NO325178B1

NO325178B1 - Rekonstituert human anti-HM1.24 antistoff og H-kjede derav, DNA som koder for V-regionen til H-kjeden og L-kjeden av antistoffet, vektor som omfatter nevnte DNA, vertcelle som omfatter nevnte vektor, fremgangsmate for produksjon av antistoffet, samt farmasoytisk blanding og terapeutisk middel som inneholder antistoffet.

Info

Publication number: NO325178B1
Application number: NO19991591A
Authority: NO
Inventors: Kosaka Masaaki; Ono Koichiro; Ohtomo Toshihiko; Tsuchiya Masayuki; Yoshimura Yasushi; Koishihara Yasuo
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2008-02-11
Also published as: KR20000048884A; CN1271205C; WO1998014580A1; CZ117399A3; ATE512224T1; NO991591D0; CN1235639A; PL187642B1; CZ296790B6; IL129286A0; US20030129185A1; EP0960936B1; UA76934C2; SK44399A3; CN1765928A; TW530064B; BR9712488A; US7892543B2; RU2184147C2; KR100388256B1

Abstract

Et rekonstituert humant antiHM1.24 antistoff som omfatter:. (A) en L-kjede som omfatter. (1) C-regionen til en human L-kjede, og. (2) V-regionen til en L-kjede som omfatter FR til en human L-kjede og CDR til L-kjede til et muse anti-HMl .24. monoklonalt antistoff, og. (B) en H-kjede som omfatter. (1) C-regionen til en human H-kjede, og. (2) V-regionen til en H-kjede som omfatter FR til en human H-kjede og CDR. til H-kjeden til et muse anti-HMl.24 monoklonalt antistoff.Siden mesteparten av dette rekonstituerte humane antistoff er avledet fra humant antistoff og CDR har lav antigenisitet har det rekonstituerte humane antistoff fra den foreliggende oppfinnelse en lav antigenisitet og er derfor forventet å bli benyttet i medisinsk behandling.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et rekonstituert human anti-HM1.24

antistoff og H-kjede derav, DNA som koder for V-regionen til H-kjeden og L-kjeden av antistoffet, vektor som omfatter nevnte DNA, vertscelle som omfatter nevnte vektor, fremgangsmåte for produksjon av antistoffet, samt farmasøytisk blanding og terapeutisk middel som inneholder antistoffet. De gjenskapte humane antistoff er hensiktsmessige som et terapeutisk middel etc. for myelom.

Humane B-celler gjennomgår en rekke prosesser som klasserifiseres basert

på den type overflateantigener som blir uttrykket, og ender med å modnes til antistoffproduserende plasmaceller. I det siste av deres differensieringsstadier anskaffer B-celler på en side evnen til å produsere cytoplasmatiske immuno-

globuliner og på den annen side B-celle-assosierte antigener slik som celleoverflate immunglobuliner, HLA-DR, CD20, Fc-reseptorer, komplement C3-reseptorer og lignende forsvinner (Ling, N.R. et al., Leucocyte Typing III (1986) p320, Oxford, UK, Oxford).

Foreløpig har det vært rapportert monoklonale antistoff slik som anti-PCA-1 (Anderson, K.C. et al., J. Immunol. (1983) 130,1132), anti-PC-1 (Anderson, K.C. et al., J. Immunol. (1983) 132, 3172), anti-MM4 (Tong, A.W. et al., Blood (1987) 69,

238) og lignende som gjenkjenner antigener på plasmacellers cellemembran.

Imidlertid blir fremdeles anti-CD38 monoklonalt antistoff benyttet for påvisning av plasmaceller og myelomceller (Epstein, J. et al., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L.W.M.M. et al., Blood (19902) 76,1739, Leo, R. et al., Ann. Hematol.

(1992) 64,132, Shimazaki, C. et al., Am J. Hematol. (1992) 39,159, Hata, H. et al., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. et al., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. et al.,

J. Exp. Med. (1993) 178, 1023).

Imidlertid er anti-CD38 monoklonalt antistoff et antigen assosiert med

aktivering av T-celler istedenfor et antigen assosiert med differensiering av B-celler,

og det blir uttrykket på ulike celler i tillegg til B-cellene. Videre, til tross for at CD38

ikke uttrykkes på en del av lymfocytt- og plasmacellene blir proteinet uttrykket i høy grad på hematopoetiske forløperceller. På grunn av dette antas det at anti-CD38 monoklonalt antistoff ikke er velegnet for forskning på differensiering og modning av humane B-celler eller for behandling av plasmacellesykdommer.

Goto, T. et al. har rapportert om et mus anti-HM1.24 monoklonalt antistoff

som gjenkjenner et antigen som har en molekylvekt på 29 til 33 kDa som spesifikt blir uttrykket på B-cellelinjer (Blood (1994) 84,1922-1930). Basert på det faktum at

antigenet som gjenkjennes av anti-HM1.24 monoklonalt antistoff antas å være assosiert med den terminale differensiering av B-celler (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691) og at tilførsel av ant i-HM 1.24 monoklonalt antistoff til en mus med transplantert plasmacytom resulterte i spesifikk akkumulering av antistoffet i svulsten (Shuji Ozaki et al., The Program of General Assembly of the 19th Japan Myelom Study Meeting, general presentation 3), har det blitt foreslått at anti-HM1.24 monoklonalt antistoff, merket med en radioaktiv isotop, kan benyttes for lokaliseringsdiagnose av svulsten, målrettet terapi slik som radioimmunoterapi og lignende.

Videre beskriver det ovenfor nevnte nummer av Blood at anti-HM1.24 monoklonalt antistoff har komplementavhengig cytotoksisk aktivitet ovenfor den humane myelomcelle RPMI8226.

Myelom er en neoplastisk sykdom som karakteriseres av akkumulering av monoklonale plasmaceller (myelomceller) i benmargen. Myelom er en sykdom der terminalt differensierte B-celler som produserer og frigjør immunglobuliner, eller plasmaceller, blir monoklonalt øket i hovedsak i benmargen, og således blir monoklonale immunglobuliner eller komponentene som utgjør disse, L-kjeder eller H-kjeder, blir påvist i serum (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (1995) 53, 91-99).

Vanlige kjemoterapeutiske midler har blitt benyttet for behandling av myelom, men ingen effektive terapeutiske midler har blitt funnet som kan føre til myelom-remisjon og forlengelse av overlevelsestiden hos pasienter med sykdommer. Det har derfor oppstått et lenge følt behov for oppfinnelse av medikamenter som har en terapeutisk virkning på myelom.

Mus monoklonalt antistoff har høy immunogenisitet (av og til henvist til som "antigenisitet") hos mennesker. Således er den medisinske terapeutiske verdi av mus monoklonalt antistoff hos mennesker svært begrenset. For eksempel vil et museantistoff tilført til et menneske bli metabolisert som en fremmed forbindelse slik at halveringstiden til museantistoffet hos mennesket er relativt kort, og derved kan antistoffet ikke fullt vise dets forventede effekter. Videre kan humane anti-mus antistoff som blir produsert mot det tilførte museantistoff fremkalle immunologiske responser som er uheldige og farlige for pasientene, slik som serumsykdom, andre allergiske reaksjoner og lignende. Derfor kan muse monoklonale antistoff ikke bli tilført hyppig til mennesker.

For å løse disse problemer ble en fremgangsmåte utviklet for å redusere immunogenisiteten til ikke-humant avledede antistoff som med muse-avledet monoklonale antistoff. Som et slikt eksempel finnes en fremgangsmåte for å produsere et kimært antistoff der den variable region (V-region) til antistoffet blir avledet fra den originiale mus og den konstante region (C-region) i antistoffet er avledet fra et passende humant antistoff.

Siden det kimære antistoffet som er fremskaffet på denne måte inneholder den variable region til det originale museantistoff i sin intakte form forventes det å binde til antigenet med en spesifisitet som er identisk med den til det originale museantistoff. Videre er i et kimært antistoff forholdet av ikke-humane aminosyresekvenser sterkt redusert, og antistoffet blir derfor forventet å ha en lav immunogenisitet sammenlignet med det originale museantistoff. Et kimær-antistoff kan binde til antigenet på samme måte som det originale muse monoklonale antistoff, og kan inkludere immunologiske responser mot den variable museregion, selv om immunogenisiteten er redusert (LoBuglio, A.F. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, 4220-4224, 1989).

Den andre fremgangsmåte for å redusere museantistoff ets immunogenisitet, kan, selv om den er mye mer komplisert, redusere museantistoffets potensielle immunogenisitet ytterligere. I denne fremgangsmåte blir bare den komplementaritetsbestemmende region (CDR) i den variable region til et museantistoff overført til den variable region i et humant antistoff for å fremstille et "gjenskapet" humant antistoffs variable region.

For å gjøre strukturen til CDR i et gjenskapt humant antistoffs variable region så likt som mulig til det i det originale museantistoff kan imidlertid, dersom det er nødvendig, deler av aminosyresekvensen til rammeregionen (FR) som omgir CDR bli overført fra museantistoffets variable region til det humane antistoffs variable region. Deretter blir denne V-region i det humanisert gjenskapte humane antistoff koplet til den konstante region til et humant antistoff. Delen som er avledet fra den ikke-humane aminosyresekvens i det ferdige gjenskapte humaniserte antistoff er CDR, og bare deler av FR. En CDR utgjøres av hypervariable aminosyresekvenser som ikke fremviser arts-spesifikke sekvenser. Derfor burde ikke det humaniserte antistoff som har muse-CDR fremvise en immunogenisitet som er sterkere enn det naturlige humane antistoff som har det humane antistoff CDR.

Hva angår det humaniserte antistoff, se Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327,1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239,1534-1536,1988; Kettleborough, CA. et al., Protein Engng., 4, 773-783,1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2,124-134,1991; Groman, S.D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 4181 -4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271; 1991; Co, M.S. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proe. Nat I. Acad. Sei. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; og Sato, K. et al, Cancer Res., 53, 851-856,1993.

Queen et al. (internasjonal søknad publikasjonsnr. WO 90-07861) beskriver en fremgangsmåte for å produsere et humanisert antistoff fra et anti-IL-2-reseptor antistoff anti-Tac. Det er imidlertid vanskelig å gjennomføre en komplett humanisering av alle antistoff selv om man følger fremgangsmåten som er beskrevet i WO 90-07861. Således beskriver ikke WO 90-07861 en generell fremgangsmåte for å humanisere antistoff, men beskriver bare en fremgangsmåte for å humanisere anti-Tac antistoff som er et av anti-IL-2-reseptor antistoffene. Videre er det selv når fremgangsmåten i WO 90-07861 blir fulgt nøyaktig vanskelig å lage et humanisert antistoff som har en aktivitet som er helt identisk med det til det originale museantistoff.

Generelt er aminosyresekvensene til CDR/FR i ulike antistoff ulike. Således varierer bestemmelsen av aminosyreresten som skal byttes ut for å konstruere et humanisert antistoff og utvelging av aminosyreresten som substituerer for nevnte aminosyrerest med individuelle antistoff. Derfor kan ikke fremgangsmåten for å preparere humaniserte antistoff som beskrevet i WO 90-07861 bli benyttet for humanisering av alle antistoff.

Queen et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, (1989) 86,10029-10033 har en lignende beskrivelse som den i WO 90-07861. Denne referansen informerer at bare en tredjedel av det originale museantistoffs aktivitet ble oppnådd med et humanisert antistoff som var fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i WO 90-07861. Med andre ord viser dette at fremgangsmåten til WO 90-07861 i seg selv ikke kan produsere et komplett humanisert antistoff som har en aktivitet som er lik den til det originale museantistoff.

Co et al., Cancer Research (1996) 56,1118-1125 ble publisert av gruppen til Queen et al. nevnt over. Denne referanse beskriver at et humanisert antistoff med en aktivitet som er lignende den til det originale museantistoff ikke kunne konstrueres selv om fremgangsmåten for å lage et humanisert antistoff som beskrevet i WO 90-07861 ble benyttet. Således forteller dette faktum ikke bare at fremgangsmåten til WO 90-07861 i seg selv ikke kan produsere et komplett humanisert antistoff i en aktivitet som er lik den til det originale museantistoff, men også at fremgangsmåten for å konstruere humanisert antistoff som beskrevet i WO 90-07861 ikke kan appliseres for humanisering av alle antistoff.

Ohtomo et al., Molecular Immunology (1995) 32, 407-416 beskriver humanisering av muse ONS-M21 antistoff. Denne referanse opplyser at aminosyreresten som ble foreslått for å humanisere anti-Tac antistoffet i WO 90-07861 ikke har noen relasjon med aktiviteten og at fremgangsmåten som beskrevet i WO 90-07861 ikke kan benyttes.

Kettleborough et al, Protein Eng. (1991) 4, 773-783 beskriver at en rekke humanisert antistoff ble konstruert fra museantistoff ved å substituere aminosyrerester. Imidlertid var det nødvendig å substituere flere aminosyrerester enn det som ble antydet i fremgangsmåten for å humanisere anti-Tac antistoff som er beskrevet i WO 90-07861.

De her beskrevne referanser indikerer at fremgangsmåten for å produsere humanisert antistoff som beskrevet i WO 90-07861 er en fremgangsmåte som bare kan appliseres for anti-Tac antistoffet som er beskrevet der, og at selv å benytte nevnte teknologi ikke gir samme aktivitet som det som det originale museantistoff hadde.

De opprinnelige museantistoff beskrevet i disse referanser har ulike amino-syresekvénser sammenlignet med anti-Tac antistoffet som er beskrevet i WO 90-07861. Såiedes kunne fremgangsmåten for å konstruere humaniserte antistoff som hadde evne til å appliseres til anti-Tac antistoffet ikke benyttes overfor andre antistoff. Siden muse-HM1.24 antistoffet i den foreliggende oppfinnelse på samme måte har en aminosyresekvens som er ulik den til anti-Tac antistoffet kan fremgangsmåten for å konstruere humanisert antistoff for anti-Tac antistoffet ikke benyttes. Videre har det vellykkede konstruerte humaniserte antistoff i den foreliggende oppfinnelse en aminosyresekvens som er ulik den til humaniserte anti-Tac antistoff beskrevet i WO 90-07861. Dette faktum indikerer også at den samme fremgangsmåte ikke kan appliseres for å humanisere antistoff som har ulike CDR-FR sekvenser.

Således blir, selv om det opprinnelige museantistoff som skal humaniseres er kjent, identiteten til CDR-FR sekvensen til et humanisert antistoff som har aktivitet bekreftet bare etter prøving og feiling eksperimenter. WO 90-07861 nevner ikke FR-sekvensen som blir kombinert i det humaniserte antistoff som konstrueres i den foreliggende oppfinnelse, og heller ikke det faktum at et aktivt humanisert antistoff kunne fremskaffes fra kombinasjonen med FR, og enda mindre sekvensen til CDR.

Som ovenfor her nevnt er det forventet at humaniserte antistoff vil være vellykket med henblikk på terapeutiske formål, men humanisert anti-HM1.24 antistoff er ikke kjent eller heller ikke antydet. Videre er det ikke noen standardisert fremgangsmåte som er tilgjengelig og som generelt kunne appliseres til ethvert antistoff for å produsere et humanisert antistoff, og en rekke påfunn er nødvendig for å konstruere et humanisert antistoff som fremviser tilstrekkelig bindingsaktivitet, bindingsinhibisjonsaktivitet, og nøytraliserende aktivitet, (f.eks, Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851-856,1993).

Den foreliggende oppfinnelse frembringer rekonstituerte human antistoff fra anti-HM1.24 antistoff. Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre rekonstituert human H-kjede til anti-HM1.24 antistoffet. Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre DNA som koder for V-regionen til H-kjeden og L-kjeden av antistoffet. Videre frembringer den foreliggende oppfinnelse et ekspresjonssystem for å produsere rekonstituert antistoff fra anti-HM1.24, inklusive vektor og vertscelle som omfatter nevnte DNA. Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre fremgangsmåter for å produsere antistoff av anti-HM1.24 antistoff ved hjelp av vertscelle som er kotransformert med ekspsresjonsvektoren. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også farmasøytisk blanding og terapeutisk middel for myelom som inneholder rekonstituert human anti-HM1.24 antistoff.

I et første aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et rekonstituert human antistoff fra anti-HM1.24 antistoff som omfatter:

(A) en L-kjede som omfatter

(1) C-regionen til en human L-kjede, og

(2) V-regionen til en L-kjede som omfatter FR fra en human L-kjede og CDR fra L-kjeden til et anti-HM1.24 antistoff, og

(B) en H-kjede som omfatter

(1) C-regionen til en human H-kjede, og

(2) V-regionen til en H-kjede som omfatter

a) FR til en human H-kjede hvori aminosyren i posisjon 30 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR1 er treonin, aminosyren i posisjon 71 ifølge definisjonene til

Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene

til Kabat i nevnte FR3 er alanin og

b) CDR til kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser:

Foretrukket kjennetegnes det rekonstituerte human antistoffet ifølge oppfinnelsen av at nevnte FR til den humane H-kjede er avledet fra FR til et humant antistoff fra HSGI, og nevnte C-region i den humane H-kjede er human Cy1-region. Ifølge andre foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse kjennetegnes det rekonstituerte human antistoffet av at nevnte FR1-3 til H-kjeden er avledet fra humant antistoff HG3, og nevnte FR4 fra H-kjeden er avledet fra FR4 fra humant antistoff JH6, eller eventuelt av at nevnte V-region fra L-kjeden har aminosyresekvensene representert som SEQ ID NO: 106. Foretrukket kan det rekonstituerte human antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved at nevnte V-region fra H-kjeden har aminosyresekvensen representert som SEQ ID NO: 113, 115, 116, 117,118,119,120, 121,122,123,125 eller 128.

Ifølge et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en rekonstituert, human H-kjede til anti-HM1.24 antistoffet, kjennetegnet ved at den omfatter:

(1) C-regionen til en human H-kjede, og

(2) V-regionen til en H-kjede som omfatter

Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene

til Kabat i nevnte FR3 er alanin og

b) CDR til kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser: Foretrukne utførelsesformer av den rekonstituerte human H-kjeden er kjennetegnet ved at; - nevnte C-region til den humane H-kjede er humant Cy1-region, der nevnte FR til den humane H-kjede er avledet fra FR til det humane antistoff fra HSGI, eller at - nevnte FR1 -3 er avledet fra FR1 -3 fra humant antistoff HG3 og nevnte FR4 er avledet fra FR4 fra humant antistoff JH6, eller at - FR1-3 i hovedsak er den samme som FR1-3 til humant antistoff HG3 og nevnte FR4 er i hovedsak det samme som FR4 fra humant antistoff JH6, eller at - aminosyren i posisjon 73 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er lysin, eller at - V-region til H-kjeden har aminosyresekvensene representert som SEQ ID NO: 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125 eller 128.

I et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes DNA som kjennetegnes ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede som omfatter: a) FR til en human H-kjede hvori aminosyren i posisjon 30 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR1 er treonin, aminosyren i posisjon 71 ifølge definisjonene til

Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene

til Kabat i nevnte FR3 er alanin og

b) CDR til H-kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser:

I foretrukne utførelsesformer av DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnes det

ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR er avledet fra FR fra det humane antistoff fra HSGI, eller at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR 1-3 er avledet fra FR1-3 fra humant antistoff HG3, eventuelt at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR1-3 er i hovedsak den samme som FR1-3 fra humant antistoff HG3.1 andre foretrukne

utførelsesformer kjennetegnes DNA ifølge oppfinnelsen av at den koder for V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane antistoff ifølge krav 12 der aminosyren i posisjon 73 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er lysin, eller at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte V-region til H-kjeden har aminosyresekvensen fremstilt som SEQ ID NO: 113, 115,116,117,118,119,120,121,122,123,125 eller 128, eventuelt at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 som har nukleotidsekvensen beskrevet i SEQ ID NO: 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 eller 102.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en DNA som kjennetegnes ved at den koder for den rekonstituerte humane L-kjede til et anti-HMl .24 antistoff som omfatter:

(1) C-regionen til en human L-kjede, og

(2) V-regionen til en L-kjede som omfatter FR fra en human L-kjede og CDR fra L-kjeden til et anti-HM1.24 antistoff. Foretrukne utførelsesformer av denne DNA kjennetegnes ved at nevnte V-region til L-kjeden koder for for aminosyresekvensen fremstilt som SEQ ID NO: 106, eller at nevnte V-region til L-kjeden har nukleotidsekvensen som beskrevet i SEQ ID NO: 9.1 en annen foretrukken utførelsesform kjennetegnes DNA ifølge foreliggende oppfinnelse av at nevnte C-region i L-kjeden er Cic-regionen til en human L-kjede.

I en annen foretrukken utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse DNA som koder for den rekonstituerte humane H-kjede til et anti-HM1.24 antistoff som omfatter:

(1) C-regionen til en human H-kjede, og

(2) V-regionen til en H-kjede ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 18. Foretrukne utførelse av dette DNA kjennetegnes ved at;

nevnte V-region fra H-kjeden har aminosyresekvensen representert som SEQ ID NO: 113,115,116,117,118,119,120,121, 122,123,125 eller 128, eller at nevnte V-region fra H-kjeden har nukleotidsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO: 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 eller 102, eventuelt at

nevnte C-region til den humane H-kjeden er Cy1-regionen fra den humane H-kjede.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en vektor som kjennetegnes v e d at den omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 og 26.

