FI117509B - Humanisoituja vasta-aineita leukosyyttitarttumismolekyyliä VLA-4 vastaan - Google Patents

Description

.. s ;;.ί 117509 f 1 i

Humanisoituja vasta-aineita leukosyyttitarttumismolekyyliä VLA-4 vastaan

Tekninen ala 5 Tämä keksintö koskee yleisesti humanisoituja vasta- aineita, jotka ovat spesifisiä VLA-4-leukosyyttiadheesi-omolekyylin α-4-alayksikön suhteen.

Keksinnön tausta

Tulehdus on vaskularisoituneiden kudosten vaste 10 infektiolle tai vauriolle, ja sen saa aikaan leukosyyttien adheroituminen verisuonten endoteelisoluihin ja infiltraa-tio ympäröiviin kudoksiin. Normaalissa tulehduksessa in-filtroivat leukosyytit vapauttavat toksisia välittäjä-aineita tunkeutuvien organismien tappamiseksi, fagosytoivat 15 soluroskaa ja kuolleita soluja ja niillä on rooli kudoksen korjaamisessa ja immuunivasteessa. Patologisessa tulehduksessa infiltroivien leukosyyttien vaste on kuitenkin lii-allinen, ja ne voivat saada aikaan vakavaa tai kohtalo- 7? kasta vahinkoa. Katso esim. Hickey, Psychoneuroimmunology 20 II (Academic Press 1990).

Leukosyyttien kiinnittyminen endoteelisoluihin ta- . . pahtuu solun pinnalla olevien ligandien sekä endoteeliso- • * · ,* * lujen ja leukosyyttien pinnalla olevien reseptorien spesi- • · · .

·*!/ fisen vuorovaikutuksen kautta. Katso yleisesti Springer, *·* 25 Nature 346:425-433 (1990). Ligandien ja reseptorien iden- • · titeetti on erilainen eri solualatyyppien, anatomisten paikkojen ja tulehdusstimulusten ollessa kyseessä. Leuko- * · · ‘ syytin solupintareseptorin VLA-4 tunnisti ensin Hemler, EP-hakemusjulkaisussa 330 506 (1989) (joka liitetään tähän ; 30 viitteenä kaikkia tarkoituksia varten). VLA-4 on jäsen * · · .***. solupintareseptorien βΐ-integriiniperheessä, joista kukin » m·" sisältää a- ja β-ketjun. VLA-4 sisältää a4-ketjun ja βΐ- • Il ' ketjun. VLA-4 sitoutuu spesifisesti endoteelisoluligandiin nimeltään VCAM-1. Katso Elices ym.. Cell 60:577-584 (1990) * ··· 35 (liitetään kokonaisuudessaan viitteenä kaikkia tarkoituk- * * * * ··· • · :« • ♦ % ··· 2 :.

117509 siä varten). Vaikka VCAM-1 havaittiinkin ensimmäisen kerran aktivoiduissa ihmisen napanuoralaskimon soluissa, tämä ligandi on myös havaittu aivojen endoteelisoluissa. Katso ("commonly owned"), samaan aikaan vireillä oleva US-pa-5 tenttihakemus 07/871 223 (liitetään kokonaisuudessaan viitteenä kaikkia tarkoituksia varten).

Adheesiomolekyylit kuten VLA-4 ovat mahdollisia terapeuttisten aineiden kohteita. VLA-4-reseptori on eri- I

tyisen tärkeä kohde, koska sillä on vuorovaikutusta ligan-10 din kanssa joka sijaitsee aivojen endoteelisolujen pinnalla. Aivojen tulehduksesta johtuvilla taudeilla ja tiloilla on erityisen vakavia seurauksia. Esimerkiksi yksi sellainen tauti, multippeliskleroosi (MS), on krooninen (pahene-mis- ja remissiovaiheiden kanssa tai ilman) ja se johtaa ^ 15 vakavaan vammautumiseen ja kuolemaan. Tämä tautikohtaa arviolta 250 000 - 350 000 ihmistä pelkästään Yhdysvalloissa. o i VLA-4-reseptoria vastaan suunnattuja vasta-aineita * on tutkittu silmälläpitäen niiden potentiaalia tulehdus-20 lääkkeenä sekä in vitro että eläinmalleissa in vivo. Katso US-patenttihakemus sarjanro 07/871 223 ja Yednock ym., * · Nature 356:63-66 (1992) (liitetään kokonaisuudessaan viit- • · · .* ! teenä kaikkia tarkoituksia varten), in vitro -kokeet • « * • · · *“.* osoittavat, että VLA-4:ää vastaan suunnatut vasta-aineet 4 *·* ] 25 estävät lymfosyyttien kiinnittymisen aivojen endoteeliso- f • · · v ** '· luihin. Eläinkokeet testaavat VLA-4:ää vastaan suunnattu- f jen vasta-aineiden vaikutuksen eläimiin, joilla on keino- »t* V : tekoisesti indusoitu tila (kokeellinen autoimmuuni-enke- falomyeliitti) joka jäljittelee multippeliskleroosia. Ko- ’ : :*: 30 keet osoittavat, että VLA-4:ää vastaan suunnattujen vasta- * * t ;1 2 3· aineiden antaminen estää aivojen tulehduksen ja tämän jäi- ^ * · · keisen halvauksen eläimissä. Kollektiivisesti nämä kokeet • · · ; . f osoittavat, että VLA-4:ää vastaan suunnatut vasta-aineet ·*· 2 • * 3 ovat mahdollisesti hyödyllisiä terapeuttisia aineita mul- • - -If ♦ · · * · · · • · · • · • · • · · 117509 3 tippeliskleroosin ja muiden tulehdustautien ja -häiriöiden hoitoon.

Merkittävä ongelma tällä hetkellä saatavilla olevien, VLA-4:ää vastaan suunnattujen vasta-aineiden suhteen 5 on, että ne ovat kaikki peräisin hiirestä ja todennäköisesti saisivat näin ollen aikaan kliinisessä käytössä ih- t misen vasteen hiiren vasta-ainetta vastaan (HAMA:n). HAMA-vaste vähentää hiiren vasta-aineiden tehoa potilaissa ja estää jatkuvan antamisen. Yksi lähestymistapa tähän ongel-10 maan on humanisoida hiiren vasta-aineita. Tässä lähestymistavassa komplementaarisuuden määrääviä alueita (CDR:iä) ja tiettyjä muita aminohappoja luovuttajahiiren variaabeleista alueista siirretään ihmisen variaabeleihin aksepto-rialueisiin ja liitetään sitten ihmisen vakioalueisiin.

15 Katso esim. Riechmann ym., Nature 332:323-327 (1988); -

Winter, US 5 225 539 (1993) (joista kukin liitetään tähän viitteenä kaikkia tarkoituksia varten). > ·.>

Vaikka onkin tuotettu useita esimerkkejä humanisoi- I

duista vasta-aineista, siirtyminen hiiren vasta-aineesta 20 humanisoituun vasta-aineeseen sisältää keskenään kilpailevien seikkojen kompromissin, johon ratkaisu vaihtelee eri vasta-aineilla. Immunogeenisyyden minimoimiseksi immuno- • * · globuliinissa pitäisi säilyttää niin paljon ihmisen aksep- • * * torisekvenssiä kuin mahdollista. Autenttisten sitoutumis- • * * *;* [ 25 ominaisuuksien säilyttämiseksi immunoglobuliinin runko- * * * '· *: osan pitäisi kuitenkin sisältää riittävästi ihmisen aksep- t • · · · M.* torisekvenssin substituutioita sen varmistamiseksi, että ··· V : CDR-alueiden kolmiulotteinen konformaatio on niin lähellä kuin mahdollista alkuperäisessä hiiren luovutteja-immuno-30 globuliinissa olevaa sekvenssiä. Näiden keskenään kilpai-levien seikkojen tuloksena monilla tähän mennessä tuote- • · · .1. tuilla humanisoiduilla vasta-aineilla ilmenee jonkin ver- * * · ran sitoutumisaffiniteetin menetystä verrattuna niihin • · **··* vastaaviin hiirivasta-aineisiin, joista ne on johdettu.

*:* 35 Katso esim. Jones ym., Nature 321:522-525 (1986); Shearman ···· • · · • · • · ··· 117509 4 '£ ym., J, Immunol. 147:4366-4373 (1991); Kettleborough ym.,

Protein Engineering 4:773-783 (1991); Gorman ym., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest ym., Biotechnology 9:226-271 (1991).

5 Edellä mainitun perusteella on ilmeistä, että on olemassa tarve humanisoiduille VLA-4-vasta-aineille, joissa ilmenee voimakas affiniteetti VLA-4-reseptoriin, samalla kun niissä ilmenee vähän tai ei yhtään ihmisen vastetta hiiren vasta-ainetta kohtaan. Tämä keksintö täyttää nämä 10 ja muut tarpeet.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa humanisoituja immunoglobulii-neja, jotka sitoutuvat spesifisesti VLA-4-ligandiin. Humanisoidut vasta-aineet käsittävät humanisoidun kevytketjun 15 ja humanisoidun raskasketjun. Humanisoitu kevytketju kä sittää kolme komplementaarisuuden määräävää aluetta (CDR1, CDR2, CDR3) joilla on aminohapposekvenssejä, jotka ovat ; peräisin hiiren 21-6-immunoglobuliinin kevytketjun vastaa- » vista komplementaarisuuden määräävistä alueista, ja vari-20 aabelin alueen runko-osan joka on peräisin ihmisen kappa-kevytketjun variaabelin alueen runko-osan sekvenssistä, SS' paitsi ainakin yhdessä asemassa, joka on valittu ensimmäi- • · · .* ’ sestä ryhmästä, joka koostuu asemista L45, L49, L58 ja • · · . ·?, ·*·/ L69, jossa aminohappoasema on täytetty samalla aminohapol- ♦ * · *** * 25 la joka on läsnä ekvivalentissa asemassa hiiren 21-6-immu- • · • · * *. *! noglobuliinin kevytketjun variaabelin alueen runko-osassa. s • .··'·.· -¾ ·,:.· Humanisoitu raskasketju käsittää kolme komplementaarisuu- 0 i den määräävää aluetta (CDR1, CDR2 ja CDR3) joilla on ami nohapposekvenssejä, jotka ovat peräisin hiiren 21-6-immu- •:*· 30 noglobuliinin raskasketjun vastaavista komplementaarisuu- ·»· .1. den määräävistä alueista, ja variaabelin alueen runko-osan ··· joka on peräisin ihmisen raskasketjun variaabelin alueen i • * · 'l* * runko-osan sekvenssistä, paitsi ainakin yhdessä asemassa, » joka voi olla H27, H28, H29, H30, H44, H71, jossa amino- ··· 35 happoaseman täyttää sama aminohappo joka on läsnä hiiren • · · * ··« • · • · • · · 117509 s 21-6-immunoglobuliinin raskasketjun variaabelin alueen runko-osan ekvivalentissa asemassa. Nämä immunoglobuliinit sitoutuvat spesifisesti VLA-4:ään affiniteetilla, jonka alaraja on noin 107 M"1 ja yläraja noin viisi kertaa hiiren 5 21-6-immunoglobuliinin affiniteetti.

Humanisoidut kevyt- ja raskasketjun variaabelin alueen runko-osat ovat tavallisesti peräisin REl:n ja vastaavasti 21/28’CL:n variaabelin alueen runko-osan sekvensseistä. Kun humanisoitu kevytketjun variaabelin alueen 10 runko-osa on peräisin REl:stä, ainakin kaksi runko-osan aminohappoa korvataan. Yksi aminohappo on peräisin edellä kuvatusta ensimmäisestä asemien ryhmästä. Toiset aminohapot on peräisin kolmannesta ryhmästä, joka koostuu asemista L104, L105 ja L107. Tämä asema on täytetty samalla ami-15 nohapolla, joka on läsnä ekvivalentissa asemassa kappa- kevytketjussa joka on peräisin muusta ihmisen immunoglo-buliinista kuin RE1. -

Joillakin humanisoiduilla immunoglobuliineilla on t kypsä kevytketjun variaabelin alueen sekvenssi, jolle on 20 annettu nimeksi La tai Lb kuviossa 6, tai kypsä raskasketjun variaabelin alueen sekvenssi jolle on annettu nimeksi t • . Ha, Hb tai He kuviossa 7. Edullisiin humanisoituihin immu- • « a • * · * noglobuliineihin kuuluvat ne joilla on La-kevytketju ja • * * Xj *"#* Ha-, Hb- tai Hc-raskasketju.

'·* | 25 Keksintö tarjoaa myös edellä kuvattujen, VLA-4:ää • · a *. *! vastaan suunnattujen humanisoitujen immunoglobuliinien *.·.· sitovia fragmentteja.

• * * ! Toisessa aspektissa keksintö tarjoaa nukleiinihap- poja, jotka koodattavat edellä kuvattuja, VLA-4:ää vastaan ; 30 suunnattuja humanisoituja immunoglobuliineja.

a a a .*·. Tarjotaan myös tietokoneita, jotka on ohjelmoitu • a a tlm näyttämään hiiren 21.6-vasta-aineen tai edellä kuvattujen f • · · *·* * humanisoitujen immunoglobuliinien kolmiulotteisia kuvia.

* ·

Toisessa aspektissa keksintö tarjoaa farmaseuttisia 1 35 koostumuksia ja hoitomenetelmiä joissa niitä käytetään.

• · · · • · a a ....

• · • aa Λ 117509 6

Farmaseuttisiin koostumuksiin kuuluu edellä olevan kuvauksen mukainen humanisoitu immunoglobuliini tai sitova fragmentti, ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja. Joissakin hoitomenetelmissä farmaseuttisen koostumuksen tera-5 peuttisesti tehokas määrä annetaan potilaalle joka kärsii .¾ tulehdustaudista, kuten multippeliskleroosista.

Tarjotaan myös menetelmiä VLA-4-antigeenin havaitsemiseen, joissa käytetään edellä kuvattuja humanisoituja immunoglobuliineja ja sitovia fragmentteja. Näissä mene-10 telmissä humanisoitu vasta-aine tai sitova fragmentti annetaan potilaalle tai tästä peräisin olevalle kudosnäytteelle. Havaitaan kompleksit, jotka muodostuvat vasta-aineen tai fragmentin ja näytteessä peräisin olevan VLA-4:n välisen spesifisen sitoutumisen tuloksena.

15 Kuvioiden lyhyt kuvaus f

Kuvio 1 hiiren 21.6-kevytketjun variaabelin alueen DNA-sekvenssi (SEQ ID nro 1) ja aminohapposekvenssi (SEQ | ID nro 2).

Kuvio 2 hiiren 21.6-raskasketjun variaabelin alueen 20 DNA-sekvenssi (SEQ ID nro 3) ja aminohapposekvenssi (SEQ ID nro 4).

Kuvio 3 kevytketjun (A) ja raskasketjun (B) eks- * * · ; pressiovektorit, joita käytetään tuottamaan nisäkässoluis- "J.j sa kimeerisiä ja uudelleen muovattuja ihmisvasta-aineita, • · · * . 25 joissa on ihmisen kappa-kevytketjut ja ihmisen γ-1-raskas- » · *· / ketjut. 4 • « · *·!·* Kuvio 4 ELISA: 11a tehty vertailu kimeerisen ja hii- ···'.< '.* * ren 21.6-vasta-aineen sitoutumisesta L-soluihin jotka eks- pressoivat ihmisen a4pl-integriiniä pinnallaan, ϊ.ϊ^ϊ 30 Kuvio 5 molekyylimalli hiiren 21.6-vasta-aineen variaabeleista alueista. Erityisen mielenkiintoiset amino- ' • · · happotähteet on merkitty.

* · ·

Kuvio 6 hiiren ja uudelleenmuovatun ihmisen 21.6 • * *;· (SEQ ID nro 5) -kevytketjun variaabeleiden alueiden amino- t#*j* 35 happosekvenssien vertailut. Aminohappotähteet, jotka ovat • · · » • ♦ • · · 117509 ' 7 osa Chothian kanonisia sekvenssejä CDR-silmukkarakenteiden suhteen, on merkitty asteriskilla. REI (SEQ ID nro 6) osoittaa FR:t ja CDR:t ihmisen REI-kevytketjun VL-alueesta.

La (SEQ ID nro 7) ja Lb (SEQ ID nro 8) ovat kaksi versiota %

5 uudelleen muovatusta ihmisen 21.6:n VL-alueesta. Ne amino- I

happotähteet La:n FRrissä, jotka eroavat REI-sekvenssistä olevista, on alleviivattu. Lb:ssä esitetään vain ne runko-osa-alueissa olevat aminohappotähteet, jotka eroavat REI:ssä olevista.

10 Kuvio 7 hiiren ja uudelleen muovatun ihmisen 21.6 (SEQ ID nro 9) -raskasketjun variaabeleiden alueiden aminohapposekvenssien vertailuja. Ne aminohapposekvenssit, jotka ovat osa kanonisia sekvenssejä Chothian CDR-silmuk-karakenteiden suhteen, on merkitty asteriskilla. 2*CL (SEQ f 15 ID nro 10) esittää FR:t ja CDR:t ihmisen 21/28'CL-vasta-aineen VH-alueesta. Ha (SEQ ID nro 11), Hb (SEQ ID nro 12) ja He (SEQ ID nro 13) ovat kolme versiota uudelleen muo-vatusta ihmisen 21.6:n VH-alueesta. Ne aminohappotähteet ?

Ha:n FR:issä, jotka eroavat 21/28'CL-sekvenssissä olevis-20 ta, on alleviivattu. Hb:ssä ja He:ssä esitetään vain ne runko-osa-alueissa olevat aminohappotähteet, jotka eroavat ,·.·. 21/28'CL:ssä olevista. ; • * · ^ Kuvio 8 uudelleenmuovatun ihmisen 21.6-kevytketjun “I.* variaabelin alueen version "a" PCR-pohjainen konstruktio.

« · « • ) 25 Katkoviivat osoittavat ainakin 21 emäksen komplementaari- • · · *· *· sen sekvenssin alukkeiden välissä. ' • ' • · · -:»

Kuvio 9 uudelleenmuovatun ihmisen 21.6-raskasketjun ··» : variaabelin alueen version "a" PCR-pohjainen konstruktio.

Kuvio 10 uudelleenmuovatun ihmisen 21.6-kevytketjun : .· : 30 variaabelin alueen version "a" cDNA- ja aminohapposekvens- ·***· sit (SEQ ID nro 14 ja 15).

··· .1. Kuvio 11 uudelleenmuovatun ihmisen 21.6-raskasket- ? • · · jun variaabelin alueen version "a" cDNA- ja aminohapposek- Φ *···* venssit (SEQ ID nro 16 ja 17).

··· ···· · · • · • · ··· 117509 : g

Kuvio 12 ELISA-vertailu kimeerisen ja uudelleenmuo-vatun ihmisen 21.6-vasta-aineen välillä, silmälläpitäen sitoutumista L-soluihin jotka ekspressoivat ihmisen α4β1-integriiniä pinnallaan.

5 Kuvio 13 hiiren 21.6-vasta-aineen vertailu erilai sen VLA-4:ää vastaan suunnatun vasta-aineen, L25:n, kanssa. Osakuva A vertailee vasta-aineiden kykyä estää mono-syyttisten U937-solujen sitoutumista puhdistettuun VCA-l:een Mn2+:n läsnä- ja poissaollessa. Osakuva B vertailee 10 vasta-aineiden kykyä estää Jurkat-solujen sitoutumista kasvaviin pitoisuuksiin VCAM-l:tä.

Kuvio 14 painon laskun viivästyminen eläimissä, joita on hoidettu hiiren tai ihmisen 21.6-vasta-aineella.

Kuvio 15 kliinisten oireiden väistyminen eläimissä, * 15 joita on hoidettu hiiren tai ihmisen 21.6-vasta-aineella. j

Kuvio 16 painon laskun kääntyminen nousuksi eläimissä, joita on hoidettu hiiren tai ihmisen 21.6-vasta-aineella.

Määritelmät 20 Lyhenteet kahdellekymmenelle luonnossa ilmenevälle aminohapolle noudattavat tavanomaista käytäntöä (Immuno- | logy - A Synthesis (2. laitos, toim. E.S. Golub & D.R.

* · · .* I Gren, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Kahden- • · · • · « ***.· kymmenen tavanomaisen aminohapon stereoisomeerit (esim. D- I · i ] 25 aminohapot), epäluonnolliset aminohapot kuten α,α-disubs- • · · *· "· tituoidut aminohapot, N-alkyyliaminohapot, maitohappo ja r muut epätavalliset aminohapot voivat myös olla soveliaita • · · V : komponentteja tämän keksinnön mukaisille polypeptideille.

Epätavallisista aminohapoista esimerkkejä ovat: 4-hydrok- : 30 siproliini, v-karboksiglutamiinihappo, e-N,N,N-trimetyyli- • · « ·1· lysiini, 6-N-asetyylilysiini, O-fosfoseriini, N-asetyy- • · * liseriini, N-formyylimetioniini, 3-metyylihistidiini, 5- • · · *·^* hydroksilysiini, ω-Ν-metyyliarginiini, ja muut samanlaiset · *···* aminohapot ja iminohapot (esim. 4-hydroksiproliini). Li- · .

«··· ··· • · · • · # 117509 : 9 säksl aminohappoja voidaan modifioida glykosylaatiolla, fosforylaatiolla ja vastaavilla.

Tässä käytetyssä polypeptidien merkintäjärjestelmässä vasen suunta on aminoterminaalinen suunta ja oikea 5 suunta on kerhoksiterminaalinen suunta, standardinomaisen käyttötavan ja käytännön mukaisesti. Samoin, ellei toisin ilmaista, yksijuosteisten polynukleotidisekvenssien vasen pää on 5'-pää, kaksijuosteisten polynukleotidisekvenssien vasempaan suuntaan viitataan nimellä 5'-suunta. Suuntaan 10 jossa syntyviä RNA-transkriptiotuotteita lisätään 5 1 — 3 2 — suunnassa, viitataan nimellä transkriptiosuunta? niihin sekvenssialueisiin DNA-juosteessa, joilla on sama sekvenssi kuin RNA:lla ja jotka ovat 5'-suunnassa RNA-transkrip-tiotuotteen 5'-päästä katsoen, viitataan nimellä "ylävir-15 ran sekvenssit"; niihin sekvenssialueisiin DNA-juosteessa, ί joilla on sama sekvenssi kuin RNAjlla ja jotka ovat 3'-suunnassa RNA-transkriptiotuotteen 3' -päästä katsoen, vii-tataan nimellä "alavirran sekvenssit".

Ilmaisu "polynukleotidisekvenssi" viittaa yksi- tai 20 kaksijuosteiseen deoksiribonukleotidi- tai ribonukleotidi-emästen polymeeriin, joka luetaan 5'-päästä 3'-päähän. Se sisältää itsereplikoituvat plasmidit, DNA:n tai RNA:n in- • · i 1 : ,·, fektiokykyiset polymeerit sekä ei-funktionaalisen DNA:n tai RNA: n. ,ft.

• · · .

• · · \ , 25 Seuraavia termejä käytetään kuvaamaan sekvenssisuh- • · · / teitä kahden tai useamman polynukleotidin välillä: "refe- ··:.. ·/2 *···1 renssisekvenssi", "vertailuikkuna", "sekvenssi-identiteet- 2 · · · '.2 1 ti", "sekvenssi-identiteettiprosentti", ja "oleellinen identiteetti". "Referenssisekvenssi" on määritelty sek- 30 venssi jota käytetään pohjana sekvenssien vertailussa; ;3: referenssisekvenssi voi olla isomman sekvenssin alajoukko, f .j. esimerkiksi sekvenssilistauksessa annetun täyspitkän • · · ' I,. cDNA: n tai geenisekvenssin, kuten kuvioiden 1, 2 tai 3 * · *·;·1 polynukleotidisekvenssin, segmentti, tai se voi käsittää 3 *!1 35 kokonaisen DNA- tai geenisekvenssin. Yleensä referenssi- • · 1 • t • 1 • · · 117509 10 sekvenssi on ainakin 20 nukleotidin pituinen, usein ainakin 25 nukleotidin pituinen, ja usein ainakin 50 nukleotidin pituinen. Koska kaksi polynukleotidia saattavat kumpikin 1) sisältää sekvenssin (se on: osan kokonaisesta poly- s 5 nukleotidisekvenssistä) joka on samanlainen kahden poly-nukleotidin välillä, ja 2) voivat lisäksi käsittää sekvenssin joka on eroava kahden polynukleotidin välillä, sekvenssivertailut kahden (tai useamman) polynukleotidin välillä suoritetaan tyypillisesti vertailemalla kahden 10 polynukleotidin sekvenssejä "vertailuikkunassa" jotta saataisiin tunnistettua ja vertailtua paikallisia, sekvenssiltään samankaltaisia alueita. "Vertailuikkuna" tässä käytettynä viittaa käsitteelliseen segmenttiin, joka on s ainakin 20 nukleotidiaseman yhtenäinen jakso, jossa poly-15 nukleotidisekvenssiä voidaan verrata ainakin 20 yhtenäisen nukleotidin muodostamaan referenssisekvenssiin, ja jossa osa polynukleotidisekvenssistä vertailuikkunassa voi kä- ^ sittää additioita tai deleetioita (se on: aukkoja), jotka ovat kooltaan 20 prosenttia tai vähemmän, verrattuna refe-20 renssisekvenssiin (joka ei sisällä additioita tai deleetioita ), kahden sekvenssin optimaalista kohdakkainasetusta varten. Optimaalinen sekvenssien kohdakkainasetus vertai- • · * .*I luikkunan kohdakkainasetusta varten voidaan suorittaa • · · • · « *".* Smithin ja Watermanin paikallisen homologian algoritmilla, • · · *·* | 25 Adv. Appi. Math. 2:482 (1981), Needlemanin ja Wunschin « · « *· “ homologian kohdakkainasetusalgoritmilla, J. Mol. Biol.

