ES2341708T7 - Anticuerpos específicos de CD22 humana y sus usos terapéuticos y diagnósticos - Google Patents

Anticuerpos específicos de CD22 humana y sus usos terapéuticos y diagnósticos Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos específicos de CD22 humana y sus usos terapéuticos y diagnósticos
La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para los determinantes anti- génicos del antígeno de los linfocitos B, CD22. La presente invención se refiere también a los usos terapéuticos de la molécula de anticuerpo y a métodos para producir la molécula de anticuerpo.
En una molécula de un anticuerpo natural, hay dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen en su extremo N-terminal un dominio variable. Cada dominio variable se compone de cuatro regiones marco (FR) que alternan con tres regiones determinantes de la complementariedad (cDr). Los residuos de los dominios variables se numeran convencionalmente según un sistema creado por Kabat et al. Este sistema está descrito por Kabat et al., 1987, en Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (de aquí en adelante "Kabat et al. (cita anterior)"). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto cuando se indica otra cosa.
Las designaciones de los residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que los de la numeración estricta de Kabat que corresponde a un acortamiento de un componente estructural o a una inserción en un componente estructural, ya sea marco o CDR, de la estructura del dominio variable básico. La numeración correcta de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.
Las CDR del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) según la numeración de Kabat.
Las CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) según la numeración de Kabat.
La construcción de anticuerpos injertados con CDR se describe en la solicitud de patente europea EP-A-0239400, que describe un procedimiento en el que las CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón se injertan en las regiones marco de los dominios variables de una inmunoglobulina humana mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos largos. Las CDR determinan la especificidad de unión al antígeno de los anticuerpos y son secuencias peptídicas relativamente cortas mantenidas sobre las regiones marco de los dominios variables.
El primer trabajo sobre anticuerpos monoclonales humanizados por injertos de CDR se llevó a cabo sobre anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos sintéticos, tales como NP. Sin embargo, ejemplos en los que un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la lisozima y un anticuerpo monoclonal de rata que reconoce un antígeno sobre las células T humanas fueron humanizados por injertos de CDR, han sido descritos por Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) y Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.
Riechmann et al., encontraron que la transferencia de las CDR solas (como han sido definidas por Kabat (Kabat et al. (cita anterior) y Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) no fue suficiente para proporcionar una actividad satisfactoria de unión al antígeno en el producto injertado con CDR. Se encontró que muchos residuos marco tenían que ser alterados para que se correspondieran con los de la región marco del donante. Los criterios propuestos para seleccionar qué residuos marco necesitan ser alterados están descritos en la solicitud de patente internacional No. WO 90/07861.
Se han publicado una serie de reseñas que exponen los anticuerpos injertados con CDR, incluyendo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Los linfomas malignos son un grupo diverso de neoplasmas. La mayoría de los casos aparecen en personas ancianas. El linfoma no Hodgkin (NHL) es una enfermedad que normalmente afecta de 200.000 a 250.000 pacientes en los Estados Unidos. Es el segundo cáncer que aumenta más rápidamente en los Estados Unidos, aumentando a una tasa de aproximadamente 55.000 nuevos casos por año. La incidencia aumenta a una velocidad que es mayor que la que se puede atribuir simplemente al aumento de la edad de la población y a la exposición a factores de riesgo conocidos.
La clasificación del linfoma es compleja, y ha evolucionado en las recientes décadas. En 1994 se introdujo la clasificación revisada de linfomas europeo-americanos (REAL). Esta clasificación organiza los linfomas de células B (el identificado más frecuentemente), de células T y de origen inclasificable en subtipos acordados. En la práctica diaria, el agrupamiento de los NHL en categorías de grado bajo, intermedio y grado alto basándose en su apariencia histológica general, refleja en líneas generales su comportamiento clínico.
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El NHL afecta predominantemente a los nódulos linfáticos pero, en pacientes individuales, el tumor puede implicar otros sitios anatómicos tales como el hígado, bazo, médula ósea, pulmones, intestino y piel. La enfermedad comúnmente se presenta como un alargamiento indoloro de los nódulos linfáticos. El linfoma extranodural afecta con la mayor frecuencia al intestino, aunque ha sido documentado el linfoma primario virtualmente de cada órgano. Los síntomas sistémicos incluyen fiebre, sudores, cansancio y pérdida de peso.
Hasta recientemente, el sistema de clasificación de Ann Arbor, basado enteramente en la extensión anatómica de la enfermedad, ha sido el principal determinante de la terapia en el NHL. Esta información puede ser mejorada incorporando indicadores adicionales de pronóstico, incluyendo la edad, los niveles de lactato-deshidrogenasa sérica y el estado general. Aún así, el conocimiento del sistema de clasificación de Ann Arbor, junto con el subtipo histológico e inmunológico del tumor, es todavía el principal determinante del tratamiento.
El NHL de grado bajo tiene un curso poco activo, con una supervivencia media del paciente de 8 a 10 años. La supervivencia se ve poco impactada por la terapia actualmente disponible, aunque la irradiación de la enfermedad local y la quimioterapia para los síntomas sistémicos mejoran la calidad de vida de los pacientes. La quimioterapia de combinación se puede reservar para la enfermedad recurrente. La enfermedad intermedia y, especialmente, la enfermedad de grado alto es extremadamente agresiva y tiende a diseminarse. La enfermedad de este grado requiere tratamiento urgente. La radioterapia puede ser un componente útil de tratamiento en pacientes con una enfermedad muy masiva. Se han empleado muchos regímenes diferentes de quimioterapia, y se puede obtener una supervivencia a largo plazo libre de la enfermedad en más de la mitad de los pacientes. La terapia de dosis altas con soporte de células madre se introdujo inicialmente para los pacientes con enfermedad recurrente o refractaria, pero ahora está encontrando, cada vez más, un lugar en la terapia de primera línea para los pacientes con enfermedad de poco riesgo. La tendencia en los últimos años hacia una estrategia terapéutica cada vez más agresiva debe ser sopesada frente a la edad generalmente elevada y la debilidad relativa de muchos pacientes con NHL, y por la necesidad de combinar la toxicidad del tratamiento con el diagnóstico individual de la enfermedad de cada paciente.
Se necesitan mejores tratamientos, que sean más eficaces y mejor tolerados. Los agentes recientemente introducidos incluyen nuevos fármacos citotóxicos, incorporados progresivamente en combinaciones, y la introducción de terapias basadas en anticuerpos.
El linfoma no Hodgkin engloba un conjunto de linfomas de células B. Los antígenos de las células B representan por tanto dianas adecuadas para la terapia con anticuerpos.
El CD22 es una glicoproteína de membrana de 135 kDa que pertenece a una familia de proteínas de unión al ácido siálico llamadas sialoadhesinas. Se detecta en el citoplasma de modo temprano en el desarrollo de las células B, aparece en la superficie celular simultáneamente con la IgD y se encuentra en la mayor parte de las células B maduras. La expresión aumenta después de la activación de las células B. El CD22 se pierde con la diferenciación terminal y generalmente se define como ausente en las células plasmáticas. Por tanto este antígeno de interiorización está presente en la superficie de células pre-B y de las células B maduras pero no en las células madre ni en las células plasmáticas.
Existen dos isoformas de CD22 en el hombre. La forma predominante (CD22p) contiene 7 dominios tipo inmunoglo- bulina (tipo Ig) en la región extracelular. La variante CD22a carece del dominio 4 tipo Ig y puede tener un dominio citoplásmico truncado. Los anticuerpos que bloquean la adhesión de CD22 a los monocitos, neutrófilos, linfocitos y eritrocitos se ha demostrado que se unen dentro del primero o segundo dominio tipo Ig.
El dominio citoplásmico de CD22 es tirosina fosforilada después del ligamiento del receptor del antígeno de células B y se asocia con Lyk, Syk y fosfatidil-inositol 3-quinasa. La función de CD22 es modular por reducción el umbral de activación de las células B. Puede mediar también en la adhesión de las células mediante la interacción con células que llevan los sialoglicoconjugados apropiados.
El CD22 se expresa en la mayor parte de las leucemias y linfomas de células B, incluyendo el NHL, la leucemia linfoblástica aguda (B-ALL), la leucemia linfocítica crónica (B-CLL) y especialmente la leucemia no linfocítica aguda (ANLL).
Los anticuerpos monoclonales frente a CD22 han sido descritos en la técnica anterior. El documento WO 98/41641 describe anticuerpos recombinantes anti-CD22 con residuos de cisteína en Vh44 y Vl100. El documento WO 96/04925 describe las regiones Vh y Vl del anticuerpo LL2 anti-CD22. El documento US 5686072 describe combinaciones de inmunotoxinas anti-CD22 y anti-CD19. El documento WO 98/42378 describe el uso de anticuerpos desnudos anti-CD22 para el tratamiento de tumores malignos de células B.
Una serie de medicamentos basados en anticuerpos han sido autorizados recientemente, por ejemplo, Rituxan (un anticuerpo quimérico humano no marcado y1 (+región mY1V), específico para CD20), o están en ensayos clínicos para esta enfermedad. Estos se basan o bien en la destrucción de las células B mediada por el complemento o mediada por ADCC o bien en el uso de radionúclidos, tales como 131I o 90Y, que llevan asociados los problemas de preparación y de uso para los clínicos y pacientes. Existe la necesidad de una molécula de anticuerpo para tratar el
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NHL que se pueda usar repetidamente y que se produzca de manera fácil y eficiente. Existe también la necesidad de una molécula de anticuerpo, que tenga una alta afinidad para CD22 y una baja inmunogenicidad en los seres humanos.
El epratuzumab es una versión humanizada del anticuerpo LL2 que se une al dominio extracelular de CD22 con una afinidad (Kd) de 0,7 nM (Carnahan et al., Clin. Cancer Res. 9. supplement, 3982s-3990s, 2003)
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para el CD22 humano, que comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) que tiene la secuencia dada como H1 en la Figura 1 (SEQ ID NO:1) para CDR-H1, como H2 en la Figura 1 (SEQ ID NO:2) o como H2 de la que se ha separado un sitio potencial de glicosilación, o una H2 en la que el residuo de lisina en la posición 60 (según el sistema de numeración de Kabat) ha sido reemplazado por un aminoácido alternativo, o una H2 en la que tanto el sitio de glicosilación como la lisina reactiva en la posición 60 han sido eliminados para CDR-H2 y como H3 en la Figura 1 (SEQ ID NO:3) para CDR-H3 y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) que tiene la secuencia dada como L1 en la Figura 1 (SEQ ID NO:4) para CDR-L1, como L2 en la Figura 1 (SEQ ID NO:5) para CDR-L2 y como L3 en la Figura 1 (SEQ ID NO:6) para CDR-L3.
Las CDR dadas en las SEQ IDS NOS:1 a 6 y en la Figura 1 mencionadas anteriormente se derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón 5/44.
Las secuencias completas de los dominios variables del anticuerpo de ratón 5/44 se muestran en la Figura 2 (cadena ligera) (SEQ ID NO:7) y en la Figura 3 (cadena pesada) (SEQ ID NO:8). Este anticuerpo de ratón se denomina también en lo que sigue "el anticuerpo del donante" o el "anticuerpo monoclonal murino".