I enda et aspekt dekker foreliggende oppfinnelse en vertscelle som kjennetegnes ved at den er transformert med en vektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12,13,14,15,16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 og 26.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for produksjon av dét rekonstituerte humane antistoff av anti-HM1.24 antistoff, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: dyrking av vertscelle som er kotransformert med ekspresjonsvektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 19, 20, 21 og 22, og en ekspresjonsvektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12,13,14,15,16,17,18, 23, 24, 25 og 26, og gjenvinning av det ønskede antistoff.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en farmasøytisk blanding og et terapeutisk middel for myelom som inneholder som en aktiv ingrediens rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff ifølge krav 7.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er en kurve som viser at FCM-analyse som bruker den humane myelomcellelinje KPMM2, blir fluorescensintensiteten til et kimært anti-HM1.24 antistoff skiftet på samme måte som fremkalt av et mus anti-HM1.24 antistoff, sammenlignet med kontrollantistoffet. Fig. 2 er en kurve som viser at det kimære anti-HM1.24 antistoff hemmer på samme måte som muse anti-HM1.24 antistoffet, binding av det biotinylerte muse anti-HM1.24 antistoff til WISH-cellene i en doseavhengig måte, ved bruk av Cell-ELISA der WISH-cellen benyttes. Fig. 3 er en kurve som viser at kontrollhumant lgG1 eller muse anti-HM1.24 antistoffet ikke har noen cytotoksisitet mens kimære anti-HM1.24 antistoff fremviser øket cytotoksisitet overfor RPMI 8226 cellen med en øket E/T-ratio. Fig. 4 er en diagramfremstilling av en fremgangsmåte for å konstruere L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff ved transplantasjon av CDR i PCR-fremgangsmåten. Fig. 5 er en diagramfremstilling av en fremgangsmåte for å samle oligonukleotidene til RVH1, RVH2, RVH3 og RVH4 ved hjelp av PCR-fremgangsmåten for å fremstille H-kjeden i det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff. Fig. 6 er en diagramfremstilling av en fremgangsmåte for å konstruere V-regionen til H-kjeden til et humant mus hybrid anti-HM1.24 antistoff ved hjelp av PCR-metoden. Fig. 7 er en diagramfremstilling av en fremgangsmåte for å konstruere V-regionen til H-kjeden til et muse humant hybrid anti-HM1.24 antistoff ved hjelp av PCR-metoden. Fig. 8 er en grafisk fremstilling som viser at versjonen a av L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff har en antigen bindingsaktivitet som er lik den til det kimære anti-HM1.24 antistoff. -1 og -2 viser at de kommer fra ulike grupper. Fig. 9 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff der versjonen a til L-kjeden og versjonen a, b, f eller h til H-kjeden har blitt kombinert, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 10 er en grafisk fremstilling som viser bindingsaktiviteten til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff der versjon b til L-kjeden og versjonen a, b, f eller h til H-kjeden har blitt kombinert, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 11 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff der versjon a til L-kjedeh og H-kjeden versjon a, b, f eller h har blitt kombinert, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 12 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff der versjon b til L-kjeden og versjon a, b, f eller h til H-kjeden har blitt kombinert, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 13 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene a, b, c og d til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 14 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene a og e i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. -1 og -2 viser at de kommer fra ulike grupper. Fig, 15 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til versjonene a, c, p og r i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 16 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til et humant mus hybrid anti-HM1.24 antistoff, et mus humant hybrid anti-HM1.24 antistoff og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 17 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktivitet til versjonene a, b, c og f i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 18 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene a og g i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 19 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til versjonene a og g i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 20 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene h og i i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 21 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene f, h og j i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 22 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til versjonene h og i i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 23 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til versjonene f, h og j til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 24 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene h, k, I, m, n og o i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 25 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktiviteten til versjonene a, h, p og q til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 26 er en grafisk fremstilling som viser inhibisjonsaktiviteten med henblikk på binding til WISH-cellen av versjonene h, k, I, m, n og o i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 27 er en grafisk fremstilling som viser bindingsinhibisjonsaktiviteten til versjonene a, h, p og q i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 28 er en grafisk fremstilling som viser antigen bindingsaktivitet til versjonene a, c, p og r til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, og et kimært anti-HM1.24 antistoff. Fig. 29 er en grafisk fremstilling som viser at versjon s av et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff har en antigen bindingsaktivitet som er lik den til versjon r i det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff. Fig. 30 er en grafisk fremstilling som viser at versjon s av et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff har en bindingsinhibisjonsaktivitet som er lik den til versjon r i det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff. Fig. 31 er en grafisk fremstilling som viser at et renset rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff har en antigen bindingsaktivitet som er lik den til et kimært anti-HMl.24 antistoff. Fig. 32 er en grafisk fremstilling som viser at et renset rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff har en bindingsinhibisjonsaktivitet som er lik den til et kimært anti-HM 1.24 antistoff. Fig, 33 er en grafisk fremstilling som viser at tilførsel av et kimært anti-HM 1.24 antistoff frembragte en forlengelse av overlevelsesperioden sammenlignet med tilførsel av kontroll humant lgG1 i en mus transplantert med humane myelomceller. Fig. 34 er en grafisk fremstilling som viser at når celler avledet fra friske menneskers perifere blod blir benyttet som effektorcelle fremviser kontroll humant lgG1 ingen cytotoksisitet overfor KPMM2-celler og et muse anti-HM 1.24 antistoff har også en svak cytotoksisitet mens et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff fremviser en sterk cytotoksisitet overfor KPMM2-cellene. Fig. 35 er en grafisk fremstilling som viser at når celler avledet fra perifert blod fra friske mennesker blir benyttet som effektorceller frembringer kontroll humant lgG1 ingen cytotoksisitet overfor ARH-77 cellene og et muse anti-HM 1.24 antistoff har også en svak cytotoksisitet, mens et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff fremviser en sterk cytotoksisitet overfor ARH-77 celler. Fig. 36 er en grafisk fremstilling som viser at når celler avledet fra benmargen til SCID-mus blir benyttet som en effektorcelle fremviser kontroll humant lgG1 ingen cytotoksisitet overfor KPMM2-cellene, mens et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff fremviser en øket cytotoksisitet overfor KPMM2-cellene med økning i antistoff konsentrasjonen. Fig. 37 er en grafisk fremstilling som viser at i en mus som har fått transplantert humane myelomceller blir nivået i serum humant IgG øket etter tilførsel av kontroll humant lgG1 sammenlignet med nivået før tilførsel, mens tilførsel av et rekonstituert humant-HM1.24 antistoff hemmer økningen i serumnivå av det IgG. Fig. 38 er en grafisk fremstilling som viser at tilførsel av et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff til en mus som har fått transplantert humane myelomceller fører til forlengelse av overlevelsesperioden sammenlignet med tilførsel av kontroll humant IgG 1. Fig. 39 er en grafisk fremstilling som viser at i serum humant IgG-nivået hos en mus som har fått transplantert humane myelomceller blir øket etter tilførsel av melfalan og kontroll humant lgG1, sammenlignet med nivået før tilførsel, mens til-førsel av et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff hemmer økningen i det humane IgG-nivå i serum. Fig. 40 er en grafisk fremstilling som viser at tilførsel av et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff til en mus som har fått transplantert humane myelomceller fører til forlengelse av overlevelsesperiode sammenlignet med tilførsel av melfalan eller kontroll human IgG 1.

Fremgangsmåte for å utføre oppfinnelsen

1. Konstruksjon av et kimært antistoff.

(1) Kloning av DNA som koder for V-regionen til et mus anti-HM1.24

monoklonalt antistoff.

Fremstilling av mRNA

For å klone DNA som koder for V-regionen til et mus anti-HM1.24 monoklonalt antistoff ble totalt RNA fremstilt fra et gjenvunnet hybridom ved å bruke en kjent metode slik som en guanidin-ultrasentrifugefremgangsmåte (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979), 18, 5294-5299), AGPC-metoden (Chomczynski, P. et al.

(1987), 162,156-159), etc og mRNA blir fremstilt ved å bruke oligo (dT)-cellulose spinnesøyle etc. koplet med mRNA rensningssettet (produsert av Pharmacia), etc. Videre, ved å bruke QuickPrep mRNA rensningssettet (produsert av Pharmacia) kan mRNA bli fremstilt uten ekstraksjonstrinnet med det totale RNA.

Fremstilling og amplifikasjon av cDNA

Fra mRNA som ble fremskaffet i den ovenfor beskrevne fremstilling av mRNA blir hvert cDNA som koder for V-regionene til en L-kjede og en H-kjede syntetisert ved å bruke en revers transkriptase. cDNA til V-regionen i L-kjeden blir syntetisert ved å bruke AMV revers transkriptase første-tråds cDNA-syntesesett. For amplifikasjon av det syntetiserte cDNA benyttes en passende primer som hybridiserer med ledersekvensen og C-regionen til antistoffgenet, (f.eks MKV primeren som har basesekvensene representert av SEQ ID NO: 29 til 39, og MKC primeren som har basesekvensen representert av SEQ ID NO: 40).

Syntese og amplifikasjon av cDNA til V-regionen til en H-kjede kan utføres ved hjelp av PCR (polymerase kjedereaksjon) ved bruk av 5'-RACE-fremgangsmåten (Frohman, M.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 8998-9002,1988, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) ved å bruke 5'-Ampli FINDER RACE reagenssett (CLONTECH). Ampli FINDER ankeret blir ligert til 5'-ende til cDNA syntetisert som over, og en primer som spesifikt hybridiserer med ankerprimeren (SEQ ID NO: 77) og den konstante region (C-regionen) til en mus H-kjede

(f.eks MHC2a primeren som har basesekvensen representert av SEQ ID NO: 42)

kan benyttes som primer for amplifikasjon av V-regionen til H-kjeden.

Rensning av DNA og bestemmelse av basesekvensen til dette

En agarosegel-elektroforese blir utført på PCR-produktet der det benyttes en kjent fremgangsmåte for å kutte ut det ønskede DNA-fragment og DNA blir gjenvunnet og renset fra dette, for deretter å bli ligert til et vektor DNA.

DNA kan renses ved å bruke et kommersielt sett (f.eks GENECLEAN II; BIO101). Et kjent vektor DNA (f.eks pUC19, Bluescript, etc) kan benyttes for å gjenvinne DNA-fragmenter.

Det ovenfor beskrevne DNA og den ovenfor beskrevne DNA-vektor blir ligert ved å bruke et kjent ligeringssett (produsert av Takara Shuzo) for å fremskaffe en rekombinant vektor. Den fremskaffede rekombinante vektor blir deretter introdusert inn i Escherichia coli JM109, hvoretter ampicillinresistente kolonier blir utvalgt bg en vektor-DNA blir produsert basert på en kjent metode (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Etter å fordøye den ovenfor nevnte vektor-DNA med restriksjonsenzymer blir basesekvensen til det ønskede DNA bestemt ved hjelp av en kjent fremgangsmåte

(f.eks dideoksy-metoden) (J. Sambrook, et ai., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). I overensstemmelse med den foreliggende beskrivelse kan et automatisk sekvenseringssystem (DNA Sequencer 373A; produsert av ABI Co. Ltd.) benyttes.

Region som bestemmer komplementaritet

V-regionen til H-kjede og V-regionen til en L-kjede danner et antigent bindingssete, der de totale strukturer har lignende egenskaper. Således har hver av fire rammeregioner (FR) blitt ligert med tre hypervariable regioner, dvs komplementaritetsbestemmende regioner (CDR). Aminosyresekvensene til FR har blitt relativt godt konservert, mens det er ekstremt høy variasjon blant aminosyresekvensene til CDR-regionene (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Mange deler av de ovenfor nevnte fire FR har p-platestrukturen, med resultatet at tre CDR danner sløyfer. CDR kan noen ganger danne del av p-platestrukturen. De tre CDR blir holdt tilbake sterisk i nær relasjon med hverandre, og danner et antigen bindingssete med tre CDR fra den parrende region.

Basert på disse fakta blir aminosyresekvensen til den variable region i et mus anti-HM1.24 antistoff tilpasset databasen til aminosyresekvensene i antistoff som er utviklet av Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983) for å studere homologi og derved å finne CDR-regioner.

(2) Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for et kimært antistoff.

Når et DNA-fragment som koder for V-regionene til mus L-kjeden og H-kjeden til et mus monoklonalt antistoff blir klonet kan et kimært anti-HM 1.24 antistoff fremskaffes ved å kople disse mus V-regioner til et DNA som koder for den konstante region til et humant antistoff og deretter ved å uttrykke dem.

En grunnleggende fremgangsmåte for å konstruere et kimært antistoff omfatter kopling av mus ledersekvensen og V-regionssekvensen som er tilstede i det klonede cDNA til en sekvens som koder for C-regionen til et humant antistoff som allerede er tilstede i en ekspresjonsvektor som kan brukes i pattedyrceller. Alternativt omfatter det å kople mus ledersekvensen og V-regionsekvensen som er tilstede i det klonede cDNA til en sekvens som koder for C-regionen til et humant antistoff som deretter blir koplet til en ekspresjonsvektor hensiktsmessig i pattedyrceller. C-regionen til et humant antistoff kan være C-regionen til enhver H-kjede og C-regionen til enhver L-kjede. Det kan f.eks nevnes Cy1, Cy2, Oy3 eller Cy4 til en human H-kjede, eller CX eller Ck til en L-kjede.

For fremstilling av et kimært antistoff blir to typer ekspresjonsvektorer konstruert: Disse er en ekspresjonsvektor som omfatter DNA som koder for V-regionen til en mus L-kjede og C-regionen til en human L-kjede under kontroll av en ekspresjonsregulatorisk region slik som forsterker/promoter-systemet, og en ekspresjonsvektor som omfatter DNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede og C-regionen til en human H-kjede under kontroll av et ekspresjonsregulatorisk system slik som forsterker/promoter-systemet. Deretter blir en vertscelle slik som pattedyrcelle kotransformert med bruk av disse ekspresjonsvektorer, og de transformerte celler blir dyrket in vitro eller in vivo for å produsere et kimært antistoff (f.eks WO 91-16928).

Eventuelt blir DNA som koder for mus ledersekvensen og V-regionen til en L-kjede og C-regionen til en human L-kjede og DNA som koder for mus ledersekvensen og V-regionen til en H-kjede og V-regionen til en human H-kjede som er tilstede i det klonede cDNA introdusert inn i en enkel ekspresjonsvektor (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 94-11523), og en vertscelle blir transformert ved å bruke den nevnte vektor. Den transformerte vert blir deretter dyrket in vitro eller in vivo for å produsere det ønskede kimære antistoff.

1) Konstruksjon av en kimære H-kjede

En ekspresjonsvektor for H-kjeden til det kimære antistoff kan fremskaffes ved å introdusere cDNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede inn i en passende ekspresjonsvektor som inneholder genomisk DNA eller cDNA som koder for C-regionen til H-kjeden til et humant antistoff. Som C-regionen til en H-kjede kan nevnes f.eks Oy1, Cy2, Cy3 eller Oy4.

Konstruksjon av en ekspresjonsvektor til en kimær H-kjede som inneholder Cyl genomisk DNA

Som en ekspresjonsvektor som har genomisk DNA kodene for Cyl som C-regionen til en H-kjede kan benyttes f.eks HFE-PMh-gy1 (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759) eller DHFR-AE-RVh-PM1 F (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759).

For å innføre cDNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede inn i disse ekspresjonsvektorene kan passende basesekvenser bli introdusert ved bruk av PCR-metoden. Disse passende basesekvensene kan introduseres ved hjelp av PCR-metoden ved å bruke en PCR-primer som er oppbygget for å ha en gjenkjennelsessekvens til et passende restriksjonsenzym ved 5'-enden og en Kozak konsensus sekvens umiddelbart før startkodonet, og en PCR-primer som er bygget opp ved 3'-enden for å ha en gjenkjennelsessekvens for et passende restriksjonsenzym, og et spleisedonorsete der et primært transkript av genomisk DNA blir korrekt spleiset slik at det blir et mRNA.

cDNA som blir konstruert på denne måten og koder for V-regionen til en mus H-kjede blir behandlet med passende restriksjonsenzymer, innført inn i den ovenfor nevnte ekspresjonsvektor, og en kimære H-kjede-ekspresjonsvektor som omfatter Cyl DNA kan konstrueres.

Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for cDNA kimær H-kjeden

En ekspresjonsvektor som har cDNA til Cy1 som C-regionen til en H-kjede kan konstrueres som følger. Den kan konstrueres ved å fremstille mRNA fra en CHO-celle der ekspresjonsvektoren DHFR-AE-RVh-PM1 F (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759) som koder for genomisk DNA til V-regionen til H-kjeden til et humanisert PM 1-antistoff og C-regionen Cyl til H-kjeden til et humant antistoff (N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679,1982) og ekspresjonsvektoren RV1-PM1a (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759) som koder for genomisk DNA til V-regionen og L-kjeden til et humanisert PM1 antistoff og C-regionen til k-kjeden til et humant antistoff L-kjede har blitt integrert; kloning av cDNA som omfatter V-regionen til H-kjeden til det humaniserte PM1 antistoff og C-regionen Cyl til H-kjeden til det humane antistoff ved hjelp av RT-PCR-metoden, og; ligering til en passende ekspresjonsvektor hensiktsmessig for dyreceller ved bruk av passende restriksjonsenzymseter.

For direkte å ligere cDNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede til cDNA som inneholder C-regionen Cy1 til H-kjeden til et humant antistoff kan passende basesekvenser introduseres ved hjelp av PCR-metoden. For eksempel kan disse passende basesekvenser introduseres ved hjelp av PCR-metoden ved bruk av en PCR-primer laget for å ha en gjenkjennelsessekvens for et passende restriksjonsenzym i 5'-enden og en Kozak konsensussekvens umiddelbart før startkodonet, og en PCR-primer laget for å ha en gjenkjennelsessekvens for et passende restriksjonsenzym benyttet for direkte ligering av C-regionen Cyl fra en H-kjede ved 3'-enden.

En ekspresjonsvektor som omfatter en cDNA kimære H-kjede kan konstrueres ved å behandle cDNA som er fremstilt på denne måte som koder for V-regionen til en mus H-kjede med et passende restriksjonsenzym, ligering til det ovenfor nevnte cDNA som inneholder C-regionen Cy1 til H-kjeden, og innsetting i en ekspresjonsvektor slik som pCOS1 eller pCHOI.

2) Konstruksjon av L-kjeden til et kimært antistoff

En ekspresjonsvektor for L-kjeden til et kimært antistoff kan fremskaffes ved å kople cDNA som koder for V-regionen til en mus L-kjede til genomisk DNA eller cDNA som koder for C-regionen til L-kjeden til et humant antistoff, og deretter introdusere dette inn i en passende ekspresjonsvektor. En K-kjede eller en X-kjede kan f.eks nevnes som C-regionen til en L-kjede.

Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for K-kjeden til en cDNA-kimær L-kjede

For å konstruere en ekspresjonsvektor som inneholder cDNA som koder for V-regionen til en mus L-kjede kan passende basesekvenser introduseres ved å bruke PCR-metoden. For eksempel kan disse passende basesekvenser bli introdusert ved hjelp av PCR-metoden ved å bruke en PCR-primer som er bygget opp for å ha en gjenkjennelsessekvens for et passende restriksjonsenzym og en Kozak konsensussekvens ved 5'enden, og en PCR-primer som er bygget opp for å ha en gjenkjennelsessekvens for et passende restriksjonsenzym ved 3'enden.

K-kjede C-regionen til en human L-kjede med henblikk på kopling til V-regionen til en mus L-kjede kan konstrueres f.eks fra HEF-PM1k-gk (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759) som inneholder genomisk DNA. En ekspresjonsvektor for K-kjeden til L-kjeden til et cDNA kimært antistoff kan konstrueres ved å introdusere gjenkjennelsessekvenser til passende restriksjonsenzymer ved 5'-enden eller 3'-enden til DNA som koder for K-kjedens C-region til L-kjeden ved hjelp av PCR-metoden, ligering av den således konstruerte V-regionen fra mus L-kjeden til K-kjedens C-region fra L-kjeden, og deretter innføring i en ekspresjonsvektor slik som pCOS1 eller pCHOI .

Konstruksjon av et rekonstituert humant antistoff

(1) Forming av V-regionen til et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff

For å konstruere et rekonstituert humant antistoff der CDR til et mus monoklonalt antistoff har blitt koplet til et humant antistoff er det ønskelig at det er høy grad i homologi mellom FR i muse monoklonale antistoffet og FR i det humane antistoff. V-regionene i L-kjeden og H-kjeden tjl muse anti-HM1.24 antistoffet blir således sammenlignet med V-regionene til alle kjente antistoff der strukturene har blitt kartlagt, ved hjelp av proteindatabanken. V-regionen til L-kjeden til et mus anti-HM 1.24 antistoff er mest likt konsensussekvensen til subgruppe IV i V-regionen til L-kjeden til et humant antistoff (HSGIV) med en homologi på 66,4%. På den annen side viser det en prosent homologi på 56,9%, 55,8% og 61,5% i henholdsvis HSGI, HSGII og HSGIII. V-regionen til L-kjeden til et mus anti-HM 1.24 antistoff, når den blir sammenlignet med V-regionen til L-kjeden til kjente humane antistoff viser en homologi på 67,0% med V-regionen til L-kjeden til det humane antistoff REI, fra subgruppe I i V-regionen til L-kjeden til det humane antistoff. Derfor ble FR til REI benyttet som startmateriale for å konstruere V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

Versjon a til V-regionen til L-kjeden i det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff ble planlagt. I denne versjon ble FR til det humane antistoff gjort identisk med REI-basert FR tilstede i det rekonstituerte humane CAMPATH-1H antistoff (se Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25, (1988), der FR inneholdt i versjon a V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant PM-1 antistoff beskrevet i internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759), og mus CDR ble gjort identisk med CDR i V-regionen til L-kjeden til mus anti-HM1.24 antistoff.

V-regionen til H-kjeden til et mus anti-HM 1.24 antistoff er mest likt konsussekvensen til V-regionen til H-kjeden til et humant antistoff (HSGI) med en homologi på 54,7%. På den annen sider viser regionen en homologi på 34,6% og 48,1% henholdsvis HSGII og HSGIII. Når V-regionen til H-kjeden til et mus anti-HMl .24 antistoff blir sammenlignet med V-regionen til H-kjeden til kjente humane antistoff var FR1 til FR3 mest like ved V-regionen til H-kjeden til det humane antistoff HG3, fra subgruppe I i V-regionen til en human H-kjede (Rechavi, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, 855-859), med en homologi på 67,3%.

Derfor ble FR fra det humane antistoff HG3 benyttet som startmateriale for konstruksjon av V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff.

Siden aminosyresekvensen til FR4 fra det humane antistoff HG3 ikke har blitt beskrevet ble imidlertid aminosyresekvensen til FR4 til det humane antistoff JH6 (Ravetch, J.V. et al., Cell, 27, 583-591) som viser den høyeste homologi med FR4 til et mus anti-HM1.24 antistoff benyttet som FR4. FR4 til JR6 har den samme aminosyresekvens som FR4 fra H-kjeden til et mus anti-HM1.24 antistoff med unntak av bare en aminosyre.

I den første versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HMl .24 antistoff ble FR1 til FR3 gjort identisk med FR1 til FR3 fra det humane antistoff HG3, med unntak av aminosyrene i posisjon 30 i det humane FR1 og posisjon 71 i det humane FR3 som ble gjort identisk med aminosyrene i mus anti-HMl .24 antistoff, og CDR ble gjort identisk med CDR i V-regionen til H-kjeden til et mus anti-HM1.24 antistoff. (2) Konstruksjon av V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff. L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff blir konstruert ved CDR overføring i PCR-metoden. Fremgangsmåten blir vist skjematisk i fig. 4. Åtte PCR-primere blir benyttet for konstruksjon av et rekonstituert anti-HM1.24 antistoff, (versjon a) der FR er avledet fra det humane antistoff REI. De eksterne primere A (SEQ ID NO: 47) og H (SEQ ID NO: 48) er oppbygget for å hybridisere med DNA-sekvensen til HEF ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK.