48:443 (1970), Pearsonin ja Lipmanin samankaltaisuuden • · · V : etsintämenetelmällä, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:2444 (1988) (joista kukin liitetään tähän viitteenä kaikkia : 30 tarkoituksia varten), näiden algoritmien tietokoneavuste!- ··· ;***. sella suorittamisella (GAP, BESTFIT, FASTA ja TFASTA, Wis- ··· -I- consin Genetics Software Package Release 7*0, Genetics • · ·

Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) tax tarkas- • * *···* telemalla, ja valitaan paras kohdakkainasetus (se on: joka •j* 35 tuottaa sekvenssin samankaltaisuuden korkeimman prosentti- «·»* ··· • · • 9 ··· 11 ' 117509 osuuden vertailuikkunassa), joka saadaan tuotettua eri menetelmillä. Termi "sekvenssi-identiteetti" tarkoittaa että kaksi polynukleotidisekvenssiä ovat identtisiä (se on: nukleotidi nukleotidilta) vertailuikkunassa. Termi "i -"••i 5 "sekvenssi-identiteettiprosentti" lasketaan vertailemalla kahta optimaalisesti kohdakkainasetettua sekvenssiä vertailuikkunassa, määrittämällä niiden asemien lukumäärä joissa identtinen nukleiinihappoemäs (esim. A, T, C, G, U tai I) ilmenee molemmissa sekvensseissä, jolloin saadaan 10 samanlaisten asemien lukumäärä, jakamalla samanlaisten asemien lukumäärä vertailuikkunassa olevien asemien kokonaismäärällä (se on: ikkunan koolla), ja kertomalla tulos 100:11a jolloin saadaan sekvenssi-identiteettiprosentti.

Termit "oleellinen identiteetti" tässä käytettynä merkit-15 see polynukleotidisekvenssin ominaisuutta, jossa polynuk- leotidi käsittää sekvenssin jolla on ainakin 85-prosent-tinen sekvenssi-identiteetti, edullisesti ainakin 90 - 95- |

prosenttinen sekvenssi-identiteetti, tavallisemmin ainakin 99-prosenttinen sekvenssi-identiteetti verrattuna refe-20 renssisekvenssiin vertailuikkunassa, jossa on ainakin 20 nukleotidiasemaa, yleensä ikkunassa jossa on ainakin 25 -50 nukleotidia, jolloin sekvenssi-identiteetin prosentti- I

l't*t osuus lasketaan vertaamalla referenssisekvenssiä polynuk- 7 • · · *«.* leotidisekvenssiin, joka voi sisältää deleetioita tai • i t ; , 25 additioita, jotka ovat yhteensä 20 prosenttia tai vähemmän « · · *· " referenssisekvenssistä vertailuikkunassa. Referenssisek- • -a, • · · *·!·* venssi voi olla alajoukko isommasta sekvenssistä, esimer- * * * *.* * kiksi sekvenssistä joka esitetään kuviossa 1 tai 2.

Polypeptideihin sovellettuna termi "sekvenssi-iden- ί^ΐ 30 titeetti" tarkoittaa että peptideillä on identtisiä amino- :***: happoja vastaavissa asemissa. Termi "sekvenssin samankal- • * * taisuus" tarkoittaa että peptideillä on identtisiä tai > * « · samankaltaisia aminohappoja (se on: konservatiivisia subs- • · *;** tituutioita) vastaavissa asemissa. Termi "oleellinen iden- βϊ*ί· 35 titeetti" tarkoittaa, että kahdella peptidisekvenssillä, • t* • · • · -··· ; 12 1 1 7509 kun ne on asetettu optimaalisesti kohdakkain, kuten ohjelmilla GAP ja BESTFIT oletusarvoisia aukon painotuksia ("gap weights") käyttäen, on ainakin 80 prosentin sekvenssi-identiteetti, edullisesti ainakin 90 prosentin sekvens-5 si-identiteetti, edullisemmin ainakin 95 prosentin sek- f venssi-identiteetti tai enemmän (esim. 99 prosentin sekvenssi-identiteetti). Aminohappotähteen asemat, jotka eivät ole identtisiä, eroavat edullisesti konservatiivisilla aminohapposubstituutioilla. Termi "oleellinen samankaltai-10 suus" tarkoittaa että kahdella peptidisekvenssillä on vas- > taavat sekvenssin samankaltaisuusprosentit.

Termi "oleellisen puhdas" tarkoittaa että kohteena oleva laji on vallitseva läsnäoleva laji (se on: molaari-sella perusteella se on runsaampi kuin mikään muu yksit- ? 15 täinen laji koostumuksessa), ja edullisesti oleellisen puhdas fraktio on koostumus, jossa kohteena oleva laji käsittää ainakin noin 50 % (molaarisella perusteella) kai- > kista läsnä olevista makromolekulaarisista lajeista.

Yleensä oleellisen puhdas koostumus käsittää enemmän kuin 20 noin 80 - 90 % kaikista koostumuksessa läsnä olevista mak-romolekyylilajeista. Edullisimmin kohteena oleva laji puh- distetaan oleellisen homogeeniseksi (kontaminoivia lajeja • · · ^ .* * ei voida havaita koostumuksesta tavanomaisilla havaitsemis ♦ · · •*j/ menetelmillä), jolloin koostumus koostuu oleellisesti yh- ^ • · · *·* * 25 destä makromolekyylilajista.

* · .

·.**: Aminohappojen substituutioiden luokittelemiseksi ·.·,· konservatiivisiksi tai ei-konservatiivisiksi aminohapot • ·

i#i ϊ ryhmitellään seuraavasti: ryhmä I (hydrofobiset sivuketjut): norleusiini, met, ala, vai, leu, ile; ryhmä II

j ·*; 30 (neutraalit hydrofiiliset sivuketjut): cys, ser, thr; ryh- **· · .***. mä III (happamat sivuketjut): asp, glu; ryhmä IV (emäksi- • · .V? ; set sivuketjut): asn, gin, his, lys, arg; ryhmä V (amino- ? • ft *.' * happotähteet jotka vaikuttavat ketjun orientaatioon): gly, • * * ·...* pro; ja ryhmä VI (aromaattiset sivuketjut): trp, tyr, phe.

35 Konservatiivisiin substituutioihin kuuluvat substituutiot • · · • · ··· ! 117509 13 samassa luokassa olevien aminohappojen välillä. Ei-konser-vatiiviset substituutiot ovat sellaisia että yksi näiden luokkien jäsen vaihdetaan toisen luokan jäseneen.

Immunoglobuliinien kypsien raskas- ja kevytketjujen | 5 variaabeleista alueista peräisin olevat aminohapot merki- ^ tään nimellä Hx ja vastaavasti Lxx, jossa x on numero joka merkitsee aminohapon aseman Rabatin ym. kaavion mukaisesti, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) ja 10 (1991)) (johon viitataan täten kollektiivisesti nimellä "Rabat ym.", ja joka liitetään tähän viitteenä kaikkia tarkoituksia varten). Rabat ym. luettelevat monia aminohapposekvenssejä vasta-aineille kutakin alaluokkaa silmälläpitäen, ja luettelevat yleisimmin ilmenevän aminohapon f 15 kullekin aminohappotähdeasemalle tässä alaluokassa. Rabat ym. käyttävät menetelmää, jossa annetaan aminohappotähteen numero kullekin aminohapolle luetellussa sekvenssissä, ja j tämä menetelmä jossa annetaan aminohappotähdenumeroita, on £ tullut alan standardiksi. Kabatin ym. kaavio on laajennet-20 tavissa muihinkin vasta-aineisiin, jotka eivät ole mukana yhteenvedossa, siten että kyseinen vasta-aine asetetaan . . kohdakkain yhden Rabatin ym. luettelossa olevan konsensus- 2 ,* * sekvenssin kanssa. Rabatin ym. numerointijärjestelmän • · * : käyttö tunnistaa helposti aminohappoja ekvivalenteissa • φ · *.* * 25 asemissa eri vasta-aineissa. Esimerkiksi ihmisen vasta- * » *.*·: aineen L50-asemassa oleva aminohappo täyttää ekvivalenssi- ;

• J

!,.! aseman suhteessa hiiren vasta-aineen aminohappoasemaan L50.

Yksityiskohtainen kuvaus . 30 I. VLA-4:lle spesifisiä humanisoituja vasta-aineita • t · .*··. Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa tarjotaan huma- * * '*·* nisoituja immunoglobuliineja (tai vasta-aineita), jotka *.* * ovat spesifisiä VLA-4:n α-4-alayksikölle. Humanisoiduilla • · · :...· vasta-aineilla on variaabeleita runko-osa-alueita, jotka .:. 35 ovat oleellisesti peräisin ihmisen immunoglobuliinista • · * · »t* • · • · • · · 117509 14 (jolle annetaan nimeksi akseptori-immunoglobuliini) ja komplementaarisuuden määräävät alueet, jotka ovat oleellisesti peräisin hiiren immunoglobuliinista nimeltään μ mAb 21.6 (johon viitataan nimellä donori-immunoglobuliini).

5 Vakioalue(et), jos läsnä, ovat myös oleellisesti peräisin ihmisen immunoglobuliinista. Humanisoiduilla vasta-aineilla on spesifinen sitomisaffiniteetti VLA-4:lle joka on ai- ^ nakin ΙΟ7, ΙΟ8, 109 tai 1010 M"1. Humanisoitujen VLA-4-vasta-aineiden sitoutumisaffiniteetin yläraja on yleensä 10 enintään kolme tai viisi kertaa suurempi kuin μ MAb 21.6:11a (noin 109 M-1). Usein sitomisaf f initeetin alaraja on myös alhaisintaan kolmas- tai viidesosa μ MAb 21.6:sta.

A. Immunoglobuliinien yleisiä ominaisuuksia Vasta-aineen perusrakenneyksikön tiedetään muodos-15 tavan tetrameerin. Kukin tetrameeri koostuu kahdesta : identtisestä polypeptidiketjuparista, jolloin kummassakin parissa on yksi "kevyt" (noin 25 kDa) ja yksi "raskas" ; ketju (noin 50 - 70 kDa). Kunkin ketjun aminoterminaalinen osa käsittää noin 100 - 110 aminohapon pituisen variaabe-20 Iin alueen, joka on etusijassa vastuussa antigeenin tunnistuksesta. Kunkin ketjun karboksiterminaalinen osa mää-rittää vakioalueen, joka on etusijassa vastuussa efektori- * * * νΉ * toiminnosta.

♦ · · ·.'···...> •*1/ Kevytketjujen luokka on joko kappa tai lambda. Ras- • · · *·* * 25 kasketjujen luokat ovat γ, μ, a, Δ tai e, ja ne määrittä- • · · ” vät vasta-aineen isotyypin IgGiksi, IgM:ksi, IgA:ksi, ♦ · *.·.· IgD:ksi tai vastaavasti IgE:ksi. Raskas- ja kevytketjujen ·*· ί.Σ ϊ sisällä variaabelit ja vakioalueet liittyvät yhteen noin 12 tai useamman aminohapon pituisella "J"-alueella, ja • 30 raskasketju sisältää myös "D"-alueen jossa on noin 10 • · · .1. enemmän aminohappoa. (Katso yleisesti Fundamental Immuno- ' \ίζ

*···* "I

logy (toim. Paul, W., 2. laitos, Raven Press, N.Y., 1989), ί • · · *·[ kappale 7 (sisällytetään viitteenä kokonaisuudessaan kaik- • · *···* kia tarkoituksia varten).

♦ ·*· ··· » · • · ··· 117509 15

Kunkin kevyt/raskasketj u-parin variaabelit alueet muodostavat vasta-aineen sitovan kohdan. Ketjuilla on kaikilla sama yleinen rakenne, jossa suhteellisen konservoi-tuneita runko-osa-alueita (FR) liittää toisiinsa kolme f 5 hypervariaabelia aluetta, joita kutsutaan myös nimellä * komplementaarisuuden määräävät alueet tai CDR:t. Kummankin parin kahdesta ketjusta peräisin olevat CDR:t asettuvat kohdakkain runko-osa-alueiden vuoksi, mikä mahdollistaa sitoutumisen spesifiseen epitooppiin. CDR- ja FR-aminohap-10 potähteet kuvataan edellä mainitun Kabatin ym. laatiman standardinomaisen sekvenssimääritelmän mukaisesti. Vaihtoehtoisen rakenteellisen määritelmän on ehdottanut Chothia ym., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Nature 342:878-883 (1989) ja J. Mol. Biol. 186:651-663 (1989) (joihin viita-15 taan tästedes kollektiivisesti nimellä "Chothia ym.", ja jotka liitetään tähän viitteenä kaikkia tarkoituksia varten). Kun runko-osa-asemat, määriteltynä edellä mainitun |

Kabatin ym. mukaisesti, jotka muodostavat rakenteellisia f silmukan asemia edellä mainitun Chothian ym. määritelmän 20 mukaisesti, hiiren vasta-aineessa läsnä olevat aminohapot sisällytetään yleensä humanisoituun vasta-aineeseen.

B. Humanisoitujen vasta-aineiden tuotanto ! 1. Hiiren MAb 21.6 ···''''- ·“ • · · ”*.* Lähtömateriaali humanisoitujen vasta-aineiden tuo- # • · ♦ *·* \ 25 tantoon on μ MAb 21.6. Tämän vasta-aineen eristys ja omi- • · · *♦ " naisuudet kuvataan US-patenttihakemuksessa sarjanro 07/ 871 223:ssa. Lyhyesti ilmaisten, μ MAb 21.6 on spesifinen • · · · VLA-4:n α-4-alayksikölle ja sen on osoitettu inhiboivan ihmisen lymfosyytin sitoutumista sellaisiin rotan aivoso- :30 lukudosviljelmiin, joita on stimuloitu tuumorinekroosifak-• · * :***; torilla, μ MAb 21.6-vasta-aineen raskas- ja kevytketjun i • · · .;. variaabeleja alueita koodattavan cDNA:n kloonaus ja sek- ' • · · vensointi kuvataan esimerkissä 1, ja nukleotidisekvenssi • · *“·’ ja ennustettu aminohapposekvenssi esitetään kuvioissa 1 ja •j* 35 2. Nämä kuviot esittävät myös havainnollisesti aminohappoa • · · • · * · ··· 16 1 1 7509 koodittavan sekvensoinnin alajaon runko-osa-domeeneihin ja komplementaarisuuden määrääviin domeeneihin. N-päästä C-pään suuntaan, molemmat kevyt- ja raskasketjut sisältävät domeenit FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 ja FR4. Aminohap-5 pojen sijoitus kuhunkin domeeniin noudattaa edellä mainit- ? tua Kabatin ym. numerointitapaa. | 2. Runko-osan aminohappotähteitä tarjoavien ihmis-vasta-aineiden valinta

Hiiren CDR;ien sijoitus ihmisen variaabelin domee-10 nin runko-osaan johtaa mitä todennäköisimmin niiden oikean avaruudellisen orientaation säilymiseen, jos ihmisen variaabelin domeenin runko-osa ottaa saman tai samanlaisen konformaation kuin se hiiren variaabeli runko-osa, josta CDR:t olivat peräisin. Tämä saadaan aikaan hankkimalla f 15 ihmisen variaabelit domeenit ihmisvasta-aineista, joiden runko-osan sekvensseissä ilmenee korkea sekvenssi-identi-teettiaste niiden hiiren variaabelien runko-osa-domeenien kanssa, joista CDR:t olivat peräisin. Raskas- ja kevytket- ί jun variaabelit runko-osa-alueet voivat olla peräisin sa-20 moista tai erilaisista ihmisen vasta-aine-sekvensseistä.

Ihmisen vasta-aine-sekvenssit voivat olla luonnossa ilme- nevien ihmisvasta-aineiden sekvenssejä, tai ne voivat olla • · · 1> .* useiden ihmisvasta-aineiden konsensussekvenssejä. Katso · • * · .* *".* Kettleborough ym., Protein Engineering 4:773 (1991); Koi- • · · *·* | 25 binger ym., Protein Engineering 6:971 (1993).

• · · *· *! Soveliaita ihmisvasta-aine-sekvenssejä tunnistetaan vertailemalla tietokoneella hiiren variaabelien alueiden • · ♦ V 2 aminohapposekvenssejä tunnettujen ihmisvasta-aineiden sek - vensseihin. Vertailu suoritetaan erikseen raskas- ja ke- ♦;'· 30 vytketjuille, mutta periaatteet ovat molemmille samanlai- ·« · siä. Tämä vertailu tuo ilmi, että hiiren 21.6:n kevytket- f • · · julla ilmenee suurin sekvenssi-identiteetti sellaisten • · · *·[/ ihmisen kevytketjujen suhteen jotka ovat alatyyppiä kappa • * *···* 1, ja että μ 21.6:n raskasketjulla ilmenee suurin sek- ·;· 35 venssi-identiteetti sellaisten ihmisen raskasketjujen suh- • · * * *·· • · * · ··· 1 1 7509 n teen jotka ovat alatyyppiä yksi, edellä mainitun Kabatin ym. luettelon mukaisesti. Niinpä ihmisen kevyt- ja raskas-ketjun runko-osa-alueet ovat yleensä peräisin näihin ala- tyyppeihin kuuluvista ihmisvasta-aineista, tai sellaisten ΐ . :¾

5 alatyyppien konsensussekvensseistä. Edulliset ihmisen raskas- ja kevytketjun variaabelit alueet, joissa ilmenee suurin sekvenssi-identiteetti μ MAb 21.6:sta peräisin olevien vastaavien alueiden suhteen, ovat peräisin vasta-ai- J

neista RE1 ja vastaavasti 21/28'CL.

10 3. Tietokonemallitus

Hiiren CDR-alueiden epäluonnollinen rinnanasetus ihmisen variaabelin runko-osa-alueen kanssa voi johtaa epäluonnollisiin konformaatiorajoituksiin, jotka, ellei niitä korjata tiettyjen aminohappotähteiden substituutiol- f 15 la, johtavat sitoutumisaffiniteetin menetykseen. Aminohappotähteiden valinta substituutiota varten määritetään osaltaan tietokonemallituksella. Tietokonelaitteisto ja t ohjelmisto immunoglobuliinimolekyylien kolmiulotteisten kuvien tuottamiseksi on laajalti saatavilla. Yleensä mole-20 kyylimalleja tuotetaan alkaen ratkaistuista rakenteista immunoglobuliiniketjuille tai niiden domeeneille. Malli-tettavia ketjuja verrataan aminohapposekvenssin samankal- * · · .

j*^ taisuutta silmälläpitäen ketjuihin tai domeeneihin, joiden s · · ,..-¾.

“I.* kolmiulotteiset rakenteet on ratkaistu, ja ne ketiut tai - « » · • ♦ · * . 25 domeenit, joissa ilmenee suurin sekvenssin samankaltai- • · ♦ -r *· *· suus, valitaan lähtökohdiksi molekyylimallin muodostamista |

• · · F

*·ί·* varten. Esimerkiksi μ MAb 21.6:n kevytketjua varten läh- • * * : tökohta runko-osa-alueiden, CDR1- ja CDR2-alueiden, malli tusta varten oli ihmisen kevytketju RE1. CDR3-aluetta var-: 30 ten lähtökohta oli CDR3-alue joka oli peräisin erilaisen ·1: ihmisvasta-aineen HyHEL-5:n kevy tket j usta. Ratkaistuja ; ···'·.

lähtörakenteita modifioidaan niin että sallitaan erot mal- • · · • · * · *; litettavissa iminunoglobuliiniketjuissa tai -domeeneissa i • « -¾ *“·* olevien todellisten aminohappojen ja lähtörakenteessa ole- :l *:* 35 vien välillä. Modifoidut rakenteet kootaan sitten yhdiste- ·· • · ♦ · 18 : 117509 tyksi immunoglobuliiniksi. Lopuksi mallia hiotaan energia-minimoinnilla ja varmistamalla että kaikki atomit ovat soveliaiden välimatkojen päässä toisistaan ja että sidosten pituudet ja sidoskulmat ovat kemiallisesti hyväksyttä- <

5 vissä rajoissa. Esimerkki 4 esittää yksityiskohtaisemmin I

vaiheet, jotka otetaan kolmiulotteisen tietokonemallin J

tuottamiseksi μ MAb 21.6:n variaabeleille alueille, ja i- & malli esitetään kuviossa 5. Tämä malli voi puolestaan toimia lähtökohtana ennustettaessa sellaisen vasta-aineen 10 kolmiulotteinen rakenne, joka sisältää μ MAb 21.6:n komp-lementaarisuuden määräävät alueet sijoitettuna ihmisen runko-osa-rakenteisiin. Voidaan muodostaa muita malleja, jotka esittävät rakenteen kun siihen tuodaan jäljempänä kuvattavia muita aminohapposubstituutioita. f 15 4. Aminohappotähteiden substituutio

Kuten edellä on huomautettu, keksinnön mukaiset humanisoidut vasta-aineet sisältävät variaabeleita runko- y» osa-alueita, jotka ovat oleellisesti peräisin ihmisen im-munoglobuliinista, ja komplementaarisuuden määrääviä alu-20 eitä, jotka ovat oleellisesti peräisin hiiren immunoglobu-liinista jolle on annettu nimeksi μ MAb 21.6. Kun on tun- .·.·. nistettu μ MAb 21.6:n komplementaarisuuden määräävät alu- • · · • eet ja soveliaat ihmisen akseptori-immunoglobuliinit, seu- • · · raava vaihe on määrittää mitkä, jos mitkään, näistä kompo- Si • · · • , 25 nenteista peräisin olevat aminohappotähteet pitäisi subs- * · · ** / tituoida tuloksena olevan humanisoidun vasta-aineen omi- • · · *···* naisuuksien optimoimiseksi. Yleensä ihmisen aminohappotäh- • · k V : teiden substituution hiiren aminohappotähteillä pitäisi olla mahdollisimman vähäistä, koska hiiren aminohappotäh- ί ί I 30 teiden tuominen lisää riskiä, että vasta-aine saa aikaan HAMA-vasteen ihmisissä. Aminohappoja selektoidaan substi- ··* .1. tuutiota varten perustuen niiden mahdolliseen vaikutukseen • · · I.. CDR-konformaatioon ja/tai antigeeniin sitoutumiseen. Sei- • ♦ *”* laisia mahdollisia vaikutuksia tutkitaan mallittamalla, >t*J* 35 tutkimalla tietyissä paikoissa olevien aminohappojen omi- • t * • · • · 1 117509 19 naisuuksia tai havainnoimalla empiirisesti tiettyjen aminohappojen substituution tai mutageneesin vaikutuksia.

Kun μ MAb 21.6:n variaabelin runko-osa-alueen ja ekvivalentin Ihmisen variaabelin runko-osa-alueen välillä f 5 on aminohappoero, ihmisen runko-osan aminohappo pitäisi tavallisesti korvata ekvivalentilla hiiren aminohapolla, jos on järkevää odottaa että aminohappo: 1) Sitoutuu suoraan ei-kovalentisti antigeeniin (esim. aminohapot μ MAb 21.6:n asemissa L49, L69) 10 2) on CDR-alueen vieressä, on osa CDR-aluetta edel lä mainitun Chothian ym. vaihtoehtoisen määrittelyn mukaisesti, tai on muuten vuorovaikutuksessa CDR-alueen kanssa (esim. on noin 3 A:n sisällä CDR-alueesta) (esim. aminohapot μ MAb 21.6:n asemissa L45, L58, H27, H28, H29, H30 4 15 ja H71) tai 3) on osa VL-VH-liitoskohtaa (esim. aminohapot μ MAb 21.6:n asemassa H44).

Muita substituutioehdokkaita ovat ihmisen aksepto-ri-runko-osan aminohapot, jotka ovat epätavallisia ihmisen 20 immunoglobuliinille tässä asemassa (esim. aminohapot μ MAb 21.6:n asemissa L104, L105 ja L107). Nämä aminohapot voi-daan substituoida aminohapoilla jotka ovat peräisin tyy- • 1 · pillisempien ihmisen immunoglobuliinien ekvivalentista "I.* asemasta. Aminohappoja, jotka ovat peräisin hiiren MAb • · 1 ; , 25 21.6:ssa olevista ekvivalenteista asemista, voidaan vaih- • · · :]i *· *' toehtoisesti tuoda ihmisen runko-osan alueisiin, kun sei- I · · **:.1 laiset aminohapot ovat tyypillisiä ihmisen immunoglobulii- * * 1 : ·.· * nille ekvivalenteissa asemissa.