Una realización alternativamente preferida de la presente invención es el anticuerpo monoclonal de ratón 5/44 que tiene las secuencias del dominio variable de cadena ligera y de cadena pesada que se muestran en la Figura 2 (SEQ ID NO:7) y en la Figura 3 (SEQ ID NO:8), respectivamente. La región constante de cadena ligera de 5/44 es kappa y la región constante de cadena pesada es IgG1.
En otra realización preferida, el anticuerpo según la presente invención es una molécula de anticuerpo quimérico de ratón/humano, que se denomina aquí molécula de anticuerpo 5/44 quimérico. La molécula de anticuerpo quimérico comprende los dominios variables del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44 (SEQ ID NOS:7 y 8) y los dominios constantes humanos. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo 5/44 quimérico comprende el dominio C kappa humano (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; número de acceso de Genebank J00241) en la cadena ligera y los 4 dominios gamma humanos (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) en la cadena pesada, opcionalmente con el residuo de serina en la posición 241 reemplazado por un residuo de prolina.
Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2' en el que una secuencia del sitio potencial de glicosilación ha sido eliminada y en el que inesperadamente ha aumentado la afinidad del anticuerpo 5/44 quimérico para el antígeno CD22 y que preferiblemente tiene como CDR-H2 la secuencia dada como H2' (SEQ ID NO:13).
Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2" en el que un residuo de lisina en la posición 60, que está localizado en una posición expuesta dentro de CDR-H2 y que se considera que tiene el potencial de reaccionar con agentes de conjugación dando como resultado una reducción de la afinidad de unión al antígeno, está sustituido por un aminoácido alternativo para producir una sustitución conservada. Preferiblemente CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2" (SEQ ID NO:15).
Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2"' en el que tanto la secuencia del sitio potencial de glicosilación como el residuo de lisina en la posición 60, están sustituidos por aminoácidos alternativos. Preferiblemente CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2"' (SEQ ID NO:16).
En una tercera realización alternativamente preferida, el anticuerpo según la presente invención es una molécula de anticuerpo injertada con CDR. La expresión "una molécula de anticuerpo injertada con CDR " como se usa aquí se refiere a una molécula de anticuerpo en la que la cadena pesada y/o la cadena ligera contiene una o más CDR (incluyendo, si se desea, una CDR modificada) procedentes de un anticuerpo del donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en una cadena pesada y/o en una cadena ligera del marco de la región variable de un anticuerpo del aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano).
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Preferiblemente, dicho anticuerpo injertado con CDR tiene un dominio variable que comprende las regiones marco del aceptor humano así como una o más CDR del donante mencionadas anteriormente.
Cuando se injertan las CDR, se puede usar cualquier secuencia marco apropiada de la región variable del aceptor teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo del donante del que se derivan las CDR, incluyendo las regiones marco de ratón, de primates y humanas. Ejemplos de marcos humanos que se pueden usar en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al. (cita anterior)). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden usar para la cadena pesada, REI se puede usar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden usar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, se pueden usar secuencias de la línea germinal humana. La región marco preferida para la cadena ligera es la secuencia del subgrupo germinal humano (DPK9+JK1) que se muestra en la Figura 5 (SEQ ID NO: 17). La región marco preferida para la cadena pesada es la secuencia del subgrupo humano (DP7+JH4) que se muestra en la Figura 6 (SEQ ID NO:21).
En un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, se prefiere usar como anticuerpo del aceptor uno que tenga cadenas que sean homólogas a las cadenas del anticuerpo del donante. Las cadenas pesadas y ligeras del aceptor no tienen que ser derivadas necesariamente del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas con regiones marco derivadas de diferentes cadenas.
También, en un anticuerpo injertado con CDR de la presente invención, las regiones marco no tienen que tener necesariamente exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo del aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden ser cambiados a residuos que se presentan más frecuentemente para esa clase o tipo de cadena del aceptor. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones marco del aceptor se pueden cambiar para que se correspondan con el residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo del donante o con un residuo que es una sustitución conservadora del residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo del donante. Dichos cambios se deben mantener al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo del donante. En el documento WO 91/09967 se expone un protocolo para seleccionar residuos en las regiones marco del aceptor que puede ser necesario cambiar.
Preferiblemente, en una molécula de anticuerpo injertada con CDR según la presente invención, si la cadena ligera del aceptor tiene la secuencia del subgrupo DPK9+JK1 humano (mostrada en la Figura 5) (SEQ ID NO:17 (DPK9) más sEq ID NO:18(JK1)) entonces las regiones marco del aceptor de la cadena ligera comprenden residuos del donante en las posiciones 2, 4, 37, 38, 45 y 60 y pueden comprender adicionalmente un residuo del donante en la posición 3 (según Kabat et al. (cita anterior)).
Preferiblemente, en una molécula de anticuerpo injertada con CDR de la presente invención, si la cadena pesada del aceptor tiene la secuencia DP7+JH4 humana (mostrada en la Figura 6 (SEQ ID NO:21 (DP7) más SEQ ID NO:22 (JH4)), entonces las regiones marco del aceptor de la cadena pesada comprenden, en adición a una o más CDR del donante, residuos del donante en las posiciones 1, 28, 48, 71 y 93 y pueden comprender adicionalmente residuos del donante en las posiciones 67 y 69 (según Kabat et al. (cita anterior)).
Los residuos del donante son residuos procedentes del anticuerpo del donante, esto es el anticuerpo del cual se derivaron originalmente las CDR.
Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2' en el que una secuencia del sitio potencial de glicosilación ha sido eliminada para aumentar la afinidad del anticuerpo 5/44 quimérico para el antígeno CD22 y que preferiblemente tiene como CDR-H2 la secuencia dada como H2' (SEQ ID NO:13).
Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2" en el que un residuo de lisina en la posición 60, que está localizado en una posición expuesta dentro de CDR-H2 y que se considera que tiene el potencial de reaccionar con agentes de conjugación dando como resultado una reducción de la afinidad de unión al antígeno, está sustituido por un aminoácido alternativo. Preferiblemente CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2" (SEQ ID NO: 15).
Alternativamente o adicionalmente, el anticuerpo de la presente invención puede comprender una cadena pesada en la que el dominio variable comprende como CDR-H2 (como ha sido definida por Kabat et al., (cita anterior)) un H2"' en el que tanto la secuencia del sitio potencial de glicosilación como el residuo de lisina en la posición 60, están sustituidos por aminoácidos alternativos. Preferiblemente CDR-H2 tiene la secuencia dada como H2"' (SEQ ID NO:16).
La molécula de anticuerpo de la presente invención puede comprender: una molécula de anticuerpo completa, que tiene las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa; un fragmento de la misma, tal como un Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 o fragmento Fv; un monómero o dímero de cadena ligera o cadena pesada; un anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, un Fv de cadena sencilla en el que los dominios variables de cadena pesada y de
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cadena ligera están unidos por un enlace peptídico. Similarmente, las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera se pueden combinar con otros dominios de anticuerpo cuando sea apropiado.
La molécula de anticuerpo de la presente invención puede tener unida a ella, una molécula efectora o una molécula indicadora. Por ejemplo, puede tener un macrociclo, para quelar un átomo de un metal pesado, o una toxina, tal como ricina, unida a ella por una estructura de puente covalente. Alternativamente, se pueden usar procedimientos de tecnología de ADN recombinante para producir una molécula de anticuerpo en la que el fragmento Fc (CH2, CH3 y dominios bisagra), los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina completa han sido reemplazados, o han sido unidos a la misma por un enlace peptídico, una proteína no inmunoglobulina funcional, tal como una enzima o una molécula de toxina.
La molécula de anticuerpo de la presente invención, tiene preferiblemente una afinidad de unión de al menos 0,85 x
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10 M, más preferiblemente al menos 0,75 x 10 M y lo más preferiblemente al menos 0,5 x 10 M.
Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención comprende el dominio variable de cadena ligera 5/44-gL1 (SEQ ID NO:19) y el dominio variable de cadena pesada 5/44-gH7 (SEQ ID NO:27). Las secuencias de los dominios variables de estas cadenas ligeras y pesadas se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente.
También se han descrito variantes de la molécula de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada para CD22. Dichas variantes se pueden obtener por una serie de protocolos de maduración de afinidad incluyendo la mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), la mezcla de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), la mezcla de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la exposición de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y la PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (cita anterior) expone estos métodos de maduración de afinidad.
La presente invención proporciona también una secuencia de ADN que codifica la cadena o cadenas pesadas y/o ligeras de la molécula de anticuerpo de la presente invención.
Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o la cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la presente invención.
La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido por un proceso químico, cADN, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.
La presente invención se refiere también a un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Preferiblemente, el vector de clonación o de expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente.
Los métodos generales por los que los vectores se pueden construir, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York y el Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.
Las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican la totalidad o parte de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se pueden sintetizar como se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las correspondientes secuencias de aminoácidos.
El ADN que codifica las secuencias marco del aceptor está ampliamente disponible para los expertos en la técnica y se puede sintetizar fácilmente sobre la base de sus secuencias conocidas de aminoácidos.
Las técnicas estándar de biología molecular se pueden usar para preparar las secuencias de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden utilizar la mutagénesis dirigida a un sitio y las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado.
Se puede utilizar cualquier sistema adecuado de célula hospedante/vector para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpo tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente los fragmentos Fv y los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, los Fv de cadena sencilla. Se pueden usar sistemas de expresión de células hospedantes eucarióticas, por ejemplo, de mamífero, para la producción de moléculas de anticuerpo más grandes, incluyendo las moléculas de anticuerpo completas. Las células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen células de CHO, de mieloma o hibridoma.
