CZ117399A3

CZ117399A3 - Chimerní L řetězec, chimerní H řetězec, chimerní protilátka a způsob její přípravy, pozměněná lidská protilátka a způsob její přípravy, DNA, vektor, hostitelská buňka, farmaceutický prostředek a léčebné činidlo

Info

Publication number: CZ117399A3
Application number: CZ991173A
Authority: CZ
Inventors: Koichiro Ono; Toshihiko Ohtomo; Masayuki Tsuchiya; Yasushi Yoshimura; Yasuo Koishihara; Masaaki Kosaka
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 1999-09-15
Also published as: CA2267072C; TW530064B; CN1271205C; PL332742A1; EP0960936A4; CN1235639A; TR199900722T2; KR100388256B1; EP0960936B1; NO325178B1; WO1998014580A1; CA2267072A1; AU715156B2; US6699974B2; CN1765928A; US7892543B2; PL187642B1; BR9712488A; NO991591L; AU4399297A

Description

Chimerní L řetězec, chimerní H řetězec, chimerní protilátka a způsob její přípravy pozměněná lidská protilátka a způsob její přípravy, DNA, vektor, hostitelská buňka, farmaceutický prostředek a léčebné činidlo.

'lip*''

Oblast techniky

Předkládaný vynález pojednává o pozměněných lidských anti-HM 1.24 protilátkách a chimerních anti-HM 1.24 protilátkách, o genech, které je kódují, o způsobech přípravy těchto protilátek a o využití zmíněných protilátek. Pozměněné lidské protilátky anti-HM 1.24 a chimerní protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou užitečné jako léčebná činidla, např pro myelom.

Dosavadní stav techniky

Lidské B buňky procházejí řadou procesů, jež jsou klasifikovány na základě druhu exprimovaných povrchových antigenů a nakonec dozrávají v plazmatické buňky, které produkují protilátky. V konečném stupni jejich diferenciace, B buňky získávají na jedné straně schopnost produkovat cytoplazmatické imunoglobuliny a na straně druhé mizí s B buňkami asociované antigeny, jako jsou povrchové buněčné imunoglobuliny, HLA-DR, CD20, Fc receptory, receptory C3 komplementu a podobné (Ling, N. R. a kol., Leucocyte Typing III (1986) str. 320, Oxford, UK, Oxford).

Dosud byly publikovány práce o monoklonálních protilátkách, jako jsou antiPCA-1 (Anderson, K. C., a kol., J. Immunol. (1983) 130, 1132), anti-PC-1 (Anderson, K.

C., a kol., J Immunol. (1983) 132, 3172), anti-MM4 (Tong, A. M. W. a kol., Blood (1987) 69, 238) a podobných, které rozeznávají antigeny na buněčné membráně plazmatických buněk. Avšak anti-CD38 monoklonální protilátky jsou stále používány pro detekci plazmatických a myelomových buněk (Epstein, J. a kol., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L. W. Μ. M. a kol., Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. a kol., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, C. a kol., Am. J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. a kol., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H a kol., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. a kol., J.Exp. Med. (1993) 178, 1023).

Anti-CD38 monoklonální protilátka je antigen spojený spíše s aktivací T buněk, než antigen spojený s diferenciací B buněk a je exprimován spolu s B buňkami i na

různých buňkách jiných. Navíc, ačkoli CD38 není exprimován na některých lymfoplazmacytoidních buňkách, je silně exprimován na prekurzorech buněk krvetvorby. Z těchto důvodů se má za to, že anti-CD38 monoklonální protilátka není vhodná pro výzkum diferenciace a zrání lidských B buněk, nebo pro léčení nemocí plazmatických buněk.

Goto, T. a kol., popsali myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku, která rozeznává antigen o molekulové váze 29 až 33 kDa, který je exprimován specificky na liniích B buněk (Blood (1994) 84, 1922-1930). Protože se má za to, že antigen rozeznávaný anti-HM 1.24 monoklonální protilátkou souvisí s konečnou diferenciací B buněk (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691) a že podání anti-HM

1.24 monoklonální protilátky myši s transplantovaným plazmocytomem má za následek specifické hromadění protilátek na nádoru, (Shuji Ozaki a kol., The Program of General Assembly of the 19^th Japan Myeloma Study Meeting, generál presentation 3), bylo předpokládáno, že anti-HM 1.24 monoklonální protilátka značená radioizotopem, může být použita pro určení umístění nádoru, pro místně cílenou terapii, jako je radioimunoterapie a podobně.

Dále zde výše zmíněný časopis Blood popisuje, že anti-HM 1.24 monoklonální protilátka vykazuje cytotoxickou aktivitu k buňkám myelomové buněčné linie RPMI8226, závislou na komplementu.

Myelom je neoplastická nemoc, charakterizovaná hromaděním monoklonálních plazmatických buněk (myelomové buňky) v kostním morku. Myelom je nemoc, v níž koncově diferencované B buňky, produkující a sekretující imunoglobulíny, nebo plazmatické buňky, mají monoklonálně zvýšený počet hlavně v kostním morku a v souhlase s tím jsou v séru detekovány monoklonální imunoglobulíny, nebo jejich složky, L řetězce a H řetězce ( Masaaki Kosaka a kol., Nippon Rinsho (1995) 53, 9199).

Pro léčbu myelomu byly používány běžné chemoterapeutické prostředky, ale nebyly nalezeny efektivní léčebné prostředky, které by vedly k vymizení myelomu a prodloužení doby přežívání pacientů s myelomem. Proto je dlouho pociťována potřeba zavedení léků, které by měly léčebný účinek na myelom.

Myší monoklonální protilátky mají u lidí vysokou imunogenicitu (někdy označováno jako „antigenicita“). Tím je pro člověka lékařská léčebná hodnota myších monoklonálních protilátek omezena. Např. myší protilátky podané člověku mohou být • · • ·

3··· ···· ··· ·· ·· ·· ·· ·· metabolizovány jako cizorodá látka tak, že jejich poločas v člověku je relativně krátký a tudíž nemohou plně prokázat své očekávané účinky. Navíc proti podaným myším protilátkám vytvářené lidské anti-myší protilátky mohou spustit imunologické odezvy, které jsou pro pacienty nežádoucí a nebezpečné, jako je sérová nemoc, jiné alergické reakce a podobně. Proto nemohou být myší monoklonální protilátky podávány lidem často.

Aby se rozřešily tyto problémy, byla vyvinuta metoda pro snížení imunogenicity protilátek jiného, než lidského původu, jako jsou např. monoklonální protilátky odvozené z myší. Příkladem takové metody je způsob, jak vytvořit chimerní protilátku, jejíž variabilní oblast (V oblast) je odvozena z původní myší protilátky a konstantní oblast (C oblast) je odvozena ze vhodné lidské protilátky.

Protože takto získané chimerní protilátky obsahují variabilní oblast původní myší protilátky v neporušené podobě, dá se očekávat, že se budou vázat k antigenu se specificitou, která se shoduje se specificitou původní myší protilátky. Navíc v chimerní protilátce je podíl aminokyselinových sekvencí, odvozených z „nikoli lidského“ zdroje podstatně redukován a tak se dá očekávat, že protilátka bude mít ve srovnání s původní myší protilátkou nízkou imunogenicitu. Chimerní protilátka se může vázat k antigenu stejným způsobem jako původní myší monoklonální protilátka a může také vyvolat imunologické odpovědi proti myší variabilní oblasti, třebaže je imunogenicita snížena (LoBuglio, A. F. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

Druhý způsob snížení imunogenicity myších protilátek, třebaže je komplikovanější, může snížit potenciální imunogenicitu myších protilátek ještě daleko výrazněji. Při tomto způsobu je přenesena do variabilní oblasti lidské protilátky pouze oblast určující komplementaritu (CDR - complementarity determining region) z myší protilátky a vznikne tak pozměněná („reshaped“) variabilní oblast lidské protilátky.

