaskularisert vev mot infeksjon eller skade og er forårsaket av adhesjon av leukocytter til endotelcellene i blodkar, og deres infiltrasjon i omkringliggende vev. Ved normal inflammasjon frigjør de infiltrerende leukocyttene toksiske mediatorerfor å drepe invaderende organismer, fagocytere avfall og døde celler og spiller en rolle i vevsreparasjon og i immunresponsen. Ved patologisk inflammasjon er imidlertid infiltrerende leukocytter over-responsive og kan forårsake alvorlig eller fatal skade. Se f.eks.. Hickey, Psychoneuroimmunology II (Academic Press, 1990).
Festingen av leukocytter til endotelceller blir utført via spesifikke interaksjoner av celleoverflate-ligander og reseptorer på endotelceller og leukocytter. Se generelt Springer, Nature 346:425-433 (1990). Identiteten til ligandene og reseptorene varierer for ulike celle-subtyper, anatomisk lokalisering og inflammatorisk stimuli. VLA-4 leukocytt-celleoverflate-reseptoren ble først identifisert av Hemler, EP 330 506 (1989) (inkorporert ved referanse i sin helhet for alle formål). VLA-4 er et medlem av pi-integrin-familien av celleoverflate-reseptorene, som hver omfatter a- og p-kjeder. VLA-4 omfatter en a4-kjede og en p1-kjede. VLA-4 binder spesifikt til en endotelcelle-ligand kalt VCAM-1. Se Elices et al., Cell 60:577-584 (1990) (inkorporert ved referanse i sin helhet for alle formål). Til tross for at VCAM-1 først ble detektert på aktiverte humane navlestreng-veneceller, er denne liganden også blitt detektert på hjerneendotelceller. Se felleseiet, samtidig US-søknad Nr. 07/871 223 (inkorporert ved referanse i sin helhet for alle formål).
Adhesjonsmolekyler så som VLA-4 er potensielle mål for terapeutiske midler. VLA-4-reseptoren er et spesielt viktig mål på grunn av dens interaksjon med en ligand som sitter i hjerneendotelceller. Sykdommer og tilstander som resulterer fra hjerneinflammasjon har spesielt alvorlige konsekvenser. En slik sykdom, multippel sklerose (MS) har f.eks., et kronisk forløp (med eller uten eksacerbersasjon og remisjon) som fører til alvorlig handikap og død. Sykdommen berører beregnet 250 000 til 350 000 mennesker bare i USA.
Antistoffer mot VLA-4-reseptoren er blitt testet for deres anti-inflammatoriske potensiale både in vitro og in vivo i dyremodeller. Se USSN 07/871 223 og Yednock et al., Nature 356:63-66 (1992) (inkorporert ved referanse i sin helhet for alle formål). In wfrø-eksperimentene demonstrerte at anti-VLA-4-antistoffer blokkerer festing av lymfocytter til hjerneendotelceller. Dyreforsøkene tester effektiviteten av anti-VLA-4-antistoffer på dyr som har en kunstig fremkalt lidelse (eksperimentell autoimmun encefalomyelitt), som simulerer multippel sklerose. Eksperimentene viser at administrering av anti-VLA-4-antistoffer hemmer inflammasjon i hjernen og medfølgende paralyse hos dyret. Sammen identifiserer disse eksperimentene anti-VLA-4-antistoffer som potensielt nyttige terapeutiske midler for å behandle multippel sklerose og andre inflammatoriske sykdommer og lidelser.
Et betydelig problem med anti-VLA-4-antistoffene som er tilgjengelige i dag er at de alle er av murin opprinnelse, og vil derfor sannsynligvis skape en anti-mus-respons (HAMA) ved klinisk anvendelse. En HAMA-respons reduserer effektiviteten av muse-antistoffene hos pasienter, og hindrer videre behandling. En fremgangsmåte for å løse dette problemet, er å humanisere muse-antistoffer. Ved denne fremgangsmåten er komplement-bestemmende regioner (CDR) og visse andre aminosyrer fra donor-mus variable regioner podet inn i humane variable akseptor-regioner og så satt sammen med humane konstante regioner. Se f.eks.. Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Winter, US 5.225.539
(1993) (begge er her tatt med ved referanse i sin helhet for alle formål).
Selv om det er produsert flere eksempler på humaniserte antistoffer, involverer overgangen fra et murint til et humanisert antistoff et kompromiss mellom konkurrerende faktorer hvor løsningen varierer med de ulike antistoffene. For å minimalisere immunogenisitet bør immunoglobulinet beholde så mye som mulig av den humane akseptor-sekvensen. For å beholde autentiske bindings-egenskaper bør imidlertid immunoglobulin-rammeverket inneholde tilstrekkelige substitusjoner av den humane akseptor-sekvensen til å sikre en tredimensjonal konformasjon av CDR-regioner så nær som mulig til den i det originale musedonor-immunogiobulinet. Som et resultat av disse konkurrerende faktorene viser mange av de humaniserte antistoffene som er produsert til nå, noe tap av bindingsaffinitet sammenlignet med det korresponderende murine antistoffet hvilket de er avledet fra. Se f.eks. Jones et al., Nature 321:522-525 (1988); Shearman et al., J. Immunol. 147:4366^373 (1991); Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Gorman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest et al., Biotechnology 9:266-271 (1991).
Basert på det foregående er det klart at det er et behov for humaniserte VLA-4-antistoffer som utviser en sterk affinitet for VLA-4-reseptoren, mens den utviser liten, om noen, human-antimus-respons. Foreliggende oppfinnelse oppfyller dette, og andre behov.
Oppfinnelsen tilveiebringer humanisert antistoff, kjennetegnet ved at det omfatteren humanisert tungkjede og en humanisert lettkjede: (1) den humaniserte lettkjeden omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) som har aminosyresekvenser fra de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 immunoglobulin lettkjede, og et variabel regionrammeverk fra en human kappa lettkjedevariabel regionrammeverksekvens unntatt i minst en posisjon valgt fra en første gruppe bestående av L45, L49, L58 og L69, hvor aminosyreposisjonen er okkupert av den samme aminosyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen i mus 21.6 immunoglobulin lettkjede-variabel regionrammeverk; og (2) den humaniserte tungkjeden omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) som har aminosyresekvenser fra de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 immunoglobulin tungkjede, og et variabel regionrammeverk fra en human tungkjede variabel regionrammeverksekvens unntatt i minst en posisjon valgt fra en gruppe bestående av H27, H28, H29, H30, H44, H71, hvor aminosyreposisjonen er okkupert av den samme aminosyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen i mus 21.6 immunoglobulin tungkjede variabel regionrammeverket; hvor immunoglobulinet spesifikt binder en alfa-4 integrin med en bindingsaffinitet som har en nedre grense på 10<7 >M"<1> og en øvre grense på fem ganger bindingsaffiniteten til mus 21.6-immunoglobulinet.
Vanligvis er de humaniserte lett- og tungkjede variable region-rammeverk fra henholdsvis Bence-Jones immunoglobulin RE1 og 21/28'CL variabel region-rammeverksekvenser. Når det humaniserte lettkjede variable region-rammeverket er fra RE1 er minst to rammeverk-aminosyrer erstattet. En aminosyre er fra den første gruppen av posisjoner beskrevet supra. De andre aminosyrene er fra en tredje gruppe bestående av posisjonene L104, L105 og L107. Denne posisjonen er besatt av den samme aminoyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen på en kappa-lettkjede fra et annet humant immunoglobulin enn RE1.
Noen humaniserte immunoglobuliner har en moden lettkjede variabel-regionsekvens betegnet La eller Lb i figur 6, eller en moden tungkjede variabel regionsekvens betegnet Ha, Hb eller Hc i figur 7. Foretrukne humaniserte immunoglobuliner omfatter de som har en La- lettkjede og en Ha-, Hb- eller Hc-tungkjede.
Oppfinnelsen tilveiebringer også bindingsfragmenter av de humansierte immunoglobulinene mot VLA-4 beskrevet ovenfor.
Ved et annet aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter et humanisert antistoff ifølge krav 1 eller 8, eller et bindingsfragment derav, og en farmasøytisk aksepterbar bærer for dette. De farmasøytiske preparatene omfatter et humanisert immunoglobulin eller bindingsfragment som beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk aksepterbar bærer.
I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse, omfattes anvendelse av humanisert antistoff ifølge krav 1 eller 8, i fremstilling av en farmasøytisk blanding, ifølge krav 11, for behandling av en inflammatorisk sykdom hos en pasient. Den inflammatoriske sykdommen som behandles kan være multippel sklerose.
Det beskrives metoder for å detektere VLA-4-antigen ved å anvende de humaniserte immunoglobulinene og bindingsfragmentne beskrevet supra. Ved disse metodene blir et humanisert antistoff eller bindingsfragment administrert til en pasient eller en vevsprøve fra denne. Komplekser som er dannet ved spesifikk binding mellom antistoff eller fragment og VLA-4 som er tilstede i prøven, er detektert.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURER
Figur 1: DNA- (Sekv. Id. Nr:1) og aminosyre- (Sekv. Id. Nr:2) sekvenser av mus 21.6 lettkjede-variabel region. Figur 2: DNA- (Sekv. Id. Nr:3) og aminosyre- (Sekv. Id. Nr:4) sekvenser av mus 21.6 tungkjede-variabel region. Figur 3: Lett- (A) og tung-(B) kjede ekspresjonsvektorer som er anvendt for å produsere kimære og omdannede humane antistoffer med humane kappa lettkjeder og humane gamma-1 tungkjeder i mammalske celler. Figur 4: ELISA-sammenligning av kimære og muse 21.6-antistoff-binding til L-celler som uttrykker humane <x4p1-integrin på overflaten deres. Figur 5: Molekylær modell av de variable regionene fra mus 21.6-antistoff. Enheter av spesiell interesse er merket. Figur 6: Sammenligning av aminosyresekvenser fra mus og omdannet human 21.6 (Sekv. Id. Nr :5) lettkjede variable regioner. Aminosyre-enhetene som er en del av de vedtatte Chothia-sekvenser for CDR-løkke-strukturene er markert med en stjerne. REI (Sekv. Id. Nr:6) viser FRene og CDRene fra VL-regionen fra human REI lettkjede. La (Sekv. Id. Nr: 7) og Lb (Sekv. Id. Nr: 8) er de to versjonene av omdannet human 21.6 VL-regionen. Enhetene i FRene i La som skiller seg fra de i REI-sekvensen er understreket. I Lb er bare de enhetene i rammeverkregionene som skiller seg fra de i REI vist. Figur 7: Sammenligninger av aminosyresekvensene i mus og omdannet human 21.6- (Sekv. Id. Nr:9) tungkjede variable regioner. Aminosyre-enhetene som er en del av de vedtatte sekvensene i Chothia CDR-løkkestrukturene er merket med en stjerne. 2<*>CL (Sekv. Id. Nr: 10) viser FRene og CDRene fra VH-regionen fra humant 21/28<*>CL-antistoff. Ha (Sekv. Id. Nr: 11), Hb (Sekv. Id. Nr: 12) og Hc (Sekv. Id. Nr: 13) er de tre versjonene av omdannet human 21.6 VH-region. Enhetene i FRene i Ha som skiller seg fra de i 21/28 CL-sekvensen er understreket. I Hb og Hc er bare de enhetene i rammeverkregionene som skiller seg fra de i 21/28* CL vist. Figur 8: PCR-basert konstruksjon av versjon "a" i omdannet human 21.6 lettkjede variabel region. De prikkede linjene indikerer en komplementær sekvens på minst 21 baser mellom primerne. Figur 9: PCR-basert konstruksjon av versjon "a" i omdannet human 21.6 tungkjede variabel region. Figur 10: cDNA- og aminosyresekvenser (Sekv. Id. Nr: 14 og 15) av den første versjonen ("a") av omdannet human 21.6 lettkjede variabel region. Figur 11: DNA- og aminosyresekvenser (Sekv. Id. Nr: 16 og 17) av den første versjonen ("a") av omdannet human 21.6 tungkjede variabel region. Figur 12: ELISA-sammenligning av kimære og omdannede humane 21.6 antistoffer for å binde L-celler som uttrykker human a4p1-integrin på overflaten deres. Figur 13: Sammenligning av mus 21.6-antistoff med et annet anti-VLA-4-antistoff, L25. Panel A sammenligner antistoffenes evne tii å blokkere binding av U937 monocyttiske celler til renset VCA-1 ved tilstedeværelsen og fraværet av Mn<2+>. Panel B sammenligner antistoffenes evne til å blokkere binding av Jurkat-celler til økende konsentrasjoner av
VCAM-1.
Figur 14: Forsinkelse av vekttap hos dyr som er behandlet med mus eller human 21.6-antistoff. Figur 15: Reversering av kliniske symptomer hos dyr som er behandlet med mus eller humant 21.6-antistoff. Figur 16: Reversering av vekttap hos dyr som er behandlet med mus eller human 21.6-antistoff.
DEFINISJONER
Forkortelser for de tyve naturlig forekommende aminosyrene følger konvensjonelt bruk (Immunology - A Synthesis (2. ed. E.S. Golub & D.R. Gren red. Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tyve konvensjonelle aminosyrene, ikke-naturiige aminosyrer så som a.a-disubstituerte aminosyrer, N-alkyl-aminosyrer, melke-syre og andre ikke-konvensjonelle aminosyrer, kan også være velegnede komponenter for polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ikke-konvensjonelle aminosyrer omfatter 4-hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, e-N,N,N-trimetyllysin, s-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, co-N-metylarginin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin). Aminosyrer kan videre bli modifisert ved glykosylering, fosforylering og lignende.
I polypeptid-betegnelsen anvendt her er den venstre retningen den aminoterminale retningen og den høyre retningen er den karboksyterminale retningen, i samsvar med vanlig bruk og konvensjon. På samme måte, dersom ikke annet er spesifisert, er den venstre enden av enkelttrådete polynukleotidsekvenser 5 - enden; den venstre retningen av dobbelttrådete polynukleotidsekvenser er referert til som 5'-retningen. Retningen på 5'- til 3'-tilsetting av nakent RNA-transkript er referert til som transkripsjonsretningen; sekvensregioner på DNA-tråden som har den samme sekvensen som RNAet, og som er 5' for 5'-enden av RNA-transkriptet er referert til som "oppstrøms-sekvenser"; sekvensregioner på DNA-tråden som har den samme sekvensen som RNAet, og som er 3' for 3'-enden av RNA-transkriptet er referert til som "nedstrøms-sekvenser".
Angivelsen "polynukleotidsekvens" refererer til en enkel- eller dobbelt-trådet polymer av deoksyribonukleotid eller ribonukleotidbaser lest fra 5'til 3'-enden. Dette inkluderer selvreplikerende plasmider, infeksiøse polymerer av DNA eller RNA og ikke-funksjonelt DNA eller RNA.