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La presente invención proporciona también un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo según la presente invención, que comprende el cultivo de una célula hospedante que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para llevar a la expresión de una proteína a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y al aislamiento de la molécula de anticuerpo.
Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como cadenas ligeras, la línea de células se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un vector sencillo, y el vector incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.
La presente invención proporciona también una composición terapéutica o para diagnóstico, que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona también un procedimiento para la preparación de una composición terapéutica o para diagnóstico, que comprende la mezcla de una molécula de anticuerpo de la presente invención junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición terapéutica o para diagnóstico o puede ir acompañado por otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes anticuerpos, por ejemplo células anti-T, anticuerpos anti-IFNY o anti-LPS, o ingredientes no anticuerpos tales como las xantinas.
Las composiciones farmacéuticas preferiblemente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa aquí se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición determinada, o para poner de manifiesto un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal se puede usar también para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Dicha información se puede usar entonces para determinar las dosis útiles y las vías de administración en los seres humanos.
La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad de la enfermedad, de la salud general del sujeto, de la edad, peso y sexo del sujeto, de la dieta, tiempo y frecuencia de la administración, combinación o combinaciones de fármacos, reacciones de sensibilidad y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación rutinaria y depende de la opinión del clínico. Generalmente, una dosis eficaz variará de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 15 mg/kg.
Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.
La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la enfermedad a tratar, del grado de linfoma maligno o leucemia y de si la molécula de anticuerpo se usa profilácticamente o para tratar una afección existente.
La frecuencia de administración dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida larga (por ejemplo, 2 a 15 días) puede ser necesario administrar solamente una dosis una vez al día, una vez por semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.
Una composición farmacéutica puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración del anticuerpo. El vehículo no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Pueden ser vehículos adecuados las macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como las proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.
Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de un ácido mineral, tales como hidrocloru- ros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables de las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente pueden estar presentes en dichas composiciones, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del
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pH. Tales vehículos hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas y suspensiones, para ingestión por el paciente.
Las formas preferidas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o perfusión, por ejemplo por inyección rápida o por perfusión continua. Cuando el producto es para inyección o para perfusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo acuoso u oleoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a ser tratados pueden ser animales. Sin embargo, es preferible que las composiciones se adapten para administración a sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por toda serie de vías incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Los hyposprays se pueden usar también para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones. Se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos previamente a la inyección.
La administración directa de las composiciones generalmente se realizará por inyección, subcutáneamente, intrape- ritonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o se pueden administrar en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones se pueden administrar también en una lesión. La posología de tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.
Se puede apreciar que el ingrediente activo de la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición es para ser administrada por una vía que usa el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que ha sido absorbido del tracto gastrointestinal.
Una exposición concienzuda de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharma- ceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
También se contempla que el anticuerpo de la presente invención sea administrado mediante el uso de terapia géni- ca. Con el fin de conseguir esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes apropiados de ADN se introducen en un paciente, de tal modo que las cadenas de anticuerpo se expresen a partir de las secuencias de ADN y sean ensambladas in situ.
La presente invención proporciona también la molécula de anticuerpo de la presente invención, para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por las células que expresan CD22.
La presente invención proporciona además el uso de la molécula de anticuerpo según la presente invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por las células que expresan CD22.
La molécula de anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en cualquier terapia en la que se desee reducir el nivel de células que expresan CD22 que están presentes en el cuerpo humano o animal. Estas células que expresan CD22 pueden estar circulando en el cuerpo o estar presentes a un nivel indeseablemente alto localizado en un sitio particular del cuerpo. Por ejemplo, los niveles elevados de células que expresan CD22 estarán presentes en los linfomas de células B y en las leucemias. Se puede utilizar la molécula de anticuerpo de la presente invención en la terapia de enfermedades mediadas por las células que expresan CD22.
La molécula de anticuerpo de la presente invención se usa preferiblemente para el tratamiento de linfomas malignos y leucemias, muy preferiblemente el NHL.
Se ha descrito un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen o tienen riesgo de padecer un trastorno mediado por las células que expresan CD22, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molécula de anticuerpo de la presente invención.
La molécula de anticuerpo de la presente invención se puede usar también en el diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y en el diagnóstico por imagen de las enfermedades que implican células que expresan CD22.
La presente invención se describe adicionalmente sólo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos, que hacen referencia a las Figuras adjuntas, en las cuales:
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La Figura 1 presenta la secuencia de aminoácidos de las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44 (SEQ ID NOS:1 a 6);
La Figura 2 presenta la secuencia completa del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44;
La Figura 3 presenta la secuencia completa del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44;
La Figura 4 presenta la estrategia para la eliminación del sitio de glicosilación y de la lisina reactiva en CDR-H2; La Figura 5 presenta el diseño de injerto para la secuencia de cadena ligera 5/44;
La Figura 6 presenta el diseño de injerto para la secuencia de cadena pesada 5/44;
La Figura 7 presenta los vectores pMRR14 y pMRR10.1;
La Figura 8 presenta los resultados del ensayo Biacore de los mutantes 5/44 quiméricos;
La Figura 9 presenta los oligonucleótidos para el ensamblaje de los genes gH 1 y gL1 en 5/44;
La Figura 10 presenta los vectores intermedios pCR2.1 (544gH1) y pCR2.1 (544gL1);
La Figura 11 presenta las casetes de oligonucleótidos utilizadas para preparar injertos adicionales;
La Figura 12 presenta el ensayo de competición entre el anticuerpo de ratón 5/44 marcado fluorescentemente y las variantes injertadas; y
La Figura 13 presenta la secuencia completa de ADN y proteína de las cadenas pesadas y ligeras injertadas. Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos candidatos
Se seleccionaron un panel de anticuerpos frente a CD22 a partir de hibridomas utilizando los siguientes criterios de selección: unión a células Daudi, interiorización sobre células Daudi, unión a células mononucleares de sangre periférica (PBMC), interiorización sobre PBMC, afinidad (superior a 10"9M), y1 de ratón y tasa de producción. Se seleccionó el 5/44 como el anticuerpo preferido.
Ejemplo 2
Clonación y expresión génica de una molécula de anticuerpo 5/44 quimérico Preparación de las células de hibridoma 5/44 y preparación del RNA a partir de ellas
El hibridoma 5/44 se generó por tecnología convencional de hibridoma después de la inmunización de ratones con proteína CD22 humana. Se preparó el RNA a partir de las células de hibridoma 5/44 utilizando un kit RNEasy (Qia- gen, Crawley, UK; Catalogue No. 74106). El RNA obtenido se transcribió de forma inversa a cADN, como se describe más adelante.
Distribución de CD22 en los tumores de NHL
Se ha realizado un estudio inmunohistoquímico para examinar la incidencia y la distribución de la tinción utilizando anticuerpos monoclonales 5/44 anti-CD22. Se incluyeron en el estudio anticuerpos control anti-CD20 y anti-CD79a para confirmar las áreas de células B de los tumores.
Se estudió un total de 50 tumores y se dividieron en categorías como sigue utilizando los sistemas de clasificación de Formulación de Trabajo y el REAL:
• 7 Leucemias/linfomas linfoblásticos B (Grado alto/l)
• 4 Linfomas linfocíticos pequeños B-CLL (Grado bajo/A)
• 3 Inmunocitomas linfoplasmacitoides (Grado bajo /A)
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• 1 Célula de cubierta (Grado intermedio/F)
• 14 Linfomas del centro folicular (Grado bajo a intermedio/D)
• 13 Linfomas de células grandes difusas (Grado intermedio a alto/G,H)
• 6 Inclasificables (K)
• 2 Linfomas de células T
40 linfomas de células B fueron positivos para el antígeno CD22 con el anticuerpo 5/44 a 0,1 pg/ml y otros 6 se convirtieron en positivos cuando la concentración aumentó a 0,5 pg/ml. Para los 2 tumores restantes de células B que fueron negativos a 0,1 pg/ml, hubo insuficiente tejido restante para analizar a la concentración más alta. Sin embargo, el ensayo paralelo con otro anticuerpo 6/13 anti-CD22 Celltech, que dio una tinción más fuerte que el 5/44, dio como resultado en los 48 linfomas de células B una tinción positiva para CD22.
Por tanto, es posible llegar a la conclusión de que el antígeno CD22 está ampliamente expresado en los linfomas de células B y por ello proporciona una diana adecuada para la inmunoterapia en el NHL.
Clonación por PCR de 5/44 Vh y Vl
Las secuencias de cADN que codifican los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de 5/44 se sintetizaron utilizando transcriptasa reversa para producir copias de cADN de una sola cadena del mRNA presente en el RNA total. Este se utilizó entonces como el modelo para la amplificación de las secuencias de la región V murina utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
a) Síntesis de cADN
El cADN se sintetizó en un volumen de reacción de 20 pl que contenía los siguientes reactivos: Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, ditiotreitol 10 mM, MgCh 3 mM, cada desoxiribonucleósido-trifosfato a concentración 0,5 mM, 20 unidades de RNAsin, 75 ng de cebador hexanucleótido aleatorio, 2 pg de RNA 5/44 y 200 unidades de transcriptasa reversa de virus de leucemia murina de Moloney. Después de incubación a 42 °C durante 60 minutos, se terminó la reacción calentando a 95 °C durante 5 minutos.
b) PCR
Se sometieron alícuotas de cADN a la PCR usando combinaciones de cebadores específicos para cadenas pesadas y ligeras. Se utilizaron como cebadores directos mezclas de cebadores degenerados diseñados para hibridarse con las secuencias del péptido señal. Todas estas secuencias contienen, en orden, un sitio de restricción (Vl Sful; Vh HindlII) a partir de 7 nucleótidos de sus extremos 5', la secuencia GCCGCCACC (SEQ ID NO:50), para permitir la traducción óptima de los mRNA resultantes, un codón de iniciación y 20-30 nucleótidos basados en las secuencias del péptido líder de anticuerpos conocidos de ratón (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