Avšak, aby vzniklá struktura oblasti určující komplementaritu pozměněné variabilní oblasti lidské protilátky byla co možná nejpodobnější variabilní oblasti původní myší protilátky, když je to nezbytné, může být z variabilní oblasti myší protilátky do variabilní oblasti lidské protilátky přenesena i část aminokyselinové sekvence podpůrné oblasti (FR - framework region), která podporuje CDR. Následkem toho je tato V oblast zušlechtěné pozměněné lidské protilátky vázána ke konstantní oblasti lidské protilátky. Část, která je odvozena z „nikoli lidské“ aminokyselinové sekvence v konečné formě pozměněné zušlechtěné lidské protilátky, je CDR a pouze • · · • · část FR. CDR se skládá z hypervariabilních aminokyselinových sekvencí, které neobsahují druhově specifické sekvence. Proto zušlechtěná protilátka, nesoucí myší

CDR by neměla mít silnější imunogenicitu, než přirozená lidská protilátka obsahující

CDR lidské protilátky.

Pro informace, týkající se zušlechtěných protilátek viz Riechmann, L. a kol., Nátuře, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. a kol., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C. A. a kol., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Maeda, H. a kol., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S. D. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P. R. a kol., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M. S. a kol., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992 a Seto, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Queen a kol., (International Application Publication No. WO 90-07861) popisuje způsob přípravy zušlechtěných protilátek proti IL-2 receptoru Anti-Tac. Nicméně je obtížné zcela zušlechtit všechny protilátky postupem uveřejněným v WO 90-07861. WO 90-07861 nepopisuje obecný způsob zušlechťování protilátek, ale pouze popisuje způsob zušlechťování protilátek Anti-Tac, které jsou jedny z protilátek proti receptoru IL-2. Navíc, i když je postup uveřejněný v WO 90-07861 přesně reprodukován, je obtížné vytvořit zušlechtěné protilátky, které mají aktivitu zcela totožnou s původními myšími protilátkami.

Obecně se aminokyselinové sekvence CDR/FR jednotlivých protilátek od sebe liší. Současně i určení aminokyselinového zbytku, který má být zaměněn při konstrukci zušlechtěných protilátek a výběr aminokyselinového zbytku, kterým má být výše uvedený zbytek zaměněn, se u jednotlivých protilátek liší. Proto postup zušlechťování protilátek uveřejněný v WO 90-07861 nelze uplatnit pro zušlechťování všech protilátek.

V práci Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1989) 86, 10029-10033 je uveřejněno podobné zjištění, pokud se týká WO 90-07861. Je zde popsáno, že zušlechtěné protilátky, získané postupem, popsaným v WO 90-07861, měly pouze třetinovou aktivitu původních myších protilátek. Jinými slovy to ukazuje, že postupem uveřejněným v WO 90-07861 nelze připravit zušlechtěnou protilátku, s aktivitou shodnou s původní myší protilátkou.

Práce Co a kol., Cancer Research (1996) 56, 1118-11125 byla publikována výše zmíněnou skupinou Queen a kol. Tato práce popisuje, že zušlechtěné protilátky, ··· ··· · · · ···· · ···· · ·· s aktivitou rovnající se původním myším protilátkám, nelze konstruovat ani způsobem určeným pro tvorbu zušlechtěných protilátek, uveřejněným v WO 90-07861. Tedy se nejen ukazuje, že samotným způsobem podle WO 90-07861 nelze připravit zušlechtěnou protilátku s aktivitou totožnou s původní myší protilátkou, ale i že tento způsob konstrukce zušlechtěných protilátek uveřejněný v WO 90-07861, nelze aplikovat při zušlechťování všech protilátek.

Ohtomo a kol., Molecular Immunology (1955) 32, 407-416 popisuje zušlechťování myších protilátek ONS-M21. V této práci je ukázáno, že aminokyselinový zbytek, který byl navrhován pro zušlechtění protilátek Anti-Tac v WO 90-07861 nemá vztah k aktivitě, a způsob uveřejněný v WO 90-07861 nelze použít.

Kettlenborough a kol., Protein Eng. (1991) 4, 773-783 popisuje, že několik zušlechtěných protilátek bylo konstruováno z myší protilátky záměnou aminokyselinových zbytků. Nicméně bylo zapotřebí záměny více aminokyselinových zbytků, než bylo navrženo ve způsobu zušlechťování Anti-Tac protilátek, popsaném v WO 90-07861.

Tyto uvedené práce naznačují, že způsob tvorby zušlechtěných protilátek uveřejněný v WO 90-07861 je technika použitelná pouze pro Anti-Tac protilátku tam popsanou, a že dokonce použití zmíněné technologie nevede k aktivitě, která by se * rovnala aktivitě původní myší protilátky.

Původní myší protilátky, popsané v těchto pracech, mají aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence Anti-Tac protilátky, popsané v WO 90-07861. Současně i způsob konstrukce zušlechtěných protilátek, který bylo možno použít pro Anti-Tac protilátku, nelze použít pro protilátky jiné. Podobně, protože myší protilátka anti-HM 1.24, která je předmětem tohoto vynálezu, má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence Anti-Tac protilátky, způsob konstrukce zušlechtěné protilátky, použitý pro Anti-Tac protilátku, nelze použít. Navíc, úspěšně konstruovaná zušlechtěné protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence zušlechtěné Anti-Tac protilátky, popsané v WO 90-07861. Tato skutečnost také ukazuje, že stejný způsob nelze použít pro zušlechťování protilátek, které mají odlišné CDR-FR sekvence.

Tedy, ačkoli je původní myší protilátka pro zušlechťování známa, shoda CDR-FR sekvence zušlechtěné protilátky mající aktivitu, je potvrzena pouze metodou pokusu a omylu. V WO 90-07861 není zmínka o FR sekvenci, která je připojena k zušlechtěné

protilátce, konstruované podle předkládaného vynálezu, ani o tom, že aktivní zušlechtěná protilátka může být připravena připojením FR sekvence, která je mnohem menší než sekvence CDR.

Jak je zde výše zmíněno, očekává se, že zušlechtěné protilátky budou užitečné pro léčebné účely, ale zušlechtěná anti-HM 1.24 protilátka není známa, ani dokonce předpokládána. Navíc není dostupný standardizovaný způsob, který by byl obecně použitelný u kterékoli protilátky pro přípravu zušlechtěné protilátky, a mnoho vynalézavosti je potřeba při konstrukci zušlechtěné protilátky, která by vykazovala dostatečnou vazebnou aktivitu, vazebně inhibiční aktivitu a neutralizační aktivitu (např. Sáto, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje pozměněné anti-HM 1.24 protilátky. Dále předkládaný vynález popisuje chimerní protilátky člověk/myš, které jsou užitečné v průběhu konstrukce zmíněných pozměněných protilátek. Předkládaný vynález dále popisuje fragmenty pozměněných protilátek. Dále předkládaný vynález popisuje expresní systém pro přípravu chimerních protilátek, pozměněných protilátek a jejich fragmentů. Předkládaný vynález dále popisuje způsoby přípravy chimerních anti-HM

1.24 protilátek a jejich fragmentů, a rovněž pozměněných anti-HM 1.24 protilátek a jejich fragmentů.