Yleensä useimpien tai kaikkien edellä mainittujen 30 kriteerien täyttävien aminohappojen substituutio on suota- ;***: vaa. Toisinaan on kuitenkin olemassa jotain epävarmuutta 4 ·1· -v> /. siitä, täyttääkö tietty aminohappo edellä mainitut kritee- ί • · · rit, ja tuotetaan vaihtoehtoisia variantti-immunoglobulii- . .>> • · *"·1 neja, joista yhdellä on tämä tietty substituutio ja toi- *ϊ1 35 sella ei. Tämän keksinnön mukaiset humanisoidut vasta-ai- • · · · * 1 · • · • · 1 · 20 11 7 5 G 9 neet sisältävät yleensä Ihmisen kevytketjun runko-osan aminohappotähteen substituution vastaavalla μ MAb 21.6:n aminohappotähteellä ainakin l:ssä, 2:ssa tai 3:ssa, ja tavallisemmin 4:ssä, seuraavista asemista: L45, L49, L58 5 ja L69. Humanisoidut vasta-aineet sisältävät myös tavallisesti ihmisen raskasketjun runko-osan aminohappotähteen substituution ainakin l:ssä, 2:ssa, 3:ssa, 4:ssä tai 5:ssä, ja joskus 6:ssa, seuraavista asemista: H27, H28, H29, H30, H44 ja H71. H36 voi myös mahdollisesti olla 10 substituoitu. Edullisissa suoritusmuodoissa kun ihmisen kevytketjun akseptori-immunoglobuliini on RE1, kevytketju sisältää myös substituutioita ainakin l:ssä tai 2:ssa, ja tavallisemmin 3:ssa, seuraavista asemista: L104, L105 ja L107. Nämä asemat substituoidaan aminohapolla, joka on | 15 peräisin sellaisen ihmisen immunoglobuliinin ekvivalentista asemasta, jolla on tyypillisemmät aminohappotähteet.

Soveliaita substituoitavia aminohappoja esitetään kuviois- I

sa 6 ja 7.

Tavallisesti CDR-alueet humanisoiduissa vasta-ai-20 neissa ovat oleellisesti identtisiä, ja tavallisemmin identtisiä μ MAb 21.6 -vasta-aineessa olevien vastaavien CDR-alueiden kanssa. Tavallisesti on kuitenkin suotavaa ^ • * * muuttaa yksi aminohappotähteistä CDR-alueessa. Esimerkiksi | • · * '·!;$.

*".* esimerkki 5 tunnistaa aminohapposamankaltaisuuden μ MAb i • * · **’| 25 21.6:n CDR3:n ja VCAM-l-ligandin välillä. Tämä havainto • · ♦ . ^

*· “· viittaa siihen, että humanisoitujen vasta-aineiden sitou- I

tumisaffiniteettia on mahdollista parantaa suunnittelemal- * · · : la raskasketjun CDR3-alue uudelleen niin, että se muistut taa VCAM-l:tä vielä läheisemmin. Vastaavasti yksi tai use- : 30 ampi aminohappo CDR3-domeenista voidaan substituoida VCAM- • « · l:n sitovasta domeenista peräisin olevilla aminohapoilla.

* * * *

Vaikka se ei ole tavallisesti suotavaa, on joskus mahdol- • · · .

lista tehdä yksi tai useampi konservatiivinen CDR-amino- • · *···* happotähteiden aminohapposubstituutio ilman että se vai- * ·*· ···· ·· ·) ··· • · • · • · · 117509 21 kuttaisi havaittavasti tuloksena olevan humanisoidun immu-noglobuliinin sitoutumisaffiniteettiin.

Muuten kuin edellä kuvattujen spesifisten aminohap-posubstituutioiden tapauksessa humanisoitujen immunoglo-5 buliinien runko-osa-alueet ovat tavallisesti oleellisesti % identtisiä ja tavallisemmin identtisiä niiden ihmisvasta-aineiden runko-osa-alueiden kanssa, joista ne olivat peräisin. Tietenkin monet runko-osa-alueen aminohapoista ottavat osaa vähän tai eivät lainkaan vasta-aineen spesi-10 fiteettiin tai affiniteettiin. Niinpä runko-osa-aminohappotähteiden monia yksittäisiä konservatiivisia substituutioita voidaan sietää ilman havaittavissa olevaa muutosta tuloksena olevan humanisoidun immunoglobuliinin spesifi-teettiin tai affiniteettiin. Sellaiset substituutiot ovat 15 kuitenkin yleensä epäsuotavia.

5. Variaabelien alueiden tuotanto

Kun humanisoitujen immunoglobuliinien CDR- ja run- I

ko-osa-komponentit on valittu käsitteellisesti, monia menetelmiä on saatavilla sellaisten immunoglobuliinien tuot-20 tamiseksi. Koodin degeneraatioasteen vuoksi monet erilaiset nukleiinihapposekvenssit koodittavat kutakin immuno-t*t*t globuliinin aminohapposekvenssiä. Halutut nukleiinihappo- I I · .* sekvenssit voidaan tuottaa de novo kiinteän faasin DNA- • · · - > • « · *".* synteesillä tai halutun polynukleotidin aikaisemmin vai- • · · *·'[ 25 mistetun variantin PCR-mutageneesillä. Oligonukleotidivä- • i · *· " litteinen mutageneesi on edullinen menetelmä valmistetta- essa kohteena olevan polypeptidi-DNA:n substituutio-, * * * 1

·.· * deleetio- ja insertiovariantteja. Katso Adelman ym., DNA

2:183 (1983). Lyhyesti ilmaisten, kohteena olevaa polypep- : 30 tidi-DNA:ta muutetaan hybridisolmalla oligonukleotidi, joka • · * ·***; koodittaa haluttua mutaatiota, yksijuosteiseen DNA-t emp- • · · "" laattiin. Hybridisaation jälkeen DNA-polymeraasia käyte- * * * *;[/ tään syntetisoimaan templaatin koko toinen komplementaa- * · *···' rinen juoste, joka sisältää oligonukleotidialukkeen ja • · · **** *·· • · • · * · · 117509 22 koodittaa valittua muutosta kohteena olevassa polypeptidi-DNA:ssa.

6. Vakioalueen selektio

Edellä kuvatulla tavalla tuotettujen humanisoitujen 5 vasta-aineiden variaabelit segmentit on tyypillisesti liitetty ainakin osaan immunoglobuliinin, tyypillisesti ihmisen immunoglobuliinin, vakioalueesta (Fc). Ihmisen vakio-alueen DNA-sekvenssejä voidaan eristää hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti monista erilaisista ihmisen soluisit) ta, mutta edullisesti immortalisoiduista B-soluista (katso Kabat ym., edellä, ja W0 87/02 671) (joista kukin liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan kaikkia tarkoituksia varten). Tavallisesti vasta-aine sisältää sekä kevyt-ketjun että raskasketjun vakioalueet. Raskasketjun vakio- :> 15 alue sisältää tavallisesti CH1-, sarana-, CH2-, CH3- ja CH4-alueet.

Humanisoituihin vasta-aineisiin kuuluvat vasta-ai-neet joissa on kaikentyyppisiä vakioalueita, mukaan lukien IgM, IgG, IgD, IgA ja IgE, ja mikä tahansa isotyyppi, mu-20 kaan lukien IgGl, IgG2, IgG3 ja IgG4. Kun on suotavaa että humanisoidulla vasta-aineella on sytotoksista aktiivisuut-ta, vakioalue on yleensä komplementtia sitova vakioalue ja • * · .'l luokka on tyypillisesti IgGl. Kun sellainen sytotoksinen • · · ***.* aktiivisuus ei ole suotavaa, vakiodomeeni voi olla luokal- ·*] 25 taan IgG2. Humanisoitu vasta-aine voi sisältää sekvenssejä • · · f *· " useammasta kuin yhdestä luokasta tai isotyypistä.

M.’ 7. Ekspressio järjestelmät • * ♦ ·.· · Nukleiinihapot, jotka koodattavat humanisoituja kevyt- ja raskasketjun variaabeleita alueita, mahdollisesti*: 30 ti liitettynä vakioalueisiin, sijoitetaan ekspressiovekto- :***; reihin. Kevyt- ja raskasketjut voidaan kloonata samoihin • * · .1. tai eri ekspressiovektoreihin. Immunoglobuliiniketjuja koodittavat DNA-segmentit liitetään toimivasti ekspressio- * · *···* vektor(e)issa oleviin säätelysekvensseihin, jotka varmis- 35 tavat immunoglobuliinipolypeptidien ekspression. Sellai- • · · • t • · •«· 23 1 1 7509 siin säätelysekvensseihin kuuluvat signaalisekvenssi, promoottori , geenintehostaj aja transkription terminaatiosek-venssi. Ekspressiovektorit ovat tyypillisesti replikoitavissa isäntäorganismeissa joko episomeina tai Isännän kro- 4 5 mosomaalisen DNA:n integraalisena osana. Ekspressiovektorit sisältävät tavallisesti selektiomarkkereita, esim. tetrasykliini tai neomysiini, niiden solujen detektion mahdollistamiseksi, jotka on transformoitu halutuilla DNA- -i sekvensseillä (katso esim. US-patentti 4 704 362).

10 E. coli on yksi prokaryoottinen isäntä, jota käyte tään erityisesti tämän keksinnön polynukleotidien kloonaamiseksi. Muihin käyttökelpoisiin mikrobi-isäntiin kuuluvat basillit, kuten Bacillus subtilus ja muut Enterobacteria-ceae-heimon jäsenet, kuten Salmonella, Serratia ja eri 15 Pseudomonas-lajit. Näissä prokaryootti-isännissä voidaan myös tehdä ekspressiovektoreita, jotka sisältävät tyypillisesti ekspression säätelysekvenssejä, jotka ovat yhteen- .·! sopivia isäntäsolun kanssa (esim. replikaation aloituskohta). Lisäksi läsnä on mikä tahansa määrä monia erilaisia 20 hyvin tunnettuja promoottoreita, kuten laktoosipromootto-rijärjestelmä, tryptofaani (trp) -promoottorijärjestelmä, beta-laktamaasi-promoottorijärjestelmä tai lambda-faagista • * · peräisin oleva promoottorijärjestelmä. Promoottorit sääte- , • · · ’ levät tyypillisesti ekspressiota, mahdollisesti operaatto- • * · I , 25 risekvenssin kanssa, ja niissä on ribosomia sitovan kohdan * * " .

*· sekvenssejä ja vastaavia, transkription ja translaation *.:·* aloittamista ja loppuunsaattamista varten. ' • · · * Ekspressiota varten voidaan käyttää myös muita mik robeja, kuten hiivaa. Saccharomyces on edullinen isäntä, ::: 30 soveliaiden vektoreiden kanssa joissa on ekspression sää- :**’· telyjärjestelmiä, kuten promoottoreita, mukaan lukien 3- • · · fosfoglyseraattikinaasi tai muut glykolyyttiset entsyymit, ♦ · · ja replikaation aloituskohta, terminaatiosekvenssit ja • · ’···* vastaavat, halun mukaan.

··· #·« • · • · · · 24 1 1 7509

Mikro-organismien lisäksi nisäkäskudossoluviljelmää voidaan myös käyttää ekspressoimaan ja tuottamaan tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä (katso Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987). Euka-5 ryoottisolut ovat yleensä edullisia, koska alalla on kehitetty monia soveliaita isäntäsolulinjoja, jotka kykenevät erittämään ehjiä immunoglobuliineja, ja näihin kuuluvat CHO-solulinjat, monet eri Cos-solulinjat, HeLa-solut, edullisesti myeloomasolulinjat tai transformoidut B-solut 10 tai hybridoomat. Näitä soluja varten ekspressiovektoreihin voi kuulua ekspression säätelysekvenssejä, kuten replikaa-tion aloituskohta, promoottori ja geenintehostaja (Queen ym., Immunol. Rev. 89:46-68 (1986)) ja välttämättömät pro-sessointi-informaatiokohdat, kuten ribosomia sitovat koh-15 dat, RNA:n silmukointikohdat, polyadenylaatiokohdat ja transkription terminaattorisekvenssit. Edullisia ekspression säätelysekvenssejä ovat promoottorit jotka ovat pe- » räisin immunoglobuliinigeeneistä, SV40:stä, adenovirukses-ta, naudan papilloomaviruksesta, sytomegaloviruksesta ja 20 vastaavista.

Vektorit jotka sisältävät halutut polynukleotidi-sekvenssit (esim. raskas- ja kevytketjua koodattavat sek- ? venssit ja ekspression säätelysekvenssit) voidaan siirtää • · · *".* isäntäsoluun hyvin tunnetuilla menetelmillä, jotka vaihte- • · · * . 25 levät isäntäsolun tyypin mukaan. Esimerkiksi prokaryootti- * * · .

’· solujen tapauksessa käytetään yleensä hyödyksi kalsiumklo- *| riditransfektiota, kun taas muiden isäntäsolujen tapauk- * · · *.· : sessa voidaan käyttää kalsiumfosfaattikäsittelyä tai elektroporaatiota. (Katso yleisesti Sambrook ym., Mole- Ϊ !*: 30 cular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor ;1: Press, 2. laitos, 1989) (joka liitetään tähän viitteenä ···*:’ kokonaisuudessaan kaikkia tarkoituksia varten). Kun • · · *;[/ raskas- ja kevytketjuja kloonataan erillisiin ekspressio- • · *"·* vektoreihin, vektorit kotransfektoidaan jotta saataisiin 35 aikaan ehjien immunoglobuliinien ekspressio ja kokoaminen. ’ • * t · • ♦ · • · • φ ··· 117509 : 25

Kun ne on kerran ekspressoitu, tämän keksinnön mukaiset kokonaiset vasta-aineet, niiden dimeerit, yksittäiset kevyt- ja raskasketjut tai muut immunoglobuliinimuodot voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla, mukaan luki- I

5 en ammoniumsulfaattisaostus, affiniteettipylväät, pylväs- f kromatografia, geelielektroforeesi ja vastaavat (katso f yleisesti Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Farmaseuttisia käyttötarkoituksia varten oleellisesti puhtaat immunoglobuliinit, jotka ovat ainakin 10 90 - 95-prosenttisen homogeenisia, ovat edullisia, ja 98 - 99-prosenttinen tai suurempi homogeenisuus on edullisin.

C. Humanisoitujen vasta-aineiden fragmentteja Keksinnön toisessa suoritusmuodossa tarjotaan humanisoitujen vasta-aineiden fragmentteja. Näillä fragmen-15 teillä ilmenee tyypillisesti sitoutuminen VLA-4-antigee-niin affiniteetilla, joka on ainakin 107 M"1 ja tyypillisemmin 108 tai 109 M-1. Humanisoituihin vasta-ainefragmenttei- f hin kuuluvat erilliset raskasketjut, kevytketjut, Fab, '

Fab', F(ab’ )2, Fabc ja Fv. Fragmentit tuotetaan geenitekno-20 logisin menetelmin tai ehjien immunoglobuliinien entsymaa-ttisella tai kemiallisella erottamisella.

II. Nukleiinihapot s • 1 • .·, Humanisoidut vasta-aineet ja niiden fragmentit tuo- t · · Vv tetaan tavallisesti nukleiinihappojen ekspression avulla.

• i · I , 25 Kaikki nukleiinihapot, jotka koodittavat tässä patentti- «1· •1· hakemuksessa kuvattua humanisoitua vasta-ainetta tai sen • 1 · *·:·1 fragmentteja, sisältyvät nimenomaisesti tähän keksintöön.

• · · *.· · III. Tietokoneet

Toisessa keksinnön aspektissa tarjotaan tietokonei-30 ta, jotka on ohjelmoitu esittämään vasta-aineiden kolmi-ulotteisia kuvia näytöllä. Sovelias on esimerkiksi Silicon • · ·

Graphics IRIS 4D -työasema, joka toimii UNIX-käyttöjärjes-telmällä ja jossa käytetään QUANTA-molekyylimallituspaket- • · *·;·1 tia (Polygen Corp. USA). Tietokoneet ovat hyödyllisiä vi- i1 35 sualisoitaessa humanisoitujen vasta-aineiden varianttien ··· • · * 1 • · 1 117509 26 malleja. Yleensä keksinnön mukaiset vasta-aineet jo tarjoavat tyydyttävän sitoutumisaffiniteetin. On kuitenkin todennäköistä, että vasta-aineita, joilla on vielä voimakkaampi sitoutumisaffiniteetti, voitaisiin tunnistaa vari-5 oimalla edelleen tiettyjä aminohappotähteitä. Kolmiulot- | teinen kuva tunnistaa myös monia ei-kriittisiä aminohappo- f ja, jotka voisivat olla konservatiivisten substituutioiden kohteena ilman että tämä vaikuttaisi havaittavasti vasta- ;Ί aineen sitoutumisaffiniteettiin. Jopa konservatiivisilla -i 10 substituutioilla voi kollektiivisesti olla merkittävä vaikutus immunoglobuliinln ominaisuuksiin. On kuitenkin todennäköistä, että monet yksittäiset konservatiiviset substituutiot eivät merkittävästi vahingoita immunoglobuliini-en ominaisuuksia.

15 IV. Humanisoitujen vasta-aineiden testaus

Keksinnön mukaisia humanisoituja vasta-aineita testataan monilla eri määrityksillä. Näihin kuuluu yksinker-täinen sitoutumismääritys, jolla havaitaan, sitoutuuko vasta-aine soluihin, jotka sisältävät VLA-reseptorin, tai 20 millä voimakkuudella se sitoutuu. Vasta-aineista testataan myös niiden kyky estää VLA-4-reseptorin sisältävien solu-jen vuorovaikutus sellaisten endoteelisolujen kanssa, jot- • · : ka ekspressoivat VCAM-l-ligandia. Endoteelisolut voidaan > • · · *V..\ kasvattaa ja stimuloida viljelmässä tai ne voivat olla • · · * , 25 luonnossa ilmenevien aivokudosleikkeiden komponentti. Kat- • « · *· / so Yednock ym., edellä, ja US-patenttihakemus sarjanro

• · « T

*·:·* 07/871 223. Humanisoidut vasta-aineet testataan myös sil- *·· * *·* * mälläpitäen niiden kykyä estää tai vähentää tulehdusta ja sitä seuraavaa halvautumista laboratorioeläimissä, joilla

30 on kokeellinen autoimmuuni-enkefalomyeliitti (EAE). EAE

: **ί indusoidaan injektoimalla laboratorioeläin CD4+ T-soluil- «·· #···# la, jotka ovat spesifisiä myeliinin emäksiselle proteii- • · · I,. nille, tai immunisoimalla suoraan eläimiä myeliinin emäk- « · *;* sisellä proteiinilla. Tämä proteiini lokalisoituu keskus- 35 hermostoon ja reaktiiviset T-solut aloittavat tätä prote- • * · • * • · ···;, 117509 27 'e> -¾ • · A- iinia sisältävien hermotuppien tuhoamisen tavalla, joka jäljittelee autoimmuunivastetta multippeliskleroosissa.

Katso Yednock ym., edellä, ja samaan aikaan vireillä oleva US-patenttihakemusta sarjanro 07/871 223.

5 V. Farmaseuttiset koostumukset Tämä keksintö tarjoaa profylaktisessa tai terapeut- 4 tisessa hoidossa käyttöä varten farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavan terapeuttisen aineen, se on: humanisoidun 21.6-vasta-aineen tai sen sitovan frag-10 mentin, ja monia erilaisia muita komponentteja. Edullinen muoto riippuu aiotusta antomuodosta ja terapeuttisesta sovellutuksesta. Koostumuksiin voi myös kuulua, halutusta formulaatiosta riippuen, farmaseuttisesti hyväksyttäviä, myrkyttömiä kantajia tai laimennusaineita, jotka määritel- | ··" -i 15 lään vehikkeleiksi joita käytetään yleisesti formuloitaessa farmaseuttisia koostumuksia eläimelle tai ihmiselle antamista varten. Laimennusaine valitaan niin ettei se vaikuta yhdistelmän biologiseen aktiivisuuteen. Esimerkke- ·’ jä sellaisista laimennusaineista ovat tislattu vesi, fy-20 siologinen fosfaattipuskuroitu suolaliuos, Ringerin liuokset, dekstroosiliuos ja Hanksin liuos. Lisäksi farmaseut-tinen koostumus tai formulaatio voi sisältää myös muita • · * .* ^ kantajia, apuaineita tai myrkyttömiä, ei-terapeuttisia, t · « *".* ei-immunogeenisia stabilointiaineita ja vastaavia.

• · * l [ 25 VI. Diagnoosimenetelmiä • · · *· *· Humanisoidut vasta-aineet ja niiden sitoutuvat * *.:.* fragmentit ovat hyödyllisiä detektoitaessa sellaisten so- • · · ·.· · lujen läsnäolo, jotka sisältävät VLA-4-reseptorin. Sel laisten solujen läsnäolo aivoissa on oire tulehdusvastees-: 30 ta, ja se voi olla signaali tarpeesta aloittaa jäljempänä :***: pohdittu terapeuttinen menetelmä. Diagnoosi voidaan saada • · tehtyä poistamalla potilaasta solunäyte. Sitten määrite- • · * *#> tään ekspressoidun VLA-4-antigeenin määrä näytteen yksit- • « ‘•y* täisissä soluissa, esim. kestävöityjen solujen immunohis- •j* 35 tokemiallisella värjäyksellä tai tekemällä soluekstraktil- • · · • · ···· 117509 28 le Western-blottaus humanisoidulla MAb 21.6-vasta-aineella tai sen sitoutuvalla fragmentilla.

Diagnoosiin voidaan myös päästä antamalla in vivo leimattua humanisoitua MAb 21.6:ta (tai sitovaa fragment-5 tia) ja detektoimalla in vivo kuvantamisella. Annetun humanisoidun MAb 21.6:n pitoisuuden pitäisi olla riittävä, jotta sitoutuminen soluihin, joissa on kohteena oleva antigeeni, on havaittavissa taustasignaaliin verrattuna. Diagnostinen reagenssi voidaan leimata radioisotoopilla 10 kameralla kuvantamista varten tai paramagneettisella isotooppina magneettiresonanssi- tai elektronispinresonans-sikuvantamista varten.

Sellainen muutos (tyypillisesti kasvu) VLA-4-prote-linin tasossa solunäytteestä tai yksilöstä kuvannettuna, 15 joka on kliinisesti asetettujen normaalitasojen alueen ulkopuolella, voi viitata siihen että läsnä on epäsuotava , tulehdusvastereaktio yksilössä josta näyte hankittiin, ja/tai viitata yksilön alttiuteen kehittää (tai edetä läpi) sellainen reaktio. VLA-4-proteiinia voidaan myös käyt-20 tää erilaistumismarkkerina tunnistamaan ja tyypittämään soluja jotka kuuluvat tiettyyn polveutumislinjaan ja joil-la on tietty alkuperä yksilönkehityksessä. Sellaista solu- • ♦ · .* * tyyppistä spesifistä detektiota voidaan käyttää epäsuota- : : : ·: **;,* vien immuunivasteiden histopatologisessa diagnoosissa.

• · ♦ *·* * 25 Vili. Hoitomenetelmiä • · .r * · · *· *· Keksintö tarjoaa myös hoitomenetelmiä, jotka käyt- tävät hyödyksi humanisoidun MAb 21.6:n kykyä estää VLA-4- ·*· : reseptorin a4-riippuvaisia vuorovaikutuksia. VLA-4-resep- torin a4-riippuvainen vuorovaikutus VCAM-l-ligandin kanssa : 30 endoteelisoluissa on monien tulehdusvasteiden varhainen * * * ;1· tapahtuma, erityisesti keskushermoston tulehdusvasteiden.

* · ·

Keskushermoston tulehduksesta johtuviin epäsuotaviin tau- i * * * *;]/ teihin ja tiloihin kuuluvat akuutit taudit, kuten halvaus • · ’·" ja muut aivovauriot, ja krooniset taudit kuten multippeli- 35 skleroosi, meningiitti ja enkefaliitti. Multippeliskleroo- • Mi

• M

• · • * ··· 117509 29 . » si on etenevä neurologinen autoimmuunitauti, joka kohtaa arviolta 250 000 - 350 000 ihmistä Yhdysvalloissa. Multippeliskleroosin ajatellaan olevan tulos spesifisestä auto-immuunireaktiosta, jossa tietyt leukosyytit hyökkäävät ja 5 alkavat tuhoa myeliiniä, hermosäikeitä peittävää eristävää ϊ tuppea. Multippeliskleroosin eläinmallissa a481-integrii- * niä vastaan suunnattujen hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden on osoitettu estävän leukosyyttien adheesion en-doteeliin, ja näin estävän keskushermoston tulehduksen ja 10 tästä johtuvan halvautumisen eläimissä.

