PL181827B1

PL181827B1 - Nowa humanizowana immunoglobulina specyficznie wiazaca VLA-4, nowy kwas nukleinowy kodujacy lancuch ciezki tej immunoglobuliny i nowy kwas nukleinowy kodujacy lancuch lekki tej immunoglobuliny PL PL

Info

Publication number: PL181827B1
Application number: PL95315634A
Authority: PL
Inventors: Mary M Bendig; Olivier J Leger; Jose Saldanha; S Tarran Jones; Ted Yednock
Original assignee: Athena Neurosciences
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 2001-09-28
Also published as: EP0804237A1; HUT75129A; FR06C0024I2; EP0804237A4; PT804237E; AU1696095A; FI962958L; NZ279730A; JPH09508272A; ES2424292T3; DE122006000043I1; HU220799B1; KR970700513A; MX9602971A; CA2182013C; JP5487382B2; AU703152B2; NO319867B1; FR06C0024I1; NO963097D0

Description

Przedmiotem wynalazku są nowa humanizowana immunoglobulina specyficznie wiążąca VLA-4, nowy kwas nukleinowy kodujący łańcuch ciężki tej immunoglobuliny i nowy kwas nukleinowy kodujący łańcuch lekki tej immunoglobuliny. Ta humanizowana immunoglobulina to humanizowane przeciwciało specyficzne względem podjednostki α-4 leukocytowej cząsteczki adhezyjnej VLA-4.

Stan zapalny stanowi reakcję unaczynionych tkanek na infekcję lub uszkodzenie, występującąna skutek adhezji leukocytów do komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i ich przenikania do otaczających tkanek. Przy zwykłym stanie zapalnym przenikające leukocyty uwalniają mediatory toksyczności uczestniczące w niszczeniu inwazyjnych organizmów i fagocytozie szczątek komórek i martwych komórek oraz odgrywająrolę w naprawie tkanki i reakcji odpornościowej. Natomiast w patologicznym stanie zapalnym przenikające leukocyty sąnadreaktywne i mogąpowodować poważne lub śmiertelne uszkodzenia. Patrz np. Hickey, Psychoneuroimmunology II (Academic Press 1990).

Łączenie się leukocytów z komórkami śródbłonka przebiega poprzez specyficzne oddziaływanie powierzchniowych ligandów i receptorów komórkowych na komórkach śródbłonka i leukocytach. Patrz ogólnie Springer, Naturre 346:425-433 (1990). Rodzaj ligandów i receptorów zmienia się w zależności od podtypów komórek, umiejscowienia anato micznego i bodźców zapalnych. Receptor powierzchni komórek leukocytowych VLA-4 został po raz pierwszy zidentyfikowany przez Hemlera, EP 330 506 (1989). VLA-4 należy do rodziny integryn (31, powierzchniowych receptorów komórkowych, z których każdy zawiera łańcuchy α i β. VLA-4 zawiera łańcuch a4 i łańcuch β1. VLA-4 specyficznie wiąże ligand komórek śródbłonka określany jako VCAM-1. Patrz Elices i inni, Cell 60:577-584 (1990). Choć VCAM-1 wykryto po raz pierwszy w uaktywnionych lu181 827 dzkich komórkach żyły pępkowej, ligand' ten został wykryty także w mózgowych komórkach śródbłonka (zgłoszenie PCT/US90/05106, publikacja WO 91/05038).

Cząsteczki adhezyjne, takie jak VLA-4 stanowią potencjalne cele środków terapeutycznych. Receptor VLA-4 jest szczególnie ważnym celem z uwagi na jego współoddziaływanie z ligandem znajdującym się na mózgowych komórkach śródbłonka. Choroby i stany wynikające z zapalenia mózgu mają szczególnie poważne konsekwencje. Przykładowo jedna z takich chorób, stwardnienie rozsiane (MS) w stanie przewlekłym (z występowaniem lub bez zaostrzenia stanu lub remisji) prowadzi do poważnego kalectwa i śmierci. Ocenia się, że w samych tylko Stanach Zjednoczonych Ameryki choroba ta dotyka 250000-350000 ludzi.

Potencjalne działanie przeciwzapalne przeciwciał przeciw receptorowi VLA-4 zostało zbadane in vitro i in vivo na modelach zwierzęcych. Patrz PCT/US90/05106 oraz Yednock i inni, Nature 356:63-66 (1992). Doświadczenia in vitro wykazały, że przeciwciała anty-VLA-4 blokująprzyleganie limfocytów do mózgowych komórek śródbłonka. W doświadczeniach na zwierzętach zbadano wpływ przeciwciał anty-VLA-4 na zwierzęta, u których sztucznie 'wywołano stan symulujący stwardnienie rozsiane (doświadczalne autoimmrniologiczne zapalenie mózgu i rdzenia). Doświadczenia wykazały, że podawanie przeciwciał anty-VLA-4 zapobiega zapaleniu mózgu, a w konsekwencji sparaliżowaniu zwierzęcia. Łącznie doświadczenia te pozwoliły zidentyfikować przeciwciała anty-VLA-4 jako potencjalnie przydatne środki terapeutyczne do leczenia stwardnienia rozsianego oraz innych chorób i zaburzeń zapalnych.

Poważny problem w przypadku znanych przeciwciał anty-VLA-4 stanowi to, że wszystkie są przeciwciałami pochodzenia mysiego, w związku z czym istnieje prawdopodobieństwo nasilania się ludzkiej reakcji przeciwmysiej (HAMA) przy ich stosowaniu klinicznym. Reakcja HAMA zmniejsza skuteczność działania mysich przeciwciał u pacjentów oraz uniemożliwia ich podawanie ciągłe. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest humanizowanie mysich przeciwciał. Zgodnie z takim sposobem regiony determinujące dopasowanie (CDR) oraz pewne inne aminokwasy z donorowych mysich części zmiennych szczepi się na ludzkich akceptorowych częściach zmiennych, a następnie łączy się z ludzkimi częściami stałymi. Patrz np. Riechmann i inni, Nature 332:323-327 (1988); Winter, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 225 539 (1993).

Jakkolwiek otrzymano szereg przykładowych humanizowanych przeciwciał, to przejście od mysiego do humanizowanego przeciwciała stanowi kompromis względem konkurencyjnych problemów, których rozwiązanie zmienia się w zależności od konkretnych przeciwciał. W celu ograniczenia do minimum immun ogeniczności immunoglobulina powinna zachowywać w możliwie jak największym stopniu ludzką sekwencję akceptorową. Jednakże dla zachowania rzeczywistych właściwości wiążących region zrębowy immunoglobuliny powinien zawierać wystarczającą ilość podstawień właściwych ludzkiej sekwencji akceptorowej, aby zapewnić uzyskanie trójwymiarowej konformacji regionów CDR, możliwiejak najbardziej zbliżonej do występującej w wyjściowej mysiej immunoglobulinie donorowej. Na skutek takich konkurencyjnych problemów wiele znanych humanizowanych przeciwciał wykazuje pewien spadek powinowactwa wiązania w porównaniu z odpowiednimi przeciwciałami mysimi, z których zostały otrzymane. Patrz np. Jones i imii, Nature 321:522-525 (1986); Shearman i inni, J. Immunol. 147:4366-4373 (1991);Kettleborough i inni, Protein Engineering 4:773-783 (1991); Gorman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest i inni, Biotechnology 9:266-271 (1991).

Z powyższego jasno wynika, że istnieje zapotrzebowanie na humanizowane przeciwciała anty-VL A-4 wykazuj ące silne powinowactwo do receptora VLA-4, wywołuj ące przy tym co naj wyżej nieznaczną ludzką reakcję przeciwmysią.

Dla otrzymania odpowiednich humanizowanych przeciwciał istotny jest dobór mysiego przeciwciałajako materiału wyjściowego, z którym rozpoczętoby żmudny i drogi sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała anty-VLA-4 o pożądanych właściwościach.

Istnieje bezgranicznie duża potencjalna grupa mysich przeciwciał anty-VLA-4 spośród których można wybrać materiał wyjściowy. W publikacji WO 91/03252 omówiono 4 mysie monoklonalne przeciwciała, a wiele innych mysich przeciwciał można wytworzyć znanymi sposobami.

181 827

W obrębie tej dużej grupy przeciwciała zasadniczo różniąsię pod względem funkcjonowania. Nawet w przypadku wydzielania przeciwciał z jednego szczepu myszy skierowanych przeciw małemu resztkowemu antygenowi, takiemu jak arsenian azofenylowy (M.cz. 217), otrzymane przeciwciała mająróżne sekwencje i różne właściwości wiązania. Patrz Capra i inni, Immunology Today 3, 332-339 (1982). W przypadku wydzielenia przeciwciał skierowanych przeciw dużo większym i strukturalnie bardziej złożonym heterodimerycznym białkom oczekuje się, że różnice we właściwościach będą o wiele większe. Przypuszczenie to potwierdzono drogą obserwacji, że podjednostki α-4 VLA-4 mają co najmniej dwie wyraźne domeny wiążące ligand (VCAM-1 i fibronektyna), a różne przeciwciała mająróżne zdolności do blokowania tych odpowiednich wiązań. Przykładowo przeciwciała podane w WO 91/03252 blokują wiązanie fibronektyny, przeciwciała omawiane w publikacji w Agents Actions, Vol. 39, 1993, hamują wiązania VCAM-1 i komórkami U937 i komórkami z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), natomiast hamujątylko wiązanie fibronektyny z komórkami U937, a przeciwciała opisane przez Elices (HP 1/3) blokują tylko wiązanie VCAM-1. Skomplikowane funkcjonowanie antygenu VLA-4 zostało także udowodnione w dużej liczbie przypadków pośredniczonych przez ten antygen, obejmujących proliferację komórek T, wytwarzanie cytokiny, przyspieszanie lub opóźnianie śmierci komórek, regulowanie komórek T genu żelatynazy, regulowanie monocytalnych mediatorów zapalenia, wyzwalanie fosforylowania tyrozyny, jak również stymulowanie migracji monocytów i limfocytów przez śródbłonek. Lobb & Hemmler, J Clin. Invest, str. 1723.

W publikacji w Agents Actions omówiono przeciwciało 21.6, jednak nie ujawniono jak otrzymywać to przeciwciało i nie określono jego sekwencji. Nie wskazano depozytu, ani nie podano sekwencji aminokwasów domen zmiennych, co pozwoliłoby na odtworzenie przeciwciała. Właściwe odtworzenie przeciwciała bez informacji na temat depozytu lub sekwencji pociąga za sobą zbyt długo trwające doświadczenia. Zatem ta publikacja nie zawiera wystarczającego ujawnienia mysiego przeciwciała 21.6. W przypadku braku dostępności mysiego przeciwciała 21.6 nikt nie mógłby znać sekwencji jego regionów części zmiennej, a więc nie mógłby wytworzyć humanizowanego przeciwciała 21.6 z regionami CDR oraz wybranymi regionami zrębowymi części zmiennej z mysiego przeciwciała 21.6.

Jakkolwiek są znane, np. z publikacji WO 90/07861, pewne ogólne kryteria określające, które ludzkie regiony zrębowe części zmiennej powinny być podstawione, to rzeczywiste reszty sąróżne dla różnych przeciwciał i określone drogą modelowania molekularnego poszczególnego mysiego przeciwciała do humanizowania. W literaturze dotychczas nie podano żądnych wskazówek odnośnie konkretnych podstawień wymaganych w humanizowaniu mysiego przeciwciała 21.6.

Obecnie otrzymano humanizowane immunoglobuliny zawierające regiony CDR i pewne regiony zrębowe części zmiennej z mysiego przeciwciała 21.6.

Te humanizowane immunoglobuliny specyficznie wiążą ligand VLA-4. Humanizowane przeciwciała zawierają humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki. Humanizowany łańcuch lekki obejmuje 3 regiony determinujące dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) zawierające sekwencje aminokwasów z odpowiednich regionów determinujących dopasowanie łańcucha lekkiego mysiego immunoglobuliny 21-6 oraz region zrębowy części zmiennej z sekwencji zrębowej części zmiennej ludzkiego łańcucha lekkiego k, przy czym w co najmniej jedńej pozycji wybranej z pierwszej grupy obejmującej pozycje L45, L49, L58 i L69 pozycja aminokwasu jest zajmowana przez taki sam aminokwas, jaki występuje w równoważnej pozycji regionu zrębowego części zmiennej łańcucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21-6. Humanizowany łańcuch ciężki obejmuje 3 regiony determinujące dopasowanie (CDR1, CDR2 i CDR3) zawnerające sekwencje aminokwasów z odpowiednich regionów determinujących dopasowanie łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21-6 oraz region zrębowy części zmiennej z sekwencji zrębowej części zmiennej ludzkiego łańcucha ciężkiego, przy czym w co najmniej jednej pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje H27, H28, H29, H30, H44 i H71 pozycja aminokwasu jest zajmowana przez taki sam aminokwas Jaki występuje w równoważnej pozycji regionu zrębowego części zmiennej łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21-6. Immunoglobuliny wiążą się

181 827 specyficznie z VLA-4 z powinowactwem, którego dolna granica wynosi około 10⁷ M’1 a górna granica jest około 5 razy większa od powinowactwa mysiej immunoglobuliny 21-6.

Zazwyczaj humanizowane regiony zrębowe części zmiennych łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego pochodząz sekwencji zrębowych części zmiennych odpowiednio RE1 i 21/28'CL. Gdy humanizowany region zrębowy części zmiennej łańcucha lekkiego pochodzi z RE1, to wówczas zastąpione zostają co najmniej dwa zrębowe aminokwasy. Jeden aminokwas pochodzi z pierwszej grupy pozycji wymienionych powyżej. Inne aminokwasy pochodzą z trzeciej grupy obejmującej pozycje Ll04, Ll05 i L107. Pozycja ta zajmowana jest przez taki sam aminokwas, jaki występuje w równoważnej pozycji łańcucha lekkiego κ ludzkiej immunoglobuliny innej niż RE1.

Pewne humanizowane immunoglobuliny zawierają dojrzałą sekwencję części zmiennej łańcucha lekkiego oznaczonąjako La lub Lb na fig. 6, albo dojrzałą sekwencję części zmiennej łańcucha ciężkiego oznaczoną jako Ha, Hb lub Hc na fig. 7. Do korzystnych humanizowanych immunoglobulin należąte, które zawierająłańcuch lekki La oraz łańcuch ciężki Ha, Hb lub Hc.

Tak więc wynalazek dotyczy nowej humanizowanej immunoglobuliny specyficznie wiążącej VlA-4, zawierającej część zmienną dojrzałego łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 11 i część zmienną dojrzałego łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 7, albo fragmentu wiążącego tej immunoglobuliny.

Korzystnie humanizowana immunoglobulina zawiera domenę części stałej, przy czym domena części stałej ma funkcję efektorową, która w szczególności jest zdolna do wiązania dopełniacza lub toksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała, względnie nie ma funkcji efektorowej.

Wynalazek dotyczy także nowego kwasu nukleino wego kodującego łańcuch ciężki humanizowanej immunoglobuliny specyficznie wiążącej VLA-4, o sekwencji nukleotydów SEQ ID NO: 16.

Wynalazek dotyczy również nowego kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki humanizowanej immunoglobuliny specyficznie wiążącej VLA-4, o sekwencji nukleotydów SEQIDNO: 14.

Nowe humanizowane immunoglobuliny (przeciwciała) mają szereg nieoczekiwanych i pożądanych właściwości przy podawaniu in vivo.

W przykładzie 9 dowiedziono, że zastrzegane humanizowane immunoglobuliny (przeciwciała) są skuteczne w usuwaniu i odwracaniu objawów klinicznych w modelu zwierzęcym symulującym stwardnienie rozsiane u ludzi. W szczególności, w wyniku leczenia zaawansowanej choroby u świnki morskiej tymi humanizowanymi przeciwciałami uzyskuje się znaczące odwrócenie objawów klinicznych, znaczące przybranie na wadze, znaczące zmniejszenie napływania leukocytów do ośrodkowego układu nerwowego i znaczący wzrost liczby płytek krwi.

W przykładzie 8 ponadto wykazano, że przeciwciało 21.6 ma inne użyteczne właściwości, co czyni go szczególnie odpowiednim dla sposobów terapeutycznych. W przykładzie tym wykazano, że przeciwciała 21.6 blokują wiązanie VLA-4 do VCAM bez względu na obecność Mn²⁺(aktywator VLA-4) i na stężenie VCAM-1. Z tego przykładu dodatkowo wynika, że aktywacja VLA-4 i regulacja w górę VCAM-1 są prawdopodobnie wynikiem odpowiedzi zapalnej in vivo. Zatem zdolność przeciwciała 21.6 do blokowania niezależnie od stężenia [Mn²⁺] i [VCAM-1] czynią to przeciwciało szczególnie przydatne w celu podawania terapeutycznego in vivo. Dla porównania dostępne w handlu przeciwciało przeciw VLA-1 (L25) nieznacznie blokuje wiązanie przy dużym stężeniu [Mn²⁺] i [VCAM-1],

W celu identyfikacji humanizowanych immunoglobulin opisanych powyżej stosuje się komputery zaprogramowane tak, że przedstawiają trójwymiarowe obrazy mysiego przeciwciała 21.6 lub humanizowanych immunoglobulin.

Humanizowane immunoglobuliny i ich fragmenty wiążące opisane powyżej stosuje się jako środki farmaceutyczne do leczenia stanów zapalnych. Środki farmaceutyczne zawierająhumanizowaną immunoglobulinę lub jej fragment wiążący oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W pewnych sposobach leczenia środek farmaceutyczny podaje się ilości terapeutycznie skutecznej pacjentowi z chorobą zapalną taką stwardnienie rozsiane.

181 827

Humanizowane immunoglobuliny i ich fragmenty wiążące opisane powyżej są również użyteczne w sposobach wykrywania antygenu VLA-4. Zgodnie z takimi sposobami humanizowane przeciwciało lub fragment wiążący podaje się pacjentowi lub wprowadza do pobranej do niego tkanki. Wykrywa się kompleksy wytworzone w wyniku specyficznego wiązania przeciwciała lub fragmentu z VLA-4 obecnym w próbce.

Poniżej podano definicje określeń stosowanych w opisie.

Skróty dwudziestu występujących w naturze aminokwasów stosowano w sposób zgodny z przyjętąkonwencją (mrnwnology- A Synthesis (2 ed., E.S. Golub iD.R. Gren, red.; Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Stereoizomery (np. D-aminokwasy) dwudziestu zwykłych aminokwasów, nienaturalne aminokwasy, takie jak α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy oraz inne niekonwencjonalne aminokwasy, mogąrównież stanowić przydatne składniki omawianych polipeptydów. Do przykładowych niekonwencjonalnych aminokwasów należą:

4-hydroksyprolina, γ-karboksyglutaminian, 8-N,NN^T-trimetylolizyna ε-N-acetylolizyna, O-fosfoseryna, N-acetyloseryna, N-formylometionina, 3-metylohistydyna, 5-hydroksylizyna, ω-N-metyloargmina oraz inne podobne aminokwasy i iminokwasy (np. 4-hydroksyprolina). Ponadto aminokwasy mogąbyć modyfikowane przez glikozylowanie, fosforylowanie itp.

W użytej notacji polipeptydów kierunek lewostronny oznacza kierunek do końcowej grupy aminowej, a kierunek prawostronny oznacza kierunek do końcowej grupy karboksylowej, zgodnie ze standardowym znaczeniem i konwencją. Podobnie, o ile nie zaznaczono tego inaczej, lewostronny koniec sekwencji jednoniciowego polinukłeotydu stanowi koniec 5'; a lewostronny kierunek sekwencji dwuniciowego polinukłeotydu oznacza kierunek do 5'. Kierunek od 5' do 3' addycji powstających transkryptów RNA określa się jako kierunek transkrypcji; obszary sekwencji w nici DNA zawierające taką samą sekwencję jak RNA i będące 5' względem końca 5' transkryptu RNA określa się jako „sekwencje w górę”; obszary sekwencji w nici DNA zawierające taką samą sekwencję jak RNA i będące 3' względem końca 3' transkryptu RNA określa się jako „sekwencje w dół”.

Określenie „sekwencja polinukłeotydowa” odnosi się do jedno- lub dwuniciowego polimeru zasad dezoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych, odczytywanego od końca 5' do 3'. Obejmuje ono samoreplikujące się plazmidy, infekcyjne polimery DNA lub RNA oraz niefunkcyjne dNa lub RNA.

Następujące określenia stosuje się do opisywania zależności między sekwencjami dwóch lub więcej polinukleotydów: „sekwencja odniesienia”, „okno porównawcze”, „identyczność sekwencji”, „procent identyczności sekwencji” oraz „zasadnicza identyczność”. „Sekwencja odniesienia” stanowi określoną sekwencję wykorzystywaną jako podstawa do porównywania sekwencji; sekwencja odniesienia może stanowić fragment większej sekwencji, np. segment pełnej długości cDNA lub sekwencji genu wymienionej w zestawieniu sekwencji, np. sekwencji polinukleotydowej przedstawionej na fig. 1 lub 2, albo też może stanowić pełną sekwencję DNA lub genu. Zazwyczaj sekwencja odniesienia zawiera co najmniej 20 nukleotydów, często co najmniej 25 nukleotydów albo co najmniej 50 nukleotydów. Każdy z dwóch polinukleotydów może (1) z^A^^er^ić sekwencję (np. część pełnejsekwencjj pohniudeotydu) wykazującąpodobieństwo do sekwencji drugiego polinudleotydu oraz (2) zawiera sekwencję różniącą się od sekwencji drugiego pollnudleotydu, a więc porównanie sekwencji w dwóch (lub więcej) polinudleotydach zazwyczaj prowadzi się porównując sekwencje dwóch polinuWeotydów w „oknie porównawczym” w celu zidentyfikowania i porównania lokalnych obszarów podobieństwa sekwencji. Stosowane tu określenie „okno porównawcze” oznacza pojęciowy segment złożony z co najmniej 20 sąsiadujących pozycji nukleotydowych, w którym sekwencję polinuldeotydowąmożna porównać z sekwencją odniesienia z co najmniej 20 nukleotydów, przy czym część sekwencji polinukleotydowej w oknie porównawczym może obejmować addycje lub delecje (czyli luki) wynoszące 20% lub poniżej, w porównaniu z sekwencją odniesienia (która nie zawiera addycji lub delecji) przy optymalnym ułożeniu dwóch sekwencji. Optymalne złożenie sekwencji przy układaniu okna porównawczego przeprowadzić można z wykorzystaniem algorytmu lokalnej homologii, Smith i Waterman, Adv. Appl Math. 2:482 (1981), algorytmu homologii ułożenia, Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol.

181 827

48:443 (1970), przez poszukiwaniepodobieństwametodąPearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), przez komputerowe oprogramowanie tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) lub przez sprawdzanie, po czym wybiera się najlepsze ułożenie (zapewniające najwyższy procent podobieństwa w oknie porównawczym) uzyskane różnymi metodami. Określenie „identyczność sekwencji” oznacza, że dwie sekwencje polinukleotydowe są identyczne (czyli zawierają kolejno takie same nukleotydy) w oknie porównawczym. „Procent identyczności sekwencji” wylicza się porównując dwie optymalnie ułożone sekwencje w oknie porównawczym, ustalając liczbę pozycji, w których występują identyczne zasady w kwasie nukleinowym (np. A, T, C, G, U lub I) w obydwu sekwencjach, dzieląc liczbę dopasowanych pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównawczym (czyli przez szerokość okna) oraz mnożąc wynik przez 100. Stosowane tu określenie „zasadnicza identyczność” oznacza cechę sekwencji polinukleotydowej, zgodnie z którąpolinukleotyd zawiera sekwencję wykazującąco najmniej 85% identyczności, korzystnie od co najmniej 90 do 95% identyczności, ajeszcze częściej co najmniej 99% identyczności w porównaniu z sekwencją odniesienia w oknie porównawczym o co najmniej 20 pozycjach nukleotydów, często w oknie o co najmniej 20-25 nukleotydach, przy czym procent identyczności sekwencji wylicza się porównując sekwencję odniesienia z sekwencjąpolinukleotydową, która może zawierać delecje lub addycje stanowiące łącznie nie więcej niż 20% sekwencji odniesienia w oknie porównawczym. Sekwencja porównawcza może stanowić fragment większej sekwencji, np. sekwencji pokazanej na fig. 1 lub 2.