Přesněji řečeno, předkládaný vynález popisuje chimerní protilátky a pozměněné protilátky, které specificky rozpoznají polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103. cDNA, kódující zmíněný polypeptid, byla vložena mezi štěpná místa pro Xbal ve vektoru pUC19, čímž byl připraven plazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, obsahující tento plazmid pRS38-p(JC19 byla uložena pro mezinárodní použití 5.října 1993 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) pod přístupovým číslem FERM BP-4434 podle ustanovení Budapešťské smlouvy (viz Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).

Jako konkrétní provedení takových chimérických protilátek nebo pozměněných protilátek je zmíněna chimerní protilátka anti-HM 1.24 nebo pozměněná lidská • · protilátka anti-HM 1.24. Podrobný popis chimerní protilátky anti-HM 1.24 nebo pozměněné lidské protilátky anti-HM 1.24 bude podán dále.

Zde předkládaný vynález také popisuje chimerní L řetězce, obsahující konstantní oblast (C oblast) lidského lehkého (L) řetězce a variabilní (V) oblast L řetězce anti-HM

1.24 protilátky, a chimerní H řetězec, obsahující konstantní oblast lidského těžkého (H) řetězce a V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Zde předkládaný vynález dále popisuje chimerní protilátky obsahující:

(1) L řetězec, obsahující C oblast lidského L řetězce a V oblast L řetězce antiHM 1.24 protilátky, a (2) H řetězec, obsahující C oblast lidského H řetězce a V oblast H řetězce antiHM 1.24 protilátky.

Zde předkládaný vynález dále popisuje V oblast pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, která obsahuje:

(1) podpůrnou oblast (FR) zV oblasti lidského L řetězce, a (2) CDR z V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a

V oblast pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:

(1) FR z V oblasti lidského H řetězce, a (2) CDR z V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Zde předkládaný vynález dále popisuje pozměněný lidský L řetězec anti-HM

1.24 protilátky, který obsahuje:

(1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR lidského z L řetězce a CDR z L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:

(1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR z lidského H řetězce a CDR z H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Zde předkládaný vynález dále popisuje pozměněnou lidskou protilátku anti-HM 1.24, která obsahuje:

(A) L řetězec obsahující (1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR z lidského L řetězce a CDR z L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a • · (Β) Η řetězec obsahující (1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast H řetězce, obsahujícího FR z lidského H řetězce a CDR z H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující V oblast L řetězce anti-HM 1.24 protilátky a DNA, kódující V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující chimerní L řetězec, obsahující:

(1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a DNA kódující chimerní H řetězec, obsahující:

(1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24, obsahující:

(1) FR z V oblasti lidského L řetězce, a (2) CDR z V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a

DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky obsahující:

(1) FR z V oblasti lidského H řetězce, a (2) CDR z V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a

Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující pozměněný lidský L řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:

(1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast z L řetězce, obsahující FR z lidského L řetězce a CDR z L řetězce anti-HM 1.24 protilátky,a

DNA kódující pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:

(1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast z H řetězce, obsahující FR z lidského H řetězce a CDR z H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje vektor, obsahující kteroukoli z různých DNA, uvedených výše.

Předkládaný vynález dále popisuje hostitelské buňky, transformované výše uvedeným vektorem.

• · · /-> ······· · y ····· ···· ♦··!

Předkládaný vynález také popisuje způsoby přípravy chimerních anti-HM 1.24 protilátek, které sestávají z pěstování hostitelských buněk, které byly kotransfekovány expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující výše uvedený chimemí L řetězec a expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující výše uvedený H řetězec a získání požadované protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje způsoby přípravy pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky, které sestávají z pěstování hostitelských buněk, které byly kotransfekovány expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující uvedený pozměněný lidský L řetězec a expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující uvedený pozměněný lidský H řetězec a získání požadované protilátky.

Předkládaný vynález dále popisuje farmaceutické prostředky, zvláště léčebné přípravky pro myelom, obsahující uvedenou chimerní protilátku nebo pozměněnou lidskou protilátku.

Předkládaný vynález dále popisuje farmaceutické prostředky, které obsahují jako aktivní složku chimerní protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci publikovanou v SEQ ID NO: 103 a farmaceutické prostředky, obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid s aminokyselinovou sekvencí publikovanou v SEQ ID NO. 103. Jako farmaceutický prostředek je zde publikováno léčebné činidlo pro myelom.

Způsob provedení vynálezu.

1) Konstrukce chimerní protilátky (1) Klonování DNA, kódující V oblast myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky

Příprava mRNA

Pro klonování DNA, kódující V oblast myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky byla ze získaného hybridomu za pomoci běžné metody, jako je ultracentrifugační metoda, používající guanidin (Chirgwin, J. M. a kol., Biochemistry (1979), 18, 52945299), nebo metody AGPC (Chomczinski, P. a kol., (1987), 162, 156-159) připravena celková RNA a z ní je připravena mRNA pomocí sloupců s Oligo(dT)-celulózou, které jsou součástí soupravy pro izolaci mRNA (vyráběno firmou Pharmacia). Navíc pomocí soupravy QuickPrep mRNA Purification Kit (vyráběno firmou Pharmacia) lze mRNA připravit bez extrakčního stupně celkové RNA.

Příprava a amplifikace cDNA • · · · · · ♦ · · · ···· · · · · · · ·· · ·· ··· ·· · · ··· ··· ··»···· · · ····· ·· · · ·· · ·

Z mRNA, získané ve výše uvedeném odstavci „Příprava mRNA“, byla pomocí reverzní transkriptázy syntetizována DNA jak V oblasti L řetězce, tak H řetězce. cDNA

V oblasti L řetězce je syntetizována pomocí soupravy AMV Reverse Transcriptase

First-Strand cDNA Synthesis Kit. Pro amplifikaci syntetizované cDNA byl použit vhodný primer, který hybridizuje s leader sekvencí a C oblastí protilátkového genu (např. MKV primer, mající sekvenci bází uvedenou v SEQ ID NO: 29 až 39 a MKC primer, mající sekvenci bází uvedenou v SEQ ID NO: 40).

Syntéza a amplifikace cDNA V oblasti H řetězce může být provedena pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) metodou 5-RACE (Frohman, M. A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988, Belyavsky, A. a kol., Nucl. Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) pomocí soupravy 5'-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH). K 5' konci cDNA syntetizované jak uvedeno výše, byl ligován Ampli FINDER Anchor, a jako primer pro amplifikaci V oblasti H řetězce může být použit primer, který specificky hybridizuje s Anchor primerem (SEQ ID NO: 77) a s konstantní oblastí (oblast Cy) myšího H řetězce (např. primer MHC2a, mající bázovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42).

Purifikace DNA a určení její sekvence bází

Byla provedena agarová gelová elektroforéza PCR produktu a známým postupem byl vyříznut požadovaný DNA fragment a DNA z něho byla vyizolována a vyčištěna a poté ligována do vektorové DNA.

DNA lze čistit pomocí dodávané soupravy (např. GENECLEAN II; BIO101).

K ligování DNA fragmentů lze použít některou známou vektorovou DNA (např. pUC19, Bluescript apod.).