Los cebadores 3' se diseñan para abarcar la unión J-C del marco 4 del anticuerpo y contienen un sitio de restricción para la enzima BsiWI para facilitar la clonación del fragmento Vl PCR. Los cebadores 3' de cadena pesada son una mezcla diseñada para abarcar la unión J-C del anticuerpo. El cebador 3' incluye un sitio de restricción Apal para facilitar la clonación. La región 3' de los cebadores contiene una secuencia mixta basada en las que se encuentran en anticuerpos conocidos de ratón (Kabat et al., 1991, cita anterior).
Las combinaciones de los cebadores descritos antes hacen posibles los productos de la PCR para que VH y V1 sean clonados directamente en un vector de expresión apropiado (véase más adelante) para producir cadenas pesadas y ligeras quiméricas (de ratón-humano) y para que estos genes sean expresados en células de mamíferos para producir anticuerpos quiméricos del isotipo deseado.
Las incubaciones (100 pl) para la PCR se prepararon como sigue. Cada reacción contenía Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, gelatina al 0,01 % p/v, cada desoxiribonucleósido-trifosfato a concentración 0,25 mM, 10 pmol de mezcla de cebador 5', 10 pmol de cebador 3', 1 pl de cADN y 1 unidad de Taq polimerasa. Se incubaron las reacciones a 95 °C durante 5 minutos y después se sometieron a ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto. Después de 30 ciclos, se analizaron alícuotas de cada reacción por electroforesis sobre un gel de agarosa.
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Para la región V de cadena pesada, solamente se obtuvo un producto de ADN amplificado cuando un grupo de cebadores hibridado dentro del comienzo del marco I reemplazó al grupo de cebadores del péptido señal. Los fragmentos se clonaron en vectores de secuenciación del ADN. Se determinó la secuencia de ADN y se tradujo para dar una secuencia deducida de aminoácidos. Esta secuencia deducida se verificó por referencia a la secuencia proteíni- ca N-terminal determinada experimentalmente. Las figuras 2 y 3 presentan la secuencia proteínica de ADN de las regiones V maduras de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44 respectivamente.
c) Clonación molecular de los fragmentos de la PCR
Se clonaron entonces las secuencias de la región v murina en los vectores de expresión pMRR10.1 y pMRR14 (Figura 7). Estos son vectores para la expresión de la cadena ligera y de la cadena pesada respectivamente que contienen ADN que codifica las regiones constantes de la cadena ligera kappa humana y de la cadena pesada gamma- 4 humana. La región Vl se subclonó hasta el vector de expresión por digestión de restricción y ligamiento a partir del vector de secuenciación, utilizando los sitios de restricción SfuI y BsiWI, creando el plásmido pMRR10(544cL). El ADN de cadena pesada se amplificó por la PCR utilizando un cebador 5' para introducir un péptido señal, ya que no se obtuvo éste en la estrategia de clonación - se empleó un anticuerpo líder de cadena pesada de ratón a partir de un hibridoma diferente interno (denominado 162). El cebador 5' tenía la siguiente secuencia:
5gcgcgcaagcttgccgccaccatggacttcggattctctctcgtgttcctggc ACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’ (SEQ ID NO:51).
El cebador inverso era idéntico al utilizado en la clonación del gen Vh original. El producto resultante de la PCR se digirió con enzimas HindIII y ApaI, se sub-clonó, y se confirmó su secuencia de ADN, creando el plásmido pMRR14(544cH). La co-transfección transitoria de ambos vectores de expresión en células CHO generó el anticuerpo c5/44 quimérico. Este se consiguió utilizando el reactivo de lipofectamina según los protocolos del fabricante (InVitrogen:Life Technology, Groningen, The Netherlands. Catalogue no. 11668-027).
Eliminación del sitio de glicosilación y de la lisina reactiva
Se observó en la CDR-H2 una secuencia del sitio potencial de glicosilación unido por N, que tiene la secuencia de aminoácidos N-Y-T (Figura 3). La SDS-PAGE, la transferencia Western y la tinción por carbohidrato de geles de 5/44 y sus fragmentos (incluyendo Fab) indicaron que este sitio estaba ciertamente glicosilado (no se muestra). En adición, se observó un residuo de lisina en una posición expuesta dentro de CDR-H2, que tenía el potencial de reducir la afinidad de unión del anticuerpo proporcionando un sitio adicional para la conjugación con un agente con el que se pueda conjugar el anticuerpo.
Se utilizó una estrategia de PCR para introducir sustituciones de aminoácidos en la secuencia de CDR-H2 en un intento de eliminar el sitio de glicosilación y/o la lisina reactiva, como se muestra en la Figura 4. Se utilizaron cebadores directos que codifican las mutaciones N55Q, T57A o T57V para eliminar el sitio de glicosilación (Figura 4) y se generó un cuarto cebador directo que contenía la sustitución K60R, para eliminar el residuo de lisina reactiva (Figura 4). Se utilizó un cebador inverso marco 4 en cada una de estas amplificaciones de la PCR. Los productos de la PCR se digirieron con las enzimas XbaI y ApaI y se insertaron en pMRR14(544cH) (también se escindieron con XbaI y ApaI) para generar plásmidos de expresión que codifican estos mutantes. Las mutaciones N55Q, T57A y T57V cortan el sitio de glicosilación mediante el cambio de la secuencia de aminoácidos fuera del consenso N-X-T/S mientras que la mutación K60R reemplaza la lisina potencialmente reactiva con el residuo de arginina cargado positivamente de forma similar. Los plásmidos de variante cH resultantes se co-transfectaron con el plásmido cL para generar variantes del anticuerpo quimérico expresado.
Evaluación de las actividades de los genes quiméricos
Las actividades de los genes quiméricos se evaluaron después de la transfección transitoria en células
CHO.
c) Determinación de las constantes de afinidad por análisis BiaCore.
Las afinidades del 5/44 quimérico o sus variantes, en los que se han eliminado sus sitios de glicosilación o sus lisi- nas reactivas, se investigaron utilizando tecnología BIA para la unión a construcciones CD22-mFc. Los resultados se presentan en la Figura 8. Todas las medidas de unión se realizaron en el instrumento BIAcore™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). El ensayo se llevó a cabo mediante la captura de CD22mFc a través del Fc antiratón inmovilizado. El anticuerpo estaba en la fase soluble. Se inyectaron las muestras, el patrón, y los controles (50 ul) sobre el Fc anti-ratón inmovilizado seguido por el anticuerpo en la fase soluble. Después de cada ciclo, se regeneró la superficie con 50 ul de HCl 40 mM a 30 ul/min. Se realizó el análisis cinético utilizando el programa informático BIAevaluation 3.1 (Pharmacia).
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La eliminación del sitio de glicosilación en la construcción T57A dio como resultado una constante de asociación ligeramente más rápida y una constante de disociación significativamente más lenta en comparación con el 5/44 quimérico, dando una mejora de la afinidad de aproximadamente 5 veces. La mutación N55Q no tuvo ningún efecto sobre la afinidad. Este resultado fue inesperado ya que da a entender que la eliminación del propio carbohidrato aparentemente no tuvo ningún efecto sobre la unión (como con el cambio de N55Q). Se observó mejor afinidad solamente con el cambio de T57A. Una posible explicación es que, a pesar de la presencia de carbohidrato, la treo- nina en la posición 57 ejerce un efecto negativo sobre la unión que es eliminado en la conversión de treonina a ala- nina. La hipótesis de que el pequeño tamaño de la alanina es importante, y que el efecto negativo de la treonina está relacionado con su tamaño, se basa en el resultado obtenido utilizando la mutación T57V: el reemplazamiento con valina en la posición 57 no es beneficioso (no se muestran los resultados).
La eliminación de la lisina por la mutación K60R tuvo un efecto neutro sobre la afinidad, esto es, la introducción de arginina elimina un sitio reactivo potencial sin comprometer la afinidad.
Las mutaciones para la eliminación del sitio de glicosilación y para la eliminación de la lisina reactiva fueron por tanto incluidas ambas en el diseño de humanización.
Ejemplo 2
Injerto de CDR del 5/44
La clonación molecular de genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo 5/44 y su uso para producir anticuerpos 5/44 quiméricos (de ratón/humano) han sido descritos anteriormente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios Vl y Vh de 5/44 de ratón se muestran en las figuras 2 y 3 (SEQ ID NOS:7 y 8), respectivamente. Este ejemplo describe el injerto de CDR del anticuerpo 5/44 sobre marcos humanos para reducir la inmunogenicidad potencial en los seres humanos, según el método de Adair et al., (WO91/09967).
Injerto de CDR de la cadena ligera de 5/44
El alineamiento de la secuencia proteínica con las secuencias de consenso de la región V de cadena ligera kappa del sub-grupo I humano indicó una identidad de la secuencia del 64 %. En consecuencia, para construir la cadena ligera injertada con CDR, las regiones marco del aceptor elegidas corresponden a las de la secuencia 012,DPK9 de la línea germinal del sub-grupo I humano VK. La secuencia del marco 4 del aceptor se derivó de la secuencia de la línea germinal de la región J humana JK1.
Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones marco de 5/44 murino y la secuencia del aceptor se da en la Figura 5 y muestra que hay 27 diferencias entre las cadenas del donante y del aceptor. En cada posición, se hizo un análisis del potencial del residuo murino para contribuir a la unión al antígeno, ya sea directa o indirectamente, mediante efectos sobre el empaquetado o en la interfase Vn/VL. Cuando un residuo murino fue considerado importante y suficientemente diferente del residuo humano en términos de tamaño, polaridad o carga, entonces se retuvo dicho residuo murino. Basándose en este análisis, se construyeron dos versiones de la cadena ligera injertada con CDR, que tienen las secuencias dadas en la SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO:20 (Figura 5).
Injerto de CDR de la cadena pesada del 5/44
El injerto de CDR de la cadena pesada del 5/44 se llevó a cabo utilizando la misma estrategia que se ha descrito para la cadena ligera. Se encontró que el dominio V de la cadena pesada del 5/44 era homólogo a las cadenas pesadas humanas que pertenecen al sub-grupo I (70 % de identidad de secuencia) y por tanto se utilizó la secuencia VH1-3,DP7 del marco de la línea germinal del sub-grupo I humano como un marco del aceptor. Las secuencias del marco 4 del aceptor se derivaron de la secuencia de la línea germinal de la región J humana JH4.
Una comparación de la cadena pesada del 5/44 con las regiones marco se muestra en la Figura 6 en la que se puede ver que la cadena pesada de 5/44 difiere de la secuencia del aceptor en 22 posiciones. El análisis de la contribución que cualquiera de éstas puede hacer a la unión del antígeno lleva a 5 versiones de las cadenas pesadas injertadas con CDR a ser construidas, que tienen las secuencias dadas en las SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27 (Figura 6).
Construcción de genes para secuencias injertadas.
Se diseñaron genes para codificar las secuencias injertadas gH1 y gL1, y se diseñaron y construyeron una serie de oligonucleótidos solapantes (Figura 9). Se empleó una técnica de ensamblaje por la PCR para construir los genes de la región V injertada con CDR. Se prepararon volúmenes de reacción de100 ul que contenían Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, gelatina al 0,001 %, cada desoxiribonucleósido-trifosfato a concentración 0,25 mM, 1 pmol de cada uno de los cebadores 'internos' (TI, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmol de cada uno de los cebadores 'externos' (F1, R1), y 1 unidad de Taq polimerasa (AmpliTaq, Applied BioSystems, catalogue no. N808-0171). Los parámetros del ciclo de la PCR fueron 94 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, durante 30 ciclos. Los productos de reacción se aplicaron entonces a un gel de agarosa al 1,5 %, se separaron y se recuperaron utilizando columnas giratorias QIAGEN (kit de extracción en gel QIAquick, cat no. 28706). El ADN se eluyó