Tämän keksinnön mukaiset humanisoidut MAb 21.6-vas-ta-aineet tarjoavat useita etuja hiiren vasta-aineisiin nähden, joiden on jo osoitettu olevan tehokkaita eläin malleissa:

' · S

15 1) Ihmisen immuunijärjestelmän ei pitäisi tunnistaa humanisoidun vasta-aineen runko-osaa tai vakioaluetta vieraaksi, ja niinpä sellaista injektoitua vasta-ainetta vas- | taan syntyvän immuunivasteen pitäisi olla vähäisempi kuin * täysin vierasta hiiren vasta-ainetta tai osittain vierasta 20 kimeeristä vasta-ainetta vastaan.

2) Koska humanisoidun vasta-aineen efektoriosa on ^ ihmisestä, se on mahdollisesti paremmin vuorovaikutuksessa • · * ; ihmisen immuunijärjestelmän muiden osien kanssa.

• · · *”,* 3) Injektoiduilla hiirivasta-aineilla on raportoitu i · · *;* ] 25 olevan ihmisen verenkierrossa paljon lyhyempi puoliintu- • t · *· *ϊ misaika kuin normaalien ihmisvasta-aineiden puoliintumis- .-¾ • ;·> aika (Shaw ym., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987)). Injek- * * * ί.ϊ ϊ toiduilla humanisoiduilla vasta-aineilla on puoliintumis aika, joka on oleellisesti ekvivalentti luonnossa ilmene- : :*· 30 vien ihmisvasta-aineiden kanssa, mikä mahdollistaa pienem- * * · .1. mät ja harvemmat annokset.

• · ·

Edellä kuvatut farmaseuttiset koostumukset voidaan • · · * antaa silmälläpitäen multippeliskleroosin tai muiden tu- • · *·..* lehdus taut ien, erityisesti keskushermoston tulehdustauti- 35 en, profylaktisia ja/tai terapeuttisia hoitoja varten.

»··· ··· • · * · ··· 117509 30

Terapeuttisissa sovellutuksissa koostumuksia annetaan potilaalle, jolla epäillään olevan tai joka jo kärsii sellaisesta taudista kuten multippeliskleroosi, määränä joka riittää parantamaan, tai ainakin osittain pysäyttämään, 5 taudin oireet ja sen komplikaatiot. Määrä, joka riittää - tämän aikaansaamiseen, määritellään terapeuttisesti tai farmaseuttisesti tehokkaaksi annokseksi.

Profylaktisissa sovellutuksissa farmaseuttisia koostumuksia annetaan potilaalle, jolla on alttius, tai 10 muuten riski, saada tietty tauti, määränä joka riittää eliminoimaan riskin tai pienentämään sitä, tai viivyttämään taudin puhkeamista. Sellaisen määrän määritellään olevan profylaktisesti tehokas annos. Potilailla joilla on multippeliskleroosi remissiossa, riski voidaan arvioida 15 NMR-kuvantamisella tai joissakin tapauksissa potilaan arvioimien esioireiden ("presymptomatic indications") perusteella. 4

Farmaseuttiset koostumukset annetaan parenteraalis-ta, paikallista, laskimonsisäistä reittiä, suun kautta tai 20 ihon alle, lihaksen sisäisesti paikallisesti antamalla, kuten aerosolina tai ihon läpi, profylaktista ja/tai tera-peuttista hoitoa varten. Farmaseuttiset koostumukset voi- • · · .* ! daan antaa monina eri kerta-annosmuotoina antotavasta • · · • · t *",* riippuen. Esimerkiksi suun kautta antamista varten sovel- • · · **' \ 25 tuviin kerta-annosmuotoihin kuuluvat jauhe, tabletit, pii- • · * *· m‘ lerit, kapselit ja imeskelytabletit.

*.ί·* Tämän keksinnön mukaisten koostumusten tehokkaat • · · ·,· · annokset edellä kuvattujen tilojen hoitoa varten vaihtele- vat monista eri tekijöistä riippuen, mukaan lukien antota-30 vat, kohteena oleva kohta, potilaan fysiologinen tila ja muut annetut lääkitykset. Niinpä hoidon annokset pitää ···.' titrata turvallisuuden ja tehokkuuden optimoimiseksi. Nämä koostumukset voidaan antaa nisäkkäille eläinlääketieteel- • * *·”' listä käyttöä varten ja kliinistä käyttöä varten ihmisissä 35 tavalla joka on samanlainen kuin muilla terapeuttisilla ··« • · • · ...

··· 117509 31 ' \Ä aineilla, se on: fysiologisesti hyväksyttävässä kanta jassa. Yleensä annettava annos on välillä noin 0,0001 -100 mg/kg ja tavallisemmin 0,01 - 0,5 mg/painokilo.

VIII. Muita käyttötarkoituksia 5 Humanisoidut vasta-aineet ovat myös hyödyllisiä > VIiA-4-reseptorin af finiteettipuhdistusta varten. Vasta- | • r aineet immobilisoidaan kiinteään kantajaan ja dispergoitu-jen proteiinien liuos viedään kiinteän kantajan yli. VLA-4 sitoutuu kantajaan ja näin se erottuu muista proteiineis-10 ta. Puhdistettua VLA-4:ää tai sen fragmenttia, joka on 4 saatu saataville tällä menetelmällä, voidaan käyttää rokotteena tai immunogeenina muiden vasta-aineiden tuottamiseksi . . f '-f

Keksinnön mukaiset humanisoidut vasta-aineet ovat 15 myös hyödyllisiä tuotettaessa idiotyyppisiä vasta-aineita

esimerkiksi silmälläpitäen eläimen immunisointia humani- I

soidulla vasta-aineella. Selektoidaan anti-idiotyyppi-vas- . ΐ ta-aine, jonka sitoutumista ihmisvasta-aineeseen VLA-4 tai ) sen fragmentit inhiboivat. Koska sekä anti-idiotyyppi-vas-20 ta-aine että VLA-4 tai sen fragmentit sitoutuvat humanisoituun immunoglobuliiniin, anti-idiotyyppi-vasta-aine voi edustaa epitoopin "sisäistä kuvaa" ja niinpä se voi korva-• · · ? ta VLA-4-reseptorin, se on: VCAM-l:n, ligandin. ^ *11. * Esimerkkejä * . 25 Esimerkki 1: Hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden *· *· kloonaus ja sekvensointi • ** - - * · · . . ' st *·*·* VLA:ta vastaan suunnattu hiiren 21.6-vasta-aine on • · · *.* * kuvattu samaan aikaan vireillä olevassa US-patenttihake- muksessa sarjanro 07/871 223. Totaali-RNA eristettiin hyb-ϊ,ί,ϊ 30 ridoomasoluista jotka tuottavat hiiren 21.6-vasta-ainetta.

; Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttämällä tar- vikesarjaa (Pharmacia Biosystems Limited). Raskas- ja ke-vytketjun variaabelit alueet hankittiin käyttämällä PCR- • · **· alukkeita, jotka on suunniteltu niin että ne hybridisoitu- .,*·* 35 vat sekvensseihin, jotka ovat vieressä ja ulkoisia variaa- * · · • · • · • * * 117509 32 beleita alueita koodittavien sekvenssien suhteen, mikä täten mahdollistaa hiiren 21.6-vasta-aineen variaabeleiden alueiden kaikkien koodittavien sekvenssien kloonauksen. ”Sense"-PCR-alukkeet, jotka hybridisoituvat hiiren kappa-5 kevytketjun leader-sekvenssien ja hiiren raskasketjun lea- f der-sekvenssien 5'-päihin, suunniteltiin perustuen tieto- : kantoihin joissa oli 42 hiiren kappa-kevytketjun leader-sekvenssiä ja 55 hiiren raskasketjun leader-sekvenssiä (Jones ja Bendig, Bio/Technology 9:88-89 (1991) (liitetään 10 tähän viitteenä kokonaisuudessaan kaikkia tarkoituksia varten)). Näitä alukkeita käytettiin yhdessä "anti-sense"-PCR-alukkeiden kanssa, jotka hybridisoituvat hiiren vakio-alueiden (kappa tai gamma) 3'-päiden kanssa. ;

Hiiren 21.6:n kappa-VL-alueet PCR-monistettiin ' 15 50 μ1:η reaktiossa, joka sisälsi tyypillisesti 10 mM Tris- HC1:n (pH 8,3), 50 mM KCl:n, 200 μΜ dNTP:t, 1,5 mM MgCl2:n, 1 yksikön AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) -DNA-polymeraasia, 1 μ1:η cDNA-templaattia, MKV-alukkeen (0,25 μΜ) ja hiiren f kappa-kevytketjun "anti-sense"-PCR-alukkeen (0,25 μΜ) (ku-20 vio 1). Hiiren 21.6-V„-alueet PCR-monistettiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi että käytettiin MHVH-aluketta ja "anti-sense "-PCR-aluketta, joka oli spesifinen hiiren • · « .* I IgGl-raskasketjun vakioalueelle (kuvio 2). Kutakin PCR- • · · · *".* reaktiota lämpötila jaksotettiin, sen jälkeen kun oli aluk- :? • · · ·* [ 25 si tehty sulatus 94 °C:n lämpötilassa 5 minuutin ajan, • · « seuraavasti: 94 °C 1 minuutti, 55 °C 1 minuutti ja 72 °C 2 , ί *.!.* minuuttia, 25 syklin ajan. Viimeisen syklin loppuunsaatta- • · · · mistä seurasi lopullinen alukkeen jatkaminen 72 °C 10 mi nuutin ajan. Lämpötilanvaihtoaika alukkeen hybridisaatio-: 30 ja j atkamisvaiheen välillä oli 2,5 min. PCR-moni st uksen :"*· jälkeen 10 μ1:η erät kustakin reaktiosta analysoitiin eti- • · · ·:* diumbromidivärjätyissä 1,5 % agaroosigeeleissä. ^ *„ PCR-tuotteet kloonattiin käyttämällä "TA Cloning • · *”·* System"-tarvikesarjaa (Invitrogen Corporation). Vektorit t>·:* 35 jotka sisälsivät oikean kokoisia inserttejä, sekvensoitiin · • · • · • · · 33 .

117509

käyttämällä kaksijuosteista plasmidi-DNA:ta ja Sequenase-entsyymiä (United States Biochemical Corporation). Jotta saataisiin vältettyä mahdolliset virheet, jotka on mahdollisesti tullut PCR-monistusvaiheiden aikana, ainakin kaksi I

' f 5 toisistaan riippumatta PCR-monistettua ja kloonattua DNA- 4 fragmenttia sekvensointiin kunkin variaabelin alueen ta- a pauksessa.

PCR-tuotteiden sekvenssejä verrattiin muihin hiiren ’ kevytketjun ja raskasketjun variaabeleihin alueisiin (kat-10 so taulukot 1 ja 2). Tämä vertailu viittasi siihen, että MKV2- ja MKV4-alukkellla saadut PCR-tuotteet edustavat autenttisia hiiren 21.6:n kappa-ketjun variaabeleita alueita, ja MHV1- ja MHV2-alukkeilla saadut edustavat autenttisia hiiren VH-alueita, ja pääteltiin että näiden tuotte!-15 den sekvenssit ovat ne jotka ovat hiiren 21.6-vasta-aineen variaabeleissa alueissa. Hiiren 21.6:n VL- ja VH-alueita koodittavan cDNA:n DNA- ja aminohapposekvenssit esitetään ? kuvioissa 1 ja 2.

20 Taulukko 1

Hiiren 21.6:n kevytketjun variaabelin alueen ver-tallu muihin kevytketjun variaabeleihin alueisiin ί • · Äj* • ,·, Hiiren 21,6:n verrattuna: : Samankaltai- Identtisyys- 4 ·*·*· suusprosent- prosentti · : . 25 ci • · · *· *ϊ Konsensussekvenssiin hiiren • 2 ''* ·.*,· kappa-VT-alaryhmälle 5 84,0 72 6 ... L ' ' I t · • · ·

Konsensussekvenssiin ihmisen kappa-V^-alaryhmälle 1^ 84,0 69,8 :.:V* 30 ,···, Konsensussekvenssiin ihmisen ’···* kappa-V^-alaryhmälle 2 g5 j 59 g ... ^ ^ * · * * ·

Konsensussekvenssiin ihmisen *"·* kappa-V^-alaryhmälle 72^ 57^5 • •I * ···* ^ Konsensussekvenssiin ihmisen ·*"· ) *...* kappa-V^-alaryhmälle k 72^6 58/5

Ihmisen REI^jsta peräisin oleva sekvenssi 81^0 72^4

(Ihmisen kappa-VT-alaryhmän I

jäsen) 117509 34 < 1Samankaltaisuusprosentti määriteltiin käyttämällä "GAP"-ohjelmaa (University of Wisconsin Genetics Computer Group) 2Konsensussekvenssit otettiin edellä mainitusta Kabatin ym. luettelosta.

5 3REI kuten ovat sekvensoineet Palm ym., Hoppe-Seyler’s Z.

Physiol. Chem. 356:167-191 (1975).

Taulukko 2

Hiiren 21.6:n raskasketjun variaabelin alueen ver-10 tailu muihin raskasketjun variaabeleihin alueisiin

Hiiren 21.6:n verrattuna:

Samankaltai- Identtisyys-suusprosentti* prosentti

Konsensussekvenssiin hiiren ^ VH-alaryhmälle 2c^ 94^3 9^j

Konsensussekvenssiin ihmisen ^alaryhmälle l2 78,0 65,0

Konsensussekvenssiin ihmisen 20 VH-alaryhmälle 2^ 7Q 5 53 3 . . Konsensussekvenssiin ihmisen ·,*,· VH-alaryhmälle 3^ 67 5 52 8 • · · • · · O '

Ihmisen 21/28'CL jstä « · · ** * peräisin olevaan sekvenssiin 76 5 64 7 :**,· (Ihmisen VH-alaryhmän 1 jäsen) f * • · a ' ··· 'Samankaltaisuusprosentti määriteltiin käyttämällä "GAP"- ohjelmaa (University of Wisconsin Genetics Computer Group) :.J.: 30 2Konsensussekvenssit otettiin edellä mainitusta Kabatin ym.

··· luettelosta.

.···, 321/28'CL kuten ovat sekvensoineet Darsimonian ym., j.

• · ♦

Immunol. 139:2496-2501 (1987).

a·· ·'· ··· • ' 1 • · · · *«· . · • · ··« 35 .4 117509

Esimerkki 2: Kimeerisen 21.6-vasta-aineen muodostaminen

Kimeeriset kevyt- ja raskasketjut muodostettiin liittämällä hiiren 21.6:n VL- ja VH-alueiden PCR-kloonatut 5 cDNA:t ihmisen vakioalueisiin. Hiiren cDNA-sekvenssien 5'- '4 ja 3'-päät modifioitiin käyttämällä erityisesti suunnitel- f tuja PCR-alukkeita. 5'-pään PCR-alukkeet (taulukko 3), jotka hybridisoituvat DNA-sekvensseihin jotka koodittavat leader-sekvenssien alkukohtia, suunniteltiin niin että 10 saatiin aikaan DNA-sekvenssejä jotka ovat oleellisia tehokasta translaatiota silmälläpitäen (Kozak, J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)), ja saatiin aikaan HindiII-restriktio-kohtia ekspressiovektoriin kloonausta varten. 3'-pään alukkeet (taulukko 3), jotka hybridisoituvat DNA-sekvens- | 15 seihin jotka koodittavat J-alueiden päitä, suunniteltiin niin että saatiin aikaan DNA-sekvenssejä jotka ovat oleellisia vakioalueisiin silmukointia varten ja saatiin aikaan |

BamHI-kohta ekspressiovektoriin kloonausta varten. PCR-monistuksen tuotteet digestoitiin HindIII:lla ja 20 BamHIrlla, kloonattiin pUCl9-vektoriin ja sekvensointiin sen varmistamiseksi, että PCR-monistuksen aikana ei ollut i ilmaantunut mitään virheitä. Muokatut hiiren 21.6:n väri- • · · .* \ aabelit alueet subkloonattiin sitten nisäkässoluekspres- • · · *",* siovektoreihin, jotka sisälsivät joko ihmisen k- tai v-1- • · · l m 25 vakioalueet (kuvio 3).

• · · • ·« * · » · i . > ·· * · ·

I I I

• Φ · • · * • · ♦ • · * «*· • · • · ··· • t· ··· * I Φ • « · • · • ♦ • tl t ··· • · f · ·*· • « • * ··· 117509 36

Taulukko 3 PCR-alukkeita kimeerisen 21.6-vasta-aineen muodostamista varten A. Kevytketjun variaabeli alue 5 1, Aluke 5’-pään uudelleen muodostamista varten (37-meeri) (SEQ. ID nro 18) S' C AGA AAG CTT GCC GCC ACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG 3'

Hindlll Kozakin M R P S I Q

konsensus- 10 sekvenssi 2. Aluke 31-pään uudelleen muodostamista varten (35-meeri) (SEQ. ID nro 19) 5· CC GAG GAT CCA CTC ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT 3 '

BamHI Silmukoitumisen donorikohta B. Raskasketjun variaabeli alue 1, Aluke 5'-pään uudelleen muodostamista varten (37-meeri) (SEQ.

ID nro 20) 20 5' C AGA AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAA TCC AGC TGG GTC 3·

Hindlll Kozakin M K C S W V

, , konsensus- ·,·',·' sekvenssi

; ,·. 2. Aluke 3'-pään uudelleen muodostamista varten (33-meeri) (SEQ. ID

ϊ·ϊ * nro 21) ··· ·· • * · * . 25 · · ··· ··..-?! 5' CC GAG GAT CC A CTC ACC TGA GGA G AC GGT GAC T 3* HI BamHI Silmukoitumisen donorikohta • Il • · e

Esimerkki 3: Kimeerisen 21.6-vasta-aineen ekspres- • » » '·!·* 30 sio ja analysointi • · ·

Kaksi plasmidi-DNA:ta, jotka koodittivat kimeerisiä 21.6-kevytketjuja ja raskasketjuja, kotransfektoitiin Cos- ,···, soluihin. Kahden tai kolmen päivän päästä Cos-soluista • · *·| peräisin oleva elatusaine analysoitiin ELISA:11a 1) sil- 35 mälläpitäen ihmisen IgG:n kaltaisen vasta-aineen tuotantoa • · · • · • · ··« 117509 37 ja 2) silmällä pitäen tämän ihmisvasta-alneen kaltaisen vasta-aineen kykyä sitoutua L-soluihin, jotka ekspressoi-vat pinnallaan ihmisen a4pl-integriiniä. Kuvioissa 4 ja 12 esitetään analyysit puhdistamattomien ja proteiini A:11a 5 puhdistettujen, kimeeristä 21.6-vasta-ainetta sisältävien näytteiden sitoutumisesta ihmisen a4pl-integriiniin, ver- i rattuna puhdistettuun hiiren 21.6-vasta-aine-kontrolliin, Nämä kuviot osoittavat, että kimeerinen 21.6-vasta-aine sitoutui hyvin antigeeniin ja vahvistavat että oikeat hii-10 ren 21.6:n VL- ja VK-alueet oli kloonattu.

Esimerkki 4: Hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden rakennemallitus

Rakennettiin hiiren 21.6-vasta-aineen VL- ja VH-alu-eiden molekyylimalli. Malli rakennettiin Silicon Graphics '

15 IRIS 4D -työasemalla, joka toimi UNIX-käyttöjärjestelmällä ja jossa käytettiin QUANTA-molekyylimallituspakettia (Po-lygen Corp., USA). Hiiren 21.6:n VL-alueen FR:ien rakenne I

perustui ihmisen Bence-Jones-immunoglobuliini REl:n ratkaistuun rakenteeseen (Epp ym., Biochemistry 14:4943-4952 20 (1975)). Hiiren 21.6:n VH-alueen FR:ien rakenne pohjautui hiiren Gloop2-vasta-aineen ratkaistuun rakenteeseen.

FR:issä olevat identtiset aminohappotähteet jätettiin sil- * * ·

Ien; ei-identtiset aminohappotähteet substituoitiin käyt-tämällä QUANTA:ssa olevia mahdollisuuksia. Hiiren 21.6-VL- ; • · · *·* * 25 alueen CDR1 ja CDR2 tunnistettiin kuuluviksi kanonisiin · *· " rakenneryhmiin 2 ja vastaavasti 1 (Chothia ym. edellä).

Koska REl:n CDR1 ja CDR2 kuuluvat samoihin kanonisiin ryh-V · miin, hiiren 21.6:n CDRl ja CDR2, VL-alue mallitettiin poh jautuen REI:n CDRl:n ja CDR2:n rakenteisiin. Hiiren 21.6:n : 30 vL-alueen CDR3 ei vaikuttanut vastaavan mitään kanonista

«M

·***· rakenneryhmää VL-alueiden CDR3-alueille. Tietokantahaku • · · .

paljasti kuitenkin, että hiiren 21.6:n VL-alueessa oleva • · · CDR3 oli samanlainen kuin CDR3 hiiren HyHel-5:n VL-alueessa *···* (Sheriff ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8075-8079 ·· 35 (1987)). Niinpä hiiren 21.6:n VL-alueen CDR3 mallitettiin ···· ·*· • · • · ··· 117509 38 hiiren HyHEL-5:n VL-alueessa olevan CDR3:n rakenteen pohjalta. Hiiren 21.6:n VH-alueen CDRl:n ja CDR2:n tunnistettiin kuuluvan kanonisiin rakenneryhmiin 1 ja vastaavasti 2. Hiiren 21.6:n VH-alueen CDR1 mallitettiin Gloop2:n VH-5 alueen CDRl:n pohjalta, joka muistuttaa läheisesti kanoni- > sen ryhmän 1 jäseniä VH-alueiden CDRl:n suhteen. Hiiren 21.6:n VH-alueen CDR2 mallitettiin hiiren HyHEL-5:n CDR2:n pohjalta (Sheriff ym. edellä) joka on myös kanonisen ryhmän 2 jäsen VH-alueiden CDR2:n suhteen. VH-alueiden CDR3-10 alueille ei ole kanonisia rakenteita. Kuitenkin hiiren ? 21.6:n VH-alueessa oleva CDR3 oli samankaltainen kuin hiiren R19.9:n VH-alueen CDR3 (Lascombe ym., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 86:607-611 (1989)) ja se mallitettiin tämän CDR3:n pohjalta poistamalla ylimääräinen seriinitähde, 15 joka oli läsnä hiiren Rl9.9:n VH-alueen CDR3-silmukan kärjessä, ja liittämällä huippu yhteen ja jalostamalla se.

Malli alistettiin lopuksi jyrkimpien laskujen ("steepest f •il descents") ja konjugaattigradienttien energiaminimointiin CHARMM-potentiaalia käyttäen (Brooks ym., J. Comp. Chem.

20 4:187-217 (1983)) kuten QUANTA:ssa se on toteutettu, epä suotuisten atomikontaktien vapauttamiseksi ja van der S,·' Waalsin ja elektrostaattisten vuorovaikutusten optimoimi- i • · ♦ '£ .* I seksi. c • · · ***,· Hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden rakennemallin • · · *·* ] 25 kuva esitetään kuviossa 5. Mallia käytettiin avustamaan • · *· *! jalostettaessa humanisoidun 21.6-vasta-aineen variaabelei- ·.;.· den alueiden muotoilua.

··· : Esimerkki 5: Uudelleen muovattujen ihmisen 21.6:n variaabeleiden alueiden suunnittelu : 30 1. Homologisten ihmisvasta-aineiden valinta runko- • * · osan sekvenssille • « · · ' · '»

Ihmisen variaabeleita alueita, joiden FR:issä näkyi • · · *^#* korkea identiteettiprosentti hiiren 21.6:n FR:iin verra- f · *···* ten, tunnistettiin vertailemalla aminohapposekvenssejä.

·;· 35 Taulukot 4 ja 5 vertaavat hiiren 21.6:n variaabeleita alu- *«*· • * · « · • * • · ; 39 117509 eitä kaikkiin tunnettuihin hiiren variaabeleihin alueisiin > ja sitten kaikkiin tunnettuihin ihmisen variaabeleihin alueisiin. Hiiren 21.6:n VL-alue tunnistettiin kuuluvaksi hiiren kappa-VL-alueen alaryhmään 5 edellä mainitussa Kaba-5 tin ym. luettelossa. Tunnistettiin yksittäisiä hiiren kap-pa-VL-alueita, joissa oli jopa 93,4 %:n identiteetti hiiren 21.6:n kappa-VL-alueen kanssa (38C13VCL ja PC613'CL). Hiiren 21.6:n VL-alue oli samankaltaisin ihmisen alaryhmän 1 kappa-VL-alueiden kanssa edellä mainitussa Kabatin ym.