Výše uvedená DNA a výše uvedená vektorová DNA mohou být ligovány běžnou ligační soupravou (vyráběna Takara Shuzo), čímž je získán rekombinantní vektor. Získaný rekombinantní vektor je potom vnesen do Escherichia coli JM109, poté jsou vybrány kolonie resistentní k ampicilinu a vektorová DNA je připravena na základě známého postupu (J. Sambrook, a kol., „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Po štěpení výše uvedené vektorové DNA restrikčnimi enzymy je známou metodou určena sekvence bází požadované DNA (např. dideoxynukleotidovou metodou) (J. Sambrook, a kol., „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbor Laboratory • · · · · · · · · · ···· 9 9 9 99 9 9 9 ·

Press, 1989). Při realizaci předkládaného vynálezu lze použít automatický sekvenační systém (DNA Sequencer 373A vyráběný ABI Co. Ltd.)

Oblast určující komplementaritu

V oblast z H řetězce a V oblast z L řetězce tvoří vazebné místo pro antigen, a jejich společné struktury mají podobné vlastnosti. Tak byla každá ze čtyř podpůrných oblastí (FR) ligována se třemi hypervariabilními oblastmi, tj. oblastmi určujícími komplementaritu (CDR). Aminokyselinové sekvence FR byly relativně dobře zachovány, zatímco mezi aminokyselinovými sekvencemi oblastí CDR je extrémně vysoká variabilita (Kabat, E. A. a kol., „Sequence of Proteins of Immunological Interest“, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Mnohé části výše uvedených čtyř oblastí FR zaujímá strukturu β-listu (β-sheet) a následkem toho tři CDR vytvářejí smyčky. CDR mohou někdy tvořit část β-listu. Tři CDR se v prostoru nacházejí ve vzájemné těsné blízkosti a tvoří vazebné místo pro antigen se třemi CDR v párovací oblasti.

Na základě těchto skutečností, aminokyselinová sekvence variabilní oblasti myší anti-HM 1.24 protilátky se porovnává s databází aminokyselinových sekvencí protilátek, připravenou Kabat, E. A. a kol., „Sequence of Proteins of Immunological Interest“, US Dept. Health and Human Services, 1983, aby se zjistila homologie a tím našly oblasti CDR.

(2) Konstrukce expresního vektoru pro chimerní protilátku

Jakmile je DNA fragment, kódující V oblastí myšího L řetězce a H řetězce myší monoklonální protilátky klonován, chimerní anti-HM 1.24 protilátku je možno získat připojením těchto myších V oblastí k DNA kódující konstantní oblast lidské protilátky a poté ji exprimovat.

Základní metoda pro konstrukci chimerní protilátky zahrnuje vazbu myší leader sekvence a sekvence V oblasti, která je přítomna v klonované cDNA, k sekvenci kódující C oblast lidské protilátky, již přítomné v expresním vektoru pro savčí buňky. Případně tato metoda zahrnuje vazbu myší leader sekvence a sekvence V oblasti, která je přítomna v klonované cDNA, k sekvenci kódující C oblast lidské protilátky a poté ligovat do expresního vektoru pro savčí buňky.

C oblastí lidské protilátky může být C oblast kteréhokoli H řetězce a C oblast kteréhokoli L řetězce. Jako příklad mohou být uvedeny Cy1, Cy2, Cy3 nebo Cy4 lidského H řetězce, nebo CA nebo Ck L řetězce.

«4 ·* · 4 · · · · • 44 4 4 4 4444

4444 4 4444 4 44 4

444 44 44 444 444

444 4444 4 4

4 4 4 ·4 4« 44 4·

Pro produkci chimerní protilátky jsou konstruovány dva typy expresních vektorů: jsou to expresní vektor obsahující DNA V oblasti myšího L řetězce a C oblast lidského L řetězce pod kontrolou expresně regulační oblasti, jako je systém enhancer/promotor a dále expresní vektor obsahující DNA V oblasti myšího H řetězce a C oblast lidského H řetězce pod kontrolou expresně regulační oblasti, jako je systém enhancer/promotor. Potom jsou za použití těchto expresních vektorů kotransfekovány hostitelské buňky, jako např. savčí buňky, a transformované buňky jsou pěstovány in vitro nebo in vivo a produkují chimérické protilátky (např. WO 91-16928).

Případně DNA kódující myší leader sekvenci a V oblast z L řetězce a C oblast z lidského L řetězce a DNA kódující myší leader sekvenci a V oblast z H řetězce a C oblast z lidského H řetězce, přítomné v klonované DNA, jsou vneseny do jednoho expresního vektoru (viz International Application Publication No. WO 94-11523) a hostitelská buňka je transformována za použití takovéhoto vektoru. Transformovaný hostitel je pak pěstován in vitro nebo in vivo a produkuje požadované chimerní protilátky.

(1) Konstrukce chimerního H řetězce

Expresní vektor pro H řetězec chimerní protilátky může být získán vnesením cDNA kódující V oblast myšího H řetězce do vhodného expresního vektoru, obsahujícího genomickou DNA nebo cDNA, kódující C oblast H řetězce lidské protilátky. Jako příklad C oblasti H řetězce je možno uvést např. Cy1, Cy2, Cy3 nebo Cy4.

Konstrukce expresního vektoru pro chimerní H řetězec obsahující Cy1 genomickou DNA

Jako expresní vektor, obsahující genomickou DNA pro Cy1 jakožto C oblast H řetězce, může být použit např. HFE-PMh-gy1 (International Application Publication No. WO 92/19759) nebo DHFR-AE-RVh-PM1f (International Application Publication No. WO 92/19759).

Aby bylo možno vložit cDNA kódující V oblast myšího H řetězce do těchto expresních vektorů, mohou tam být metodou PCR zavedeny vhodné bázové sekvence. Tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci bezprostředně před starovním kodonem, a PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací

• ·· • · • fl ··	flfl	• · • • flfl	• fl « fl • ·	• · fl •
fl •	V fl
flflfl	•	•	• ·	•
• fl ··		··	«·	··	flfl

sekvenci pro vhodný restrikční enzym a donorové místo sestřihu, kde je primární transkript genomické DNA vhodně sestřižen za vzniku mRNA.

Na takto konstruovanou DNA, kódující V oblast myšího H řetězce je působeno vhodnými restrikčními enzymy, pak je vnesena do výše uvedeného expresního vektoru, a tak může být zkonstruován vektor, obsahující Cy1 DNA a exprimující chimerní H řetězec.

Konstrukce expresního vektoru pro cDNA chimerního H řetězce

Expresní vektor, obsahující cDNA z Cy1 jako C oblast z H řetězce, může být konstruován následovně. Může být konstruován připravením mRNA z buněk CHO, v nichž byl integrován expresní vektor DHFR-AE-RVh-PM1f (International Application

Publication No. WO 92/19759), kódující genomickou DNA V oblasti H řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast Cy1 H řetězce lidské protilátky (N. Takahashi, a kol., Cell 29, 671-679, 1982) a expresní vektor RV1-PM1a (International Application

Publication No. WO 92/19759), kódující genomickou DNA V oblasti L řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast κ řetězce lidského L řetězce protilátky; dále klonováním cDNA, obsahující V oblast z H řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast Cy1 z H řetězce lidské protilátky pomocí RT-PCR metody a ligováním do vhodného expresního vektoru pro živočišné buňky, za použití míst pro vhodné * restrikční enzymy.

Aby bylo možno přímo ligovat cDNA, kódující V oblast myšího H řetězce k cDNA, obsahující C oblast Cy1 z H řetězce lidské protilátky, mohou být pomocí PCR metody zavedeny vhodné bázové sekvence. Např. tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci bezprostředně před starovním kodonem, a PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym, použitý pro přímou ligaci C oblasti Cy1 z H řetězce.