W odniesieniu do polipeptydów określenie „identyczność sekwencji” odnosi się do peptydów zawierających identyczne aminokwasy w odpowiednich pozycjach. Określenie „podobieństwo sekwencji” odnosi się do pepetydów zawierających identyczne lub podobne aminokwasy (tak zwane podstawienia konserwatywne) w odpowiednich pozycjach. Określenie „zasadnicza identyczność” oznacza, że dwie sekwencje pcptydowe przy optymalnym zestawieniu, np. z wykorzystaniem programów GAP lub BESTFIT z uwzględnieniem wag brakujących luk, wykazują co najmniej 80% identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 90% identyczności, a korzystniej co najmniej 95% identyczności lub powyżej (np. 99% identyczności sekwencji). Korzystnie reszty w pozycjach, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów. Określenie „zasadnicze podobieństwo” oznacza, że dwie sekwencje peptydowe wykazują odpowiedni procent podobieństwia sekwencji.

Określenie „zasadniczo czysty” oznacza, że określony składnik jest składńikiem przeważającym (to znaczy molowo występuje w kompozycji w większej ilości niżjakikolwiek inny składnik), przy czym korzystnie zasadniczo oczyszczoną frakcję stanowi kompozycja, w której określony składnik stanowi co najmniej około 50% (molowo) wszystkich obecnych makrocząsteczkowych składników. Zazwyczaj zasadniczo czysta kompozycja będzie zawierać określony składnik w ilości stanowiącej od ponad około 80 do 90% wszystkich makrocząsteczkowych składników obecnych w kompozycji. Najbardziej określony składnik jest oczyszczony w stopniu zasadniczo odpowiadającym jednorodności (składników stanowiących zanieczyszczenia nie można wykryć w kompozycji z wykorzystaniem konwencjonalnych metod wykrywania), tak że kompozycja zawiera zasadniczo jeden rodzaj makrocząsteczek.

Aby poklasyfikować podstawienia aminokwasów jako konserwatywne łub niekonserwatywne, pogrupowano je następująco: grupa I (hydrofobowe łańcuchy boczne); norleucyna, met, ala, val, leu, ile; Grupa II (obojętne hydrofitowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; grupa III (kwasowe łańcuchy boczne): asp, glu; Grupa IV (zasadowe łańcuchy boczne); asn, gin, his, arg; Grupa V (reszty wpływające na orientację łańcucha); gly, pro; oraz grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, phe. Konserwatywne podstawienia obejmują podstawienia aminokwasów tej samej grupy. Podstawienia niekonserwatywne obejmują zamianę elementu jednej grupy na element z drugiej gjupy.

Aminokwasy z części zmiennych dojrzałych łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin oznacza się odpowiednio jako Hx i Lxx, gdzie x stanowi liczbę określającą pozycję aminokwasu, zgodnie ze schematem Kabata i innych, Sequeoces ofProteins oflmmuuologicallnteeeet (Naaional

181 827

Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1987) i (1991)) (pozycje poniżej łącznie określanejako „Kabat i inni”).Kabat i inni zestawili wiele sekwencji aminokwasów dla przeciwciał w każdej podklasie oraz podają najczęściej występujące aminokwasy dla pozycji każdej reszty w tej poddasie. Kabat i inni zastosowali metodę przypisywania numeru reszty każdemu aminokwasowi w wymienionej sekwencji i taki sposób przypisywania numerów reszt został powszechnie przyjęty. Schemat Kabata i innych można rozszerzyć na inne przeciwciała nie ujęte w zestawieniu dopasowując określone przeciwciało do jednej z sekwencji zgodności Kabata i innych. Zastosowanie układu numerowania Kabata i innych umożliwia łatwą identyfikację aminokwasów w równoważnych pozycjach w różnych przeciwciałach. Tak np. aminokwas w pozycji L50 ludzkiego przeciwciała zajmuje pozycję odpowiadającą pozycji aminokwasu L50 w mysim przeciwciele.

Wynalazek opisano bardziej szczegółowo poniżej.

I. Humanńzowane przeeiwciida specyffczne względem WA-4

W jednej postaci wynalazek dotyczy humanizowanych immunoglobulie (lub przeciwciał) specyficznych względem podjcdnostdC α-4 w VLA-4. Humanizowane immunoglobuliny zawierają zmienne regiony zrębne pochodzące zasadniczo z ludzkiej immunoglobulmy (określanej jako CmmueoglobulCen akceptorowa) oraz regiony determinujące dopasowanie pochodzące zasadniczo z mysiej immunoglobuliny nazwanej μ MAb 21.6 (określanej jako immunoglobulina donorowa). Jeśli występuje jedna lub więcej części stałych, to zasadniczo pochodzą one również od ludzkiej immunoglobuliny. Humanizowane przeciwciała wykazują powinowactwo właściwe względem VLA-4 co najmniej 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M'¹. Zazwyczaj górna granica powinowactwa wiązania humanizowanych przeciwciał z VLA-4 stanowi 3-5 wielkości dla μ MAb 21.6 (około 109 m-1). Często dolna granica powinowactwa wiązania stanowi również 3-5 wielkości dla μ MAb 21.6.

A. Ogólna charakterystyka immunoglobulin

Wiadomo, że rodstawowąjcdeostdę strukturalną rreeyCwyiała stanowi tetramer. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów rolireptydowyyh, przy czym każda para oawCcrajedee łańcuch „lekki” (około 25 kDa) i jeden łańcuch „ciężki” (około 50-70 kDa). Aminokońcowa część każdego łańcucha obejmuje część omiceeą o około 100-110 lub więcej aminokwasach, odpowiedzialną przede wszystkim za rozpoznawanie antygenu. Karboksy-końcowa część każdego łańcucha stanowi część stałą odpowiedzialną przede wszystkim za funkcję efektorową.

Łańcuchy lekkie dzielą się na κ i λ. Łańcuchy ciężkie dzielą się na γ, μ, α, δ i ε; określają one odpowiednio izotypy przeciwciała IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. W łańcuchach lekkich i ciężkich części zmienne i stałe są połączone obszarem ,J” zawierającym około 12 lub więcej aminokwasów, a łańcuchy ciężkie zawierają obszar „D” o około 10 lub więcej aminokwasach. (Patrz ogólnie FundamentalImmunology (red. Paul W., 2 wyd., Raven Press, N Y., 1989), rozdz. 7.

Części zmienne każdej pary łańcuch lcddC/łańyuyh ciężki tworzą miejsce wiązania przeciwciała. Wszystkie łańcuchy wykazują tą samą ogólną budowę z względnie zachowanymi regionami zrębowymi (FR) połączonymi trzema regionami hiperomicneymi określanymi również jako regiony determinujące dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów każdej pary są dopasowane poprzez regiony zrębowe, co umożliwia wiązanie z określonym crCtorem. Reszty CDR i FR są zakreślone zgodnie ze standardową definicją sekwencji Kabata i innych, supra. Alternatywną definicję strukturalną zaproponowali Chothia i inni, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Nature 342:878-883 (1989); i J. Mol. Biol. 186:651-663 (1989) (pozycje poniżej łącznie odrcślanejado „Chothia i inni”). W przypadku pozycji zrębowych określonych przez Kabata i innych, supra, które stanowiąpozycje strukturalnej pętli, określonej przez Chothia i innych, supra, aminokwasy znajdujące się w mysim przeciwciele zostają zazwyczaj wprowadzone do humanizowanego przeciwciała.

B. Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał (1) Mysie MAb 216

Materiałem wyjściowym do wytwarzania humanizowanych przeciwciał jest mysie μ MAb 21.6. Wydzielanie i właściwości tego przeciwciała opisano w PCT/US90/05 106. Pokrótce, μ MAb

21.6 jest trecyfcczee względem rodjcdeostdi α-4 w VLA-4 i, jak wykazano, hamuje wiązanie lu181 827 dzkiego limfocytu z hodowlami tkankowymi komórek mózgowych szczura pobudzanych czynnikiem martwicy nowotworu. Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA kodującego części zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała μ MAb 21.6 opisano w przykładzie 1, a sekwencje nukleotydów i przewidywane sekwencje aminokwasów pokazano na fig. 1 i 2. Przedstawiono tam również podział sekwencji kodującej aminokwasy na domenę zrębową ideterminującą dopasowanie. Od końca N do końca C, zarówno w łańcuchu lekkim, jak i w ciężkim, występują domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Aminokwasy przypisano do poszczególnych domen zgodnie z konwencją numerowania Kabata i innych, supra.

(2) Dobór ludzkich przeciwciał dostarczających reszt zrębowych

Wprowadzenie mysich CDR do ludzkiego regionu zrębowego części zmiennej najprawdopodobniej spowoduje .zachowanie ich prawidłowej orientacji przestrzennej jeśli region zrębowy ludzkiej zmiennej domeny przyjmie konformację taką samą lub podobną do konformacji mysiego regionu zrębowego części zmiennej, z którego pochodząCDR. Osiąga się to stosując ludzkie zmienne domeny z ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi domenami regionu zrębowego części zmiennej, z których pochodząCDR. Regiony zrębowe części zmiennej łańcucha ciężkiego i lekkiego mogą pochodzić z tych samych lub z różnych sekwencji ludzkich przeciwciał. Sekwencje ludzkich przeciwciał mogą być sekwencjami ludzkich przeciwciał występujących w naturze, albo też mogą stanowić sekwencje zgodności szeregu ludzkich przeciwciał. Patrz Kettleborough i inni, Protein Engineering 4:713 (1991); Kolbinger i inni, Protein Engineering 6:971 (1993).

Odpowiednie sekwencje ludzkich przeciwciał identyfikuje się przez komputerowe porównywanie sekwencji aminokwasów mysich części zmiennych z sekwencjami znanych ludzkich przeciwciał. Porównanie przeprowadza się osobno dla łańcucha ciężkiego i lekkiego, z tym, że zasada w każdym przypadku jest podobna. Porównanie to potwierdziło, że łańcuch lekki μ 21.6 wykazuje najwyższą identyczność łańcucha z ludzkimi łańcuchami lekkimi podtypu κ 1, a łańcuch ciężki μ 21.6 wykazuje najwyższą identyczność łańcucha z ludzkimi łańcuchami ciężkimi podtypu jeden, według definicji Kabata i innych, supra. Zatem ludzkie regiony zrębowe, lekki i ciężki, zazwyczaj pochodzą z ludzkich przeciwciał tych podtypów lub z sekwencji zgodności tych podtypów. Korzystne ludzkie części zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego, wykazujące najwyższą identyczność sekwencji z odpowiednimi obszarami z μ MAb 21.6, pochodzą odpowiednio z przeciwciał RE1 i 21/28'CL.

(3) Modelowanie komputerowe

Nienaturalne zestawianie mysich obszarów CDR z ludzkim regionem zrębowym części zmiennej może spowodować nienaturalne napięcia konformacyjne, które, jeśli nie zostaną skorygowane przez podstawienie pewnych reszt aminokwasów, prowadzą do utraty powinowactwa wiązania. Doboru reszt aminokwasów do podstawienia dokonuje się częściowo na podstawie modelowania komputerowego. Sprzęt komputerowy i oprogramowanie do tworzenia trójwymiarowych obrazów cząsteczek immunoglobulinowych sąpowszechnie dostępne. Zazwyczaj modele cząsteczkowe tworzy się wychodząc z ustalonych struktur łańcuchów immunoglobulin lub ich domen. Modelowane łańcuchy porównuje się pod względem podobieństwa sekwencji aminokwasów z łańcuchami lub domenami ustalonych struktur trójwymiarowych, a łańcuchy lub domeny wykazujące najwyższe podobieństwo sekwencji wybiera się jako punkty wyjściowe do konstrukcji modelu cząsteczkowego. Tak np. w przypadku łańcucha lekkiego μ MAb 21.6 punkt wyjściowy do modelowania regionów zrębowych, regionów CDR1 i CDR2, stanowił ludzki łańcuch lekki RE 1. Dla regionu CDR3 punkt wyjściowy stanowił region CDR3 z łańcucha lekkiego odmiennego ludzkiego przeciwciała HyHEL-5. Ustalone wyjściowe struktury zmodyfikowano tak, aby umożliwić modelowanie różnic między rzeczywistymi aminokwasami w łańcuchach lub domenach immunoglobuliny i w strukturze wyjściowej. Zmodyfikowane struktury złożono następnie w kompozytową immunoglobulinę. Na koniec model zoptymalizowano przez minimalizowanie energii oraz przez sprawdzenie czy wszystkie atomy znajdują się w odpowiednich odległościach jeden od drugiego oraz czy długości wiązań i kąty między nimi znajdują się w dopuszczalnych pod względem chemicznym granicach.

181 827

W przykładzie 4 przedstawiono dokładniej etapy prowadzące do wytworzenia trójwymiarowego modelu komputerowego części zmiennych μ MAb 21.6, a sam model pokazano na fig. 5. Model ten może z kolei służyć jako punkt wyjścia do przewidywania trójwymiarowej struktury przeciwciała zawierającego regiony determinujące dopasowanie μ MAb 21.6 wstawione do struktur ludzkiego regionu zrębowego. Skonstruować można dodatkowe modele reprezentujące strukturę, do której wprowadzono dodatkowe podstawienia aminokwasów, opisane poniżej.

(4) Podstawienia reszt aminokwasów

Jak to zaznaczono powyżej, humanizowane przeciwciała według wynalazku zawierają regiony zrębowe części zmiennej pochodzące zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny oraz regiony determinujące dopasowanie pochodzące zasadniczo z mysiej immunoglobuliny określonej jako μ MAb 21.6. Po zidentyfikowaniu regionów determinujących dopasowanie z μ MAb 21.6 i odpowiednich ludzkich immunoglobulin akceptorowych w następnym etapie ustala się, jeśli jest to konieczne, które reszty z tych składników należy podstawić, aby zoptymalizować właściwości uzyskanego humanizowanego przeciwciała. W zasadzie podstawianie ludzkich reszt aminokwasów mysimi należy ograniczyć do minimum, gdyż wprowadzenie mysich reszt zwiększa ryzyko uzyskania przeciwciała wywołującego reakcję HAMA u ludzi. Do podstawienia aminokwasy dobiera się biorąc pod uwagę ich ewentualny wpływ na konformację CDR i/lub wiązanie z antygenem. Badanie tych ewentualnych wpływów przeprowadza się przez modelowanie, określając charakterystyki aminokwasów w określonych miejscach, albo też na drodze empirycznej, obserwując wpływ podstawienia lub mutagenezy poszczególnych aminokwasów.

Gdy występująróżnice w aminokwasach między regionem zrębowym części zmiennej μ MAb

21.6 i odpowiednim ludzkim regionem zrębowym części zmiennej, ludzki aminokwas zrębowy należy zazwyczaj podstawić równoważnym mysim aminokwasem, jeśli w granicach, rozsądku oczekuje się, że aminokwas:

(1) niekowalencyjnie wiąże bezpośrednio antygen (np. aminokwasy w pozycjach L49, L69 w μ MAb 21.6), (2) sąsiaduje z regionem CDR, wchodzi w skład regionu CDR zgodnie z alternatywną definicją zaproponowaną przez Chothia i innych, supra, albo w inny sposób oddziaływuje z regionem CDR (np. znajduje się w odległości do około 3 x 10'¹⁰m od regionu CDR (np. aminokwasy w pozycjach L45, L58, H27, H28, H29, H30 i H71 w μ MAb 21.6 ) lub

3) uczestniczy w granicy faz V_L-V_H (np. aminokwasy w pozycji H44 w μ MAb 26.1).

Innymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy ludzkiego akceptorowego regionu zrębowego nie występujące normalnie w danej pozycji ludzkiej immunoglobuliny (np. aminokwasy w pozycjach L104, L105 i L107 w μ MAb 21.6). Aminokwasy te można podstawić aminokwasami z odpowiednich pozycji w bardziej typowych ludzkich immunoglobulinach. Aminokwasy z równoważnych pozycji w mysim MAb 21.6 można także wprowadzić do ludzkich regionów zrębowych, gdy są to aminokwasy typowe dla ludzkiej immunoglobuliny w równoważnych pozycjach.

Zazwyczaj pożądane jest podstawienie całości lub większości aminokwasów spełniających powyższe kryteria. Czasami jednak występują pewne wątpliwości odnośnie tego czy konkretny aminokwas spełnia powyższe kryteria, toteż wytwarza się alternatywne warianty immunoglobulin, z którychjeden zawiera konkretne podstawienie, a drugi jest go pozbawiony. Humanizowane przeciwciała według wynalazku będązazwyczaj zawierać podstawienia reszt ludzkiego regionu zrębowego łańcucha lekkiego odpowiednimi resztami z μ MAb 21.6 w co najmniej jednej, dwu lub trzech, ajeszcze częściej w czterech następujących pozycjach: L45, L49, l58 i L69. Humanizowane przeciwciała będą również zazwyczaj zawierać podstawienia reszt ludzkiego regionu zrębowego łańcucha ciężkiego odpowiednimi resztami z μ MAb 21.6 w co najmniej jednej, dwu, trzech, czterech lub pięciu, a czasami w sześciu następujących pozycjach; H27, H28, H29, H30, H44 i H71. Ewentualnie może być również podstawiona pozycja h36.

W korzystnych postaciach, gdy ludzką immunoglobulinę akceptorową z łańcuchem lekkim stanowi REI, łańcuch lekki zawiera również podstawienia w co najmniej jednej lub dwu, a jeszcze częściej w trzech następujących pozycjach: L104, L105 i L107. Pozycje te sąpodstawio181 827 ne aminokwasami z równoważnych pozycji ludzkiej immunoglobuliny zawierającej bardziej typowe reszty aminokwasów. Odpowiednie do podstawiania aminokwasy pokazano na fig. 6 i 7.

Zazwyczaj regiony CDR w humanizowanych przeciwciałach są zasadniczo identyczne, a jeszcze częściej identyczne z odpowiednimi regionami CDR w przeciwciele μ MAb 21.6. Czasami jednak pożądane jest dokonanie zmiany jednej reszty w regionie CDR. Tak np. w przykładzie 5 zidentyfikowano podobieństwo aminokwasów pomiędzy μ MAb 21.6 CDR3 i ligandem VCAM-1. Obserwacje te sugerują, że powinowactwo wiązania humanizowanych przeciwciał można poprawić przekształcając region CDR3 łańcucha ciężkiego tak, aby odpowiadał on jeszcze dokładniej VCAM-1. Zatem jeden lub więcej aminokwasów z domeny CDR3 można podstawić aminokwasami z domeny wiązania VCAM-1. Jakkolwiek nie jest to zwykle pożądane, można czasem dokonać podstawieńjednego lub więcej konserwatywnych aminokwasów w resztach CDR bez znaczącego wpływu na powinowactwo wiązania uzyskanej ludzkiej immunoglobuliny.

Poza konkretnymi podstawieniami aminokwasów przedstawionymi powyżej regiony zrębowe humanizowanych immunoglobubn są zwykle zasadniczo identyczne, a jeszcze częściej identyczne z regionami zrębowymi ludzkich przeciwciał, od których pochodzą. Oczywiście wiele aminokwasów w regionie zrębowym przyczynia się w nieznacznym stopniu lub nie wpływa bezpośrednio na specyficzność lub powinowactwo przeciwciała. Tak więc dopuścić można wiele pojedynczych podstawień konserwatywnych reszt zrębowych bez znaczącego zmieniania specyficzności lub powinowactwa uzyskanej humanizowanej immunoglobuliny. Jednak z reguły podstawienia takie nie są pożądane.

(5) Wytwarzanie części zmiennych

Po teoretycznym wybraniu składników CDR i zrębowych humanizowanych immunoglubulin można zastosować szereg dostępnych sposobów wytwarzania takich immunoglobulin. Z uwagi na zdegenerowanie kodu różne sekwencje kwasów nukleinowych będą kodować każdą sekwencję aminokwasów immunoglobuliny. Pożądane sekwencje kwasów nukleinowych można wytworzyć drogą syntezy de novo DNA w fazie stałej lub przez mutagenezę PCR wcześniej otrzymanego wariantu pożądanego polinukleotydu. Mutageneza z udziałem oligonukleotydu stanowi korzystny sposób wytwarzania wariantów' DNA docelowego polipeptydu z podstawieniami, delecjami i insercjami. Patrz Adelman i inni, DNA 2:183 (1983). W skrócie DNA docelowego polipeptydu zmienia się przez hybrydyzację oligonukleotydu kodującego pożądanąmutację z jednoniciową matrycą DNA. Po hybrydyzacji polimerazę DNA wykorzystuje się do syntezy pełnej drugiej komplementarnej · nici matrycy, która zawiera oligonukleotydowy starter i koduje wybrane zmiany w DNA docelowego polipeptydu.

(6) Dobór części stałej

Zmienne segmenty humanizowanych przeciwciał otrzymane w sposób opisany powyżej zazwyczaj łączy się z co najmniej częścią stałego obszaru immunoglobuliny (Fc), zwykle ludzkiej immunoglobuliny. Ludzkie sekwencje stałego obszaru DNA można wydzielić znanymi sposobami z wielu różnych komórek, ale korzystnie z uśmierconych komórek B (patrz Kabat i inni, supra, oraz WO 87/02671). Zwykle przeciwciało będzie zawierać części stałe zarówno łańcucha lekkiego jak i łańcucha ciężkiego. Część stała łańcucha ciężkiego obejmuje zazwyczaj regiony CH1, zawiasowy, CH2, CH3 i CH4.

Humanizowane przeciwciała obejmują przeciwciała zawierające wszystkie typy części stałych, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE oraz dowolny izotyp, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Gdy pożądane jest, aby humanizowane przeciwciało wykazywało działanie cytotoksyczne, domenę stałą stanowi zazwyczaj domena stała wiążąca dopełniacz, a klasę stanowi zazwyczaj IgG,. Gdy takie działanie cytotoksyczne nie jest pożądane, domena stała może należeć do klasy IgG₂. Humanizowane przeciwciało może zawierać sekwencje z więcej niż jednej klasy lub izotypu.

(7) Układy ekspresji

Kwasy nukleinowe kodujące humanizowane części zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego, ewentualnie połączone z częściami stałymi, wprowadza się do wektorów ekspresji. Łańcuchy lekkie i ciężkie można klonować w tym samym lub w różnych wektorach ekspresji. Segmenty

DNA kodujące łańcuchy immunoglobuliny są operacyjnie połączone z sekwencjami regu12

181 827 lującymi w wektorze (wektorach) ekspresji zapewniających ekspresję polipeptydów immunoglobuliny. Takie sekwencje regulujące obejmują sekwencję sygnałową, promotor, enhancer i sekwencję terminacji transkrypcji. Wektory ekspresji mogą zazwyczaj ulegać replikacji w organizmach gospodarzach jako episomy lub jako integralna część chromosomowego DNA gospodarza. Zazwyczaj wektory ekspresji będą zawierać markery selekcji, np. tetracyklinę lub neomycynę, aby umożliwić wykrycie tych tnrnsfonnowanych komórek z pożądanymi sekwencjami DNA (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 704 362).

E. coli stanowi jeden z prokariotycznych gospodarzy szczególnie przydatnych do klonowania żądanych polinukleotydów. Do innych przydatnych gospodarzy drobnoustrojowych należą bakterie takie jak Bacillus subtilis, a także inne pałeczki jelitowe takie jak Salmonella, Serratia i różne gatunki Pseudomonas. W takich prokariotycznych gospodarzach można także uzyskać wektory ekspresji, które będą zazwyczaj zawierać sekwencje regulujące ekspresję, kompatybilne z komórką gospodarza (np. początek replikacji). Występować może także dowolna liczba różnych znanych promotorów, takichj ak układ promotora laktozy, układ promotora tryptofanu (trp), układ promotora β-laktamazy lub układ promotora z faga λ. Promotory zazwyczaj regulują ekspresję, ewentualnie wraz z sekwencją operatorową, oraz zawierają sekwencje miejsca wiązania rybosomu itp., do inicjowania i dopełniania transkrypcji i translacji.