CDR tilkoplingsprimere L1S (SEQ ID NO: 49) L2S (SEQ ID NO: 50) og L3S (SEQ ID NO: 51) har en sens DNA-sekvens. CDR tilkoplingsprimere L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) og L3A (SEQ ID NO: 54) har en antisens DNA-sekvens, der hver har eh komplementær DNA-sekvens (20 til 23 bp) sammenlignet med DNA-sekvensen ved 5'-enden av primerene henholdsvis L1S, L2S og L3S.

I det første stadium av PCR blir de fire reaksjoner A-L1 A, L1S-L2A, L2S-L3A og L3S-h utført og hvert PCR-produkt blir renset. De fire PCR-produkter fra den første PCR blir tillatt å bindes med hverandre ved hjelp av deres egen komplementaritet (se WO 92-19759). Deretter blir de eksterne primere A og H tilsatt for å forsterke full-lengde DNA som koder for V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff (den andre PCR). I den ovenfor nevnte PCR kan plasmidet HEF-RVL-M21a (se internasjonal søknadspublikasjon nr. W095-14041) som koder for versjon a til V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant ONS-M21 antistoff basert på det humane antistoff REI-avledet FR bli benyttet som en templat.

I det første stadium av PCR ble templat DNA og hver av primerene benyttet. PCR-produkter A-L1A (215 bp), L1S-L2A (98 bp), L2S-L3A (140 bp) og L3S-H (151 bp) blir renset ved hjelp av 1,5% lavt smeltepunkts agarosegel og blir sammenbundet i den andre PCR. I den andre PCR blir hvert produkt fra den første PCR og hver ekstern primer (A og H) benyttet.

Et 516 bp DNA-fragment som resulterer fra den andre PCR blir renset ved å bruke 1,5% lavt smeltepunkt agarosegel, fordøyet med BamHI og Hindlll, og DNA-fragmentene som blir produsert på denne måte blir klonet inn i HEF ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK. Etter å bestemme DNA-sekvensen ble plasmidet som inneholdt DNA-fragmentet som har den korrekte aminosyresekvens til V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff benevnt plasmidet HEF-RVLa-AHM-gic. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til L-kjeden som var inneholdt i denne plasmid HEF-RVLa-AHM-gic blir vist i

SEQ ID NO: 9.

Versjon b til V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff kan konstrueres ved mutagenese ved bruk av PCR. Mutagen primere FTY-1 (SEQ ID NO: 55) og FTY-2 (SEQ ID NO: 56) er bygget opp slik at fenylalanin i posisjon 71 blir mutert til tyrosin.

Etter at de ovenfor beskrevne primere blir amplifisert ved bruk av plasmidet HEF-RVLa-AHM-gK som en templat blir sluttproduktet renset. Ved å fordøye med BamHI og Hindlll blir DNA-fragmentene som fremskaffes klonet inn i HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK for å fremskaffe plasmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til L-kjeden inneholdt i denne plasmid HEF-RVLb-AHM-gK blir vist i SEQ ID NO: 10.

(3) Konstruksjon av V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert

human anti-HM 1.24 antistoff.

3-1. Konstruksjon av versjonene a til e av V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert human anti-HM1.24 antistoff.

DNA som koder for V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert human anti-HMl .24 antistoff kan bli bygget opp som følger. Ved å kople DNA-sekvensen som koder for FR1 til 3 av det humane antistoff HG3 og FR4 til det humane antistoff JH6 til DNA-sekvensen som koder for CDR til V-regionen til H-kjeden til et mus anti-HMl .24 antistoff kan en full-lengde DNA som koder for V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert human anti-HM 1.24 antistoff bli bygget opp.

Deretter blir Hindlll-gjenkjennelsessetet/KOZAK konsensussekvensen og BamHI-gjenkjennelsessetet/spleisedonorsekvensen knyttet henholdsvis til 5'-enden og 3'-enden av denne DNA-sekvens slik at innføring av HEF-ekspresjonsvektoren blir tillatt.

DNA-sekvens bygget opp på denne måte blir delt i fire oligonukleotider. Deretter blir oligonukleotider som har mulighet for å hindre sammenkopling av disse oligonukleotider analysert med datamaskin med henblikk på sekundær struktur.

Sekvensene til de fire oligonukleotider RVH1 til RVH4 blir vist i SEQ ID NO: 57 til 60. Disse oligonukleotider har en lengde på 119 til 144 baser og har en overlappende region 25 til 26 bp. Blant oligonukleotidene har RVH2 (SEQ ID NO: 58) og RVH4 (SEQ ID NO: 60) en sens DNA-sekvens, mens RVH1 (SEQ ID NO: 57) og RVH3 (SEQ ID NO: 59) har en antisens DNA-sekvens. Fremgangsmåte for å bygge sammen disse fire oligonukleotider ved hjelp av PCR-metoden er vist i figur (se fig. 5).

PCR blir utført ved å bruke de fire oligonukleotider og RHP1 (SEQ ID NO: 60) og RHP2 (SEQ ID NO: 62) som de eksterne primere.

Det amplifiserte 438 bp DNA-fragment blir renset, fordøyet med Hindlll og BamHI, og deretter klonet i HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VH-gyl. Etter bestemmelse av basesekvensen ble plasmidet som inneholder DNA-fragmentet som koder for den korrekte aminosyresekvens til V-regionen til H-kjeden benevnt HEF-RVHa-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden som innholdes i dette plasmid HEF-RVHa-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 11.

Hver av versjonene b, c, d og e til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff blir konstruert som følger. Ved konstruksjon av hver av versjonene b og etterfølgende til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff kan en tredimensjonal strukturell modell til V-regionen til et mus anti-HM1.24 antistoff bli konstruert for å forutsi posisjonen til aminosyreresten som skal substitueres i antistoffmolekylet.

Ved å bruke som mutagen primer BS (sekvens 63) og BA (SEQ ID NO: 64) oppbygget for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden blir versjon b amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHb-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHb-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 12.

Ved å bruke som mutagen primer CS (sekvens 65) og CA (SEQ ID NO: 66) oppbygget for å mutere treonin i posisjon 73 til lysin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden blir versjon c amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHc-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHc-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 13.

Ved å bruke som mutagen primer DS (sekvens 67) og DA (SÉQ ID NO: 68) beregnet for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og treonin i posisjon 73 til lysin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden blir versjon d amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHd-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHd-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO: 14.

Ved å bruke som mutagen primer ES (sekvens 69) og EA (SEQ ID NO: 70) beregnet for å mutere valin i posisjon 67 til alanin og metionin i posisjon til leucin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl blir versjon E amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHe-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 15.

3-2. Konstruksjon av H-kjede hybrid V-region

Ved å konstruere en H-kjede hybrid V-region er det mulig å studere hvilke FR i V-regionen til et humanisert antistoff som bidrar til bindingsaktiviteten og bindingsinhibisjonsaktiviteten. Blant de to som ble konstruert er aminosyresekvensene til FR1 og FR2 avledet fra et mus anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff (mus human hybrid anti-HM1.24 antistoff) i en, og aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra et mus anti-HMl.24 antistoff (humant mus hybrid anti-HM1.24 antistoff) i den andre. Aminosyresekvensene til CDR-regionene er alle avledet fra et mus anti-HM1.24 antistoff.

To H-kjede hybrid V-regioner blir konstruert ved hjelp av PCR-metoden.

Fremgangsmåten er skjematisk vist i fig. 6 og 7. For å konstruere to H-kjede hybrid V-regioner kan fire primere bli benyttet. De eksterne primere a (SEQ ID NO: 71) og h (SEQ ID NO: 72) er bygget opp for å hybridisere med DNA-sekvensen til HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VH-gy1. H-kjede hybrid konstruksjonsprimer HYS (SEQ ID NO: 73) blir bygget opp for å ha sens DNA-sekvens og H-kjede hybrid primer HYA (SEQ ID NO: 74) for å ha antisens DNA-sekvensen slik at DNA-sekvensene er komplementære til hverandre.

For å konstruere H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra et mus anti-HM1.24 antistoff og sekvensene fra FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff, ble PCR der plasmidet HÉF-1.24H-gy1 brukt som templat, den eksterne primer a, og H-kjede hybrid primer HYA, og PCR der plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl som templat, H-kjede hybrid primeren HYA, og den eksterne primer h utført i det første PCR stadium, og hvert PCR-produkt blir renset.

De to PCR-produkter fra den første PCR blir tillatt å binde sammen ved hjelp av deres egen komplementaritet (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759). Deretter ved at eksterne primere a og h blir tilsatt et full-lengde DNA som koder for H-kjeden hybrid V-regionen der aminosyresekvesen til FR1 og FR2 er avledet fra et mus anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra versjonen a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff blir amplifisert i det andre stadium av PCR.

For å konstruere H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 blir avledet fra versjon a til V-regionen i H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra et mus anti-HM1.24 antistoff blir PCR der plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl benyttet som et templat, den eksterne primer a og H-kjeden hybrid primer HYA, og PCR der plasmidet HEF-1.24H-gy1 benyttes som templat, H-kjede hybrid primer HYS og den eksterne primer h utført i det første stadium av PCR, og hvert PCR-produkt blir renset.

De to PCR-rensede produkter fra den første PCR blir tillatt å kople sammen basert på deres egen komplementaritet (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759). Deretter blir, ved å tilsette de eksterne primere a og h en full-lengde DNA som koder for H-kjeden hybrid V-region der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HMl .24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra et mus anti-HM 1.24 antistoff forsterket i det andre PCR-stadium.

Fremgangsmåtene i den første PCR, rensning av PCR-produktene, sammenkopling, den andre PCR og kloning inn i HEF ekpresjonsvektoren HEF-VH-gy1 blir utført ifølge fremgangsmåten vist i "Eksempel 9. Konstruksjon av V-regionen til L-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff". Etter bestemmelse av DNA-sekvensen ble plasmidet som inneholder DNA-f ragmentet som koder for den korrekte aminosyresekvens til H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra et mus anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant antistoff-HM1.24 antistoff ble nevnt HEF-MH-RVH-AHM-gy1.

Aminosyresekvensen og basesekvesen til V-regionen til H-kjeden som er inneholdt i dette plasmid HEF-MH-RVH-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 75. På lignende måte ble plasmidet som inneholder DNA-f ragmentet som koder for den korrekte aminosyresekvens til H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra en versjon a rekonstituert humant anti-HM 1:24 antistoff, og de til FR3 og FR4 er fra V-regionen til H-kjeden til et mus anti-HM1.24 antistoff ble benevnt HEF-HM-RVH-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-HM-RVH-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO: 76.

3-3. Konstruksjon av versjonene f og s av V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff

Hver av versjonene f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r og s til V-regionen til H-

kjeden til et rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff blir konstruert som følger.

Under konstruksjon av hver av versjonene f og de etterfølgende til V-regionen til H-kjeden til et rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff kan en tredimensjonal

strukturell modell av V-regionen til et mus anti-HM1.24 antistoff bli konstruert, som

5

nevnt over, slik at man kan forutsi posisjonen til aminosyreresten som skal substitueres i antistoffmolekylet.

Ved å bruke som mutagen primer FS (sekvens 78) og FA (SEQ ID NO: 79) som er oppbygget for å mutere treonin i posisjon 75 til serin og valin i posisjon 78 til alanin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHe-AHM-gy1 ved PCR-metoden blir versjon f amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHf-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHf-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 16.

Ved å bruke sorti mutagen primer GS (sekvens 80) og GA (SEQ ID NO: 81) som er oppbygget for å mutere alanin i posisjon 40 til arginin og som ét templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl blir versjon g amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHg-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHg-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 17.

Ved å bruke som mutagen primer FS og GA og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHb-AHM-gyl blir versjon h amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHh-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHh-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO 18.

Ved å bruke som mutagen primer IS (sekvens 82) og IA (SEQ ID NO: 83) som er oppbygget for å mutere arginin i posisjon 83 til alanin og serin i posisjon 84 til fenylalanin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gy1 blir versjon i amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHi-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHi-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 19.

Ved å bruke som mutagen primer JS (SEQ ID NO: 84) og JA (SEQ ID NO: 85) som er oppbygget for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHj-AHM-gyl blir versjon j amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHj-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHj-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 20.

Ved å bruke som mutagen primer KS (SEQ ID NO: 86) og KA (SEQ ID NO: 87) som er oppbygget for å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl blir versjon k amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHk-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHk-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 21.

Ved å bruke som mutagen primer LS (SEQ ID NO: 88) og LA (SEQ ID NO: 89) som er oppbygget for å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin og serin i posisjon 82B til isoleucin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl blir versjon I amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHI-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHI-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 22.

Ved å bruke som mutagen primer MS (SEQ ID NO: 90) og MA (SEQ ID NO: 91) som er oppbygget for å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin, serin i posisjon 82B til isoleucin og treonin i posisjon 87 til serin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl blir versjon m amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHm-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHm-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 23.

Ved å bruke som mutagen primer NS (SEQ ID NO: 92) og NA (SEQ ID NO: 93) som er oppbygget for å mutere serin i posisjon 82B til isoleucin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl blir versjon n amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHn-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHn-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 24.

Ved å bruke som mutagen primer OS (SEQ ID NO: 94) og OA (SEQ ID NO: 95) som er oppbygget for å mutere treonin i posisjon 87 til serin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl blir versjon o amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHo-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHo-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 25.

Ved å bruke som mutagen primer PS (SEQ ID NO: 96) og PA (SEQ ID NO: 97) som er oppbygget for å mutere valin i posisjon 78 til alanin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl blir versjon p amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHp-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHp-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO 26.

Ved å bruke som mutagen primer QS (SEQ ID NO: 98) og QA (SEQ ID NO: 99) beregnet på å mutere treonin i posisjon 75 til serin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl blir versjon q amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHq-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHq-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 27.

Ved å bruke som mutagen primer CS (SEQ ID NO: 65) og CA (SEQ ID NO: 66) og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHp-AHM-gyl blir versjon r amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHr-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHr-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 28.

Ved å bruke som mutagen primer SS (SEQ ID NO: 100) og SA (SEQ ID NO: 101) som er oppbygget for å mutere metionin i posisjon 69 til isoleucin og som et templat DNA plasmidet HEF-RVHr-AHM-gy1 blir versjon s amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHs-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHs-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 102.

Aminosyresekvensene til V-regionen til L-kjeden konstruert blir vist i tabell 1,

og aminosyresekvensene til V-regionen til H-kjeden blir vist i tabellene 2 til 4.

3. Produksjon av et kimært antistoff og et rekonsituert humant antistoff For produksjon av et kimært antistoff eller et rekonstituert humant antistoff blir to ekspresjonsvektorer for hver konstruert, som omfatter en ekspresjonsvektor som omfatter DNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede og C-regionen til en human H-kjede under kontroll åv en ekspresjonsregulatorisk region slik som

forsterker/promotersystemet og DNA som koder for V-regionen til en mus L-kjede og C-regionen til en human L-kjede under kontroll av en ekspresjonsregulatorisk region slik som forsterker/promotersystemet, eller en ekspresjonsvektor som omfatter DNA som koder for V-regionen til en humanisert H-kjede og C-regionen til en human H-kjede under kontroll av en ekspresjonsregulatorisk region slik som forsterker/- promotersystemet og DNA som koder for V-regionen til en humanisert L-kjede og C-regionen til en human L-kjede under kontroll av en ekspresjonsregulatorisk region slik som forsterker/promotersystemet.

Deretter blir en vertscelle slik som pattedyrecellen kotransformert ved bruk av disse vektorer, og de transformerte celler blir dyrket in vitro eller in vivo for å produsere et kimært antistoff eller et rekonstituert humant antistoff (f.eks internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 91-16928). Videre blir et antistoff-gen introdusert inn i pattedyr slik som geit for å produsere et transgent dyr der et kimært antistoff eller et rekonstituert humant antistoff kan fremskaffes fra melken.

Videre blir V-regionen til en H-kjede og C-regionen til en H-kjede, og V-regionen til en L-kjede og C-regionen til en L-kjede ligert til en enkel vektor for å transformere en passene vertscelle og derved å produsere antistoff. Således blir for ekspresjon av kimære antistoff DNA som koder for mus ledersekvens og V-regionen til H-kjeden og humant H-kjede C-region tilstede i det klonende cDNA, og DNA som koder for mus ledersekvens og L-kjede V-region og human L-kjede C-region introdusert inn i en enkel ekspresjonsvektor (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 94-11523).

For ekspresjon av et rekonstituert humant antistoff blir DNA som koder for V-regionen til en humanisert H-kjede og C-regionen til en human H-kjede, og DNA som koder for V-regionen til en humanisert L-kjede og C-regionen til en human L-kjede introdusert inn i en enkel ekspresjonsvektor (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 94-11523). Ved bruk av nevnte vektor blir vertsceller transformert, og de transformerte vertsceller blir dyrket in vivo eller in vitro for å produsere det ønskede kimære antistoff eller det rekonstituerte humane antistoff.

En transformant som blir transformert som nevnt over av et gen som kodet for

det ønskede kimære antistoff eller et rekonstituert humant antistoff blir dyrket, og kimære antistoffet eller det rekonstituerte humane antistoff som blir produsert kan isoleres fra innsiden eller utsiden av cellene og renset til homogenitet.

Isolering og rensning av det ønskede protein fra den foreliggende oppfinnelse,

et kimært antistoff eller et rekonstituert humant antistoff, kan utføres ved hjelp av en affinitetssøyle. Som en søyle som benytter f.eks protein A kan nevnes HyperD, POROS, Sepharose F. F, etc. Som alternativ kan vanlig isolasjons- og rensningsmetoder benyttet for proteiner bli brukt, og fremgangsmåten er ikke begrenset på noen måte. For eksempel kan kombinasjoner av ulike kromatografiske metoder, ultrafiltrering, utsalting, dialyse og lignende, benyttet etter behov, kunne tillate isolering og rensning av kimære antistoffet eller det rekonstituerte humane antistoff.

For produksjon av kimære anti-HM 1.24 antistoff eller det rekonstituerte

humane anti-HM 1.24 antistoff kan enhver ekspresjonsmetode bli benyttet,

inkluderende f.eks eukaryote celler slik som dyreceller, den etablerte pattedyrcellelinje i system, et insektscellesystem, et soppcellesystem og et gjærcellesystem, videre prokaryote celler slik som bakterieceller f.eks Escerichia coli-celler, og lignende. Fortrinnsvis bør kimær-antistoffet eller det rekonstituerte humane antistoff bli uttrykket i COS-celler, CHO-celler, Hela-celler, Vero-celler, myelomceller eller BHK-celler.

I disse tilfeller kan vanlige promotere som er hensiktsmessig for

ekspresjon i pattedyrceller bli benyttet. For eksempel kan fortrinnsvis den humane cytomegalovirus øyeblikkelig tidlig (HCMV) promoter bli benyttet. Eksempler på ekspresjonsvektorer som inneholder HCMV-promoteren inkluderer HCMV-VH-HCy1, HCMV-VL-HCk etc og som er avledet fra pSV2ne (internasjonal søknadspublikasjon

nr. WO 92-19759).

Videre kan som promoter for genekspresjon i pattedyrceller til bruk i den foreliggende oppfinnelse benyttes viruspromotere slik som retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) etc, og promotere avledet fra pattedyrceller slik som human polypeptidkjede elongeringsfaktor 1a (HEF-1a) osv. For eksempel kan når SV40 promoter blir benyttet ekspresjon lett utføres ved å bruke metoden til Mulligan et al. (Nature 277,108 (1979)), og når HEF-1a promoteren blir benyttet kan metoden til Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research, 18, 5322,1990) bli benyttet.

Som en kilde til replikasjon kan benyttes de avledet fra SV40, polyomavirus, adenovirus, bovint papillomvirus (BPV) og lignende, og for amplifikasjon av genets kopiantall i et vertscellesystem kan ekspresjonsvektoren inkludere som en selektiv markør f.eks aminoglykosidfosfotransferase (APH) genet, tymidinkinase (TK) genet, E. coli xantin-guaninfosforibosyltransferase (Ecogpt) genet, dihydrofolat-reduktase (DHRF) genet og lignende. 4. Bindingsinhibisjonsaktiviteten til et kimært antistoff eller et rekonstituert humant antistoff. (1) Måling av antistoffkonsentrasjon Konsentrasjon av renset antistoff kan bli målt ved hjelp av ELISA eller ved måling av absorbans.

ELISA-plater for måling av antistoffkonsentrasjon kan prepareres som følger. Hver brønn i en 96-brønns ELISA-plate (f.eks Maxisorp, produsert av NUNC) blir immobilisert med 100 uJ geit anti-humant IgG antistoff i en konsentrasjon på 1 u.g/ml.

Etter blokking med 100 ug/ml av en fortynningsbuffer (f.eks 50 mM Tris-HC, 1 mM MgCI2) 0,15 M NaCI, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3,1% bovint serumalbumin (BSA), pH 8,1), blir seriefortynninger av kultur supernatant fra celler der kimære antistoffet, hybridantistoff eller det rekonstituerte humane antistoff ble uttrykket, f.eks kultur supernatanten til COS-celler eller CHO-celler, eller det rensede kimære antistoff, hybridantistoff eller rekonstituerte human antistoff tilsatt til hver brønn. Deretter blir 100 uJ alkalisk fosfatasekonjugert geit anti-humant IgG antistoff tilsatt, 1 mg/ml av substratløsningen (Sigma104, p-nitrofenylfosfat, produsert av SIGMA) tilsatt, og absorbans ved 405 nm blir målt ved hjelp av en mikroplateleser (BioRad). Som standard for måling av konsentrasjon kan et humant IgGlK (produsert av The Binding Site) bli benyttet. Konsentrasjonen av det rensede antistoff blir fremskaffet ved å måle absorbans ved 280 nm og ved å kalkulere med 1 mg/ml som 1,25 OD.