De følgende begrepene er anvendt for å beskrive sekvens-slektskap mellom to eller flere polynukleotider: "referansesekvens", "sammenligningsvindu", "sekvensidentitet", "prosent sekvensidentitet" og "vesentlig identitet". En "referansesekvens" er en definert sekvens anvendt som en basis for en større sekvenssammenligning; en referansesekvens kan være et subsett av en større sekvens, f.eks. som et segment av en fullengde cDNA eller gensekvens gitt i en sekvensliste, så som polynukleotidsekvensen i figurene 1 eller 2, eller kan omfatte en komplett DNA eller gensekvens. Generelt er en referansesekvens minst 20 nukleotider lang, ofte minst 25 nukleotider lang og ofte minst 50 nukleotider lang. Siden to polynukleotider hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs en del av den komplette polynukleotidsekvense) som er lignende for de to polynukleotidene og
(2) videre kan omfatte en sekvens som er forskjellig for de to polynukleotidene, blir sekvens-sammenligninger mellom to (eller fler) polynukleotider er typisk utført ved å sammenligne sekvenser i de to polynukleotidene over et "sammenligningsvindu" for å identifisere og sammenligne lokale regioner med sekvenslikhet. Et "sammenligningsvindu", som anvendt her, referer til et konseptuelt segment på minst 20 kontinuerlige nukleotidposisjoner hvor en polynukleotidsekvens kan bli sammenlignet med en referansesekvens på minst 20 kontinuerlige nukleotider, og hvor delen av polynukleotidsekvensen i sammenligntngsvinduet kan omfatte insersjoner eller delesjoner (dvs. gap) på 20 prosent eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter insersjoner eller delesjoner) for optimal oppstilling av de to sekvensene. Optimal oppstilling av sekvenser for oppstilling av et sammenligningsvindu kan bli utført ved den lokale homologi-algoritmen til Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), ved homologi-oppstillingsalgoritmen til Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), ved søk for likhet-metoden til Pearson & Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 85:2444
(1988) (som alle er tatt med her i sin helhet ved referanse for alle formål), ved computer-implementeringer av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i the Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) eller ved inspeksjon, og den beste oppstillingen (dvs den som resulterer i den høyeste prosenten med sekvenslikhet gjennom sammenligningsvinduet) generert ved de ulike metodene blir valgt. Begrepet "sekvensidentitet" betyr at to polynukleotidsekvenser er identiske (dvs på en nukleotid mot nukleotidbasis) over sammenligningsvinduet. "Prosent sekvensidentitet" blir kalkulert ved å sammenligne to optimalt oppstilte sekvenser gjennom sammenligningsvinduet, bestemme antall posisjoner hvor den identiske nukleinsyrebasen (dvs. A, T, C, G, U eller I) forekommer i begge sekvensene for å gi antallet like posisjoner, dele antallet av like posisjoner med det totale antallet posisjoner i sammenligningsvinduet (dvs. vindus-størrelsen), og multiplisere resultatet med 100, hvilket gir prosent sekvensidentitet. Begrepene "vesentlig identitet" som anvendt her betegner en karakteristikk av en polynukleotidsekvens, hvor polynukleotidet omfatter en sekvens som har minst 85 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis på minst 90 til 95 prosent sekvensidentitet, mer vanlig på minst 99 prosent sekvensidentitet sammenlignet med en referanse sekvens over et sammenligningsvindu på minst 20 nukleotidposisjoner, vanligvis over et vindu på minst 25-50 nukleotider, hvor prosenten sekvensidentitet er beregnet ved å sammenligne referansesekvensen mot polynukleotidsekvensen som kan inkludere delesjoner eller addisjoner som utgjør 20 prosent eller mindre av referansesekvensen over sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være et subsett av en større sekvens, f.eks. sekvensen vist i Figurene 1 eller 2.
Som anvendt for polypeptider betyr begrepet "sekvensidentitet" peptider som har identiske aminosyrer i korresponderende posisjoner. Begrepet "sekvenslikhet" betyr peptider som har identiske eller lignende aminosyrer (dvs. konservative substitusjoner) i korresponderende posisjoner. Begrepet "vesentlig identitet" betyr at to peptidsekvenser, når de er oppstilt optimalt, så som ved programmene GAP eller BESTFIT ved anvendelse av default-gap-verdier, har minst 80 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 prosent sekvensidentitet, mer foretrukket minst 95 prosent sekvensidentitet eller mer (f.eks. 99 prosent sekvensidentitet). De posisjoner som ikke er identiske vil fortrinnsvis skilles ved konservative aminosyresubstitusjoner. Begrepet "vesentlig likhet" betyr at to pepti-sekvenser har tilsvarende prosentdeler med sekvenslikhet.
Begrepet "hovedsakelig rent" betyr at objektet er den dominerende arten som er tilstede (dvs. på en molar basis er den mer tallrik enn noen andre individuelle arter i komposisjonen), og fortrinnsvis er en hovedsakelig renset fraksjon en komposisjon hvor objektet omfatter minst omtrent 50 % (på en molar basis) av alle makromolekylartene som er tilstede. Generelt vil en hovedsakelig ren komposisjon omfatte mer enn omtrent 80 til 90 prosent av alle makromolekyl-arter som er tilstede i komposisjonen. Mest foretrukket er objektet renset til essensiell homogenisitet (kontaminerende arter kan ikke bli detektert i komposisjonen ved konvensjonelle deteksjonsmetoder) hvor komposisjonen i all hovedsak består av en enkelt makromolekylær art.
For det formål å klassifisere aminosyresubstitusjoner som konservative eller ikke-konservative aminosyrene gruppert som følger: gruppe I (hydrofobe sidekjeder): norleucin, met, ala, val, leu, ile; gruppe II (nøytrale hydrofile sidekjeder): cys, ser, thr; gruppe III (sure sidekjeder): asp, glu; gruppe IV (basiske sidekjeder): asn, gin, his, lys, arg; gruppe V (enheter som influerer på kjede-orientering): gly, pro; og gruppe VI (aromatiske sidekjeder) trp, tyr, phe). Konservative substitusjoner involverer substitusjoner mellom aminosyrer i den samme klassen. Ikke-konservative substitusjoner består i utbytting av et medlem i en av disse klassene med et annet.
Aminosyrer fra de variable regionene av de modne tung og lettkjedene i immunoglobuliner er betegnet hhv. Hx og Lxx, hvor x er et nummer som betegner posisjonen av aminosyren i samsvar med skjemaet til Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD
(1987) og (1991)) (heretter er begge referert til som Kabat et al.,", tatt med her som referanse i sin helhet for alle formål). Kabat et al., lister opp mange aminosyresekvenser for antistoffer for hver subklasse, og lister opp de mest vanlig forekommende aminosyrene for hver enhetsposisjon i den subklassen. Kabat et al., anvender en metode for å gi et enhetsnummer til hver aminosyre i en opplistet sekvens, og denne metoden for å gi enhetsnumre er blitt standard på området. Kabat et ars skjema er utvid bart til andre antistoffer som ikke er inkludert i kompendiet ved å oppstille det aktuelle antistoffet med en av konsensus-sekvensene i Kabat et al. Anvendelse av Kabat et al. nummereringssystemt gjør det lett å identifisere aminosyrene i ekvivalente posisjoner i ulike antistoffer. F.eks.. okkuperer en aminosyre i posisjon L50 i et humant antistoff den tilsvarende posisjonen som en aminosyreposisjon L50 i et muse-antistoff.
DETALJERT BESKRIVELSE
I Humaniserte antistoffer spesifikke for VLA- 4
Ved en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er humaniserte immunoglobuliner (eller antistoffer) spesifikke for alfa-4-subenhet av VLA-4 tilveiebragt. De humaniserte immunoglobulinene har variable rammeverkregioner hovedsakelig fra et humant antistoff (kalt et akseptar immunoglobulin) og komplementaritetsbestemmende regioner er hovedsakelig fra et muse-immunoglobulin kalt mu MAb 21.6 (referert til som donor-immunoglobulinet). Den(de) konstante region(ene) er også hovedsakelig fra et humant immunoglobulin dersom den(de) er tilstede. De humaniserte antistoffene utviser en spesifikk bindingsaffinitet for VLA-4 på minst 10<7>,10<8>,10<9> eller 1010M*<1>. Vanligvis er den øvre grensen av bindingsaffinitet til de humaniserte antistoffene for VLA-4 innenfor en faktor på tre eller fem av den for mu MAb 21.6 (omtrent 10<9> M'<1>). Ofte er den lavere grensen for bindingsaffinitet også innenfor en faktor på tre eller fem av den for mu MAb 21.6.
A Generelle karakteristika for immuno<g>lobuliner
Den grunnleggende antistoffstrukturenheten er kjent å omfatte en tetramer. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par med polypeptidkjeder idet, hvert par har en "lett"- (omtrent 25 kDa) og en "tung"- (omtrent 50-70 kDa) kjeder: Den aminoterminale delen av hver kjede omfatter en variabel region på omtrent 100 til 110 eller f ler aminosyrer som primært er ansvarlig for antigen-gjenkjenning. Den karboksyterminale delen av hver kjede definererer en konstant region som primært er ansvarlig for effektorfunksjon.
Lett-kjeder er klassifisert som enten kappa eller lambda. Tungkjeder er klassifisert som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon, og definerer antistoffets isotype som hhv IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. Innen lett og tungkjeder er de variable og konstante regionene koblet sammen ved en "J"-region på omtrent 12 eller fler aminosyrer, hvor tungkjeden også omfatter en "D"-region på omtrent 10 flere aminosyrer. (Se generelt, Fundamental Immunology (Paul, W., red. 2.ed. Raven Press, N.Y., 1989) Ch. 7 (tatt med ved referanse i dens helhet for alle formål).
De variable regionene i hvert lett/tungkjede par danner det antistoff-bindende setet. Kjedene utviser alle den samme generelle strukturen med relativt konserverte rammeverkregioner (FR) koblet ved tre hypervariable regioner, også kalt komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR. CDRene fra de to kjedene i hvert par er oppstilt ved rammeverkregioner, noe som tillater binding til en spesifikk epitope. CDR og FR-enheter er delineært i samsvar med standard sekvensdefinisjoner ifølge Kabat et al., supra. En alternativ strukturell definisjon er blitt foreslått av Chothia et al., J. Mol. Biol: 196: 901-917 (1987); Nature 342:878-883 (1989); og J. Mol. Biol 186:651-663 (1989) (heretter er alle tatt med som "Chothia et al" og tatt med ved referanse i deres helhet for alle formål). Når rammeverkposisjoner, som definert av Kabat et al, supra, utgjør strukturelle løkke-posisjoner som definert av Chothia et al, supra, blir vanligvis aminosyrene tilstede i muse-antistoffet inkorporert i det humaniserte antistoffet.
B. Produksjon av humaniserte antistoffer
mMus MAb 21. 6
Utgangs-materialet for produksjon av humaniserte antistoffer er mu MAb 21.6. Isoleringen og egenskapene til dette antistoffet er beskrevet i USSN 07/871 223. Mu MAb 21.6 er spesifikt for alfa-4-subenheten av VLA-4, og er blitt vist å inhibere human lymfocyttbinding til vevskulturer fra rotte hjerneceller som er stimulert med tumornekrosefaktor.
Kloningen og sekvenseringen av cDNA som koder for mu MAb 21.6 antistoff tung- og lettkjede variable regioner er beskrevet i eksempel 1, og nukleotid og beregnede aminosyresekvenser er vist i fig. 1 og 2. Disse figurene illusterer også underinndelingen av de aminosyrekodende sekvensene i rammeverk- og komplementaritetsbestemmende domener. Fra N-terminal til C-terminal omfatter både lett og tungkjeder domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Benevnelsen av aminosyrene til hvert domene er i samsvar med nummereringskonversjonen ifølge Kabat et al., supra.
( 2) Seleksjon av humane antistoffer for å fremskaffe rammeverk- enheter
Substitusjon av mus CDR i humane variable domene-rammeverk resulterer mest sannsynlig opprettholdelse av deres korrekte romlige orientering hvis det humane variable domene-rammeverket adopterer den samme eller lignende konformasjon som det variable rammeverket fra mus som CDR stammet fra. Dette oppnås ved å ta de humane variable domenene fra humane antistoffer hvis rammeverksekvenser utviser en høy grad av sekvensidentitet med de murine variable rammeverkdomenene fra hvilken CDR ble avledet. De tung og lettkjede variable rammeverkregionene kan bli avledet fra samme eller ulike humane antistoffsekvenser. De humane antistoffsekvensene kan være sekvenser fra naturlig forekommende humane antistoffer eller kan være konsensus-sekvenser fra flere humane antistoffer. Se Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773
(1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993).
Egnede humane antistoffsekvenser blir identifisert ved computer-sammenligninger av aminosyresekvensene fra de mus variable regionene med sekvenser fra kjente humane antistoffer. Sammenligningen er utført separat for tung og lettkjeder, men prinsippene er like for begge. Denne sammenligningen viser at mu 21.6 lettkjeden viser den største sekvensidentiteten til humane lettkjeder av subtype kappa 1, og at mu 21.6 tungkjeden viser størst sekvensidentitet tii human tungkjede av subtype en, som definert av Kabat et al., supra. Lette og tunge humane rammeverkregioner blir således vanligvis avledet fra humane antistoffer fra disse subtypene eller fra konsensus-sekvenser fra slike subtyper. De foretrukne lett- og tung-kjede humane variable regionene som viser størst sekvensidentitet med de korresponderende regioner fra mu MAb 21.6 er hhv. fra antistoffene RE1 og 21/28'CL.
( 3) Computer- modellering
De unaturlige juxtaposisjonene av murine CDR-regioner med humane variable rammeverkregionen kan resultere i unaturlige konformasjons-begrensninger, som kan føre til tap av bindingsaffinitet dersom dette ikke korrigeres ved substitusjon av visse aminosyre-enheter. Seleksjonen av aminosyre-enheter for substitusjon blir delvis bestemt ved computer-modellering. Computer-maskinvare og programvare for å produsere tredimensjonale bilder av immunoglobulinmolekyler er lett tilgjengelig. Generelt blir molekylære modeller produsert ved å starte med løste strukturer for immunoglobulinkjeder, eller domener derav. Kjedene som skal modelleres blir sammenlignet for aminosyre-sekvenslikhet med kjeder eller domener av løste tredimensjonale strukturer, og kjedene eller domenene som viser den største sekvenslikheten blir valgt som startpunkter for konstruksjon av den molekylære modellen. F.eks. for den lette kjeden av mu MAb 21.6 var human lettkjede RE1 det startende punktet for modellering av rammeverkregionene, CDR1 og CDR2 regionene. For CDR3-regionen var startpunktet CDR3-regionen fra lettkjeden av et annet humant antistoff, HyHEL-5. Det løste startstrukturen er modifisert for å tillate forskjeller mellom de aktuelle aminosyrene i immunoglobulinkjedene eller domenene som skal bli modelleres, og de i utgangsstrukturen. De modifiserte strukturene blir så satt sammen til et sammensatt immunoglobulin. Til slutt blir modellen forbedret ved energi-minimalisering og ved å verifisere at alle atomene er innenfor egnede distanser fra hverandre og at båndlengder og -vinkler er innenfor kjemisk aksepterbare grenser. Eksempel 4 angir mer detaljert trinnene som er gjort for å produsere en tredimensjonal computermodell for de variable regionene i mu MAb 21.6, og modellen er vist i figur 5. Denne modellen kan igjen fungere som et startpunkt for å beregne den tredimensjonale strukturen til et antistoff som inneholder mu MAb 21.6 komplementaritetsbestemmende regioner som er substituert i humane rammeverkstrukturer. Ytterligere modeller kan bli konstruert som representerer strukturen når ytterligere aminosyresubstitusjoner som skal blir beskrevet nedenfor blir introdusert.