Do ekspresji wykorzystać można także inne drobnoustroje, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem jest Saccharomyces, a odpowiednie wektory zawierają sekwencje regulujące ekspresję, takie jak promotory obejmujące kinazę 3-fosfoglicerynianu lub inne enzymy glikolityczne, a także początek replikacji, sekwencje terminacji itp., zależnie od potrzeb.

Oprócz drobnoustro_j ów hodowlę komórek tkanki ssaków można wykorzystać do ekspresji i wytwarzania żądanych polipeptydów (patrz Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987). Komórki eukariotyczne są obecnie korzystne z uwagi na to, że ustalono szereg odpowiednich linii komórek gospodarzy zdolnych do wydzielania nienaruszonych immunoglobulin, obejmujących linie komórek CHO, różne linie komórek Cos, komórki HeLa, korzystnie linie komórek szpiczaka, oraz tnmsfonnowane komórki B lub hybrydomy. Wektory ekspresji dla takich komórek mogązawierać sekwencje regulujące ekspresję, takiejak początek replikacji, promotor i enhancer (Queen i inni, Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)) oraz niezbędne miejsca dostarczające informacji dla obróbki, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca rozszczepiania RNA, miejsca poliadenylowania i sekwencje terminatora transkrypcyjnego. Korzystne sekwencje regulujące ekspresję stanowiąpromotory pochodzące z genów immunoglobuliny, SV40, adenowirusa, wirusa motylicy bydlęcej, wirusa cytomegalli itp.

Wektory zawierające odpowiednie sekwencje polinukleotydowe (np. sekwencje kodujące łańcuch ciężki i lekki oraz sekwencje regulujące ekspresję) można przenieść do komórki gospodarza znanymi sposobami, które zmieniają się w zależności od typu komórki gospodarza. Przykładowo transfekcja z użyciem chlorku wapnia jest powszechnie wykorzystywana w przypadku komórek prokariotycznych, a obróbkę fosforanem wapnia lub elektroporację można zastosować w przypadku innych gospodarzy komórkowych (Patrz ogólnie Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2 wyd., 1989). Gdy ciężkie i lekkie łańcuchy klonuje się w odrębnych wektorach ekspresji, przeprowadza się współtransfekcję wektorów, aby osiągnąć ekspresję i złożenie nienaruszonych immunoglobulin.

Po ekspresji pełne przeciwciała, ich dimery, poszczególne łańcuchy i ciężkie lub inne formy immunoglobulin według wynalazku można oczyszczać znanymi sposobami obejmującymi wytrącanie siarczanem amonowym, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa, elektroforeza na żelu itp. (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Do zastosowań farmaceutycznych korzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny o homogeniczności co najmniej około 90-95%, a najkorzystniej 98-99% lub powyżej.

C. Fragmenty humanizowanych przeciwciał

Wynalazek obejmuje swym zakresem fragmenty humanizowanych przeciwciał. Zazwyczaj te fragmenty wykazują specyficzne wiązania z antygenem VLA-4 z powinowactwem co najmniej 10⁷ M'¹, a jeszcze częściej 10⁸ lub 10⁹ M'¹. Fragmenty humanizowanych przeciwciał

181 827 zawierają odrębne ciężkie łańcuchy, lekkie łańcuchy Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc i Fv. Fragmenty wytwarza się technikami rekombinacji DNA albo drogąenzymatycznego lub chemicznego rozdzielania nienaruszonych immunoglobulin.

II Kwasy nukleinowe

Humanizowane przeciwciała i ich fragmenty zazwyczaj powstająw wyniku ekspresji kwasów nukleinowych. Wszystkie kwasy nukleinowe kodujące humanizowane przeciwciało lub jego fragment opisany w zgłoszeniu, objęte są zakresem wynalazku.

III. Komputery

W celu badania przeciwciał stosuje się komputery tak zaprogramowane, że wyświetlają trójwymiarowe obrazy przeciwciał na monitorze. Odpowiednia jest np. stacja robocza Silicon Graphics IRIS 4D pracująca pod systemem operacyjnym UNIX i wykorzystująca program modelowania cząsteczkowego QUANTA (Polygen Corp., USA). Komputery znajdują zastosowanie do wizualizacji modeli wariantów humanizowanych przeciwciał. Z reguły przeciwciała według wynalazku same zapewniają zadowalające powinowactwo wiązania. Jednakże istnieje prawdopodobieństwo, że przeciwciała o jeszcze silniejszym powinowactwie wiązania można zidentyfikować dodatkowo zmieniając reszty pewnych aminokwasów. Trójwymiarowy obraz umożliwi również zidentyfikowanie wielu aminokwasów nie mających decydującego znaczenia, w przypadku których zastosować można konserwatywne podstawienia nie wywierające znaczącego wpływu na powinowactwo wiązania przeciwciała. Sumarycznie nawet konserwatywne podstawienia mogą wywrzeć znaczący wpływ na właściwości immunoglobuliny. Jednakże jest bardzo prawdopodobne, że wiele pojedynczych podstawień konserwatywnych nie będzie znacząco zmieniać właściwości immunoglobulin.

IV. Badanie humanizowanych przeciwciał

Humanizowane przeciwciała według wynalazku zbadano w różnych testach. Obejmują one prosty test wiązania w celu wykrycia zachodzenia i siły wiązania przeciwciała z komórkami przenoszącymi receptor VLA. Bada się także zdolność przeciwciał do blokowania oddziaływania komórek przenoszących receptor VLA-4 z komórkami śródbłonka, w których zachodzi ekspresja ligandu VCAM-1. Można stosować komórki śródbłonka hodowane i pobudzane w hodowli albo też komórki stanowiące składnik sekcji występujących w naturze tkanek mózgowych. Patrz Yednock i inni, supra, oraz PCT/US90/05106. Bada się także zdolność humanizowanych przeciwciał do zapobiegania lub osłabiania stanu zapalnego prowadzącego do paraliżu u zwierząt doświadczalnych z wywołanym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE). EAE wywołuje się wstrzykując zwierzętom doświadczalnym komórki CD4+T specyficzne względem podstawowego białka mielinowego lub bezpośrednio immunizując zwierzęta podstawowym białkiem mielinowym. Białko to znajduje się w ośrodkowym układzie nerwowym, a reaktywne komórki T inicjująrozpad osłon zawierających to białko w sposób symulujący odpowiedź autoimmunotogiczną w stwardnieniu rozsianym. Patrz Yednock i inni, supra, oraz PCT/US90/05106.

V. Środki farmaceutyczne

Humanizowane immunoglobuliny są użyteczne jako środki farmaceutyczne do stosowania w profilaktyce lub leczeniu stanów zapalnych. Takie środki farmaceutyczne zawierają substancję terapeutycznie czynną, to znaczy humanizowane przeciwciało 21.6 lub jego fragment wiążący, oraz szereg innych składników. Korzystna postać zależy od przewidywanego sposobu podawania i stosowania terapeutycznego. W zależności od pożądanej receptury środki mogą również zawierać farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, które określa się jako zarobki, powszechnie stosowane do formułowania środków farmaceutycznych do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik dobiera się tak, aby nie wpływał on na działanie biologiczne środka. Do takich rozcieńczalników przykładowo należą woda, fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem, roztwory Ringera, roztwór dekstrozy i roztwór Hanka. Środek lub preparat farmaceutyczny może również zawierać inne nośniki, środki pomocnicze albo nietoksyczne, nieterapeutyczne, nieimmunogeniczne stabilizatory itp.

181 827

VI. Sposoby diagnooownnia

Humanizowane przeciwciała i ich fragmenty wiążące sąprzydatne w wykrywaniu obecności komórek przenoszących receptor VLA-4. Obecność tych komórek w mózgu jest oznaką reakcji zapalnej i może stanowić sygnał do rozpoczęcia leczenia w sposób opisany poniżej. Diagnozę można przeprowadzić pobierając próbkę komórek od pacjenta. Następnie oznacza się ilość antygenu VLA-4 powstałego w wyniku ekspresji w poszczególnych komórkach próbki, np. drogąimmunohistochemiyoncgo barwienia utrwalonych komórek albo metodą blottCegu Westema ekstraktu komórkowego z humanizowanym rrocyiwyinłem MAb 21.6 lub jego wiążącym fragmentem.

Diagnozę można również przeprowadzić podając in vivo zeayeoec humanizowane MAb 21.6 (lub fragment wiążący), które następnie wykrywa się drogąwCzualioayjC in vivo. Stężenie podawanego humanizowanego Mab 21.6 powinno być takie, aby można było wykryć wiązanie z komórkami zawierającymi docelowy antygen w porównaniu z sygnałem tła. Odczynnik diagnostyczny może być znaczony radioizotopem do wizualizacji za pomocą kamery lub izotopem paramagnetycznym do wizualizacji metodą rezonansu magnetycznego lub spinowego rezonansu elektronowego.

Zmiany (oaowyyzaj wzrost) poziomu białka VLA-4 w próbce komórek łub w obrazie osobnika, wykraczające poza zakres kliniconic określonych normalnych poziomów, może świadczyć o występowaniu niepożądanej reakcji zapalnej u osobnika, od którego pobrano próbkę i/lub być oznaką skłonności osobnika do rozwinięcia się (lub rozszerzania) takiej reakcji. Białko VLA-4 można także wykorzystać jako rozróżniający marker do identyfikacji i ustalania typu komórek pewnych linii i pochodzenia. Taką detekcję specyficzną względem komórki-typu można wykorzystać do histopatologicznego diagnozowania niepożądanych reakcji odpornościowych.

VII. Sposoby leczenia

Immunoglobulmy według wynalazku są użyteczne w leczeniu stanów zapalnych. W sposobach leczenia wykorzystuje się zdolność humanizowanego MAb 21.6 do blokowania uzależnionych od a-4 oddziaływań receptora VLA-4. Uoależeisee od a-4 oddziaływanie receptora VLA-4 z ligandem VCAM-1 na komórkach środbłonka stanowi wczesny objaw wielu reakcji zapalnych, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym. Do niepożądanych chorób i stanów wynikających z zapalenia ośrodko wego układu nerwowego należą choroby ostre, takie jak udar i inne urazy mózgu oraz choroby przewlekłe, takie jak stwardnienie rozsiane, zapalenie opon i zapalenie mózgu. Stwardnienie rozsiane jest postępującą neurologiczną chorobą autoimmunslsgiczną, która dotyka, jak się szacuje, od 250000 do 350000 osób w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Uważa się, że stwardnienie rozsiane spowodowane jest specyficzną reakcją autoimmunslsgicoeą, w której pewne leukocyty atakująi micjująroorad mieliny, osłonki izolacyjnej podrywająyęj włókna nerwowe. W zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego wykazano, że mysie msnodloealnc przeciwciała skierowane przeciwintegrynieα-Ι-βΊ blokują adhezję leukocytów do śródbłsnda, a tym samym zapobiegają zapaleniu ośrodkowego układu nerwowego, a w konsekwencji paraliżowi zwierząt.

Humanizowane przeciwciała MAb 21.6 według wynalazku wykazują szereg zalet w porównaniu z mysimi przeciwciałami, które, jak to wykazano, działają skutecznie w przypadku modeli owCeroęyych:

1) Układ odpornościowy człowieka nie rozpoznaje rdzenia lub stałego obszaru humanizowanego przeciwciała jako obcego i z tego względu reakcja na przeciwciało skierowana przeciw wstrzykniętemu takiemu przeciwciału powinna być słabsza niż przeciw całkowicie obcemu przeciwciału mysiemu lub częściowo obcemu przeciwciału chimerycznemu.

2) Część efedtorowa humanizowanego przeciwciała jest pochodzenia ludzkiego, toteż może ono lepiej oddziaływać z innymi częściami układu odpornościowego człowieka.

3) Podano, że wstrzyknięte mysie przeciwciała wykazująokrct półtrwania w krwioobiegu człowieka znacznie krótszy od okresu półtrwania zwykłych ludzkich przeciwciał (Shaw i inni, J. Immunol. 138:4334-4538 (1987)). Wstrzyknięte humanizowane przeciwciała wykazują okres półtrwania zasadniczo równoważny z okresem dla występujących w naturze ludzkich przeciwciał, co umożliwia stosowanie mniejszych dawek i rzadsze podawanie.

181 827

Opisane powyżej środki farmaceutyczne można podawać w celach profilaktycznych i/lub przy leczeniu stwardnienia rozsianego oraz innych zaburzeń zapalnych, zwłaszcza dotyczących ośrodkowego układu nerwowego. W zastosowaniach terapeutycznych środki podaje się pacjentowi, u którego podejrzewa się lub stwierdza występowanie takiej choroby jak stwardnienie rozsiane, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania objawów choroby i jej powikłań. Ilość zapewniającą taki efekt określa się jako dawkę terapeutycznie lub farmaceutycznie skuteczną.

W zastosowaniach profilaktycznych środki farmaceutyczne podaje się pacjentowi z podejrzeniem lub z ryzykiem wystąpienia choroby, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka, albo opóźnienia rozwinięcia się choroby. Ilość taką określa się jako dawkę profilaktycznie skuteczną. U pacjentów z cofaniem się stwardnienia rozsianego ryzyko można ocenić na podstawie wizualizacj i NMR lub, w pewnych przypadkach, na podstawie oznak przedobjawowych obserwowanych u pacjenta.

Środki farmaceutyczne podaje się pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, domięśniowo lub miejscowo, np. w postaci aerozolu, lub przezskórnie w celach profilaktycznych i/lub terapeutycznych. Środki farmaceutyczne można podawać w wielu różnych formach postaci dawkowanych, zależnie od sposobu podawania. Tak np. postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują proszki, tabletki, pigułki, kapsułki i pastylki.

Skuteczne dawki środka farmaceutycznego w leczeniu wyżej opisanych stanów będą zmieniać się w zależności od wielu różnych czynników, takich jak sposób podawania, docelowe miejsce, stan fizjologiczny pacjenta oraz inne podawane leki. I tak dawki ^lecznicze powinny być dopasowane w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności. Środki można podawać ssakom w celach weterynaryjnych oraz ludziom w celach klinicznych w sposób podobnyjak inne środki terapeutyczne, np. w fizjologicznie tolerowanym nośniku. Zazwyczaj podawana dawka wynosić będzie od około 0,0001 do 100 mg/kg, ajeszcze częściej od 0,01 do 0,5 mg/kg wagi ciała pacjenta.

VIII. Inne zastosowania

Humanizowane przeciwciała można także wykorzystać do oczyszczania receptora VLA-4 na drodze powinowactwa. Przeciwciała unieruchomią się na stałym nośniku i przez nośnik przepuszcza się roztwór zdyspergowanych białek. VLA-4 wiąże się z nośnikiem i tym samym oddziela się od innych białek. Oczyszczony VLA-4 lub jego fragment, dostępne dzięki zastosowaniu takiego sposobu, można zastosować jako szczepionkę lub jako immunogen do wytwarzania kolejnych przeciwciał.

Humanizowane przeciwciała według wynalazku sąrównież przydatne do wytwarzania idiotypowych przeciwciał, np. przez , immunizację zwierzęcia humanizowanym przeciwciałem. Wybiera się anty-idiotypowe przeciwciało, którego wiązanie z ludzkim przeciwciałemjest inhibitowane przez VLA-4 lubjego fragmenty. Z uwagi na to, że zarówno anty-idiotypowe przeciwciało, jak i VLA-4 lub jego fragmenty wiążą się z humanizowaną immunoglobuliną, anty-idiotypowe przeciwciało może reprezentować „wewnętrzny obraz” epitopu i tym samym może zastępować ligand receptora VLA-4, np. VCAM-1.

Poniżej podano krótki opis rysunków, przy czym określenie SEQ ID NO oznacza sekwencję o numerze identyfikacyjnym podanym po tym określeniu.

Figura 1: Sekwencje DNA (SEQ ID NO: 1) i aminokwasów (SEQ ID NO: 2) obszaru zmiennego łańcucha lekkiego mysiego 21.6.

Figura 2: Sekwencje DNA (SEQ ID NO: 3) i aminokwasów (SEQ ID NO: 4) obszaru zmiennego łańcucha ciężkiego mysiego 21.6.

Figura 3: Wektory ekspresji łańcucha lekkiego (A) i ciężkiego (B) wykorzystywane do wytwarzania chimerycznych i przekształconych ludzkich przeciwciał z ludzkimi łańcuchami lekkimi Ki ludzkimi łańcuchami ciężkimi γ-1 w komórkach ssaków.

Figura 4: Porównanie metodąELISA przeciwciała chimerycznego i mysiego 21.6 wiążącego się z komórkami L, na których powierzchni zachodzi ekspresja ludzkiej integryny α4 βΐ.

181 827

Figura 5: Model cząsteczkowy części zmiennych mysiego przeciwciała 21.6. Zaznaczono szczególnie interesujące reszty.

Figura 6: Porównanie sekwencji aminokwasów obszarów zmiennych mysiego i przekształconego ludzkiego (SEQ ID NO: 5) łańcucha lekkiego. Reszty aminokwasów stanowiące część sekwencji kanonicznych Chothia w strukturach pętli CDR zaznaczono gwiazdkami. REI (SEQ ID NO: 6) przedstawia FR i CDR z obszaru V_L ludzkiego łańcucha lekkiego REI. La (SEQ ID NO: 7) i Lb (sEq ID NO: 8) stanowią dwie wersje przekształconego ludzkiego obszaru 21.6 Vl Reszty w FR z La różniące się od reszt w sekwencji REI podkreślono. W Lb pokazano tylko reszty w regionach zrębowych różniące się od reszt w REI.

Figura 7: Porównanie sekwencji aminokwasów obszarów zmiennych mysiego i przekształconego ludzkiego (SEQ ID NO: 9) łańcucha ciężkiego. Reszty aminokwasów stanowiące część sekwencji kanonicznych Chothia w strukturach pętli CDR zaznaczono gwiazdkami. 2*CL (SEQ ID NO: 10) przedstawia FR i CDR z obszaru V_H ludzkiego lekkiego przeciwciała 21/28'CL. Ha (SEQ ID NO: 11), Hb (SEQ ID NO: 12) i Hc (SEQ ID NO: 13) stanowią 3 wersje przekształconego ludzkiego obszaru 21.6 Vh Reszty w FR z Ha różniące się od reszt w sekwencji 21/28'CL podkreślono. W Hb i Hc pokazano tylko reszty w obszarach zrębowych różniące się od reszt w 21/28'CL.

Figura 8: Oparta na PCR konstrukcja wersji „a” przekształconej obszaru zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego 21.6. Liniami kropkowanymi zaznaczono komplementarną sekwencję co najmniej 21 zasad pomiędzy starterami.

Figura 9: Oparta na PCR konstrukcja wersji „a” przekształconej obszaru zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego 21.6.

Figura 10: Sekwencje cDNA i aminokwasów (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 14 i 15) pierwszej wersji „a” przekształconej obszaru zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego 21.6.

Figura 11: Sekwencje cDNA i aminokwasów (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 16 i 17) pierwszej wersji „a” przekształconej obszaru zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego 21.6.

Figura 12: Porównanie metodą ELISA przeciwciała chimerycznego i przekształconego ludzkiego przeciwciała 21.6 wiążącego się z komórkami L, w których zachodzi na powierzchni ekspresja ludzkiej integryny α4β1.

Figura 13: Porównanie mysiego przeciwciała 21.6 z odmiennym przeciwciałem anty-VLA-4, L25. Na panelu A porównano zdolność przeciwciał do blokowania wiązania monocytowych komórek U937 z oczyszczonym VCA-1 w obecności i pod nieobecność Mn2+. Na panelu B porównano zdolność przeciwciał do blokowania wiązania komórek Jurkata przy wzrastających stężeniach VCAM-1.

Figura 14: Opóźnienie w spadku wagi zwierząt leczonych mysim lub ludzkim przeciwciałem 21.6.

Figura 15: Odwracanie klinicznych objawów u zwierząt leczonych mysim lub ludzkim przeciwciałem 21.6.

Figura 16: Odwrócenie spadku wagi zwierząt leczonych mysim lub ludzkim przeciwciałem 21.6.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład 1. Klonowanie i sekwencjonowanie mysich części zmiennych 21.6

Mysie anty-VLA przeciwciało 21.6 opisano w PCT/US90/05106. Pełny RNA wydzielono z komórek hybrydomy wytwarzających mysie przeciwciała 21.6. cDNA pierwszej nici zsyntetyzowano stosując zestaw (Pharmacia Biosystems Limited). Części zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego uzyskano stosując startery PCR zaprojektowane tak, aby hybrydyzowały z sekwencjami flankującymi i zewnętrznymi w stosunku do sekwencji kodującymi części zmienne, co umożliwia klonowanie pełnych sekwencji kodujących części zmienne mysiego przeciwciała 21.6. Sensowne startery PCR hybrydyzujące z końcami 5' mysich sekwencji Klidera łańcucha lekkiego i mysich sekwencji łańcucha ciężkiego zaprojektowano na podstawie baz danych dla 42 sekwencji κ lidera łańcucha lekkiego i 55 mysich sekwencji łańcucha ciężkiego (Jones i Bendig, Bio/Te1831 827 choology 9:88-89 (1991). Startery te zastosowano w połączeniu z antysensownymi starterami PCR hybrydyzującymi z końcami 3' mysich części stałych (κ lub γ).

Amplifikację PCR mysich obszarów κ V_L21.6 przeprowadzono w mieszaninach reakcyjnych o objętości 50 pl, zawierających 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 200 μΜ dNTPs, 1,5 mM MgCl₂ 1 jednostkę polimerazy DNA AmpliTaą (Pekin Elmer Cetus), 1 pl matrycy cDNA, 0,25 pM startera MKV i 0,25 pM antysensownego startera mysiego łańcucha lekkiego κ (fig. 1). Amplifikację PCR mysich obszarów V_H21.6 przeprowadzono w sposób opisany powyżej, z tym, że zastosowano starter MHVH i antysensowny starter PCR specyficzny względem stałego obszaru IgG1 mysiego łańcucha ciężkiego (fig. 2). Każdą reakcję PCR prowadzono w cyklach, po wstępnym stapianiu w 94°C przez 5 minut, przy czym każdy z 25 cykli obejmował 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 2 minuty w 72°C. Ostatni cykl kończono przeprowadzając ostateczne wydłużanie w 72°C przez 10 minut. Przedział czasowy między etapami hybrydyzacji startera i wydłużania wynosił 2,5 minuty. Po amplifikacji PCR porcje po 10 pl z każdej reakcji analizowano na 1,5% żelach agarozowych zabarwionym bromkiem etydiowym.

Produkty PCR klonowano stosując „TA Klonowanie System” (Invitrogen Corporation). Wektory zawierające inserty o odpowiedniej wielkości sekwencjonowano stosując dwuniciowy plazmidowy DNA i Sequenase (United States Biochemical Corporation). Aby zapobiec ewentualnym błędom, które mogłyby zostać wprowadzone w czasie etapów amplifikacji PCR w przypadku każdego części zmiennej sekwencjonowano co najmniej dwa niezależne zamplifikowanego metodą PCR i klonowanego DNA.

Sekwencje produktów PCR porównano z innymi obszarami zmiennymi mysiego łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego (patrz tabele 1i 2). Z porównania tego wynika, że produkty PCR ze starterów MKV2 i MKV4 stanowią rzeczywiste obszary zmienne κ 21.6, a produkty ze starterów MHV1 i MHV2 stanowią rzeczywiste mysie obszary Vh a ponadto stwierdzono, że sekwencje w tym produkcie stanowią sekwencje obszarów zmiennych mysiego przeciwciała 21.6. Sekwencje DNA i aminokwasów w odniesieniu do cDNA kodującego mysie obszary V_Li Vhz 21.6 przedstawiono na fig. 1 i 2.