(2) Bindingsaktivitet Bindingsaktivitet kan bli målt ved hjelp av Cell-ELISA ved å bruke den humane anmiotiske cellelinje WISH (ATCC CCL25). Cellé-ELISA-platen kan prepareres som følger. WISH-celler preparert i en passende konsentrasjon med PRM11640 medium forsterket med 10% føtalt kalveserum blir tilsatt en 96-brønns plate, inkubert over natten, og fiksert etter å bli vasket to ganger med PBS(-), med 0,1% glutaraldehyd (produsert av Nakalai tesque).

Etter å ha blitt blokket blir 100 (il med seriefotrynninger av kultursupernatanten i celler der det kimære anti-HM 1.24 antistoffet, hybrid anti-HM 1.24 antistoffet eller det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff var uttrykket, f.eks kultur supernatanten til COS-celler eller CHO-celler, eller det rensede kimære anti-HM 1.24 antistoff, hybrid anti-HM 1.24 antistoff eller rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff blir tilsatt til hver brønn, inkubert ved romtemperatur i to timer, hvoretter peroksydasemerket kanin anti-humant IgG antistoff (produsert av DAKO) tilsettes.

Etter inkubering ved romtemperatur i en time blir substratløsningen tilsatt og deretter inkubert. Deretter blir reaksjonen stoppet med 50 uJ 6N svovelsyre, og absorbans ved 490 nm målt ved å bruke mikroplateleser modell 3550 (produsert av Bio-Rad).

(3) Måling av bindingsinhibisjonsaktivitet

Bindingsinhibisjonsaktivitet fremvist av det biotinylerte mus anti-HM 1.24 antistoff blir målt med Cell-ELISA ved å bruke den humane amnioncellelinje WISH (ATCC CCL25). Celle-ELISA-platen kan prepareres som beskrevet over (2). WISH-celler preparert i en passende konsentrasjon med PRM11640 medium forsterket med 10% føtalt kalveserum blir tilsatt en 96-brønns plate, inkubert over natten, og vasket to ganger med PBS(-), hvoretter de blir filtrert med 0,1 % glutaraldehyd

(produsert av Nakalai tesque).

Etter blokking blir 50 uJ av seriefotrynninger av kultur supernatanten til celler

der kimære anti-HM 1.24 antistoff, hybrid anti-HM1.24 antistoff eller det rekonstituerte humane ant i-HM 1.24 antistoff blir uttrykket, f.eks kultur supernatanten til COS-celler eller CHO-celler, eller det rensede kimære anti-HM1.24 antistoff, hybrid anti-HM1.24 antistoff eller rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff blir tilsatt til hver brønn, og samtidig blir 50 |il 2 ug/ml biotinylert mus anti-HM1.24 antistoff tilsatt, og deretter inkubert ved romtemperatur i to timer. Etter vasking blir peroksydasemerket streptavidin (produsert av DAKO) tilsatt.

Etter inkubering ved romtemperatur i en time og vasking blir substratløsningen tilsatt og deretter inkubert. Deretter blir reaksjonen stoppet med 50 uJ 6N svovelsyre, og absorbans ved 490 nm målt ved å bruke mikroplateleser modell 3550 (produsert av BioRad).

Måling av ADCC-aktivitet

ADCC-aktiviteten til kimært antistoff eller det rekonstituerte humane antistoff kan bli målt som følger. Først blir mononukleære celler separert fra humant perifert blod eller benmarg ved hjelp av tetthetssentrifugeringsmetoden og preparert som effektorcellen. Humane myelomceller blir preparert som målcellen ved merking av RPMI 8226 celler (ATCC CCL 155) med 51 Cr. Kimærantistoffet eller det rekonstituerte humane antistoff som skal analyseres for ADCC-aktivitet blir deretter tilsatt til de merkede målceller og inkubert, og en passende ration med effektorceller blir deretter tilsatt til målcellen og inkubert.

Etter inkubering blir supernatanten samlet for måling av radioaktivitet ved hjelp av en gammateller. På dette tidspunkt kan 1% NP-40 benyttes for måling av den maksimalt frisatte radioaktivitet. Cytotoksisitet (5) kan kalkuleres som (A-C) / (B-C) x 100, der A er radioaktivitet (cpm) frisatt i nærvær av antistoff, B er radioaktivitet (cpm) frisatt av NP-40, og C er radioaktivitet (cpm) frisatt av kulturvæsken uten antistoff.

Når ADCC-aktivitet eller CDC-aktivitet forventes for C-regionen til antistoffet, kan humant Cy1 eller humant Cy3 bli benyttet som C-regionen til antistoffet. Videre kan man ved tilsetning, endring eller modifikasjon av deler av aminosyren til C-regionen til antistoffet en høyere ADCC-aktivitet eller CDC-aktivitet bli indusert.

Som eksempel er den IgM-lignende polymerisering av IgG ved hjelp av aminosyresubstitusjon (Smith, R.I.F. & Morrison, S.L, BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), den IgM-lignende polymerisering av IgG ved aminosyretilførsel (Smith, R.I.F. et a., J. Immunol. (1995) 154, 2226-2236), ekspresjon ved tandemkopling av gener som koder for en L-kjede (Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724-727), dimerisering av IgG ved aminosyresubstitusjon (Caron, P.C. et al., J. Exp. Med.

(1992) 176,1191 -1195, Shopes, B.J. Immunology (1992) 148, 2918-2922, dimerisering av IgG ved kjemisk modifikasjon (Wolff, E.A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565), og introduksjon av effektorfunksjonen ved aminosyreendring ved hengselregionen til antistoffér (Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol (1991) 21, 2379-2384). De kan oppnås ved oligomer seterettet mutagenese ved å bruke primere, addisjon av basesekvenser ved bruk av restriksjonsenzymsk kløvningsseter, og kjemiske modifikasjoner som induserer kovalent binding.

In vivo diagnostika for myelom

Kimær anti-HM 1.24 antistoffet eller det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff fra den foreliggende oppfinnelse kari benyttes som et in vivo diagnostikum for myelom ved å kople det til en merket forbindelse slik som en radioisotop og lignende.

Videre kan fragmenter av det kimære anti-HM1.24 antistoff eller det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff, slik som Fab, F(ab')2, Fv eller enkeltkjede Fv (scFv) der Fv eller Fv til en H-kjede og en L-kjede blir koplet med en passende kopler som har blitt bundet til en merket forbindelse slik som en radioisotop etc bli benyttet som et in vivo diagnostikum for myelom.

Spesifikt kan disse antistoff-f ragmenter bli fremskaffet ved å konstruere genet som koder for disse antistoff-f ragmenter, introdusere dem inn i en ekspresjonsvektor, og deretter uttrykke dem i passende vertsceller, eller fordøye det kimære anti-HMl .24 antistoff eller det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff med et passende enzym.

De ovenfor nevnte in vivo diagnostika for myelom kan bli tilført systemisk på en parenteral måte.

En farmasøytisk blanding og et terapeutisk middel for myelom.

For å bekrefte de terapeutiske effektene av det kimære anti-HM 1.24 antistoff eller det humaniserte anti-HM1.24 antistoff fra den foreliggende oppfinnelse, blir nevnte antistoff tilført til et dyr med transplanterte myelomceller og antitumoreffektene blir evaluert.

Blant myelomceller som kan transplanteres til dyr blir humane myelomceller foretrukket, og det kan f.eks nevnes KPMM2 (japansk ikke-gransket patentpublikasjon (Kokai) No. 7-236475), RPMI8226 (ATCC CCL155), ARH-77 (ATCC CRL1621) og S6B45 (Suzuki, H. et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22,1989-1993). De dyrearter som kan få nevnte celler transplantert blir fortrinnsvis utvalgt fra dyr som har nedsatt eller manglende immunologiske funksjoner, hvoriblant nakne mus, SCID-mus, beige mus og nakne rotter kan nevnes.

Videre kan antitumoreffektene som skal evalueres bli bekreftet ved variasjon i mengde av humane immunglobuliner i serum, måling av tumorvolum og/eller vekt, variasjon av vekten til humant Bence Jones proteiner i urinen, dyrenes overlevelsesperiode og lignende.

Farmasøytiske blandinger eller terapeutiske midler for myelom som inneholder som et aktivt ingrediens det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff fra den foreliggende oppfinnelse kan bli systemisk eller lokalt tilført på en parenteral måte. For eksempel kan intravenøs injeksjoner slik som dryppinfusjon, intramuskulær injeksjon, intraperitoneal injeksjon eller subkutan injeksjon bli utvalgt, og doseregimentet kan passende velges avhengig av alder og den medisinske tilstand til pasientene.

Effektiv dose blir utvalgt fra området 0,01 mg til 1000 mg/kg kroppsvekt/dose. Alternativt kan dosen på 5 mg/kropp, fortrinnsvis 50 til 100 mg/kropp bli utvalgt.

Farmasøytiske blandinger eller terapeutiske midler for myelom som inneholder som en aktiv ingrediens det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff fra den foreliggende oppfinnelse kan inneholde farmasøytiske akseptable bærere eller tilsetningsmidler avhengig av tilførselsrute.

Som eksempler på slike bærere og tilsetningsmidler kan nevnes vann, farmasøytisk akseptable organiske løsninger, kollagen, polyvinylalkohol, polyvinyl-pyrrolidon, karboksyvinylpolymer, natriumkarboksymetylcellulose, natriumpolyakrylat, natriumalginat, vannløselig dekstran, natriumkarboksymetylstivelse, pektin, metylcellulose, etylcellulose, xantangummi, arabisk gummi, kasein, gelatin, agar, diglysering, glysering, propylenglykol, polyetylenglykol, vaselin, parafin, stearyl-alkohol, stearinsyre, humant serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, laktose, farmasøytisk akseptable overflatemidler og lignende. Tilsetningsmidler som skal brukes kan utvelges fra, men er ikke begrenset til de ovenfor nevnte eller kombinasjoner av disse.

Eksempler

Den foreliggende oppfinnelse vil heretter bli forklart mer spesifikt.

Eksempel 1 Kloning av cDNA som koder for V-regionen til et mus anti-HM 1.24

antistoff

1. Isolerasjon av messenger-RNA (mRNA)

Ved bruk av Fast Track mRNA Isolation Kit Version 3.2 (produsert av Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner ble mRNA isolert fra 2 x 10<8> hybridom-celler (FERM BP-5233) som produserer et mus-HM1.24 antistoff.

2. Amplifikasjon av genet som koder for den variable region til antistoff ved PCR-metoden

PCR ble utført ved bruk av amplifikasjons Thermal Cycler (produsert av Perkin Eimer Cetus).

2-1. Amplifikasjon og fragmentering av genet som koder for V-regionen til

en mus L-kjede

Fra mRNA isolert på denne måte ble enkelt-trådet cDNA syntetisert ved å bruke AMV revers transkriptase første-trådet cDNA-syntesereagenssett (produsert av Life Science) og benyttet til PCR. Som PCR-primere ble MKV (mus kappa variabel) primere (Jones, S.T. et al, Bio/Technology, 9, 88-89, (1991) som er vist i SEQ ID NO: 29 til 39, som hybridiserer med ledersekvensen til en mus kappa type L-kjede benyttet.

100 uJ av PCR-løsningen inneholdende 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP9, 1,5 mM MgCI2, 5 enheter DNA polymerase Ampli Taq (produsert av Perkin Eimer Cetus), 0,25 mM av MKC primere vist i SEQ ID NO: 29 til 39, 3 mM av MKC-primer vist i SEQ ID NO: 40, og 100 ng enkelt-trådet cDNA ble dekket med 50 uJ mineralolje, og deretter oppvarmet ved en begynnertemperatur på 94°C i 3 min, og deretter ved 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt i denne rekkefølge. Etter å gjenta denne syklus 30 ganger ble reaksjonsblandingen inkubert ved 72°C i 10 minutter. Det amplifiserte DNA-fragment ble renset ved lavsmeltepunktsagarose (produsert av Sigma), og fordøyet med Xmal (produsert av New England Biolabs) og Sali (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C.

2-2. Amplifikasjon og fragmentering av cDNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede

Genet som koder for V-regionen til en mus H-kjede ble amplifisert ved

hjelp av 5'-RACE metoden (Rapid Amplification of cDNA ends; Frohman, M.A. et al„ Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 8998-9002 (1988), Edwards, J.B.D.M., et al., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991)). Etter at cDNA var syntetisert ved bruk av primer P1 (SEQ ID NO: 41) som spesifikt hybridiserer med den konstante region til mus lgG2a, ble cDNA som koder for V-regionen til en mus H-kjede amplifisert ved hjelp av 5'-AmpliFINDER RACE KIT (produsert av CLONTECH) ved bruk av primeren MHC2a (SEQ ID NO: 42) som spesifikt hybridiserer med den konstante region i mus

lgG2a og ankerprimeren (SEQ ID NO: 77) bundet til reagenssettet. Det amplifiserte DNA-fragment ble renset med lav smeltepunkts agarose (produsert av Sigma) og fordøyet med EcoRI (produsert av Takara Shuzo) og Xmal (produsert av New England Biolabs) ved 37°C;

3. Kopling og transformasjon

DNA-fragmentet som omfatter genet som koder for V-regionen til mus kappa type L-kjeden produsert som beskrevet over, ble ligert til pUC19 vektoren produsert ved fordøyelse med Sali og Xmal ved reaksjon i en reaksjonsblanding som inneholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 10 mM MgCI2, 10 mM ditiotreitol, 1 mM ATP, 50 mg/ml polyetylenglykol (8000) og en enhet T4 DNA ligase (produsert av GIBCO-BRL) ved 16°C i 2,5 timer. På lignende måte ble DNA-fragmentet som omfatter genet som koder for V-regionen til mus H-kjeden reagert og koplet til pUC19 vektoren fremstilt ved fordøyelse med EcoRI og Xmal ved 16°C i tre timer.

Deretter ble 10 uJ av den ovenfor beskrevne ligeringsblanding tilsatt til 50 uJ av de kompetente Escherichia coli DH5a-celler, som fikk stå på is i 30 minutter, ved 42°C i ett minutt, og deretter på is i ett minutt. Deretter ble 400 uJ 2 x YT medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) tilsatt, inkubert ved 37°C i en timer og deretter ble E. coli platet ut på 2 x YT agarmedium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) som inneholdt 50 |ig/ml ampicillin, og der inkubert over natt ved 37°C for å fremskaffe E. coli transformanten.

Transformånten ble dyrket over natt ved 37°C i 10 ml av 2 x YT medium som inneholdt 50 u.g/ml ampicillin, og fra denne kultur ble plasmid DNA fremstilt ved å bruke alkalimetoden (Molecular Cloning: Å Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Plasmidet som ble fremstilt på denne måte som inneholder genet som koder for V-regionen til mus kappa type L-kjeden avledet fra hybridomet som plasserer anti-HM 1.24 antistoff ble benevnt pUCHMVL9. Plasmidet fremskaffet ved hjelp av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte og som inneholder genet som koder for V-regionen til mus H-kjeden avledet fra hybridomet som produserer anti-HM1.24 antistoff ble benevnt pUCHMVHRI 6.

Eksempel 2 Bestemmelse av basesekvensen til DNA

Basesekvensen tii den kodende region i cDNA i det ovenfor nevnte plasmid ble bestemt ved å bruke den automatiske DNA sekvenator (produsert av Applied Biosystem Inc.) og Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (produsert av Applied Biosystem Inc.) ved hjelp av protokollen beskrevet av produsenten.

Basesekvensen til genet som koder for V-regionen til L-kjeden til mus anti-HMl .24 antistoff inneholdt i plasmidet pUCHMVL9 blir vist i SEQ ID NO: 1. Basesekvesen til genet som koder for V-regionen til H-kjeden til mus anti-HM1.24 antistoffet inneholdet i plasmidet pUCHMVHR16 blir vist i SEQ ID NO: 2. Eksempel 3 Bestemmelse av CDR

De totale strukturer til V-regionene til en L-kjede og en H-kjede har likheter med hverandre, der fire rammedeler blir koplet med tre hypervariable regioner, dvs komplementaritetsbestemmende regioner (CDR). Aminosyresekvensen til ramme-regionene er relativt godt konservert, men variasjon i aminosyresekvensen til ekstremt høy (Kabat, E.A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Basert på disse fakta ble aminosyresekvensen til den variable region til anti-HMl .24 antistoffet sammenlignet med aminosyresekvesen til antistoff i databasen for å analysere homologi, og CDR-regionen ble bestemt som vist i tabell 5.

Eksempel 4 Bekreftelse av ekspresjon av det klonede cDNA

(Konstruksjon av det kimære anti-HM1.24 antistoff)

1. Konstruksjon av en ekspresjonsvektor

For å konstruere ekspresjonsvektoren som uttrykker et kimært anti-HM 1.24 antistoff ble cDNA-klonene pUCHMVL9 og pUCHMVHR16 som koder for henholdsvis V-regionene til L-kjeden og H-kjeden til muse anti-HM 1.24 antistoff modifisert ved hjelp av PCR-metoden, og deretter introdusert inn i HEF-ekspresjonsvektoren (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759).

Baklengsprimeren ONS-L722S (SEQ ID NO: 43) for V-regionen til en L-kjede og baklengsprimeren VHR16S (SEQ ID NO: 44) for V-regionen til en H-kjede ble bygget opp slik at de hybridiserer til DNA som koder for start av ledersekvensen til V-regionen for hver og de har Kozak konsensus-sekvensen (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, (1987)) og gjenkjennelsessetet for Hindlll restriksjonsenzymet. Forlengsprimeren VL9A (SEQ ID NO: 5) for V-regionen til en L-kjede og forlengsprimeren VHR16A (SEQ ID NO: 46) for V-regionen til en H-kjede ble bygget opp slik at de hybridiserer til DNA-sekvesen som koder for enden av J-regionen, og de har en spleisedonorsekvens og gjenkjennelsessetet for BamHI restriksjonsenzymet.

100 uJ av PCR reaksjonsblandingen som inneholdt 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM dNTPs, 1,5 mM MgCI2,100 pmol av hver primer, 100 ng templat DNA (pUCHMVL9 eller pUCHMVHR16), og 5 enheter av Ampli Taq enzym ble dekket med 50 uJ mineralolje, denaturert initialt ved 94°C og deretter varmet ved 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt i 3 cykler for tilslutt å bli inkubert ved 72°C i 10 minutter.

PCR-produktet ble renset med den 1,5% lavt smeltepunkts agarosegelen, og fordøyet med Hindlll og BamHI, og deretter klonet til HEF-VL-gK for V-regionen til L-kjeden og til HEF-VH-gy1 for V-regionen til H-kjeden. Etter bestemmelse av DNA-sekvens ble plasmidene som inneholdt DNA-fragmentet som inneholder den korrekte DNA-sekvens benevnt henholdsvis HEF-1.24L-gK og HEF-1.24H-gy1.

Regionene som koder for de variable regioner fra de ovenfor nevnte plasmider, henholdsvis HEF-1.24L-gK og HEF-1.24H-gy1 ble fordøyet méd restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI for å lage restriksjonsfragementer som ble innført i Hindlll-setet og BamHI-setene til plasmidvektor pUC19 og de ble nevnt pUC19-1.24L-gK og pUC19-12.4H-gy1.

Escherichia coli som inneholdt henholdsvis plasmidene pUC19-1.24L-gK og pUC19-1.24H-gy1 ble benevnt Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) og Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1), og ble deponert internasjonalt på 29. august 1996 hos National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) med tilgangsnummerene henoldsvis FERM BP-5646 og FERM BP-5644, under reglene til Budapest-avtalen.

2. Transfeksjon inn i COS-7 celler

For å påvise transient ekspresjon av kimært anti-HM 1.24 antistoff ble de ovenfor beskrevne ekspresjonsvektorer prøvet i COS-7 (ATCC CRL-1651) celler. HEF-1.24L-gK og HEF-1.24H-gy1 ble kotransformert inn i COS-7 celler ved elektroporering med bruk av Gene Pulser instrumentet (produsert av BioRad). Hvert DNA (10 |ig) ble tilsatt til 0,8 ml deler av 1 x 10<7> celler/ml i PBS, og ble utsatt for pulser ved 1500 V og en kapasitet på 25 |iF.

Etter hvileperiode på 10 minutter ved romtemperatur ble de elektroporerte celler tilsatt til 30 ml DMEM kulturvæske (produsert av GIBCO) som inneholdt 10% y-globulinfritt bovint føtalt serum. Etter inkubering ved 72 timer i C02 inkubatoren BNA120D (produsert av TABAI) ble kultur supernatanten samlet opp, og celleavfall

ble fjernet med sentrifugering som ble benyttet for det følgende eksperiment.

3. FCM-analyse

Antigen bindingsaktiviteten til kimært anti-HM 1.24 antistoff ble studert ved

hjelp av FCM (strømningscytometri) analyse ved bruk av KPMM2-celler. Etter at 4,7

x 10<5> KPMM2-celler (japansk ikke-gransket patentpublikasjon (Kokai) No. 7-236475) ble vasket med PBS(-), ble 50 uJ av COS-7 cellekulturen som produserer det ovenfor nevnte kimære anti-HM 1.24 antistoff og 50 ul FACS buffer (PBS(-) som inneholdt 2% bovint føtalt serum og 0,1% natriumazid), eller 5 jd av 500 u.g/ml renset mus anti-HMl .24 antistoff og 95 uJ av FACS-bufferen tilsatt, og inkubert på is i en time.

Som en kontroll ble 50 |il av 2 u.g/ml kimære SK2 (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 94-28159) og 50 uJ av FACS-bufferen, eller 5 uJ av 500 ^ig/ml renset mus lgG2aic (UPC10) (produsert av CAPPEL) istedenfor renset mus anti-HM1.24 antistoff, og 95 uJ FACS-buffer tilsatt, og inkubert på lignende måte.

Etter vasking med FACS-bufferen ble 100 |il av 25 |ig/ml FITC-konjugert geit anti-humant antistoff (GAH) (produsert av CAPPEL) eller 10 u.g/ml FITC-konjugert geit anti-mus antistoff (GAM) (produsert av Becton Dickinson) tilsatt, og inkubert på is i 30 minutter. Etter vasking med FACS-bufferen ble blandingen suspendert i 1 ml av FACS-buffer, og fluorescensintensitet i hver celle ble målt ved hjelp av FACScan (produsert av Becton Dickinson).

Som vist i fig. 1 blir det klart at kimære anti-HM 1.24 antistoffet bandt til KPMM2-cellen siden toppen av fluorescensintensitet skiftet til høyre i de kimære anti-HM1.24 antistofftilsatte celler sammenlignet med kontrollene på samme måte med tilfellet der mus anti-HM 1.24 antistoff var tilsatt. Dette bekreftet at det klonede cDNA koder for den variable region til mus anti-HM1.24 antistoffet.