( 4) Substitusjon av aminosyre- enheter
Som bemerket ovenfor omfatter de humaniserte antistoffene ifølge oppfinnelsen variable rammeverkregioner som hovedsakelig er fra et humant immunoglobulin og komplementaritetsbestemmende regioner som hovedsakelig er fra et mus immunoglobulin kalt mu MAb 21.6. Etter å ha identifisert de komplementaritetsbestemmende regionene til mu MAb 21.6 og egnede humane akseptor-immunoglobuliner er det neste trinnet å bestemme hvilke, hvis noen, enheter fra disse komponentene som bør erstattes for å optimalisere egenskapene til det resulterende humaniserte antistoffet. Generelt bør erstatning av humane aminosyre-enheter med murine minimaliseres, på grunn av at introduksjon av murine enheter øker faren for at antistoffet utløser en HAMA-respons hos mennesker. Aminosyrer blir valgt for substitusjon på grunnlag av deres mulige innvirkning på CDR-konformasjon og/eller binding til antigen. Undersøkelser av slike mulige påvirkninger skjer ved modellering, undersøkelse av karakteristikkene til aminosyrene ved spesielle lokasjoner eller empiriske observasjoner av effektene av substitusjon eller mutagenese av spesielle aminosyrer.
Når en aminosyre er forskjellig hos en mu MAb 21.6 variabel rammeverkregion og en ekvivalent human variabel rammeverkregion, bør normalt den humane rammeverkaminosyren bli erstattet med den ekvivalente museaminosyren hvis det er rimelig å anta at aminosyren
(1) ikke-kovalent binder antigen direkte (f.eks. aminosyrene ved posisjonene L49 og L69 i mu MAb 21.6), (2) er nabostilt med en CDR-region, er del av en CDR-region under den alternative definisjonen foreslått av Chothia et al., supra, eller på annen måte interagerer med en CDR-region (f.eks.. er innenfor omtrent 3Å av en CDR-region) (f.eks.. aminosyrer ved posisjonene L45, L58, H27, H28, H29, H30 og H71 i mu MAb 21.6) eller (3) deltar i Vi_-VH-grenseflaten (f.eks. aminosyrene ved posisjon H44 av mu MAb 21.6).
Andre kandidater for substitusjon er akseptor humane rammeverkamino-syrer som er uvanlige for et humant immunoglobulin i den posisjonen (f.eks. aminosyrer ved posisjonene L104, L105 og L107 i mu MAb 21.6). Disse aminosyrene kan bli erstattet med aminosyrer fra de ekvivalente posisjoner i mer typiske humane immunoglobuliner. Alternativt kan aminosyrer fra ekvivalente posisjoner i mus MAb 21.6 bli introdusert i de humane rammeverkregionene når slike aminosyrer er typiske for human immunoglobulin i ekvivalente posisjoner.
Generelt er substitusjon av alle eller de fleste av aminosyrene som oppfyller kriteriene ovenfor ønskelig. Av og til er det imidlertid noe uklart hvorvidt en spesiell aminosyre oppfyller kriteriene ovenfor, og alternative variantimmuno-globuliner produseres, hvor en har den spesielle substitusjonenmens den andre ikke har den. De humaniserte antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse vil normalt omfatte en substitusjon av en humant lettkjede rammeverkenhet med en korresponderende mu MAb 21.6-enhet i minst 1,2 eller 3, og mer vanlig 4 av de følgende posisjoner: L45, L49, L58 og L69. De humaniserte antistoffene omfatter også normalt en substitusjon av en human tungkjederammeverkenhet i minst 1, 2, 3, eller 5, og av og til 6 av de følgende posisjonene: H27, H28, H29, H30, H44 og H71. H36 kan også eventuelt bli erstattet. Ved foretrukne utførelsesformer når det humane lettkjede akseptor-immunoglobulinet er RE1, omfatter lettkjeden også substitusjoner i minst 1 eller 2, og mer vanlig 3 av de følgende posisjonene: L104, L105 og L107. Disse posisjonene er erstattet med aminosyren fra den ekvivalente posisjonen fra et humant immunoglobulin som har en mer typisk aminosyre-enhet. Egnede aminosyrer for substitusjon er vist i figurene 6 og 7.
CDR-regionene i humaniserte antistoffer er vanligvis i hovedsak identiske, og mer vanlig identisk med de korresponderende CDR-regionene i mu MAb 21.6 antistoffet. Av og til er det imidlertid ønskelig å endre en av enhetene i en CDR-region. Eksempel 5 identifiserer f.eks. en aminosyrelikhet mellom mu MAb 21.6 CDR3 og VCAM-1-liganden. Denne observasjonen antyder at bindingsaffiniteten til humaniserte antistoffer kan bli forbedret ved å redesigne tungkjede CDR3-regionen til å ligne VCAM-1 enda mer. I samsvar med dette kan en eller flere aminosyrer fra CDR3-domenet bli erstattet med aminosyrer fra VCAM-1 - bindingsdomenet. Selv om det vanligvis ikke er ønskelig, er det noen ganger mulig å lage en eller flere konservative aminosyresubstitusjoner av CDR-enheter uten å nevneverdig påvirke bindingsaffiniteten av det resulterende humaniserte immunoglobulinet.
Utenom de spesifikke aminosyresubstitusjonene som er diskutert ovenfor, er rammeverkregioner av humaniserte immunoglobuliner vanligvis hovedsakelig identiske, og mer vanlig identiske med rammeverkregionene til de humane antistoffer hvorfra de er avledet. Mange av aminosyrene i rammeverkregionen gir selvfølgelig små eller ingen direkte bidrag til spesifisiteten eller affiniteten til et antistoff. Mange individuelle konservative substitusjoner av rammeverk-enheter kan således bli tolerert uten nevneverdig endring av spesifisiteten eller affiniteten av det resulterende humaniserte immunoglobulinet. Generelt er imidlertid slike substitusjoner uønskelige.
( 5) Produksjon av variable regioner
Etter konseptuelt å ha valgt CDR og rammeverkkomponentene til humaniserte immunoglobuliner er en rekke metoder tilgjengelige for å produsere slike immunoglobuliner.
På grunn av degenerertheten i koden vil en rekke nukleinsyresekvenser kode for hver immunoglobulin aminosyresekvens. De ønskede nukleinsyre-sekvensene kan bli produsert ved de novo fast-fase DNA-syntese eller ved PCR-mutagenese av en tidligere preparert variant av det ønskede polynukleotidet. Oligonukleotidmediert mutagenese er en foretrukket metode for å preparere substitusjon, delesjon og insersjonvarianter av målpolypeptid-DNA. Se Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Mål-polypeptid-DNA blir endret ved å hybridisere en oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjonen til en enkelttrådet DNA-templat. Etter hybridisering blir en DNA-polymerase anvendt for å syntetisere en hel andre komplementær tråd av templatet som inkorporerer oligonukleotid-primeren, og som koder for den valgte endringen i mål-polypeptid-DNA.
( 6) Seleksjon av konstant region
De variable segmentene fra humaniserte antistoffer produsert som beskrevet ovenfor er typisk koblet til i det minste en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den fra et humant immunoglobulin. Humane konstant-region DNA-sekvenser kan bli isolert i samsvar med velkjente prosedyrer fra en rekke humane celler, men fortrinnsvis udødeliggjorte B-celler (se Kabat et al., supra, og WO87/02671) (som hver er tatt med ved referanse i deres helhet for alle formål). Antistoffet vil normalt omfatte både lettkjede og tungkjede konstante regioner. Tungkjede-konstantregionen omfatter normalt CH1-, hengsel-, CH2-, CH3- og CH4-regioner.
De humaniserte antistoffene omfatter antistoffer som har alle typer konstante regioner, omfattende IgM, IgG, IgD, IgA og IgE og alle isotyper, omfattende lgG1, lgG2, lgG3 og lgG4. Når det er ønsket at det humaniserte antistoffet skal oppvise cytotoksisk aktivitet er det konstante domenet vanligvis et komplementaritetsfestende konstant domene og klassen er typisk IgGi. Når slik cytotoksisk aktivitet ikke er ønskelig kan det konstante domenet være av lgG2-klassen. Det humaniserte antistoffet kan omfatte sekvenser fra mer enn en klasse eller isotype.
( 7) Ekspresjonssystemer
Nukleinsyrer som koder for humaniserte lett- og tungkjede variable regioner, eventuelt bundet til konstante regioner, er satt inn i ekspresjonsvektorer. Lett og tungkjeder kan bli klonet i den samme eller ulike ekspresjonsvektorer. DNA-segmentene som koder for immunoglobulinkjeder er operabelt koblet til kontrollsekvenser i ekspresjonsvektorer) som sikrer ekspresjon av immunoglobulin-polypeptider. Slike kontrollsekvenser omfatter en signalsekvens, en promoter, en enhancer og en transkripsjons-terminatorsekvens. Ekspresjonsvektorer er typisk replikerende i vertsorganismene enten som episomer eller som en integrert del av vertens kromosomale DNA. Normalt vil ekspresjonsvektorer inneholde seleksjonsmarkører, f.eks. tetracyklin eller neomycin for å tillate deteksjon av de cellene som er transformert med de ønskede DNA-sekvensene (se f.eks. US. Patent 4 704 362).
E. Coli er en prokaryot vert som er spesielt anvendelig for å klone polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre mikrobielle verter som er egnet for anvendelse omfatter basiller, så som Bacillus subtilus og andre entero-bakterier, så som Salmonella, Serratia og ulike Pseudomonas- arter. I disse prokaryote vertene kan en også lage ekspresjonsvektorer, som typisk vil omfatte ekspresjonskontrollsekvenser som er kompatible med vertscellen (f.eks. et replikasjonsorigo). I tillegg vil et antall ulike velkjente promotere være tilstede, så som laktose-promotersystemet, ettryptofan (trp) promotersystem, et beta-laktamase promotersystem eller et promotersystem fra fag lambda. Promoterene vil typisk kontrollere ekspresjon, eventuelt med en operatorsekvens, og har ribosombindingsetesekvenser og lignende, for å initiere og fullføre transkripsjon og translasjon.
Andre mikrober, så som gjær kan også bli anvendt for ekspresjon. Saccharomyces er en foretrukket vert, med egnede vektorer som har ekspresjonskontrollsekvenser, så som promotere, omfattende 3-fosfoglycerat-kinase eller andre glykolytiske enzymer, og et replikasjonsorigo, termineringssekvenser og lignende som ønsket.
I tillegg til mikroorganismer kan mammalsk vevcellekultur også bli anvendt for å uttrykke og produsere polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse (se Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987). Eukaryote celler er foretrukket, fordi et antall egnede vertscellelinjer som kan sekretere intakte immunoglobuliner er blitt utviklet innen feltet, og inkluderer CHO-cellelinjer, forskjellige Cos-cellelinjer, HeLa-celler, fortrinnsvis myeloma-cellelinjer eller transformerte B-celler eller hybridomer. Ekspresjonsvektorer for disse cellene kan inkludere ekspresjonskontrollsekvenser, så som et replikasjonsorigo, en promoter og en enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)), og nødvendige prosesseringsinformasjonsseter, så som ribosom-bindingsseter, RNA-spleiseseter, polyadenyleringsseter og transkripsjonsterm[nseringssekvenser. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser er promotere avledet fra immunoglobulin gener, SV40, adenovirus, bovint papilloma virus, cytomegalovirus og lignende.
Vektorene som inneholder polynukleotidsekvensene av interesse (f.eks. tung og lettkjede kodende sekvenser og ekspresjonskontrollsekvenser) kan bli overført til vertscellen ved velkjente metoder, som kan variere avhengig av typen cellulær vert. F.eks. blir kalsiumkloridtransfeksjon vanligvis anvendt for prokaryote celler, mens kalsiumfosfatbehandling eller elektroporering kan bli anvendt for andre cellulære verter. (Se generelt Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2.utg, 1989) (tatt med herved referanse i sin helhet for alle formål). Når tung og lettkjeder blir klonet i separate ekspresjonsvektorer blir vektorene kotransfektert for å oppnå ekpresjon og sammensetting av intakte immunoglobuliner.
Når de er uttrykt kan komplette antistoffer, deres dimerer, individuelle lett og tungkjeder, eller andre immunoglobulinformer ifølge den foreliggende oppfinnelsen, bli renset ifølge standard prosedyrer innen feltet, omfattende ammoniumsulfat-presipitering, affinitetskolonner, kolonnekromatografi, gelelektroforese og lignende (se generelt Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Hovedsakelig rene immunoglobuliner med minst 90 til 95% homogenisitet er foretrukket, og 98 til 99% eller høyere homogenisitet er mest foretrukket for farmasøytiske anvendelser.
C. Fragmenter fra humaniserte antistoffer
Ved en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fragmenter av humaniserte antistoffer. Typisk utviser disse fragmentene spesifikk binding til VLA-4-antigenet med en affinitet på minst 10<7> M"<1>, og mer normalt typisk 10<8> eller 10<9> M"<1>. Humaniserte antistoff-fragmenter omfatter separate tungkjeder, lettkjeder Fab, Fab' F(ab')2, Fabc og Fv. Fragmenter blir produsert ved rekombinante DNA-teknikker, eller ved enzymatisk eller kjemisk separasjon av intakte immunoglobuliner.
II. Nukleinsyrer
De humaniserte antistoffene og fragmenter derav blir normalt produsert ved ekpresjon av nukleinsyrer. Alle nukleinsyrer som koder for et humanisert antistoff eller et fragment derav, som er beskrevet i denne søknaden, omfattes av oppfinnelsen.
III. Computere
Det beskrives computere som er programmert for å vise tredimensjonale bilder av antistoffer på en skjerm. F.eks.. er en Silicon Graphics IRIS 4D-arbeidsstasjon som kjører med UNIX-operativtsystem og anvender den molekylære modelleringspakken QUANTA (Polygen Corp. USA) egnet. Computere er nyttige for å visualisere modeller av varianter av humaniserte antistoffer. Generelt oppviser antistoffene ifølge oppfinnelsen allerede tilstrekkelig bindingsaffinitet. Det er imidlertid sannsynlig at antistoffer med enda sterkere bindingsaffinitet kan bli identifisert ved ytterligere variasjon av visse aminosyre-enheter. Det tredimensjonale bildet vil også identifisere mange ikke-kritiske aminosyrer, som kan underkastes konservative substitusjoner uten nevneverdig å påvirke bindingsaffiniteten til antistoffet. Samlet kan også konservative substitusjoner ha en signifikant effekt på egenskapene til et immunoglobulin. Det er imidlertid sannsynlig at mange individuelle konservative substitusjoner ikke signifikant vil ødelegge egenskapene til immunoglobulinene.