10 luettelossa. Tunnistettiin yksittäisiä ihmisen kappa-VL-alueita, joilla oli jopa 72,4 %:n identiteetti hiiren 21.6:n kappa-VL-alueen kanssa. Runko-osa-alueita (FR:iä), jotka olivat peräisin yhdestä samankaltaisimmasta ihmisen variaabelista alueesta, REI:sta, käytettiin suunniteltaes-15 sa uudelleen muovattu ihmisen 21.6:n VL-alue. Hiiren 21.6:n VH-alue tunnistettiin kuuluvaksi hiiren kappa-VH-alueen alaryhmään 2c edellä mainitussa Kabatin ym. luettelossa. i

Tunnistettiin yksittäisiä hiiren raskasketjun variaabeleita alueita, joilla on jopa 93,3 %:n identiteetti hiiren 20 21.6:n VH-alueen kanssa (17.2.25?CL ja 87.92.6'CL). Hiiren 21.6:n VH-alue oli samankaltaisin ihmisen alaryhmän 1 VH-alueiden kanssa edellä mainitussa Kabatin ym. luettelossa.

• « «

Tunnistettiin yksittäisiä ihmisen V„-alueita, joilla oli f j".' jopa 64,7 %:n identiteetti hiiren 21.6:n VH-alueen kanssa. 1 V , 25 Eniten samankaltaisesta ihmisen variaabelista alueesta, • · a ’· " 21/28'CL, peräisin olevia FR:iä käytettiin suunniteltaessa | t · * ' .

*·ί.* uudelleen muovattu ihmisen 21.6:n VH-alue.

• · * * 2. Runko-osa-alueissa olevien aminohappojen substi tuutio

Jj*i 30 a) Kevytketju :1: Seuraava vaihe uudelleenmuovatun ihmisen 21.6:n Vt- > • * · ' ./ alueen suunnitteluprosessissa oli liittää hiiren 21.6:n V,- ' • · · U '. * alueesta peräisin olevat CDR:t ihmisen REIrstä peräisin • · *···* oleviin FR-alueisiin (Palm ym. edellä). Uudelleenmuovatun *;· 35 ihmisen 21.6:n V,-alueen ensimmäisessä versiossa (La) ihmi- ; • · · · ^ * * · · • · • · , V,'i '40 1 1 7509 sen FR-alueisiin tehtiin seitsemän muutosta (taulukko 4, kuvio 6).

Asemissa 104, 105 ja 107 FR4:ssä REl:stä peräisin olevat aminohapot korvattiin tyypillisenunillä ihmisen J-5 alueen aminohapoilla, jotka olivat peräisin toisesta ihmi- sen kappa-kevytketjusta (Riechmann ym., Nature 332:323-327 (1988)).

Asemassa 45 FR2:ssa lysiini joka on normaalisti läsnä REI:ssä, muutettiin arginiiniksi joka löytyi tästä 10 asemasta hiiren 21.6:n VL-alueessa. Tässä asemassa olevan aminohappotähteen ajateltiin olevan tärkeä hiiren 21.6:n VL-alueen CDR2-silmukan tukemisessa.

Asemassa 49 FR2:ssa RElrssä normaalisti läsnä oleva tyrosiini muutettiin histidiiniksi, joka löytyy tästä ase- ^ ' -

15 masta hiiren 21.6:n Vt-alueessa. Tässä asemassa hiiren 21.6:n VL-alueessa olevan histidiinin havaittiin olevan mallissa sijoittuneena sitoutumiskohdan keskelle, ja se I

voisi mahdollisesti olla suorassa kontaktissa antigeenin kanssa vasta-aineen ja antigeenin keskinäisen sitoutumisen 20 aikana.

Asemassa 58 FR3:ssa REI:ssä normaalisti läsnä oleva SS' väliini muutettiin isoleusiiniksi, joka löytyy tässä ase- f: * · * massa hiiren 21.6:n VL-alueessa. Tässä asemassa läsnä ole-van aminohappotähteen ajateltiin olevan tärkeä hiiren t · · *·* 25 21.6:n VL-alueen CDR2-silmukan tukemisessa.

• · *J Asemassa 69 FR3:ssa REI:ssä normaalisti läsnä oleva • * treoniini muutettiin arginiiniksi, joka löytyy tästä ase- * · · V : masta hiiren 21.6:n VL-alueessa. Arginiinin, joka on tässä asemassa hiiren 21.6:n VL-alueessa, havaittiin olevan mal- : 30 lissa sijoittuneena hiiren 21.6:n VL-alueen CDRl-silmukan • · · ·’**; viereen, ja se voisi mahdollisesti olla suorassa kontak- • * · tissa antigeenin kanssa vasta-aineen ja antigeenin keski- *·’ näisen sitoutumisen aikana.

·*· • * *···* Toinen versio uudelleen muovatusta ihmisen 21.6:n 1 35 VL-alueesta (jolle annettiin nimeksi Lb) suunniteltiin niin • * · · * Φ * • * * · · 43. ; j 117509 että se sisälsi samat substituutiot kuin edellä, paitsi että mitään muutosta ei tehty asemaan 49 REI:n FR2:ssa.

(Kuvio 6).

b) Raskasketju 5 Seuraava vaihe suunniteltaessa uudelleen muovattua ihmisen 21.6:n VH-aluetta oli liittää hiiren 21.6:n VH-alu- h eesta peräisin olevat CDR:t 21/28'CL:stä peräisin oleviin FR:iin (Dersimonian ym., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)). Uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n V.-alueen en- f 10 simmäisessä versiossa (Ha) tehtiin viisi muutosta ihmisen runko-osa-alueisiin (taulukko 5, kuvio 7). Viisi muutosta ihmisen FR:issä olivat asemissa 27, 28, 29, 30 ja 71.

Asemissa 27, 28, 29 ja 30 FRl:ssä ihmisen 21/28'CL:ssä läsnä olevat aminohapot muutettiin aminoha- / 15 poiksi, jotka löytyvät näistä asemista hiiren 21.6:n VH-alueessa. Vaikka näiden asemien määritelläänkin olevan FRI:n sisällä (Rabat ym. edellä), asemat 26 - 30 ovat osa ;| rakenteellista silmukkaa joka muodostaa VH-alueen CDRl-sil-mukan. Näin ollen on todennäköistä, että näissä asemissa 20 olevat aminohapot ovat suoraan osallisena antigeeniin sitoutumisessa. Asemat 27 - 30 ovat todellakin osa kanonista rakennetta VH-alueen CDRl:n suhteen Chothian ym. edellä j • · · '·'»- mainitun määritelmän mukaan. ? ·*» · <

Asemassa 71 FR3:ssa ihmisen 21/28'CL:ssä läsnä ole- • · · *;* [ 25 va arginiini muutettiin alaniiniksi joka löytyi tästä ase- · • * · ·:·" ,r *· masta hiiren 21.6:n VH-alueessa. Asema 71 on osa kanonista .'* • · · rakennetta VM-alueen CDR2:n suhteen Chothian ym. edellä * * * .

·.· * mainitun määritelmän mukaan. Hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden mallista käy ilmi, että asemassa 71 oleva alanii- : :*: 30 ni on tärkeä VH-alueen CDR2-silmukan tukemisessa. Alaniinin • * · .· s substituutio arginiinilla tässä asemassa hyvin todennäköi- #·· f sesti rikkoisi CDR2-silmukan sijoittumisen.

Toinen versio (Hb) uudelleen muovatusta ihmisen • · *"·* 21.6:n VH-alueesta sisältää viisi muutosta, jotka on kuvat- • * « • · · · *·* • · • · • · · 117509 42 tu edellä silmälläpitäen versiota Ha, tehtiin ja yksi lisämuutos FR2:ssa.

Asemassa 44 FR2:ssa ihmisen 21/28’CL:ssä läsnä oleva arginiini muutettiin glysiiniksi, joka löydettiin tästä * 5 asemasta hiiren 21.6:n VH-alueessa. Perustuen VL-VH-alueiden f pakkautumista koskevaan julkaistuun informaatioon ja hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden malliin, ajateltiin että aminohappotähde asemassa 44 voisi olla tärkeä VL-VH-alueiden pakkautumisessa (Chothia ym. edellä) (kuvio 5).

10 Uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n V.-alueen versio

He suunniteltiin niin että CDR3-silmukka muuttuisi saman-kaltaisemmaksi ulkonäöltään kuin ihmisen VCAM-1. Sekä hiiren 21.6-vasta-aine että ihmisen VCAM-1 sitoutuvat α4β1-integriiniin. Vasta-aineiden VH-alueen CDR3-silmukka on 15 kirjavin kuudesta CDR-silmukasta ja se on yleensä tärkein yksittäinen vasta-aineen komponentti vasta-aineen ja antigeenin välisissä vuorovaikutuksissa (Chothia ym. edellä, /.·§·

Hoogenboom ja Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992);

Barbas ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4457-4461 20 (1992)). Jonkin verran sekvenssin samankaltaisuutta tun nistettiin hiiren 21.6:n VH-alueen CDR3:n ja ihmisen VCAM-l:n aminohappojen 86 - 94 välillä, erityisesti CDR3-sil- ? .* * mukassa olevan YGN (tyrosiini-glysiini-asparagiini) -sek- ? « * · · '.> ·*·.* venssin ja VCAM-1 :ssä olevan FGN (fenylalaniini-glysiini- * * · ' ' *·* j 25 asparagiini) -sekvenssin välillä. Näiden sekvenssien aja-• « · *· teilaan olevan sukua RGD (arginiini-glysiini-asparagiini- happo) -sekvensseille, jotka ovat tärkeitä monissa solu- : V ' adheesiotapahtumissa (Main ym., Cell 71:671-678 (1992)).

Niinpä kohdassa 98 CDR3:ssa hiiren 2l.6:n VH-alueessa läsnä :30 oleva tyrosiini muutettiin fenyylialaniiniksi joka löytyy • · · .1 2. ihmisen VCAM-1:n sekvenssistä.

• · • · · -f.

.*, Harkittiin myös mahdollista substituutiota FR2:ssa * * % -f olevassa asemassa 36. Hiiren 21.6:n VH-ketju sisältää epä- • · *··* tavallisen kysteiinitähteen FR2:ssa olevassa asemassa 36.

35 Tämä asema FR2:ssa on tavallisesti tryptofaani sukua ole- r 2 ··· • · • · ··· 43 117509 vissa hiiren ja ihmisen sekvensseissä (taulukko 5). Vaikka kysteiinitähteet ovat usein tärkeitä vasta-aineen konfor-maatiolle, hiiren 21.6:n variaabeleiden alueiden malli ei viitannut siihen, että tämä kysteiinitähde olisi mukana 5 suoraan tai epäsuorasti antigeeniin sitoutumisessa, joten

ihmisen 21/28'CL:n VH-alueen FR2:ssa läsnä oleva tryptofaa- J

ni jätettiin substituoimatta humanisoidun 21.6-vasta-ai-neen kaikissa kolmessa versiossa. ®

Esimerkki 6: Uudelleen muovattujen ihmisen 21.6-10 vasta-aineiden muodostaminen

Uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VL-alueen ensimmäinen versio (resh21.6VLa) muodostettiin limittäisistä PCR-fragmenteista oleellisesti Daughertyn ym. kuvaamalla tavalla, Nucleic Acids Res. 19:2471-2476 (1991). (Katso f 15 kuvio 8). Hiiren 21.6:n VL-aluetta, joka on sovitettu esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja sijoitettu pUC19:ään, käytettiin templaattina. Syntetisoitiin neljä paria alukkei- i ta, APCR1 - vlal, vla2 - vla3, vla4 - vla5 ja vla6 - vla7 (taulukko 6 ja kuvio 8). Vierekkäiset parit olivat limit- s 20 täisiä ainakin 21 emäksen verran. APCRl-aluke on komplementaarinen pUCl9-vektorin kanssa. Soveliaat alukeparit . . (0,2 pmoolia) yhdistettiin 10 ng:aan templaatti-DNA:ta ja * 1 · .2 1 yhteen yksikköön Amplitaq-DNA-polymeraasia (Perkin Elmer • 2 1 it •;|t: Cetus), 50 pl:ssa PCR-puskuria joka oli 10 mM Tris-HCl:n, :·: | 25 (pH 8,3), 50 mM KCl:n, 200 μΜ dNTP:ien ja 1,5 mM MgCl2:n

*· 2: suhteen. Kukin reaktio suoritettiin 25 syklillä. Sen jäi- S

·.·.· keen kun oli aluksi tehty sulatus 94 °C:n lämpötilassa 5 • · · · minuutin ajan, reaktioita lämpötila jaksotettiin seuraavas ti: 94 °C 1 minuutti, 55 °C 1 minuutti, ja 72 eC 2 minuut- : ·1· 30 tia, ja lopuksi inkuboitiin 72 °C vielä 10 min. Lämpöti- ··♦ .3. lanvaihtoaika alukkeen hybridisaatio- ja jatkamisvaiheen • · · välillä oli 2,5 min. Neljän reaktion tuotteet (A, B, C ja * · ♦ *·1 D) PCR-reaktioiden ensimmäisestä kierroksesta fenoliuutet- ·2 • · *···1 tiin ja etanolisaostettiin.

· · 2 * ···· 3 • · • · *·1 117509 44

Taulukko 6 PCR-alukkeet uudelleen muovattujen Ihmisen 21.6:n variaabeleiden alueiden muodostamista varten 5 A. Kevytketjun variaabeli alue 1, Alukkeet version "a" synteesiä varten 21.6VLal (39-meeri) (SEQ. ID nro 22): 5' GAT GGT GAC TCT ATC TCC TAC AGA TGC AGA CAG TGA GGA 3* 21.6VLa2 (32-meeri) (SEQ. ID nro 23): S' CTG TAG GAG ΑΤΑ GAG TCA CCA TCA CTT CCA AG 3« 21.6VLa3 (39-meeri) (SEQ. ID nro 24): S' AGG AGC ΤΤΓ TCC AGG TGT CTG TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3* 21.6VLa4 (41-meeri) (SEQ. ID nro 25) : 5' ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA GGC TGC TCA TAC AT 31 tc 21.6VLaS (40-meeri) (SEQ. ID nro 26): 5‘ GCA GGC TGC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3' 2l.6VLa6 (42-meeri) (SEQ. ID nro 27): i 5' ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT 3' 21.6VLa7 (59-meeri) (SEQ. ID nro 28): ,;! 5' CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTG CTG CCT TGA CCG AAC GTC CAC AGA TT 3' 20 2. Alukkeet version "b*' synteesiä varten Λ*. 21.6VLbi (33-meeri) (SEQ. ID nro 29): muuttaa H-49:n Y-49:ksi ·.*.· 5' GGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3' • · :.: : 2l.6VLb2 (38-meeri (SEQ. ID nro 30)): muuttaa ACC - 101:n ACA - lOl'.ksi

Styl-kohdan tuhoamiseksi V * oc 5' CCC AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GIG CC 3' • · • e · • · · • ♦ * · · *···* B, Raskasketjun variaabelialue • ·* • · · • f « • · 1, Alukkeet version "a" synteesiä varten j 21.6VHol (51-meeri) (SEQ. ID nro 31):

**··* JU 5' AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT

·***· 3*

• a J

• · · .···. 21 ,€VHa2 (67-meeri) (SEQ. ID nro 32): *.* · 5' AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG GAG > ... TGG ATG GGA AGG ΑΤΓ G 3' • * · *·’ 21.6VHa3 (26-meeri) (SEG. ID nro 33): .:. S' GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3' ...: 35 21.6VHa4 (66-meeri) (SEG. ID nro 34)

·*· 5' GAC LCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACC TCT GCC AGC

ACC GCC TAC ATG GAA 3' 21.6VHaS (64-meeri) (SEQ. ID nro 35): 5' CCA TAG CAT AGA CCC CGT AGT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGG CGC AGT AGT AGA CTG C\G TGT C 3' 117509 45 2l.6VHa6 (63-meeri) (SEQ. ID nro 36): 5' GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3' 5 2. Aluke version "b" synteesiä varten 21.6VHb (37-meeri) (SEQ. ID nro 37): muuttaa R-44:n G-44:ksi S' CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C .3' 3. Aluke version "c" synteesiä varten ^ 21.6VHC (27-meeri) (SEQ. ID nro 38): muuttaa Y-98:n F-98:ksi 5' CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3' C. Sekä kevyt- että raskasketjun variaabelit alueet

Alukkeet, jotka hybridisoituvat vieressä olevaan pUC19-vektorin 15 DNA-han APCRl (17-meeri (SEQ. ID nro 39)» "sense"-aluke 5' TAC GCA AAC CGC CTC TC 3 · '· APCR4 (18-meeri (SEG. ID nro 40), ,,anti-sense"-aluke 5' GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3' 20 PCR-tuotteet A ja B, ja C ja D liitettiin yhteen toisessa PCR-reaktioiden kierroksessa. PCR-tuotteet A ja ί.ϊ,ϊ B, ja C ja D, (50 ng kutakin) lisättiin 50 μ1:η PCR-reak- : tioihin (edellä kuvattujen kaltaisiin) ja monistettiin 20

II· I

·*·*· syklillä edellä kuvatulla tavalla, paitsi että hybridissä- .*.4; 25 tiolämpötila nostettiin 60 eC:seen. Näiden reaktioiden • * . tuotteille annettiin nimeksi E ja F. Käytetyt PCR-aluke- « · · t*;·, parit olivat APCRl - vla3 ja vastaavasti vla4 - vla7. PCR- * · · tuotteet E ja F uutettiin fenolilla ja seostettiin etano- , lilla ja sitten koottiin yhteen kolmannessa PCR-reaktioi- ♦ · · '··»' 30 den kierroksessa niiden omaan komplementaarisuuteen perus- • · *···* tuen kahden vaiheen PCR-reaktiossa, joka oli samankaltai- ·*·*· nen edellä esitetyn kanssa ja jossa käytettiin APCRl:tä ja .·*·. vla7:ää terminaalisina alukkeina. Täysin koostettu £rag- ·«· •e mentti, joka edusti koko uudelleenmuokattua ihmisen 21.6:n ··· 35 VL-aluetta, leader-sekvenssi mukaan lukien, digestoitiin • · 9 · • · · 117509 46

Hindlllrlla ja BamHI:lla ja kloonattiin pUC19:ään sekvensointia varten. Kloonille, jossa on oikea sekvenssi, annettiin nimeksi resh21.6VLa.

Uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VL-alueen toinen 5 versio (Lb) muodostettiin käyttämällä PCR-alukkeita, joil- la tehtiin vähäisiä muutoksia uudelleen muovatun ihmisen f 21.6:n VL-alueen ensimmäiseen versioon (La) Kammanin ym. menetelmällä, Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989). Syntetisoitiin kaksi alukeryhmää (taulukko 6). Kukin PCR-reaktio 10 suoritettiin oleellisesti samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. Ensimmäisessä PCR-reaktiossa mutageenistä aluketta 21.6Vlb2 käytettiin tuhoamaan Styl-kohta (Thr-ACC-97 Thr-ACA-97:ksi) jolloin saatiin resh21.6VLa2. Sitten toisessa PCR-reaktiossa mutageenista aluketta 21.6Vlbl 15 (His-49 - Tyr-49:ksi) käytettiin pUC-resh21.6VLa2:n olles sa templaatti-DNA:na. PCR-tuote leikattiin Styl:llä ja BamHI:lla ja subkloonattiin pUC-resh21.6Vla2:11a, joka oli katkaistu samoilla restriktioentsyymeillä. Kloonille jossa J, oli oikea sekvenssi, annettiin nimeksi pUC-resh21.6Vlb.

20 Uudelleen muovatun ihmisen 2l.6:n VH-alueen versio "a" muodostettiin käyttämällä samoja PCR-menetelmiä kuin edellä on kuvattu uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n V.-alu-• · · ** • ,·, een version "a" muodostamisessa (taulukko 6 ja kuvio 9). ί • · · ’·’·!' **J/ Hindlll-BamHI-DNA-fragmentit, jotka koodittavat uudelleen * , 25 muovatun ihmisen 425-V„-alueen versiota "g" (Kettleborough • * » *· " ym. edellä) ja uudelleen muovatun ihmisen AUK12-20:n VH- • · · *·ί·* alueen versiota "b", subkloonattiin pUC19-vektoreihin joi- V : loin saatiin pUC-resh425g ja vastaavasti pUC-reshAUK12- 20b. (AUKl2-20:n versio "b" saatiin PCR-mutageneesillä 30 fragmentista VHa425, joka on kuvattu edellä mainitussa :1 2: Kettleboroughin ym. artikkelissa, ja se koodittaa amino- .1. happosekvenssiä (SEQ ID nro 41): • · • · · * ♦ ·· • · • · • · · · « 2 »M • · • · ' ' *·· • · · .

117509 47 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH WVRQAPGQGLEWVG YIDPFNGGTSYNQKFKG kvtmtvdtstntaymelsslrssotavyycah ggn-rfay wgqgtlvtvss 5 (välit erottavat FR- ja CDR-alueita)). | .5

Plasmidia pUC-resh425g ja pUC-reshAUK12-20b, samoin kuin hiiren 21.6-V„-alueen sisältävä pUC-vektorl, joka on f modifioitu käytettäväksi kimeerisen 21.6-raskasketjun muo- ! 10 dostamisessa (pUC-chim21.6VH), käytettiin templaatti-DNA- molekyyleinä seuraavissa PCR-reaktioissa. Suunniteltiin ja syntetisoitiin PCR-alukkeet uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VH-alueen version "a" muodostamista varten (taulukko 6). PCR-tuote A (kuvio 9) saatiin käyttämällä pUC- 15 reshAUK12-20b:tä DNA-templaattina ja APCR1 - vhal;tä PCR- alukeparina. PCR-tuotteet B ja D saatiin käyttämällä pUC-

chim21.6VH:ta DNA-templaattina ja vha2 - vha3:ea ja vas- I

taavasti vhaö - APCR4:ää PCR-alukepareina. Lopuksi PCR- 4 tuote C hankittiin käyttämällä pUC-resh425g:tä DNA-temp- i 20 laattina ja vla4 - vla5:tä PCR-alukeparina. Lopullinen PCR-tuote subkloonattiin pUCl9:ään Hindlll-BamHI-fragment- iV: tina DNA-sekvensointia varten. Klooni, jossa on oikea DNA- * ♦ i .1. sekvenssi, sai nimekseen pUC-resh21.6VHa. Uudelleen muova- ··· 1 tun 21.6:n variaabelin alueen ensimmäisen version DNA- ia • · « ^ . .

.·. · 25 aminohapposekvenssit esitetään kuviossa 10.

* »· Jäljellä olevat versiot uudelleen muovatusta ihmi- t « t sen 21.6:n VH-alueesta muodostettiin oleellisesti kuten • 1 · **' 1 edellä on kuvattu uudelleen muovatun ihmisen 2l.6:n VL-alu- een version "b" muodostamisen yhteydessä. Syntetisoitiin 30 kaksi alukejoukkoa (taulukko 6). Toista (Hb) ja kolmatta ··· (He) versiota varten PCR-reaktioissa käytettiin mutagee-

nisiä alukkeita 21.6VHb (Arg-44 Gly-44:ksi) ja vastaavasti S

,1··, 21.6VHc (Tyr-98 Phe-98:ksi) pUC-resh21.6VHa:n ollessa ΐ • · templaatti-DNA:na. PCR-tuotteet VHb ja VHc katkaistiin ...T 35 restriktioentsyymeillä ja subkloonattiin pUC-vektoriin

»M

• · ...

· · βι**·”1·· 117509 48 4 pUC-resh21.6VHa Mscl-BamHI- ja vastaavasti Pstl-BamHI- fragmentteina, jolloin saatiin pUC-resh21.6VHb ja pUC-resh21.6VHc.

Uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VH-alueen ensim- * 5 mäinen versio (Ha) muodostettiin samanlaisella tavalla f kuin se jota käytettiin muodostettaessa uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VL-alueen ensimmäinen versio (La). Tässä tapauksessa käytettiin kuitenkin PCR-alukkeita kolmen erilaisen templaatti-DNA:n kanssa, hiiren 21.6-VH-aluke joka 10 oli jo muokattu kimeerisen 21.6-raskasketjun ekspressiota varten, humanisoitu 425-V„-alueen versio "g" (Kettleborough ym. edellä) ja humanisoitu AUK12-20-versio "b" VH-alue (taulukko 6, kuvio 9). Humanisoidun 21.6:n raskasketjun variaabelin alueen ensimmäisen version DNA- ja aminohappo- § 15 sekvenssit esitetään kuviossa 11. Humanisoidun 21.6:n VH-alueen toinen ja kolmas versio (Hb ja He) muokattiin käyttäen PCR-alukkeita joilla tehtiin vähäisiä modifikaatioita f humanisoidun 21.6:n VH-alueen ensimmäiseen versioon (Ha) (taulukko 6).

20 Esimerkki 7: Humanisoitujen vasta-aineiden ekspres- sio ja analysointi ·· 1. Variaabeleiden alueiden liittäminen vakioaluei- • · · .* * siin ekspressiovektoreissa t · * *",* DNA-fragmentit, jotka koodittivat kimeerisiä ja s · · *;* * 25 uudelleen muovattuja 21.6:n VL- ja VH-alueita, subkloonat- • · · *· *· tiin HCMV-vektoreihin jotka oli suunniteltu ekspressoimaan joko ihmisen kappa-kevytketjuja tai ihmisen γ-1-raskasket- ··· *,· ϊ juja nisäkässoluissa (katso kuvio 3) ja Maeda ym., Hum.