Claims (33)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para el CD22 humano, que comprende una cadena
    pesada en la que el dominio variable comprende la SEQ ID NO:1 para CDR-H1, la secuencia
    GINPGNNYATYRRKFQG de gH7 de la Figura 6 o la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:13 o la SEQ ID NO:15 o la SEQ ID NO:16 para CDR-H2, y la SEQ ID NO:3 para CDR-H3, y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende la SEQ ID NO:4 para CDR-L1, la SEQ ID NO:5 para CDR-L2 y la SEQ ID NO:6 para CDR-L3.
  2. 2. La molécula de anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia
    GINPGNNYATYRRKFQG de gH7 de la Figura 6 para CDR-H2.
  3. 3. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que es una molécula de anticuerpo injertada con CDR.
  4. 4. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 3, en la que el dominio variable comprende regiones marco del aceptor humano y las CDR del donante no humano.
  5. 5. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 4, en la que las regiones marco del aceptor humano del dominio variable de la cadena pesada se basan en las SEQ ID NOs: 21 y 22 y comprenden residuos del donante en las posiciones 1, 28, 48, 71 y 93, numeradas según Kabat, que corresponden a los residuos 1, 28, 48, 72 y 97, respectivamente, en la SEQ ID NO:8.
  6. 6. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente residuos del donante en las posiciones 67 y 69, numeradas según Kabat, que corresponden a los residuos 68 y 70, respectivamente, en la SEQ ID NO:8.
  7. 7. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que las regiones marco del aceptor humano del dominio variable de la cadena ligera se basan en las SEQ ID NOs: 17 y 18 y comprenden residuos del donante en las posiciones 2, 4, 37, 38, 45 y 60, numeradas según Kabat, que corresponden a los residuos 2, 4, 42, 43, 50 y 65, respectivamente, en la SEQ ID NO:7.
  8. 8. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente un residuo del donante en la posición 3, numerada según Kabat, que corresponde al residuo en dicha posición en la SEQ ID NO:7.
  9. 9. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para el CD22 humano, que comprende una cadena pesada según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, y una cadena ligera según la reivindicación 7 o la reivindicación 8.
  10. 10. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la SEQ ID NO:19 (la región variable de cadena ligera 5/44-gL1) y la SEQ ID NO:27 (la región variable de cadena pesada 5/44- gH7).
  11. 11. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para el CD22 humano, que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:28 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:30.
  12. 12. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para el CD22 humano, que tiene una cadena ligera que consiste en la secuencia dada en la SEQ ID NO:28 y una cadena pesada que consiste en la secuencia dada en la SEQ ID NO:30.
  13. 13. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal anti-CD22 murino 5/44, en el que el dominio variable de la cadena ligera tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 7 y el dominio variable de la cadena pesada tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 8.
  14. 14. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que es una molécula de anticuerpo quimérico que comprende las secuencias de los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 18, citados en la SEQ ID NO:7 y en la SEQ ID NO:8 respectivamente.
  15. 15. Una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
  16. 16. Una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
  17. 17. Una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
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    50
  18. 18. Un vector de clonación o de expresión que comprende una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
  19. 19. Una célula hospedante que comprende un vector de clonación o de expresión según la reivindicación
  20. 18.
  21. 20. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, para uso en terapia.
  22. 21. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 20, que tiene especificidad para el CD22 humano, o una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o 20, para uso en el tratamiento de una patología mediada por células que expresan CD22.
  23. 22. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 20 o 21, o una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, 20 o 21, para uso en el tratamiento de un linfoma maligno.
  24. 23. La molécula de anticuerpo o la secuencia de ADN de la reivindicación 22, en la que el linfoma maligno es linfoma no Hodgkin.
  25. 24. El uso de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que tiene especificidad para el CD22 humano, o el uso de una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología mediada por células que expresan CD22.
  26. 25. El uso de la reivindicación 24, en el que la patología es un linfoma maligno.
  27. 26. El uso de la reivindicación 25, en el que el linfoma maligno es un linfoma no Hodgkin.
  28. 27. Una composición terapéutica o para diagnóstico, que comprende la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o la secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
  29. 28. Una composición terapéutica que comprende la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde la molécula de anticuerpo tiene una toxina unida a la misma mediante una estructura de puente covalente, y que comprende un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  30. 29. Una composición terapéutica o para diagnóstico según la reivindicación 27, que comprende adicionalmente anticuerpos anti-células T, anti-IFNY o anti-LPS, o ingredientes no anticuerpos tales como las xantinas.
  31. 30. Un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende el cultivo de una célula hospedante según la reivindicación 19, en condiciones adecuadas para llevar a la expresión de una proteína a partir de ADN que codifica dicha molécula de anticuerpo y al aislamiento de dicha molécula de anticuerpo.
  32. 31. Un procedimiento para la preparación de una composición terapéutica o para diagnóstico según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, que comprende la mezcla de una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
    Figura 1:
    Secuencia de las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 5/44
    H1
    NYWIH (SEQ ID NO: 1)
    H2
    GINPGNNYTTYKRNLKG (SEQ ID NO: 2)
    H3
    EGYGNYGAWFAY (SEQ ID NO: 3)
    L1
    RSSQSLANSYGWTFLS (SEQ ID NO: 4)
    L2
    GISNRFS (SEQ ID NO: 5)
    L3
    LQGTHQPYT (SEQ ID NO: 6)
    10 20 30 40 SO
    GAT
    GTT GTG GTG ACT CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGC TTT GGA GAT CAA GTT
    CTA
    CAA CAC CAC TGA GTT TGA GGT GAG AGG GAC GGA CAG TCG AAA CCT CTA GTT CAA
    D
    V V V T Q T P h S L P V 3 F G D 0 V>
    60
    70 80 90 100 110
    TCT
    ATC TCT TGC AGG TCT AGT CAG AGT CT7 GCA AAC AGT TAT GGG AAC ACC TTT TTG
    AGA
    TAG ftGA ACG 7CC AGA TCñ GTC TCA GAA CGT TTG TCA ATA CCC TTG TGG AAA AAC
    S
    I S C R O S Q S L A N s 7 G N T F
    120 130 140 150 160 170
    TCT
    TGG TAC CTG CAC AAG CCT GGC CAG TCT CCA CAG CTC CTC ATC TAT GGG ATT TCC
    AGA
    ACC ATG GAO GTG TTC GGA CCG GTC AGA GGT GTC GAG GAG TAG ATA CCC TAA AGG
    $
    W Y L K K P G Q 3 P Q L L I Y G I 5>
    180 190 200 210 220
    AAC
    ACA TTT TCT GGG GTG CCA GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGT TCñ GGG ACA GAT TTC
    TTG
    TCT AAA AGA ccc CAC GGT CTG TCC AAG TGA CCG TCA CCA AGT CCC TGT CTA AAG
    N
    R E c* G V P D R F T G S G S G T D F>
    230
    240 250 260 270 280
    ACA
    ere AAG ATC AGC ACA ATA AAG CCT GAG GAC TTG GGA ATG TAT TAC TGC TTA CAA
    TGT
    GAG TTC TAG TCG TGT TAT TTC GGA CTC CTG AAC CCT TAC ATA ATC ACG AAT GTT
    T
    L K I S T 1 K P E D L G M Y Y C L
    290
    300 310 320 330
    GGT
    ACA CAT CAG CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GfiA ATA AAA CGT
    CCA
    TCT GTA GTC GGC ATG TGC AAG CCT ccc CCC TGG TTC GAC CTT TAT TTT GCA
    G
    T H 0 F Y J-i F G G G T K b E 7 K FL>
    10 20 30 40 50
    GAG
    GTC CAA CTG CAG CAG TCT GGG ACT GTA CTG GCA AGG CCT GGG GCT TCC GTG AAG
    CTC
    CAG GTT GAC GTC GTC AGA CCC TGA CAT GAC CGT TCC GGA CCC CGA AGG CAC TTC
    E
    V Q L Q 0 S G T V L A A P G A 5 V K>
    60
    70 80 SO 100 no
    ATG
    rcc TGC AAG GCT TCT GGC TAC AGG TTT ACC AAC TAC TGG ATT CAG TGG GTft AAA
    TAC
    AGG ACG TTC CGA AGA CCG ATG TCC AAA TGG TTG ATG ACC TAA GTG ACC CAT TTT
    M
    S C K A S G y Ft F T N y W 1 H W V K>
    120 130 140 150 160 170
    CAG
    AGG CCT GGG CAG GGT CTA GAA TGG ATT GGT GGT ATT AAT CCT GGA AAT AAT TAT
    GTC
    TCC GGA CCC GTC OCA GAT CTT ACC TAA CCA CCA TAA TTA GGA CCT TTA TTA ATA
    Q
    A P G Q G L E W 1 G G I N P G H fí y>
    180 190 200 210 220
    ACT
    ACG TAT AAG AGG AAC TTG AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GTC ACA TCC GCC
    TGA
    TGC ATA TTC TCC TTG AAC TTC CCG TTC CGG TGT GAC TGA CGT CAG TGT AGG CGG
    T
    T
    Y !( R N L K G K A T 1 T A V T $ A>
    Í30
    240 250 260 270 280
    AGC
    ACT GCC TAC ATG GAC CTC AGC AGC CTG ACA AGT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC
    TCG
    TGA CGG ATG TAC CTG GAG TCG TCG GAC TGT TCA CTC CTG AGA ccc CAG ATA ATG
    í
    T A y H D L 5 S L T 8 E D S V Y Y>
    2 SO
    300 310 320 330 34 0
    TGT
    ACA AGA GAG GGC TAT GGT AAC TAC GGG GCC TGG TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGG
    ACA
    TGT TCT CTC CCG ATA CCA TTG ATG CCC CCG ACC AAA CGA ATG ACC CCG GTC CCC
    C
    T A E G y G !+ y G A tí F A y <rl G Q G>
    350 360
    ACT CTG GTC ACC GTC TCC TCA TGA GAC CAG TGG CAG AGG AGT T L V T V $ S>
    Estrategia de la PCR para mutar la CDR-H2 en el vector cH
    imagen1
    10 20 40
    VL
    DVWTQTPLSLPVSFGDQVSISC RSSQSLANSYGNTFLS W YL H KPGQS PQLLIY
    MI II III III M III
    DPK9
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC -1 1 WYQQKPGKAPKLLIY 1 1 1 WYLHKPGKAPQLLIY
    gU
    1 1 DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSQSLANSYGNTFLS
    eUi
    DVWTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSQSLANSYGNTFLS WYLHKPGKAPiQLLIY
    60 70 ao 90
    Vl
    GISNRFS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYC II 1 1 1 1 III GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQFEDFATYYC l LQGTHQPYT
    DPK9
    £U
    1 GISNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQGTHQPYT
    gU
    GISNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQGTHQPYT
    100
    Vl
    FGGGTKLEIKR i i
    JK1
    1 1 FGQGTKVEIKR
    gLI
    FGQGTKVEIKR
    gu
    FGQGTKVEIKR
    DPK-9 es la secuencia marco de la línea germinal del aceptor humano.
    Las líneas verticales indican diferencias entre los residuos de ratón y humanos.
    Las secuencias subrayadas indican residuos del donante que han sido retenidos en el injerto. Las CDR se indican en azul (no se muestran para DPK-9).
    El injerto gL1 tiene 6 residuos marco del donante, el gL2 tiene 7.