IV Testing av humaniserte antistoffer
De humaniserte antistoffene ifølge oppfinnelsen er testet ved en rekke tester. Disse omfatter en enkel bindingstest for å detektere eksistensen eller
styrken på binding av et antistoff til celler som bærer VLA-reseptoren. Antistoffene er også testet for deres evne til å blokkere interaksjonen av celler som bærer VLA-4-reseptoren med endotelceller som uttrykker VCAM-1-ligand. Endotelcellene kan bli dyrket og stimulert i kultur, eller kan være en komponent av naturlig
forekommende hjemevevssnitt. Se Yednock et al., supra og USSN 07/871 223. De humaniserte antistoffene er også testet for deres evne til å forhindre eller redusere inflammasjon og påfølgende paralyse i laboratoriedyr som har eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). EAE er fremkalt ved injeksjon av CD4<+> T-celler som er spesifikke for myelin basisk protein i et laboratoriedyr, eller ved direkte immunisering av dyr med myelin basiskt protein. Dette proteinet er lokalisert i sentralnervesystemet, og de reaktive T-cellene initierer destruksjon av lag som inneholder dette proteinet på en måte som stimulerer den autoimmune
responsen ved multippel sklerose. Se Yednock et al., supra, og samtidige USSN 07/871 223.
V. Farmasøytiske preparater
Oppfinnelsen tilveiebringer farmasøytiske preparater som skal anvendes for profylaktisk eller terapeutisk behandling, omfattende et aktivt terapeutisk agens, dvs. et humanisert 21.6 antistoff eller et bindingsfragment derav, og en rekke andre komponenter. Den foretrukne formen avhenger av den tilsiktede måten for administrering og terapeutiske applikasjoner. Preparatene kan også omfatte, avhengig av den ønskede formularen, farmasøytiske aksepterbare, ikke-toksiske bærere eller tynnere, som er definert som hjelpemidler som er vanlig anvendt for å formulere farmasøytiske preparater for administrering tii dyr eller mennesker. Fortynningsmidler blir valgt slik at det ikke påvirker den biologiske aktiviteten til kombinasjonen. Eksempler på slike fortynningsmidler er destillert vann, fysiologisk fosfat-bufret saltoppløsning, Ringers-løsning, dektrose-løsning og Hanks-løsning. I tillegg kan de farmasøytiske preparatene eller formuleringene også omfatte andre bærere, adjuvanser eller ikke-toksiske, ikke-terapeutiske, ikke-immunogene stabilisatorer og lignende.
VI. Diagnostiske metoder
De humaniserte antistoffene og deres bindingsfragmenter er nyttige for å detektere tilstedeværelse av celler som bærer VLA-4-reseptoren. Tilstedeværelse av slike celler i hjernen diagnostiserer en inflammatorisk respons, og kan signalisere behov for å begynne en terapeutisk metode som beskrevet nedenfor. Diagnose kan bli utført ved å fjerne en cellulær prøve fra en pasient. Mengden uttrykt VLA-4-antigen i individuelle celler i prøven blir så bestemt, f.eks. ved immunohistokjemisk farging av fikserte celler eller ved Westert blotting av et celleekstrakt med et humanisert MAb 21.6-antistoff eller et bindingsfragment derav.
Diagnose kan også bli oppnådd ved in wVo-administrasjon av merket humanisert MAb 21.6 (eller bindingsfragment) og deteksjon ved in wVo-avbildning. Konsentrasjonen av humansiert MAb 21.6 som blir administrert, må være tilstrekkelig til at bindingen til celler som har mål-antigenet er detekterbar sammenlignet med bakgrunnssignalet. Det diagnostiske reagenset kan bli merket med en radioisotop for kameraavbildning, eller paramagnetisk isotop for magnetisk resonans eller elektronspinn-resonansavbildning.
En endring (typisk en økning) i nivået av VLA-4-protein i en cellulær prøve eller avbildning fra et individ, som er utenfor omfanget av klinisk etablert normalet nivåer, kan indikere tilstedeværelse av en uønsket inflammatorisk responsreaksjon hos individet som prøven ble tatt fra, og/eller indikere en predisposisjon hos individet for å utvikle (eller gjennomgå) en slik reaksjon. VLA-4-proteinet kan også bli anvendt som en differensieringsmarkør for å identifisere og type celler av spesielle linjer og utviklingsopprinnelse. Slike celletypespesifikke deteksjoner kan bli anvendt for histopatologisk diagnostisering av uønskede immunresponser.
VII: Metoder for behandling
Det beskrives metoder for behandling som utnytter evnen humaniserte MAb 21.6 har tii å blokkere a4-avhengige interaksjoner med VLA-4-reseptoren. Den ct4-avhengige interaksjon av VLA-4-reseptoren med VCAM-1 -liganden på endotelceller er en tidlig begivenhet ved mange inflammatoriske responser, spesielt de i sentralnervesystemet. Uønskede sykdommer og lidelser som resulterer fra inflammasjon i sentralnervesystemet omfatter akutte sykdommer, så som slag og andre cerebrale traumer, og kroniske sykdommer, så som multippel sklerose, meningitt og encefalitt. Multippel sklerose er en progressiv neurologisk autoimmun sykdom som beregnet berører 250 000 til 350 000 personer i USA. Multippel sklerose er antatt å være et resultat av en spesifikk autoimmun reaksjon hvor visse leukocytter angriper og initierer destruksjonen av myelin, det isolerende laget som dekker nervefibere. I en dyremodell for multippel sklerose er murine monoklonale antistoffer rettet mot alfa-4-beta-1-integrin vist å blokkere adhesjonen av leukocytter til endotelet, og således forhindre inflammasjon av sentralnervesystemet og påfølgende paralyse hos dyret.
De humaniserte MAb 21.6 antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse gir mange fordeler fremfor muse-antistoffene som allerede er vist å være effektive i dyresystemer: 1) Det humane immunsystemet skal ikke gjenkjenne rammeverket eller konstantregionen av det humaniserte antistoffet som fremmed, og derfor bør antistoffresponsen mot et slikt injisert antistoff være mindre enn mot et totalt fremmed museantistoff, eller et delvist fremmed kimært antistoff. 2) Fordi effektordelen av det humaniserte antistoffet er humant kan det interagere bedre med andre deler av det humane immunsystemet. 3) Injiserte muse-antistoffer er blitt rapportert å ha en halveringstid i human sirkulasjonen som er mye kortere enn halveringstiden for normale humane antistoffer (Shaw et al., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987)). Injiserte humaniserte antistoffer har en halveringstid som i all hovedsak er ekvivalent med naturlig forekommende humane antistoffer, noe som tillater lavere og mindre hyppige doser.
De farmasøytiske preparatene som er beskrevet ovenfor kan bli administrert for forebyggende og/eller terapeutiske behandlinger av multippel sklerose eller andre inflammatoriske sykdommer, spesielt de i sentralnervesystemet. Ved terapeutiske anvendelser blir preparatene administrert til en pasient som antas å lide av, eller som allerede lider av, en sykdom så som multippel sklerose, i en mengde som er tilstrekkelig til å kurere, eller i det minste delvis stoppe, symptomene på sykdommen og dens komplikasjoner. En mengde som er tilstrekkelig til dette er definert som en terapeutisk eller farmasøytisk effektiv dose.
Ved forebyggende anvendelser er farmasøytiske preparater administrert til en pasient som er mottagelig for, eller på annet vis har en risiko for, en spesiell sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig til å eliminere eller redusere risikoen eller forsinke utbruddet av sykdommen. En slik mengde er definert å være en forebyggende effektiv dose. Hos pasienter med multippel sklerose i remisjon, kan risiko bli målt ved NMR-avbildning, eller i noen tilfeller, ved presymptomatiske indikasjoner observert av pasienten.
De farmasøytiske preparatene vil bli administrert ved parental, topisk, intravenøs, oral eller subkutan, intramuskulær lokal administrasjon, så som med aerosol eller transdermalt for forebyggende og/eller terapeutisk behandling. De farmasøytiske preparatene kan bli administrert i en rekke enhetsdoseformer avhengig av administreringsmetoden. F.eks. vil enhetsdoseformer egnet for oral administrasjon omfatter pulver, tabletter, piller, kapsler og pastiller.
Effektive doser av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse for behandlingen av de ovenfor beskrevne tilstander, vil variere avhengig av mange ulike faktorer, omfattende administreringsmåten, målsetet, den fysiologisk tilstand til pasienten og andre administrerte medikamenter. Behandlingsdosene må således bli titrert for å optimalisere sikkerhet og effektivitet. Disse komposisjonene kan bli administrert til pattedyr for veterinær anvendelse og for klinisk bruk på mennesker på samme måte som andre terapeutiske midler, dvs. i en fysiologisk aksepterbar bærer. Generelt vil administreringsdosen ligge i området fra omtrent 0,0001 til 100 mg/kg, og mer vanlig 0,01 til 0,5 mg/kg av vertens kroppsvekt.
VIII. Andre anvendelser
De humaniserte antistoffene er også nyttige for affinitetsrensing av VLA-4-reseptoren. Antistoffene blir immobilisert på en fast bærer, og en løsning av dispergerte proteiner blir sendt over bæreren. VLA-4 binder til bæreren, og blir derved separert fra andre proteiner. Det rensede VLA-4 eller et fragment derav, gjort tilgjengelig ved denne metoden, kan bli anvendt som en vaksine eller som et immunogen for å produsere ytterligere antistoffer.
De humaniserte antistoffene ifølge oppfinnelsen er også nyttige for å generere idiotype antistoffer ved f.eks.. immunisering av et dyr med et humanisert antistoff. Et anti-idiotype-antistoff hvis binding til det humaniserte antistoffet inhiberes ved VLA-4 eller fragmenter derav, blir valgt. På grunn av at både det anti-idiotype-antistoffet og VLA-4 eller fragmenter derav bindes til det humaniserte immunoglobulinet, kan anti-idiotype antistoffet representere det "interne bildet" av en epitope og kan således erstatte liganden til VLA-4-reseptoren, dvs VCAM-1.
EKSEMPLER
Eksempel 1: Kloning og sekvensering av mus 21. 6 variable regioner
Muse anti-VLA antistoff 21.6 er beskrevet i den samtidige søknad USSN 07/871 223. Total-RNA ble isolert fra hybridoma-celler som produserer mus 21.6 antistoff. Første-tråd cDNA ble syntetisert ved å anvende et kit (Pharmacia Biosystems Limited). Tung- og lettkjede variable regioner ble anskaffet ved å anvende PCR-primere som er designet for å hybridisere til sekvenser som flankerer og er eksterne for sekvensene som koder for de variable regionene, for derved å tillate kloning av hele de kodende sekvensene for mus 21.6-antistoff variable regioner. Sense PCR-primere som hybridiserer til 5'-endene av muse-kappa-lettkjede-leadersekvenser og til muse-tungkjede-leadersekvenser ble designet basert på databaser av 42 muse kappa lettkjede leadersekvenser og av 55 muse-tungkjede leadersekvenser (Jones & Bendig, Bio/Technology 9:88-89
(1991) (tatt med her ved referanse i deres helhet for alle formål). Disse primerne ble anvendt i forbindelse med anti-sense PCR-primere som hybridiserer til 3'-endene av de mus konstante regionene (kappa eller gamma).
Mus 21.6 kappa VL-regioner ble PCR-amplifisert i en 50 ul reaksjon som typisk inneholder 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 200 \ iM dNTP, 1,5 mM MgCl2,1 enhet Amplitaq (Perkin Eimer Cetus DNA-polymerase, VI cDNA-templat, 0,25 |iM MKV primer og 0,25 \ M mus kappa-lettkjede antisense PCR-primer (figur 1). Mus 21.6 Vn-regioner ble PCR-amplifisert som beskrevet ovenfor, bortsett fra at MHVH-primer og en antisense PCR-primer som er spesifikk for muse-lgG1-tungkjede konstant region ble anvendt (figur 2). Hver PCR-reaksjon ble kjørt 25 sykler, etter en initiell denaturering ved 94°C i 5 min, 94°C i 1 min, 55°C i 1 min og 72°C i 2 min. Fullførelsen av den siste syklusen ble fulgt av en siste forlengelse ved 72°C i 10 min. Tiden mellom primer-annealing og ekstensjonstrinn var 2,5 min. Etter PCR-amplifisering ble 10jil alikvoter fra hver reaksjon analysert på en ethidiumbromidfarget 1,5% agarosegel.
PCR-produktene ble klonet ved å anvende "TA-Cloning System" (Invitrogen Corporation). Vektorer som inneholder insersjoner av den korrekte størrelsen ble sekvensert ved å anvende dobbelttrådet plasmid-DNA og Sequenase (United States Biochemical Corporation). For å unngå feil som kunne ha blitt introdusert under PCR-amplifiseringstrinn ble minst to uavhengige PCR-amplifiserte og klonede DNA-fragmenter sekvensert for hver variable region.
Sekvensene på PCR-produktene ble sammenlignet med andre mus lettkjede og tungkjedevariable regioner (se tabellene 1 og 2). Denne sammenligningen indikerer at PCR-produktene fra MKV2 og MKV4-primerne representerer autentiske mus 21.6 kappa variable regioner, og de fra MHV1 og MHV2-primerne representerer autentiske mus VH-regioner, og det ble konkludert med at sekvensene fra disse produktene er de fra mus 21.6 antistoff variable regioner. DNA- og aminosyresekvensene av cDNA som koder for mus 21.6 VL og VH-regioner er vist i figurene 1 og 2.
<3>21/28'CL som sekvensert av Dersimonian et al., J. Immunol. 139:2496-2501
(1987).
Eksempel 2: Konstruksjon av kimært 21. 6 antistoff
Kimære lett- og tungkjeder ble konstruert ved å koble PCR-klonede cDNAer fra muse 21.6 Vl og Vn-regioner til humane konstante regioner. 5'- og 3'-endene av muse-cDNA-sekvensene ble modifisert ved å anvende spesielt designede PCR-primere. 5'-ende-PCR-primeme (tabell 3), som hybridiserer med DNA-sekvensene som koder for begynnelsen av leader-sekvensene, ble designet for å skape DNA-sekvensene som er essensielle for effektiv translasjon (Kozak, J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)), og for å kreere et Hindlll-restriksjonssete for å klone i en ekspresjonsvektor. 3'-ende-primerne (tabell 3), som hybridiserer med DNA-sekvensene som koder for endene av J-regionene, ble designet for å skape de DNA-sekvensene som er essensielle for spleising til konstante regioner, og for å kreere et BamHI-sete for å klone i en ekspresjonsvektor. Produktene fra PCR-amplifiseringen ble kuttet med Hindlll og BamHI, klonet i en pUC19-vektor og sekvensert for å bekrefte at ingen feil hadde skjedd under PCR-amplifiseringen. De adapterte muse 21.6 variable regionene ble så subklonet i pattedyrcelle-ekspresjonsvektorer som inneholdt enten de humane kappa eller gamma-1 konstante regionene.