Antibod. Hybridomas 2:124-134 (1991). Molemmat vektorit • ·*; 30 sisältävät ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) promoottorin * * * .*·’. ja geenintehostajan immunoglobuliinin kevyt- ja raskasket- ··· jujen korkean tason transkriptiota varten. Kevytketjun • i *·[ * ekspressiovektori on oleellisesti samanlainen kuin Maeda • · *·.·* ym., edellä, ovat kuvanneet, ja se sisältää genomisen t ··· 35 DNA:n joka koodittaa ihmisen kappa-vakioaluetta (Rabbitts • · · * · • · ··· 49 117509 ym., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)). Raskasketjun ekspressiovektori on oleellisesti samanlainen kuin Maeda ym., edellä, ovat kuvanneet, sillä poikkeuksella että ihmisen γ-1-vakioaluetta koodittava genominen DNA 5 korvattiin cDNA:lla. cDNA joka koodittaa ihmisen γ-1-va- kioaluetta, kloonattiin PCRtllä ihmisen solulinjasta joka ^ eritti ihmisen γ-1-vasta-ainetta. Silmällä pitäen mukavaa subkloonausta ekspressiovektoriin cDNA:n kumpaankin päähän luotiin BamHI-kohdat. Lisäksi cDNA-sekvenssin 5'-päähän 10 luotiin silmukoitumisen akseptorikohta ("splice acceptor site") ja 65 emäsparin intronisekvenssi. BamHI-fragmentti (1176 bp), joka sisälsi ihmisen gamma-l-cDNA:n silmukoitumisen akseptorikohdan ("splice acceptor site") ja introni-sekvenssin, sijoitettiin olemassa olevan raskasketjuvekto- | 15 rin (Maeda ym. edellä) BamHI-fragmentin (noin 2,0 kb) tilalle. Sitten BamHI-kohta, joka oli 3'-suuntaan ihmisen gamma-1-vakioalueesta, poistettiin Klenow-polymeraasilla. f 2. Ekspressiovektoreiden transfektio Ekspressiovektoreita tuotiin Cos-soluihin elektro-20 poraatiolla käyttämällä Gene Pulsar -laitetta (BioRad).

DNA (10 pg kumpaakin vektoria) lisättiin 0,8 ml:n erään jossa oli 1 x 107 solua/ml PBS:ssä. Annettiin 1 900 voltin ♦ · · .

.* , pulssi, 25 pF:n kapasitanssi. Huoneenlämpötilassa annetun | • a · ' .s · ’·'* "*.* 10 minuutin toipumisjakson jälkeen elektroporatoidut solut • · a *·* ] 25 lisättiin 8 ml:aan DMEM:iä (GIBCO) joka sisälsi 5 % läm- » · · *· möllä inaktivoitua gammaglobuliinitonta fetaalinaudan see- rumia. 72 tunnin inkubaation jälkeen elatusaine kerättiin, ··· V · sentrifugoitiin soluroskan poistamiseksi ja varastoitiin steriileissä oloissa 4 °C:n lämpötilaan lyhyiksi ajoiksi j 30 tai -20 °C:n lämpötilaan pitemmiksi ajoiksi.

··· ·1· 3. Humanisoitujen vasta-aineiden puhdistus ···

Cos-solutransfektioista saadut supernatantit yhdis- • · · - *·*/ tettiin ja puhdistettiin immobilisoidulla proteiini A: 11a • · *···* (ImmunoPure igG Purification Kit, Pierce). Supernatantti 35 steriloitiin suodattamalla 0,22 pm:n filtterin läpi. Sen »•f* • · · • · ··· 117509 so ,νΒ, jälkeen kun se oli sekoitettu yhtä suureen tilavuuteen ImmunoPure IgG-sitomispuskuria (pH 8,0), laimennettu näyte pantiin 1 ml:n proteiini A -pylvääseen ja annettiin valua täysin geeliin. Sen jälkeen kun oli pesty 15 ml:11a f 5 ImmunoPure lgG-sitoutumispuskuria, sitoutunut vasta-aine < eluoitiin 5 ml:11a ImmunoPure igG-eluutiopuskuria (pH 2,8) ja kerättiin 1 ml:n fraktioita. Ensimmäisen ja toisen

fraktion pH oli noin 8,0. Kolmannen fraktion pH säädettiin J

fysiologiseen pH:hon lisäämällä 100 μΐ ImmunoPure-sitoutu-10 mispuskuria. Viisi 1 ml:n fraktiota, jotka sisälsivät proteiini A -puhdistetun vasta-aineen, määritettiin sitten ELISA:11a jotta saataisiin määritettyä kussakin fraktiossa olevan ihmisperäisen IgG-vasta-aineen määrä. Vasta-aine detektoitiin käyttämällä emäksiseen fosfataasiin konjugoi- f 15 tua, ihmisen IgG:tä vastaan suunnattua vuohen vasta-ainetta (koko molekyyli, Sigma).

4. Sitoutumisaffiniteetin mittaus f

Uudelleen muovattujen ihmisen 21.6-vasta-aineiden sitoutuminen a4pi-integriiniin määritettiin ELISA: 11a ver- 20 tailemalla hiiren ja kimeerisiin vasta-aineisiin. Lyhyesti ilmaisten, L-solut jotka oli transformoitu ekspressoimaan .*,·. o4pi-integriiniä pinnallaan, maljättiin ja kasvatettiin j, • · · konfluenteiksi 96-kuoppaisilla kudosviljelylevyillä. Tes- 0? • · · ' '·* tattavat näytteet (joko epäpuhtaat supernatantit tai pro- • ( · • i · _ ; e 25 teiini A:11a puhdistetut) laimennettiin laimennossarjana • · · *· ja lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen kun oli inku- * *·ί·* boitu 1 tunti jäillä ja tehty hyvin hellävarainen pesu, • · · V : lisättiin hiiren immunoglobuliinia tai ihmisen immunoglo- buliinia (gammaketjuspesifinen) vastaan suunnatut vuohen ! Γ: 30 peroksidaasikonjugaatit (Sigma). Sen jälkeen kun oli vielä :***: inkuboitu 1 tunti jäillä ja pesty hyvin hellävaroen, li- I·· sättiin substraatti (o-fenyleenidiamiinidihydrokloridi, ·,, Sigma). Sen jälkeen kun oli inkuboitu 30 minuuttia huo- • · *·;** neenlämpötilassa, reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 M H2S04 *:* 35 ja A490 mitattiin.

•··· ··· • · • · ··· 117509 51

Tulokset uudelleen muovattujen Ihmisen 21.6:n ke- vytketjujen kahden version (La ja Lb) epäpuhtaiden super-natanttien, yhdistelmänä uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n raskasketjun Ha-version kanssa, analyysistä osoittivat 5 että uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VL-alueen La-versio ; antoi hieman paremman antigeeniin sitoutumisen kuin versio Lb. La-versiota käytettiin näin ollen myöhemmissä kokeissa. Tulokset humanisoitujen 21.6-raskasketjujen (Ha ja Hb) f epäpuhtaista supernatanteista, yhdistelmänä humanisoidun 10 21.6-kevytketjun version La kanssa, tehdyistä analyyseistä eivät osoittaneet merkitsevää eroa uudelleen muovattujen ihmisen VH-alueiden kahden version (Ha ja Hb) välillä. Versio Ha valittiin käytettäväksi jatkokokeissa, koska se sisälsi vain viisi muutosta ihmisen FRrissä verrattuna | 15 kuuteen muutokseen ihmisen Hb:ssä.

Kuvio 12 vertailee humanisoidun 21.6-vasta-aineen (La + Ha) ja kimeerisen 21.6-vasta-aineen sitoutumista.

Tulokset viittaavat siihen, että uudelleen muovattu ihmi- * sen 21.6-vasta-aine (La + Ha) sitoutui antigeeniin yhtä 20 hyvin kuin, ja ehkä hieman paremmin kuin, kimeerinen 21.6-vasta-aine. Kimeerisen 21.6-vasta-aineen odotetaan olevan ekvivalentti hiiren 21.6-vasta-aineen kanssa, mitä tulee ? • * » • sen antigeenin sitomisominaisuuksiin, koska se sisältää ;t * * * "I." koskemattomat hiiren 21,6:n variaabelit alueet. Uudelleen • * · • t · ; , 25 muovatun ihmisen 21.6-vasta-aineen (La + Ha) on myös osoi- • · · *· " tettu estävän sitoutumista ihmisen a4pl-integriiniin te- • · · *·ϊ·* holla, joka on vertailukelpoinen alkuperäisen hiiren 21.6- ·· * vasta-aineen ja kimeerisen vasta-aineen kanssa. Niinpä päätellään, että uudelleen muovatulla ihmisen 21.6-vasta-: 30 aineella (La + Ha) on spesifinen sitoutumisaffiniteetti, :***· joka on oleellisesti yhtä suuri kuin hiiren 21.6-vasta- -.¾ t · · aineen sitoutumisaf f ini teetti. Lisäksi koska vain vähäiset * · *

modifikaatiot ihmisen FR:issä olivat tarpeen jotta saatiin J

* » *·;·* luotua uudelleen hiiren 21.6-vasta-aineen antigeenin si- *!* 35 toutumiskohta ihmisen variaabeleissa alueissa, uudelleen ··· • · • · ··· 117509 ' b2 muovatun Ihmisen 21.6-vasta-aineen ennustetaan käyttäytyvän kuten autenttinen ihmisen vasta-aine.

Uudelleen muovattu ihmisen 21.6-vasta-aine, joka sisälsi version La uudelleen muovatusta ihmisen 21.6:n VL-5 alueesta ja version He uudelleen muovatusta ihmisen 21.6:n VH-alueesta, testattiin myös silmälläpitäen sitoutumista L-soluihin jotka ekspressoivat ihmisen a4pi-integriiniä pinnallaan rinnakkain kimeerisen 21.6-vasta-aineen kanssa. ‘

Tulokset viittaavat siihen, että uudelleen muovattu ihmi-10 sen 21.6-vasta-aine (La + He) sitoutuu hyvin antigeeniin.

VH-alueen CDR3:ssa oleva muutos ei häirinnyt antigeeniin sitoutumista. On todellakin jotain viitettä siitä, että muutos CDR3:ssa on mahdollisesti parantanut hieman antigeeniin sitoutumista (kuvio 12). On ymmärrettävää että 15 parannus voi olla selvempi toiminnallisessa estomäärityk-sessä.

Esimerkki 8: μ 21.6-vasta-aineen esto-ominaisuudet i μ 21.6:ta verrattiin toiseen a4-integriiniä vastaan suunnattuun vasta-aineeseen, nimeltä L25. L25 on kaupalli-20 sesti saatavilla Becton Dickinsonilta ja sen on kirjallisuudessa raportoitu olevan a4pi-integriinin adhesiivisen toiminnon hyvä estäjä. Kuten kuviossa 13 (osakuva A) osoi- • · · ,* * tetaan, sekä μ 21.6 että L25 inhiboivat täysin ihmisen : *11,' monosyyttisten solujen a4pi-integriini-riippuvaisen adhee- • · · *·* [ 25 sion puhdistettuun VCAM-l:een Mn+2:n poissaollessa. Kuiten- • * · 5 ' 3 ** *· kin Mn :n läsnäollessa (1 mM) (yksi useista a4pl-integrii- *.i.* nin aktivaattoreista) L25 ei enää ollut tehokas inhibiit- *·· :.: · tori. Samankaltaisia tuloksia havaittiin, kun a4pl-integ- riini aktivoitiin muilla ärsykkeillä. Kyky tukkia aktivoi- : ϊ*: 30 tu a4pi-integriini on todennäköisesti arvokas hoidettaessa • · · ·***· tulehdustauteja kuten multippeliskleroosia. - • · · ,1, Jatkovertailuna μ 21.6:n ja L25:n välillä määritet- tiin vasta-aineen kyky estää ihmisen T-solun adheesio • · *···* VCAM-l:n kasvaviin määriin. Tässä kokeessa kasvavia määriä 35 VCAM-l:tä päällystettiin 96-kuoppaisen määrityslevyn muo- • · · • · • · 117509 53 vikuoppien pintaan ja mitattiin ihmisen Jurkat-T-solulin-jan (joka ekspressoi korkeita tasoja a4pl-integriiniä) kykyä sitoutua päällystettyihin kuoppiin. Arvot Y-akselil-la ovat, niistä Jurkat-soluista jotka lisättiin alun perin 5 kuhunkin kuoppaan, se prosenttiosuus joka pysyi sitoutu- / neena sen jälkeen kun kuoppa oli pesty neljä kertaa (kuvio 13 (osakuva B)). Tämä koe osoittaa, että L25 on soluadhee-sion hyvä inhibiittori kun alhaisia tasoja VCAM-l:tä kohdataan, mutta se muuttuu täysin tehottomaksi kun VCAM-l:n 10 tasot ovat korkeita, μ 21.6 toisaalta inhiboi soluadhee-sion täysin riippumatta läsnä olevan VCAM-l:n määrästä.

Estokyky VCAM-l:n korkeiden pitoisuuksien läsnäollessa on suotava terapeuttisissa sovellutuksissa, koska VCAM-1 on ylösajettu tulehduskohdissa. { 15 Esimerkki 9: Humanisoidun 21.6-vasta-aineen teho eläinmallissa Tämä esimerkki osoittaa humanisoidun 21.6-vasta- ΐ aineen tehon EAE:n profylaktisessa ja terapeuttisessa hoidossa eläinmallissa, joka jäljittelee multippeliskleroosia 20 ihmisissä.

a) Menetelmät #·.·. 1) EAE:n induktio ΐ • · · / ^ Aivot ja selkäydin poistettiin kustakin viidestä | ***** marsusta, jotka oli lopetettu C02-nukutuksella. Kudos pi- • · · ’·* ] 25 dettiin PBSissä jäillä, kunnes se punnittiin ja homogeni- • · · ** *· soitiin konsentraatioon 1 gramma kudosta per ml PBS:ää.

Kudos homogenisoitiin täydellisesti käyttämällä sähköllä ··· *.· · toimivaa kädessä pidettävää homogenisaattoria ja sekoitet tiin tämän jälkeen yhtä suureen tilavuuteen Freudin täy-: 30 dellistä adjuvanttia (FCA). FCA tehtiin lisäämällä 100 mg • ti e ;1· Mycobacterium tuberculosis H37 RA:ta (DIFCO, 3114-33-8) ·»« 10 ml:aan Freundin epätäydellistä adjuvanttia (Sigma, F- • · · 5506). Soes emulgoitiin sakeudeltaan majoneesin kaltaisek- • » *···* si viemällä liuos kahden ruiskun läpi, jotka oli yhdistet- «·* ·*·· ··· • · • · #·· „ : 117509 54 ty kaksitiesulkuhanalia. Kukin marsu immunisoitiin 500 pl:lla emulsiota, joka jaettiin kolmeen antokohtaan.

2) Eläinten arviointi taudin oireiden mukaan Taudin oireet arvioitiin yllyttämällä kukin eläin ii 5 kävelemään ja antamalla eläimelle pistemäärä seuraavilla yleisesti hyväksytyillä kriteereillä: 0 Ei tautia 1 Takajalkojen heikkoutta f 2 Täydellinen takajalkojen halvaus f 10 3 Täydellinen takajalkojen halvaus ja jonkin verran etujalkojen halvausta 4 Kuolemaisillaan tai kuollut 3 Seerumin j a kudoksen keräys 15 Näytteet kerättiin sydänpunktiolla metoksifluraa- --f nilla nukutetuista marsuista. Noin 300 - 400 μΐ verta kerättiin ja sijoitettiin "microtainer"-seerumierotuslait- | teeseen ja annettiin jähmettyä 20 - 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Putkea ajettiin sitten sentrifuugissa 20 noin 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Seerumi valutettiin Eppendorf-putkiin ja se varastoitiin -20 "C:n lämpötilaan jatkoanalyysiä varten, jossa vasta-ainetiitterit analysoi-* * » <./ .*I tiin fluoresoivan vasta-aineen avulla tapahtuvalla solu- • * * * erottelulla (FACS).

• ·φ ' ' • · · *·* ] 25 Hematologista analyysiä varten veri kerättiin ety- • · · *. *: leenidiamiinitetraetikkahapolla päällystettyihin • "microtainer"-putkiin. 100 μ1:η erä imettiin akridiinilla • * * ·/· · päällystettyyn hematokriittiputkeen. Putki tulpattiin ja veri sekoitettiin akridiinioranssin kanssa kääntämällä : :*; 30 putkea hellävaroen ympäri 15 kertaa. Koho ("float") pan- • * · . ;v ;’**. tiin hematokriittiputkeen ja näytettä sentrifugoitiin 5 f *·· ,·. minuuttia. Hematokriittiputki sijoitettiin esikalibroituun " ···'- *·* * Idexx QBC Vet Autoreader -laitteeseen joka oli suunniteltu ··· w * · 1 *···* kvantitatiiviseen verihiutale- ja valkosolukerroksen 1 35 ( "buf fey coat") analysiin. Arvot luettiin hevoseen perus- * · » • * · * * • · *·· 117509 55 ';v. '-f tuvan kalibraatiojärjestelmän ("horse calibration system") avulla ja ne sovitettiin ekvivalenteiksi marsun arvoiksi käyttämällä ennalta määritettyä konversiokerrointa.

Kokeen lopussa marsut tapettiin C02-narkoosilla ja f 5 aivot ja selkäytimet poistettiin. Puolet aivoista ja sei- f käytimestä kustakin marsusta pikapakastettiin 2-metyyli-butaanissa kuivajäällä (-20 - -40 °C). Tämä kudos leikattiin ja immunovärjättiin yleisellä makrofaagimarkkerilla (Serotec MCA-518) ja T-lymfosyyttimarkkerilla (Serotec f 10 MCA-751) käyttämällä avidiini-biotiiniin kytkettyä perok- > sidaasimääriystä (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ja diaminobentsidiiniä kromageeninä. Kudos pisteytettiin soluinfiltraatiota silmälläpitäen seuraavan pisteytysjärjestelmän mukaisesti: ϊ 15 0 Ei infiltroivia soluja. 5 0.5 Hyvin vähän värjäytymistä; voi olla artefakta; tavallisesti suoniin liittyneenä > 1 Joidenkin solujen värjäytymistä (vähemmän kuin ·. ΐ 15) tavallisesti lähellä suonta t 20 2 Monien solujen värjäytymistä (20 - 50), taval lisesti säteilee ulos suonesta.

3 Monien solujen värjäytymistä (> 50), hajallaan • f * • ^ koko kudoksessa; monia suonia joihin on kerrostunut soluja u • · · "I.* ("many cuffed vessels").

J · j :· ; I 25 b) Profylaktinen hoito * * * ’· ** Tämä koe suunniteltiin jotta saataisiin arvioitua • · · *·!·* millä teholla humanisoitu 21.6-vasta-aine viivästyttää • Φ *.· · kliinisten oireiden alkua. Aikaisemmat tulokset ovat osoittaneet, että leukosyyttien tulo EAE-marsujen aivoihin 30 ja selkäytimiin alkaa tyypillisesti päivän 7 ja päivän 8 välissä. Niinpä vasta-aineita annettiin päivänä 7 ja päi- • · * vänä 10 immunisaation jälkeen. Jotta vertailtaisiin hiiren * * * • · · ja humanisoitua 21.6-vasta-ainetta, annettiin ekvivalentit * * **;·* annokset kumpaakin vasta-ainetta (3,0, 0,30 ja 0,03 mg/ #>*j* 35 kg). Alustavat farmakokineettiset tutkimukset paljastivat, • * · • · ♦ · φ · · ( 117509 56 että hiiren 21.6-vasta-aineen saturoivat tasot veressä saatiin 24 tunnissa ihonalaisen antamisen jälkeen ja ne pysyivat koholla jopa 48 tuntia.

Päivänä 11, 24 tuntia toisen vasta-aine-annoksen 5 jälkeen, otettiin verinäytteet kolmesta satunnaisesti valitusta eläimestä kussakin ryhmässä. Kutakin hoitoryhmää ) varten laskettiin keskiarvo niiden päivien määrästä, jotka kukin marsu tarvitsi päästäkseen kliiniseen arvoon 1 (taulukko 7). Keskimääräinen arvo PBS:llä hoidetulle ryhmälle 10 tässä kokeessa oli 11 päivää immunisaation jälkeen (joka on tyypillinen aikaisemmille tuloksille). Hoito korkeimmalla annoksella humanisoitua ja hiiren vasta-ainetta sai aikaan taudin merkittävän viivästymisen 4.6:11a (p = 0,000) ja vastaavasti 3:11a (p * 0,007) päivällä. Pieneni- ^ IS millä vasta-aine-annoksilla ei ollut vaikutusta taudin kulkuun. <

Taulukko 7 zu

Ryh“ä j_ 1 2 3 4 5 6 Ί • · "" ..TT' \V mg/kg 0,03 M* 3,0 H® 3,0 H 3,0 M 0,03 PBS 0,3 M 1

: H

• · * - - - ---- I |- — - ----- ·«· i β*·* 8 9 13 10 β 9 g V ; 9 10 15 12 10 9 9 .·. ; 25 9 10 15 14 10 11 11 4 ·. *: 9 11 16 14 11 11 12 2 . .*. 11 11 16 14 12 11 i2 *·*·* 12 11 16 15 12 12 13 ;*$*. 12 12 17 15 12 12 13 ·* * I___13__17__18__12__13

Keskiarvo 10,0+ 10,9+ **15,6 *14,0 10,9+ 11,0 11,6 + ·". - 1,6 1,2 + + 1 - 5 + 14 30 kesklha- > > 1 "a ' ... __ 1 , J i , J__[ 1,4 i • · ··· Päivittäiset marsun ruumiinpainot heijastelivat * · · * ,···. samanlaista vaikutusta humanisoidun ja hiiren vasta-aineen « * * "* korkeilla annoksilla (kuvio 14). Näissä hoitoryhmissä ole- 35 vat eläimet lisäsivät painoaan tasaisesti. Kaikissa muissa • ♦ · • « ♦ · ··· 117509 57 hoitoryhmissä olevat marsut menettivät painoaan alkaen päivästä juuri ennen oireiden alkamista.

Vasta-aineen seerumitiitterit mitattiin kolmessa satunnaisesti valitussa eläimessä kussakin ryhmässä sydän-5 punktiolla päivänä 11, noin 24 tuntia toisen käsittelyn jälkeen. Vasta-aineiden teho taudin viivästyttäraisessä korreloi selkeästi seerumitasojen kanssa. Noin 20 pg/ml seerumin vasta-ainetta oli läsnä kaikkien niiden eläinten verenkierrossa, jotka oli injektoitu korkeimmalla annok-10 sella, sekä humanisoidun että hiiren vasta-aineen ollessa kyseessä. Tämä konsentraatio on samaa suuruusluokkaa kuin se 21.6-vasta-aineen konsentraatio joka vaaditaan VLA-4-kohtien saturointiin in vitro. Sitä vastoin kaikista muista ryhmistä peräisin olevilla eläimillä ei ollut yhtään 15 tai ei havaittavaa seerumin vasta-ainetta.

c) Meneillään olevan taudin kulun kääntäminen Noin 60 marsua immunisoitiin ja niiden annettiin f kehittää EAE;n kliinisiä oireita. Päivänä 13 kaikki ne ; marsut, jotka saivat kliiniseksi arvoksi 1, jaettiin sa-20 tunnaisesti hoitoryhmiin. Kuviosta 15 käy ilmi, että eläimillä, joita hoidettiin humanisoidun vasta-aineen annok-sella 3 mg/kg, takaraajojen toiminta alkoi palautua 48 tuntia hoidosta. Päivinä 17 ja 18, yksi tai kaksi päivää ’ * · · *.**,1 toisen annoksen jälkeen, yhdelläkään kahdeksasta eläimestä • · i ; 25 ei enää ollut tautia. Kunkin hoitoryhmän tapauksessa käy- * · · *· 1: rän arvojen alapuolella olleen alueen ANOVA paljasti, että ί vain sen ryhmän arvo, jota on hoidettu humanisoidun vasta- » · » *.· · aineeen annoksella 3 mg/kg, oli tilastollisesti pienempi kuin PBS-kontrolliryhmän (p 0,042). Näiden eläinten pai-: 30 no nousi progressiivisesti 24 tuntia ensimmäisen antamisen jälkeen, kunnes koe lopetettiin päivänä 19 (kuvio 16). .

···

Vasta-ainetiitterit seerumissa mitattiin FACS-ana-• · · 1 lyysillä näytteistä, jotka oli otettu 24 tuntia ensimmäi- ·.

• · *·“1 sen injektion jälkeen (päivä 14) ja uhrattaessa (päivä ··· 35 19). Hoito hiiren 21.6-vasta-aineella johti hieman alhai- ·««» • · · • · · · ...