Eksempel 5 Etablering av CHO cellelinjen som stabilt produserer et kimært anti-HM1.24 antistoff

1. Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for den kimære H-kjede

Etter fordøying av det ovenfor nevnte plasmid HEF-1.24H-gy1 med restriksjonsenzymene Pvul og BamHI, ble et omtrent 2,8 kbp-fragment som inneholdt EF1 promoteren og DNA som koder for V-regionen til H-kjeden til mus anti-HMl .24 antistoffet renset ved å bruke 1,5% lavt smeltepunkts agarosegel. Deretter ble det ovenfor nevnte DNA-fragment innsatt i et omtrent 6 kbp-fragment som var produsert ved fordøyelse av ekspresjonsvektoren benyttet for human H-kjede ekspresjonsvektor, DHFR-AE-Rvh-PM1f (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759), som inneholdt DHFR-genet og genet som koder for den konstante region til en human H-kjede med Pvul og BamHI for på konstruere en ekspresjonsvektor, DHFR-AE-HEF-1.24H-gy1, for H-kjeden til det kimære anti-HM1.24 antistoff.

2. Geneintroduksjon inn i CHO-celler

For å etablere et stabilt produksjonssystem for det kimære anti-HM 1.24 antistoff ble genene til de ovenfor nevnte ekspresjonsvektorer, HEF-1.24L-gK og DHFR-AE-HEF-1.24H-gy1, som var linearisert ved hjelp av fordøyelse med Pvul samtidig introdusert inn i CHO-cellen DXB11 (donert fra Medical Research Council Collaboration Center) ved elektroporeringsmetoden under betingelser som er lignende med den ovenfor nevnte (den ovenfor nevnte transfeksjon inn i COS-7 celler).

3. Geneamplifikasjon ved MTX

Blant de geneintroduserte CHO-celler kan bare de CHO-celler der både L-kjede og H-kjede ekspresjonsvektoren har blitt introdusert overleve i det nukleosidf ri a-MEM-kulturmedium (produsert av GIBCO-BRL) som har tilsatt 500 u.g/ml G418 (produsert av GIBCO-BRL) og 10% bovint føtalt serum, og disse ble derfor selektert. Deretter ble 10 nM MTX (produsert av Sigma) tilsatt til den ovenfor nevnte kulturvæske. Blant klonene som propagerte ble de som produserer det kimære anti-HM1.24 antistoff i store mengder selektert. Som et resultat ble klonene nr. 8-13 som fremviser en produksjonseffektivitet på omtrent 20 |ig/ml av det kimære antistoff fremskaffet, og benevnt de kimære ant i-HM 1.24 antistoff produserende cellelinjer. Eksempel 6 Konstruksjon av det kimære anti-HM1.24 antistoff

Det kimære anti-HM1.24 antistoff ble konstruert på den følgende måte. De ovenfor nevnte kimære anti-HM1.24 antistoffproduserende CHO-celler ble dyrket kontinuerlig i 30 dager ved å bruke som medium Iscovs modifiserte Dulbeccos medium (produsert av GIBCO-BRL) som inneholdt 5% y-globulinfritt nyfødt bovint serum (produsert av GIBCO-BRL) ved hjelp av høytetthets celledyrkningsinstrument Verax system 20 (produsert av CELLEX BIOSCIENCE Inc.).

På dag 13, 20, 23, 26 og 30 etter påbegynning av kulturen ble kulturvæsken samlet opp ved å bruke en trykkfilterenhet SARTOBRAN (produsert av Sartorius), og det kimære anti-HM 1.24 antistoff ble deretter affinitetsrenset ved å bruke et stort volum antistoffs oppsamlingssystem Afi-Prep System (produsert av Nippon Gaishi) og Super Protein A-søyle (søylevolum: 100 ml, produsert av Nippon Gaishi) med bruk av PBS som absorpsjon/vaskebuffer og 0,1 M natriumcitratbuffer (pH 3) som elueringsbuffer ifølge de vedlagte instruksjoner. De eluerte fraksjoner ble justert til omtrent pH 7,4 ved umiddelbart å tilsette 1 M Tris-HCI (pH 8,0). Antistoff-konsentrasjon ble målt ved absorbans ved 280 nm og kalkulert med 1 |ig/ml som 1,35 OD.

Eksempel 7 Bestemmelse av aktivitet av det kimære anti-HM1.24 antistoff

Kimære anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert ved den følgende bindings inhibisjonsaktivitet.

1. Måling av bindingsinhibisjonsaktivitet.

1 -1. Konstruksjon av et biotinylert anti-HM1.24 antistoff

Etter at mus anti-HM 1.24 antistoffet var fortynnet med 0,1 M bikarbonat buffer til 4 mg/ml, ble 4 uJ av 50 mg/ml Biotin-N-hydroksysuksinimid (produsert av EY LABS Inc.) tilsatt og reaksjonen fikk foregå ved romtemperatur i 3 timer. Deretter ble 1,5 ml av 0,2 M glysinløsning tilsatt, inkubert ved romtemperatur i 30 minutter for å stoppe reaksjonen og de biotinylerte IgG-fraksjoner ble samlet opp ved å bruke PD-10 søylen (produsert av Pharmacia Biotech).

1 -2. Måling av bindings inhibisjonsaktivitet

Bindingsinhibisjonsaktivitet av det biotinylerte mus anti-HM 1.24 antistoff ble målt med celle-ELISA ved å bruke den humane amnion membrancellelinje WISH-celler (ATCC CCL 25). Celle-ELISA-platene ble preparert som følger. Til en 96-brønns plate ble tilsatt 4 x 105 celler/ml preparert med PRM11640 medium forsterket med 10% føtalt bovint serum, inkubert over natten og vasket to ganger med PBS(-), hvoretter de ble immobilisert med 0,1% glutaraldehyd (produsert av Nakalai tesque).

Etter blokking ble 50 \ i\ seriefortynninger av det kimære anti-HM 1.24 antistoff eller mus anti-HM1.24 antistoffet fremskaffet ved affinitetsrensning tilsatt til hver brønn, og samtidig ble 50 uJ av 2 u.g/ml biotinylert mus anti-HM 1.24 antistoff tilsatt, blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer og deretter ble det peroksydasemerkede streptavidin (produsert av DAKO) tilsatt. Etter inkubering ved romtemperatur i en time og deretter vasking ble substratløsning tilsatt. Etter stopp av reaksjonen ved tilsetning av 50 uJ av 6N svovelsyre ble absorbans ved 490 nm målt ved å bruke MICORPLATE READER modell 3550 (produsert av Bio-Rad).

Resultatene, som vist i fig. 2, viste at det kimære anti-HM1.24 antistoff har identisk bindings inhibisjonsaktivitet med mus anti-HM 1.24 antistoff til det biotinylerte mus anti-HM 1.24 antistoff. Dette indikerer at kimære antistoffet har den samme V-regionen som mus anti-HM1.24 antistoffet.

Eksempel 8 Måling av ADCC-aktivitet til kimære anti-HM1.24 antistoff

ADCC (antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet) aktivitet ble målt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i Current Protocols in Immunology, kap. 7. Immunologic studies in human, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1. Preparering av effektorceller

Monocytter ble separert fra perifert blod eller benmarg fra friske individer og pasienter med multippelt myelom ved tetthets sentrifugeringsmetoden. Således ble en lik mengde av PBS(-) tilsatt til perifert blod og benmarg fra friske individer og pasienter med multippelt myelom, og overlagt på Ficoll (produsert av Pharmacia)-Conrey (produsert av Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.) (spesifikk egenvekt 1,077), og ble sentrifugert ved 400 g i 30 minutter. Monocyttlaget ble samlet, og vasket to ganger med RPM11640 (produsert av Sigma) forsterket med 10% føtalt bovint serum (produsert av Witaker), og fremstilt med en celletetthet på 5 x 106/ml med det samme kulturmedium.

2. Preparering av målceller

Den humane myelomcellelinje RPMI 8226 (ATCC CCL 155) ble radioaktivt merket ved å inkubere i RPM11640 (produsert av Sigma) forsterket med 10% føtalt serum (produsert av Witaker) sammen med 0,1 mCi av 51Cr-natriumkromat ved 37°C i 60 minutter. Etter radioaktiv merking ble cellene vasket tre ganger med Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og justert til en konsentrasjon på 2 x 10<5>/ml.

3. ADCC-analyse

Til en 96-brønns ubunnet plate (produsert av Corning) ble tilsatt 50 jil 2 x 10<5 >målceller/ml, 1 jig/ml affinitetsrenset kimært anti-HM 1.24 antistoff og mus anti-HMl .24 antistoff, eller kontroll human IgG (produsert av Serotec), og reaksjonen pågikk ved 4°C i 15 minutter.

Deretter ble 100 (il av 5 x 106 effektorceller/ml tilsatt til dette, og inkubert i C02 inkubator i 4 timer, med ratio (E:T) av effektorcellene (E) til målcellene (T) satt véd 0:1,5:1,20:1 eller 50:1.

Ett hundre (il av supernatanten ble tatt og radioaktiviteten frisatt inn i kulturmediet ble målt ved hjelp av en gammateller (ARC361, produsert av Aloka). For måling av maksimal radioaktivitet ble 1% NP-40 (produsert av BRL) benyttet. Cytotoksisitet (%) ble kalkulert som (A-CV(b-C) x 100, der A er radioaktivitet (cpm) frisatt i nærvær av antistoff, B er radioaktivitet (cpm) frisatt av NP-40, og C er radioaktivitet (cpm) frisatt av kulturmediet alene uten antistoff.

Som vist i fig. 3 øket cytotoksisitet når kimære anti-HM 1.24 antistoff ble tilsatt sammenlignet med kontroll lgG1, med økning i E:T ratio, som indikerte at dette

kimære anti-HM1.24 antistoff har ADCC-aktivitet. Videre, siden ingen cytotoksisitet ble observert selv om muse anti-HM 1.24 antistoff ble tilsatt, ble det vist at Fc-delen av det humane antistoff kreves for å fremskaffe ADCC-aktivitet når effektorcellen er en humant avledet celle.

Eksempel 9 Konstruksjon av det rekonstituerte humane anti-HM1.24

antistoff

1. Oppbygning av V-regionen til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24

antistoff.

For å konstruere det rekonstituerte humane antistoff der CDR til mus monoklonalt antistoff har blitt satt på et humant antistoff er det foretrukket at det er en høy grad av homologi mellom FR fra museantistoff og FR fra det humane antistoff. Derfor ble V-regionene til L-kjeden og H-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoffet sammenlignet til V-regionene til alle kjente antistoff hvis strukturer har blitt utledet, idet Protein Data Bank ble benyttet. V-regionen til L-kjeden til mus anti-HM1.24 antistoffet er mest likt konsensussekvensen til subgruppe IV (HSGIV) til V-regionen til en human L-kjede med en homologi på 66,4%. På den annen side viste den homologi på 56,9%, 55,8% og 61,5% med henholdsvis HSGI, HSGII og HSGIII.

Når V-regionen til L-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoffet blir sammenlignet med V-regionen til L-kjeden i kjente humane antistoff har det vist en homologi på 67,0% med V-regionen REI til en human L-kjede, en av subgruppe I til V-regionen til en human L-kjede. Således ble FR til REI benyttet som startmateriale for å konstruere V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

Versjon a av V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble planlagt. I denne versjonen ble human FR gjort identisk med det REI-baserte FR som er tilstede i det rekonstituerte humane CAMPATH-1H antistoff (se Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25, (1988), FR inneholdt i versjon a i V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane PM-1 beskrevet i internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759), og muse CDR ble gjort identisk med CDR i V-regionen til L-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoffet.

H-kjede V-regionen til mus anti-HM 1.24 antistoffet er mest likt konsensus-sekvensen fra HSGI til V-regionen til en human H-kjede med en homologi på 54,7%. På den annen side viser det en homologi på 34,6% og 48,1% med henholdsvis HSGII og HSGIII. Når V-regionen til H-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoffet blir sammenlignet med V-regionen til H-kjeden fra kjente humane antistoff var FR1 til FR3 mest likt med V-regionen til H-kjeden til det humane antistoff HG3, en av subgruppe I til V-regionen til en human H-kjede (Rechavi, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, 855-859), med en homologi på 67,3%.

FR fra det humane antistoff HG3 ble derfor benyttet som startmateriale for kontruksjon av V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff. Siden aminosyresekvensen fra FR4 i humant HG3 ikke har blitt beskrevet var imidlertid aminosyresekvensen til FR4 fra det humane antistoff JH6 (Ravetch, J.V. et al., Cell, 27, 583-591) som viser den høyeste homologi med FR4 til H-kjeden til mus anti-HM1.24 antistoff ble benyttet. FR4 fra JH6 har den samme aminosyresekvens som den til FR4 fra H-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoff med unntak av en aminosyre.

I den første versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff ble FR1 til FR3 gjort identisk med FR1 til FR3 fra humant HG3, og CDR ble gjort identisk med CDR fra V-regionen fra H-kjeden til muse anti-HM1.24 antistoffet, med unntak av at aminosyrene ved posisjon 30 i det humane FR1 og posisjon 71 i det humane FR3 ble gjort identisk med aminosyrene i mus anti-HM1.24 antistoffet.

2. Konstruksjon av V-regionen til L-kjeden i det rekonstituerte humane

anti-HM 1.24 antistoffet.

L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoffet ble konstruert ved påsetning av CDR i PCR-metoden. Fremgangsmåten er vist i fig. 4. Åtte PCR-primere ble benyttet for konstruksjon av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff (versjon a) med FR avledet fra det humane antistoff REI. De eksterne primere A (SEQ ID NO: 47) og H (SEQ ID NO: 48) ble oppbygget for å hybridisere med DNA-sekvensen til ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK.

Primerene for tilkopling av CDR L1S (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) og L3S (SEQ ID NO: 51) har sens DNA-sekvensen. Primerene for tilkopling av CDR L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) og L3A (SEQ ID NO: 54) har antisens DNA-sekvensen, der hver har en komplementær DNA-sekvens (20 til 23 bp) til DNA-sekvensen ved den 5'-ende av primerene henholdsvis L1S, L2S og L3S.

I det første stadium av PCR ble de fire reaksjoner A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A og L3S-H utført for å rense hvert PCR-produkt. De fire PCR-produkter fra den første PCR ble tillatt å koples sammen med hverandre ved hjelp av deres egen komplementaritet (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759). Deretter ble de eksterne primere A og H tilsatt for å forsterke full-lengde DNA som koder for V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff (den andre PCR-reaksjon). I den ovenfor nevnte PCR ble plasmid HEF-RVL-M21a (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 95-14041) som koder for versjon a av V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane ONS-M21 antistoff basert på det humane antistoff REI-avledet FR benyttet som en templat.

I det første stadium av PCR ble PCR-blandingen som inneholder 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM dNTPs, 1,5 mM MgCI2l 100 ng av templat DNA, 100 pmol av hver primer og 5 u av Ampli Taq benyttet. Hvert PCR-rør ble dekket med 50 \ i\ mineralolje. Deretter ble de første denaturert ved oppvarming til 94°C, og deretter utsatt for en reaksjonscyklus på 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt, hvoretter de ble inkubert ved 72°C i 10 minutter.

PCR-produktene A-L1A (215 bp), L1S-L2A (98 bp), L2S-L3A (140 bp) og L3SH (151 bp) ble renset ved å bruke 1,5% lav smeltepunkts agarosegel, og ble sammenkoplet i den andre PCR. I den andre PCR ble 98 |d PCR-blanding som inneholdt 1 \ ig hver PCR-produkter fra første stadium og 5 u av Ampli Taq inkubert i 2 cykler på 94°C i 2 minutter, 55°C i 2 minutt og 72°C i 2 minutt, og deretter ble 100 pmol hver av de eksterne primere (A og H) tilsatt. PCR-røret ble dekket med 50 \ i\ mineralolje og 30 cykler PCR ble utført under de samme betingelser som beskrevet over.

Et 516 bp DNA-fragment som resulterte fra den andre PCR ble renset ved å bruke 1,5% lavt smeltepunkts agarosegel, fordøyet med BamHI og Hindlll, og DNA-fragmentene som ble produsert på denne måte ble klonet inn i HEF ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK. Etter bestemmelse av DNA-sekvensen ble plasmidet som inneholdt DNA-fragmentet som hadde den korrekte aminosyresekvens til V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff benevnt plasmid HEF-RVLa-AHM-gK. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til L-kjeden som er inneholdt i dette plasmid HEF-RVLa-AHM-gtc blir vist i SEQ ID NO: 9, (aminosyresekvensen er angitt for seg i SEQ ID NO: 106, se konkordansoversikt på s. 83).

Versjon b av V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble konstruert ved mutagenese under bruk av PCR. Mutagene primere FTY-1 (SEQ ID NO: 55) og FTY-2 (SEQ ID NO: 56) ble bygget opp slik at de muterer fenylalanin i posisjon 71 tyrosin.

Etter at de ovenfor nevnte primere var amplifisert ved å bruke plasmidet HEF-RVLa-AHM-gic som templat blir sluttproduktet renset og fordøyet med BamHI og Hindlll. DNA-fragmentene fremskaffet på denne måte ble klonet inn i HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VL-gK for å fremskaffe plasmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til L-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVLb-AHM-gK blir vist i SEQ ID NO: 10.

3. Konstruksjon av V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

3-1. Konstruksjon av versjonene a til e av V-regionen til H-kjeden til det

rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

DNA som koder for V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff ble bygget opp som følger. Ved kopling av DNA-sekvensen som

koder for FR1 til 3 av det humane antistoff HG3 og FR4 fra det humane antistoff JH6 til DNA-sekvensen som koder for CDR til V-regionen til H-kjeden til mus anti-HM 1.24 antistoffet ble full-lengde DNA som koder V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff bygget opp.

Deretter ble Hindlll gjenkjennelsessetet/KOZAK konsensussekvensen og BamHI gjenkjennelsessetet/spleisedonorsekvensen tilkoplet henholdsvis 5'-ende og 3'-ende til denne DNA-sekvens, for å muliggjøre innføring av HEF-ekspresjonsvektoren.

DNA-sekvensen som ble bygget opp på denne måte blir delt i fire oligonukleotider. Deretter ble oligonukleotidene som potensielt hindrer sammenkopling av disse oligonukleotider utsatt for computeranalyse for å klarlegge sekundær-strukturen.

Sekvensene til de fire oligonukleotider RVH1 til RVH4 blir vist i SEQ ID NO: 57 til 60. Disse oligonukleotider har en lengde på 119 til 144 baser og har den 25 til 26 bp overlappende region. Blant oligonukleotidene har RVH2 (SEQ ID NO: 58) og RVH4 (SEQ ID NO: 60) sens DNA-sekvens, og RVH1 (SEQ ID NO: 57) og RVH3 (SEQ ID NO: 59) har antisens DNA-sekvens. Fremgangsmåten for å sammenkople disse fire oligonukleotider ved hjelp av PCR-metoden er vist i figuren (se fig. 5).

PCR-blandingen (98 uJ) som inneholdt 100 ng av hver av de fire olige-nukleotider og 5 u av Ampli Taq ble først denaturert ved oppvarming til 94°C i 2 minutter, og ble deretter utsatt for 2 inkubasjonssykler som omfattet 94°C i 2 minutter, 55°C i 2 minutter og 72°C i 2 minutter. Etter at 100 pmol av hver av RHP1 (SEQ ID NO: 61) og RHP2 (SEQ ID NO 62) ble tilsatt som den eksterne primer ble PCR-røret dekket med 50 jxl mineralolje. Røret ble deretter først denaturert ved oppvarming til 94°C i 1 minutt, og ble deretter utsatt for 38 sykler med 94°C i 1 minutt, 55°C i 1 minutt og 72°C i 1 minutt, og ble deretter inkubert ved 72°C i 10 minutter.

Det 438 bp DNA-fragment ble renset ved å bruke 1,5% lav smeltepunkts agarosegel, fordøyet med Hindlll og BamHI, og deretter klonet inn i HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VH-gy1. Etter bestemmelse av basesekvensen ble plasmidet som inneholder DNA-fragmentet som koder for aminosyresekvensen til den korrekte V-regionen i H-kjeden benevnt HEF-RVHa-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHa-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 11.

Hver av versjonene b, c, d og e fra V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble konstruert som følger.

Ved å bruke som mutagen primer BS (SEQ ID NO: 63) og BA (SEQ ID NO: 64) oppbygget for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl som et templat DNA ved hjelp av PCR-metoden ble versjon b amplifisert for å fremskaffe plasmid HEF-RVHb-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHb-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 12.

Ved å bruke som mutagen primeren CS (SEQ ID NO: 65) og CA (SEQ ID NO: 66) oppbygget for å mutere treonin i posisjon 73 til lysin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden ble versjon c amplifisert for å fremskaffe plasmid HEF-RVHc-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHc-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 13.

Ved å bruke som mutagen primer DS (SEQ ID NO: 67) og DA (SEQ ID NO: 68) konstruere for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og treonin i posisjon 73 til lysin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden ble versjon d amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHd-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHd-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO: 14.

Ved å bruke som mutagen primer ES (SEQ ID NO: 69) og EA (SEQ ID NO: 70) planlagt for å mutere valin i posisjon 67 til alanin og metionin i posisjon 69 til leucin og bruke plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl som templat DNA ble versjon E amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden som inneholdes i dette plasmid HEF-RVHe-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO: 15.

3.2 Konstruksjon av H-kjede hybrid V-region

To H-kjede hybrid V-regioner ble konstruert. Ett er et mus humant hybrid anti-HM1.24 antistoff der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra mus anti-HM 1.24 antistoffet og de til FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff, og den andre er humant muse hybrid anti-HM1.24 antistoff der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a til V-regionen til H-kjeden i det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra mus anti-HM1.24 antistoffet. Aminosyresekvensene til CDR-regionene er alle avledet fra mus anti-HM 1.24 antistoff.

To H-kjede hybrid V-regioner ble konstruert ved hjelp av PCR-metoden.

Fremgangsmåten er skjematisk vist i fig. 6 og 7. For å konstruere to H-kjede hybrid V-regioner ble fire primere benyttet. De eksterne primere a (SEQ ID NO: 71) og h (SEQ ID NO: 72) ble konstruert for å hybridisere med DNA-sekvensen til HEF-ekspresjonsvektoren HEF-VH-gy1. H-kjede hybrid konstruksjonsprimer HYS (SEQ ID NO: 73) ble konstruert for å ha sens DNA-sekvensen og H-kjede hybrid primer HYA (SEQ ID NO: 74) ble konstruert for å ha antisens DNA-sekvens slik at DNA-sekvensene er komplementær med henblikk på hverandre.