Tabela 1

Porównanie mysiego obszaru, zmiennego łańcucha lekkiego 21.6 z innymi obszarami zmiennymi łańcuchów lekkich

Mysi V_l21.6 w stosunku do	Procent podobieństwa¹	Procent identyczności
2 sekwencji zgodności mysiego κ Vl podgrupa 5	84,0	72,6
2 sekwencji zgodności ludzkiego κ Vl podgrupa 1	84,0	69,8
sekwencji zgodności ludzkiego κ Vl podgrupa 2	65,1	52,8
2 sekwencji zgodności ludzkiego κ Vl podgrupa 3	72,6	57,5
sekwencji zgodności ludzkiego κ Vl podgrupa 4²	72,6	58,5
sekwencji zgodności ludzkiego REI³ (człon ludzkiego κ V_l podgrupa 1)	81,0	72,4

^Procent podobieństwa określono stosując program „GAP” z University ofWisconsin Genetics Computer Group. 2ekwencje zgodności na podstawie Kabata i innych, supra.

REI sekwencjonowany przez Palma i innych, Hoppe-Seylefs Z. Physiol. Chem.. 356:167-191 (1975).

181 827

Tabela 2

Porównanie obszaru zmiennego łańcucha ciężkiego mysiego 21.6 z innymi obszarami zmiennymi łańcuchów ciężkich

Mysi V_l2 1.6 w stosunku do	Procent podobieństwa	Procent identyczności
2 sekwencji zgodności mysiego Vh podgrupa 2c	94,3	91,1
2 sekwencji zgodności ludzkiego Vh podgrupa 1	78,0	65,0
2 sekwencji zgodności ludzkiego Vh podgrupa 2	70,5	53,3
sekwencji zgodności ludzkiego Vh podgrupa 32	67,5	52,8
sekwencji zgodności ludzkiego 21/28'CL (człon ludzkiego Vh podgrupa 1)	76,5	64,7

¹ Procent podobieństwa określono stosując program „GAP” z University ofWisconsin Genetics Computer Group.

² Sekwencje zgodności na podstawie Kabata i innych, supra.

³ 21/28'CL sekwencjonowany przez Dersimoniana i innych, J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)

Przykład 2: Konstrukcja chimerycznego przeciwciała 21.6

Chimeryczne lekkie i ciężkie łańcuchy skonstruowano przez połączenie sklonowanych w PCRcDNAmysiego21.6Ł_Lobszarów V_Hz ludzkimi częściami stałymi. Końce 3'i 5'mysich sekwencji cDNA zmodyfikowano stosując specjalnie zaprojektowane startery PCR. Startery PCR końca 5' (tabela 3), które hybrydy zująz sekwencjami kodującymi początki sekwencji lidera, zaprojektowano tak, aby uzyskać sekwencje istotne dla osiągnięcia skutecznej t^^^jslacji (Kozak, J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)), oraz wprowadzić miejsca restrykcyjne HindIII do klonowania w wektorze ekspresji. Startery końca 3' (tabela 3), które hybrydyzująz sekwencjami DNA kodującymi końce obszarów J zaprojektowano tak, aby stworzyć sekwencje DNA istotne dla połączenia się z obszarami stałymi oraz wprowadzić miejsce BamHI do klonowania w wektorze ekspresji. Produkty amplifikacji PCR strawiono HindIII i BamHI, klonowano w wektorze pUC19 i posekwencjonowano, aby potwierdzić, że w czasie amplifikacji PCR nie wystąpiły błędy. Przystosowane mysie obszary zmienne 21.6 subklonowano następnie w wektorach ekspresji komórek ssaka zawierających ludzkie obszary stałe Klub γ-1 (fig. 3).

Tabela 3

Startery PCR do konstrukcji chimerycznego przeciwciała 21.6

A. Obszar zmienny łańcucha lekkiego

1. Starter do rekonstrukcji końca 5' (37 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18)

5' C AGA AAG CTT GCC GCC ACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG 3’

HindIII Sekwencja M R P S I Q zgodności

Kozaka

2. Starter do rekonstrukcji końca 3' (35 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19) ’ CC GAG GAT CCA CTC ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT 3 ’

BamHI Miejsce donorowe składania

181 827

B. Obszm zmienny łańcucha ciężkiego

1. Starter do rekonstrukcji końca 5' (37 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20)

5’ C AGA AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAA TGC AGC TGG GTC 3’ Hindlll Sekwencja M K C S W V zgodności

Kozaka

2. Starter do rekonstrukcji końca 3' (33 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnymi 1)

5’ CC GAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT GAC T 31’ BamHI Miejsce donorowe składania

Przykład 3: Ekspresja i analiza chimerycznego przeciwciała 21.6

Przeprowadzono współtransfekcję dwóch plazmidowych DNA kodując cych łańcuchy lekkie i ciężkie chimerycznego 21.6 w komórkach Cos. Po 2-3 dniach przeprowadzono analizę metodą ELISA w celu stwierdzenia (1) wytwarzania ludzkiego przeciwciała IgG-podobnego oraz (2) zddblości tego luddko-ppdoobego oρreciwciaładowiązaaiał ię z komórkamiL, nap pwieezchni których zachdddi ekspresja ludzkiej ioteonyay α4β1. Na fig. 4 i 12 przeOstawidoo wyniki analizy nie oczyszczonych i oczyszczonych od białka A próbek chimerycznego przeciwciała

21.6 w odniesieniu do wiązania się z ludzką mtegryną α4β1 w pdrówoaold z 0ootrolnym oczyszczonym mysim przeciwciałem 21.6. Z wykresów tych wynika, że chimeryczne przeciwciało

21.6 dobrze wiąże się z antygenem, co potwierdza, że przeprowadzono klonowanie prawidłowych obszarów Vl i Vh mysiego 21.6.

Przykład 4: Modelowanie budowy zmiennych obszarów mysiego 21.6.

Zbudowano model cząsteczkowy obszarów Vl i Vh mysiego przeciwciała 21.6. Model wykonano na stacji roboczej Sillcoo Graphics IRIS 4D pracującej pod systemem operacyjnym UNIX z wykorzystaniem pakietu do modelowania cząsteczkowego QUANTA (Potygen Corp., USA). Budowę FR obszaru V, mysiego 21.6 oparto na rozwiązanej strukturze ludzkiej immunoglobuliny REI Bence-Jonesa (Epp i inni, Biocehmistry 14:4943-4952 (1975)). Budowę FR obszaru Vh mysiego 21.6 oparto na rozwiązanej strukturze mysiego przeciwciała Gloop2. Zachowano identyczne reszty w FR; reszty oieldentyczne podstawiono wykorzystując możliwości QUANTA. CDR1 i CDR2 obszaru V, mysiego 21.6 zidentyfikowano jako należące do odpowiednio do Opoomeznych grup struktury 2 i 1 (Chdthip i inni, supra). W związku z tym, że CDR1 i CDR2 z REI należą do- tych samych Opodoiezaych grup struktury, CDR1 i CDR2 obszaru V, mysiego 21.6 modelowano na strukturach CDR1 i CDR2 z REI. Okazało się natomiast, że CDR3 obszaru V, mysiego 21.6 nie odpowiada żadnej z kpnooiezoyeh grup struktury dla CDR3 obszarów V,.

Przeglądanie baz danych wykazało jednak, że CDR3 w regionie V, mysiego 21.6 było podobne do CDR3 w regionie V, mysiego HyHEL-5 (Sheriff i ϊοοΙ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8075-8079 (1987)). W związku z tym CDR3 obszaru V, mysiego 21.6 modelowano na strukturze CDR3 obszaru V, mysiego HyHEL-5. CDR1 i CDR2 obszaru Vh mysiego 21.6 zidentyfikowano jako należące odpowiednio do kpoonicznych grup struktury 1 i 2. CDR1 obszaru Vh mysiego 21.6 modelowano na CDR1 obszaru Vh Glddp2, który bardzo przypomina elementy grupy kaaoolezaej 1 dla CDR1 obszarów Vh CDR2 obszaru Vh mysiego 21.6 modelowano na CDR2 mysiego HyHEL-5 (Sheriff i inni, supra), który również należy do grupy kpnooicznej 2 dla CDR2 .obszarów Vh. Dla CDR3 obszarów Vh brak jest struktur kaoooiczaych. Jednakże CDR3 w reoidnte V_H mysiego 21.6 był podobny do CDR3 w regionie Vh mysiego R19.9 (Lasco20

181 827 mbe i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:607-611 (1989)), także modelowano go na tym CDR3 przez usunięcie dodatkowej reszty seryny w wierzchołku pętli CDR3 obszaru Vh mysiego R19.9 oraz hybrydyzację i szczegółową analizę luki. Na koniec przeprowadzono minimalizację energii modelu w oparciu o najostrzejsze spadki i sprzężone gradienty, stosując potencjał CHARMM (Brooks i inni, J. Comp. Chem. 4:187-217 (1983)) wchodzący w skład QUANTA, w celu złagodzenia niekorzystnych kontaktów atomowych i zoptymalizowania oddziaływań van der Waalsa i elektrostatycznych.

Widok modelu strukturalnego obszarów zmiennych mysiego 21.6 przedstawiono na fig. 5. Model zastosowano przy opracowywaniu projektu części zmiennych humanizowanego przeciwciała 21.6.

Przykład5: Projektowanie przekształconych części zmiennych ludzkiego 21.6.

(1) Dobór homologicznych ludzkich przeciwciał dla sekwencji zrębowej

Ludzkie części zmienne, których FR wykazują wysoki procent identyczności z FR mysiego 21.6 zidentyfikowano przez porównanie sekwencji aminokwasów. W tabelach 4 i 5 porównano obszary zmienne mysiego 21.6 ze wszystkimi znanymi mysimi obszarami zmiennymi oraz ze wszystkimi znanymi ludzkimi obszarami zmiennymi. Obszar Vl mysiego 21.6 zidentyfikowano jako należący do podgrupy 5 mysiego obszarukVl według Kabata i innych, supra. Stwierdzono, że poszczególne mysie obszary κ Vl wykazuj ądo 93,4% identyczności z obszarem kVl mysiego

21.6 (38C13V'CL i PC613'CL). ObszarV_L mysiego 21.6 jest najbardziej zbliżony do ludzkich obszarów κ Vl według definicji Kabata i innych, supra. Stwierdzono, że poszczególne ludzkie obszary κ VLwykazujądo 72,4% identyczności z obszarem K^mysiego 21.6. Obszary zrębowe (FR) z jednego z najbardziej podobnych ludzkich części zmiennych, REI, wykorzystano do projektowania przekształconego obszaru Vl ludzkiego 21.6. Obszar Vh mysiego 21.6 zidentyfikowano jako należący do podgrupy 2c mysiego obszaru Vh według definicji Kabata i innych, supra:. Stwierdzono, że poszczególne obszary zmienne mysiego łańcucha ciężkiego wykazujądo 93,3% identyczności z obszarem Vh mysiego 21.6 (17.2.25'CL i 87.92.6'CL). Obszar V_H mysiego 21.6 był najbardziej zbliżony do ludzkich obszarów Vh podgrupy 1 według definicji Kabata i innych, supra. Stwierdzono, że poszczególne ludzkie obszary Vhwykazujądo 64,7% identyczności z obszarem Vh mysiego 21.6. FR z jednego z najbardziej podobnych ludzkich części zmiennych, 21/28'CL, wykorzystano do projektowania przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6.

(2) Podstawienia aminokwasów w regionach zrębowych (a) Łańcuch lekki

W następnym etapie procesu projektowania przekształconego ludzkiego obszaru 21.6 połączono CDR z obszaru Vl mysiego 21.6 z FR z ludzkiego REI (Palm i inni, supra). W pierwszej wersji przekształconego obszaru Vl ludzkiego 21.6 (La) dokonano 7 zmian w ludzkich FR (tabela 4, fig. 6).

W pozycjach 104,105 i 107 w FR4, aminokwasy z REI zastąpiono aminokwasami z bardziej typowego ludzkiego obszaru J, z innego ludzkiego łańcucha lekkiego κ (Riechmann i inni, Nature 332:323-327 (1988)).

W pozycji 45 w FR2 lizynę normalnie występującą w REI zmieniono na argininę występującą w tej pozycji w regionie Vl mysiego 21.6. Uważano, ze reszta aminokwasu w tej pozycji odgrywa istotną rolę w podtrzymywaniu pętli CDR2 obszaru Vl mysiego 21.6.

W pozycji 49 FR2 tyrozynę normalnie występującą w REI zmieniono na histydynę występującą w tej pozycji w regionie Vl mysiego 21.6. Na modelu zaobserwowano, że histydyna w tej pozycji w obszarze ^mysiego 21.6 jest zlokalizowana w środku miejsca wiązania i może ewentualnie tworzyć bezpośredni kontakt z antygenem w czasie wiązania przeciwciało-antygen.

W pozycji 58 w FR3 walinę normalnie występującąw REI zmieniono na izoleucynę występującą w tej pozycji w obszarze VLmysiego 21.6. Uważano, że reszta aminokwasu w tej pozycji odgrywa istotną rolę w podtrzymywaniu pętli CDR2 obszaru Vl mysiego 21.6.

W pozycji 69 w FR3 treoninę normalnie występuj ącąw REI zmieniono na argininę występującąw tej pozycji w obszarze Vl mysiego 21.6. Na modelu zaobserwowano, że arginina w tej pozycji w obszarze Vl mysiego 21.6 zlokalizowana jest w sąsiedztwie pętli CDR1 obszaru Vl

181 827 mysiego 21.6 i może ewentualnie tworzyć bezpośredni kontakt z antygenem w czasie wiązania przeciwciało-antygen.

Zaprojektowano drugą wersję przekształconego obszaru V_L ludzkiego 21.6 (określoną jako Lb), zawierającą te same podstawienia jak powyżej, z tym wyjątkiem, że nie wprowadzono zmiany w pozycji 49 w FR2 z REI (fig. 6).

(b) Łańcuch ciężki

W następnym etapie procesu projektowania przekształconego ludzkiego obszaru 21.6 połączono CDR z obszaru V_H mysiego 21.6 z FR z 21/28'CL (Dersimonian i inni, J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)). W pierwszej wersji przekształconego ludzkiego obszaru V 21.6 (Ha) wprowadzono 5 zmian w ludzkich regionach zrębowych (tabela 5, fig. 7). 5 zmian w ludzkich FR wprowadzono w pozycjach 27,28,29, 30 i 71.

W pozycjach 27,28,29 i 30 w FR1 aminokwasy występujące w ludzkim 21/28'CL zamieniono na aminokwasy występujące w tych samych pozycjach w obszarze Vh mysiego 21.6. Jakkolwiek uznano, że pozycje te onajdująsię wewnątrz FR1 (Kabat i inni, supra), to pozycje 26-30 stanowią część pętli strukturalnej, która tworzy pętlę CDR1 obszaru Vh W związku z tym prawdopodobne jest, że aminokwasy w tych pozycjach uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu antygenu. W rzeczywistości pozycje 27-30 stanowią część struktury kanonicznej dla CDR1 obszaru Vh jak to określili Chothia i inni, supra.

W pozycji 71 w FR3 argininę występującą w ludzkim 21/28'CL zmieniono na alaninę występującąw tej samej pozycji w obszarze Vh mysiego 21.6. Pozycja 71 stanowi część kanonicznej struktury dla CDR2 obszaru Vh, jak to określili Chothia i inni, supra.. Z modelu części zmiennych mysiego 21.6 wynika, że alanina w pozycji 71 odgrywa ważnąrolę podtrzymując pętlę CDR2 w obszarze Vh Podstawienie alaniny argininąw tej pozycji najprawdopodobniej zniszczyłoby ułożenie pętli CDR2.

Druga wersja Hb przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6 zawierała 5 zmian opisanych powyżej dla wersji Ha oraz jedną dodatkową zmianę w FR2.

W pozycji 44 w FR2 argininę występującą w ludzkim 21/28'CL zmieniono na glicynę występującą w tej samej pozycji w obszarze Vh mysiego 21.6. Na podstawie opublikowanych informacji o upakowaniu obszarów V_l-Vh i modelu części zmiennych mysiego 21.6 stwierdzono, że reszta aminokwasu w pozycji 44 może odgrywać ważną rolę w upakowaniu obszarów V_l-Vh (Chothia i inni, supra) (fig. 5).

Zaproś ektowano wersję Hc przekształconego obszaru V ludzkiego 21.6 tak, aby bardziej upodobnić pętlę CDR3 do ludzkiego VCAM-1. Zarówno mysie przeciwciało 21.6, jak i ludzkie VCAM-1 wiążą się z integrynąα.4β1. Pętla CDR3 obszaru Vh przeciwciał najbardziej wyróżnia się spośród 6 pętli CDR i stanowi zazwyczaj najważniejszy pojedynczy składnik w przeciwciele przy oddziaływaniach przeciwciało-antygen (Chothia i inni, supra; Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992); Barbas i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457-4461 (1992)). Zidentyfikowano pewne podobieństwa sekwencji pomiędzy CDR3 obszaru Vh mysiego 21.6 i aminokwasami 86 - 94 ludzkiego VCAM-1, zwłaszcza pomiędzy sekwencją yGn (Tyrozyea'Glicyna-Asparagien) w pętli CDR3 i sedweecjąFGN (Fenyloalanina-Glicyna-Asparagina) w VCAM-1. Uważa się, że sekwencje te są spokrewnione z sekwencjami RGD (Arginina'Gli' cyna-Kwas Asparaginowy) odgrywającymi ważną rolę w zjawiskach adhezji różnych komórek (Main i inni, Cell 71:671-678 (1992)). Z tego względu w pozycji 98 w CDR3 tyrozynę występującą w regionie Vh mysiego 21.6 zmieniono na fenyloalaninę występującą w sekwencji ludzkiego VCAM-1.

Rozważono również ewentualne podstawienie w pozycji 36 w FR2. Łańcuch VH mysiego

21.6 zawiera niezwykłą resztę cysteiny w pozycji 36 w FR2. W pozycji tej w FR2 w pokrewnych mysich i ludzkich sekwencjach występuje zazwyczaj tryptofan (tabela 5). Jakkolwiek reszta cysteiny odgrywa istotną rolę w konformacji przeciwciała, model części zmiennych mysiego 21.6 nie wskazuje, aby reszta cysteiny brała bezpośrednio lub pośrednio udział w wiązaniu antygenu, tak że we wszystkich 3 wersjach humanizowanego przeciwciała 21.6 nie zmieniano tr^tofanu występującego w regionie Vh ludzkiego 21/28'CL.

181 827

Przykład 6. Konstrukcja przekształconych ludzkich przeciwciał 21.6

Pierwszą wersję przekształconego obszaru V_L ludzkiego 21.6 (resh 21.6VLa) skonstruowano z zachodzących na siebie fragmentów PCR, zasadniczo w sposób opisany przez Daugherty'ego i innych, Nucleic Acids Res. 19:2471-2476 (1991). (Patrz fig. 8). Obszar Vl mysiego 21.6 przystosowany w sposób opisany w przykładzie 2 i wstawiony do pUC19, zastosowano jako matrycę. Zsyntetyzowano 4 pary starterów, APCR1 -vla1, vla2-vla3, vla4-vla5 i vla6-vla7 (tabela 6 i fig. 8). Sąsiednie pary zachodziły na siebie na odcinku co najmniej 21 zasad. Starter APCR1 był komplementarny z wektorem pUC19. Odpowiednie pary starterów (po 0,2 pmola) połączono z 10 ng matrycowego DNA i 1 jednostkąpolimerazy dNa AmpliTag (Perkin Elmer Cetus) w 50 pl buforu PCR zawieraj ącego 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 200 pM dNTPs i 1,5 mM MgCl₂. Po wstępnym stapianiu w 94°C przez 5 minut, każdy cykl obejmował 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 2 minuty w 72°C, oraz końcowe inkubowanie w 72°C przez kolejne 10 minut. Przedział czasowy między etapami hybrydyzacji startera i wydłużania wynosił 2,5 minuty. Produkty z 4 reakcji (A, B, C i D) z pierwszej rundy reakcji PCR ekstrahowano fenolem i wytrącano etanolem.

Tabela 6

Startery PCR do konstrukcji przekształconych obszarów zmiennych ludzkiego 21.6

A. Obszar zmienny łańcucha lekkiego

1. Startery do syntezy wersji „a”

21.6VLal (39 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22):

5' GAT GGT GAC TCT ATC TTC TAC AGA TGC AGA CAG TGA GGA 3'

21.6VLa2 (32 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23):

5' CTG TAG GAG ATA GAG TCA CCA TCA CTT GCA AG 3'

21.6VLa3 (39 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24):

5' AGG AGC TTT TCC AGG TGT CTG TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3'

21.6VLa4 (41 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25):

5' ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA GGC TGC TCA TAC AT 3'

21.6VLa5 (40 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 26):

5' GCA GGC TGC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3'

21,6VLa6 (42 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 27):

5' ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT 3'

21.6VLa7 (59 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 28):

5' CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTG GTG CCT TGA CCG AAC GTC CAC AGA TT 3'

2. Startery do syntezy wersji „b”

21.6VLb1 (33 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 29): zmiany H-49 do Y-49 5' GGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3'

21.6VL2 (38 erów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 30): zmiany ACC-101 do ACA 101, w celu zniszczenia miejsca StyI.

5' CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3'

B. Obszar zmienny łańcucha ciężkiego 1. Startery do syntezy wersji „a”

21,6VHal (51 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31):

181 827 cd. tabeli 6

5' AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT 3'

21.6VHa2 (67 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32):

5' AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT G 3'

21.6VHa3 (26 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33):

5' GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3'

21.6VHa4 (66 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34):

5' GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACC TCT GCC AGC ACC GCC TAC ATG GAA 3'

21.6VHa5 (64 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35):

5' CCA TAG CAT AGA CCC CGT AGT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGG CGC AGT AGT AGA CTG CAG TGT C 3'

21.6VHa6 (63 mery) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36):

5' GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3'

2. Startery do syntezy wersji „b”

21.6VHb (37 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37): zmiany R-44 do G-44 5' CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C 3'

3. Starter do syntezy wersji „c”

21,6VHc (27 merów) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38): zmiany Y-98 do F-98 5' CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3'

C. Obszary zmiennie łańcuchów i letkich, i ciężkich

Startery hybrydyzujące z flankującym DNA wektora pUC19 APCR1 (17merów (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 39), starter sensowny)

5' TAC GCA AAC CGC CTC TC 3'

APCR4 (18 merów (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40), starter nonsensowny)

5' GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3'

Produkty PCR A i B oraz C i D połączono w drugim etapie reakcji PCR. Produkty PCR A i B oraaC i D (po 50 np) dodanodo50pl nueszznin reakcyjnnyh PCR (w sposób opisany pootyżej) i prowadzono amplifikację przez 20 cykli w sposób opisany powyżej, z tym że temoarktueę hybrydyzacji podwyższono do 60°C. Produkty z tych reakcji oznaczono jako E i F. Zastosowano odpowiednio pary starterów PCR APCR1 -vla3 i vla4-vla7. Produkty PCR E i F wyakstrahowano fenolem i wytrącono etanolem, a następnie złączono w trzeciej rundzie reakcji PCR poprzez ich własną komplemaotkryość, w dwustopniowej reakcji PCR zbliżonej do opizknaj powyżej, stosując APCR1 i vla7 startery końcowe. W pełni złączony fragment reprezentujący cały przekształcony obszar Vl ludzkiego 21.6, zawierający sekwencję lidera, strawiono HinOIII i BamHI i klonowano w pUC 19 do saCwancjooowania. Klon zawiarająyy prawidłową sekwencję oznaczono jako eash21. 6VLa.

Drugą wersję przekształconego obszaru Vl ludzkiego 21.6 (Lb) skonztruowand stosując startery PCR, tak aby wprowadzić niazoayzya modyfikacje do oiaewzzaj wersji przekształydnago obszaru VLluOzkiegd 21.6 (La), matoOąKkmmknk i innych, Nuci. AciOs Res. 17:5404 (1989).