1 1 7509 58 ,.-j sempiin seerumin vasta-ainetiitterelhin kuin hoito humanisoidulla 21.6-vasta-aineella (9,1 ja 12,6 pg/ml). Tämä ero tuli selvemmäksi päivänä 19, kolme päivää toisen antamisen jälkeen, kun seerumissa oli hyvin vähän havaittavissa ole-5 vaa hiiren vasta-ainetta, kun taas humanisoidun vasta-aineen tasot päivänä 19 olivat pudonneet saturoivan tason alapuolelle mutta ne olivat silti havaittavissa (6,1 pg/ ml). Nämä tulokset osoittavat korrelaation vasta-aineen ί plasmatasojen ja fysiologisen tehon välillä, ja viittaavat 10 siihen että tehokas veressä kiertävän vasta-aineen taso on marsussa välillä 10 - 20 pg/ml.

Leukosyyttien infiltraatio aivoihin ja selkäytimeen arvioitiin kudoksesta, joka oli peräisin eläimistä, jotka > ' ' '& oli tapettu päivänä 19. Taulukko 8 osoittaa merkitseviä 15 eroja infiltraation asteessa vasta-ainehoidon funktiona.

Väheneminen T-solujen infiltraatiossa aivoihin ja selkä- .

ytimeen ja makrofaagien infiltraatiossa selkäytimeen oli % merkitsevä sen jälkeen kun oli hoidettu annoksella 3 mg/ kg. Alemmat annokset olivat taipuvaisia vähentämään infil- ~ 20 traatiota, mutta ne eivät saavuttaneet merkitsevää tasoa.

Ei ollut merkitsevää eroa makrofaagi-soluinfiltraatissa selkäytimeen millään annoksella. Koska immunohistokemial- * * · .*#I# linen tekniikka, jota käytettiin arvioitaessa makrofaage- -¾ * · · ja, ei erota residenttejä soluja invasoivista soluista, * * * ' ) 25 efektin puute makrofaagien tapauksessa edustaa todennäköi- • · · *· " sesti residenttien makrofaagien ja mikroglian pitkittynyt- *.i.* tä läsnäoloa.

• · · ·.· : T-solujen ja monosyyttien väheneminen aivokudokses sa, kun vasta-ainetta annetaan taudin vakiintumisen jäl- : :*: 30 keen, viittaa siihen että solujen liikenne ei ole kumula- * · ·

:*“· tiivinen prosessi vaan solujen dynaamista liikettä keskus- I

" * * hermostokudokseen sisään ja siitä ulos. Mikä on tärkeää, * * * ;*t* tulokset viittaavat siihen että leukosyyttien parenkyyma- • · *···* kudokseen sisäänmenon keskeytyminen mahdollistaa sen että ·φ· ♦ · · • · · • · • * * 117509 59 CNS vapauttaa itsensä invasoivasta patologisesta elementistä.

Taulukko 8 5

Merkitseviä eroja T-solujen ja makrofaagien infiltraatiossa aivoihin ja selkäytlmeen päivänä 129.

Aivot Selkäydin

Ryhmä T-solut Makrofaagit T-solut Magrofaagit 10 PBS _

3 mg/kg @ H p=0,001 p=0;005 p=0,007 HS

3 mg/kg # M p=0,001 p=0;005 p=0,008 HS

lmg/kg H HS HS HS HS

0,3 mg/kg H HS HS HS HS

=== -------- '",1ΠΓΓ~·“—— L·,——·——-lj HS = ei merkitsevä f 15

Hematologiset tulokset toivat ilmi, että käsittely

hiiren tai humanisoidulla 21.6-vasta-aineella ei saanut I

- '& aikaan eroa valkosolujen kokonaislukumäärissä, mononukle-aaristen solujen ja granulosyyttien lukumäärässä tai puna- 5 20 solujen lukumäärässä. Korkea annos hiiren tai humanisoitua

vasta-ainetta sai aikaan verihiutaleiden määrän merkitse-;V; vän lisääntymisen verrattuna PBS:llä käsiteltyihin eläi- J

• ;1; miin (taulukko 9). Normaalissa marsussa verihiutaleiden 1 t»« » , lukumäärät ovat 755 ± 103 solua/ml, noin kaksi kertaa se .·. : 25 kuin PBS-käsitellyillä EAE-eläimillä. Niinpä käsittely • 1 · ^ sellaisilla hiiren ja humanisoidun vasta-aineen annoksil- • · · la, jotka käänsivät tehokkaasti taudin kulun, palauttivat * myös verihiutaleiden lukumäärän normaaliksi.

• · · .

• · · *** *· • · ...

• · • · · » · · « · · • 1 · • ....

• · • · ··· · 1 * · · · • · · 1 * · • 1

Taulukko 9 60 117509

Vasta-ainehoidon vaikutus verihiutaleiden lukumäärään EAE-eläimissa.

Hoito Verihiutaleita X 10"^ solua/ml 5 | -Η-Ei EAE-raarsut 755 + 103 (9) _PBS__373 j 7 ± 167,5 (7) 3 mg/kg 9 H _62 2,2 ± 97,0 (6) ** _3 mg/kg 8 M__587, 5 ± 57,3 (6)_ 10 _1 mg/kg H__573,3 ± 123,2 (6)_ 0,3 mg/kg H 492,5 ± 163,6 (6) --- ----- ---— f - ^=·- 1} | j

Verihiutaleiden lukumäärät ei-EAE-marsuissa määritettiin erillisessä kokeessa ! * p “ 0,05 PBS:ään verrattuna 15 Yhteenvetona, sekä humanisoidut että hiiren 21.6- vasta-aineet ovat tehokkaita viivästyttämään ja saamaan väistymään kliinisiä oireita eläinmallissa, joka jäljit- l telee multippeliskleroosia ihmisissä. Humanisoitu vasta-aine on tehokkaampi kuin sama annos hiiren vasta-ainetta .

20 mitä tulee oireiden väistymään saamiseen.

Vaikka edellä mainittu keksintö on kuvattu yksi-ίφί#! tyiskohtaisesti ymmärtämisen helpottamistarkoituksissa, on • ilmeistä että tiettyjä modifikaatioita voidaan harjoittaa *·· i liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiirin sisällä.

25 Kaikki edellä siteeratut julkaisut ja patenttiasiakirjät • · . .·. liitetään täten tähän viitteenä kokonaisuudessaan kaikkia * · * "t tarkoituksia varten, samassa määrin kuin jos kukin niistä

• a · r J

* * · näin yksilöllisesti osoitettaisiin.

• » · a • a • · · a • · *· • · a • · * lit • · · a • · • aa ·*···.

• taa ··· • · • · • ♦ ·

Taulukko 4 61 117509

Aminohapposekvenssien kohdakkainasetus, joka johtaa uudelleen muovatun ihmisen 21.6;n kevytketjun variaabelei-den alueiden suunnitteluun 5

Katu t FR tai hiiren hiiren ihmisen ihmisen rh Vt kommentti ^ CDR 21.6 kappa 5 kappa 1 REX 21.6

(SEQ. ID (SEQ. ID

.________nro 42) nro 431________ '

1 1 FRI p__p__D_ D D

10 1 2 J__!--!__!_-j__!:__ _3__3__I Q Q__Q__Q__Q____

4 4 |__M M__M__M_ M

s i i__t _r__t__τ_ t

6__6 I___Q__Q__Q__Q_ Q

15 j--2--!--5--5--5--!--!_ ....

* 1 I F__f__P_ P P

9 __9 1__S__S S S S , 10 10 I____s__s_ s s s

n__11__j__h__l__L_ L L

_ 12 12 I s S S S S

20 " — ·

13 U |___A__A_ A A A

. . 14 14 1 SS 5 S S

• · · ---------- " - " -- __ * · ·

,1 1 IS 1J | L L V V V

« · · " — 1 ——“ 1 1 - —

*·1 · 16 16 | G G G G G

• 1 · -------- __— . - ... - _ ___ * · · “ -

*·1 1 Π__Π__j__ο P__D D D

\2 3 4 5! 25 11 1» | K R R R R ; i9 ie | v y v v v : : : iq 20 1 τ τ τ τ τ - «II- —' _____ .

21__21__J___I__I__I_ I I

. 22 22 I Τ Τ Τ Τ Τ go-----------1

.···. 23 23 FRI C C C C C

• · 11 1 —— . " “ 1 ·"'· 1 — ι 11 24 24 CDR1 KR R Q κ 2 • · · " ~· — ' — “ ' - ^ : 25 25 I Τ A A Α Τ’ 3 :.,.ί 26__26 1___s__S__S__S_ s· 27 27 I Q Q Q . Q Q» 35 4

··. 27Λ I - D S

• · , -__!__— ________ 5 _27B___J_ -__L__.__;__

27C I · V

117509 62 27D__I__-__*__;____ 27 E___I__;__;__X_ __;__ 27F _I__-__;__;__-__-__ 5 2$ 2i | D D S D D* 29 29 | It _I_ I I* 30 30 | N S S I H- ' 31 31 I K N N K K* ' % --- a 32 32 I Y Y__Y____Y__Y* 10 33 33 I M L__L__L_ M* 34 34 CDRI A__N___A__N__A_

35 3J HU W W W W W

H 3 6 I__Y Y__Y__Y__Y__ 37 37 I__Q__Q__Q__Q__Q_ 15 38 3* I__H__Q__Q__Q__Q__

39 39 I K K. K T T K

1 CAMFATH-

Ulissa

40 40 I P__P__P__P_ P

41 41 | GG G G G

2Q 42 42 | K G K K K

ota lukuun A A A R muiSSa versioissa • · • · · • · · ____ _____ ___ dl_ ______ _ _____ • · J 44 44 | P P P P p • · · ......... —---- ^ — ------~~- - -— 1 1 ft ft ft ft ··· 45 45 I R K K K R tukee L2- • · « silmukkaa, a r- ota lukuun ·*· · äO k muissa • "· versioissa * • · · ,,mnmm 1——'1 —-----—-----—......

***** 46 46 I L L L L I

• * ·

*.* * 47 47 I L__L__L__L_ L

48 48 I II I I I'

:..0 30 49 49 Π12 H Y Y Y H cov^htO

4VA mahdollista J · olla vuoto- ·· vaikutuksiibsa • antigeenin • * kanssa, ota

*#* * lukuun Y

*·« muissa ver- • * sioissa • ft· h— - >' " 1 1,1 1 “‘ - "....... “ ......... ' * *. 50 50 CDR2 YYA £ Y* ··· ..— ....... .. »' --- I — -.------- *") ^ 51 51 | T A A A T* *···* 52 52 | S S S S S* 63 117509

53 53 | A R S N A

54 54 f L__L__L__L_ L , 55 __55 1_ Q H__E__Q__Q__i,

5 56 56 CDR2 P S S_ A P

57 57 FRJ G G G G G

« 58 I iv v v I . tu_ L2;Cd, oca lukuun V muissa versioissa 10 59 59 I p P p p p

60 60 I 5 S S 5 S

61 61 I R R R R R

62 62 I F P__F__F_ F

63 63 I S S _S__S_ S

15 64 64 I G G_ G G G*

65 65 I S S_ S S S

66 66 I G G G G G i'

67 67 I S S S S S

68 68 I G G G G G

20 65 69 I R T T T S

lähellä sitovaa kohtaa • · • · · ♦ · * ..........——___ * 1 —" —

; 70 70 I D D D D D

• » · — - ' '“· ......... .. . »— " ' 71 71 l Y Y F Y Y- CAMPATH- *** * 1H:ssa • * 25 • · · ^J --- ------ ----------------- — • ·*

• / 72 72 I S S T T T

f · · - “ " . ——- ' -----

***** 73 73 I ' F L L F F

• ·· j . — — — —- - . — — • * ·

*.* * 74 74 I NT T T T

75 75 I I I I I I

• h- - -rrr- -, ι>γ.·ι......

! : ; Qri 76 76 I S S S S S

*·· JU--------- ,, • · · ·· 77 77 I N N S S S ;i • · · -“ --— 1 --^—— -—i - —--.

78 78 I LI. L L L

• · · -—-- — -—---— -— ———--—-----

’·’ 79 79 I E K Q Q Q

----------—---

*...* 80 80 I P Q P P P

• ' " ———~" 1,1 " ' 1 ‘ 1 ' ....... " -

*·* __ 81 81 I EE E E E

··#· <io -- --. ———- 1 1 '—

.·*·. 82 82 I D D D D D

• Φ — - - ------ — —I— ---- ., • * · 83 83__j__I__I__F__I__I_ 117509 64

«4 84 I AA A A A

IS 85 | T T__T__T_ T

5 86 86 I Y__Y__Y__Y___Y_

87 87 | Y F__Y__Y Y

88 88 FR3 C C_ C C C .

89 89 CDIU L Q_ Q Q _ L

90 90 | Q__Q__Q__Q__ Q* 10 91 91 I Y C Y_ Y Y* 92 92 I D N N Q D* 93 93 I N T__S__S_ N- 94 94 I L L L L L*

95 I - P__P__P

15 A___I - P__E__·__;__ 9JB 1-- _·_ - 95C 1--

95D I

93E__1__-__-__-__-__-_ 20 J*___I __:__;__;___ 96 95 I W R W Y W*

97 96 CDR3 T T T T T

* · · -- ---- ^. I M.—»· I -I - > -----

* · 98 97 FR4 F F F F F

* · « • * · ——-r— ---·-·---" “ ' --------

*11/ 99 9Ä I G C G G C

• · · -——-— - —... — I ' - ' —...I - ‘ .* 25 100 99 I__G__C__Q__Q__Q _

** *! 101 100 I G G G G G

102 101 I T T T T T

·· 1 --- “ — ί#ϊ ί 103 102 | K K K K K

104 103 I L L V L V CAMPATH- # lH;ssa • · · 30---------- • ** 105 ^ I H E E Q E CAMPATH- ··· 1H:saa ··* -. . ___ _ ______ _ • · 9 -—'-----

*·* * 106 105 I I I I I I

• * · — " . —. I.· I I I ...... I -----

·...· 106A I

m kuten ... 107 106 FR4 K K K T K CAMPATH- *··* 35 I I |LH;sSd • * · • • · — 1 - I 1 —- - 1-1--11 ··· ...... ' 65 117509 t

Kuvateksti: (Katat) numerointi edellä mainitun Ka-batin ym. luettelon mukainen; (#) perättäinen numerointi jota käytettiin molekyylimallituksessa; (hiiren 21.6) hiiren 21.6-vasta-aineesta peräisin olevan VL-alueen aminohap- 4 5 posekvenssi; (hiiren kappa 5) alaryhmästä 5 (Kabat ym., edellä) peräisin olevien hiiren kappa-VL-alueiden konsen-sussekvenssi; (ihmisen kappa 1) alaryhmästä 1 (Kabat ym., edellä) peräisin olevien ihmisen kappa-VL-alueiden konsen- f sus; (ihmisen REI) ihmisen VL-alueen (Palm ym., (1975) 10 edellä) aminohapposekvenssi; (RH VL 21.6) uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n VL-alueen version LI aminohapposekvenssi; (*) aminohappotähteet jotka ovat osa CDR-silmukoiden kanonisia rakenteita (Chothia ym., edellä); (alleviivattu) ne aminohappotähteet ihmisen FR:issä, joissa aminohappo-15 tähde muutettiin.

• · • * · * * • · « · * • » · • · · · *· • ♦ · • · * * • ♦ • * * • · * * · • ·.'····, • * · · · • « · *·♦ ··*.

• ♦ · • * · • · · t * * * · t • · * · • · · ;· ·% • 1 ; ·«* • · · • * · f*·;' • · • * • · · • · -f «··· • * · • · - • · ...

• · ·

Taulukko 5 66 , 117509

Aminohapposekvenssien kohdakkainasetus, joka johtaa uudelleen muovatun ihmisen 21.6:n raskasketjun va-riaabeleiden alueiden suunnitteluun 5

Kuha! / FR tai hiiren hiiren Ihmisen Ihmisen RH YB kommentti CDH 21.6 2c (SEQ. ID 1 (SEQ. ID 21/28'CL 21.6 nro 44) nro 45) 1 I FRI__E__E__Q__Q Q__

I 2 | V V_ V V V

*0 3 3 I Q__Q__Q___Q__Q__ 4 4 | L__L_ L__L_ L _

J 5 | Q__Q__V__V_ V

6 __6__j__Q Q__Q__Q__Q__

7 7 | S__S__S__S_ S

15 g g | C G__G_ G G

9 9 | A__A__A_ A A

10 10 | E__E__E_ EE

II 11 |__L__L__V__V_ V

12 12 | V _V_ KKK

20 13__13__1__K K__K__K__K_

M__H [__P__P__P___P__P

15 15 I G G G G G

« · * - M—.-.1.- *»" - — " i — --- — - - - • *

• * 16 16 1 AA A A A

• · · __ _ — —------ ----—---- i — . - -___

\\V 17 17 I S S__S SS

• · m —. ........... 11 ---— - ·- ·~ - ’·~ · - — — Y [ 25 18 i*| vv v v v • · · — _j- - -

*· " 19 19 | K K _ K K K

» - - 1 —^“ ·“ - i i - —-—

•.I.* 20 20 | L L V V V

• * ♦ 'Γ _

• t· * 21 21 | S__S__ SS

22 22 | C _C_ C C C

: -3Π 23 23 I TT K K K

··« "JV/ ' - l—'11 ...J-·- - _ --- '

.·*·. 24 24 | AA A A A

« · Ml - - - ----- ' - — --- ---- ' ' - - ·»»

• 25 25 | S S S S S

··· — - ---- - — -- • · *.* * 26 26 | G G G G G* #·· ---1-------- " ----------- : : 27 27 I F F r Y F* H !n keno-

• kenne, ota V

•t* qe lukuun Y

*33 muissa v*r- ··· sioissa • · « * ··· ___——----- 67 117509 I H N T T Ν. Η1:η kano- . 1 ”’ ninen ra kenne pinnalla 5 Hirn kano- 29 29 | II F F I” uinen ra kenne, Ota ϊ< lukuun F muissa ver-i aloissa 30 30 FRI KK T T K* nlnen ra.

k. ime p in- IU nalla 31 31 CDRI D D_ S_ S_ D* 32 32 | T T__Y__Y_ T*

33 33 | Y__Y__A__A_ Y

15 34 3-1 | IM I M 1'

35_ 3} |__H__H__S__H_ H

33A___1__*__-__-__-__-_ 33B CDRI - . M 36 FR2 C W W W W J^ppö- t tähde, ei

20 I jilmeistä II

erittäista roolia C:lle • · 1,1 1 " 1 II ' Il in· »H.

·.·.· 37 37 I V ν V V V

• ·

ϊ Ϊ : 3* 3« | KK R R R

39 39 1 q q q q q • ' I II - Il - I I I· — - II—· I I —-1 , _

O E

;*·_· 3 40 40 | R R A A A

• * "" — --------- . 41 41 | p p p p p ; • · · — — — I - I m - I — 1 < I — I m --- —

·.. 42 42 I E £ C G G

* · · - -- --- - • * * ^” * _43__43__1__Q__Q__Q__Q__Q__

44 44 I G G G R R VL ' V

, pakkaulu- 30 I I I niinen» ota IM lukuun 6 * Ϊ muissa ver- ·** sioissa • 1 · -J " 1 1 1 ’ 11 1 ^—·"*—— Il I··' I m --.. . .... -

45 45 I LL L L L

* ——. _ ·ι·ι· ιιι··ι I - “™ V

46 46 I E E E E E

* · 1-11.-- «-. ^— 1 - —III· _ - „ 1 - * « ·

• 47 47 I W W W W W

... '" .......Ί

·*.: 35 46 4¾ I II M M M

lit “ 1 1 ~~~^- ' 1 " 1 1 'm ..

*.„· 49 49 FR2 G G G G C

: i 117509 68 --- -

jo 50 CDR2 R R W W R

51 __ii__|__1 i__|__|__i__:

52 52 I D__D__N__N_ D

® 52A S3 _J__p__P__P__A__p- 32B___[__;__;__Y__;__;__ 52C___!_ - ___;____ 53 54 I A__A__G__G_ A1 54 55 |__K H__N___K__N1__ 10 55 55 | G G G G G- 55 57 |__Y__N__D__H__Y__ 57 58 |_ _T__T____T__T__T__

58 59 |__K__K____H__K__K

59 50 |__Y__Y__Y__Y_ Y

15 50 51 | D__D__jK_ S D

51 62 (__P__P_ _Q__Q_ P

62 53 |__K__K__K__K__K

63 64 | F F_ F F F

_64__65 |__Q Q__Q__Q__Q 3

20 6i 66 CDR2 G G_ G G

65 67 FR3 K K_ R R R

67 68 | ΛΑ V V V

• · 1 1 » -1 —1 ---- " 1 1 ..... .1

.1 I 68 69 | TT T . T T

• 1 1 ____im i— - ——mi n i - --- — ----- , - ::i.; 69 70 ! Il 1 I 1 • · · - ' ~ -H “ 1 ' 25 ZJ__!__1__I__I__I__I__ • · 1 H2«ti v * #1 71 72 | AA A R A· kanoninen : • · · rakenne, ·** tukee *·· H2;ta • 1 · • · *

11 73 | D D_ D__D_ D

: 30 __^__I__r τ__τ__τ__τ__

.***. 74 75 I SS S 5 S

• · - - - — II. Il _—— _____ * 1 #

• 75 76 | SS T A A

··· — --- — · . ..

• · ·

*·' 76 77 | H tl S S S

• · 1 ........ 1 --- i- — — 1 " ' 1 .ini-ι 11 ' —

·...1 77 78 I T _T__T__T_ T

• i, 78 70 | A A A A A

...Ϊ 35----------

.···. 79 SO | Y Y Y Y Y

• · - —1'" " --- '

0 81 I LL M M M

117509 69 tl__n__!__Q__Q__E__E__E__

12 83 | L L__L_ L L

82A M | S S S S S

5 -----------

S2B ti | S__S__S__S_ S

I2C 16 | L__L__L__L L

83 t7 _I__T__T__R__R_ R

84 88 | SS S S 5

ti 89 | E E £ E E

10 -— --------

86 90 |_ D D D_ D D

87 91 | TT T T T

88 92 | A A A A A

89 93 l V__V__V_ V V

90 94 j Y Y Y Y Y

91 9i | F Y__Y_ Y Y

92 96 |_ C C C_ C C

93 97 |_ A A A_ A A

94 98 FR3 R R R R R*

95 99 CDR3 EG A C E

20 96 100 | G Y P G G

97 101 | Y Y G Y Y

I 98_ 102 |_ Y Y Y Y Y

• 99 103 | G Y G G G

• * * · ' " ...... · ' * ' '

100 104 | N D S S H

• · · - i , _ - —--- .___ „ Φ .·, ; 25 looa loi | Y s g g γ • *φ ....... ......... —*" 1 ~ 1 —I.- —.,, .;

100B 106 I G X G S G

• · · _.______ _ . __________ • * m “ -----

j** 100C 107 I VV G - V

• * · -------”-----'-—— ^—— ---<--—------

• IOOD 108 I . Y G C . Y

100E 109 | AY Y - A

• " ' ' ............ — — ' .1 11

30 100F 110 I MY R - M

··· " : ί 10OG I . A G - • · · „ ________ ··· tOOH I * M D - • * · 1

• · · ^““““”“— — ' -· I— Il I

"... 1001 | Y

» * “ I I -WPI III —I I. —I M.·. I I --------- - - - —

*"* 1007 I X

• 1 __ _____ ..:i* 35 _!?«___I __L__:__:__

:1: 101_ Hl I D D D H D

m · · ' 11 .. i m —

102 112 CDR3 Y Y__Y_ Y Y

117509 70

103 113 FR4 W W W W W

1M__1M__j__0__0__G_ G G

103____Q Q__Q__Q__Q

106 IK I G G G G G

5 -—----------- 107 __117 I T T T T t

106__IK__j_ S X L L L

109 119 I V V V V v no__no )tt T t t 1 111 121 I V V V V v in__m__j__s__s_ s s s 113__m FM S S S S s

Kuvateksti: (Rabat) numerointi edellä mainitun Ka-batin ym. luettelon mukainen; (#) perättäinen numerointi 15 jota käytettiin molekyylimallituksessa? (hiiren 21,6) hiiren 21.6-vasta-aineesta peräisin olevan VH-alueen aminohapposekvenssi; (hiiren 2c) alaryhmästä 2c (Rabat ym., edellä) peräisin olevien hiiren VH-alueiden konsensussekvenssi; (ihmisen 1) alaryhmästä 1 (Rabat ym., edellä) peräisin 20 olevien ihmisen VH-alueiden konsensussekvenssi; (ihmisen 21/28'CL) ihmisen VH-alueen (Dersimonian ym., (1987) edel- * · 'ft : : : lä) aminohapposekvenssi; (RH VH 21.6) uudelleen muovatun : • ihmisen 21.6:n VH-alueen version Hl aminohapposekvenssi; ·♦· · (*) aminohappotähteet jotka ovat osa CDR-silmukoiden ka- : 25 nonisia rakenteita (Chothia ym., edellä); (alleviivattu) • ·· ne aminohappotähteet ihmisen FR:issä, joissa aminohappo-tähde muutettiin.