Expresní vektor, obsahující cDNA chimerního H řetězce, může být konstruován tak, že na takto konstruovanou DNA, kódující V oblast myšího H řetězce je působeno vhodným restrikčním enzymem, poté je ligována k výše zmíněné cDNA, obsahující C oblasti Cy1 H řetězce a nakonec vložena do expresního vektoru, jako je pCOSl nebo pCHOl.

2) Konstrukce L řetězce chimerní protilátky

• ·

Expresní vektor pro L řetězec chimérické protilátky může být získán spojením cDNA kódující V oblast myšího L řetězce s genomickou DNA nebo cDNA, kódující C oblast L řetězce lidské protilátky, a poté vnesením do vhodného expresního vektoru. Jako příklad C oblasti L řetězce je možno uvést κ řetězec nebo λ řetězec.

Konstrukce expresního vektoru pro κ řetězec cDNA chimerního L řetězce. Aby bylo možno konstruovat expresní vektor, obsahující cDNA kódující

V oblast myšího L řetězce, mohou být pomocí PCR metody zavedeny vhodné bázové sekvence. Např. tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci a PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym.

Kappa řetězec (κ) C oblasti lidského L řetězce pro vazbu k V oblasti myšího L řetězce, může být vytvořen např. zHEF-PM1k-gk (International Application Publication No. WO 92/19759), obsahujícího genomickou DNA. Expresní vektor pro κ řetězec L řetězce cDNA chimérické protilátky může být konstruován vnesením rozpoznávacích sekvencí pro vhodné restrikční enzymy pomocí metody PCR na 5' konec nebo 3' konec DNA, kódující κ řetězec C oblasti L řetězce, ligováním takto konstruované V oblasti myšího L řetězce ke κ řetězci C oblasti L řetězce a posléze vložením do expresního vektoru, jako je pCOS1 nebo pCHO1.

2. Konstrukce pozměněné lidské protilátky (1) Navržení V oblasti pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

Aby bylo možno konstruovat pozměněnou lidskou protilátku, v níž by

CDR z myší monoklonální protilátky byla připojena k lidské protilátce, je žádoucí, aby existovala vysoká homologie mezi FR myší monoklonální protilátky a FR lidské protilátky. V oblasti z L řetězce a H řetězce myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky byly tedy za pomoci Protein Data Bank porovnány s V oblastmi všech známých protilátkek, jejichž struktury byly objasněny.

V oblast z L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci podskupiny IV V oblasti z L řetězce lidské protilátky (HSGIV), přičemž homologie je 66,4 %. Na druhé straně vykazuje 56,9% homologii s HSGI, 55,8% s HSGII a 61,5% homologii s HSGIII.

• ·

Pokud je V oblast z L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky, porovnána s V oblastmi z L řetězce známých lidských protilátek, vykazuje 67,0% homologii s V oblastí z L řetězce lidské protilátky REI, jedné z I podskupiny V oblastí L řetězce lidské protilátky. Proto byla FR z REI použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Byla navržena verze V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. V této verzi byla FR lidské protilátky vytvořena totožně s FR oblastí odvozenou z REI, která je již přítomna v pozměněné lidské CAMPATH-1H protilátce (viz Riechmann, L. a kol., Nátuře 322, 21-25, (1988), s FR oblastí, obsaženou ve verzi

V oblasti L řetězce pozměněné lidské PM-1 protilátce popsané v International Application Publication No. WO 92-19759, a myší CDR byla vytvořena shodně s CDR z

V oblasti L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.

Oblast V z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci V oblasti z H řetězce lidské protilátky (HSGI) s homologii 54,7 %. Na druhé straně vykazuje 34,6% homologii s HSGII a 48,1% homologii s HSGIII. Když je V oblast z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblastí z H řetězce známých lidských protilátek, FR1 až FR3 byly nejvíce podobné V oblasti H řetězce lidské protilátky HG3, jedné z I podskupiny V oblasti lidského H řetězce (Rechavi, G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), kdy homologie je 67,3 %.

Proto byla FR lidské protilátky HG3 použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Avšak, protože aminokyselinová sekvence FR4 lidské protilátky HG3 nebyla popsána, aminokyselinová sekvence FR4 z lidské protilátky JH6 (Ravetch, J. V. a kol., Cell, 27, 583-591), která vykazuje nejvyšší homologii s FR4 myší anti-HM 1.24 protilátky, byla použita jako FR4. FR4 z JH6 má kromě jedné aminokyseliny sekvenci shodnou s FR4 z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.

V první verzi a V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly FR1 až FR3 vytvořeny shodně s FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3, kromě toho, že aminokyseliny v pozici 30 v lidské FR1 a v pozici 71 v lidské FR3 byly shodné s aminokyselinami myší anti-HM 1.24 protilátky a CDR byla vytvořena shodně s CDR V oblasti H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.

(2) Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

Řetězec L pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky je konstruován připojením CDR oblasti pomocí PCR metody. Postup je schematicky znázorněn na Obr. 4. Při konstrukci pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (verze a), která má FR odvozenou z lidské protilátky REI, bylo použito osm PCR primerů. Vnější primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí HEF expresního vektoru HAF-VL-gK.

Primery L1S (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3S (SEQ ID NO: 51) mají negativní DNA sekvenci. Primery L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) a L3A (SEQ ID NO: 54) mají pozitivní DNA sekvenci, přičemž každý mají komplementární DNA sekvence (20 až 23 bázových párů) s DNA na 5'-konci primerů L1S, L2S a L3S.

V prvním stupni PCR byly provedeny 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3S-H a každý PCR produkt byl vyčištěn. Čtyřem PCR produktům z prvních PCR bylo umožněno vzájemné sestavení na základě jejich vlastní komplementarity (viz WO 9219759). Poté byly přidány vnější primery A a H a byla amplifikována celková délka DNA kódující V oblast L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (druhá PCR). Ve výše uvedené PCR může být jako matrice použit plazmid HEF-RVL-M21a (viz. International Application Publication No. WO 95-14041), kódující verzi a V oblasti z L řetězce pozměněné lidské ONS-M21 protilátky, založené na FR odvozené z lidské protilátky REI.

V prvním stupni PCR byla použita matricová DNA a každý z primerů.

PCR produkty A-L1A (215 bázových párů), L1S-L2A (98 bázových párů),

L2S-L3A (140 bázových párů) a L3S-H (98 bázových párů) byly čištěny za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy a byly sestaveny v průběhu 2. PCR. Ve druhé PCR byly použity všechny produkty první reakce a oba vnější primery (A a H).

Fragment dlouhý 515 bázových párů, který je výsledkem druhé PCR byl čištěn za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy, štěpen BamHI a HindlII, a takto získané DNA fragmenty byly klonovány do expresního vektoru HEF-VL-gx. Po určení DNA sekvence byl plazmid, obsahující správnou aminokyselinovou sekvenci V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, označen jako HEF-RVLa-AHM-gx. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVLa-AHM-gx jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9.

Verze b V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky může být vytvořena mutagenezí pomocí PCR. Mutační primery ΠΎ-1 (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) jsou navrženy tak, aby mutovaly fenylalanin v pozici 71 na tyrozín.

Po amplifikaci výše uvedených primerů za použití plazmídu HEF-RVLaAHM-gr jako matrice, byl získaný produkt vyčištěn. Po štěpení BamHI a HindlII byly získané DNA fragmenty klonovány do expresního vektoru HEF-VL-gK a získán tak plazmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVLb-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.