Tabell 3
PCR-primere for konstruksjonen av kimært 21.6 antistoff
A. Lettkjede variabel region
1. Primer for rekonstruksjon av 5'-enden (37mer) (Sekv Id Nr: 18)
5' C AGA AAGCTT GCC GCC ACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG 3'
Hindlll Kozak konsensus- M R P Sl Q
sekvens
2. Primer for rekonstruksjon av 3'-enden (35mer) (Sekv Id Nr:19)
5' CC G AG GAT CCA CTC ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT 3'
BamHI Spleise-donorsete
B. Tungkjede variabel region
1. Primer for rekonstruksjon av 5'-enden (37mer) (Sekv Id Nr:20)
5' C AGA AAGCTT GCC GCC ACC ATG AAA TGC AGC TGG GTC 3'
Hindlll Kozak konsensus- M K C S W V
sekvens
2. Primer for rekonstruksjon av 3'-enden (33mer) (Sekv Id Nr:21)
5' CC GA G GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT GAC T 3'
BamHI Spleise-donorsete
Eksempel 3: Ekspresjon og analyse av 21. 6 kimært antistoff
De to plasmid-DNAene som koder for de kimære 21.6 lett- og tungkjedene ble kotransfektert i Cos-celler. Etter to eller tre dager ble mediet fra Cos-cellene analysert ved ELISA
(1) for produksjon av et humant IgG-lignende antistoff og
(2) for evnen til dette human-lignende antistoffet har til å binde L-celler som uttrykker human a4p1-integrin på deres overflate. Figurene 4 og 12 viser analyser av ikke-renset og protein-A-rensede prøver av kimært 21.6 antistoff for binding til humant <x4p1-integrin, sammenlignet med renset mus 21.6-antistoff-kontroll. Disse figurene viser at det kimære 21.6-antistoffet binder godt til antigen, og bekrefter at de korrekte muse 21.6 Vl og VH-regionene er blitt klonet.
Eksempel 4: Modellering strukturen av de mus 21. 6 variable regionene
En molekylær modell av Vl- og VH-regionene av mus 21.6 antistoff ble dannet. Denne modellen ble dannet med en Silicon Graphics IRIS 4D-arbeidsstasjon som kjører under UNIX-operativsystemet og ved å anvende den molekylære modelleringspakken QUANTA (Polygen Corp., USA). Strukturen av FRene fra mus 21.6 VL-regionen ble basert på den løste strukturen av human Bence-Jones immunoglobulin REI (Epp et al., Biochemistry 14:4943^952 (1975). Strukturen av FR'ene fra mus 21.6 VH-region ble basert på den løste strukturen av muse-antistoff Gloop2. Identiske enheter i Frene ble beholdt; ikke-identitske enheter ble substituert ved å anvende fasilitetene innen QUANTA. CDR1 og CDR2 fra mus 21.6 VL-region ble identifisert som tilhører hhv vedtatte strukturgrupper 2 og 1 (Chothia et al., supra). Siden CDR1 og CDR2 av REI tilhører de samme vedtatte gruppene, CDR1 og CDR2 fra mus 21.6, VL-region modellert ut fra strukturene av CDR1 og CDR2 fra REI. CDR3 fra mus 21.6-VL-region ser ikke ut til å korrespondere med noen av de vedtatte struktur-gruppene for CDR3 av Vi_-regioner. Et database-søk viste imidlertid at CDR3 i mus 21.6 VL-region lignet på CDR3 i mus HyHEL-5- VL-region (Sheriff et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8075-8079 (1987)). CDR3 fra mus 21.6 VL-region ble således modellert fra strukturen til CDR3 i mus HyHEL-5 VL-region. CDR1 og CDR2 fra mus 21.6 VH-region ble identifisert som tilhørende hhv. vedtatte strukturgrupper 1 og 2. CDR1 fra mus 21.6 VH-region ble modellert fra CDR1 fra Gloop2 VH-region som nært ligner medlemmer av vedtatte gruppe 1 for CDR1 av Vn-regioner. CDR2 fra mus 21.6 VH-region ble modellert fra CDR2 fra mus HyHEL-5 (Sheriff et al., supra), som også er et medlem av vedtatt gruppe 2 for CDR2 for VH-regioner. For CDR3 i VH-regioner er det ingen vedtatte strukturer. CDR3 i mus 21.6 VH-region lignet imidlertid CDR3 i mus R19.9 VH-region (Lascombe et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:607-611 (1989)) og ble modellert fra denne CDR3 ved å fjerne en ekstra serin-enhet som er tilstede ved apex av CDR3-løkken i mus R19.9 Vh-region, og anneale og forbedre gapet. Modellen ble tilslutt utsatt for bratteste nedganger og konjugert gradient energi-minimalisering ved å anvende CHARMM-potensial (Brooks et al., J. Comp. Chem. 4:187-217 (1983)) som lagt inn i QUANTA for å hemme ikke-fordelaktige atomkontakter og for å optimalisere van der Waals og elektrostatiske interaksjoner.
En oversikt over den strukturelle modellen av mus 21.6 variable regioner er presentert i figur 5. Modellen ble anvendt for å hjelpe til å forbedre designet av de humaniserte 21.6 antistoff variable regionene.
Eksempel 5: Design av omdannede humane 21. 6 variable regioner ( 1) Seleksjon av homologe humane antistoffer for rammeverksekvens
Humane variable regioner hvis FR viser en høy prosent identitet med de fra mus 21.6 ble identifisert ved å sammenligne aminosyresekvenser. Tabellene 4 og 5 sammenligner muse 21.6 variable regioner med alle kjente mus variable regioner og så med alle kjente humane variable regioner. Mus 21.6 VL-regionen ble identifisert som tilhørende mus kappa VL-region subgruppe 5 som definert av Kabat et al., supra. Individuelle mus kappa VL-regioner ble identifisert som hadde så mye som 93,4% identitet med mus 21.6 kappa VL-regionen (38C13VCL og PC613'CL). Mus 21.6 VL-region lignet mest human kappa VL-regioner fra subgruppe 1 som definert av Kabat et al., supra. Individuelle humane kappa VL-regioner ble identifisert som hadde så mye som 72,4%identitet med mus 21.6 kappa VL-regionen. Rammeverkregionene (FR) fra en av de mest lignende humane variable regionene, REI, ble anvendt ved designet av omdannet human 21.6 VL-region. Mus 21.6 VH-region ble identifisert som tilhørende mus Vn-region subgruppe 2c som definert av Kabat et al., supra. Individuelle mus tungkjede variable regioner ble identifisert som hadde så mye som 93,3% identitet med mus 21.6 VH-regionen (17.2.25'CL og 87.92.6'CL). Mus 21.6 VH-region lignet mest humane VH-regioner fra subgruppe 1 som definert av Kabat et al., supra. Individuelle humane VH-regioner ble identifisert som hadde så mye som 64,7% identitet med mus 21.6 VH-regionen. FRene fra en av de mest lignende humane variable regionene, 21/28'CL, ble anvendt ved designet av omdannet human 21.6 Vn-region.
( 2) Substitusjon av aminosyrer i rammeverkregioner
( a) Lettkjede
Det neste trinnet i design-prosessen for den omdannede humane 21.6 VL-regionen var å sette sammen med CDR fra mus 21.6 VL-region med FR fra human REI (Palm et al., supra). Ved den første versjonen av omdannet human 21.6 VL-region (La) ble syv endringer gjort i de human FRene (Tabell 4, figur 6).
Ved posisjonene 104, 105 og 107 i FR4 ble aminosyrer fra REI erstattet med mer typiske humane J-region-aminosyrer fra en annen human kappa lettkjede (Riechmann et al., Naute 332:323-327 (1988)).
Ved posisjon 45 i FR2 ble lysinet som normalt er tilstede i REI endret til arginin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VL-region. Aminosyre-enheten i denne posisjonen var antatt å være viktig for å støtte CDR2-løkken i mus 21.6 VL-regionen.
Ved posisjon 49 i FR2 ble tyrosinet som normalt er tilstede i REI endret til histidin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VL-regionen. Histidinet i denne posisjonen i mus 21.6 VL-region ble observert i modellen å være lokalisert i midten av bindingssetet og muligens kunne lage direkte kontakt med antigen under antistoff-antigen-binding.
Ved posisjon 58 i FR3 ble valinet som normalt er tilstede i REI endret til isoleucin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VL-regionen. Aminosyre-enheten i denne posisjonen var antatt å være viktig for å støtte CDR2-løkken i mus 21.6 VL-regionen.
Ved posisjon 69 i FR3 ble treoninet som normalt er tilstede i REI endret til arginin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VL-regionen. Argininet i denne posisjonen i mus 21.6 VL-region ble observert i modellen å være lokalisert ved siden av CDR1 -løkken i mus 21.6 VL-regionen og muligens kunne lage direkte kontakt med antigenet under antistoff-antigenbinding.
En annen versjon av omdannet human 21.6 VL-region (betegnet Lb) ble designet, som omfattet de samme substitusjonene som ovenfor, bortsett fra at ingen endring ble gjort ved posisjon 49 i FR2 i REI. (Figur 6).
( b) Tungkjede
Det neste trinnet i designprosessen for den omdannede humane 21.6 VH-regionen var å sette sammen CDRene fra mus 21.6 VH-region med FRene fra 21/28'CL (Dersimonian et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)). I den første versjonen av omdannet human 21.6 V-region (Ha) ble fem endringer gjort i de humane rammeverkregionene (tabell 5, figur 7). De fem endringene i de humane FRene var ved posisjonene 27, 28, 29, 30 og 71.
Ved posisjonene 27,28, 29 og 30 i FR1 ble aminosyrene som er tilstede i human 21/28'CL endret til aminosyrene som finnes ved disse posisjonene i mus 21.6 Vn-regionen. Selv om disse posisjonene er designet til å være innenfor FR1 (Kabat et al., supra) er posisjonene 26 til 30 deler av den strukturelle løkken som danner CDR1 -løkken i Vn-regionen. Det er derfor sannsynlig at disse aminosyrene i disse posisjonene er direkte involvert i binding til antigen. Posisjonene 27 til 30 er faktisk del av den vedtatte strukturen for CDR1 i VH-regionen som definert av Chothia et al., supra.
Ved posisjon 71 i FR3 ble argininet som er tilstede i human 21/28'CLendret til alanin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VH -regionen. Posisjon 71 er del av den vedtatte strukturen for CDR2 i Vn-regionen som definert av Chothia et ai., supra. Fra denne modellen av mus 21.6 variable regioner ser det ut til at alaninet ved posisjon 71 er viktig for å støtte CDR2-løkken i Vn-regionen. En erstatning av et arginin med alanin i denne posisjonen vil veldig sannsynlig ødelegge plasseringen av CDR2-løkken.
En andre versjon (Hb) av omdannet human 21.6 VH-region inneholder de fem endringene som er beskrevet ovenfor for versjon Ha, pluss en ytterligere endring i FR2.
Ved posisjon 44 i FR2 ble argininet som er tilstede i human 21/28'CL endret til glycin som funnet i den posisjonen i mus 21.6 VH-regionen. Basert på publisert informasjon om pakkingen av V|_-VH-regioner og modellen av mus 21.6 variabel region, var det antatt at aminosyrenenheten ved posisjon 44 kunne være viktig ved pakkingen av Vi_-VH-regionene (Chothia et al., supra) (figur 5).
Omdannet human 21.6 V-region versjon Hc ble designet for å lage CDR3-løkken mer likhuman VCAM-1. Både mus 21.6-antistoff og human VCAM-1 binder til a4p1-integrin. CDR3-løkken av VH-regionen i antistoffene er den mést diverger-ende av de seks CDR-løkkene, og er generelt den viktigste enkeltkomponenten av antistoffet i antistoff-antigeninteraksjoner (Chothia et al., supra; Hoogenboom & Winter J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992); Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:4457-4461 (1992)). Noe sekvenslikhet ble identifisert mellom CDR3 fra mus 21.6 VH-region og aminosyrene 86 til 94 fra human VCAM-1, særlig mellom YGN (tyrosin-glycin-asparagin)-sekvensen i CDR3-løkken og FGN (fenylalanin-glycin-asparagin)-sekvensen i VCAM-1. Disse sekvensene antas å være relatert med RGD (arginin-glycin-asparaginsyre)-sekvenser som er viktig i ulike celle-adhesjonsbegivenheter (Main et al., Cell 71:671-678 (1992)).
Ved posisjon 98 i CDR3 ble derfor tyrosinet som er tilstede i mus 21.6 VH-regionen endret til fenylalanin som funnet i sekvensen i human VCAM-1.
Mulige substitusjoner ved posisjon 36 i FR2 ble også tatt i betraktning. Mus 21.6 VH-kjeden omfatter en uvanlig cystein-enhet i posisjon 36 i FR2. Denne posisjonen i FR2 er vanligvis et tryptofan i relaterte mus og humane sekvenser (tabell 5). Selv om cysteinenheter ofte er viktig for konformasjon av et antistoff, indikerte ikke modellen av muse 21.6 variable regionene at denne cysteinenheten var involvert enten direkte eller indirekte med antigenbinding, så tryptofanet som er tilstede i FR2 fra human 21/28'CL VH-region ble ikke erstatte i noen av de tre versjonene av humanisert 21.6 antisotff.
Eksempel 6: Konstruksjon av omdannede humane 21. 6 antistoffer
Den første versjonen av omdannet human 21.6 VL-region (resh21.6VLa) ble konstruert fra overlappende PCR-fragmenter hovedsakelig som beskrevet av Daugherty et al., Nucleic Acids Res. 19:2471-2476 (1991). (se figur 8). Mus 21.6 VL-regionen, tilpasset som beskrevet i eksempel 2 og satt inn i pUC19, ble anvendt som templat. Fire par med primere, APCR1-vla1, vla2-vla3, vla4-vla5 og vla6-vla7 ble syntetisert (tabell 6 og figur 8). Nabostilte par overlappet med minst 21 baser. APCR1-primeren er komplementær med pUC19-vektoren. De egnede primer-parene (0,2 ^mol) ble kombinert med 10 ng templat DNA, og 1 enhet AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus) i 50 \ i\ PCR-buffer inneholdende 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 200 \ iM dNTP og 1,5 mM MgCI2. Hver reaksjon ble utført i 25 sykler. Etter en initiell smelting av 94C° i 5 min ble reaksjonene kjørt i sykler med 94C° i 1 min, 55C° i 1 min og 72C° i 2 min, og tilslutt inkubert ved 72° i ytterligere 10 min. Stigningstiden mellom primer-annealings- og -ekstensjonstrinnene var 2,5 min. Produktene fra de fire reaksjonene (A,B,C og D) fra den første runden av PCR-reaksjonene ble fenol-ekstrahert og etanolpresipitert.
Tabell 6
PCR-primere for konstruksjon av omdannede humane 21.6 variable regioner
A. Lettkjede variabel region
1. Primere for syntesen av versjon "a"
PCR-produktene A og B, og C og D ble koblet ved en andre runde med PCR-reaksjoner. PCR- produktene A og B, og C og D (50 ng av hver) ble satt til 50 fal PCR-reaksjoner (som beskrevet ovenfor) og amplifisert gjennom 20 sykler som beskrevet ovenfor, bortsett fra at annealingstemperaturen ble øket til 60°C. Produktene fra disse reaksjonen ble betegnet E og F. Parene med PCR-primere som ble anvendt var hhv. APCR1-vla3 og vla4-vla7. PCR-produktene E og F ble fenol-ekstrahert og etanol-presipitert, og så satt sammen ved en tredje runde med PCR-reaksjoner ved deres egne komplementariteter i en to-trinns-PCR-reaksjon lignende den beskrevet ovenfor ved å anvende APCR1 og vla7 som de terminale primerne. Det fullt sammensatte fragmentet som representerer hele den omdannede humane 21.6 VL-regioner omfattende en leader-sekvens, ble kuttet med Hindlll og BamHI og klonet i pUC19 for sekvensering. En klon som hadde den korrekte sekvensen ble betegnet resh21.6VLa.