For konstruksjon av H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra mus anti-HM1.24 antistoffet og de til FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff, ble PCR som benyttet plasmidet HEF-1.24H-gy1 som templat, den eksterne primer a og H-kjede hybrid primeren HYS (SEQ ID NO: 73) og den eksterne primer h (SEQ ID NO: 72) utført i det første stadium av PCR og hvert PCR-produkt blir renset. De to PCR-produkte fra den første PCR blir tillatt å bindes sammen ved deres egen komplementaritet (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759).

Ved tilsetning av de eksterne primere a (SEQ ID NO: 71) og h (SEQ ID NO: 72) ble deretter et full-lengde DNA som koder for H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvesene til FR1 og FR2 er avledet fra muse anti-HM1.24 antistoffet og de til FR3 og FR4 er fra versjonen a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff amplifisert i det andre stadium av PCR.

For konstruksjon av H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra mus anti-HM1.24 antistoffet ble PCR i første stadium utført med plasmid HEF-RVHa-AHM-gyl som et templat, ekstern primer a og H-kjede hybrid primer HYA, og PCR ved bruk av plasmidet HEF-1.24H-gy1 som templat, H-kjede hybrid primer HYS og ekstern primer h utført i det første stadium av PCR, og hvert PCR-produkt ble renset.

De to PCR-rensede produkter fra den første PCR ble tillatt å sammenbindes ved deres egen komplementaritet (se internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92-19759). Deretter ble ved tilsetning av de eksterne primere a og h et full-lengde DNA som koder for H-kjeden hybrid V-region der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a i V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff og de fra FR3 og FR4 er fra mus anti-HM 1.24 antistoffet, amplifisert i det andre PCR-stadium.

Metodene for den første PCR, rensning av PCR-produkter, sammenkopling, den andre PCR og kloning inn i HEF ekpresjonsvektoren HEF-VH-gyl ble utført ifølge fremgangsmåtene vist i "Eksempel 9. Konstruksjon av V-regionen til L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff".

Etter bestemmelse av DNA-sekvensen ble plasmidet som inneholder DNA-fragmentet som koder for den korrekte aminosyresekvens til H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra mus anti-HM 1.24 antistoffet og de til FR3 og FR4 er fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane antistoff-HM1.24 antistoff benevnt HEF-MH-RVH-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-MH-RVH-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO: 75. På samme måte ble plasmidet som inneholder DNA-fragmentet som koder for den korrekte aminosyresekvens til H-kjede hybrid V-regionen der aminosyresekvensene til FR1 og FR2 er avledet fra versjon a til V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff og de til FR3 og FR4 er fra mus anti-HM 1.24 antistoffet benevnt HEF-HM-RVH-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-HM-RVH-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO: 76.

3-3. Konstruksjon av versjonene f til s av V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff

Hver av versjonene f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r og s av V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff ble konstruert sorti følger.

Under bruk av mutagen primer FS (SEQ ID NO: 78) og FA (SEQ ID NO: 79) oppbygget for å mutere treonin i posisjon 75 til serin og valin i posisjon 78 til alanin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHe-AHM-gyl ved hjelp av PCR-metoden ble versjon f amplifisert for å fremskaffe plasmid HEF-RVHf-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHf-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 16.

Ved bruk av mutagen primer GS (SEQ ID NO: 80) og GA (SEQ ID NO: 81) oppbygget for å mutere alanin i posisjon 40 til arginin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ble versjon g amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHg-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHg-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 17.

Ved å bruke som mutagen primer FS (SEQ ID NO: 78) og FA (SEQ ID NO: 79) og som templat DNA plasmidet HEF-RVHb-AHM-gyl ble versjon h amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHh-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 18.

Ved bruk av mutagen primer IS (SEQ ID NO: 82) og IA (SEQ ID NO: 83) oppbygget for å mutere arginin i posisjon 83 til alanin og serin i posisjon 84 til fenylalanin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon i amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHi-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHi-AHM-gyl blirvistiSEQIDN019.

Ved å bruke som mutagen primer JS (SEQ ID NO: 84) og JA (SEQ ID NO: 85) oppbygget for å mutere arginin i posisjon 66 til lysin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHf-AHM-gyl ble versjon j amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHj-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-. kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHj-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 20.

Ved å bruke som mutagen primer KS (SEQ ID NO: 86) og KA (SEQ ID NO: 87) oppbygget for å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin og som templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon k amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHk-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHk-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 21.

Ved å bruke som mutagen primer LS (SEQ ID NO: 88) og LA (SEQ ID NO: 89) beregnet på å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin og serin i posisjon 82B til isoleucin og som templat DNA bruke plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon I amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHI-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHI-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 22.

Ved å bruke som mutagen primer MS (SEQ ID NO: 90) og MA (SEQ ID NO: 91) beregnet på å mutere glutaminsyre i posisjon 81 til glutamin, serin i posisjon 82B til isoleucin og treonin i posisjon 87 til serin, og som templat DNA bruke plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon m amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHm-AHM-gyl . Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHm-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 23.

Ved å bruke som mutagen primer NS (SEQ ID NO: 92) og NA (SEQ ID NO: 93) beregnet på å mutere serin i posisjon 82B til isoleucin, og bruke som templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon n amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHn-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHn-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 24.

Ved å bruke som mutagen primer OS (SEQ ID NO: 94) og OA (SEQ ID NO: 95) beregnet på å mutere treonin i posisjon 87 til serin og bruke som templat DNA plasmidet HEF-RVHh-AHM-gyl ble versjon o amplifisert for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHo-AHM-gy1. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHo-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 25.

Ved å bruke som mutagen primer PS (SEQ ID NO: 96) og PA (SEQ ID NO: 97) beregnet på å mutere valin i posisjon 78 til alanin, og bruke som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl ble versjon p amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHp-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHp-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 26.

Ved å bruke som mutagen primer QS (SEQ ID NO: 98) og QA (SEQ ID NO: 99) beregnet på å mutere treonin i posisjon 75 til serin og bruke som templat DNA plasmidet HEF-RVHa-AHM-gyl blir versjon q amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHq-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHq-AHM-gyl blir vist i SEQ ID NO 27.

Ved å bruke som mutagen primer CS (SEQ ID NO: 65) og CA (SEQ ID NO: 66) og bruke som templat DNA plasmidet HEF-RVHp-AHM-gyl ble versjon r amplifisert ved PCR-metoden for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHr-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til H-kjeden inneholdes i dette plasmid HEF-RVHr-AHM-gy1 blir vist i SEQ ID NO 28.

Versjon s av V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble konstruert ved mutagenese under bruk av PCR. Mutagenprimerene SS (SEQ ID NO: 100) og SA (SEQ ID NO: 101) ble bygget opp for å mutere metionin i posisjon 69 til isoleucin.

Etter at den ovennevnte primer ble amplifisert ved bruk av plasmid HEF-RVHr-AHM-gyl som en templat ble sluttproduktet renset, fordøyet med BamHI og Hindlll, og DNA-fragmentet fremskaffet ble klonet inn i HEF ekspresjonsvektoren HEF-VH-gy1 for å fremskaffe plasmidet HEF-RVHs-AHM-gyl. Aminosyresekvensen og basesekvensen til V-regionen til L-kjeden inneholdt i dette plasmid HEF-RVHs-AHM-gyl ble vist i SEQ ID NO: 102.

Regionene som koder for den variable region til hver av de ovenfor nevnte plasmider HEF-RVLa-AHM-gic og HEF-RVHr-AHM-gyl ble fordøyet for å lage restriksjonsfragmenter med restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI. De ble innført i Hindlll og BamHI setene til plasmid vektor pUC19. Hvert plasmid ble benevnt pUC19-RVLa-AHM-gK og pUC19-RVHr-AHM-gyl.

Escherichia coli-bakterier som inneholder hver av plasmidene pUC19-RVLa-AHM-gK og pUC19-RVHr-AHM-gy1 ble benevnt henholdsvis Escherichia coli DH5ot (pUC19-RVLa-AHM-gK) og Escherichia coli DH5cc (pUC19-RVHr-AHM-gyl), og har blitt lagret internasjonalt på 29. august 1996 hos National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) under adgangsnummerene henoldsvis FERM BP-5645 og FERM BP-5643, under reglene som gjelder for Budapest-avtalen.

Regionene som koder for den variable region i det ovenfor nevnte plasmid HEF-RVHs-AHM-gyl ble fordøyet for å lage et restriksjonsfragment med restriksjonsenzymene Hindlll og BamHI. De ble innført i Hindlll og Barn Hl-setene til plasmid vektor-pUC19. Plasmidet fremskaffet ble benevnt pUC19-RVHs-AHM-gy1.

Escherichia coli-bakterier som inneholder plasmidet pUC19-RVHs-AHM-gyl ble benevnt Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1), og har blitt lagret internasjonalt 29. september 1997 hos National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) med adgangsnummer FERM BP-6127 ifølge reglene i Budapest-avtalen. 4. Konstruksjon av det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff,

kimære anti-HM 1.24 antistoffet og H-kjede hybridantistoffet

For å evaluere hver kjede av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff og det kimære anti-HM 1.24 antistoff som en positiv kontroll tillatt å bli uttrykket. Under konstruksjon av hver av versjon b og følgende fra V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff ble H-kjede hybridantistoffet tillatt å uttrykkes for å analysere hvilken aminosyresekvens i FR som skulle bli byttet ut. Det ble videre også uttrykket sammen med kimær H-kjeden for å evaluere versjon a av L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

4-1. Ekspresjon av det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff (1)

Ti |xg av både ekspresjonsvektoren (HEF-RVHa-AHM-gy1 til HEF-RVHr-AHM-gyl ) for H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff og ekspresjonsvektoren (HEF-RVLa-AHM-gic eller HEF-RVLb-AHM-gK) for L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble kotransformert inn i COS-7 celler ved elektroporering under bruk av Gene Pulser instrumentet (produsert av BioRad). Hvert DNA (10 u.g) ble tilsatt til 0,8 ml prøver med 1 x 10<7> celler/ml i PBS, og ble utsatt for pulser ved 1500 V og med en kapasitet på 25 uF.

Etter hvileperiode på 10 minutter ved romtemperatur ble de elektroporerte celler tilsatt 30 ml med DMEM kulturmedium (produsert av GIBCO) som inneholdt 10% y-globulinfritt føtalt bovihserum. Etter inkubering på 72 timer i C02 inkubatoren BNA120D (produsert av TABAI) ved 37°C og med 5% C02 ble kultur supernatanten innsamlet, celleavfallet ble fjernet ved sentrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter i en 15PR-22 sentrifuge (produsert av HITACHI) utstyrt med en sentrifugerotor 03 (produsert av HITACHI) og mikrokonsentratoren (Centricon 100, produsert av Amicon) ble ultrafiltrert ved å bruke en J2-21 sentrifuge (produsert av BECKMAN) utstyrt med en JA-20.1 sentrifugerotor (produsert av BECKMAN), og ble deretter benyttet i et Cell-ELISA.

Ekspresjon av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff (2)

Ti ug av hver av ekspresjonsvektorene (HEF-RVHs-AHM-gyl) for versjon "s" av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff og ekspresjonsvektoren (HEF-RVLa-AHM-gic) for L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff ble kotransformert inn i COS-7 celler ved elektroporering under bruk av Gene Pulser instrumentet (produsert av BioRad). Hvert DNA (10 ug) ble tilsatt til 0,8 ml prøver med 1 x 10<7> celler/ml i PBS, og ble utsatt for pulser ved 1500 V og med en kapasitet på 25 uF.

Etter hvileperiode på 10 minutter ved romtemperatur ble de eléktroporerte celler tilsatt 30 ml DMEM kulturmedium (produsert av GIBCO) som inneholdt 10% y-globulinfritt føtalt bovinserum. Etter inkubering i 72 timer i C02 inkubatoren BNA120D (produsert av TABAI) ved 37°C og med 5% C02 ble kultur supernatanten innsamlet, celleavfallet ble fjernet ved sentrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter i en 05PR-22 sentrifuge (produsert av HITACHI) utstyrt med en sentrifugerotor 03 (produsert av HITACHI) og mikrokonsentratoren (Centricon 100, produsert av Amicon) ble konsentrert ved ultrafiltrering under bruk av en J2-21 sentrifuge (produsert av BECKMAN) utstyrt med en JA-20.1 sentrifugerotor (produsert av BECKMAN). Filtratet ble filtrasjonssteriliset rved å bruke et filter, Millex GV13mm (produsert av Millipore), og ble deretter brukt til Cell-ELISA.

4-2. Ekspresjon av kimære anti-HM 1.24 antistoffet

Ved bruk av ti jig av hver av ekspresjonsvektorene HEF-1.24H-gy1 for H-kjeden til det kimære anti-HM 1.24 antistoff og ekspresjonsvektoren HEF-1.24L-gic for L-kjeden til det kimære anti-HM1.24 antistoff ble kimære anti-HM1.24 antistoffet, til bruk i Cell-ELISA, produsert ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for ekspresjon av det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff.

4-3. Ekspresjon av anti-HM 1.24 antistoffet omfattende versjon a av den

humaniserte L-kjede og kimære H-kjeden

Ved bruk av ti ug av hver av ekspresjonsvektorene HEF-1.24H-gy1 for H-kjeden til det kimære anti-HM1.24 antistoffet og ekspresjonsvektoren HEF-RVLa-AHM-gic for versjon a av L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff ble anti-HM 1.24 antistoffet omfattende versjon a til den humanisert L-kjede og kimære H-kjeden, til bruk i Cell-ELISA, produsert ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for ekspresjon av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

4-4. Ekspresjon av H-kjede hybrid antistoffet

Ved bruk av ti ug av hver av ekspresjonsvektorene (HEF-MH-RVH-AHM-gyl eller HEF-HM-RVH-AHM-gyl) for V-regionen til H-kjede hybridet og ekspresjonsvektoren HEF-RVLa-AHM-gic for L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble H-kjede hybridantistoffet, til bruk i Cell-ELISA, produsert ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for ekspresjon av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

4-5. Måling av antistoff-konsentrasjon

Konsentrasjonen av antistoffet som var fremskaffet ble målt ved hjelp av ELISA. Hver brønn i en 96-brønns ELISA-plate (Maxisorp, produsert av NUNC) ble immobilisert ved å tilsette 100 (il geit anti-humant IgG antistoff (produsert av BIO SOURCE) justert til en konsentrasjon på 1 ug/ml med dekningsbufferen (0,1 M NaHC03, 0,02% NaN3, pH 9,6) og inkubert i romtemperatur i en time. Etter blokkade med 100 uJ av en fortynningsbuffer (50 mM Tris-HCI, 1 mM MgCI2, 0,15 M NaCI, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% bovint serumalbumin (BSA), pH 8,1), ble 100 uJ av hver av seriefotrynninger av kultur supernatant fra COS-7 celler som frigjorde det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff, kimære anti-HM 1.24 antistoffet eller H-kjede hybridantistoffet som ble konsentrert ved filtrering til hver brønn, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking ble 100 (il alkalisk fosfatasemerket geit antihumant IgG-antistoff (produsert av DAKO) tilsatt.

Etter inkubasjon ved romtemperatur i en time og vasking ble 100 uJ av 1 ug/ml substratløsning (Sigma104, p-nitrofenylfosfat, SIGMA) oppløst i substrat-bufferen (50 mM NaHC03,10 mM MgCI2, pH 9,8) tilsatt, og absorbans ved 405 nm ble deretter målt ved bruk av MICORPLATE READER modell 3550 (produsert av Bio Rad). Som standard for måling av konsentrasjon ble humant IgGlK (produsert av The Binding Site) benyttet.

5. Etablering av CHO-cellelinjen som stabilt produserer det rekonstituerte

humane anti-HM1.24 antistoff

5-1. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren for H-kjeden til det rekonstituerte

humane anti-HM1.24 antistoff

Etter fordøying av plasmidet HEF-RVHr-AHM-gyl med restriksjonsenzymene Pvul og BamHI ble et omtrent 2,8 kbp-fragment som inneholdt DNA som koder for EF1-promoteren og V-regionen fra H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff renset ved å bruke 1,5% lavt smeltepunktsagarosegel. Det ovenfor nevnte DNA-fragment ble deretter innført i et omtrent 6 kbp-fragment som ble produsert ved å fordøye ekspresjonsvektoren benyttet for en human H-kjede ekspresjonsvektor, DHFR-AE-Rvh-PM1f (internasjonal søknadspublikasjon nr. WO 92/19759), som inneholder DHFR-genet og genet som koder for den konstante region fra en human H-kjede med Pvul og BamHI for å konstruere en ekspresjonsvektor, DHFR-AE-HEF-RVhr-AHM-gyl, for H-kjeden til det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff.

5-2. Geneintroduksjon i CHO-celler

For å etablere et stabilt produksjonssystem for det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff ble genene til de ovenfor nevnte ekspresjonsvektorene DHFR-AE-HEF-RVHr-AHM-gy1 og HEF-RVLa-AHM-gic som ble linearisert ved hjelp av fordøyelse med Pvul samtidig innført i CHO-cellen DXB11 ved elektroporeringsmetoden under samme betingelser som de ovenfor nevnte (transfeksjon inn i de ovenfor nevnte COS-7 celler).

5-3. Geneamplifikasjon med MTX

Blant CHO-celler med gener introdusert kan bare de CHO-celler der både L-kjeden og H-kjeden ekspresjonsvektorer har blitt introdusert overleve i nukleosidfritt Gc-MEM-kulturmedium (produsert av GIBCO-BRL) som har fått tilsatt 500 ug/ml G418 (produsert av GIBCO-BRL) og 10% bovint føtalt serum var tilsatt, og disse ble således utvalgt. Deretter ble 10 nM MTX (produsert av Sigma) tilsatt til det ovenfor nevnte kulturmedium. Blant de kloner som ble propagerte ble de som produserte det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff i store mengder utvalgt. Som et resultat ble klone 1 som fremviser en produksjonseffektivitet på omtrent 3 jig/ml av det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff fremskaffet, og benevnt den rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoffproduserende cellelinjer.

5-4. Konstruksjon av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

Det rekonstituerte anti-HM1.24 antistoff ble konstruert på ved den følgende fremgangsmåte. De ovenfor nevnte CHO-celler som produserer det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble dyrket i 10 dager i medium som bestod av det nukleosidfrie a-MEM kulturmedium (produsert av GIBCO-BRL) som hadde fått tilsatt 500 ug/ml G418 (produsert av GIBCO-BRL) og 10% yfritt føtalt bovint serum, under bruk at C02 inkubatoren BNAS120D (produsert av TABAI) under 37°C og 5% C02 betingelser. På dag 8 og 10 etter dyrkingsstart ble kulturvæsken samlet, celleavfallet ble fjernet ved sentrifugering i 10 minutter ved 2000 rpm ved å bruke sentrifuge RL-500SP (produsert av Tomy Seiko) utstyrt med TS-9 rotoren, og deretter filtrasjonssterilisert ved å bruket et flasketoppfilter (produsert av FALCON) som har med en membran på 0,45 u.m i porediameter.

Etter at en like stor mengde med PBS(-) ble tilsatt til kulturvæsken fra CHO-celler som produserer det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff affinitetsrenset ved å bruke høy-hastighets antistoffrensningssystemet ConSep LC100 (produsert av MILLIPORE) og hyper D protein A-søylen (produsert av Nippon Gaishi) der PBS(-) ble brukt som absorpsjons/vaskebuffer og 0,1 M natriumcitratbuffer (pH 3) ble brukt som elueringsbuffer ifølge de vedlagte instruksjoner. De eluerte fraksjoner ble justert til omtrent pH 7,4 ved umiddelbart å tilsette 1 M Tris-HCI (pH 8,0) og deretter å bruke sentrifugerings ultrafiltråsjonkonsentratoren Centriprep-10 (produsert av MILLIPORE), konsentrasjon og substitusjon til PBS(-) ble utført og preparatet ble filtrasjonssterilisert ved å bruke et membranfilter MILLEX-GV (produsert av MILLIPORE) med en porestørrelse på 0,22 (im for å fremskaffe dét rensede rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff. Antistoffkonsentrasjonen ble målt som absorbans ved 280 nm og kalkulert med 1 mg/ml som 1,35 OD.

Eksempel 11 Bestemmelse av aktivitet av det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff

Det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert med henblikk på den følgende antigenbindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet. 1. Fremgangsmåte for måling av antigenbindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet.

1 -1. Måling av antigenbindingsaktivitet

Antigenbindingsaktivitet ble målt ved hjelp av Cell-ELISA under bruk av WISH-celler. Cell-ELISA-plater ble forberedt som beskrevet i det ovenfor nevnte eksempel 7.1-2.

Etter blokkering ble 100 |xl seriefortynninger av det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff som ble fremskaffet fra konsentratet fra kultur supernatanten fra COS-7 celler eller renset fra kultur supernatanten fra CHO-celler tilsatt til hver brønn. Etter inkubering i 2 timer ved romtemperatur og vasking ble peroksydase-merket kanin anti-humant IgG antistoff (produsert av DAKO) tilsatt. Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur og vasking ble 100 |il substratløsning tilsatt i hver brønn. Etter hver inkubering ble reaksjonen stoppet med 50 |xl 6N svovelsyre og absorbans ved 490 nm ble målt ved bruk av MICROPLATE READER modell 3550 (produsert av Bio-Rad).

1- 2. Måling av bindingsinhibisjonsaktivitet

Bindingsinhibisjonsaktivitet av det biotinmerkede mus anti-HM 1.24 antistoff ble målt ved hjelp av Cell-ELISA under bruk av WISH-celler. Cell-ELISA-plater ble forberedt som beskrevet i det ovenfor nevnte eksempel 7.1-2. Etter blokking ble 50 (il seriefortynninger av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff som ble fremskaffet fra konsentratet av kultursupernatanten fra COS-7 celler eller renset fra kultursupernatanten fra CHO-celler tilsatt til hver brønn og 50 uJ av det biotinmerkede mus anti-HM 1.24 antistoff ble samtidig tilført. Etter inkubering ved romtemperatur i to timer og vasking ble peroksydasemerket streptavidin (produsert av DAKO) tilsatt. Etter inkubering ved romtemperatur i en time og vasking ble 100 (il substratløsning tilsatt til hver brønn. Etter inkubering ble reaksjonen stoppet med 50 (il 6N svovelsyre, og absorbans ved 490 nm ble målt ved bruk av MICORPLATE READER modell 3550 (produsert av Bio-Rad).