Zsyntatyzowaoo 2 zestawy starterów (tabela 6). Każdą reakcję PCR oeowk0zooo zasadniczo w takich samych warunkach jak powyżej. W pierwszej reakcji PCR zastosowano mutagen^ czny starter 21,6VLb2 w celu rozłożenia miejsca Styl (Tlm-ACC^ do Thr-ACA-97) uzyskując

181 827 resh21.6VLa2. Następnie w drugiej reakcji PCR mutageniczny starter 21.6VLbl (His-49 do Tyr-49) zastosowano z pUC-resh21.6VLa2 jako matrycowym dNa. Produkt PCR przecięto Styl i BamHI, a następnie subklonowano w pUC-resh21.6VLa2 rozszczepionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Klon o prawidłowej sekwencji oznaczono jako pUC-resh21.6VLb.

Wersję „a” przekształconego obszaru V_H ludzkiego 21.6 skonstruowano takimi samymi metodami PCR, które wykorzystano do konstrukcji wersji „a” przekształconego obszaru V_L ludzkiego 21.6 (tabela 6 i fig. 9). Fragmenty DNA HindIII-BamHI kodujące wersję „g” przekształconego obszaru V_H ludzkiego 425 (Ketdeborough i inni, supra), i wersję „b” przekształconego obszaru VHudzkiego AUK12-20 subklonowano w wektorach pUC19 uzyskując odpowiednio pUCresh425g i pUC-reshAUK12-20b. (Wersja „b” AUK12-20 uzyskana na drodze mutagenezy PCR fragmentu VHa425 opisanego przez Kettleborough'a i innych, supra, koduje sekwencję aminokwasów:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH WVRQAPGQGLEWVG

YIDPFNGGTSYNQKFKG KVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGN -RFAY

WGQGTLVTVSS (przerwy rozdzielają obszary Fr i CDR)).

Plazmidy pUS-resh425 g i pUC-reshAUK12-20b oraz wektor pUC zawierający obszar Vh mysiego 21.6 zmodyfikowanyjako do zastosowania w konstrukcji łańcucha ciężkiego chimerycznego 21.6 (pUC-chim21.6 VH), zastosowano jako matrycowe DNA w kolejnych reakcjach PCR. Startery PCR zaprojektowano i zsyntetyzowano do konstruowania wersji „a” przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6 (tabela 6). Produkt PCR A (fig. 9) otrzymano stosując pUCreshAUK12-20b jako matrycę DNA oraz APCR1-vhal jako parę starterów PCR. Produkty PCRB i D otrzymano stosując odpowiednio pUC-chim21.6VH jako matrycę DNA oraz vha2-vha3 i vha6-APCR4 jako pary starterów PCR. Natomiast produkt PCR C otrzymano stosując pUCresh425g jako matrycę DNA i vla4-vla5 jako parę starterów PCR. Ostateczny produkt PCR subklonowano w pUC19 jako fragment HindIII-BamHI do sekwencjonowania DNA. Klon o prawidłowej sekwencji DNA oznaczono jako pUC-resh21,6VHa. Sekwencje DNA i aminokwasów pierwszej wersji przekształconej części zmiennej 21.6 pokazano na fig. 10.

Pozostałe wersje przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6 skonstruowano zasadniczo w sposób opisany powyżej w odniesieniu do konstrukcji wersji „b” przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6. Zsyntetyzowano 2 zestawy starterów (tabela 6). W wersji drugiej (Hb) i trzeciej (Hc) zastosowano odpowiednio mutageniczne startery 21,6VHb (Arg-44 do Gly-44) i 21.6VHc (Tyr-98 do Phe-98) w reakcjach PCR z pUC-resh21.6VHa jako matrycowym DNA. Produkty PCR VHb i VHc pocięto enzymami restrykcyjnymi i subklonowano w wektorze pUC, pUC-resh21,6VHa odpowiednio jako fragmenty MscI-BamHI i PstI-BamHI, uzyskując pUC-resh21.6VHb i pUCresh21.6VHc.

Pierwszą wersję przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6 (Ha) skonstruowano w sposób podobny do zastosowanego przy konstrukcji pierwszej wersji przekształconego obszaru V_Lludzkiego 21.6 (La). Jednakże w tym przypadku startery PCR zastosowano z trzema różnymi matrycowymi DNA, obszarem Vh mysiego 21.6 przygotowanego do ekspresji chimerycznego łańcucha ciężkiego 21.6, wersji „g” obszaru Vh humanizowanego 425 (Kettleborough i inni, supra) oraz wersji „b” obszaru Vh humanizowanego AUK12-20 (tabela 6, fig. 9). Sekwencja DNa i aminokwasów pierwszej wersji obszaru zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego 21.6 pokazano na fig. 11. Drugąi trzeciąwersję obszaru Vh humanizowanego 21.6 (Hb i Hc) skonstruowano stosując startery PCR w celu wprowadzenia nieznacznych modyfikacji do pierwszej wersji obszaru Vh humanizowanego 21.6 (Ha) (tabela 6).

Przykład 7: Ekspresja i analiza humanizowanych przeciwciał

1. Łączenie obszarów zmiennych z obszarami stałymi w wektorach ekspresji

Fragmenty DNA kodujące chimeryczne i przekształcone obszary V_Li Vh21.6 subklonowano w wektorach HCMV zaprojektowanych tak, aby osiągnąć ekspresję ludzkich łańcuchów lekkich Klub ludzkich łańcuchów ciężkich γ-1 w komórkach ssaków (patrz fig. 3) oraz Maeda i inni, Hum. Antibod. Hybridomas 2:124-134 (1991). Obydwa wektory zawierają promotor i en181 827 hancer ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV) dla osiągnięcia wysokiego poziomu transkrypcji łańcuchów lekkich i ciężkich immunoglobuliny. Wektor ekspresji łańcucha lekkiego, który dokładnie opisali Maeda i inni, supra, zawiera genomowy DNA kodujący ludzką część stałą κ (Rabbitts i inni, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)). Wektor ekspresji łańcucha ciężkiegojest zasadniczo taki jak wektor opisany przez Maedę i innych, supra, z tym że genomowy DNA kodujący ludzki obszar stały γ-1 zastąpiono cDNA. cDNA kodujący ludzki obszar stały γ-1 klonowano z linii ludzkich komórek, która wydziela ludzkie przeciwciało γ -1 w PCR. Aby ułatwić subklonowanie w wektorze ekspresji miejsca BamHI stworzono na każdym końcu cDNA. Ponadto na końcu 5' sekwencji cDNA stworzono miejsce akceptora przyłączenia i sekwencję intronu o 65 bp. Fragment BamHI (1176 bp) zawierający miejsce akceptora przyłączania cDNA ludzkiego γ -1 i sekwencję intronu wprowadzono zamiast fragmentu BamHI (około 2,0 kb) w istniejącym wektorze łańcucha ciężkiego (Maeda i inni, supra),. Miejsce BamHI od strony 3' stałego obszaru ludzkiego γΐ - usunięto następnie za pomocą polimerazy Klenowa.

2. Transfekcja wektorów ekspresji

Wektory ekspresji wprowadzono do komórek Cos przez elektroporację stosując aparat Gene Pulsar (BioRad). DNA (po 10 pg każdego wektora) dodano do porcji 0,8 ml 1 x10⁷ komórek/ml w PBS. Puls przykładano przy 1 900 V, pojemność 25 μΕ Po 10 minutach okresu odzysku w temperaturze otoczenia komórki po elektroporacji dodano do 8 ml DMEM (GIBCO) zawierającego 5% zdezaktywowanej płodowej surowicy cielęcej nie zawierającej γ-globuliny. Po inkubowaniu przez 72 godziny ośrodek zebrano, odwirowano w celu usunięcia szczątków, komórkowych i przechowywano w sterylnych warunkach w 4°C przez krótki okres czasu lub w -20°C przez dłuższe okresy.

3. Oczyszczanie humanizowanych przeciwciał

Supernatanty z transfekowanych komórek Cos zebrano i oczyszczono na unieruchomionym białku A (ImmnoPure IgG Purification Kit, Pierce). Supematant wysterylizowano na drodze sączenia przez filtr 0,22 μm. Po wymieszaniu z równą objęt<^^<cią buforu wiążącego ImmunoPure IgG (pH 8,0) rozcieńczonąpróbkę wprowadzono do 1-ml kolumny z białkiem A i w całości przepuszczono przez żel. Po przemyciu 15 ml buforu wiążącego ImmunoPure IgG związane przeciwciało eluowano 5 ml buforu elucyjnego ImmunoPure IgG (pH 2,8) zbierając frakcje po 1 ml. pH pierwszej i drugiej frakcji wynosiło około 8,0 pH trzeciej doprowadzono do fizjologicznego zakresu dodając 100 μΐ buforu wiążącego ImmunoPure. Pięć 1-ml frakcji zawierających przeciwciało oczyszczone na białku A zanalizowano następnie metodą ELISA w celu oznaczenia zawartości przeciwciała IgG obecnego w każdej frakcji. Przeciwciała wykrywano stosując przeciw-ludzkie IgG skoniugowane z kozią fosfatazą alkaliczną (cała cząsteczka, Sigma).

4. Pomiar powinowactwa wiązania

Wiązanie przekształconego ludzkiego przeciwciała 21.6 z integryną α4 βΐ oceniano metodą ELISA w porównaniu z mysim i chimerycznym przeciwciałem. W skrócie komórki L transformowane tak, aby na ich powierzchni zachodziła ekspresja integryny α4β1, posiano i hodowano do zlania na płytkach do hodowli tkankowych o 96 studzienkach. Próbki do badań (supernatanty surowca i oczyszczone na białku A) kolejno rozcieńczano i dodawano do każdej studzienki. Po inkubacji przez 1 godzinę na lodzie i bardzo łagodnym przemyciu dodawano kozie przeciw-mysie lub przeciw-ludzkie (specyficzne względem łańcucha γ) koniugaty peroksydazy (Sigma). Po inkubacji przez kolejną godzinę na lodzie i bardzo łagodnym przemyciu dodawano substrat (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy, Sigma). Po kolejnej inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej reakcję przerywano dodając 1M H2SO4 i mierzono A4₉₀.

Wyniki analizy surowych supernatantów dwóch wersji przekształconych lekkich łańcuchów ludzkiego 21.6 (La i Lb), w kombinacji z wersją Ha przekształconego łańcucha, ciężkiego ludzkiego 21.6 wskazują, że wersja La przekształconego obszaru Vl ludzkiego 21.6 zapewnia nieznacznie lepsze wiązanie z antygenem niż wersja Lb. W związku z tym wersję La zastosowano w kolejnych doświadczeniach. Wyniki analizy surowych supernatantów ciężkich łańcuchów humanizowanego 21.6 (Ha i Hb) w kombinacji z wersją La łańcucha lekkiego humanizowanego

21.6 wykazały brak zasadniczych różnic między dwoma wersjami (Ha i Hb) przekształconych

181 827 ludzkich obszarów Vh Wersję Ha wybrano do dalszych doświadczeń z uwagi na to, że zawierała ona jedynie 5 zmian w ludzkich FR w porównaniu z 6 zmianami w przypadku ludzkiego Hb.

Na figurze 12 porównano wiązanie humanizowanego przeciwciała 21.6 (La + Ha) i chimerycznego przeciwciała 21.6. Wyniki wskazują, że przekształcone ludzkie przeciwciało 21.6 (La + Ha) wiąże się z antygenem równie dobrze, a być może nieznacznie lepiej niż chimeryczne przeciwciało 21.6. Uważa się, że chimeryczne przeciwciało 21.6jest równoważne z mysim przeciwciałem 21.6 pod względem charakterystyki wiązania antygenu, gdyż zawiera ono nienaruszone części zmienne mysiego 21.6. Okazało się ponadto, że przekształcone ludzkie przeciwciało

21.6 (La + Ha) blokuje wiązanie z ludzką integiyną α4β1 ze skutecznością porównywalną do wyjściowego mysiego przeciwciała 21.6 i chimerycznego przeciwciała. W związku z tym można wyciągnąć wniosek, że przekształcone ludzkie przeciwciało 21.6 (La+Ha) wykazuje specyficzne powinowactwo wiązania zasadniczo takie same jak mysie przeciwciało 21.6. Ponadto z uwagi na jedynie nieznaczne modyfikacje niezbędne były do odtworzenia miejsca wiązania antygenu mysiego przeciwciała 21.6 w ludzkich częściach zmiennych, oczekuje się, że przekształcone ludzkie przeciwciało 21.6 będzie zachowywać się podobnie jak rzeczywiste ludzkie przeciwciało.

Zbadano również wiązanie przekształconego ludzkiego przeciwciała 21.6 zawierającego wersję La przekształconego obszaru V_L ludzkiego 21.6 i wersję Hc przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6 z komórkami L, na powierzchni których zachodzi ekspresja ludzkiej integryny α4 β 1 w porównaniu z chimerycznym przeciwciałem 21.6. Wyniki wskazują, że przekształcone ludzkie przeciwciało 21.6 (La+Hc) równie dobrze wiąże się z antygenem. Zmiana w CDR3 obszaru Vh nie wpływa na wiązanie z antygenem. Istnieją nawet pewne oznaki, że zmiana w CDR3 może nieznacznie poprawić wiązanie z antygenem (fig. 12). Być może poprawa ta może być wyraźniejsza w teście funkcyjnego blokowania.

Przykład 8. Właściwości blokujące przeciwciała μ 21.6 μ 21.6 porównano z innym przeciwciałem przeciw integrynie α,, określanym jako L25. L25 jest dostępny w handlu z Becton Dickinson i, jak to podano w literaturze, jest dobrym inhibitorem adhezyjnego działania integryny α4β1. Jako to pokazano na fig. 13 (część A), zarówno μ21.6 jak i L25 całkowicie inhibituj ązależną od integryny α4β1 adhezję ludzkich komórek monocytowych z oczyszczonym VCAM-1 w nieobecności Mn+2. Natomiast w obecności Mn+ (1 mM) (jednego z szeregu aktywatorów integryny α4β1) L25 przestaje być skutecznym inhibitorem. Podobne wyniki uzyskano gdy integrynę α4β1 uaktywniono innymi bodźcami. Wydaje się, że zdolność do blokowania uaktywnionej integryny α4β1 ma duże znaczenie w leczeniu chorób zapalnych takich jak stwardnienie rozsiane.

Dokładniej porównując μ 21.6 i L25 zbadano zdolność przeciwciała do inhibitowania adhezji ludzkich komórek T przy wzrastających stężeniach VCAM-1. W doświadczeniu tym wzrastające ilości VCAM-1 nanoszono na plastikowe studzienki w płytce do badań z 96 studzienkami i oznaczano zdolność linii ludzkich komórek T, Jurkata ('w których następuje wysoki poziom ekspresji integryny α4β1) do wiązania się z powleczonymi studzienkami. Wielkości na osi X oznaczająprocent tych komórek Jurkata dodanych do każdej studzienki, które pozostały związane po czterokrotnym przemyciu studzienki (fig. 13 część (część B)). Doświadczenie to wykazuje, że L25 jest dobrym ihibitorem adhezji komórek przy niskich stężeniach VCAM-1, ale staje się całkowicie nieskuteczny przy wyższych poziomach VCAM-1. Zdolność do blokowania przy wysokich stężeniach VCAM-1 jest pożądana w zastosowaniach terapeutycznych z uwagi na nasilanie się występowania VCAM-1 w ogniskach zapalnych.

Przykład 9. Skuteczność humanizowanego przeciwciała 21.6w odniesieniu do modelu zwierzęcego

W przykładzie tym zbadano skuteczność humanizowanego przeciwciała 21.6 w profilaktycznym stosowaniu i leczeniu EAE na modelu zwierzęcym symulującym stwardnienie rozsiane u ludzi.

(a) Metody (1) Wywoływanie EAE

Każdej z 5 świnek morskich uśmierconych przez narkozę CO2 usunięto mózg i rdzeń kręgowy. Tkankę trzymano w PBS na wilgotnym lodzie przed zważeniem i zhomogenizowaniem w

181 827 ilości 1 g tkanki/ml PBS. Tkankę całkowicie /homogenizowano stosując ręczny homogenizator z napędem elektrycznym, a następnie wymieszano z równą objętością pełnego dodatku Freunda (FCA). FCA przygotowano dodając 100 mg mycobacteridm tuberculosis H37 RA (DIFCO, 3114-33-8), do 10 ml niepełnego dodatku Freuodp (Sigma, F-5506). Mieszaninę zemdlgowaad do uzyskania konsystencji majonezu przepuszczając roztwór pomiędzy dwoma strzykawkami połączonymi korkiem dwudrożnym. Każdą świnkę morską immdaizowpao w 3 różnych miejscach stosując łącznie 600 pl emulsji.

(2) Ocena objawów choroby u zwierząt

Objawy choroby oceniano npkłpaipjąc każde zwierzę do chodzenia i przypisując mu ocenę w oparciu o następujące powszechnie przyjęte kryteria:

Brakobjawów choroby

Słabość kończyn tylnych

Całkowity paraliż kończyn tyłnych

Całkowtty paraliżkończyn hln^j^c^h i pewien p^aliż kończyn ριζεώήοΐ'ΐ

Konanie lub śmierć (3) Pobieranie surowicy i tkanek

Próbki pobierano wy0ondjąe dosercowąpuokcjz świnek morskich zoieczdlonych metoksyfluranem. Zbierano około 300-400 pl krwi, umieszczono ją w posrebrzanym mlknosepprptonze surowicy i pozostawiano op 20 -30 miadt w temperaturze pokojowej do skrzepnięcia. Probówkę odwirowywano następnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Surowicę odciągano do probówek Eppendorfa i przechowywano w -20°C przed wykdnłaiem oznaczenia miana przeciwciała metodą sortowania komórek aktywowanych fludresceoeyjale (FACS).

Do analiz hematoldgiczayeh krew zbierano w posrebrzanych mikroprobówkaeh powleczonych kwasem etylenddiamiaotetraoclowym. Porcję 100 ty zasysano do probówki do hematokrytu powleczonej aOrydyną. Probówkę zamykano i krew mieszano z oranżem a^i^^owym łagodnie odwracając probówkę 15 razy. Do probówki do hemald0rylu wprowadzano pływał, po czym próbkę odwirowywano przez 5 minut. Probówkę do hematokrytu umieszczano w aparacie rejestruj ącym Idexx QBC Vert Adloreader przezaaezdoym do ilościowego oznaczania kożuchowej powłoki. Wielkości odczytywano stosując układ zgrubnej kalibracji, po czym przeliczano na rówaoważoiOl świnki morskiej stosując ustalony czyoniO konwersji.

Po zakończeniu doświadczenia świnki morskie zabijano przez narkozę CO2 i usuwano im mózgi i rdzenie kręgowe. Połowę mózgu i rdzenia kręgowego każdej świnki morskiej gwałtownie zamrażano w 2-metyldbulaooale na suchym lodzie (od -20°C do -40°C). Tkankę tę pocięto i barwiono immunologiezole markerem makrofaga pan (Serotec MCA-518) i markerem limfocytu T (Serotec MCA-751) stosując test peroksydazyłączącej awldyaę-blolyaz (Vector Laboratories, Inc., Bdrliagame, USA) oraz diamlaobeozydynz jako ehromagea. Oceniano przenikanie komórek do ΙΟροΟΙ zgodnie z następującą skalą ocen:

brak przenikaniaOomóreO

0,5 bardzo słabe zabarwienie. może być wtórne. zazwyczaj zwiirzpaie z naczynłami

Zabarwienie niewielu komórek (poniżej 15), zazwycząj w sąsiedztwie naczynia

Zabarwienie wielu komórek (^0^50). zazwyczaj promieniujące od naczynia

Zabarwienie wielu komórek (>50) rdzproszdaych w ca^ł^ey 1Ορ0«^; wiele złączonych naczyń.

(b) Podawanie profilaktyczne

Doświadczenie to zaprojektowano, aby ocenić skuteczność humanizowanego przeciwciała 21.6 w opróżnianiu pojawiania się objawów klinicznych. Wcześniejsze badania wykazały, że napływ leukocytów do mózgu i rdzenia kręgowego świnek morskich z EAE zazwyczaj rozpoczyna się pomiędzy 7 i 8 dniem. Z tego względu przeciwciała podawano w 7 i 10 dniu po immunizacji. Aby porównać mysie i humanizowane przeciwciało 21.6, podawano równoważne dawki każdego z przeciwciał (3,0,0,30 i 0,03 mg/kg). Wstępne badania faπóakokiΏeyezae wykazały, że poziom nasycenia krwi mysim przeciwciałem 21.6 uzyskuje się w ciągu 24 godzin po podaniu podskórnym, przy czym pozostaje on podwyższony przez okres do 48 godzin.

181 827

W dniu 11., w 24 godziny po podaniu drugiej dawki przeciwciała pobierano próbki krwi od 3 zwierząt wybranych losowo z każdej grupy. Dla każej grupy wyliczono średnią liczbę dni do osiągnięcia przez każdą świnkę morską stopnia oceny klinicznej 1 (tabela 7). Średnia wielkość dla grupy, której podawano PBS, wyniosła w tym doświadczeniu 11 dni po immunizacji (jest to wielkość typowa dla wcześniejszych badań). Podanie najwyższej dawki humanizowanego i mysiego przeciwciała spowodowało znaczne sróźeienCe choroby odpowiednio o 4,6 (p=0,000) i 3 (^=0,007) dni. Niższe dawki przeciwciała nie wywierały wpływu na przebieg choroby.

Tabela 7

Wpływ mysiego i humanizowanego przeciwciała na okres czasu po immunizacji do osiągnięcia stopnia oceny klinicznej 1

Grupa	1	2	3	4	5	6	7
mg/kg	0,03 M#	3,0 H®	3,0 H	3,0 M	0,03 H	PBS	0,3 M
	8	9	13	10	8	9	9
	9	10	15	12	10	9	9
	9	10	15	14	10	11	11
	9	11	16	14	11	11	12
	11	11	16	14	12	11	12
	12	11	16	15	12	12	13
	12	12	17	15	12	12	13
		13	17	18	12	13
Średnia	10,0	10,9	**15,6	*14,0	10,9	11,0	11,6
± SD	±1,2	±1,2	±1,3	±2,3	± 1,5	±1,4	±1,4

® H oznacza humanizowane przeciwciało; # M oznacza mysie. **p = 0,000 i p* = 0,007 w porównaniu z PBS

Dzienne zmiany wagi ciała świnek morskich podobnie odzwierciedlają wpływ wysokich dawek humanizowanego i mysiego przeciwciała (fig. 14). Zwierzęta w takich grupach stale przybywały na wadze. Świnki morskie we wszystkich pozostałych grupach traciły na wadze poczynając od momentu tuż przed dniem wystąpienia choroby.

Miana przeciwciał w surowicy oznaczono dla 3 losowo wybranych zwierząt z każdej grupy wykonując puedcję dosercową w dniu 11, około 24 godziny po drugim podaniu środka. Występuje ścisła korelacja między skutecznością przeciwciał w opóźnianiu choroby i ich poziomem we krwi. Około 20 pg przeciwciał/ml krwi występuje w obiegu wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto najwyższą dawkę zarówno humanizowanego^ jak i mysiego przeciwciała. Jest to stężenie tego samego rzędu co stężenie przeciwciała 21.6 niezbędnego do nasycenia miejsc VLA-4 in vitro. Natomiast u zwierząt ze wszystkich pozostałych grup poziom przeciwciał w surowicy był niski lub niewykrywalny.