    10 20 3.0 40 50
    V„ EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYRFT NYWIH WVKQRPGQGLEWIG GINP

    I .1 Mili I II I
    DP7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NVRQAPGQGLEWMG

    I I I
    gHl EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFT NYWIH WVRQAPGQGLEWIG GINP
    gH4,5,6.7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFT NYWIH WVRQAPGQGLEWIG GINP

    60 70 80 90 100
    vH GNNYTTYKRNLKG KATLTAVTSASTAYMDLSSLTSEDSAVYYCTR EGYGNYG
    I I I I I I I I I I . I
    DP7 KFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

    MI I
    gHl GNQYTTYKRNLKG RATLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG
    gH4 GNNYATYRRNLKG RATLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG
    *■*
    gHS GNNYATYRRNLKG RVTMTADT S TS T V YMEL SSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG
    gH6 GNNYATYRRKFQG RATLTADT STSTVYMELSSLRSE DTAVYY CTR EGYGNYG
    gH7 GNNYATYRRKFQG RVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG
    110
    JH4 WGQGTLVTVSS
    v„ AWFAY WGQGTLVTVSS
    gHl AWFAY WGQGTLVTVSS
    gH4,5,6.7 AWFAY WGQGTLVTVSS
    DPK-7 es la secuencia marco de la línea germinal del aceptor humano.
    Las líneas verticales indican diferencias entre los residuos de ratón y humanos.
    Las secuencias subrayadas indican residuos del donante que han sido retenidos en el injerto.
    Las CDR se indican en azul (no se muestran para DP7).
    Los injertos gH4 y gH16 tienen 6 residuos marco del donante. Los injertos gH5 y gH7 tienen 4.
    imagen2
    Figura 8:
    Ensayo Biacore de 5/44 quimérico y mutantes
    5/44
    Ka es Kd e4 KDe10 -KD ü
    cLcH
    2.9 1.14 3.93 0.4
    N55Q
    5,81 1.9 3.27 0.3
    T57A
    7.8 0.51 0.66 0.07
    K6ÜR
    4.95 1.01 2.04 0.2
    Cadena pesada
    S44gH1 TI
    AGTGTGAGGTGCAATTGGTCCAGTCAGGAGCAGAGGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCA
    AAGTTTCGTGTAAGGCTAGCGGCTACAGGTTCAC
    544gHl T2
    GTGGCATTAATCCCGGGAATCAGTACACTACATATAAAAGAAATCTAAAGGGCAGAGCA
    ACGCTGACCGCGGACACCTCCACAAGCACTGTCTACA
    544gHI T3 ■
    AGAGAAGGCTACGGTAATTACGGAGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTAGTC
    ACAGTCTCCTCAGCTTCTACAAAGGGCCCAAGAAA
    544 gHI B1
    GGACCAATTGCACCTCACACTGCACTCCCTTGAGAATGAGTGCCAGGAACACGAGAGAG
    AATCCGAAGTCCATGGTGGCGGCAAGCmTATTC
    544 gHI B2 ■
    GATTCCCGGGATTAATGCCACCGATCCATTCCAGGCCTTGTCCCGGAGCCTGCCTGACCC
    AATGAATCCAATAATTTGTGAACCTGTAGCCGCTAGC
    544'gHl B3
    CGTAATTACCGTAGCCTTCTCTAGTACAATAGTACACTGCGGTGTCCTCGGATCTCAGAG
    ATGACAGCTCCATGTAGACAGTGCTTGTGGAGG
    544gHI Fl ■ ■ ,
    GAATAAAAGCTTGCCGCCACC
    544gH 1 R1
    TTTCTTGGGCCCTTTGTAGAAG
    Cadena ligera
    544 gLl TI
    GCTTCCCGGGGTGACGTTCAAGTGACCCAGAGCCCATCCAGCCTGAGCGCATCTGTAGGA
    GACCGGGTCACCATCACTTGTAGATCC
    544 gi l T2
    TATCTGCACAAACCAGGTAAAGCCCCACAATTGCTCATCTACGGAATCTCTAACAGATTT
    AGTGGTGTACCAGACAGGTTCAGCGGTTCC
    544gL] T3
    AGATTTCGCCACTTATTACTGTTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACATTCGGTCAGGG
    TACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGCGTGC
    544gLl
    GAACGTCACCCCGGGAAGCAGGAATCCAGAACAACAGAAGCACCAACAGCCTAACAGG
    CAACTTCATGGTGGCGGCTTCGAATCATCC
    544gLl D2
    CTTTACCTGGTTTGTGCAGATACCAAGACAAAAAGGTGTTCCCATAACTGTTTGCAAGAC
    TCTGACTGGATCTACAAGTGATGGTGAC
    544gLl B3
    AACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGAGACGAGATCGTGAGGGTGAAATCA
    GTACCACTTCCGGAACCGCTGAACCTGTCTG
    544gLl F1
    GGATGATTCGAAGCCGCCAC
    544gLl RI '
    GCACGCCGTACGTTTGATTTC
    Figura 10: Mapas plasmídicos de los vectores intermedios pCR2.1 (544gH1) y pCR2.1(544gL1)
    imagen3
    imagen4
    XmaT 10 20 30
    CC GGG AAT AAC TAC GCT ACA TAT AGG AGA C TTA TTG ATG CGA TGT ATA ICC TCT
    pghnyatyrr
    güí
    Xraftl
    10 20 30
    CC GGG
    AAT AAC TAC GCT ACA TAT AGG AGA
    c
    TTA TTC ATG CGA TGT ATA TCC TCT
    P G
    o H Y A r Y R R
    m
    Xma;[ 10 20 30
    CC GGG AAT AAC TAC GCT ACA TAT AGG AGA C TTA TTG ATG CGA TGT ATA TCC TCT PGHKYATYR3
    m
    Xmfil
    10 20 30
    CC GGG
    AAT AAC TAC GCT ACA TAT AGG AGA
    C
    TTA TTC ATG CGA TGT ATA TCC TCT
    P 0
    N N Y A T Y R R
    eU
    Xmal 10 20 30
    C CGG GGT GAC GTT GTC GTG ACC CAG AGC CCA CCA CTG CAA CAG CAC TCG GTC TCG GGT SRGDVVVTQSP
    40 £0 Sacll
    AAT CTA AAG GGC AC-A GCA ACG CTG ACC GC TTA GAT TTC CCG TCT CGT TGC GAC TGG N L KGRATLTA
    40 50 -SacJUL
    AAT
    CTA AAG GGC AGA GTT ACG ATG ACC GC
    TTA
    GAT TTC CCG TCT CAA TGC TAC TGG
    K
    r 0 0 R V T W T A
    40 50 Sacll
    AAA TTC CAG GGC AGA GCA ACG CTG ACC GC TTT AAG GTC CCG TCT CGT TGC GAC TGG KFQGRATLTA
    40 50 __S_ac_IJ.
    AAA TTC CAG GGC AGA GTT ACG ATG ACC GC TTT AAG GTC CCG TCT CAA TGC TAC TGG K FQGRVTMTA
    40 SO 60
    TCC AGC CTG AGC GCA TCT GTA GGA GAC CGG AGG TCG GAC TCG CGT AGA CAT CCT CTG GCC CAG TG S SLSASVGDRVT
    Intensidad media de fluorescencia Intensidad media de fluorescencia
    Figura 12: Ensayo de competición, entre la unión del anticuerpo de ratón 5/44 marcado fluorescentemente y la de las variantes injertadas.