2. Evaluering av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

2- 1. L-kjede

Versjon a av L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som beskrevet for måling av antigenbindingsaktivitet. Som vist i fig. 8 kan sees at når versjon a av L-kjeden er uttrykt i kombinasjon med den kimære H-kjede har denne vist en lignende antigenbindingsaktivitet. Imidlertid, med henblikk på videre økning i aktivitet og med henblikk på kompatibilitet med H-kjeden ble versjon b av L-kjeden konstruert. Versjonene a og b av L-kjeden ble evaluert sammen med henblikk på antigenbindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet når de var kombinert med versjonen a, b, f eller h av H-kjeden. Som vist i fig. 9,10,11 og 12 hadde versjon a av L-kjeden en høyere aktivitet enn versjon b i begge disse analyser i alle versjonene a, b, f og h av H-kjeden. Derfor ble versjon a av L-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff benyttet for det følgende eksperiment.

2-2. H-kjede versjonene a til e

Versjonene a til e av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert i kombinasjon med versjon a av L-kjeden som nevnt for måling av antigenbindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet. Resultatet som vist i fig. 11,13,14 og 15 indikerte at alle versjonene viste svakere aktiviteter sammenlignet med kimære anti-HM1.24 antistoffet, noe som antydet at ytterligere aminosyresubstitusjoner blir krevet.

2-3. H-kjede hybridantistoffet

H-kjede hybridantistoffet ble evaluert som beskrevet for måling av antigenbindingsaktivitet. Resultatet, vist i fig. 16, viste at humane mus hybrid anti-HMl .24 antistoffet har vist den samme aktivitet som det kimære anti-HM 1.24 antistoff med henblikk på antigen bindingsaktivitet, mens mus humant hybrid anti-HMl .24 antistoff har en svakere aktivitet enn det kimære anti-HM 1.24 antistoff.

Dette antydet at for å konstruere det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff med en antigen bindingsaktivitet som er lik den til det kimære anti-HM 1.24 antistoff er det nødvendig å endre aminosyrene i FR3 eller FR4 blant de som utgjorde V-regionen av H-kjeden.

2-4. Versjon f til r av H-kjeden

Versjon f av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som beskrevet over på måling av antigen bindingsaktivitet. Resultatet som vist i fig. 17 indikerte at dets antigen bindingsaktivitet er senket sammenlignet med kimære anti-HM1.24 antistoffet, men er øket når sammenlignet med de ovenfor nevnte versjonene a til c, noe som antyder at en eller flere av fire aminosyrene i posisjon 67, 69, 75 dg 78 som ble endret på nytt i denne versjon er ansvarlig for aktiviteten til det rekonstituerte humane antistoff.

Versjon f av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som beskrevet over på måling av antigen bindingsaktivitet. Resultatet som vist i fig. 17 indikerte at dets antigen bindingsaktivitet er senket sammenlignet med kimære anti-HM 1.24 antistoffet, men er øket når sammenlignet med de ovenfor nevnte versjonene a til c, noe som antyder at en eller flere av fire aminosyrene i posisjon 67, 69, 75 og 78 som ble endret på nytt i denne versjon er ansvarlig for aktiviteten til det rekonstituerte humane antistoff.

Versjon h til j av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som beskrevet for måling av antigen bindingsaktivitet og bindings inhibisjonsaktivitet. Resultatet, som vises i fig. 20, 21, 22 og 23, indikerte at alle versjonene var svakere med henblikk på begge aktiviteter, sammenlignet med kimære anti-HM 1.24 antistoffet, og var istedenfor like med den ovenfor nevnte versjon f, noe som antyder at aminosyrene i posisjon 67 og 69 blant de fire aminosyrer som var blitt endret i versjon f, ikke er ansvarlig for økningen i aktivitet av det rekonstituerte humane antistoff.

Versjonene ktil p av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som nevnt for måling av antigen bindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet. Resultatet som vist i fig. 24, 25, 26 og 27, antydet at alle versjonene var svakere med henblikk på begge aktiviteter sammenlignet med kimære anti-HM 1.24 antistoffet og var likeverdig med den ovenfor nevnte versjon h, noe som antyder at aminosyrene i posisjon 80 og etter som var endret i disse seks versjonene ikke er ansvarlig for økningen i aktivitet til det rekonstituerte humane antistoff.

Versjon q av H-kjeden til det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert som beskrevet for måling av antigen bindingsaktivitet og bindings inhibisjonsaktivitet. Resultatet, vist i fig. 25 og 27 antydet at denne versjon var svakere med henblikk på begge aktiviteter sammenlignet med den ovenfor nevnte versjon h eller versjon p og hadde samme aktiviteter som den ovenfor nevnte versjon a, noe som antyder at substitusjon av aminosyrene i posisjon 78 er essensiell for økning i aktivitet i det rekonstituerte humane antistoff.

Versjon r av H-kjeden til det rekonstituerte humane humane anti-HM1.24 antistoff ble evaluert ved fremgangsmåten beskrevet over. Resultatet, vist i fig. 15

og 28 indikerte at versjon r har lignende nivå av antigen bindingsaktivitet og bindings inhibisjonsaktivitet sammenlignet med det kimære humane anti-HM 1.24 antistoff.

De ovenfor beskrevne resultater indikerer at den minimale endring som kreves for at det rekonstituerte humane humane anti-HM1.24 antistoff skal ha et lignende nivå av antigen bindingsaktivitet sammenlignet med muse anti-HM 1.24 antistoffet eller kimære anti-HM1.24 antistoffet er aminosyrene i posisjon 30,71 og 78, og videre 73.

Antigen bindingsaktiviteten og bindingsinhibisjonsaktiviteten for H-kjede versjonene a til r i det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff er sammenfattet i tabell 6.

2-5. Versjon s av H-kjeden

Versjon av s av H-kjeden i det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert sammen med den ovenfor beskrevne versjon a av L-kjeden som beskrevet for måling av antigen bindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet. Resultatet, vist i fig. 29 og 30, indikerte at versjon s har samme nivå av antigen bindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet som versjon r.

Som nevnt over bevarer det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff i den foreliggende oppfinnelse evnen til å binde til antigen selv etter at en eller flere aminosyrerester har blitt byttet ut med andre aminosyrer. Således inkluderer den foreliggende oppfinnelse det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff der en eller flere aminosyrerester har blitt byttet ut med andre aminosyrer i den variable region i H-kjeden eller L-kjeden så lenge det bevarer de opprinnelige egenskaper.

3. Evaluering av det rensede rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

Det rensede rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert med henblikk på de ovenfor beskrevne antigens bindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet. Resultatet, som vist i fig. 31 og 32, indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har lignende nivå av antigen bindingsaktivitet og bindingsinhibisjonsaktivitet som det kimære anti-HM 1.24 antistoff. Dette faktum indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har den samme antigen bindingsaktivitet som muse anti-HM 1.24 antistoffet.

Eksempel 12 Anti-tumor virkning av det kimære av anti-HM1.24 antistoff mot den humane myelom musemodell

1. Preparering av antistoff som skal tilføres

1 -1. Preparering av det kimære anti-HM1.24 antistoff

Det rensede kimære anti-HM 1.24 antistoff fremskaffet i det ovenfor beskrevne eksempel 6 ble konsentrert og bufferløsningen ble byttet ut med PBS(-) ved å bruke sentrifugerings ultrafiltrasjonskonsentratoren Centriprep 10 (produsert av Amicon). Preparatet ble filtreringssterilisert ved å bruke membranfilteret MILLEX-GV (produsert av MILLIPORE) med en porestørrelse på 0,22 |im. Konsentrasjonen ble justert til en konsentrasjon på 200 ug/ml ved å bruke filtersterilisert PBS(-), som ble benyttet for de følgende eksperimenter. Konsentrasjonen av antistoffet ble målt som absorbans ved 280 nm og kalkulert med 1 mg/ml som 1,35 OD.

1 -2. Rensning av kontroll humant lgG1

Humant lgG1 som ble benyttet som en kontroll for det kimære anti-HM1.24 antistoffet ble renset som følger. Etter at en lik mengde av PBS(-) ble tilsatt til Hu lgG1 kappa renset (produsert av BINDING SITE) ble det affinitetsrenset ved å bruke høyhastighetsantistoffrensningssystemet ConSep LC100 (produsert av MILLIPORE) og hyper D protein A søyle (produsert av Nippon Gaishi) ved bruk av PBS(-) som absorpsjonsbuffer og 0,1 M natriumcitratbuffer (pH 3) som elueringsbuffer ifølge de vedlagte instruksjoner. De eluerte fraksjoner ble justert til omtrent pH 7,4 ved umiddelbart å tilsette 1 M Tris-HCI (pH 8,0) og deretter å bruke sentrifugerings ultrafiltrasjonkonsentratoren Centriprep-10 (produsert av Amicon) for konsentrering og buffersubstitusjon til PBS(-), og filtrasjonssterilisering ved bruk av membranfilteret MILLEX-GV (produsert av MILLIPORE) med en porestørrelse på 0,22 um. Preparatet ble justert til 200 ug/ml ved bruk av filtreringssterilisert PBS(-) og benyttet til de følgende eksperimenter. Antistoffkonsentrasjonen ble målt som absorbans ved 280 nm og kalkulert med 1 mg/ml som 1,35 OD. 2. Fremgangsmåte for kvantitering av humant serum IgG i museserum Humant IgG tilstede i museserum ble kvantitert ved hjelp av den følgende ELISA. 100 ul geite anti-humant IgG fortynnet til en 1 ug/ml med 0,1 M bikarbonatbuffer (pH 9,6) ble tilsatt en 96-brønns plate (produsert av NUNC) og inkubert ved 4°C over natten for å immobilisere antistoffet. Etter blokking med 100 ul av seriefortynnet museserum eller humant IgG som standard (produsert av CAPPEL) tilsatt og inkubert ved romtemperatur i en time. Etter vasking ble 100 ul av 2000-gangers fortynnet alkalisk fosfatasemerket anti-humant IgG (produsert av CAPPEL) tilsatt og inkubert ved romtemperatur i en time. Etter vasking ble substratløsning tilsatt og inkubert, og absorbans ved 405 nm ble deretter mål ved bruk av MICORPLATE READER modell 3550 (produsert av Bio-Rad). 3. Anti-tumor virkning av det kimære anti-HM 1.24 antistoff mot den human myelom celletransplanterte mus

3-1. Konstruksjon av den human myelom celletransplanterte mus

Den human myelom celletransplanterte mus ble konstruert som følger. KPMM2-celler som var blitt passert in vivo med bruk av SCID-mus (produsert av Nihon CLA) ble preparert i en konsentrasjon på 3 x 10<7> celler/ml med RPM11640 medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (produsert av GIBCO-BRL). To hundre ul av KPMM2-cellesuspensjonen ble injisert via nålevenen i SCID-mus (hannmus, 8 uker gamle fra Nihon CLEA) som hadde fått 100 ul anti-asialo GM1 (produsert av Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.) intraperitonealt på den foregående dag.

3-2. Tilførsel av antistoff

På dag 12 etter KPMM2-celletransplantasjon ble serum oppsamlet fra de ovenfor beskrevne humane myelom celletransplanterte mus, og humant IgG i serum ble kvantitert ved å bruke ELISA f remgansmåten nevnt i 2. over. Etablering av KPMM2-celler i benmargen ble bekreftet ved økning av humant IgG-nivå i serum. På dag 14, 21 og 28 etter KPMM2-celletransplantasjon ble 100 ul av hvert av antistoffene produsert i 1 over, gitt intraperitonealt til disse musene.

3-3. Evaluering av anti-tumor effekten av det kimære anti-HM 1.24 antistoff

mot den humane myelom celletransplanterte mus

Anti-tumor effekten av det kimære anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert ved måling av musenes overlevelsestid. Som vist i fig. 33 viste musene som hadde fått kimære anti-HM 1.24 antistoff en forlenget overlevelse sammenlignet med musene som mottok kontroll humant lgG1. Det ble således bekreftet at kimære anti-HM 1.24 antistoffet har anti-tumoreffekt mot den human myelom celletransplanterte mus. Eksempel 13 Måling av ADCC-aktivitet til det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff

ADCC (antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet) aktivitet ble målt ifølge fremgangsmåten beskrevet i Current Protocols in Immunology, kap. 7, Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1. Preparering av effektorceller

Mononukleære celler ble renset fra perifert blod fra sunne individer ved hjelp av tetthetssentrifugeringsmetoden. En lik mengde av PBS(-) ble tilsatt til det perifere blod fra sunne individer, og lagt på toppen av Ficoll-Paque PLUS (produsert av Pharmacia), og ble sentrifugert ved 400 g i 40 minutter. Laget med mononukleære celler ble samlet opp, og vasket fire ganger med RPM11640 medium (produsert av GIBCO-BRL) forsterket med 10% føtalt bovint serum (produsert av GIBCO-BRL), og gjort klar ved en celletetthet på 5 x TO6 /ml med det samme dyrkningsmedium.

LAK (Limphokine Activated Killer Cell) ble indusert fra benmargscellene

i SCID-mus (produsert av Nihon CLEA). For dette formål ble benmargsceller isolert fra lårbenet hos musene og vasket to ganger med RPM11640 medium (produsert av GIBCO-BRL) supplementert med 10% føtalt bovint serum (produsert av GIBCO-BRL) og fortynnet til en celletetthet på 2 x 10<5>/ml med det samme dyrkningsmedium. Dette ble inkubert sammen med 50 ng/ml rekombinant humant IL-2 (produsert av

R & D SYSTEMS) og 10 ng/ml rekombinant mus GM-CSF (produsert av R & D SYSTEMS) i C02-inkubatoren (produsert av TABAI) i syv dager. Celletallet ble justert til 2 x 10<6>/ml med det samme dyrkningsmedium.

2. Preparering av målceller

Den humane myelom cellelinje KPMM2 (japansk ikke-gransket patentpublikasjon (Kokai) No. 7-236475) eller plasmacelle leukemi-avledede ARH-77 (ATCC CCL-1621) ble radioaktivt merket ved inkubering i RPM11640 mediet (produsert av GIBCO-BRL) tilsatt 10% føtalt bovint serum (produsert av GIBCO-BRL) sammen med 0,1 mCi 51 Cr-natriumkrkomat (produsert av ICN) ved 37°C i 60 minutter. Etter radioaktiv merking ble cellene vasket tre ganger med det samme dyrkningsmediet og justert til 2 x 10<5>/ml.

3. ADCC analyse

Til en 96-brønns plate med u-formet bunn (produsert av Becton Dickinson) ble tilsatt 50 ul av 2 x 10<5> målceller/ml, 50 ul av det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff, mus anti-HM1.24 antistoffet, kontroll humant lgG1 (produsert av THE BINDING SITE) eller kontroll mus lgG2a (UPC10, produsert av CAPPEL), og tillatt å reagere ved 4°C i 15 minutter.

Deretter ble 100 ul effektorceller dyrket i C02 inkubatoren i 4 timer, der ratio (E:T) av effektorcellene (E) til målcellene (T) ble satt til 0:1, 3,2:1, 8:1, 20:1 eller 50:1.

100 ul av supernatanten ble tatt og radioaktiviteten frisatt inn i supernatanten ble målt med en gammateller (ARC-300, produsert av Aloka). For måling av maksimal radioaktivitet ble 1% NP-40 (produsert av Nakalai) benyttet. Cytotoksisitet (%) ble kalkulert som (A-CV(B-C) x 100, der A er radioaktivitet (cpm) frisatt i nærvær av antistoff, B er radioaktivitet (cpm) frisatt av NP-40, og C er radioaktivitet (cpm) frisatt av kulturmedium alene uten antistoff.

Fig. 34 viser resultatet som oppnås når cellene produsert fra perifert blod fra friske humane individer ble benyttet som effektorcelle og KPMM2-celler ble benyttet som målcelle. Fig. 35 viser resultatet når cellene fra det perifere blod fra det friske individ ble benyttet som effektorcellen og ARH-77 ble benyttet som målcellen. Når det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff var tilsatt øket cytotoksisiteten med økning i antistoffkonsentrasjon sammenlignet med kontroll humant lgG1, noe som indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har ADCC aktivitet.

Videre øket cytotoksisiteten tydelig sammenlignet med mus anti-HM 1.24 antistoff når det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff ble tilsatt, noe som indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har høyere ADCC-aktivitet enn muse anti-HM 1.24 antistoffet. Videre ble ingen endring i cytotoksisitet observert når KPMM2 ble benyttet som målcellen, og det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff ble tilsatt i en konsentrasjon av 0,1 ug/ml eller høyere, noe som indikerer at konsentrasjonen på 0,1 ug/ml eller høyere har tilstrekkellig ADCC-aktivitet. Når ARH-77 ble benyttet som målcelle førte tilsetning av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff i konsentrasjon på 1 ug/ml eller høyere ingen endring i cytotoksisitet, noe som indikerer at konsentrasjon på 1 ug/ml eller høyere har tilstrekkelig ADCC-aktivitet.

Fig. 36 viser resultatet som oppnås når cellene preparert fra benmargen til SCID-mus ble benyttet som effektorceller. Når det rekonstituerte humane anti-HMl .24 antistoff ble tilsatt øket cytotoksisiteten med økning i antistoffkonsentrasjonen, sammenlignet med kontroll humant lgG1, noe som indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har ADCC-aktivitet. Videre førte tilsetning av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff med en konsentrasjon på 0,1 ug/ml eller høyere ikke til noen endring i cytotoksisitet, noe som indikerer at konsentrasjonen på 0,1 ug/ml eller høyere har tilstrekkelig ADCC-aktivitet.

Disse resultater viser at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har ADCC-aktivitet både når effektorcellene som benyttes er avledet fra mus og fra mennesker.

Eksempel 14 Anti-tumoreffekt av det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff mot den humane myelom-musemodell

1. Preparering av antistoff som skal tilføres.

Det rekonstituerte anti-HM1.24 antistoff fremskaffet ved introduksjon av plasmid HEF-RVLa-AHM-gic og plasmid HEF-RVHr-AHM-gyl inn i CHO-celler ble fortynnet til konsentrasjoner på 40, 200 og 1000 ug/ml ved bruk av filtreringssterilisert PBS(-) og kontroll humant lgG1 fremskaffet i eksempel 12.1-2 ble fortynnet til konsentrasjone rpå 200 ug/ml ved bruk av filtersterilisert PBS(-), som ble benyttet som antistoff for tilførsel.

2. Anti-tumorvirkning av det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff mot den human myelom celletransplanterte mus

2-1. Konstruksjon av den humane myelom celletransplanterte mus

De humane myelom celletransplanterte mus ble produsert ifølge beskrivelse i eksempel 12.3-1. Musene som ble benyttet var SCID-mus (fem uker gamle)

(produsert av Nihnon CLEA).

2-2. Tilførsel av antistoff

På dag 9 etter transplantasjon av KPMM2-celler ble serum samlet fra de ovenfor nevnte human myelom celletransplanterte mus beskrevet i ovenfor 2-1, og humant IgG i serum ble kvantitert ved å bruke ELISA beskrevet ovenfor i 12.2. Etablering av KPMM2-celler i benmargen ble bekreftet av økningen i humant IgG-nivå i serum. På dag 10 etter KPMM2-celletransplantasjon ble 100 ul av hver av antistoffene preparert ovenfor i 1 gitt intravenøst til disse mus.

2-3. Evaluering av anti-tumoreffekt av det rekonstituerte anti-HM1.24

antistoff på den humant myelom celletransplanterte mus Anti-tumoreffekten til det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert ved å se på endring i mengde av humant IgG i museserum og i musenes overlevelsesperiode.

Endring i mengden av humant IgG i museserum ble kvantitert i serum samlet opp på dag 35 etter transplantasjon av KPMM2-celler ved å bestemme humant IgG ved hjelp av ELISA benevnt i eksempel 12.2. Resultatene ble vist i fig. 37 og viser at mengden av humant IgG i serum på 35 etter transplantasjon av KPMM2-celle har øket omtrent 1000 ganger sammenlignet med nivå på dag 9 (dagen før antistoff-tilførsel) i kontroll humant lgG1 tilførselsgruppen, mens i gruppen tilført rekonstituert humant anti-HM 1.24 antistoff var nivået omtrent likt eller nedenfor det sett på dag 9 ved enhver dose, noe som antyder at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff hindret vekst av KPMM2-celler. På den andre side viser fig. 38 at gruppen tilført rekonstituerte humant anti-HM 1.24 antistoff hadde forlenget overlevelsestid sammenlignet med kontrollgruppen tilført i humant lgG1. De foregående resultater viser at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har anti-tumorvirkning mot humant myelom celletransplanterte mus.

Eksempel 15. Sammenligning av anti-tumoreffekt mellom det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff og det eksisterende medikament melfalan i den humane myelom-musemodell

1. Preparering av medikamenter som skal tilføres

1 -1. Preparering av antistoff som skal tilføres

Det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff fremskaffet ved introduksjon av plasmidet HEF-RVLa-AHM-gic og plasmidet HEF-RVHr-AHM-gyl inn i CHO-celler ble fortynnet til konsentrasjoner på 40 og 200 ug/ml ved å bruke filtersterilisert PBS(-), og kontroll humant lgG1 fremskaffet i eksempel 12.1-2 ble fortynnet til en konsentrasjon på 200 ug/ml ved å bruke filtersterilisert PBS(-), som ble benyttet som antistoffene som skulle tilføres.

1- 2. Preparering av melfalan

Melfalan (produsert av SIGMA) som er et eksisterende medikament brukt mot myelom ble fortynnet til en konsentrasjon på 0,1 mg/ml ved å bruke 0,2% karboksymetylcellulose (CMC) (produsert av Daicel Chemical Industries, Ltd.).

2. Anti-tumoreffekten av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff

og melfalan i human myelom-celletransplanterte mus

2- 1. Konstruksjon av human myelom-celletransplanterte mus

De human myelom celletransplanterte mus ble produsert ifølge eksempel 14.2-1.

2-2. Tilførsel av medikament

På dag 9 etter transplantasjon av KPMM2-celler ble serum samlet fra de ovenfor nevnte humane myelom celletransplanterte mus som ble preparert i ovenfor nevnte 2-1, og humant IgG i serum ble kvantitert ved å bruke ELISA beskrevet i den ovenfor nevnte 12.2. Etablering av KPMM2-celler i benmargen ble bekreftet av økning av humant IgG-nivå i serum. På dag 10 etter KPMM2-celletransplantasjon ble 100 ul av hver av antistoffene beskrevet i ovenfor nevnte 1 -1 gitt intravenøst til disse mus. Videre ble 200 ul 0,2% CMC-løsning gitt oralt en gang om dagen i fem dager fra dag 10 etter transplantasjon. I melfalantilførselgruppen ble melfalan-løsningen gjot rklar ovenfor i 1-2 gitt oralt i en mengde på 100 ul pr 10 g kroppsvekt (1 mg/kg som melfalan) en gang om dagen i fem dager fra dag 10 etter transplantasjon av KPMM2-celler.