Den andre versjonen av omdannet human 21.6 VL-region (Lb) ble konstruert ved å anvende PCR-primere for å lage små modifikasjoner i den første versjonen av omdannet human 21.6 VL-region (La) ved metoden til Kamman et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989). To sett primere ble syntetisert (tabell 6). Hver PCR-reaksjon ble hovedsakelig utført under de samme betingelsene som beskrevet ovenfor. I den første PCR-reaksjonen ble mutagen primer 21.6VLb2 anvendt for å ødelegge et Styl-sete (Thr-ACC-97 til Thr-ACA-97) for å gi resh21.6VLa2. I en annen PCR-reaksjon ble så mutagen primer 21.6 Vlb1 (His^9 til Tyr-49) anvendt med pUCresh21.6VLa2 som templat-DNA. PCR-produktet ble kuttet med Styl og BamHI og subklonet i pUC-resh21.6VLa2, kuttet med de samme restriksjonsenzymene. En klon med den korrekte sekvensen ble betegnet pUC-resh21.6VLb.
Versjon "a" av en omdannet human 21.6 Vn-region ble konstruert ved å anvende de samme PCR-metodene som beskrevet for konstruksjonen av versjon "a" av omdannet human 21.6 VL-region (tabell 6 og figur 9). Hindlll-BamHI DNA-fragmentene som koder for versjon "g" av omdannet human 425 Vn-region (Kettleborough et al., supra) og versjon "b" av omdannet human AUK12-20 Vn-region ble subklonet i pUC19-vektorer noe som ga hhv. pUC-resh425g og pUC-reshAUK12-20b. (Versjon "b" av AUK12-20 ble avledet ved PCR-mutagenese av et fragment VHa425 som beskrevet av Kettleborough et al., supra, og koder for aminosyresekvensen (Sekv Id Nr: 41):
Plasmid pUC-resh425g og pUC-reshAUK12-20b, så vel som pUC-vektoren som inneholder mus 21.6 VH-regionen som modifisert for anvendelse i konstruksjonen av den kimære 21.6 tungkjeden (pUC-chim21 -6VH)), ble anvendt som templat DNA i de påfølgende PCR- reaksjonene. PCR-primerne ble designet og syntetisert for konstruksjonen av versjon "a" av omdannet human 21.6 VH-region (tabell 6). PCR-produkt A (figur 9) ble oppnådd ved å anvende pUCreshAUK12-20b som DNA-templat og APCR1-vha1 som PCR-primerparet. PCR-produktene B og D ble oppnådd ved å anvende pUC-chim21.6VH som DNA-templat og hhv. vha2-vha3 og vh6-APCR4 som PCR-primerpar. Tilslutt ble PCR-produkt C oppnådd ved å anvende pUC-resh425g som DNA-templat og vla4-vla5 som primerparet. Det siste PCR-produktet ble subklonet i pUC19 som et Hindlll-BamHI-fragment for DNA-sekvensering. En klon med den korrekte DNA-sekvensen ble betegnet pUC-resh21.6VHa. DNA- og aminosyresekvensene fra den første versjonen av omdannet 21.6 variabel region er vist i figur 10.
De resterende versjoner av omdannet human 21.6 VH-region ble konstruert i all hovedsak som beskrevet ovenfor for konstruksjonen av versjon "b" av omdannet human 21.6 VL-region. To sett med primere ble syntetisert (tabell 6). Forden andre (Hb) og tredje (Hc)-versjonen ble hhv. mutagene primerne 21.6VHb (Arg-44 til Gly-44) og 21.6VHc (Tyr-98 til Phe-98) anvendt i PCR-reaksjoner med pUC-resh21.6VHa som templat-DNA. PCR-produktene VHb og VHc ble kuttet med restriksjonsenzymer og subklonet i pUC-vektor pUC-resh21.6VHa som hhv. Mscl-BamHI og Pstl-BamHI-fragmenter for å gi pUC-resh21.6VHb og pUC-resh21.6VHc.
Den første versjonen av en omdannet human 21.6 Vn-region (Ha) ble konstruert på en lignende måte som den anvendt for konstruksjonen av den første versjonen av omdannet human 21.6 VL-region (La). I dette tilfellet ble imidlertid PCR-primerne anvendt med tre ulike DNA-templater, mus 21.6 Vn-region som allerede adaptert for ekspresjon av kimær 21.6 tungkjede, humanisert 425 VH-region "g" (Kettleborough et al., supra), og humanisert AUK12-20 versjon "b" VH-region (tabell 6, figur 9). DNA- og aminosyresekvensene av den første versjonen av den humaniserte 21.6 tungkjede variabel regionen er vist i figur 11. De andre og tredje versjonene av et humanisert 21.6 Vn-region (Hb og Hc) ble konstruert ved å anvende PCR-primere for å lage små modifikasjoner av den første versjonen av humanisert 21.6 Vn-region (Ha) (tabell 6).
Eksempel 7: Ekspresjon og analyse av humaniserte antistoffer
1. Kobling av variable regioner til konstante regioner i eks<p>resjonsvektorer
DNA-fragmentene som koder for de kimære og omdannede 21.6 VL- og VH-regioner ble subklonet i HCMV-vektorer som er designet for å uttrykke enten humane kappa lettkjeder eller humane gamma-1 tungkjeder i mammalske celler (se figur 3) og Maeda et al., Hum. Antibod. Hybridomas 2:124-134 (1991). Begge vektorene inneholder den humane cytomegalovirus (HCMV) promoteren og enhanceren for høy-nivå-transkripsjon av immunoglobulin lett- og tungkjeder. Lettkjede ekspresjonsvektoren er nøyaktig som beskrevet av Maeda et al., supra, og omfatter genomisk DNA som koder for den humane kappa konstante regionen (Rabbitts et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)). Den tungkjede ekspresjonsvektoren er hovedsakelig som beskrevet av Maeda et al., supra, bortsett fra at det genomiske DNAet som koder for den humane gamma-1 konstante regionen ble erstattet med cDNA. cDNA som koder for human gamma-1 konstant region ble klonet fra en human cellelinje som sekreterer et humant gamma-1 antistoff ved PCR. For enkel subkloning i ekspresjonsvektoren ble BamHI-seter kreert i hver ende av cDNAet. I tillegg ble et spleise-akseptorsete og en 65 bp intronsekvens kreert i 5'-enden av cDNA-sekvensen. BamHI-fragmentet (1176 bp) som inneholdt det humane gamma-1 cDNA spleise-akseptorsetet og intronsekvens ble erstattet for BamHI-fragmentet (omtrent 2,0 kb) i den eksisterende tungkjedevektoren (Maeda et al., supra). BamHI-setet til 3'-siden av den humane gamma-1 konstante regionen ble så fjernet med Klenow-polymerase.
2. Transfeksion av ekspresjonsvektorer
Ekspresjonsvektorer ble introdusert i Cos-celler ved elektroporering ved å anvende Gene Pulser apparatet (BioRad). DNA (10jig av hver vektor) ble satt til en 0,8 mt alikvot av 1x10<7> celler/ml i PBS. En puls ble gitt med 1900 volt, 25uF kapasitanse. Etter en 10 min. gjenvinningsperiode ved omgivelsestemperatur ble elektroporerte celler satt til 8 ml DMEM (GIBCO) som inneholder 5% varmeinaktivert gammaglobulinfri føtalt kalveserum. Etter 721. inkubasjon ble mediet samlet opp, sentrifugert for å fjerne cellulært debris, og lagret under sterile betingelser ved 4°C i korte tidsperioder eller ved -20°C i lengre perioder.
3. Rensing av humaniserte antistoffer
Supernatanter fra Cos-celletransfeksjoner ble samlet og renset ved immobilisert protein A (ImmunoPure IgG Purification Kit, Pierce). Supematanten ble sterilisert ved filtrering gjennom et 0,22 (am-filter. Etter blanding med et likt volum av ImmunoPure IgG bindingsbuffer (pH 8,0) ble den fortynnede prøven påført på en 1 ml protein A-kolonne og tillatt å flyte helt inn i gelen. Etter vask med 15 ml ImmunoPure IgG-bindingsbuffer ble det bundne antistoffet eluert med 5 ml ImmunoPure IgG-elueirngsbuffer (pH 2,8), og 1 ml fraksjoner ble samlet opp. pH i første og andre fraksjoner var omtrent 8,0. pH er i den tredje fraksjonen ble tilpasset fysiologisk pH ved tilsetning av 100 uJ ImmunoPure bindingsbuffer. De fem 1 ml-fraksjonene som inneholdt protein A-renset antistoff ble så testet ved ELISA for å bestemme mengden humant IgG-antistoff som er tilstede i hver fraksjon. Antistoff ble detektert ved å anvende geit alkalisk fosfat-konjugert anti-human IgG (helt molekyl, Sigma).
4. Målinger av bindin<g>saffinitet
Bindingen av omdannet humant 21.6 antistoff til <x4pi-integrin ble testet ved ELISA i sammenligning med muse og kimære antistoffer. L-celler som var transformert til å uttrykke <x4p1-integrin på overflaten deres, ble strøket ut og dyrket til konfluens i 96-brønners vevskulturplater. Prøvene som skulle bli testet (enten rå supernatanter eller protein-A-renset) ble serielt fortynnet og satt til hver brønn. Etter inkubering i 11. på is og veldig forsiktig vasking ble geit anti-mus eller anti-human (gamma-kjede spesifikk) peroksidase konjugater (Sigma) tilsatt. Etter ytterligere inkubering 11. på is og veldig forsiktig vasking ble substratet (o-fenylen-diamin-dihydroklorid, Sigma) tilsatt. Etter inkubering i 30 min. ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 1 M H2SO4 og A490 ble målt.
Resultater fra analyser av rå-form supernatanter av de to versjoner av omdannet human 21.6 lettkjeder (La og Lb), i kombinasjon med versjon Ha av omdannet human 21.6 tungkjede, indikerte at La-versjonen av omdannet human 21.6 VL-region ga noe bedre binding til antigen enn versjon Lb. La-versjonen ble derfor anvendt i etterfølgende ekperimenter. Resultater fra analyser av de rå supernatantene av humaniserte 21.6 tungkjeder (Ha og Hb), i kombinasjon med versjon La av humanisert 21.6 lettkjede, viste ingen signifikant forskjell mellom de to versjonene (Ha og Hb) av omdannede humane VH-regioner. Versjon Ha ble valgt for anvendelse i videre eksperimenter fordi den inneholdt kun fem endringer i de humane FRene, sammenlignet med seks endringer i den humane Hb.
Figur 12 sammenligner binding av humanisert 21.6 antistoff (La + Ha) med kimært 21.6 antistoff. Dataene indikerte at det omdannede humane 21.6 antistoffet (La + Ha) binder til antigen like godt som, og kanskje noe bedre enn, det kimære 21.6 antistoffet. Det kimære 21.6 antistoffet er forventet å være ekvivalent med mus 21.6 antistoff i dets antigenbindingskarakteristika fordi det inneholder dé intakte mus 21.6 variable regionene. Det omdannede humane 21.6 antistoffet (La + Ha) er også vist å blokkere binding til humant a4B1-integrin med en effektivitet sammenlignbar med det originale mus 21.6-antistoffet og med det kimære antistoffet. Det er derfor konkludert med at omdannet humant 21.6 antistoff (La + Ha) har en spesifikk bindingsaffinitet hovedsakelig lik med den til mus 21.6 antistoff. Fordi bare små modifikasjoner i de humane FRene var nødvendig for å gjendanne antigenbindingssetet av mus 21.6-antistoff innen humane variable regioner er det omdannede humane 21.6 antistoffet antatt å oppføre seg som et autentisk humant antistoff.
Omdannet humant 21.6 antistoff som inneholder versjon La av denne omdannede humane 21.6 VL-regionen og versjon Hc av den omdannede humane 21.6 VH-regionen ble også testet for binding til L-celler som uttrykker human ct4pi-integrin på deres overflate parallelt med kimært 21.6 antistoff. Resultatene indikerte at omdannet human 21.6 antistoff (La + Hc) binder godt til antigen. Endringene i CDR3 fra VH-regionen ødela ikke bindingen til antigen. Det er faktisk noe indikajson på at endringen i CDR3 kan ha en viss forbedret binding til antigen (figur 12). Denne forbedringen kan muligens være mer fremtredende i en funksjonell blokkeringstest.
Eksempel 8: Blokkeringsegenskaper av Mu 21. 6 antistoff
Mu 21.6 ble sammenlignet med et annet antistoff mot <x4-integrin kalt L25. L25 er kommersielt tilgjengelig fra Becton Dickinson, og er i litteraturen angitt å være en god inhibitor av ct4pi-integrin adhesiv funksjon. Som vist i figur 13 (panel A), vil både Mu 21.6 og L25 fullstendig inhibere ct4p1-integirn-avhengig adhesjon til humane monocyttiske celler til rensede VCAM-1 i fravær av Mn <+2>. Ved tilstedeværelse av Mn<+2> (1mM) (en av flere aktivatorer for a4B1-integrin) var imidlertid ikke L25 noen effektiv inhibitor lenger. Lignende resultater ble observert når a4<p>i-inte<g>rin ble aktivert ved andre stimuli. Kapasiteten til å blokkere aktivert a4p1-integrin er sannsynlig å være verdifull ved behandling av inflammatoriske sykdommer så som multippel sklerose.
Som en videre sammenligning mellom mu 21.6 og L25 ble kapasiteter til antistoff til å inhibere human T-celleadhesjon til økende mengder VCAM-1 bestemt. Ved dette eksperimentet ble økende mengder VCAM-1 belagt i plast-brønner i en 96-brønners testplate, og evnen til den humane T-cellelinjen Jurkat (som uttrykker høye nivåer av <x4p1-integrin), til å binde til de belagte brønnene målt. Verdier på y-aksen representerer prosenten av Jurkat-celler som opprinnelig ble satt til hver brønn som fremdeles var bundet etter vasking av brønnen fire ganger (figur 13, panel B)). Dette eksperimentet demonstrerer at L25 er en god inhibitor av celleadhesjon når lave nivåer av VCAM-1 et tilstede, men blir fullstendig ineffektiv ved høyere nivåer av VCAM-1. Mu 21.6 på den annen side inhiberer celleadhesjon fullstendig, uavhengig av mengden VCAM-1 som er tilstede. Kapasiteten til å blokkere ved høye konsentrasjoner av VCAM-1 er ønskelig for terapeutisk anvendelser på grunn av oppreguleringen av VCAM-1 ved inflammasjonssteder.
Eksempel 9: Effektivitet av humanisert 21. 6 antistoff i en dyremodell
Dette eksempelet viser effektiviteten av humanisert 21.6 antistoff ved forebyggende og terapeutisk behandling av EAE i en dyremodell som simulerer multippel sklerose hos mennesker.