(c) Odwracanie postępu choroby

Około 60 świnek immunizowano i pozostawiono do pojawienia się klinicznych objawów EAE. W dniu 13 wszystkie świnki morskie, które uzyskały ocenę dlieiyoeą 1, losowo rsdoieloes na grupy. Z fig. 15 wynika, że zwierzęta, którym podano 3 mg humanizowanego przeciwciała/kg, zaczynają odzyskiwać władność tylnych kończyn w ciągu 48 godzin od podania środka. W dniach 17il 8,1 i 2dni po drugiej dawce, u żadnego z 8 zwierząt nie stwierdzono choroby. ANOVA powierzchni pod krzywą wielkości dla każdej grupy potwierdziła, że tylko dla grupy z dawką 3 mg humranzowanego przeciwciała wielkość ta była statystycznie niższa niż dla grupy kontrolnej, której podawano PBS (p=0,042). Zwierzęta te stopniowo przybierały na wadze od 24 godzin po pierwszym podaniu, aż do zakończenia doświadczenia w dniu 19 (fig. 16).

181 827

Miana przeciwciał w surowicy oznaczano metodą FACS w próbkach pobranych w 24 godziny po pierwszej iniekcji (dzień· 14) i po uśmierceniu (dzień 19). Podawanie mysiego przeciwciała 21.6 powoduje nieznacznie niższy poziom miana przeciwciała w surowicy niż podawanie humanizowanego przeciwciała 21.6 (odpowiednio 9,1 i 12,6 pg/ml). Różnica ta staje się wyraźniejsza w dniu 19,3 dni po drugim podaniu przeciwciał, gdy poziom mysiego przeciwciała w surowicy jest słabo wykrywalny, a poziomy humanizowanego przeciwciała w dniu 19 spadają co prawda poniżej poziomu nasycenia, ale w dalszym ciągu dająsię zmierzyć (6,1 Mgnl). Dane te wykazują, że istnieje korelacja między poziomami przeciwciała w surowicy i fizjologiczną skutecznością, oraz sugerujią że skuteczny poziom przeciwciała w obiegu wynosi w przypadku świnki morskiej 10-20 pg/ml.

Przenikanie leukocytów do mózgu i rdzenia kręgowego oceniano w tkance zwierząt uśmierconych w dniu 19. Z tabeli 8 wynikająznaczące różnice w stopniu przenikania w zależności od podawania przeciwciała. Zmniejszenie przenikania komórek T do mózgu i rdzenia kręgowego oraz przenikanie makrofaga do rdzenia kręgowego jest znaczące po zastosowaniu dawki 3 mg/kg. Wydaje się, że niższe dawki zmniejszają przenikanie, z tym że nie są to wyniki znaczące. Brak jest znaczących różnic w przenikaniu komórek makrofaga do rdzenia kręgowego w' zależności od dawki. W związku z tym, że zastosowana technika imunohistochemiczna do oceny makrofagów nie rozróżnia komórek rezydentnych od inwazyjnych, brak wpływu na makrofagi prawdopodobnie związany jest z trwałą obecnością rezydentnych makrofagów i mikrogleju.

Zmniejszenie liczby komórek T i monocytów w tkance mózgowej przez podawanie przeciwciała po rozwinięciu się choroby sugeruje, że przemieszczanie się komórek nie jest procesem kumulacyjnym, ale stanowi dynamiczny ruch komórek do i z tkanki CNS. Należy podkreślić, że dane te sugerują iż przerwanie napływu leukocytów do tkanki miąższowej umożliwia pozbycie się przez sam CNS atakującego elementu patologicznego.

Tabela 8

Znaczące różnice w przenikaniu komórek T i makrofagów do mózgu i rdzenia kręgowego w dniu 19

	Mózg	Rdzeń kręgowy
Grupa PBS	Komórki T	Makrofagi	Komórki T	Makrofagi
3 mg/kg @H	p=0,001	p=0,005	p=0,007	NS
3 mg/kg #M	p=0,001	p=0,005	p=0,008	NS
1 mg/kg H	NS	NS	NS	NS
0,3 mg/kg H	NS	NS	NS	NS

NS = nie znaczący

Dane hematologiczne potwierdzają, że leczenie mysim lub humanizowanym przeciwciałem 21.6 nie powoduje różnic w ogólnej liczbie białych ciałek krwi, liczbie granulocytów lub w liczbie czerwonych ciałek krwi. Wysoka dawka mysiego lub humanizowanego przeciwciała powoduje znaczący wzrost liczby płytek krwi w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano PBS (tabela 9). U zwykłych świnek morskich liczba płytek krwi wynosi 755 ±103 komórek/ml, około 2 razy więcej· niż u zwierząt z EAE, którym podawano PBS. W związku z tym leczenie dawkami mysiego lub humanizowanego przeciwciała, które skutecznie odwracają przebieg choroby, powoduje również powrót liczby płytek krwi do wielkości normalnej.

Wpływ leczenia przeciwciałami na liczbę płytek krwi u zwierząt z EAE

181 827

Leczenie	Płytki x 10- komórek/ml
++ świnki morskie bez EAE	755 ± 103 (9)
PBS	373,3 ± 167,5 (7)
3 mg/kg @ H	622,2 ± 97,0 (6) **
3 mg/kg # M	587,5 ± 57,8 (6)
1 mg/kg H	578,3 ± 123,2 (6)
0,3 mg/kg H	492,5 ± 168,6 (6)

+4- Liczbę płytek u świnek morskich bez EAE oznaczono w odrębnym doświadczeniu * = 0,05 w stosunku do PBS

W podsumowaniu można stwierdzić, że zarówno humanizowane, jak i mysie przeciwciała

21.6 skutecznie opóźniają i powodują cofanie się objawów klinicznych w przypadku modelu zwierzęcego symulującego stwardnienie rozsiane u ludzi. Przy takiej samej dawce humanizowane przeciwciało jest skuteczniejsze niż mysie przeciwciało w cofaniu objawów.

Jakkolwiek powyższy wynalazek został opisany szczegółowo dla zapewnienia jego klarowności i lepszego zrozumienia, zrozumiałe jest, że w zakresie objętym załączonymi zastrzeżeniami dokonać można pewnych modyfikacji. Wszystkie publikacje i dokumenty patentowe cytowane powyżej wprowadza się w całości jako źródła literaturowe, w stopniu w jakim podano to przy poszczególnych pozycjach.

Tabela 4

Kabat	Nr	FR lub CDR	mysie 21.6	mysi κ 5 (sek. o numerze ident. 43)	ludzki κ 1 (sek. o numerze ident. 43)	ludzki REJ	RH V_l21.6	Komentarz
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	1	FR1	D	D	D	D	D
2	2	1	I	I	I	I	I*
3	3	1	Q	Q	Q	Q	Q
4	4	1	M	M	M	M	M
5	5	1	T	T	T	T	T
6	6	1	Q	Q	Q	Q	Q
7	7	1	s	s	s	S	s
8	8	1	P	P	P	P	P
9	9	1	s	s	S	S	s
10	10	1	s	s	s	S	s
11	11	1	L	L	L	L	L
12	12	1	S	S	S	s	s
13	13	1	A	A	A	A	A
14	14	1	S	S	S	S	S
15	15	1	L	L	V	V	V
16	16	1	G	G	G	G	G
17	17	1	G	D	D	D	D
18	18	1	K	R	R	R	R

181 827 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
19	19	1	v	V	V	V	V
20	20	1	t	T	T	T	T
21	21	1	I	I	I	1	I
22	22	1	T	T	T	T	T
23	23	FR1	c	c	C	c	c
24	24	CDR1	K	R	R	Q	K
25	25	1	T	A	A	A	T*
26	26	1	s	S	S	s	S*
27	27	1	Q	Q	Q	Q	Q*
27A		J	-	D	s	-	-
27B		1	-	-	L	-	-
27C		1	-	-	V	-	-
27D		1	-	-	X	-	-
27E		1	-	-	X	-	-
27F		-	-	-	-	-	-
28	28	1	D	D	s	D	D*
29	29	1	I	I	I	I	I*
30	30	1	N	S	s	I	N*
31	31	1	K	N	N	K	K*
32	32	1	Y	Y	Y	Y	Y*
33	33	1	M	L	L	L	M*
34	34	CDR1	A	N	A	N	A
35	35	FR2	W	W	W	W	W
36	36	1	Y	Y	Y	Y	Y
37	37	1	Q	Q	Q	Q	Q
38	38	1	H	Q	Q	Q	Q
39	39	1	K	K	K	T	T	K w CAMPATH 1H
40	40	i	P	P	P	P	P
41	41	1	G	G	G	G	G
42	42	1	K	G	K	K	K
43	43	¹	R	s	A	A	A	rozważyć R w innych wersjach
44	44	1	P	P	P	P	P
45	45	1	R	K	K	K	R	wspiera pętlę L2, dotyczy K w innych wersjach
46	46	1	L	L	L	L	L
47	47	1	L	L	L	L	L

181 827 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
48	48	1	I	I	I	I	I*
49	49	FR2	H	Y	Y	Y	H	w środku miejsca wiązania, potencjalna interakcja z antygenem, rozważyć Y w innych wersjach
50	50	CDR2	Y	Y	A	E	Y*
51	51	1	T	A	A	A	T*
52	52	1	s	S	S	S	S*
53	53	1	A	R	S	N	A
54	54	1	L	L	L	L	L
55	55	1	Q	H	E	Q	Q
56	56	CDR2	P	S	S	A	P
57	57	FR3	G	G	G	G	G
58	58	1	I	V	V	V	I	może wspierać L2, rozważyć V w różnych wersjach
59	59	1	P	P	P	P	P
60	60	1	s	s	s	s	S
61	61	1	R	R	R	R	R
62	62	1	F	F	F	F	F
63	63	1	S	S	S	S	S
64	64	1	G	G	G	G	G*
65	65	1	S	S	S	S	S
66	66	1	G	G	G	G	G
67	67	1	S	S	S	S	S
68	68	1	G	G	G	G	G
69	69	1	R	T	T	T	£	sąsiaduje z L1 na powierzchni w pobliżu miejsca wiązania
70	70	1	D	D	D	D	D
71	71	1	Y	Y	F	Y	Y*	F w CAMPATH 1H
72	72	1	S	S	T	T	T
73	73	1	F	L	L	F	F
74	74	1	N	T	T	T	T
75	75	1	I	I	I	I	I
76	76	1	s	s	S	S	S
77	77	1	N	N	S	s	S

181 827 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
78	78	1	L	L	L	L	L
79	79	1	E	E	Q	Q	Q
80	80	1	P	Q	P	P	P
81	81	1	E	E	E	E	E
82	82	1	D	D	D	D	D
83	83	1	I	I	F	I	I
84	84	1	A	A	A	A	A
85	85	1	T	T	T	T	T
86	86	1	Y	Y	Y	Y	Y
87	87	1	Y	F	Y	Y	Y
88	88	FR3	c	C	C	C	c
89	89	CDR3	L	Q	Q	Q	L
90	90	1	Q	Q	Q	Q	Q*
91	91	1	Y	G	Y	Y	Y*
92	92	1	D	N	N	Q	D*
93	93	1	N	T	S	s	N*
94	94	1		L	L	L	L*
95		1	-	P	P	P	-
95A		1	-	P	E	-	-
95B		1	-	-	-	-	-
95C		1	-	-	-	-	-
95D		1	-	-	-	-	-
95E		1	-	-	-	-	-
95F		1	-	-	-	-	-
96	95	1	w	R	W	Y	W*
97	96	CDR3	T	T	T	T	T
98	97	FR4	F	F	F	F	F
99	98	1	G	G	G	G	G
100	99	1	G	G	Q	Q	Q
101	100	1	G	G	G	G	G
102	101	1	T	T	T	T	T
103	102	1	K	K	K	K	K
104	103	1	L	L	V	L	¥	jak w CAMPATH 1H
105	104	1	E	E	E	Q	E	jak w CAMPATH 1H
106	105	1	I	I	I	I	I
106A		1	-	-	-	-	-

181 827 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9
107	106	FR4	K	K	K	T	K	jak w CAMPATH 1H

Legenda:

(Kabat) - numeracja według Kabat i inni, supra; (Nr) numerowanie sekwencji, które zastosowano przy modelowaniu cząsteczkowym; (mysi 21.6) sekwencja aminokwasów obszaru Vl mysiego przeciwciała 21.6; (mysi κ 5) sekwencja zgodności mysich obszarów Vl z podgrupy 5 (Kabat i inni, supra}·, (ludzki κ 1) sekwencja zgodności ludzkich obszarów Vl z podgrupy 1 (Kabat i inni, supra)·, (ludzki REI) sekwencja aminokwasów ludzkiego obszaru Vl (Palm i inni, (1975) supra)·, (RH Vl21.6) sekwencja aminokwasów wersji L1 przekształconego obszaru Vl ludzkiego 21.6; (*) reszty stanowiące część struktur kanonicznych pętli CDR (Chothia i inni, supra)·, (podkreślono) reszty humanizowanych FR, w których zmieniono reszty aminokwasów.

Tabela 5

Kabat	#	FR albo CDR	Mysie 21.6	Mysi 2c (sek. o numerze ident. 44)	Ludzki 1 (sek. o numerze ident. 45	Ludzki 21/28'CL	RH Vh21.6	Komentarz
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	1	FR1	E	E	Q	Q	Q
2	2	1	V	V	V	v	V
3	3	1	Q	Q	Q	Q	Q
4	4	1	L	L	L	L	L
5	5	i	Q	Q	V	V	V
6	6	1	Q	Q	Q	Q	Q
7	7	1	s	S	s	s	s
8	8	1	G	G	G	G	G
9	9	1	A	A	A	A	A
10	10	t	E	E	E	E	E
11	11	1	L	L	V	V	V
12	12	1	V	V	K	K	K
13	13	1	K	K	K	K	K
14	14	1	P	P	P	P	P
15	15	1	G	G	G	G	G
16	16	1	A	A	A	A	A
17	17	1	S	S	S	S	S
18	18	1	V	V	V	V	V
19	19	1	K	K	K	K	K
20	20	1	L	L	V	V	V
21	21	1	S	S	s	S	S
22	22	1	C	C	c	C	C
23	23	1	T	T	K	K	K
24	24	1	A	A	A	A	A
25	25	1	S	S	S	S	S

181 827 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9
26	26	1	G	G	G	G	G*
27	27	1	F	F	Y	Y	F*	struktura kanoniczna H1, rozważyć Yw innych wersjach
28	28	1	N	N	T	T	Ni	struktura kanoniczna H1, na powierzchni
29	29	1	I	I	F	F	X*	struktura kanoniczna H1, rozważyć F w innych wersjach
30	30	FR1	K	K	T	T	K*	struktura kanoniczna H1, na powierzchni
31	31	CDR1	D	D	s	S	D*
32	32	1	T	T	Y	Y	T*
33	33	1	Y	Y	A	A	Y
34	34	1	I	M	I	M	I*
35	35	1	H	H	s	H	H
35A		1	-	-	-	-	-
35B		CDR1	-	-	-	-	-
36	36	FR2	c	W	w	W	W	reszta schowana, brak oczywistej szczególnej roli dla C
37	37	1	V	V	V	V	V
38	38	1	K	K	R	R	R
39	39	1	Q	Q	Q	Q	Q
40	40	i	R	R	A	A	A
41	41	1	P	P	P	P	P
42	42	1	E	E	G	G	G
43	43	1	Q	Q	Q	Q	Q
44	44	1	G	G	G	R	R	upakowanie Vl-Vh, rozważyć G w innych wersjach
45	45	1	L	L	L	L	L
46	46	1	E	E	E	E	E
47	47	1	W	W	W	W	W
48	48	1	I	I	M	M	M
49	49	FR2	G	G	G	G	G
50	50	CDR2	R	R	W	W	R
51	51	1	I	I	I	I	I

181 827 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9
52	52		D	D	N	N	D
52A	53	1	P	P	P	A	P*
52B		1	-	-	Y	-	-
52C		1	-	-	-	-	-
53	54	1	A	A	G	G	A*
54	55	1	N	N	N	N	N*
55	56	1	G	G	G	G	G*
56	57	1	Y	N	D	N	Y
57	58	1	T	T	T	T	T
58	59	1	K	K	N	K	K
59	60	1	Y	Y	Y	Y	Y
60	61	1	D	D	A	s	D
61	62	1	P	P	Q	Q	P
62	63	1	K	K	K	K	K
63	64	1	F	F	F	F	F
64	65	1	Q	Q	Q	Q	Q
65	66	CDR2	G	G	G	G	G
66	67	FR3	K	K	R	R	R
67	68	1	A	A	V	V	V
68	69	1	T	T	T	T	T
69	70	1	I	I	I	I	I
70	71	1	T	T	T	T	T
71	72	1	A	A	A	R	.ΔΔ	Kanoniczna struktura H2, wspierająca H2
72	73	1	D	D	D	D	D
73	74	1	T	T	T	T	T
74	75	1	s	s	s	s	S
75	76	1	s	s	T	A	A
76	77	1	N	N	s	S	S
77	78	1	T	T	T	T	T
78	70	1	A	A	A	A	A
79	80	1	Y	Y	Y	Y	Y
80	81	1	L	L	M	M	M
81	82	1	Q	Q	E	E	E
82	83	1	L	L	L	L	L
82A	84	1	S	S	S	S	S
82B	85	1	s	S	S	S	S

181 827 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9
82C	86	1	L	L	L	L	L
83	87	1	T	T	R	R	R
84	88	1	s	s	S	S	S
85	89	1	E	E	E	E	E
86	90	1	D	D	D	D	D
87	91	1	T	T	T	T	T
88	92	1	A	A	A	A	A
89	93	1	V	V	V	V	V
90	94	1	Y	Y	Y	Y	Y
91	95	1	F	Y	Y	Y	Y
92	96	!	c	c	C	c	C
93	97	1	A	A	A	A	A
94	98	FR3	R	R	R	R	R*
95	99	CDR3	E	G	A	G	E
96	100	1	G	Y	P	G	G
97	101	1	Y	Y	G	Y	Y
98	102	1	Y	Y	Y	Y	Y
99	103	1	G	Y	G	G	G
100	104	1	N	D	S	S	N
100A	105	1	Y	S	G	G	Y
100B	106	1	G	X	G	S	G
100C	107	1	V	V	G	-	V
100D	108	1	Y	G	C	-	Y
100E	109	1	A	Y	Y	-	A
100F	110	1	M	Y	R	-	M
100G		1	-	A	G	-	-
100H		1	-	M	D	-	-
100I		1	-	-	Y	-	-
100J		1	-	-	X	-	-
100K		1	-	-	F	-	-
101	111	1	D	D	D	N	D
102	112	CDR3	Y	Y	Y	Y	Y
103	113	FR3	W	W	W	W	W
104	114	1	G	G	G	G	G
105	115	1	Q	Q	Q	Q	Q
106	116	1	G	G	G	G	G
107	117	1	T	T	T	T	T

181 827 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9
108	118	f	S	X	L	L	L
109	119	1	V	V	V	V	V
110	120	1	T	T	T	T	T
111	121	i	V	V	V	V	V
112	122	1	S	s	S	S	s
113	123	FR4	S	s	s	S	s

Legenda:

(Kabat) - numeracja według Kabat i inni, supra; (Nr) numerowanie sekwencji, które zastosowano przy modelowaniu cząsteczkowym; (mysi 21.6) sekwencja obszaru Vh mysiego przeciwciała 21.6; (mysi 2c) sekwencja zgodności mysich obszarów Vh z podgrupy 2c (Kabat i inni, supra); (ludzki 1) sekwencja aminokwasów ludzkiego obszaru Vh z podgrupy 1 (Kabat i inni, supra); (ludzki 21/28' CL) sekwencja aminokwasów ludzkiego obszaru Vh (Derssimonian i inni (1987), supra); (RH Vh 21.6) sekwencja aminokwasów wersji H1 przekształconego obszaru Vh ludzkiego 21.6; (*) reszty stanowiące część struktur kanonicznych pętli CDR (Chothia i inni, supra); (podkreślono) reszty humanizowanych RF, w których zmieniono reszty aminokwasów.

181 827

Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:

(i) Zgłaszający: Bendig, Mary M.

Leger, Olivier J.

Saldanha, Jose

Jones, S. Tarran (ii.) Tytuł wynalazku: Humanizowane przeciwciała przeciw leukocytowej cząsteczce adhezyjnej VLA-4 (iii.) Liczba sekwencji: 45 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adresat : Townsend and Tonnsend, iuiou rie and Crew (B) Ulćaa: One Market Plaża, Steuart Tower, Suitę 2000 (C) Miasto: San Francisco (D) tan:: CaiiOrnnaa (E) aańtWwo : USA (F) Kod: 91055 (v) Postać odczytywana komputerowo:

(A) Nośnkk: Dyskiekaa (B) Komppter: Kornpptybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn fó^lease #1.0, Version #1.25 (vi) Dine dotyczące zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: US 08/186,269 (B) Data zgłoszenia: 25 stycznia 1994 (C) Klasifkaacjo:

(viii) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:

(A) Nazwisko: Smith, WilHmi L.