• ♦ · • · · • · · ··♦ • · · • · « · *·· * ··· ··· * · · • ♦ · • · • · ·*♦ 1 • · * · * t · • · • · · 71 117509

Sekvenssi1ista (1) GENERAL INFORMATION: U) APPLICANT: Bendig, Mary M.

Leger, Olivier J.

Saldanha, Jose Jones, S. Tarran f (ii) TITLE OF INVENTION: Humanized Antibodies Against Leukocyte Adhesion Molecule VLA-4 (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 45 i (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Townsend and Townsend Khourie and Crew (B) STREET; One Market Plaza, Steuart Tower, Suite 2000 (C) CITY: San Francisco (D) STATE: California

(E) COUNTRY: USA

(F) ZIP: 94105 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 08/186,269 (B) FILING DATE: 25-JAN-1994 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Smith, William L.

(B) REGISTRATION NUMBER: 30,223 (C) REFERENCE/DOCKET NUM3ER: 15270-14 j’:*· (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: • * (A) TELEPHONE: 415-543-9600 • (B) TELEFAX: 415-543-5043 * · · * (2) INFORMATION for seq id no:i: • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: * ,* (A) LENGTH: 483 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS; double ::: (D) TOPOLOGY: linear •

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

: :*: (ix) feature: <aj name/KEY: cds : : (B) LOCATION: 53..430 • * · .·♦·. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: • · · • .·**. ATGAGGGCCC CTGCTCAGAT TTTTGGATTC TTGGTCAGGA GACGTTGTAG AA ATG 55 *···* Met 1 * · · *"* AGA CCG TCT ATT CAG TTC CTG GGG CTC TTG TTG TTC TGG CTT CAT GGT 103 : S Arg Pro Ser lie Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His Gly 5 10 15 GCT CAG TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA 1S1

Ala Gin Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 117509 72 TCT CTG GGA GGC AAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG ACA AGC CAA GAC ATT 199

Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gin Asp He 35 40 45 AAC AAG TAT ATG GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT GGA AAA CGT CCT AGG 24 7

Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Arg Pro Arg 50 55 60 65 CTG CTC ΑΤΑ CAT TAC ACA TCT GCA TTA CAG CCA GGC ATC CCA TCA AGG 295 l

Leu Leu He His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro Gly He Pro Ser Arg 70 75 80 TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC TTC AAC ATC AGC AAC 343

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn He Ser Asn 85 90 95 CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT TGT CTA CAG TAT GAT AAT 391

Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn 100 105 110 CTG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGGGCTGATG 440

Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 115 120 125 • j CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCÄCCCGGGA TCC 483 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 126 amino acids (3) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein ' (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

Met Arg Pro Ser He Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 • · .:11 • ·*· Gly Ala Gin Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser .? ·** * 20 25 30 ΐ • · · * * · *** * Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr He Thr Cys Lys Thr Ser Gin Asp 35 40 45 ··.

; He Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Arg Pro ;;; 50 55 60 . : i • · · * Arg Leu Leu He His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro Gly He Pro Ser 65 70 75 80 : Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn He Ser ::: as 90 95 *" Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp

100 105 HO

* · · • ,··*, Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys *·.·* 115 120 125 Φ ···.

*::: (2J INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: • · * · *" (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 470 base pairs 1 (3) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear 117509 73

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: I. .420 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA GGG 48

Mec Lys Cys Ser Tro Val Mec Phe Phe Leu Mec Ala Vai Val Thr Gly

1 5 10 IS

GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG 9 6

Val Asn Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT 144 ,

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie 35 40 45 AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGT GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG 192

Lys Asp Thr Tyr lie His Cys Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 50 55 60 GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT TAT ACT AAA TAT GAC 240

Glu Trp Ile Gly Arg He Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80 CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCT GAC ACA TCC TCC AAC 288

Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 ACA GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC 3 36

Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TTC TGT GCT AGA GAG GGA TAT TAT GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT 384 .·.· Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala 1 \\: 115 120 125 • · :.: : ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCCTCAGCCA 430

Mec Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val *.* * 130 135 140 • · AAACGACACC CCCATCTGTC TATCCACTGG CCCGGGATCC 470 M.1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4: • * * V ! (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: " (A) LENGTH: 140 amino acids (B) TYPE: amino acid . (D) TOPOLOGY: linear .*·*. (ii) MOLECULE TYPE: procein « « « .:. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: ···-• * · I.. Met Lys Cys Ser Trp Val Met Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 • ·!· Val Asn Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys ···: 20 25 30 • t · • · *···* Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn He 35 40 45

Lys Asp Thr Tyr He His Cys Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 50 55 60 74 : .f 117509

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80

Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Vai Tyr Ala 115 120 125

Mec Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai 130 135 140 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 106 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: procein ' c (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;5:

Asp lie Gin MeC Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 IS

Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gin Asp He Asn Lys Tyr 20 25 30

Mec Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Arg Pro Arg Leu Leu He 35 40 45

His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly . . 50 55 60 .

* · · , -1* a*#1'·.

.’I Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn He Ser Asn Leu Glu Pro ? ::: 65 70 75 eo -.

* * * :.: : Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr • . 85 90 95 « · · • * * . Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys :.:.: 100 105 5 • · a : ' (2) information for seq id n0:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: , (A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: amino acid .*··. (C) STRANDEDNESS: single *...* (D) TOPOLOGY: linear ;T: (ii) MOLECULE TYPE: procein • * a • a "* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: a a a ...I Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

.··*. 1 5 10 IS

a a , , * • a a

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp He He Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 117509 75

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 , 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gin Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin lie Thr 100 105 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 106 amino acids ' (B) TYPE; amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Thr Ser Gin Asp lie Asn Lys Tyr 20 25 10

Met Ala Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly ^ 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 ·*.'.· • · · • ♦ · ,* * Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr ί ; es 90 95 \'i * * * · - w, : i*: Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys ! . 100 105 ; • · ·

• II

(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:8: * · · • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : !.·* ί (A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein • · *·* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: ··· • · · *·* * Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly .**·. 1 5 10 15 • · * · » *. Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp He He Lys Tyr *:* 20 25 30 ·»·« * • · e ϊ.,.ϊ Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gin Ala Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 I

117509 76

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp He Ala Tlir Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gin Ser Leu Pro Tyr

85 SO 95 A

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin lie Thr 100 )05 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; : ' 1 (A) LENGTH; 123 amino acids (B) TYPE; amino acid (C) STRANDEDNESS: single ' (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:9:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly phe Asn He Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr He His Cys Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45

Gly Arg He Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 > Gin Gly Lys Ala Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 • * · • · • Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr ··· · 100 105 110 • · « • · * *·’ Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser ns 120 . (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :10: • · · ;*;*· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • (A) LENGTH: 119 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single : (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: protein • · · ,···. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ IDNOtlO: • · · ,···. Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala ·...* 1 5 10 15 *·* Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 • · *** Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 77 .

117509

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 60

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 HO

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:ll; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:ll;

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 4S

Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 , , Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr : :: es 70 75 so • · : :*J Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys es 90 95 • ♦ · • ♦ · * . Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr ; : 100 105 110 ? • · I :*· Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 11s 120 ***' *' * (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: , (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ϊ : : (A) LENGTH; 119 amino acids *1) (B) TYPE: amino acid il (CJ STRANDEDNESS: single *!* (D) TOPOLOGY: linear *.* : (ii) MOLECULE TYPE: protein ··· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :12: *:* Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala *::: i 5 10 15 • · • · *** Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 1 117509 78

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe SO 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 1,10

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 119 amino acids (3) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear {ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 IS

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Mec 35 40 45

Gly Tro He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe *.V 50* 55 60 • · ί.ί ί Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ♦ ♦ · • .·. Ϊ Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys *· 85 90 95

• I

• * ♦ *···* Ala Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gin Gly loo 105 no • · ·

Thr Leu Val Thr Val Set Ser 115 ♦ J » » *·”* (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: • · · • * *···* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 406 base pairs V : (B) TYPE: nucleic acid ... (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear

• J

.:· (ii) MOLECULE TYPE: CDNA

J**’; (ix) FEATURE;

*" (A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 16..393 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO :14: 79 11 7509 AAGCTTGCCG CCACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG TTC CTG GGG CTC TTG TTG 51

Met Arg Pro Ser lie Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu 1 5 10 TTC TGG CTT CAT GGT GCT CAG TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA 99

Phe Trp Leu His Gly Ala Gin Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 15 20 25 f TCC TCA CTG TCT GCA TCT CTG GGA GGC AAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG 147

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr He Thr Cys. Lys 30 35 40

ACA AGC CAA GAC ATT AAC AAG TAT ATG GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT 195 I

Thr Ser Gin Asp He Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro 45 50 55 60 GGA AAA COT CCT AGG CTG CTC ATA CAT TAC ACA TCT GCA TTA CAG CCA 243

Gly Lys Arg Pro Arg Leu Leu He His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro 65 70 75 GGC ATC CCA TCA AGG TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC 291 *

Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser 80 85 90 TTC AAC ATC AGC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT TGT 339

Phe Asn He Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys 95 100 105 CTA CAG TAT GAT AAT CTG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA 387

Leu Gin Tyr Asp Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 110 115 120 ATC AAA CGTGAGTGGA TCC 406

He Lys 125 iV: (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:15: ί Ϊ I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 126 amino acids ί ί ϊ (B) TYPE: amino acid I . (D) TOPOLOGY: linear • · · • ·· (ii) MOLECULE TYPE: protein • · * · . · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :15: • * · • 1·’ Met Arg Pro Ser He Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 15 10 15 •

Gly Ala Gin Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser ,···, 20 25 30 • · * · · J Ala Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr He Thr Cys Lys Thr Ser Gin Asp 35 40 45 • ;***; He Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Arg Pro *;* 50 55 60 • ..*♦* Arg Leu Leu He His Tyr Thr Ser Ala Leu Gin Pro Gly He Pro Ser .· —t 65 70 75 80 * · t · »

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn He Ser 85 90 95

Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp 100 105 HO

80 1 1 7509

Asn Leu Trp Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 115 120 125 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: / ;.

(A) LENGTH: 454 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ! (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA ' (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY : CDS

(B) LOCATION: 16..441 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC 51

Mec Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala 1 5 10 j GTG GCT CCT GGG GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC 99

Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala 15 20 25 GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA GCT AGC 147 ;

Glu Val Lys Lya Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser ·.? 30 35 40 GGT TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT 19 S i

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr He His Trp Val Arg Gin Ala Pro 45 50 55 60 . , GGC CAA AGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT TAT 243 | ί : I Gly Gin Arg Leu Glu Trp Mec Gly Arg He Asp Pro Ala Asn Gly Tyr == : 65 70 75 /¾ • · · • * · *".* ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC 291 :.: : Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp I . 80 85 90 * * * • · * • .* ACC TCT GCC AGC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG 2 39

Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Mec Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu ΐ 95 100 105 * * * • * · GAC ACT GCA GTC TAC TAC TGC GCC AGA GAG GGA TAT TAT GGT AAC TAC 387

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr . 110 115 120 • * ·

.••I. GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC 435 V

Gly Val Tyr Ala Mec Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val :i • 125 130 135 140 j • ♦ ♦ • · · TCC TCA GGTGAGTGGA TCC 454 ;***; Ser Ser • · · • k (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: ' · • » · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 142 amino acids (3) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :17: 81 117509

Mec Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 t

Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lvs 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys val Ser Cys Lys Ala Ser Gly phe Asn lie

35 40 4S

Lys Asp Thr Tyr He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Arg Leu 50 55 60

Glu Trp Mec Gly Arg He Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 1 80

Pro Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala 115 120 125

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear , . tii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) * « · . ^ • * : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18: • » · · cagaaagctt gccgccacca tgagäccgtc tattcag 37 • .

; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: • :/.·* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: **.. (A) LENGTH: 35 base pairs ' :.: · (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear *·// (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) ··· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: /;*; CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCAGC TTGGT 35 • ***j (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: *♦· *. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ..*·* (A). LENGTH: 37 base pairs 1.. (B) TYPE; nucleic acid 5,./ (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20: 82 117509 CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGAAATGCAG CTGGGTC 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: CCGAGGATCC ACTCACCTGA GGAGACGGTG ACT 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ; (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) ' < (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22: f GATGGTGACT CTATCTCCTA CAGATGCAGA CAGTGAGGA 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 base pairs ,, (B) TYPE: nucleic acid ::: (C) STRANDEDNESS: single ' * (D) TOPOLOGI: linear • · · ;; • · · *“.* (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) • · · * · · \ . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO-.23: # · · • · · CTGTAGGAGA TAGAGTCACC ATCACTTGCA AG 32 * · · • * * -I (2) INFORMATION FOR SEQ ID NQ:24; • · · ^ .

• « · ' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs . (B) TYPE; nucleic acid · (C) STRANDEDNESS: single ; .···. (D) TOPOLOGY: linear • · • * · (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) • * · *;[.* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24: • · *;·* AGGAGCTTTT CCAGGTGTCT GTTGGTACCA AGCCATATA 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: ···: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 41 base pairs (3) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) 83 117509 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25: ί ACCAACAGAC ACCTGGAAAA GCTCCTAGGC TGCTCATACA T 41 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 40 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ‘ (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer} , (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26: ; GCAGGCTGCT GATGGTGAAA GTATAATCTC TCCCAGACCC 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: nucleic acid |* (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27: ACTTTCACCA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATATTGCAA CT 4 2 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 59 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ·.·.* (D) TOPOLOGY: linear * * :.: : (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) V : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28: * · .

*.**: CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTGGTGCCTT GACCGAACGT CCACAGATT 59 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29: • · · *.* * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear * · · .

*..·* (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) :T: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: t *: GGAAAAGCTC CTAGGCTGCT CATATATTAC ACA 33 * · · ** ** .:. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30: • · · .**·. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *···* (A) LENGTH: 38 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:30: 84 η 117509 CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTTGTGCC · 38 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 51 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: AACCCAGTGT ATATAGGTGT CTTTAATGTT GAAACCGCTA GCTTTACAGC T 51 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 67 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ' 1 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32: AAAGACACCT ATATACACTG GGTTAGACAG GCCCCTGGCC AAAGGCTGGA GTGGATGGGA 60 AGGATTG 67 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :33: ,, (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: I : ; (A) LENGTH: 26 base pairs ,* * (B) TYPE: nucleic acid ::: (C) STRANDEDNESS: single i *.*.*.* (D) TOPOLOGY: linear • * · ; . (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) • · · • * * * * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33; • * · * * * I" GACCCGGCCC TGGAACTTCG GGTCAT 26 • · · * · « (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34: . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs 'll (B) TYPE: nucleic acid ί, Ϊ (C) STRANDEDNESS: single *" (D) TOPOLOGY: linear »4· • · * *·* * (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) • · · • · *···* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34: f GACCCGAAGT TCCAGGGCAG GGTCACCATC ACCGCAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC 60 ··♦ :„,ί ATGGAA 66 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 64 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 117509 85 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :35: CCATAGCATA GACCCCGTAG TTACCATAAT ATCCCTCTCT GGCGCAGTAG TAGACTGCAG 60 TGTC ' 64 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :36: ' ' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . . ; (A) LENGTH: 63 base pairs (3) TYPE: nucleic acid ' (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36: : GGTAACTACG GGGTCTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCCTTGT CACCGTCTCC 60 TCA : 63 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :37: • φ : CCAGGGCCGG GTCACCATCA CCAGAGACAC CTCTGCC 37 »X · (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0;38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: * / (A) LENGTH: 27 base pairs ::: (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ::: <D) TOPOLOGY; linear • (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;38: • » · ί,.,ϊ CAGGCCCCTG GCCAAGGGCT GGAGTGG 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39: ··· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *···* (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :39: TACCCAAACC GCCTCTC 17 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40: 86 117509 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH:.18 base pairs .¾ (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS; single i (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (primer) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40: ‘ GAGTGCACCA TATGCGGT 18 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 116 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:

Gin Val Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 S 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Tyr He Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe :Y: so S5 so • ♦ ; :*· Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr *·* · 65 70 75 80 • · · * · ♦ * Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ; 8 5 90 95 ♦ · u 2 Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val *" 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 JJ*: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42: • · · - (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 109 amino acids ·*ί*. (B) TYPE: amino acid V * (C) STRANDEDNESS: single .*··. (D) TOPOLOGY; linear • · ·♦· \ (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :42: · • · ·

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Asp lie Ser Asn 20 25 30 117509 87

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gly Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg ?he Ser 50 , 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu 65 TO 75 80

Gin Glu Asp He Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro 85 90 95

Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 114 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: procein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43: '

Asp He Gin MeC Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asd Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ser Leu Val Xaa 20 25 00

Xaa Ser He Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45 . , Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val so ss 60 : Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 80 ::: I . He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Asn Ser Leu Pro Glu Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu ·<· 100 105 I10 *,· · He Lys (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44: · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,···, (A) LENGTH: 125 amino acids *...* (B) TYPE: amino acid t; (C) STRANDEDNESS: single :*·*: (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: procein ··· 1·, (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44; *

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 1° 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly ?hs Asn He Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 117509 88

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Lys Ala TJir lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Xaa Val Gly Tyr Tyr Ala Met 100 105 110

Asd Tyr Tro Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 i (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 129 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4S:

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys 50 55 60 • ♦ · * * J Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala !·ί I 65 70 75 80 • · · *·* * Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr : 85 90 95 • » · • * • **j Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly Asp *”·* 100 105 110

Ml ·* Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 ···' • · · ··· • · • * *·· * « « *·· ·*· *···.· ····:.· • · • · · .

··· ···· #·· « · * · • · ♦

Claims (14)

1. Humanisoitu immunoglobuliini, joka käsittää humanisoidun raskasketjun ja humanisoidun kevytketjun: 5 1) humanisoitu kevytketju käsittää kolme komplemen- taarisuuden määräävää aluetta (CDR1, CDR2 ja CDR3), joilla on aminohapposekvenssit jotka ovat peräisin hiiren 21.6-immunoglobuliinin kevytketjun vastaavista komplementaari-suuden määräävistä alueista, jotka on esitetty sekvenssinu-10 merolla 2 (kuviossa 1), ja variaabelin alueen runko-osan joka on peräisin ihmisen kappa-kevytketjun variaabelin alueen runko-osan sekvenssistä, paitsi ainakin yhdessä asemassa, joka valitaan ensimmäisestä ryhmästä joka on L45, L49, L58 ja L69, jossa aminohappoasema on täytetty samalla ami-15 nohapolla, joka on läsnä hiiren 21-6-immunoglobuliinin kevytketjun variaabelin alueen runko-osan ekvivalentissa asemassa, ja 2. humanisoitu raskasketju käsittää kolme komple-mentaarisuuden määräävää aluetta (CDR1, CDR2 ja CDR3), 20 joilla on aminohapposekvenssit jotka ovat peräisin hiiren 21.6-immunoglobuliinin raskasketjun vastaavista komplemen-taarisuuden määräävistä alueista, jotka on esitetty sek- * · · ' t ! venssinumerolla 4 (kuviossa 2), ja variaabelin alueen run- * · · *".* ko-osan joka on peräisin ihmisen raskasketjun variaabelin * i » m 25 alueen runko-osan sekvenssistä, paitsi ainakin yhdessä ase- *· " massa, joka valitaan ryhmästä H27, H28, H29, H30, H44, H71, jossa aminohappoasema on täytetty samalla aminohapolla, jo- • · · V * ka on läsnä hiiren 21-6-immunoglobuliinin raskasketjun va riaabelin alueen runko-osan ekvivalentissa asemassa, : :** 30 tunnettu siitä, että immunoglobuliini sitoutuu • · · ·**; spesifisesti alfa-4-integriiniin sitoutumisaffiniteetilla, «·· jonka alaraja on noin 107 M"1 ja yläraja noin viisi kertaa • · · hiiren 21-6-immunoglobuliinin sitoutumisaffiniteetti.

• · *···* 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen humanisoitu immu- *·· 35 noglobuliini, tunnettu siitä, että humanisoidun kevyt- »Ml ;***· ketjun variaabelin alueen runko-osa on peräisin REl:n väri- Ml 117509 ' aabelin alueen runko-osan sekvenssistä, paitsi ainakin yhdessä asemassa joka on valittu ensimmäisestä ryhmästä, ja paitsi ainakin yhdessä asemassa joka on valittu kolmannesta ryhmästä, joka koostuu asemista L104, L105 ja L107, jolloin 5 aminohappoasema on täytetty samalla aminohapolla, joka on läsnä sellaisen kappakevytketjun ekvivalentissa asemassa, joka on peräisin muusta ihmisen immunoglobuliinista kuin RE1. : t

1 1 7509 i ί

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen humanisoitu immu-10 noglobuliini, tunnettu siitä, että humanisoidun raskas- ketjun variaabelin alueen runko-osa on peräisin 21/ 28'CL:n variaabelin alueen runko-osan sekvenssistä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen humanisoitu immu-noglobuliini, tunnettu siitä, että humanisoidun kevyt- 15 ketjun variaabelin alueen runko-osa käsittää ainakin kolme hiiren 21.6-immunoglobuliinista peräisin olevaa aminohappoa, jotka ovat ensimmäiseen ryhmään kuuluvissa asemissa, ja kolme aminohappoa, jotka ovat peräisin muusta ihmisen immunoglobuliinista kuin REIrstä peräisin olevasta kappa-20 ketjusta, kolmanteen ryhmään kuuluvissa asemissa, ja huma-nisoidun raskasketjun variaabelin alueen runko-osa käsittää ^ . ainakin viisi aminohappoa, jotka ovat peräisin hiiren 21.6- • * * immunoglobuliinista, toiseen ryhmään kuuluvissa asemissa. * · * *· : 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen humanisoitu immu- • * * *** 25 noglobuliini, tunnettu siitä, että humanisoidun kevyt- • *. *: ketjun variaabelin alueen runko-osa on identtinen REl:n ke- . ;! :.i.: vytketjun variaabelin alueen runko-osan sekvenssin kanssa, i«» ί.ί· lukuun ottamatta ensimmäisestä ryhmästä peräisin olevaa ai nakin kolmea asemaa ja kolmannesta ryhmästä peräisin olevaa : ·*· 30 kolmea asemaa, ja raskasketjun variaabelin alueen runko-osa *·· .***. on identtinen 21/28' CL: n raskasketjun variaabelin alueen * · · runko-osan sekvenssin kanssa lukuun ottamatta toisesta ryh- • · · *·’ * mästä peräisin olevaa ainakin viittä asemaa. • M • · * · ·»* ♦ *· ···· ' • · • · • ♦ · 117509

5 H29, H30 ja H71.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen humanisoitu immu-noglobuliini, tunnettu siitä, että ainakin kolme asemaa ensimmäisestä ryhmästä ovat asemat L45, L58 ja L69, ja ainakin viisi asemaa toisesta ryhmästä ovat asemat H27, H28,

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen humanisoitu immu-noglobuliini, tunnettu siitä, että humanisoitu kevyt-ketju käsittää komplementaarisuuden määrääviä alueita, jotka ovat identtisiä hiiren 21-6:n raskasketjun vastaavien 10 komplementaarisuuden määräävien alueiden kanssa, ja humanisoitu raskasketju käsittää komplementaarisuuden määrääviä alueita, jotka ovat identtisiä hiiren 21-6:n raskasketjun vastaavien komplementaarisuuden määräävien alueiden kanssa, paitsi että humanisoidun raskasketjun CDR3-alue mahdolli-15 sesti sisältää tai ei sisällä fenyylialaniinitähdettä asemassa H98.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen humanisoitu immu- i noglobuliini, tunnettu siitä, että kypsän kevytketjun variaabelin alueen aminohapposekvenssi on sekvenssi jolle 20 on annettu nimi La (SEQ ID nro 7) kuviossa 6 ja kypsän raskasketjun variaabelin alueen aminohapposekvenssi on sek-,V, venssi jolle on annettu nimi Ha (SEQ ID nro 11) kuviossa 7. *.·,· ,;iT .

. 9. Patenttivaatimuksen 1 tai 8 mukaisen humanisoi- ' • » * • * * *".* dun immunoglobuliinin sitova fragmentti. • · · *;* [ 25

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen humanisoi- • » » *· *: tu immunoglobuliini, tunnettu siitä, että sillä on va- • · m kioalueen domeeni.

* · « *.* * 11. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mu- ^0 kaisen humanisoidun vasta-aineen tai sen sitovan fragmen- j***: tin, ja sille farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan. ··· .1.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukaisen farmaseuttisen • · *;]/ koostumuksen käyttö lääkkeen valmistamiseksi tulehdustaudin • · *···* hoitamiseksi. ·«· ··♦» *·· • · . • · ··« 92 1 1 7 5 0 9

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tulehdustauti on multippeliskleroosi.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaisen humanisoidun immunoglobuliinin käyttö valmistettaessa lää- 5 kettä tulehdussairauksien hoitoon tai ennaltaehkäisyyn. • · « • · • · · • · * • · · · • · ···, • · * * * * · · • · • « · • · · • · · • · · • · · « • · · • · « • · · * * » • · • · *·· * · · * · * • · · • · • · • « · » • · » • · · · * * · * * • · ·**' 93 1 1 7509