    imagen5
    imagen6
    Figura 13: Secuencia completa de ADN de cadenas pesadas y ligeras injertadas
    a) Cadena pesada
    10 ■ 50 30 40 50
    AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TTC GGA TTC TCT CTC GTG TTC CTG GCA CTC ATT TTCGAACGGC GGTGG TAC CTG AAG CCT AAG AGA GAG CAC AAG GAC CGT GAG TAA H 0 FGFS-LV FLALI
    70 00 90 IDO 110
    GGA
    GTG CAG TtíT GAG GTG CAA TTG GTC CAG CCA GGA GCA GAG GTT AAG AAG CCT GGT
    CCT
    CAC GTC ACA CTC CAC GTT AAC CAG GTC AGT CCT CGT CTC CAA TTC TTC GGA CCA
    G
    V 0 C E V Q L V Q £ G A E V K K F G>
    12-0
    130 140 150 160 170
    GCT
    TCC GTC ñññ GTT TCG TGT AAC GCT AGC CGC TAC A$G TTC ACA AAT TAT TGG ATT
    CGA
    AGG CAG TTT CAA AGC ACA TTC CGA TCG CCG ATG TCC AAG TGT TTA ATA ACC TAfl
    A
    $ V K V 5 C K A S G f K F T H Y w
    1RÜ 190 2CD 310 220 230
    CAT
    TGG GTC Aj&G CAG GCT CCG GGA CAA. GGC CTG CAA TGG ATC GGT GGC ATT AAT ccc
    GTA
    ACC CAG TCC GTC CGA GGC CCT GTT CCG GAC CTT ACC TAG CCA CCG TAA TTA GCG
    H
    W V A a A F G Q G L E H 3 G G I ti P>
    2A0 250 560 270 2S0
    GCG
    AñT AAC TAC GCT AC F\ TAT AGC AGA AAA TTC CAG GGC AGA GTT ACG ATG ACC
    GCG
    CCC
    TTA TTG ATG CGA TCT ATA TCC TCT TTT AAG GTC CCG TCT CAA TGC TAC TGG CGC
    G
    N N Y A T Y R R K F Q G H V r K T A>
    290
    200 310 320 330 340
    GAC
    ACC TCC ACA AAC ACT CTC TAC ATG GAG CTG TCA TCT CTG AGA TCC GAS GAC ACC
    CTG
    TGG AGG TGT TCG TGA CAG ATG TAC CTC GAC AGT AGA GAC TCT AGG CTC CTG TGG
    □ 1
    T S T S T V Y H E L S S L R S E D T>
    350
    3 60 310 30 0 3 00 ■100
    GCA
    GT3 TAC TAT TGT ACT ACA GAA esc TAC GGT AAT TAC GjA GCC TGG TTC GCC TAC
    CGT
    CAC ATG ATA ACA TGA TCT CTT CCG ATG CCfl TTA ATG CCT CSC ACC AAG CGG ATG
    A
    V Y Y C T A E G Y G K Y G A Vi F A Y>
  33. 410 420 .0 30 i :40 450
    TGG
    GGC CAG GGT ACC CTA GTC ACA GTC TCC TCA GCT TCT ACA AAG GGC CCA TCC GTC
    ACC
    CCG GTC CCA TGG GAT CAG TGT CAG AGG AGT CGA ADA TGT TTC CCG CGT AGG CAG
    Vi
    R 0 6 T L V T V S S A £ T K G P S V>
    )Q
    410 <80 4 90 büD 510
    TTC
    ccc CTG CCG CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC
    AAG
    GGG GAC CGC GCG ACG AGG TCC TCG TGG AGG CTC TCG TGT CGG CGG GAC CCG AGG
    S
    P j. A F C S A 5 r S E S C' 4 A h 1 ■J O
    SO
    CTC AAG GAG TTC
    L K>
    £20
    530 540 550 5 60 570
    CTG
    GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG STG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC
    CTG
    GAC
    CAE TTC CTG ATG AAG GGG en* GGC CAC TGC CAC ÁGC ACC TTG AGT CCG CGG
    GAC
    1
    V E D Y F P E P V T V S U n S G . A l>
    sao sao 600 510 610
    ACC
    AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG ■GCT GTC CTA CRG TCC TCA GGA CTC TAC TCC ere
    TGG
    TCG CCG CAC GTG TGG AAG GGC CGñ CAG GAT GTC AGG AGI CCT GAC ATG AGG GAG
    T
    S G V B T F P A V L Q S E G L Y 5 b>
    64 0 650 660 67 0 6B0
    AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC 7CC AGC AGC TTG GGC ACG AP.G ACC TAC ACC TGC AAC TCG TCG CAC CAC TGG CAC GGG AGG TCG TCG AAC CCG TGC TTC TGG ATG TGG ACG TTG
    ssvvtv.es sslgtktytcn>
    C9D
    700 710 720 750 740
    GTA
    GAT CAC AAC CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT G gtgagaggcc
    CAT
    CTA GTG TTC GGG TCS TTG TGG TTC CAC CTG TTC TCT CAA C CACTCTCCGG
    V
    Ü EL K P S N T K V 0 y. ñ V>
    750 760 770 700 790 600 810 AGCACAGGGA GGGAGGGTGT CTGCTGGAAG CCAGGCTCAG CCCTCCTGCC TGGACGCACC CCGGCTGTGC TCGTGTCCCT CCCTCCCACA GACGACCTTC GGTCCGAGTC GGGAGGACGG ACCTGCGTGG GGCCGACACG
    820 030 040 S5C 963 970 890 AGOCCCAGCC CAGGGCAGCA AGGCATGCCC CATCTCTCTC CTCACCCGGA GGCCTCTGAC CACCCCACTC TCGGGGTCGG GTCCCGTCGT TCCGTACGGG GTAGñCAGAG GAGTGGGCCT CCGGAGACTG GTGGGSTGAG
    950
    900 910 920 53Ü 540
    950
    ATGCCCAGGG
    AGAfiGGÍCTT CTGGATTTTT CCACCAGGCT CCGGGCAGCC acaggctgea TGCCCCTACC
    TACfJGGTCCC
    TCTCCCAGAA GACCTAAAAA GGTGGTCCGA &SCCCGTCGG tgtccgacct acsgggatgg
    060
    970 580 590 10 C 0 101Ü 1020
    CCAjGGCCCTG
    CGCATACAGG GGCAGGTGCT ÜCGCTCAGAC CTGCCAAGAG CCATATCCGG GAGGACCCTG
    GGTCCGO'nAC
    GCGTATGTCC CCGTCCACGA CGCGAGTCTG GñCGOTTCTC GGTATAGGCC CTCCTGGGAC
    3030
    1040 1050 1060 1070 1000 1090
    COCCÍtSACCT
    AAGCCCACCC CAAAGGCCAA ACTCTCCACT OCCTCAGCTC AGACACCTTC TdCCTCCCA
    GGGGACTGGA
    TTCGGGTGGG GTTTCCGGTT TGAOAGGTGA gsgactcgas TCTGTGGAAG AGAGGAGGGT
    1100 3110 1120 1110 1140 1150
    GATCTGAGTA ACTCCCAATC TTCTCTCTGC A GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCA
    CTAGACTCAT 7GAGGGTTAG AAGAGAGACG T CTC AGG TTT ATA CCA GGG GGT ACG GGT GGT
    . £ S K Y G P VC í Pa
    1160 1170 5100 D 30 1200 1210 1220
    TGC CCA GGT AAGCCAACCC AGGCCTOGCC CTCCAGCTCA AGGCGGGACA GGTGCCCTAG AGTAGCCTGC ACG GGT CCA 7TCGGTTGGG TCCGGAGCG3 GA5GTCGAGT TCCGCCCTGT CCACGGGATC TCATCGGACG C Pililo 1240 1250 1260 1270 1200
    ATCCAGGGAC AGGCCCCAGC CGGGTGCTGA CGCATCCACC TCCATCTCTT CCTCA GCA CCT GAG TTC TAGGTCCCTG TCCGSGGTCG CCCCACGACT GCGTAGGTGG AGGTAGAGAA GGAGT CGT GGA CTC AAG
    A P E F>