(B) Numer rejestracyjny: 30,223

181 827 (C) Numer rzecznika: 15270-14 (ix) Informacja telekomunikacyjna:

(A) Telefon: 415-543-9600 (B) Faks: 415-543-5043 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 483 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Lokalizacja: 53..430 (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1: ATGAGGGCCC CTGCTCAGAT TTTTGGATTC TTGGTCAGGA GACGTTGTAG AA ATG 55

Met

AGA Arg

CCG Pro

TCT Ser

AAT I ll 5

GCA TTC

CTG Leu

GGG Gly

CTC Leu 10

TTG Leu

TTC Phe

TGG TTP

CTT Leu 15

CAT His

GGT Gly

103

Gln

Phe

GCT

GAG

TGT

GGA

ATC

CAG

ATG

ACA

CAG

TCT

CCA

TCC

TCA

CTG

TCT

GCA

151

Ala

Gln

Cys

Aap

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

GALa

20

25

30

TCT

CTG

GGA

GGG

ArA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

AAG

ACA

AGC

C7AA

GAC

ATT

199

Ser

Leu

Gly

GGy

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Thr

Se^

AGn

Asp

Il€i

35

40

45

AAC

AAG

TAT

AAG

GCT

TGG

TAC

AAC

AAA

AAG

CCT

GCGA

JAAr

AGT

CCC

AGG

247

Asn

Lys

Tyr

Mee

Ala

Trp

Tyr

Gln

His

Lys

Pro

Gly

Lys

CArg

Ppo

CArg

50

55

60

65

CTG

CTC

AAA

CCA

TAC

ACA

TCT

GCA

TTA

CAG

CCA

GGC

ATC

CCA

t<:a

AGG

2 95

Leu

Ile

H ii

Tyr

Thr

Ser

Ala

Leu

Gln

Pro

Gly

Ile

Aro

See

CArg

70

75

80

181 827

TTC AGT

GGG. AGT

AGG TCT

GGG Gly

A(GC <AGT Arg Asp 90

TAT Tyr

TCC Ser

TTC SWA: ATC AGC CAAC

343

Phe

Ser

Gly

S er 85

sey

Ser

Phe

Asn

SIl 95

Cser Am

CTG

GAG

CCT

GAA

ATT

(AGG

ACT TAT

TAT

TGG

CTA

CCG

CAT

CGA CAAT

391

Leu

Glu

Ppr

Glu

Alu

11(5

ALa

Thr Tyr

TrT

rCs

Leu

dl

Cyr

Asp Asn

100

105

110

CTG

TGG

ACG

TTC

GGC

GdG

GGC

AAC AAC

CTA

CCA

ATC

AGG

CGGGA AGCCG

AAA

Leu

Trp

Thr

Phe

Gly

Thr Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

115

HO

125

CTGCACCSAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCACCCGGGA

TCC

4^833

(2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 126 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2

Met 1	Arg	Ppr	Ser	Shr 5	Gin	Pile	Leu
Gly	ALa	Gln	Cys 20	Asp	Ile	Gln	Met
Ala	Ser	Leu 35	Gly	Gly	Lys	Val	Thr 40
Ile	Asn 50	Lys	Tyr	Met	Ala	Trp 55	Tyr
Arg 65	Leu	Leu	I le	Hlu	Tyr 70	Thr	Ser
Arg	hhC	hr c	dy	Ser 85	Gly	Ser	Gly
Asn	Llu	Glu	Pro 100	Glu	Asp	Ile	Aa

Gly	Leu 10	Luu	usu	Phe	Tec	Leu 15	ri c
Thr 25	Gln	Ser	Pos	Ser	Sur 30	Leu	Ser
Ile	Ghy	Cys	Lys	Thr 445	Ser	Gln	Asp
Gln	His	Lys	Pro 60	Gly	Lys	Arg	Ppr
Aa	Aeu	(Uug 75	ns o	Gly	lyC	Pro	le r 00
Arg	A>p 99	Tyr	Ser	Phe	Asn	Ile 99	Ser
Thr 110	T(y	Tyr	Cys	Leu	Gln 110	Tyr	Aas

Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 110 112

181 827 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfkkacyjnm 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: · 470 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowoćć· podwójna (D) Topooggia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(xi) (A) Nazia/lluca: CDS (B) Loiliiiaóia: 1..400

Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3:

ATG	AAA	TGC	AGC	TH	GTC	ATG	TTC	TTC
Met 1	Lys	Cys	Ser	Trp	Val 5	Met	Phe	Phe
GTC	AAT	T<TA	gag	GTT	GAG	CTG	CAG	GAG
Val	Asn	Ser	Glu 20	Val	Gin	Leu	Gln	Gln 25
CCA	GGG	GCC	TGA	GTC	AAG	TTG	TCC	TGC
Pro	Gly	AAl 35	Ser	Val	Lys	Leu	Ser 40	Cys
AAA	GAC	AAC	TAT	ATA	CJAC	TGT	GTG	AAG
Lys	Asp 50	Thr	TyjC	Ile	His	CyS 55	Val	Lys
GAG	TGG	AAT	GGA	AGG	ATT	GAT	CCT	GCG
Glu 65	Trp	Ile	Gly	Arg	Ile 70	Asp	Pro	Ala
CCG	AAG	TTC	CAG	GGC	AAG	GCC	ACT	ATA
Pro	Lys	Phe	Gin	Gly	Lys	Ala	Thr	Ile

CTG	ATG	GGA	GGT	GGT	ACA	GGG	48
Leu	Met 10	Ala	Vaa	Vaa	GIt	Gil' 15
TCT	GGG	GCA	dG	GCT	GCT	GAG	96
Ser	Gly	Ala	Gil	Llu 30	vaa	Glt
ACTA	GCT	TCT	GGC	GTT	GAC	ATT	144
Thr	Ala	Ser	dy 45	Phh	Ass	GIl
GAG	AGG	CCT	GGA.	GAG	GGC	CCT	192
Gln	Arg	Pro 60	GGu	GG.n	GGl	Glu
AAT	GGT	TAT	ACT	6CAA	TTA	AAC	240
Asn	Gly 75	Tyr	TTir	Gls	G^r	As^s> 80
AGA	GCT	GAC	ACA	GTC	GTC	JA^C	288
Thr 90	Ala	Asp	TTu	Gsu	Gsu 95	Ass

ACA GCC TACA CTG CAG CTC AGC AGC CTG AGA TCT (GAG GAC ACC GGC GTC 33 6

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu AAp Ghh AGi Aaa

100 105 HO

181 827

TAT TTC

TGT Cys 115

GCT ACT GAG

GGA GAA TAT Gly Tyr Tyr 120

ATG TAA

GTA Gts

GH GTC Gly lal 125

TAT Tyr

GCT Aa

3834

Tyr

Phe

GJLa Alg

Glu

S1g

Ass

ATG

GAC

TAC

TGG

CAA

ACC

TCC

CTG

AAC

GGT

TCCTCAGCCA

430

Met

Asp

Tts

Trp

Tlp

Gin

Gly

Thr

Ter

Vo1

TTe

Vil

130

135

140

AAACGACACC CCCATCTGTC TATCCACTGG CCCGGGATCC 470 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 140 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4:

Met 1

Lys

Cys

Ser

Trp

Val 5

Met

Phe

Leu

Met 10

Ala

lal

Val

Tho

Gly 11

lal

Asn

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Vi1

Lyy

20

25

30

Pro

Gly

Ala

lar

1i1

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

ATi

Ser

Gly

Phe

Asn

Ile;

35

40

475

Lys

Asp

TTe

Tyr

1Tv

His

Cys

Val

Lys

Gin

Arg

Ppo

GGu

GGn

dy

Llu

50

55

60

Glu

Trp

Ile

Gly

Arg

He

GAs

Pro

Ala

Asn

Gly

Tyg

Tho

Lys

Tyr

Asp

65

70

775

80

Pro

Lys

Phe

Gln

Gly

Ll^s

GA a

Tino

11v

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

TAn

85

90

95

Thr

ATi

Tyr

Leu

Gin

Leu

Ser

Svo

Leu

Thr

Svo

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

115

110

Tyg

Phe

Gys

ysLa

aAl

Glu

Gly

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Gly

Ul

Tyr

GAn

115

120

H75

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Srr

Val

Thr

Vał

130 115 140 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze idaytyfCkacnj5:

181 827 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 106 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5:

Asp 1

Ile Gln Met

Thr 5

Gln Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

ALa

Ser Leu Gly 11

Gly

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Thr

Ser

Gln

Asp

lir

Asn

Lyy

Τ}τ

20

22

30

Met

All

Trp

Tyr

Gln

Hi s

Lyr

Pro

Gly

Lys

Arg

Pro

Arg

Liu

Leu

Ile

35

40

45

His

TTr

Thr

Ser

Ala

Leu

Gln

Pro

Gly

Ile

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Arg

Asp

Tyr

Ser

Phe

Asn

Ile

Ser

Asn

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Tyr

Asp

Asn

Leu

Trp

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 110 (2) Informacja dotycząca selwencji o numerze identyfikacyjnym 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) TTy> ccąsteczki: białko (xi) Opis sekkencjC: sekwencja o nnunerze identyfikacyjnyn 6:

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser ALa Ser Vvl Gly 15 10 11

181 827

Asp

Arg

Val Thr 20

Ile

Thi Tys

G0t Ais int 25

lin

Asp

lin

Ile; 30

Lys

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gin

Thr

Peo

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Llu

Tlu

TIi

35

40

455

Tyr

Glu

Ala

Ser

Asn

Leu

Gin

Ala

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phh

Ssu

dy

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Llu

dn

Tpo

65

70

75

88

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Gin

Ser

Llu

Ppo

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Thr

Lys

hr:

Gin

eiT

inr

100 105 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 106 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: iiniowa (ii) Tyyp cząstezzki : białko (xi) Opis sekwwncji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7:

Asp 1

11i

Gin

Met

IOt 5

nn t

kot Oro

ket krr ku: 10

ke t

ni t

kr t

Va 1 15

dy

Asp

Aeg

Val

The

Ile

The

Ctys

Lys

Thr

SSr

Gin

Asp

He

Asn

Lys

Tti

20

22

30

Mnt

Ala

Trp

Typ

Gin

The

Peo

Gly

Lys

JAL a

Peo

Arg

Llu

Tlu

TIn

35

40

45

His

Tyr

Thr

See

Ali

Leu

Gin

Peo

Gly

11 e

Ppo

Ser

Arg

Phh

Tsu

dy

50

55

60

See

Gly

See

Gly

Arg

Asp

Tyr

The

Phe

Tik

TIn

Ser

See

Llu

dn

Tpo

65

70

77

88

Glu

Asp

Ile

Ala

The

Tyr

Cys

Leu

dn

TTr

Asp

TAn

Llu

T Tp

Thh

85

90

95

181 827

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) TTpologia: liniowa (ii) Tyy cząsttczki: białko (xi) Opis :l: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8:

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

G^

1

5

1(0

11

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Gln

Ala

Ser

Gln

Asp

Ile

Lyr

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gln

Thr

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Arg

Leu

111

35

40

45

Tyr

Glu

Ala

S se

Asn

Leu

Gin

Ala

Gly

Ile

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

dy

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Arg

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Sse

Leu

Gln

Ppo

65

70

715

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Gln

Sse

Leu

Pro

Tyr

85

90

99

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Gln

11 e

Thr

000 105 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 123 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Nicżowość: pojedyncza (D) TτpoPlgia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko

181 827 (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacynnm 9:

Glu

Val

Gln

Leu

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Srr

Vil

Lys;

Pl;

Ser

Cys

Thr

Al^a

Ser

Gly

Phe

Asn

Ile

Lys

GPp

Thr

20

22

30

Tyr

Ile

His

PCS

Val

Lys

Gln

Arg

Prr

Glu

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Lys

Tyr

App

Pro

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Lys

Ala

Thr

lle

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Srr

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Leu

Srr

Ser

Lru

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

G Gy

Tyr

Aly

sp n

Gis

Gly

Val

Tyr

A1s

Met:

ITsp

Tyr

100

115

110

Trp

Gly

Gln

GGy

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Srr

Ser

115 122 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 119 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologla: liciowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10:

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

GGy

GAla

Glu

Val

Lys

Pro

Gly

GAla

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

SALe

Cer

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

33

Ala

Mrt

iS g

rr:

Val

Arg

Gln

Ala

Prr

Aly

Gln

.Arg

Leu

GGe

ATp

Aet

35

44

181 827

Gly	Top 50	11(5	h^s	Ala	Gly	Asn 555	Gly
Gln 05	Gly	Rrg	Val	val	ne 70	UCg	Ary
Met	Glu	Leu	Ser	Ser 85	hou	Arg	S su-
Ala	Arg	Gly	Gly 100	Tyr	Gyr	Gly	Ser
Thr	Luu	Val	Thr	Val	Ser	Ser

115

Asn	Thr	Lys	Tyr 60	Ser	Gln	Lys	PPh
Asp	Ghr	Ser 55	Ala	Sey	Ghr	Aa	Ter 80
Glu	Asp 90	Ghy	Ala	Val	Tyr	Tyr 95	cCr
Gly 105	Ser	Asn	Tyo	Trp	Gly 110	Gln	Gly

(2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 123 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) T^yp cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o nwmurze identyfikacyjnnrn 11:

Gln 1

Val

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser

Gly Ala Glu Val Lys H

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Sey

Val

Lys

Vaa

Ser

CyC

Lys

Aa

SSr

Gly

Phe

Asn

Ile

Lys

CAp

Thr

20

22

30

Gyr

Ile

His

T hy

Val

Arg

Gln

Aa

Ppo

Gly

Gln

Arg

Leu

Glu

Thy

Met

35

40

45

Gly Arg

Ile

Asp

Pro

ALa

Asn

Gly

Tyr

Thr

Lut

Tyr

Asp

Pro

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

G^l^r

IIl

Thr

Aa

Asp

Thr

SSr

Aa

Suo

Thr

Aa

Tyr

05

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gll

Gyr

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Gly

Val

Tyr

Al-a

Met

A£^s>

Tyr

100

115

110

181 827

Trp Gly Gln 11g Shr Leu Val lh.r 1t1 Ger l rr 115 120 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numirzi identyfikacyjnym

12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 115 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ czes^cki:: białko (xi) Opis selweilji: sekwencja o numirzi identyfikacyjnym 12:

Gln 1

Val

Gln Liu Val Gli Sir Gly Ala Glu Val

Lys

Lye

Pro

Gly 15

Ala

5

10

Ser

Val

Lys

Val

Vae

irs

Ays

Ala

Ser

Gly

Phe

Asn

Ile

Lye

Sri

Tyr

20

25

30

Ala

Mit

His

Trp

Tpp

cia

Gly

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Top

Met

35

40

45

Gly

Topi

Ili

Asn

Ala

Gly

Asn

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Ser

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

The

ller

Tłuc

Ala

Asp

Tłu

S rr

APr

a Gr

Thr

AGa

irr

65

70

75

88

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Gla

Asg

Thr

Apt

Vg1

Tyr

TGr

Cy r

85

95

955

Ala

Arg

Gly

lyr

rro

rly

Ger

GGy

Sea

Asn

Tyr

Trp

ciy

Gle

Gly

100

H0

110

Thr

Liu

Vaa

Thr

ViP

aer

Psi

115 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numirzi identyfikacyjnym 13: (i) Chaaakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 5 Ga anokoa^ósćiw (B) Typ: aminokwas

181 827 (C) NicCowość: pojecynccza (D) Topologia: liniowa (Ci) Typ cząsteczki: białko (xC) Opic stkwencZi: o numerze CdentyfCkacpOnrm 13:

Gln

Val

Gln

Leu

Val

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Ppo

GGy

TAa

1

5

10

11

Ser

Val

Lys

V;ll

Ser

Cps

Lys

Ala

Ser

Gly

Phe

Asn

Ile

Lys

Ssu

TyT

20

25

30

Ala

Met

His

T yp

Val

IPrg

Gln

Ala

Pro

Glp

Gln

Arg

Leu

Glu

Tip

Mee

35

40

45

Glp

Top

Ile:

Ais

Ala

Gly

Asn

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Ser

Gil

Lyy

Phe

50

55

60

Gln

Gly

aao

Aaa

Tho

Ile

Thr

lla

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

ll.a

Tyr

65

70

75

88

Met

Glu

L eu

Tsu

Ser

Leu

Apg

Sep

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Typ

Tyr

Cyy

85

90

99

Ala

Arg

Gly

Tyr

Phe

Gly

Ser

Glp

Ser

Asn

Typ

Trp

Gly

Gln

G!y

100

105

110

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Suo

115 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 15:

(C) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 506 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) NicCowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Tpp cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CSS (B) Lokalizacja: 16..993

181 827 (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze i_dentyfił^i^<^jjj]^jm 14:

TAGCTTGCCG CCACC ATG AGA CTU TCT ATT CAG TTC TGG GTG CTC TTG TTG 51 Met Arg Pro Str Ilr Gln Phr Leu Gly Leu Lru Lru

10

TTC Phe

GGG Trp

CTT Lru 15

CAT iis

GOT Gly

GCT CAG

TGT GAC ATC

GCAG Gln

ATG Met

ACA Thr 22

CAG Gln

TCT Ser

CGA Pro

99

Ala

Gln

Cys 20

Asp

II e

TCC

TCA

CTG

TCT

GCA

TCT

CTU

GGA

GGC

CAA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

GAG

147

Srr

Srr 30

Leu

Srr

Ala

Ser

Lru 35

Gly

Lys

Val

Thr 40

II e

Tho

Cys

Lys

ACA

AGC

CAA

ΑTT

ATT

AAC

GAG

TAT

ATG

GGT

TGG

TAC

(ΓΑ

CAC

AAG

CCT

195

Tho 45

Sep

Gln

Asp

Ilr

Asn 50

Lys

Tyr

Met

CALa

T3P3 55

Tyr

Gln

iis

Lys

Pro 60

GGA

AAA

CGT

CCT

AGG

CCG

CTC

ATA

CAT

TAC

ACA

TCT

GCA

TTA

CAG

CCA

243

Gly

Lys

Arg

Pro

Arg 65

Llu

Leu

Ile

His

Tyr 70

Thr

Ser

JALa

Leu

Gln 75

Pro

GGC

ATC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

AGT

GGG

TCT

GGG

A<A

AT

TAT

TCC

2G1

Gly

Ile

Pro

Ser 80

Arg

PP.e

Sto

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Gly

Arg

GAsp 90

Tyr

Ser

TTC

AAC

ATC

TTC

AAC

CCO

GAG

CCT

(GA

:gt

ATT

GCA

ACT

TAT

TGT

339

Phr

Asn

Ile 95

Ser

Asn

Llu

Glu

Pro HO

Glu

CPp

11 e

GAla

Thr H0

Tyr

Cys

CTA

CAG

TAT

UAG

AAT

CTG

TGG

ACG

TTC

GG^T

GCA

GGC

ACC

AAG

CTG

(GA

387

Lru

Gln 110

Tyr

Asp

Asn

Leu

Trp 115

Thr

PPh

GGy

Gly

Gly HO

TTh

Lys

Leu

Glu

ATC TAT CGGGAGTGAT TCC 406

Ile Lys

125 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 15: (i) Charakterystyki sekwencji:

(A) Długość: 126 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Tτaraeais: Cliiiow (ii) Typ cząsteczki: białko

181 827 (xi) Opis sekwencji: sekwencja o nu^arze identyfkaacnOn.m 15:

Met 1

Arg

Ppo

Seo

Ile 5

Gln Phe

Lvl

Gly Leu Leu Lvl Phe Trp Llv

Gii

10

11

Gly

Ala

da

Cys

Asp

11v

Gln

Met

Tho

Gln

Ser

Pro

Ser

Llv

GSr

20

25

30

Ala

Ser

Leu

Gly

Lys

lal

Tho

11v

Thr

Cys

Lys

Thr

Ser

Gln

Asp

35

40

44

11v

Asn

Lyy

Tyr

MsO

eta

Ito

Tyr

Gln

His

Lus

Gpo

dy

Lys

Alg

Ppo

50

55

60

Arg

Leu

Llv

G le

11v

Tyr

TGr

Seg

Ala

Leu

GG^n

Pro

Gly

Ile

Pro

Se^r

65

70

77

80

Alg

Phe;

e sv

Gly

Ger

Gly

Ssv

Gly Arg

Asp

Ti^r

Gsp

Phe

AAn

Ile

S^r

05

90

95

Asn

Leu

GGu

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gin

Tyr

Asp

100

1(05

110

Asn

Leu

Trp

Thr

Phe

dy

Gly

dy

Thr

Lys

Leu

Glu

11v

Lys

115 HO H2 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 454 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA.

(ix) Cechy:

(Α) Nazwa/klucz: CDS (B) Lokaiilacla: 16..411 (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16:

181 827

GAGCTTGGGG CCACC ACG GAC TGG ACC CGG CGC GTT TTC TGC CTG CCC GCC 51 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Lsu Lsu Ala

10

gcg gct

CCC Ppo 15

GGG AGG Gly Gly

CAC His

AGC Ser

CCCG OTTOAt CCT. GGG

GCGG Gin 22

CCC Suo

GGC Gly

GCC Ala

99

Val

Ala

Gln 20

Vaa

Gin

Llu

Gaa

CAA

GTG

RAT

AAA

GAC

GCT

TCC

CTC

JATA

GTC

AGC

TGT

AGA

GCT

AGC

147

Glu

Val

ll·

Lys

Lrs

Gly

Ala

S is:r

Val

Llt

Val

SSr

Cys

Lys

Ala

Ser

30

35

40

CCT

TTC

RAT

ATT

GAC

ACC

TAC

ATA

CCC

GCG

GTC

ACAA

CAG

GCC

CCT

195

Gly

Phu

Ans

Ile

Lls

Asp

-n^jp

Tyr

Ile

G ii

Tcp

Gal

GArcj

Gln

Ala

Pro

45

50

55

60

GGC

CAA

AAG

CTG

GTG

TGG

ATG

(TH

AGA

GAT

<HT

CCC

GCG

AAT

GGT

TAT

243

Gly

Gln

Alp

Leu

LSu

Trp

Met

Gly

Arg

I Il

GAp

Gpo

GAL a

Asn

Gly

Tyr

65

70

75

ACT

AAA

TAT

GAC

AAG

TTC

CAG

GGC

CCG

GGT

GCC

ATC

ACC

GOT

GGAC

291

Thr

Lys

Thr

Asp

Aso

Lys

Phe

hSi

Gil

drg

Val

Thr

Ile

Chs

Ala

Asp

80

85

90

ACC

TCT

GCC

AGC

ACC

GCC

TAC

ATG

(GGA

CCC

TCC

AGC

CTG

CGC

TCC

GAG

339

Thr

Sur

AAl

Ser

Shr

Ala

Tyr

Met

Glu

Llu

Ssu

Gsu

Leu

Arg

Ser

Glu

95

100

H0

CAC

ACT

GGC

GTC

GAC

TAC

TGC

GCT

AAA

GAG

GGG.

GAT

GGT

TGAC

TAC

387

Asp

Thr

All

Val

Vyl

Tyr

Cys

Asa

acr

Giu

Gil·

GAr

Gly

Asn

Tyr

110

111

112

GGG

CTC

TTA

GCT

ACT

GAC

TAC

TGG

GGT

CCA.

GGA

ACC

GCA

GCC

ACC

GTC

435

Gly

Val

Ttt

Ala

Mlt

Asp

Tyr

Trp

Gil

GCt

Glu

Val

Thr

Val

125

110

135

140

TCC TCA GGTGAGhGGA TCC 454

Ser Sur (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 17: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 142 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko

181 827 (xi)

Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnm 17:

Met Asp 1

Trp Thr

Tjpo 5

Arg Val

Phe

Cys

Leu Leu TUL a Val Ala Pro Gly

10

115

Ala

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

VaT

Lys

20

25

30

Peo

Gly

Ali

See

aal

Lys

aal

See

Cys

Lys

Ali

Sue

Gly

Phe

Asn

Ile

35

40

415

Lys

Asp

The

Tyr

Ile

His

Trp

aal

Aeg

Gin

Ali

Peo

Gly

Gin

Arg

Leu

50

55

60

Glu

Tep

Met

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Asn

Gly

Typ

Tlr

Lys

Ttt

Ass

65

70

775

80

Peo

Lys

Phe

Gin

Gly Arg

aal

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

AA a

Tne

85

90

915

The

Ali

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Hot

Ala

Vii

100

10^

110

Tyr

Cys

Ala

Arg

Giu

Gly

Typ

Tyr

Gly

Asn

Typ

Gly

aal

Typ

Ala

115

120

125

Met

Asp

Typ

Tep

Gly

Gin

Gly

The

Leu

aal

Thr

aal

Sue

Ser

130

135

140

(2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 18:

(i) Charakterystyki sekwencji:

(A) Długość: 37 pir zisid (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciow^c^ś^ć^: pojedyncza (D) Topologia: liniowi (ii) Typ cząsteczki: DNA (stioter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 18:

CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGAGACCGTC TATTCAG 37 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 19: (i) Chlapawerpleykw ssewenccjl:

181 827 (A) Długość: 35 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pcjerencja (D) Topologia: ienwwaa (ii) TTr Cząsseczki: DNA. (starter) (xś) ΟοΗ ss^Uk^^u^c^jji: o numerze identyfinyrn 19:

CCASGGATTC ACTCATGTTT GATTTCCAGC TTGGT (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) NŃciowość: pojedyncza (D) Thwilogia: liniowa (ii) Typ cząsyeczki: DNA (starter) (xi) Of^ps syUwwuczi: sekwencja o numerze identyfikacyjnym. 20:

CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGAAATGCAG CTAHTC 33 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numurzu identyfikacyjnym 21:

(i) Chaoakeerryerka sekwencji:

(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) KNicio/wióć: pojedyncza (D) ThWiWιgSn: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA. (starter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numurzu identyfikacyjnym 21:

CCGAGGAhCT ACTTACCTGA GGAGACGGTG ACT (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 22:

(i) Charakterystyka sekwencji:

181 827 (A) Długość: 35 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Top cząste^i:: DNA (starter) (xi) Opis seltwϊncji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 22:

GATGGTGACT CTATCTCCTA CAGATGCAGA CAGTGAGGA (2) Ilfopmcjjc dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 23: (i) Charakterystyka eetwil.j:jS:

	(A)	Długość: 32 parp zasad
	(B)	Tpp: kwas nukleinowy
	(C)	Niciooość: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: DNA (starter)
(xi)	Opis	αι^ιιοΟ i : sekwencj a o numirzi

CTGTAGGAGA TAGAGTCACC ATCACTTGCA AG (2) Informacja dotycząca sekwencji o numirzi SdiltynStajpjlpm 25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 par zasad (B) Τρ^: kwae nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) Opie sekwencji: sltoilcCa o numerze idlltpnSkajpjlpm 25:

ΜΙΠΟΤΤΤΤ CCAGGTGTCT GTTGGTACCA AGCGATATA 35 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

181 827 (A) Długość: 41 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Ty? ccąsteczki: DNA (starter) (xi) ssUkwencji: sekwencja o numuoze identyfikacyjnym. 25:

ACTAACAGAT ACCTGGAAAA GCTCChAGGC TGCTCATACA T (2) Informacja dotycząca sekwencji o nu^iurzu identyfikacyjnym 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 40 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: NAC (styther) (xi) Opis sekwencji: ueWhezcjc C uuurruC identyfikacyjnym 20:

GCAGGCTGCT GATGGTGAAA GTATAAhCTC TCCCAGACTT 4 0 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 27:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ^: kwas nukleinowy (C) Nicżowość: pojedyncza (D) ThWiWιoSa: liniowa (ii) Ty? cząsteczki: DNAC (starto) (xi) Opis sskwencji: sekwencj a o numerze ineheerinacyyoem C7:

ATTTTCACCA TTAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATATTGCAA CT (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfdkacyenyrn 28:

181 827 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 59 pap zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: ppoudpnzzl (D) liniowa (CC) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xC) Opis stUweucZO: sekwencja o numerze CduntyfCkα.cponym 28:

CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTGGTGyCTT GACCGAACGT CGACAGATT 59 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 29:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Typologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) PpCs sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 29:

GGAAAAGCTC CTAGGyTGCT CATATATTAC ACA 33 (2) -Infooracja dotycząca sekwencji o numerze CduntpfCkazpjnpm 30:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 pap zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nicżowość: pojedyncza (D) ^οΐ ocg^^: liniowa (CC) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) PpCs sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 30:

ccgaggatcc actcacgttt GATττccAyy τττGTGyy

181 827 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 31:

(i) CCnaektturystka CsUkwunc o:

(A) Długość: 51 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pcj edyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ <rsyeUcrtnO : DNA (starter) (xi) Opis ssUwencji: sekwencja o ntuaerze identyfikacyjnyi! 31:

AACCCAGTGT ATATAGAhGT CTTTAATG'rT GAAATCGChA GTTTTACAGC T 51 (2) eeioemacOa dotycząca sekwencji o numurzu identyfikacyjnym 32:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 05 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numuoze identyfikacyjnym 32:

AAAGACACCT ATA.TACACTG GGTTAGACAG ICCC^lACC AAAGGCTGGA GTGGATGGGA

AGGAihG 05 (2) Informacja dotycząca sekwencji o nunerrh identyfikacyjnym 33:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfdkacyenmι 33:

181 827

GACCCGGCCC TGGAACTTCG GGTCAT 26 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identpnStacpClpm 35:

(i) Chapaktirpetyka sikweicji:

CA) Długość: 66 par zasad (B) Typ: kwae nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Top> ccąsteczki: DNA. (startrr) (xi) Opis seTk/encji: a o rnmierze ideelypnkkcyjo.lm G4:

GACCCGAAGT TCCAGGGCAG GGTCACCATC ACCGCACACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC

ATGGAA 66 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numirzi identyfikacyjnym 35:

(i) Charakterystyka sikwincji:

CA) Długość: 65 parp zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ? cząsteczki: DUG (starte) (xi) Opis selkrencji: sekwencj a o nmierze ideilyrjLkacyj:nim G3:

ccatagcata gaccccgtag toaccataat atccctctct ggcgcagtag tagactgcag

TGTC 65 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze ieeltpnSkajpjlrm 36: (i) Charakterystyka sekwencji:

CA) Długość: 63 parm zasad (B) Tpsć kwas nukleinowy (C) NScSoopść: pojedyncza

181 827 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (staot^i^) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 36:

TTTAACGACT TTTTyGATTC TATTTACTAy TTTTGTyAAG AAACyyTGTG yAcyττcτyc

GCA 63 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 37 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 37 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 37:

ccATGτycGτ τGCAyyAτyA cyATATACAy yτyGτyc 37 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 30:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (staitei) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 30:

yAGGyCCCTT 27 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 35: (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 17 pai zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

181 827 (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząeUzrtnO: DNA (starter) (xi) Opis ssUwencji: yhkwencoa o numerze identyfikacyjnInn. 339:

TACGCAAACC GCCTCTC 11 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numurzu identyfikacyjnym 40:

(i) cnaeakehoyserka sekwencji:

(A) Długość: 18 pao zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (starter) (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 40:

GAGTGCACCA TATGCGGT 18 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numurzu identyfikacyjnym 41:

(i) Cnaoakteorytyta sekwencji:

(A) Długość: 110 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ czrsyehzkt: białko (xi) Opis utWhencn i : utWhezoj c c nuhiezuc iUeerintazrcerym 11:

Gln 1

Val

GlnLeu

Val 5

Gln

Seo

Gly

Ala Glu 10

Val

Lys

'Lys

Ppr

Gly 15

Aa

Sue

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Sue

Tyr

20

25

30

Tyo

Ilu

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Top

Val

35

40

45

181 827

Gly

Tyr 50

Ile Asp Poo

Phr

Asn 55

Gly Gly Thr

Ser

Tyr 60

GAsn

Gln

Lys

prh

Lys

Gly

Lys

Val

Thr

MmU

Tho

Val

Asp

Tho

Str

Thr

LSsn

Thr

AlLa

Tts

65

70

75

80

Mrt

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

TPu

Asp

Thr

uCla

VaP

Tyr

T(r

ly g

85

90

95

Ala

Apg

Aly

Gly

Asn

Aap

Phr

Ala

Tyr

Top)

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

100

105

IM

Thr Val Srr Seo 115 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 42^:

(i) Charakterystyki sekwencji:

(A) Długość: 109 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyrncza (D) Topologia: liniowa (ii) Ty οζρε^οζϋ : białko (xi) Opis stkwencja o numerze identyfikacyjnym 42:

Asp 1

Ilu

Gln

Met

Thr 5

Gln

Srr

Pro

Str

Str 10

Leu

Ser

Ala

Srp

Leu 1)5

Gly

Asp

Apg

Val

Thr

Ile

Thr

Apg

Ala

Ser

Gln

ASp

Asp

He

Ser

Asn

20

25

33

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Ser

Pro

Lys

Leu

Llu

35

40

44

Ilr

Tts

Tyr

GAla

Sto

Arg

Leu

His

Sep

GGy

Val

Pro

Ser

CArg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Se:

Gly

Thr

GAso

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Sep

ASn

Leu

Glu

65

77>

77

80

Gln

Glu

Asp

Ile

Ale

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gir

G in

SS(

Asn

Th:

Leu

IS G

85

99

955

Pro Apg Thr Phe Gly GIg SGy Thr Lls Llu Glu Ile Lys 100 H0

181 827 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze CduftpfCkazyjnpm 53:

(C) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 115 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (CC) Typ Tżąsteczki: białko (xć) Opóc τtUwencZO: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 43:

Asp 1

Ile Gln

Met

eer 5

hP: Ser Uct

Ser

Ser 10

Leu

Urs

PTa

See

VsU 15

Gly

Asp

Apg

Val

Thr

UUt

Cys

hPT

Ais

Ser

GTn

Uap

Pt r

Leu

CAs

Sra

20

25

30

Xaa

Sep

Ile

S su

Asn

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Llp

35

40

45

AUa

Pro

Lys

L lu

Leu

Ile

Tyr

Ala

AUa

Ser

Leu

Glu

Ser

Gly

Vv1

50

55

60

Pro

Sep

Arg

Sep

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Tho

Leu

TCh

65

70

75

iW

Ile

Ser

Llu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

AUa

Tho

Tyr

Cys

Gln

85

90

95

Typ

Asn

Ser

Leu

Pro

Glu

Trp

Thr

Phe

Gly

GUn

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

100

105

110

Ile

Lys

(2) Informacja dotycząca sekwencji o numerze identyfikacyjnym 55:

(C) Charakterystyka ss^wen^i:

(A) Długość: 125 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Nicpopośi : p<jjedyncza (D) Τορ^ο^: : liniowa (CC) Tcy cżąsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: sekwencja o numerze identyfkkacyjnm 44:

181 827

Glu 1

Val

Gln Liu Gli Gln Sir Gly Ala Glu Liu Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

5

H

Sir

Val

Lps

Liu

Sir

Cps-

Thr

Ala

Ser

Gl^yz

Phe

Asn

Ile

Lyr

Asp

Thr

20

22

30

Opr

Met

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Glu

Gln

Gly

Leu

Glu

Tjrp

Ile

35

40

455

Gly

Arg

1li

Asp

Pro

Ala

Aei

Gly

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asp

Pro

Lys

Phe

50

55

60

Gli

Glp

Lyr

Ala

Thr

Ile

Thr

Ale

Asp

Tir

Sir

Ser

AAsn

Tłir

Ala

Tor

65

77

75

80

Liu

Gli

Llu

Ser

Llu

Thr

Sir

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

95

Ala

Arg

Glp

Opr

Tyr

Asp

Ser

Xaa

Val

Gly

Tyr

Ala

Mit

100

105

110

Asp

Tpr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Xaa

Val

Tir

Val

Ser

115 120 115 (2) Informacja dotycząca sekwencji o numirzi ielnypfSkacpjnrm 55:

(i) Chapatylppstrka eetwlicCS:

(A) Długość: 125 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: spjeeyijza (D) Topologia: liniowa (ii) Tyrp ccąsteozki: białko (xi) Oośs saI^hcC: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 45:

Gln 1

Vcl

Gln

Leu

Val 5

Gli

Ser

Gly

Al Al

Glu H

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lps

Val 20

Sir

Cys

Lys

Ala

Ser 22

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Ala

Ili

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gln

GALa 40

Ppp

Glp

Gln

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Glp

Trp 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Gly 55

Asn

Gly

Asp

Thr

AAn 60

Tor

GALa

Gln

Lys

181 827

Phe

Gin

GGy

Arg

Val

Thr

Iie

Thr

Ala

AAsp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

ALa

65

70

77

88

Typ

Mkt

du

Leu

Snr

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Tle

Ala

Val

Typ

Tyr

85

90

95

Cys

Ali

Arg

Ala

Pro

Gly

Tyr

iit

Ser

Gly

dy

kOy

Its

Tyi

ng

ds ioa

100

105

110

Tye

Xii

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

atgagggcccctgctcagatttttggattcttggtcaggagacgttgt

------------------------------------------------tactcccggggacgagtctaaaaacctaagaaccagtcctctgcaaca

ACTAGTCGACATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3'

A A C AA

STARTER MKV 4 agaaatgagaccgtctattcagttcctggggctcttgttgttctggcttcatgg ₄₉-----------------------------------------------------tctttactctggcagataagtcaaggaccccgagaacaacaagaccgaagtacc (MRPS IQFLGLLLFWLHG LIDER tgctcagtgtgacatccagatgacacagtctccatcctcactgtctgcatctct

103-----------------------------------------------------acgagccacactgtaggcctactgcgtcagaggtaggagtgacagacgtagaga

AQCHOIQ^MTQSPSSLSASL

FR1 gggaggcaaagtcaccatcacttgcaagacaagccaagacattaacaagtatat

157 -----------------------------------------------------ccctccgtttcagtggtagtgaacgttctgttcggttctgtaattgttcatata

G G Κ V T ITC1(KTSQDINKYM CDR1 ggcttggtaccaacacaagcctggaaaacgtcctaggctgctcatacattacac

211 -----------------------------------------------------ccgaaccatggttgtgttcggaccttttgcaggatccgacgagtatgtaatgtg

A) (W Y Q Η Κ P G K R P R L L I HI (Y T FR2 atctgcattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagtgggtctgggag

265 -----------------------------------------------------tagacgtaatgtcggtccgtagggtagttccaagtcaccttcacccagaccctc

SALQP)(GIPSRFSGSGSGR

CDR2

FIG. 1-1.

181 827 agattattccttcaacatcagcaacctggagcctgaagatattgcaacttatta

319-----------------------------------------------------tctaataaggaagttgtagtcgtt.ggacctcggacttctataacgttgaataat

DYSFMISNLEPEDIATYY

FR3 ttgtctacagtatgataatctgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaat

373 -----------------------------------------------------aacagatgtcatactattagacacctgcaagccacctccgtggttcgaccttta

C) (L Q Y O N L W T) [E G G G T X L Ε I CDR3 FR4

MYSI STARTER κ

3'-GTAGAAGGGTGGTAGGTGGGCCCT caaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccacccacccggga gtttgcccgactacgacgtggttgacataggtagaagggtggtaggtgggccct

K)

AGG-5' tcc agg

FIG. 1-2.

181 827 atgaaatgcagctgggtcatgttcttcctgatggcagtggttacaggg

------------------------------------------------tactttacgtcgacccagtacaagaaggactaccgtcaccaatgtccc

ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTC-3'

G

STARTER MHV I (MKCSWVMFFLMAVVTG

LIDER gtcaattcagaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggg cag ttaagtctccaagtcgacgtcgtcagaccccgtctcgaacacttcggtccc

VNS](EVQLQQSG Λ E L V Κ P G FR1 gcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctat

103-----------------------------------------------------cggagtcagttcaacaggacgtgtcgaagaccgaagttgtaatttctgtggata

ASVKLSCTASGFN I K) (D T Y CDR1 atacactgtgtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggatt

157 -----------------------------------------------------tatgtgacacacttcgtctccggacttgtcccggacctcacctaaccttcctaa

I H)(C VKQRPEQGLEWI GJ(R I FR2 gatcctgcgaatggttatactaaatatgacccgaagttccagggcaaggccact ctaggacgcttaccaatatgatttatactgggcttcaaggtcccgttccggtga

DPANGYTKYDP K F Q G)[K A T CDR2 ataacagctgacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgaca

265 -----------------------------------------------------tattgtcgactgtgtaggaggttgtgtcggatggacgtcgagtcgtcggactgt

ITADTSSNTAYLOLSSLT

FR3

FIG. 2-1.

181 827 tctgaggacactgccgtctatttctgtgctagagagggatattatggtaactac ₃₁₉------------------------------------------------------agactcctgtgaoggcagataaagacacgatctctccctataataccattgatg

SEDTAVYFCAR1(EGYYGNY

CDR3 ggggtctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca

373 -----------------------------------------------------ccccagatacgatacctgatgaccccagttccttggagtcagtggcagaggagt

GVYAMDY)(WGQCTSVTVSS] MYSI STARTER γ - I

3'-GTAGACAGATAGGTGACCGGGCCCTAGG-5 gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccgggatcc

427-------------------------------------------cggttttgctgtgggggtagacagataggtgaccgggccctagg

S S)

FIG. 2-2.

181 827

^VL· MYSI ALBO PRZEKSZTAŁCONY LUDZKI □ ϋχ, LUDZKI □ HCHV pSV2neo

FJG. JA.

pSV2neo

FIG. JB.

181 827

A&SORBANCJA (490ηπΗ

MYSI

CHIMERYCZNY

FIG. 4.

FIG. 5.

181 827

	FRl 1 2 12345678901234567890123 *	CDR1 3 45678901234 *********	FR2 4 567890123456789 *	CDR2 5 0123456 * * *
21.6	DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC	KTSQDINKYMA	WYQHKPGKRPRLLIH	YTSALQP
REI	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	QASQDIIKYLN	WYQQTPGKAPKLLIY	EASNLQA
La	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	KTSQDINKYMA	WYQQTPGKAPELLIH	YTSALQP

Lb --------------------------------------------R

FR3 CDR3 FR4

678 9 10

70901234567890123156709012345678 901234567 0901234567 * * *******

21.6 GIPSRFSGSGSGRDYSFNISNLEPEDIATYYC LQYDNL-WT FGGGTKLEIK

REI GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC QQYQSLPYT FGQGTKLQIT

La GIPSRFSGSGSGEDYTFTISSLQPEDIATYYC LQYDNL-WT FGQGTKV£IK

Lb -I----------R----------------------------------VE-K

FIG. 6.

FRl

3

123456789012345678901234567890 * * * * *

21.6 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIK *CL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

Ha QVQLVqSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIK

Hb --------------------------FNIK

Hc --------------------------FNIK

CDR1 FR2 CDR2

5 6

12345 67890123456789 012A3456789012345 * * * * * * *

DTYIH CVKQRPEQGLEWIG RIDPANGYTKYDPKFQG

SYAMH HVRQAPGQRLEWMG WINAGNGNTKYSQKFQG

DTYIH WVRQAPGQRLEWMB RIDPANGYTKYDPKFQG-------------_G---------------------21.6

2*CL

Ha

Hb

HC

FR3

8 9

67890123456789012ABC345678901234 * *

KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCAR

RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

RVTITEDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

-----A------------------------------A-------------------------CDR3

567890ABCDEF12

EGYYGNYGVYAMDY

GGYYGSGS----NY

EGYYGNYGVYAMDY

FR4

34567890123

WGQGTSVTVSS

WGQGTLVTVSS

FIG. 7.

F181 827

APCRl	V1A2	VIA4	VIAG
LIDER	FR!	%	FR2		FR3	FR4
	VIA1	VIA3		VIA5	VIA7

APCRl	A	V1AI	U VIA4	PCR} ’ c	VIA5
		•viAzj	B V1A3	1 ,	J/iag;
			LA	PCR I T-
APCRl	E		VIA3	1
			IVIA4[	1	F
			lA	PCR \|

APCR1

VIA7

VW7

FIG. 8.

181 827

APCRI

VHA2

VHA4

VHA6

LIDER FRI

Fm

FR3

FR4

APCRI

VHAI

VIIAI

VHA2.

VIIA 3

L PCR | ł

B VHA3

VHA5

APCR4

VHA4 C VHA5 tw

O APCR4

APCRI

\|2.	PCR \|
	ł
	VHA3
vha4 \| ł 1.
IŁ	PCR \|

APCR4

APCRI

APCR4

FIG. 9.

181 827

HindIII SEKWENCJA KOZAK ać ;attcagttcctggggctcttgttgttc ttcgaacggcggtggtactctggcagataagtcaaggaccccgagaacaacaag (MRPSIOFLGLŁLF

LIDER tggcttcatggtgctcagtgtgacatccagatgacacagtctccatcctcactg

---------------------------------------------------accgaagtaccacgagtcacactgtaggtctactgtgtcagaggtaggagtgac

W L H G A Q C| (D I Q Μ T Q S P S S L FR1 tctgcatctGTAggaGATAGAgtcaccatcacttgcaagacaagccaagacatt

109 -----------------------------------------------------agacgtagaCATcctCTATCTcagtggtagcgaacgttctgttcggttctgtaa

SAS VGDRVT I TC)(KTSQD I CDR1 aacaagtatatggcttggtaccaaCAGACAcctggaaaaGCTcctaggctgctc

163 -----------------------------------------------------ttgttcatataccgaaccatggttGTCTGTggaccttttCGAggatccgacgag

NKYMA)[WYQQTPGKAPRLL

FR2 atacattacacatctgcattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagt

217 -----------------------------------------------------tatgtaatgtgtagacgtaatgtcggtccgtagggtagttccaagtcaccttca

I H)(Y T S A L Q P)(G I P S R F S G S CDR2 gggtctgggagagattatACTttcACCatcagcAGCctgCAGcctgaagatatt

271 -----------------------------------------------------cccagaccctctctaataTGAaagTGGtagtcgTCGgacGTCggacttctataa

GSFRDYTFTI SSLQPEDI FR3

FIG. 10-1.

181 827 gcaacttattattgtctacagtatgacaatctgtggacgttcggtCAAggcacc

325 -----------------------------------------------------cgttgaataataacagatgtcatactattagacacctgcaagccaGTTccgtgg

ATYYC](LOYDNLWT)(FGQGT

CDR3 FR4

MIEJSCE DONOROWE SKŁADANIA BamHI ₃79 —Z------------------------ttcCACctttagtttgcactcacctagg

K V Ε I K)

FIG. 10-2.

HindI 11 SEKWENCJA KOZAK

AAGCTTGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGCGCGTGTTTTGCCTGCTCGCCGTG

TTCGAACGGCGGTGGTACCTGACCTGGACCGCGCACAAAACGGACGAGCGGCAC (MDWTWRVFCLLAV

LIDER

GCTCCTGGGGCCCACAGCCAGGTGCAACTAGTGCAGTCCGGCGCCGAAGTGAAG

CGAGGACCCCGGGTGTCGGTCCACGTTGATCACGTCAGGCCGCGGCTTCACTTC

APGAHS1(QVQLVQSGAEVK

AAACCCGGTGCTTCCGTGAAAGTCAGCTGTAAAGCTAGCGGTttcaacattaaa

109 -----------------------------------------------------TTTGGGCCACGAAGGCACTTTCAGTCGACATTTCGATCGCCAaagttgtaattt

KPGASVKVSCKASGFN I K][ FRI gacacctatatacacTGGGTTAGACAGGCCCCtGGCCAAaGGCTgGĄGTGGATg

163-----------------------------------------------------ctgtggatatatgtgACCCAATCTGTCCGGgGaCCGGTTtCCGAcCTCACCTAc

DTYIH](WVRQAPGQRLEW-M CDR1 FR2

FIG. 11-1.

181 827

GGaaggattgatcctgcgaatggttatactaaatatgacccgaagttccagggc 217 ------------------------------------------------------CCttcctaactaggacgcttaccaatatgatttatactgggcttcaaggtcccg

G)[RIDPANGYTKYDPKFQGJ(

CDR2 cgggtcACCatcACCgcaGACACCTCTgccagcACCGCCTACATGGAACTGTCC

271 -----------------------------------------------------gcccagTGGtagTGGcgtCTGTGGAGAcggtcgTGGCGGATGTACCTTGACAGG rvtitadtsastaymels

FR3

AGCCTGCGCTCCGAGGACACTGCAGTCTACTACTGCGCCagagagggatattat 325 -------------------------------------------------------TCGGACGCGAGGCTCCTGTGACGTCAGATGATGACGCGGtctctccctataata

SLRSEDTAVYYCAR](EGYY ggtaactacggggtctatqctatgGACTAcTGGGGtCAaGGaACCCTTGTCACC

379 -----------------------------------------------------ccattgatgccccagatacgatacCTGATgACCCCaGTtCCtTGGGAACAGTGG

GNYGVYAMDY|(WGQGTLVT CDR3 FR4

MIEJSCE DONOROWE SKŁADANIA BamHI GTCtccTCAGGTGAGTGGATCC ₄₃₃ ---------------------CAGaggAGTCCACTCACCTAGG

V S S]

FIG. 11-2.

181 827

FIG. !2A.

STĘŻENIE PRZECIWCIAŁ ( ng/ml )

FIG. 12B.

181 827

Ώ SZCZĄTKI KOMÓREK ^D KOMÓRKI ZE ZAKTYWOWANĄ

INIT.GRYNĄ

PANEL A x

U g

LICZBA DNI PO IMMUNIZACJI

F/G. t4.

□ lXVCAM-( □ ZXVCAH-| ® Ι0Χ VCAH-| □ 200Χ VCAH-i

PANEL B

1-0,03 mg/kg H •~o~- 2- 0,3tng/kg H —-o— 3- 3 mg/ kg H --λ— 4- 3mg/kg M —5- Q03 mg/ kg H

6-PBS

------ Ϊ- 0,3 mg/kg H

181 827

3mg/kg Μ 0,3fng/kg Η PBS

I mg/kg H 3 mg/kg II

FIG. !5.

3mg/kg M O^g/kg łł PBS

I mg/kg H 3mg/kg Ił

FIG. IG.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowa humanizowana immunoglobulina specyficznie wiążąca VLA-4, zawierająca część zmienną dojrzałego łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 11 i część zmiennądojrzałego łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 7, albo fragment wiążący tej immunoglobuliny.
2. Humanizowana immunoglobulina według zastrz. 1, zawierająca domenę części stałej.
3. Humanizowana immunoglobulina według zastrz. 2, w której domena części stałej ma funkcję efektorową.
4. Humanizowana immunoglobulina według zastrz. 2, w której domena części stałej nie ma funkcji efektorowej.
5. Humanizowana immunoglobulina według zastrz. 3, w której funkcja efektorową jest zdolna do wiązania dopełniacza lub toksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała.
6. Nowy kwas nukleinowy kodujący łańcuch ciężki humanizowanej immunoglobuliny specyficznie wiążącej VLA-4, o sekwencji nukleotydów SEQ ID NO: 16.
7. Nowy kwas nukleinowy, kodujący łańcuch lekki humanizowanej immunoglobuliny specyficznie wiążącej VLA-4, o sekwencji nukleotydów SEQ ID NO: 14.

* * *