( A) Metoder
( 1) Fremkalling av EAE
Hjernen og ryggmargen ble fjernet fra hver av fem marsvin som var avlivet ved C02-narkose. Vevet ble holdt i PBS på våt is inntil det ble veid og homogenisert ved en konsentrasjon på 1 gram vev per ml PBS. Vevet ble fullstendig homogenisert ved å anvende en elektrisk hånd-homogenisator og deretter blandet med et likt volum Freund's komplette adjuvans (FCA). FCA ble laget ved å sette 100 mg mycobacterium tuberculosis H37 RA (DIFCO, 3114-33-8) til 10 ml Freund's inkomplette adjuvans (Sigma, F-5506). Blandingen ble emulgert til konsistensen til majones ved å sende løsningen mellom to sprøyter koblet sammen med en to-veis stoppekran. Hvert marsvin ble immunisert med 600 (il emulsjon delt mellom tre administreringsseter.
( 2) Vurdering av dyrene for svkdoms- svmptomer
Sykdomssymptomer ble målt ved å få hvert dyr til å gå og gi dyret poeng etter de følgende vanlig aksepterte kriteriene:
0 Ingen sykdom
1 Svakhet i bakre lem
2 Fullstendig paralyse i bakre lemmer
3 Fullstendig paralyse i bakre lemmer og noe paralyse i fremre lemmer
4 Døende eller død
( 3) Serum- og vevs- oppsamlinq
Prøver ble samlet inn ved hjertepunktur fra metoksyflutan-bedøvede marsvin. Omtrent 300-400 jai blod ble samlet opp og plassert i en microtainer serum separator og fikk å klumpe seg i mellom 20-30 min. ved romtemperatur. Røret ble så spunnet i 5 min. ved romtemperatur. Serumet ble ført over i Eppendorf-rør og lagret ved -20°C for påfølgende analyse av antistoff-titere ved flourescensaktivert cellesortering (FACS).
For hematologisk analyse ble blod samlet inn i etylendiamintetraeddikksyre-belagte microtainer-rør. En 100 jai alikvot ble suget opp i et akridin-belagt hematokritt-rør. Røret ble påsatt lokk og blodet ble blandet med akridinorange ved forsiktig å vende røret 15 ganger. En flotør ble puttet i hematokirtt-røret og prøven sentrifugert i 5 min. Hematokirtt-røret ble plassert i en prekalibrert Idexx QBC Vet Autoreader som er designet for kvantitative buffy-coat analyser. Verdier ble lest under heste-kalibreringssystemet og tilpasset marsvin-ekvivalenter ved å anvende en forutbestemt konversjonsfaktor.
Ved slutten av eksperimentet ble marsvinene avlivet ved CCVnarkose, og hjernene og ryggradene fjernet. Halve hjernen og ryggraden fra hvert marsvin ble bråfryst i 2-metylbutan på tørris (-20 til -40°C). Dette vevet ble kuttet og immunofarget med en pan makrofagmarkør (Serotec MCA-518) og en T-lymfocytt markør (Serotec MCA-751) ved å anvende avidin-biotin kobling peroksidase testen (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) og diaminobenzidin som et kromogen. Vevet ble bedømt for cellulær infiltrasjon i samsvar med følgende poengsystem:
0 Ingen infiltrerende celler
0,5 Veldig lite farging; kan være artifakt; vanligvis assosiert med kar 1 Farging av få celler (færre enn 15), vanligvis nært et kar 2 Farging av mange celler (20-50), som vanligvis stråler ut fra et kar. 3 Farging av mange celler (>50) spredd gjennom vevet, mange oppslåtte kar.
( b) Forebyggende behandling
Dette eksperimentet ble designet for å evaluere effektiviteten av humanisert 21.6 antistoff til å forsinke inntreden av kliniske symptomer. Tidligere data har demonstrert at leukocytt-innkomst i hjernen og ryggraden til EAE-marsvin typisk starter mellom dag 7 og dag 8. Antistoffer ble derfor administrert på dag 7 og dag 10 etter immunisering. For å sammenligne mus og humanisert 21.6 antistoff ble ekvivalente doser av hvert av antistoffene (3,0 ,0,30 og 0,03 mg/kg) administrert. Innledende farmakokinetikkstudier viste at mettede blodnivåer av mus 21.6 antistoff ble oppnådd innen 24 timer etter subkutan administrering, og forble forhøyet frem til 48 timer.
På dag 11, 24 timer etter den andre dosen med antistoff, ble blodprøver tatt fra tre tilfeldige valgte dyr i hver gruppe. For hver behandlingsgruppe ble et gjennomsnitt av antall dager for hvert marsvin for å oppnå en klinisk score på 1, beregnet (tabell 7). Den gjennomsnittlige verdien for den PBS-behandlede gruppen i dette forsøket var 11 dager etter immunisering (som er typisk for tidligere resultater). Behandling med den høyeste dosen av humanisert og muse-antistoff resulterte i en signifikant forsinkelse av sykdom med hhv. 4,6 (p=0.000) og 3 (p=0,007) dager. De lavere doser med antistoff hadde ingen effekt på sykdomsforløpet.
Daglige kroppsvekter til marsvinet reflekterte en lignende effekt av høye doser av humanisert og mus antistoff (figur 14). Dyrene i disse behandlings-gruppene la på seg kontinuerlig. Marsvin i alle andre behandlingsgrupper tapte vekt fra like før sykdommen inntraff.
Serumtitere av antistoff ble målt i tre tilfeldig valgte dyr fra hver gruppe ved hjertepunktur på dag 11, omtrent 241. etter den andre behandlingen. Effektiviteten antistoffene har til å utsette sykdom korrelerte tett med serumnivåer. Omtrent 20 ug/ml serumantistoff var tilstede i sirkulasjonen til alle dyrene som var injisert med den høyeste dosen av både humaniserte og mus antistoffer. Denne konsentrasjonen er av den samme størrelsesordenen som konsentrasjonen av 21.6 antistoff som trengs for å mette VLA-4-seter in vitro. I motsetning hadde dyr fra alle de andre gruppene liten eller intet detekterbar serumantistoff.
fc) Reversering av forekommende sykdom
Omkring 60 marsvin ble immunisert og fikk utvikle kliniske symptomer på EAE. På dag 13 ble alle marsvinene som hadde nådd en klinisk score på 1 tilfeldig tilordnet en behandlingsgruppe. Figur 15 viser at dyrene som var behandlet med 3mg/kg humanisert antistoff begynte å gjenvinne bakre lem-funksjon innen 48 timer etter behandling. På dagene 17 og 18, en og to dager etter den andre dosen, var alle åtte dyrene sykdomsfrie. ANOVA av arealet under kurveverdier for hver behandlingsgruppe viste at bare den 3 mg/kg humanisert antistoffbehandlede gruppeverdien var statistisk lavere enn PBS-kontrollgruppen (p=0,042). Disse dyrene la på seg progressivt innen 24 timer etter den første administrasjonen frem til forsøket ble avsluttet på dag 19 (figur 16).
Antistoff-serumtitere ble målt ved FACS-analyse på prøver tatt 24 timer etter den første injeksjonen (dag 14) og ved avlivning (dag 19). Behandling med mus 21.6 antistoff resulterte i noe lavere serum antistoff-titere enn behandling med humanisert 21.6-antistoff (9,1 vs. 12,6 ng/ml). Denne forskjellen ble mer fremtredende ved dag 19, tre dager etter den andre administreringen, da det var veldig lite detekterbart serum muse-antistoff mens nivåene av humanisert antistoff på dag 19 var under metningsnivået, men fremdeles målbare (6,1 ug/ml). Disse data demonstrerte en korrelasjon mellom plasmanivåer av antistoff og fysiologisk indikerer at det effektive sirkulerende antistoffnivået er innen området 10-20 (ag/ml for marsvinet.
Leukocyttinfiltrering inn i hjernen og ryggraden ble evaluert i vev fra dyr avlivet den 19. dagen. Tabell 8 viser signifikante forskjeller i graden av infiltrering som en funksjon av antistoffbehandling. Reduksjonen i T-celleinfiltrasjon i hjerne og ryggmarg og makrofaginfiltrasjon i ryggmargen var signifikant etter behandling med 3 mg/kg. Lavere doser tenderte mot å redusere infiltrasjon, men nådde ikke signifikans. Det var ingen signifikant forskjell i cellulær infiltrering av makrofager i ryggmargen ved noen av dosene. Siden den immunohistokjemiske teknikken som ble anvendt for å evaluere makrofager ikke skiller mellom residente fra invaderende celler, representerer mangelen av effekt på makrofager sannsynligvis den opprettholdte tilstedeværelsen av residente makrofager og mikroglia.
Reduksjonen i T-celler og monocytter i hjernevev ved administrering av antistoffet etter etablering av sykdommen antyder at celletrafikkering ikke er en kumulativ prosess, men en dynamisk bevegelse av celler inn i og ut av CNS-vev. Viktig er det at dataene antyder at avbrytelse av innkomsten av leukocytter i parenkymalt vev tillater CNS å fri seg selv fra det invaderende patologiske elementet.
Hematologidata viste at behandling med mus eller humanisert 21.6-antistoff ikke ga noen forskjell i hele hvite blodcelletall, mononukleære og granulocyttall eller i røde blodcelletall. Den høyeste dosen av mus eller humanisert antistoff resulterte i en signifikant økning i blodplatetall sammenlignet med PBS-behandlede dyr (tabell 9). Hos normale marsvin er platetaller 755 +/-103 celler/ml, omtrent det dobbelte av det fra PBS-behandlede EAE-dyr. Behandling med doser av mus og humanisert antistoff som effektivt reverserte sykdommen, gjenopprettet således også platetallet til normalt.
Som konklusjon er både humaniserte og mus 21.6 antistoff effektive for å forsinke og reversere kliniske symptomer i en dyremodell som simulerer multippel sklerose hos mennesker. De humaniserte antistoffene er mer effektive enn den samme dosen mus-antistoff for reversering av symptomer.
Selv om foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet i detalj, med formål å gi en klar forståelse, vil det være klart at visse modifikasjoner kan bli foretatt innenfor rammen av de foreliggende krav. Alle publikasjoner og patentdokumenter referert til ovenfor er herved tatt med ved referanse i deres helhet for alle formål som om hver var individuelt skrevet.
Figurtekst: (Kabat) nummerering i samsvar med Kabat et al, supra; (#) sekvensiell nummerering som anvendt i den molekylære modelleringen; (mus 21.6) aminosyresekvens av VL-regionen fra mus 21.6 antistoff; (mus kappa 5) konsensussekvens fra muse kappa VL-regioner fra subgruppe 5 (Kabat et al., supra) ; (human kappa 1) konsensussekvens fra humane kappa VL-regioner fra subgruppe 1 (Kabat et al., supra) ; (human REI) aminosyresekvens av en human VL-region (Palm et al., (1975), supra) ; (RH VL 21.6) aminosyresekvens av versjon L1 av omdannet human 21.6-VL-region; (<*>) enheter som er en del av den vedtatte stukturene av CDR-løkkene (Chothia et al., supra) ; (understreket) enheter i de humane FRene hvor aminosyre-enheten ble endret.
Figurtekst: (Kabat) nummerering i samsvar med Kabat et al, supra; (#) sekvensiell nummerering som anvendt i den molekylære modelleringen; (mus 21.6) aminosyresekvenser til VH-regioner fra mus 21.6 antistoff; (mus 2c) konsensussekvens fra muse VH-regioner fra subgruppe 2c (Kabat et al., supra); (human 1) konsensussekvens fra humane VH-regioner fra subgruppe 1 (Kabat et al., supra); (human 21/28'CL) aminosyresekvens av en human VH-region (Dersimonian et al.,
(1987), supra); (RH VH 21.6) aminosyresekvens av versjon H1 av omdannet human 21.6 VH-region; (<*>) enheter som er en del av den vedtatte stukturene av CDR-løkkene (Chothia et al., supra); (understreket) enheter i de humane FRene hvor aminosyreenheten ble endret.
Claims (13)
1. Humanisert antistoff, karakterisert ved at det omfatter en humanisert tungkjede og en humanisert lettkjede: (1) den humaniserte lettkjeden omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) som har aminosyresekvenser fra de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 immunoglobulin lettkjede, og et variabel regionrammeverk fra en human kappa lettkjedevariabel regionrammeverksekvens unntatt i minst en posisjon valgt fra en første gruppe bestående av L45, L49, L58 og L69, hvor aminosyreposisjonen er okkupert av den samme aminosyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen i mus 21.6 immunoglobulin lettkjede-variabel regionrammeverk; og (2) den humaniserte tungkjeden omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) som har aminosyresekvenser fra de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 immunoglobulin tungkjede, og et variabel regionrammeverk fra en human tungkjede variabel regionrammeverksekvens unntatt i minst en posisjon valgt fra en gruppe bestående av H27, H28, H29, H30, H44, H71, hvor aminosyreposisjonen er okkupert av den samme aminosyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen i mus 21.6 immunoglobulin tungkjede variabel regionrammeverket;
hvor immunoglobulinet spesifikt binder en alfa-4 integrin med en bindingsaffinitet som har en nedre grense på 10<7> M'<1> og en øvre grense på fem ganger bindingsaffiniteten til mus 21.6-immunoglobulinet.
2. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 1, karakterisert ved at det humaniserte lettkjede variabel regionrammeverket er fra en human Bence-Jones immunoglobulin REI -variabel regionrammeverksekvens unntatt i minst en posisjon valgt fra den første gruppen, og unntatt i minst en posisjon valgt fra en tredje gruppe bestående av L104, L105 og L107, hvor aminosyreposisjonen er okkupert av den samme aminosyren som er tilstede i den ekvivalente posisjonen i en kappa lettkjede fra et humant immunoglobulin forskjellig fra REI.
3. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 2, karakterisert ved at det humaniserte tungkjede variabel regionrammeverket er fra en 21/28'CL variabel regionrammeverksekvens.
4. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 3, karakterisert ved at det humaniserte lettkjede variabel regionrammeverket omfatter minst tre aminosyrer fra mus 21.6 immunoglobulinet i posisjonen i den første gruppen og tre aminosyrer fra kappa lettkjeden fra et annet humant immunoglobulin enn REI i posisjonen i den tredje gruppen, og det humaniserte tungkjede variabel region-rammeverket omfatter minst fem aminosyrer fra mus 21.6 immunoglobulin i posisjoner i den andre gruppen.
5. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 4, karakterisert ved at det humaniserte lettkjede variabel regionrammeverket er identisk med REI-lettkjede variabel regionrammeverksekvensen bortsett fra i minst tre posisjoner fra den første gruppen og de tre posisjonene i den tredje gruppen, og tungkjede variabel regionrammeverket er identisk med 21/28'CL-tungkjede variabel regionrammeverksekvensen bortsett fra i minst fem posisjoner i den andre gruppen.
6. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 5, karakterisert ved at de minst tre posisjonene i den første gruppen er posisjonene L45, L58 og L69 og de minst fem posisjonene i den andre gruppen er posisjonene H27, H28, H29, H30 og H71.
7. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 6, karakterisert ved at den humaniserte lettkjeden omfatter komplementaritetsbestemmende regioner som er identiske med de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 tungkjede og den humaniserte tungkjeden omfatter komplementaritetsbestemmende regioner som er identiske med de korresponderende komplementaritetsbestemmende regioner fra mus 21.6 tungkjeden, bortsett fra at CDR3-regionen av den humaniserte tungkjeden kan eller kan ikke omfatte en fenylalanin-enhet ved posisjon H98.
8. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen til den modne lettkjede variabel regionen, er sekvensen betegnet La (Sekv Id Nr. 7) i fig. 6 og aminosyresekvensen til den modne tungkjede variabel regionen er Ha (Sekv Id Nr. 11) i figur 7.
9. Bindingsfragment, karakterisert ved at det er et fragment av det humaniserte immunoglobulinet ifølge krav 1 eller krav 8.
10. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 1 eller 8, karakterisert v e d at det har et konstant regiondomene.
11. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et humanisert antistoff ifølge krav 1 eller 8, eller et bindingsfragment derav, og en farmasøytisk aksepterbar bærer for dette.
12. Anvendelse av humanisert antistoff ifølge krav 1 eller 8, i fremstilling av en farmasøytisk blanding, ifølge krav 11, for behandling av en inflammatorisk sykdom hos en pasient.
13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor den inflammatoriske sykdommen er multippel sklerose.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18626994A | 1994-01-25 | 1994-01-25 | |
| PCT/US1995/001219 WO1995019790A1 (en) | 1994-01-25 | 1995-01-25 | Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule vla-4 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO963097D0 NO963097D0 (no) | 1996-07-24 |
| NO963097L NO963097L (no) | 1996-09-24 |
| NO319867B1 true NO319867B1 (no) | 2005-09-26 |
Family
ID=22684288
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19963097A NO319867B1 (no) | 1994-01-25 | 1996-07-24 | Humaniserte antistoffer mot leukocytt-adhesjonsmolekyl VLA-4, bindingsfragment derav, farmasoytisk preparat omfattende det humaniserte antistoffet eller et bindingsfragment derav, samt anvendelser av det humaniserte antistoff. |
| NO2006008C NO2006008I2 (no) | 1994-01-25 | 2006-08-07 | Natalizumab, anti alfa-4 integrin humanized monoclonal antibody |
| NO2017040C NO2017040I2 (no) | 1994-01-25 | 2017-08-01 | Natalizumab, anti alfa-4 integrin humanisert monoklonalt antistoff - forlenget SPC |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO2006008C NO2006008I2 (no) | 1994-01-25 | 2006-08-07 | Natalizumab, anti alfa-4 integrin humanized monoclonal antibody |
| NO2017040C NO2017040I2 (no) | 1994-01-25 | 2017-08-01 | Natalizumab, anti alfa-4 integrin humanisert monoklonalt antistoff - forlenget SPC |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1759709B1 (no) |
| JP (5) | JP4115517B2 (no) |
| KR (1) | KR100367948B1 (no) |
| CN (1) | CN1211123C (no) |
| AT (1) | ATE333895T1 (no) |
| AU (1) | AU703152B2 (no) |
| CA (1) | CA2182013C (no) |
| DE (2) | DE122006000043I1 (no) |
| DK (2) | DK1759709T3 (no) |
| ES (2) | ES2270425T3 (no) |
| FI (1) | FI117509B (no) |
| FR (1) | FR06C0024I2 (no) |
| HU (1) | HU220799B1 (no) |
| LU (1) | LU91271I2 (no) |
| MX (1) | MX9602971A (no) |
| NL (1) | NL300238I2 (no) |
| NO (3) | NO319867B1 (no) |
| NZ (1) | NZ279730A (no) |
| PL (1) | PL181827B1 (no) |
| PT (1) | PT804237E (no) |
| WO (1) | WO1995019790A1 (no) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307025B1 (en) | 1989-04-28 | 2001-10-23 | Biogen, Inc. | VCAM fusion proteins and DNA coding therefor |
| US5871734A (en) * | 1992-01-13 | 1999-02-16 | Biogen, Inc. | Treatment for asthma with VLA-4 blocking agents |
| US5932214A (en) | 1994-08-11 | 1999-08-03 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease with VLA-4 blockers |
| DK0678122T3 (da) | 1993-01-12 | 2000-03-06 | Biogen Inc | Rekombinante anti-VLA4 antistofmolekyler |
| AU687790B2 (en) * | 1993-02-09 | 1998-03-05 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment for insulin dependent diabetes |
| US5840299A (en) * | 1994-01-25 | 1998-11-24 | Athena Neurosciences, Inc. | Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4 |
| US7435802B2 (en) | 1994-01-25 | 2008-10-14 | Elan Pharaceuticals, Inc. | Humanized anti-VLA4 immunoglobulins |
| US7803904B2 (en) | 1995-09-01 | 2010-09-28 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Mucosal vascular addressing and uses thereof |
| US6551593B1 (en) | 1995-02-10 | 2003-04-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam |
| US7750137B2 (en) | 1995-09-01 | 2010-07-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Mucosal vascular addressins |
| US7147851B1 (en) * | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
| AU7348798A (en) * | 1997-05-09 | 1998-12-08 | John P. Robarts Research Institute, The | Method for dislodging infiltrated leukocytes from a tissue |
| DE19741235A1 (de) | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
| DE19741873A1 (de) * | 1997-09-23 | 1999-03-25 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue 5-Ring-Heterocyclen, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
| DE19751251A1 (de) | 1997-11-19 | 1999-05-20 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Substituierte Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmezeutische Präparate |
| DE19821483A1 (de) | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
| US7618630B2 (en) | 1998-09-14 | 2009-11-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of treating multiple myeloma and myeloma-induced bone resorption using integrin antagonists |
| WO2000015247A2 (en) * | 1998-09-14 | 2000-03-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of treating multiple myeloma and myeloma-induced bone resorption using integrin antagonists |
| KR100837715B1 (ko) * | 1999-04-22 | 2008-06-13 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 인테그린 알파-4 서브유닛의 길항 물질을 사용하는섬유증의 치료 방법 |
| DE19922462A1 (de) | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Aventis Pharma Gmbh | Spiro-imidazolidinderivate, ihre Herstellung ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
| CA2375827C (en) | 1999-06-01 | 2017-01-10 | Biogen, Inc. | A blocking monoclonal antibody to vla-1 and its use for the treatment of inflammatory disorders |
| DE60043308D1 (de) * | 1999-12-16 | 2009-12-24 | Biogen Idec Inc | Verfahren zur behandlung der schädigung des zentralnervensystems durch ischämie oder durch hämorrhagie mit antagonisten von alpha4 integrin |
| DE10111877A1 (de) | 2001-03-10 | 2002-09-12 | Aventis Pharma Gmbh | Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate |
| US7358054B2 (en) | 2001-04-13 | 2008-04-15 | Biogen Idec Ma Inc. | Antibodies to VLA-1 |
| DE10137595A1 (de) | 2001-08-01 | 2003-02-13 | Aventis Pharma Gmbh | Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
| IL163725A0 (en) | 2002-02-25 | 2005-12-18 | Elan Pharm Inc | Administration of agents for the treatment of inflammation |
| JP2005535572A (ja) * | 2002-04-12 | 2005-11-24 | メディミューン，インコーポレーテッド | 組換え抗インターロイキン−９抗体 |
| GB0210121D0 (en) * | 2002-05-02 | 2002-06-12 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
| AR040778A1 (es) * | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
| PL211180B1 (pl) * | 2002-12-17 | 2012-04-30 | Merck Patent Gmbh | Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków |
| CU23403A1 (es) * | 2003-04-23 | 2009-08-04 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores |
| KR101194176B1 (ko) | 2003-12-22 | 2012-10-24 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 신규한 페닐알라닌 유도체 |
| CN103169965A (zh) * | 2004-11-19 | 2013-06-26 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 治疗多发性硬化 |
| AU2006316629A1 (en) * | 2005-11-17 | 2007-05-31 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with alpha 4 beta 7 integrin |
| WO2007140249A1 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of treating stroke |
| AU2008219007A1 (en) | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating multiple sclerosis by administration of alpha-fetoprotein in combination with an integrin antagonist |
| PL2170390T3 (pl) * | 2007-06-14 | 2019-05-31 | Biogen Ma Inc | Preparaty przeciwciała natalizumab |
| CN101889036B (zh) | 2007-12-13 | 2013-01-02 | 株式会社德山 | 光致变色固化性组合物 |
| PL2288715T3 (pl) | 2008-04-11 | 2015-03-31 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | Łączniki będące albuminą surowicy ludzkiej i ich koniugaty |
| TWI466681B (zh) | 2009-03-20 | 2015-01-01 | Amgen Inc | α４β７雜二聚體專一性拮抗抗體 |
| WO2011020874A1 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Vla-4 as a biomarker for prognosis and target for therapy in duchenne muscular dystrophy |
| US20140161794A1 (en) | 2010-04-16 | 2014-06-12 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-vla-4 antibodies |
| TWI723339B (zh) | 2011-05-02 | 2021-04-01 | 美商千禧製藥公司 | 抗-α4β7抗體之調配物 |
| UA116189C2 (uk) | 2011-05-02 | 2018-02-26 | Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. | КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА |
| US10160808B2 (en) | 2012-02-16 | 2018-12-25 | Santarus, Inc. | Anti-VLA1 (CD49A) antibody pharmaceutical compositions |
| WO2018002036A1 (en) | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Zaklady Farmaceutyczne Polpharma Sa | Recombinant production of monoclonal antibodies |
| US20190374639A1 (en) | 2016-11-21 | 2019-12-12 | Polpharma Biologics S.A. | Aqueous pharmaceutical formulations |
| EP3583126A1 (en) * | 2017-02-17 | 2019-12-25 | Sanofi | Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2 |
| WO2018224673A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Zaklady Farmaceutyczne Polpharma S.A. | Improved methods of cell culture |
| CN112867394B (zh) | 2018-06-04 | 2024-09-13 | 马萨诸塞州渤健公司 | 具有降低的效应功能的抗vla-4抗体 |
| EP4284947A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-12-06 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Methods of assessing the risk of developing progressive multifocal leukoencephalopathy in patients treated with vla-4 antagonists |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| IL95501A (en) * | 1989-09-01 | 1997-04-15 | Hutchinson Fred Cancer Res | Inhibition by antibodies of lymphocyte adherence to vascular endothelium utilizing an extracellular matrix receptor-ligand interaction, and pharmaceutical compositions containing said antibodies |
| WO1993015764A1 (en) * | 1992-02-12 | 1993-08-19 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease |
| DK0678122T3 (da) * | 1993-01-12 | 2000-03-06 | Biogen Inc | Rekombinante anti-VLA4 antistofmolekyler |
| AUPP647298A0 (en) | 1998-10-13 | 1998-11-05 | Keystone Retaining Wall Systems, Inc. | Retaining wall block |
-
1995
- 1995-01-25 CN CNB951913549A patent/CN1211123C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 DK DK06013916.9T patent/DK1759709T3/da active
- 1995-01-25 PT PT95908741T patent/PT804237E/pt unknown
- 1995-01-25 DE DE1995635133 patent/DE122006000043I1/de active Pending
- 1995-01-25 ES ES95908741T patent/ES2270425T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 JP JP51977095A patent/JP4115517B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 KR KR1019960703987A patent/KR100367948B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-01-25 CA CA002182013A patent/CA2182013C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 AT AT95908741T patent/ATE333895T1/de active
- 1995-01-25 EP EP06013916A patent/EP1759709B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 PL PL95315634A patent/PL181827B1/pl unknown
- 1995-01-25 HU HU9602019A patent/HU220799B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1995-01-25 AU AU16960/95A patent/AU703152B2/en not_active Expired
- 1995-01-25 DK DK95908741T patent/DK0804237T3/da active
- 1995-01-25 EP EP95908741A patent/EP0804237B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 ES ES06013916T patent/ES2424292T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-25 NZ NZ279730A patent/NZ279730A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-01-25 WO PCT/US1995/001219 patent/WO1995019790A1/en active IP Right Grant
- 1995-01-25 DE DE69535133T patent/DE69535133T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-24 FI FI962958A patent/FI117509B/fi active Protection Beyond IP Right Term
- 1996-07-24 NO NO19963097A patent/NO319867B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-07-24 MX MX9602971A patent/MX9602971A/es unknown
-
2005
- 2005-08-05 JP JP2005228930A patent/JP2006045237A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-07-27 FR FR06C0024C patent/FR06C0024I2/fr active Active
- 2006-08-02 NL NL300238C patent/NL300238I2/nl unknown
- 2006-08-02 LU LU91271C patent/LU91271I2/fr unknown
- 2006-08-07 NO NO2006008C patent/NO2006008I2/no unknown
-
2009
- 2009-05-18 JP JP2009120421A patent/JP2009235078A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-02-18 JP JP2013028635A patent/JP5487382B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-03-18 JP JP2013054628A patent/JP2013165718A/ja not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-08-01 NO NO2017040C patent/NO2017040I2/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO319867B1 (no) | Humaniserte antistoffer mot leukocytt-adhesjonsmolekyl VLA-4, bindingsfragment derav, farmasoytisk preparat omfattende det humaniserte antistoffet eller et bindingsfragment derav, samt anvendelser av det humaniserte antistoff. | |
| US5840299A (en) | Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4 | |
| US8246958B2 (en) | Methods of inhibiting alpha-4-dependent interactions with VCAM-1 with anti-VLA-4 antibodies | |
| DK0918797T4 (en) | A humanized immunoglobulin reactive with alpha4beta7 integrin | |
| KR100240308B1 (ko) | 인간화된단클론성항체및혼성단클론성항체 | |
| AU747898B2 (en) | Monoclonal antibodies to human CD6 | |
| JP3276369B2 (ja) | 改良ヒト化免疫グロブリン | |
| EP2070948B1 (en) | Humanized Anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties | |
| PL180157B1 (en) | Humanised antibodies and their application | |
| CA2544365A1 (en) | Modified anti-cd52 antibody | |
| CN114269788B (zh) | 一种能够与人4-1bb结合的分子及其应用 | |
| CN115947855B (zh) | 抗cd24抗体的制备及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: TYSABRI - NATALIZUMAB; NAT. REG. NO/DATE: EU106346001NO 20060713 Spc suppl protection certif: 2006008 Filing date: 20060807 Extension date: 20200125 |
|
| SPCG | Granted supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: TYSABRI - NATALIZUMAB; NAT. REG. NO/DATE: EU106346001NO 20060713 Spc suppl protection certif: 2006008 Filing date: 20060807 Extension date: 20200125 |
|
| MK1K | Patent expired | ||
| SPCE | Application to extend a supplementary protection certificate (spc) |
Free format text: PRODUCT NAME: NATALIZUMAB, ANTI ALFA-4 INTEGRIN HUMANISERT MONOKLONALT ANTISTOFF; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/06/346/001 20060627; FIRST REG. NO/DATE: EU , EU/1/06/346/001 20060627 Spc suppl protection certif: 2017040 Filing date: 20170801 |
|
| SPCH | Extension of a supplementary protection certificate (spc) granted |
Free format text: PRODUCT NAME: NATALIZUMAB, ANTI ALFA-4 INTEGRIN HUMANISERT MONOKLONALT ANTISTOFF; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/06/346/001 20060627; FIRST REG. NO/DATE: EU , EU/1/06/346/001 20060627 Spc suppl protection certif: 2017040 Filing date: 20170801 |
|
| SPCX | Expiry of an spc |
Spc suppl protection certif: 2006008 |