2-3. Evaluering av anti-tumoreffekten til det rekonstituerte anti-HM 1.24

antistoff mot human myelom-celletransplanterte mus Anti-tumoreffekten til det rekonstituerte anti-HM 1.24 antistoff ble evaluert ved hjelp av endring i mengde av humant IgG i museserum og i musenes overlevelsestid.

Endring i mengde av humant IgG i museserum ble kvantitert i serum samlet opp på dag 35 etter transplantasjon av KPMM2-celler ved å bestemme humant IgG ved bruke av ELISA nevnt i eksempel 12.2. Resultat som vist i fig. 39 viste at mengden av humant IgG i serum på dag 35 etter transplantasjon av KPMM2-celler var øket omtrent 1000 ganger sammenlignet med det på dag 9 (dagen før antistoff-tilførsel) i kontroll humant lgG1 tilførselsgruppen, noe som antydet at KPMM2-celler vokste i disse mus. I melfalantilførselsgruppen syntes det også at mengde av serum human IgG var øket til høyere nivåer enn det observert før medikamenttilførsel, selv om konsentrasjonen ikke var så høy som i kontroll humant IgG tilførselsgruppen. Dette resultat indikerer at tilførsel av melfalan ikke førte til en komplett vekststopp for KPMM2-cellene. I motsetning var mengde av serum humant IgG mindre enn ved dag 9 etter transplantasjon i gruppen som fikk tilført rekonstituert humant anti-HMl .24 antistoff ved alle doser, noe som indikerer at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff undertrykket vekst av KPMM2-celler.

På den annen side viste også overlevelsesperioden som vist i fig. 40 å være forlenget i gruppen som fikk rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff tilført, sammenlignet med kontroll humant IgG tilførselsgruppen eller melfalantilførsels-gruppen. Fra disse foregående resultater kan det vises at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff har anti-tumoreffekt mot de human myelom-celletransplanterte mus, og at anti-tumoreffekten til det foreliggende antistoff er sterkere enn den til det eksisterende medikament melfalan.

De ovenfor nevnte resultater indikerer at når humant-avledede effektorceller ble benyttet hadde mus anti-HM 1.24 antistoff liten cytotoksisitet mot humane myelomceller, mens det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff og kimære anti-HMl .24 antistoffet viste sterk cytotoksisitet. Dette faktum indikerer betydningen av å humanisere antistoffet og gir håp om at det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff kan være brukbart hos mennesker.

Det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff har fremvist en meget sterk anti-tumoreffekt i den humane myelom celletransplanterte SCID-musemodell. Siden effektorcellene hos mennesker er avledet fra mennesker, og lymfocytter normalt er tilstede forventes en ytterligere sterkere anti-tumoreffekt av det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff.

I myelom-modellen har det rekonstituerte humane anti-HM 1.24 antistoff fremvist en sterk anti-tumoreffekt sammenlignet med det eksisterende medikament, og det forventes derfor at det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff vil bli et epokegjørende medikament for behandling av myelom.

Referanseeksempel 1 Konstruksjon av hybridomet som produserer mus anti-HMl .24 antistoff monoklonalt antistoff

Hybridomet som produserer mus anti-HM1.24 monoklonalt antistoff ble preparert ifølge fremgangsmåten beskrevet i Goto, T. et al., Blood (1994) 84,1992-1930.

Epstein-Barr virus nukleært antigen (EBNA)-negative plasma-cellelinje KPC-32 (1 x 10<7> celler) avledet fra benmargen til en human pasient med multippelt myelom (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) ble gitt intraperitonealt to ganger til BALB/c mus (produsert av Charles River) hver sjette uke.

For videre å øke titeren til antistoffproduksjon ble 1,5 x 10<6> KPC-32 celler injisert inn i musenes milt tre dager før avlivning av dyrene (Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Etter avlivning av musene ble milten fjernet, og miltcellene fjernet ifølge metoden til Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) ble fusjonert med myelomcellene SP2/0.

Antistoff i hybridomkultursupernatanten ble analysert med ELISA (Posner, M.R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) ved å bruke KPC-32 celledekkede plater. 5 x 104 KPC-32 celler ble suspendert i 50 ml PBS og fordelt i 96-brønns plater (u-bunnformet, Corning, produsert av Iwaki). Etter blokking med PBS som inneholdt 1 % bovint serumalbumin (BSA) ble hybridom supernatanten tilsatt og inkubert ved 4°C i 2 timer. Deretter ble peroksydasemerket geit anti-mus IgG antistoff tilsatt (produsert av Zymed) og reagert ved 4°C i 1 time, vasket, og så reagert med o-fenylendiaminsubstratløsning (produsert av Sumitomo Bakelite) ved romtemperatur i 30 minutter.

Etter at reaksjonen ble stoppet med 2N svovelsyre ble absorbans målt ved 492 nm ved å bruke ELISA-leser (produsert av Bio-Rad). For å fjerne hybridom som produserer antistoff mot humant immunglobulin ble den positive hybridomkultur supernatant absorbert til humant serum og reaktiviteten overfor andre sub-cellulære komponenter ble undersøkt. Positive hybridomer ble utvalgt og deres reaktivitet til ulike cellelinjer og humane prøver ble studert ved hjelp av strømningscytometri. De tilslutt selekterte hybridomkloner ble klonet to ganger, og ble injisert i bukhulen til pristanbehandlede BALB/c mus, hvoretter væske fra bukhulen ble fremskaffet fra disse.

Monoklonalt antistoff ble renset fra mus bukhulevæske ved ammoniumsulfatpresipitering og protein A-affinitetskromatografi (Ampure PA, produsert av Amersham). Det rensede antistoff ble konjugert til fluoresceinisotiocyanat (FITC) ved å bruke Quick Tag FITC-konjugeringsreagenssett (produsert av Boehringer Mannheim).

Som resultat reagerte de monoklonale antistoff produsert fra 30 hybridomkloner med KPC-32 og RPMI 8226-celler. Etter kloning ble reaktiviteten av supernatanten fra disse hybridomer med andre cellelinjer og mononukleære celler avledet fra perifert blod studert.

Blant disse produserte tre kloner monoklonale antistoff som spesifikt reagerte med plasmaceller. Fra disse tre kloner ble hybridomklonen som produserte monoklonalt antistoff som var best egnet for strømningscytometrianalyse og som har komplementavhengig cytotoksistet mot RPUI 8226 celler utvalgt og benevnt HM1.24. Subklassen av monoklonalt antistoff som var produsert av dette hybridom ble bestemt med ELISA ved å bruke subklassespesifikt kanin anti-mus antistoff (produsert av Zymed). Anti-HM 1.24 antistoff hadde subklassen lgG2A k. Hybridomet som produserer anti-HM1.24 antistoff ble internasjonalt deponert 14. september 1994 hos National Institute of Bioscience and Human-Technplogy, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, I ba I aki prefecture, Japan) med adgangsnummeret FERM BP-5233 ifølge reglene til Budapest-avtalen.

Referanseeksempel 2. Kloning av cDNA som koder for HM1.24 antigen polypeptid

1. Konstruksjon av cDNA bibliotek

1) Fremstilling av total RNA

cDNA som koder for HM1.24 antigenet som er et polypeptid som spesifikt gjenkjennes av mus anti-HM1.24 monoklonalt antistoff ble isolert som følger.

Totalt RNA ble fremstilt fra den humane multiple myelom cellelinjen KPMM2 ifølge metoden til Chrigwin et al. (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). 2,2 x 10<8> KPMM2-celler ble totalt homogenisert i 20 ml 4 M guanidintiocyanat (produsert av Nakalai tesque).

Homogenatet ble lagt på 5,3 M cesiumkloridlag i et sentrifugerer, som ble sentrifugert i en Beckman SW40-rotor med en hastighet på 31.000 rpm ved 20°C i 24 timer for å presipitere RNA. RNA-presipitatet ble vasket med 70% etanol og oppløst i 300 ul 10 mM Tris-HCI (Ph 7,4) som inneholdt 1 mM EDTA og 0,5% SDS.

Etter tilsetning av Pronase (produsert av Boehringer) til dette til sluttkonsentrasjon på 0,5 mg/ml ble preparatet inkubert ved 37°C i 30 minutter. Blandingen ble ekstrahert med fenol og kloroform for å presipitere RNA. RNA-presipitatet ble deretter oppløst i 200 ul 10 mM Tris-HCI (pH 7,4) som inneholdt 1 mM EDTA.

2) Fremstilling av poly(A)+RNA

Ved å bruke omtrent 500 ug total RNA fremstilt som beskrevet over som utgangsmateriale ble poly(A)+RNA renset ved å bruke Fast Track 2,0m RNA Isolation Kit (produsert åv Invitrogen) ifølge instruksjonene fra produsenten.

3) Konstruksjon av cDNA bibliotek

Ved å bruke 10 ug av det ovenfor beskrevne poly(A)+RNA som råmateriale ble dobbelt-trådet cDNA syntetisert ved å bruke cDNA syntese reagenssett TimeSaver cDNA Synthesis Kit (produsert av Pharmacia) ifølge instruksjonene fra produsenten, og ved å bruke Directional Cloning Toolbox (produsert av Pharmacia). EcoRI-adapter ble koplet til dette ifølge instruksjonene vedlagt. Kinasjon og behandling med restriksjonsenzym Noti av EcoRI adapteren ble utført ifølge vedlagte instruksjoner. Videre ble adapterbundet dobbelt-trådet cDNA med en størrelse på omtrent 500 bp eller over isolert og renset ved å bruke 1,5% lavt smeltepunkts agarosegel (produsert av SIGMA) for å fremskaffe omtrent 40 ul adapterkoplet dobbeltrådet cDNA.

Det adapterkoplede dobbelt-trådede cDNA fremstilt på denne måte ble koplet til pCOS1 vektor (japansk ikke-gransket patentpublikasjon (Kokai) 8-255196) som tidligere hadde blitt behandlet med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og alkalisk fosfatase (produsert av Takara Shuzo) med bruk av T4 for å konstruere DNA ligase (produsert av GIBCO-BRL) for å konstruere cDNA bibliotek. Det konstruerte cDNA bibliotek ble transdusert inn i Escherichia coli-stamme DH5a (produsert av GIBCO-BRL) og den totale størrelse ble estimert å være omtrent 2,5 x i 06 uavhengige kloner.

2. Kloning ved direkte ekspresjon

1) Transfeksjon inn i COSr7 celler

cDNA ble amplifisert ved å dyrke omtrent 5 x 105 kloner av de ovenfor transduserte Escherichia coli-bakterier i 2-YT medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) som inneholdt 50 ug/ml ampicillin, og plasmid-DNA ble gjenvunnet fra Escherichia coli ved alkalimetoden (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Plasmid DNA som ble fremskaffet ble transfektert inn i COS-7 celler ved hjelp av elektroporering med bruk av Gene Pulser-instrumentet (produsert av BioRad). 10 ug renset plasmid-DNA ble tilsatt til 0,8 ml COS-7celler som var suspendert 1 PBS ved en konsentrasjon på 1 x 10<7> celler/ml og ble utsatt for pulser ved 1500 V og med kapasitet på 25 uf. Etter 10 minutters hvileperiode ved romtemperatur ble de elektroporerte celler dyrket i DMEM (produsert av GIBCO-BRL) forsterket med 10% føtalt bovint serum ved 37°C og 5% C02 i tre dager.

2) Fremstilling av panning-platen

En panning-plate dekket med mus anti-HM 1.24 antistoff ble fremstilt ved fremgangsmåten til B. Seed et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, 3365-3369

(1987)). Mus anti-HM1.24 antistoffet ble tilsatt 50 mM Tris-HCI, pH 9,5 til konsentrasjon på 10 ug/ml. Tre ml antistoffløsning fremstilt på denne måte ble tilsatt en vevsdyrkningsplate med ep diameter på 60 mm og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter tre gangers vask med 0,15 M NaCI-løsning og blokking med PBS som inneholdt 5% føtalt bovint serum, 1 mM EDTA og 0,02% NaN3 ble disse plater benyttet for den følgende kloning.

3) Kloning av cDNA bibliotek

COS-7-cellene som var transfektert som beskrevet over ble løsgjort fra underlaget ved hjelp av PBS som inneholdt 5 mM EDTA og deretter vasket en gang med PBS som inneholdt 5% føtalt bovint serum. Disse cellene ble deretter suspendert i PBS som inneholdt 5% føtalt bovint serum <p>g 0,02% NaN3 til sluttkonsentrasjon på 1 x 10<6> celler/ml, som ble tilsatt panning-platen som var fremstilt som beskrevet over og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter tre gangers forsiktig vask med PBS som inneholdt 5% føtalt bovint serum og 0,02% NaN3 ble plasmid DNA gjenvunnet fra cellene som var bundet til panning-platen ved å bruke en løsning som inneholdt 0,6% SDS og 10 mM EDTA.

Det gjenvunnede plasmid-DNA ble igjen transdusert til Escherichia coli DH5ot. Etter amplifikasjon av plasmid-DNA som over ble det gjenvunnet ved alkalimetoden. Det gjenvunnede plasmid-DNA ble transfektert inn i COS-7 celler ved elektroporeringsmetoden, og plasmid-DNA ble gjenvunnet fra de bundne celler som beskrevet over. Den samme prosedyre ble gjentatt en gang til, og det gjenvunnede plasmid-DNA ble fordøyet med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti. Som resultat ble konsentrasjon av inserte med en størrelse på omtrent 0,9 kbp bekreftet. Escherichia coli transdusert med del av det gjenvunnede plasmid-DNA ble inokulert i 2-YT agarplaten som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. Etter dyrking over natt ble plasmid-DNA gjenvunnet fra en enkel koloni. Det ble fordøyet med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og klon p3.19 med et innskudd på 0,9 kbp ble fremskaffet.

Basesekvensen til denne klonen ble bestemt ved å benytte PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing kit (produsert av Perkin Eimer) ifølge instruksjonene som fulgte med settet og ved sekvensering med bruk av ABI 373A DNA-sekvensator (produsert av Perkin Eimer). Aminosyresekvensen og basesekvensen av dette blir vist i SEQ ID NO: 103.

cDNA som koder for polypeptidet med aminosyresekvensen beskrevet i SEQ ID NO: 103 ble innført i Xbal kløvingssetet i pUC19 vektoren, og har blitt fremstilt som plasmid pRS38-pUC19. Escherichia coli som inneholder dette plasmid pRS38-pUC19 har internasjonalt blitt deponert 5. oktober 1993 som Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19), hos National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) med adgangsnummeret FERM BP-4434 ifølge reglene til Budapest-avtalen (se japansk ikke-gransket patentpublikasjon (Kokai) No. 7-196694).

Industriell anvendbarhet

Siden kimære anti-HM 1.24 antistoffet består av den variable region til mus anti-HM 1.24 antistoffet og den konstante region til et humant antistoff, og det rekonstituerte humane anti-HM1.24 antistoff består av den komplementaritetsbestemmende region til mus anti-HM1.24 antistoff, rammeregionen til et humant antistoff, og den konstante region fra et humant antistoff har det lav grad av antigenisitet mot mennesker, og er derfor forventet å bli benyttet som en medisinsk blanding, spesielt for behandling av myelom.

Referanse til organismene som er donert

Den internasjonale deponeringsinstitusjon som er benyttet. Tittel: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI

Adresse: Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan 1. Escherichi coli DH5a (pRS 38-pUC19) Adgangsnummer: FERM BP-4434

Dato for donasjon: 5. oktober 1993

2. Mus-mus hybridom HM 1.24

Adgangsnummer: FERM BP-5233

Dato for donasjon: 27. april 1995

3. Escherichi coli DH5cc (pUC19-RVHr-AHM-gyl) Adgangsnummer: FERM BP-5643

Dato for donasjon: 29. august 1996

4. Escherichi coli DH5a(pUC19-1.24H-gy1) Adgangsnummer: FERM BP-5644

Dato for donasjon: 29. august 1996

5. Escherichi coli DH5a(pUC19-RVLa-AHM-gK) Adgangsnummer: FERM BP-5645

Dato for donasjon: 29. august 1996

6. Escherichi coli DH5a(pUC19-1.24L-gK) Adgangsnummer: FERM BP-5646

Dato for donasjon: 29. august 1996

7. Escherichi coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gyl) Adgangsnummer: FERM BP-6127

Dato for donasjon: 29. september 1997.

Aminosyresekvensen som er angitt sammen med DNA-sekvensen i de opprinnelige SEQ ID NO er nå angitt for seg i egne nye SEQ ID NO i henhold til følgende oversikt:

Claims

1. Rekonstituert human H-kjede til anti-HM 1.24 antistoffet, karakterisert ved at den omfatter:

(1) C-regionen til en human H-kjede, og

(2) V-regionen til en H-kjede som omfatter a) FR til en human H-kjede hvori aminosyren i posisjon 30 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR1 er treonin, aminosyren i posisjon 71 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin og b) CDR til kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser:

2. Rekonstituert human H-kjede ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte C-region til den humane H-kjede er humant Cy1-region, der nevnte FR til den humane H-kjede er avledet fra FR til det humane antistoff fra HSGI.

3. Rekonstituert human H-kjede ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte FR1-3 er avledet fra FR1-3 fra humant antistoff HG3 og nevnte FR4 er avledet fra FR4 fra humant antistoff JH6.

4. Rekonstituert human H-kjede ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte FR1-3 i hovedsak er den samme som FR1-3 til humant antistoff HG3 og nevnte FR4 er i hovedsak det samme som FR4 fra humant antistoff JH6.

5. H-kjeden til det rekonstituerte humane antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyren i posisjon 73 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er lysin.

6. Rekonstituert human H-kjede ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte V-region til H-kjeden har aminosyresekvensene representert som SEQ ID NO: 113, 115, 116, 117, 118,119, 120, 121, 122, 123, 125 eller 128.

7. Rekonstituert human antistoff fra anti-HM 1.24 antistoff omfattende: (A) en L-kjede som omfatter (1) C-regionen til en human L-kjede, og (2) V-regionen til en L-kjede som omfatter FR fra en human L-kjede og CDR fra L-kjeden til et anti-HM 1.24 antistoff, og (B) en H-kjede som omfatter (1) C-regionen til en human H-kjede, og (2) V-regionen til en H-kjede som omfatter a) FR til en human H-kjede hvori aminosyren i posisjon 30 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR1 er treonin, aminosyren i posisjon 71 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin og b) CDR til kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser:

8. Rekonstituert human antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte FR til den humane H-kjede er avledet fra FR til et humant antistoff fra HSGI, og nevnte C-region i deri humane H-kjede er human Cy1-region.

9. Rekonstituert human antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte FR1-3 til H-kjeden er avledet fra humant antistoff HG3, og nevnte FR4 fra H-kjeden er avledet fra FR4 fra humant antistoff JH6.

10. Rekonstituert human antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte V-region fra L-kjeden har aminosyresekvensene representert som SEQ ID NO: 106.

11. Rekonstituert human antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte V-region fra H-kjedén har aminosyresekvensen representert som SEQ ID NO: 113, 115, 116, 117,118,119,120,121,122,123,125 eller 128.

12. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede som omfatter: a) FR til en human H-kjede hvori aminosyren i posisjon 30 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR1 er treonin, aminosyren i posisjon 71 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin, og aminosyren i posisjon 78 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er alanin og b) CDR til H-kjeden har aminosyresekvensen representert av de følgende aminosyresekvenser:

13. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR er avledet fra FR fra det humane antistoff fra HSGI.

14. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR1-3 er avledet fra FR1-3 fra humant antistoff HG3.

15. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte FR1-3 er i hovedsak den samme som FR1-3 fra humant antistoff HG3.

16. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til H-kjeden til det rekonstituerte humane antistoff ifølge krav 12 der aminosyren i posisjon 73 ifølge definisjonene til Kabat i nevnte FR3 er lysin.

17. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 der nevnte V-region til H-kjeden har aminosyresekvensen fremstilt som SEQ ID NO: 113,115,116,117,118,119,120, 121,122, 123, 125 eller 128.

18. DNA, karakterisert ved at den koder for V-regionen til den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 12 som har nukleotidsekvensen beskrevet i SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 eller 102.

19. DNA, karakterisert ved at den koder for den rekonstituerte humane L-kjede til et anti-HM 1.24 antistoff som omfatter: (1) C-regionen til en human L-kjede, og (2) V-regionen til en L-kjede som omfatter FR fra en human L-kjede og CDR fra L-kjeden til et anti-HM 1.24 antistoff.

20. DNA ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte V-region til L-kjeden koder for aminosyresekvensen fremstilt som SEQ ID NO: 106.

21. DNA ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte V-region til L-kjeden har nukleotidsekvensen som beskrevet i SEQ ID NO: 9.

22. DNA ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte C-region i L-kjeden er CK-regionen til en human L-kjede.

23. DNA som koder for den rekonstituerte humane H-kjede til et anti-HM 1.24 antistoff som omfatter:

(1) C-regionen til en human H-kjede, og

(2) V-regionen til en H-kjede ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 18.

24. DNA som koder for den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte V-region fra H-kjeden har aminosyresekvensen representert som SEQ ID NO: 113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,125 eller 128.

25. DNA som koder for den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte V-region fra H-kjeden har nukleotidsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO: 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 eller 102.

26. DNA som koder for den rekonstituerte humane H-kjede ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte C-region til den humane H-kjeden er Cy1-regionen fra den humane H-kjede.

27. Vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 og 26.

28. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med en vektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 og 26.

29. Fremgangsmåte for produksjon av det rekonstituerte humane antistoff av anti-HMl .24 antistoff, karakterisert ved at den omfatter trinnene: dyrking av vertscelle som er kotransformert med ekspresjonsvektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 19, 20, 21 og 22, og en ekspresjonsvektor som omfatter DNA ifølge ethvert av kravene 12,13,14,15,16,17,18, 23, 24, 25 og 26, og gjenvinning av det ønskede antistoff.

30. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den inneholder som en aktiv ingrediens rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff ifølge krav 7.

31. Terapeutisk middel for myelom, karakterisert ved at det inneholder som en aktiv ingrediens rekonstituert humant anti-HM1.24 antistoff ifølge krav 7.