    12S0 2300 1310 1320 1330 1340
    CTG GGG GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG ATC ' GAC CCC CCT GGT AOT CAG MG GAC AAG GGG GGT TTT GGG TTC CTG TSA GAG TAC TAG IiGCPSVFLITPFK FKPTLMI7-

    1350 1360 1370 1390 1390 1400
    rcc CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG G7G G7G GAC AGG GCC TGG GGA CTC CAG TGC ACG CAC CAC CAC CTG SfeTPEVTCVVVD
    GTG
    AGC CAG GAA GAC CCC GAG
    CAC
    TCC GTC CTT CTG GGG CTC
    V
    s a E D p E>

    1410 1420 1430 1440 1(50
    37C CAC TTC AAC TGG TAC GTC GJVT GGC GTG CAG GTG CAT GAG GTC AAG TTG ACC ATG CAC CTA CCG CAC CTC CAC GTfi VQFN141ÍVDGVEV1!
    AAT
    GCC AAjS ACA AAG CCC
    TTA
    CGG TTC TGT TTC GGC
    13
    A K T K

    1460 1470 1480 1490 ■ 1500 1510
    CGG GAG GCC CTC
    Sí E E Q PPJS'EYAVV S V 1 T V L H>
    1470
    1480
    CAG
    TTC AAC AGC ACG
    GTC
    AAG TTG TOA TGC
    Q
    p rt S T

    1520 1530 1540 1530 1560 1570

    CAG GAC TGG CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG
    GTC CTG ACC GAC TTG CCG TTC CTC ATG TTC ACG TTC CAG AGG TTG TTT CCG GAG GGC

    Q D VI L H e K E T K C. K V 3 H K G t p>

    1580 1590 1600 1610 1620 1630
    TCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGG GACCCACGGG GTGCGAGGGC AGG AGG TAG CTC TTT TGG TAS AS S S 1 E K T
    ATC
    TCC AAA GCC AAA
    TAG
    ASE TTT CGG TTT
    I
    S K A K?
    1640 1653 1660 1670 1600 1690 1700 CACATGGACA GAGGTCAGCT CGGCCCACCC TCTGCCCTGG CAGTGACCGC TGTGCCAACC TCTGTCCCTA GTGTACCTGT CTCCAGTCGA GCCGGGTGGG AGACGGGACC CTCACTGGCG ACACGGTTGG AGACAGGGAT

    1710 mo 1730 1740 1750
    CU G6G Otó CCC CGA GAG CCA CAG .GTG TAC ACC CTG CCC CCA ICC CAG GAG GAG ATG
    ' GT CCC GTC GGG GCT CTC GGT GIC CAC ATG TGG GAC GGG GCT AGG GTC CTC CTC TAC

    G Q P f! E P {? V Y T LP PS Q E E M>
    17É0 1770 1780 1790 1800 1810
    ACC
    AAG AAC CAJG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC JlTC
    TCG
    TTC TTG GTG CAG TCG GAC TQG ACG GAC CAG TTT CCG AAG ATG GGG TCG CTG TAG
    T
    K N 0 V S L T C L V K C F ¥ F S D I>
    1910 1830 1840 1050 1060 1870
    CCC
    GTG GAG TSG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG MC AAC TAC AAG ACC ACG CCT
    CCC
    CGG
    CAC CTC ACC CTC TCG TTA CCC GTC GGC CTC TTG TTG ATG TTC TGC TGC GGA GGC
    A
    V £ W E S W 3 Q P W Y K T T F P:>
    1880 1890 1900 1910 1920
    GTG
    CTG GAC TCG GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AjGG CTA ACC GTG GAC AAG AGC
    CAC
    GAC CTG AGG CTG CCG AGG AAG AAG GAG ATG TCG TCC GAT TGC CAC CTG TTC TCG
    V
    L D S D G £ F F L Y 8 R L T V 0 K
    1930
    1940 j 950 19 60 1970 1980
    AGG
    TGC CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TCC TOC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC
    TCC
    ACC GTC CTC CCC TTA CAG AAG AGT ACG AGG CAC TAC GTA CTC COA GAC GTG TTG
    R
    W G L G H V r S C 6 V H H E A L H W>

    2000 2010 2020 2030 ' 2010
    ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CTG CGT AAA TGA GTG.C CAGGGCCGGC TGT GTC TTC TCG GAG AGG GAC AGA GAC OCA TTT ACT CAOG GTCCCGGCCG TfiKSLSLS LGK*>
    2D5D
    2060 2070 2080 20 9 0 2100 2110
    AAGCCCCCGC
    TCCCCGGGCT CTCGGGGTCG CGCGAGGATG CTTGGCAOGT ACCCCGTCTA CATACTTCCC
    TTCGGGGGCG
    AGGGGCCCGA üAGCCCCAGC GCGCTCCrAC GAACCGTGCA TGGGGCAGAT GTATGAAGGG
    2120
    2130 2140 21SQ 216-0
    A&GCACCCAG
    CATGGAAArA AAGCACCCAC CACTOCCCTG GCTCGTiATTC
    TOCGTCCGTC
    Gtacctttat TTGGTGGGTG CTCACGGGAC GGRGCTTñftG
    1990 CAC TAC GTG ATG
    H V
    b) Cadena ligera
    10
    20
    30 40 50 fio
    AAG TTG
    CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTT CTG TTG TTC TGG ATT
    TTC AAC
    GGA CAA TCC GAC AAC CAC GAA GAC AAC AAG ACC TAA
    K 1
    P V F¡ L L V Tj L 1 r W T>

    70 ec so . ioo no
    CCT GCT TCC CGG GGT GAC GTT CAA GTG ACC CAG AGC CCA TCC AGC CTG AGC GCA TCT
    GGA CGA AGG GCC CCA CTG CAA GTT CAC TGG GTC TCG GGT AGG TCG GAC TCG CGT AGA
    PASRGDVQVTCSPSSLSAS>

    120 130 HO. 150 100 170
    GIA GGA GAC CGG GTC ACC ATC ACT TGT AGA TCC AGT CAG AGT CTT GCA AAC AGT TAT
    CAT CCT CTG GCC CAG TGG TAG TGA ACA TCT AGG TCA GTC TCA GAA CGT TTG TCA ATA
    VGDRVTIT CRSSQSLANSY>

    leo IDO . 200 210 220 230
    3GG AAC ACC TTT TTG TCT TGG TAT CTG CAC AAA CCA GGT AAA GCC
    GCC TTG TGG AAA AAC AGA ACC ATA GAC CTG TTT GGT CCA TTT CGG
    G W T F L S W 7 L K K F G -KA
    CCA
    CAA TTG CTC
    GGT
    GTT AAC GAG
    F
    Q L L>

    2Í0 2S0 JíO 210 280
    ATC TAC GGA ATC TCT AAC AGA TTT AGT GGT GTA CCA GAC AGG TTC AGC GGT TCC GGA TAG ATG CCT TAG AGA TTS TCT AAA TCA CCA CAT GGT CTG TCC AñG TCG CCA AGG CCT lyGI SWRFSGVEDRF
    AGG
    GGT TCC GGA
    TCG
    CCA AGG CCT
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