(3) Konstrukce V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

3-1. Konstrukce verzí a až e V oblasti H řetězce pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky

DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky může být navržena následujícím způsobem. Připojením DNA sekvence kódující FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3 a FR4 z lidské protilátky JH6 k DNA sekvenci kódující CDR z V oblasti H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky, může být získána plná délka DNA, kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Poté je na 5' konec připojeno cílové místo pro HindlII spolu s Kozákovou konvenční sekvencí, na 3' konec je připojeno cílové místo pro BamHI spolu s donorovou sekvencí pro sestřih tak, aby bylo umožněno připojení do HEF expresního vektoru.

Takto uspořádaná DNA sekvence byla rozdělena do čtyř oligonukleotidů. Poté byly oligonukleotidy, které by potenciálně mohly bránit sestavení těchto oligonukleotidů, podrobeny počítačové analýze sekundárních struktur.

Sekvence čtyř oligonukleotidů RVH1 až RVH4 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO: 60. Tyto oligonukleotidy mají délku 119 až 144 bází a obsahují 25 až 26 bázových párů dlouhé překrývající se oblasti. Z těchto oligonukleotidů mají RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RVH4 (SEQ ID NO: 60) negativní DNA sekvenci, zatímco RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) mají pozitivní DNA sekvenci. Postup • « · ·· · 3 ·· • · · · · · · · · ···· ♦ ···· · ·· • « · · · ·· · · ··· β«· ···· · ····· · · · · · · pro sestavení těchto čtyř oligonukleotidů pomocí metody PCR je ukázán na obrázku (viz Obr. 5).

PCR byla provedena za použití čtyř oligonukleotidů a RHP1 (SEQ ID NO:

61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) jako vnějších primerů.

Amplifikovaný, 438 bázových párů dlouhý DNA fragment byl čištěn, štěpen Hindlll a BamHI a poté klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1. Po určení sekvence bází byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci V oblasti H řetězce označen jako HEF-RVHa-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11.

Jednotlivé verze b, c, d a e V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky jsou konstruovány následovně. Při konstruování verze b a dalších verzí V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, lze zkonstruovat trojrozměrný strukturální model V oblasti myší anti-HM 1.24 protilátky, aby bylo možno předpovědět polohy aminokyselinových zbytků, které budou v molekule protilátky zaměněny.

Za použití mutačních primerů BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze b amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHb-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHb-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

12.

Za použití mutačních primerů CS (sekvence 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze c amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHc-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHc-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO.

13.

Za použití mutačních primerů DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin a threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze d amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHd-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence • · · ·····*· · · • · · · · ·· · · · · · · a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHd-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 14.

Za použití mutačních primerů ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 67 na alanin a methionin v poloze 69 na leucin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze e amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15.

3-2. Konstrukce H řetězce hybridní V oblasti

Konstruováním H řetězce hybridní V oblasti je možno zkoumat, která

FR V oblasti zušlechtěné protilátky přispívá k vazebné aktivitě a která k inhibování vazebné aktivity. U dvou, které byly zkonstruovány, jedna měla aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (hybridní anti-HM 1.24 protilátka myš/člověk), zatímco druhá měla aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky (hybridní anti-HM 1.24 protilátka člověk/myš). Aminokyselinové sekvence CDR oblastí jsou celé odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky.

Dva H řetězce hybridních V oblastí byly konstruovány pomocí metody PCR. Metoda je schematicky ukázána na Obr. 6 a Obr. 7. Pro konstrukci dvou H řetězců hybridních V oblastí mohou být použity čtyři primery. Vnější primery a (SEQ ID NO. 71) a h (SEQ ID NO: 72) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1. Konstrukční primer HYS (SEQ ID NO: 73) hybridního H řetězce je navržen tak, že má negativní DNA sekvenci a hybridní primer HYA (SEQ ID NO. 74) H řetězce má pozitivní DNA sekvencí tak, že obě DNA sekvence jsou vzájemně komplementární.

Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 jsou z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda s plazmidem HEF-1.24Hgy1 jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA pro H řetězec, a dále pak PCR ··· · 4 4 4 · · 4 • · · · 4 4 4 4 « 4 · · ······ 4 · ····« 44 · 4 4 4 · · metoda, používající jako matrici plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, hybridní primer pro H řetězec HYA a vnější primer h, a produkty obou PCR reakcí byly vyčištěny.

Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759). Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně syntetizována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda s plazmidem HEF-RVHaAHM-gy1 jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA pro H řetězec, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-1.24H-gy1, hybridní primer pro H řetězec HYS a vnější primer h, a produkty obou PCR reakcí byly vyčištěny.

Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759). Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně syntetizována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky.

PCR reakce prvního stupně, čištění PCR produktů, sestavení PCR produktů, PCR reakce druhého stupně a klonování do HEF expresního vektoru HEFVH-gy1 byly provedeny podle postupu uvedeného v „Příkladu 9. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky“. Po určení DNA sekvence byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky nazván HEFMH-RVH-AHM-gy1.

• · · · · ·· · • · · · ···· · · · · ······ · · • · ·· · · ·· ··

Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-MH-RVH-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 75.

Také plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-HMRVH-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-HM-RVH-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 76.

3-3. Konstrukce verzí f až s V oblasti H řetězce pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky

Každá z verzí f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H řetězce zušlechtěné lidské anti-HM 1.24 protilátky je konstruována následujícím způsobem. Při konstruování verze f a dalších verzí V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky, lze zkonstruovat trojrozměrný strukturální model V oblasti myší anti-HM

1.24 protilátky jak bylo uvedeno výše, aby bylo možno předpovědět polohy aminokyselinových zbytků, které budou v molekule protilátky zaměněny.

Za použití mutačních primerů FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin a valin v poloze 78 na alanin a DNA plazmidů HEF-RVHe-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze f amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHf-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-RVHf-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 16.

Za použití mutačních primerů GS (SEQ ID NO: 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navržených tak, aby mutovaly alanin v poloze 40 na arginin, a DNA plazmidů HEFRVHa-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze g amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHg-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-RVHg-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

17.

Za použití mutačních primerů FS a FA a DNA plazmidů HEF-RVHb-AHMgy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze h amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-RVHh-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 18.

• 4 4 ··· 4 4 4 4 • · · · 4 4444 4 44 4 ··· 44 44 444 444

444 4444 4 4

444 44 4» 44 44 44

Za použití mutačních primerů IS (SEQ ID NO: 82) a IA (SEQ ID NO: 83) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 83 na alanin a serin v poloze 84 na fenylalanin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze i amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHi-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHiAHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 19.

Za použití mutačních primerů JS (SEQ ID NO: 84) a JA (SEQ ID NO: 85) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHfAHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze j amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHj-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHj-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 20.

Za použití mutačních primerů KS (SEQ ID NO: 86) a KA (SEQ ID NO: 87) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze k amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHk-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHk-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 21.

Za použití mutačních primerů LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO. 89) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin a serin v poloze 82B na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze I amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHl-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHl-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22.

Za použití mutačních primerů MS (SEQ ID NO: 90) a MA (SEQ ID NO: 91) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, serin v poloze 82b na izoleucin a threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHhAHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHm-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHm-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

23.

Za použití mutačních primerů NS (SEQ ID NO: 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navržených tak, aby mutovaly serin v poloze 82b na izoleucin, a DNA plazmidu HEFRVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán

plazmid HEF-RVHn-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHn-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

24.

Za použití mutačních primerů OS (SEQ ID NO: 94) a OA (SEQ ID NO: 95) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEFRVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze o amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHo-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHo-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

25.

Za použití mutačních primerů PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmidu HEF-RVHaAHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze p amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHp-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

26.

Za použití mutačních primerů QS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin, a DNA plazmidu HEF*

RVHa-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze q amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHq-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHq-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 27.

Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmidu HEF-RVHp-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze r amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 28.

Za použití mutačních primerů SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) navržených tak, aby mutovaly methionin v poloze 69 na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze s amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHs-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHs-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 102.

• · * · · · · ··· ·· · · · ·

Aminokyselinové sekvence V oblasti konstruovaného L řetězce jsou uvedeny v Tabulce 1 a aminokyselinové sekvence V oblasti H řetězce jsou uvedeny v Tabulkách 2 až 4.

Tabulka 1

Aminokyselinová sekvence V oblasti L řetězce

FR 1

2

234 5678901 234 567890123 AH,M Dl VMTQSHKFMSTSVGDRVSITC

HuSG I D I QMTQSPSSLSASVGDRVTITC REi DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TC

RVLa ----------------------RVLb ----------------------CDR1 FR2

4

45678901234 567890123456789 KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLLIY

WYQQKPGKAPKLL1Y WYQQKPGKAPKLLIY

CDR2 FR3

6 7 8

0123^56 789012345678901234567890123456(8 SASNRYT GVPDRITGSCSGTDFTFTISSVQAEDLALYYC

CVPSRFSCSGSCTDFTLT1SSLQPEDFATYYC GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED1ATYYC

AHM

HuSG

REi

RVLa RVLb	—

	CDR3	FR4
	9	10
	901234567	8901234567
AHM	QQHYSTPFT	FGSGTKLE	1K
HuSG I		FGQGTKVE	IK
RE I		FGQGTKVE	IK
RVLa	-------—	----------~	—
R V L b	—	—	—

-Y25

Tabulka 2

Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce

AHM

HuSG

HG3

RVHa

R VHb

RVHc

RVHd

RVHe

RVH {

RVHg

RVHh

RVH i

RVH j

RVH k

RVH 1

RVHm

RVHn

RVHo

RVHp

RVHq

RVH r

RVH s

FR 1 '2 3

123456789012345678901234567890 QVQLQQSGAELARPCASVKLSCKASGYTFT EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN

-----------------------------T

-----------------------------τ

CDR1 FR2 4

12345 67890123456789 PYWMQ WVKQRPGQGLEWIG

WVRQAPGXGLDWVG WVRQAPGQGLEWMG

Tabulka 3

Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce (2)

CDR2 FR3

6.7 8 9

012A3456789012345 67 8901234567 8901 2ABC34 56-7 8901234

AHM S IFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSíLAFEDSAVYYCAR HuSCI RVTXTXDXSXNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

HG3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

RVHa ----------------------A-------------------------RVHb ----------------- K----A-------------------------RVHc ----------------------A-K-----------------------RVHd ----------------- X----A-K-----------------------RVHe ------------------A-L-A-------------------------RVHf ----------------- -A-L-A---S--A------------------RYHg ----------------------A-------------------------RVHh ----------------- X----A---S--A------------------RYHi ----------------- K----A---S--A-------AF---------RYHj ----------------- KA-L-A---S--A------------------RVHk ----------------- X----A---S--A--Q---------------RYHi ----------------- K----A---S--A--Q--I------------RVHm ----------------- X----A---S--A--Q--I-----S------RVHn ----------------- X----A---S--A-----1------------RVHo ------------------- X----A---S--A-----------S------RVHd ----------------- -----A------A------------------RVHa ------------------------A---S---------------------RVHr ------------------- -----A-K------A------------------RVHs --------------------- ---Ι-Λ-Κ----A--------------------27

Tabulka 4

Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce (3)

AHM

HuSG

JH6

RVHa

RVHb

RVHc

RVHd

RVHe

RVHf

RVHg

RVHb

RVH i

RVH j

R VH k

RVH1

RVHm

RVHn

RVH o

RVHp

RVHq

RVH r

RVHs

CDR3

57890ABJK12

GLRRGGYYFDY

FR4

34567890123

WGQGTTLTVSS

WGQCTLVTVSS

WGQGTTVTVSS

• · ·· · · · ·

3. Produkce chimerních protilátek a pozměněných lidských protilátek

Pro produkci chimérických protilátek nebo pozměněných lidských protilátek byly konstruovány vždy dva expresní vektory, které obsahují DNA kódující V oblast myšího H řetězce a C oblast lidského H řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, a DNA kódující V oblast myšího L řetězce a C oblast lidského L řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, nebo expresní vektor, obsahují DNA kódující

V oblast zušlechtěného H řetězce a C oblast lidského H řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, a DNA kódující

V oblast zušlechtěného L řetězce a C oblast lidského L řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor.

Potom je hostitelská buňka, jako je savčí buňka, transformována společně těmito dvěma vektory, transformované buňky jsou pěstovány in vitro nebo in vivo a produkují chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky (např. International Application Publication No. WO 91-16928). Navíc je protilátkový gen vnesen do savců, jako např. koza, a je tak vytvořen transgenní živočich, z jehož mléka je potom možno získat chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky.

Také V oblast H řetězce a C oblast H řetězce, a V oblast L řetězce a C oblast L řetězce jsou ligovány do jednoho vektoru, jímž je transformována vhodná hostitelská buňka a tím je navozena produkce protilátek. Tedy pro expresi chimerních protilátek jsou DNA kódující myší leader sekvenci, V oblast H řetězce a lidský H řetězec C oblasti, přítomné v klonované cDNA, a DNA kódující myší leader sekvenci a L řetězec

V oblasti a lidský L řetězec C oblasti vneseny do jednoho expresního vektoru (viz International Application Publication No. WO 94-11523).

Pro expresi pozměněné lidské protilátky jsou DNA kódující V oblast zušlechtěného H řetězce a C oblast lidského H řetězce, a DNA kódující V oblast zušlechtěného L řetězce a C oblast lidského L řetězce vneseny do jednoho expresního vektoru (viz International Application Publication No. WO 94-11523). Pomocí uvedeného vektoru jsou hostitelské buňky transformovány a transformované buňky jsou pěstovány in vivo nebo in vitro a produkují požadovanou chimerní protilátku nebo pozměněnou lidskou protilátku.

Buňky, výše uvedeným postupem transformované genem kódujícím požadovanou chimerní protilátku nebo pozměněnou lidskou protilátku, jsou pěstovány a produkovaná chimerní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka může být izolována buď zevnitř buňky nebo z okolního média a vyčištěna do homogenního stavu.

Izolace a purifikace požadovaného proteinu, uvedeného v tomto vynálezu, chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, mohou být provedeny pomocí afinitního sloupce. Jako sloupec, který využívá protein A, lze uvést HyperD, POROS, Sepharose F atd. Jako alternativní možnosti lze použít běžné izolace a purifikace užívané pro proteiny, výběr metod není jakýmkoli způsobem omezen. Např. kombinace rozličných chromatografických metod, ultrafiltrace, vysolování, dialýzy a podobně podle potřeby, umožní izolaci a purifikaci chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky.

Pro produkci chimerní anti-HM 1.24 protilátky nebo pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, uvedené v tomto vynálezu, lze použít jakoukoli expresní metodu, včetně např. eukaryotických buněk jako jsou živočišné buňky, zavedených systémů savčích buněčných linií, buněčných systémů hmyzích buněk, systémů buněk hub, kvasinkových buněčných systémů a prokaryotických buněk, jako jsou bakteriální buňky, např. buněk Escherichia coli apod. Je výhodné produkovat chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, uvedené v tomto vynálezu, v COS buňkách, HeLa buňkách, Věro buňkách, buňkách myelomu nebo BHK buňkách.

V takovýchto případech mohou být použity obecné promotory, používané pro expresi v savčích buňkách. Např. s výhodou může být použit bezprostředně časný promotor lidského cytomegaloviru (HCMV). Příklady expresních vektorů, obsahujících HCMV promotor jsou např. HCMV-VH-HCy1, HCMV-VL-HCk, atd., které jsou odvozeny z pSV2neo (International Application Publication No. WO 92-19759).

Navíc jako promotory pro expresi genu v savčích buňkách v předkládaném vynálezu, lze použít virové promotory, např. retroviru, polyoma viru, adenoviru, opičího viru (SV40) atd. a promotory odvozené ze savčích buněk, jako jsou lidský faktor pro elongaci polypeptidového řetězce 1a (HEF-1a) atd. Např., když je použit promotor SV40, exprese může být snadno dosaženo při použití metody Mulligan a kol., (Nátuře 277, 108 (1079)), a když je použit promotor HEf-1a, lze použít metodu Mizushima, S. a kol., (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).

Pro replikaci lze použít systémy, které jsou odvozeny od viru SV40, polyomaviru, adenoviru, hovězího papillomaviru (BPV), adenoviru nebo podobně a pro zvýšení počtu kopií genu v hostitelském buněčném systému může expresní vektor obsahovat, jako selektivní markér, gen pro aminoglykosyl fosforibosyltransferázu (APH), gen pro thymidin kinázu (TK), gen pro xanthin-guanidin fosforibosyltransferázu z Escherichia coli (Ecogpt), gen pro dihydrofolát reduktázu (DHFR) a podobně.

4. Vazebně inhibiční aktivita chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky (1) Měření koncentrace protilátek

Koncentrace čištěných protilátek může být měřena ELISA testem nebo pomocí měření absorbace.

ELISA destičky pro měření koncentrace protilátek mohou být připraveny následujícím postupem. V každé z 96 jamek ELISA destičky (např. Maxisorb, vyrobeno NUNC) byla imobilizováno 100 μΙ kozí protilátky proti lidskému IgG při koncentraci 1 gg/ml.

Po blokování pomocí 100 gg/ml ředícího pufru (např. 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCI₂, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovězí sérumalbumin (BSA), pH 8,1), je ke každé jamce přidáno sériové ředění supernatantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimerní protilátka, hybridní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka, např. supernatant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimerní protilátka, hybridní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka. Poté je přidáno 100 gl kozí protilátky proti lidskému IgG, konjugované s alkalickou fosfatázou, roztok substrátu o koncentraci 1 mg/ml (Sigma104, p-nitrofenylfosfát, vyrobeno SIGMA) a na přístroji pro odečítání mikrodestiček (Bio Rad) je měřena absorbance při 405 nm. Jako standard pro měření koncentrace může být používán lidský lgG1x (vyrobeno The Blnding Site). Koncentrace čištěné protilátky se získá měřením absorbance při 280 nm a spočtením za předpokladu, že 1 mg/ml odpovídá absorbanci 1,35 OD.

(2) Vazebná aktivita

Vazebnou aktivitu lze měřit „buněčným“ ELISA testem za použití linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL25). Destičky pro „buněčný“ ELISA test mohou být připraveny následujícím postupem. Buňky WISH, připravené ve vhodné koncentraci v médiu PRMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, jsou přidány do 96jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí a PBS(-) jsou fixovány 0,1% glutaralgehydem (vyrobeno Nakalai tesque).

• · • ·

Po blokování je ke každé jamce přidáno 100 μΙ sériových ředění supernatantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimerní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, např. supernatant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimerní anti-HM 1.24 protilátka, protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM

1.24 protilátka, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a poté je přidána králičí protilátka proti lidskému IgG, značená peroxidázou (vyrobeno DAKO).

Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti je přidán roztok substrátu a dále inkubováno. Poté je reakce zastavena 50 μΙ 6 N kyseliny sírové a je měřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).

(3) Měření vazebně inhibiční aktivity

Vazebně inhibiční aktivita biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky je měřena „buněčným“ ELISA testem za pomoci linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL25). Destičky pro „buněčný“ ELISA test mohou být připraveny výše uvedeným postupem (2). Buňky WISH, připravené ve vhodné koncentraci v médiu PRMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, jsou přidány do 96jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí a PBS(-) jsou fixovány 0,1% glutaralgehydem (vyrobeno Nakalai tesque).

«

Po blokování je ke každé jamce přidáno 50 μΙ sériových ředění supernatantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimerní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní antiHM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, např. supernatant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimerní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka současně s 50 μΙ 2 pg/ml biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a po promytí je přidán streptavidin, značený peroxidázou (vyrobeno DAKO).

Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti a následujícím promytí je přidán roztok substrátu a dále inkubováno. Poté je reakce zastavena 50 μΙ 6 N kyseliny sírové a měřena absorbance při 490 nm na MICRIPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio-Rad).

Měření ADCC aktivity

ADCC aktivita chimerní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, může být měřena následujícím způsobem. Zaprvé jsou

ΒΒΒ · · · BBBB » »»· Β BBBB Β «Β Β

ΒΒ «ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ

ΒΒΒΒΒΒΒ Β ·

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ Β * ΒΒ z lidské periferní krve nebo kostního morku odděleny pomocí hustotní centrifugace mononukleární buňky a připraveny z nich buňky efektorové. Buňky lidského myelomu jsou připraveny jako buňky cílové tím, že jsou buňky RPMI 8226 označeny pomocí⁵¹ Cr.

Poté je k takto označeným cílovým buňkám přidána chimerní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka, u níž je ADCC aktivita měřena, inkubováno a potom jsou k cílovým buňkám ve vhodném poměru přidány efektorové buňky a dále inkubováno.

Po inkubaci je odebrán supernatant a změřena jeho radioaktivita na měřiči záření gama. Současně může být pro zjištění maxima uvolněné radioaktivity použit 1%

NP-40. Cytotoxicita (v %) může být spočtena jako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti NP-40 a C je radioaktivita (cpm), uvolněná v samotném kultivačním roztoku bez protilátek.

Když se očekává, že C oblast protilátky bude vykazovat ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu, lze jako C oblast protilátky použít lidskou Cy1 nebo lidskou Cy3. Navíc buď přidáním, změnou nebo úpravou části aminokyselin C oblasti protilátky, lze navodit vyšší ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu.

Například existuje polymerizace IgG připomínající IgM, způsobená náhradou aminokyselin (Smith, R. I. F. & Morrison, S. L., BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683688), dále polymerizace IgG připomínající IgM, způsobená přidáním aminokyselin (Smith, R. I. F. a kol., J. Immunol. (1995) 154, 2226-2236), exprese tandemově uspořádaných genů kódujících L řetězec (Shuford, W. a kol., Science (1991) 252, 724727), dimerizace IgG, způsobená záměnou aminokyselin (Caron, P. C. a kol., J. Exp.

Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B. J. Immunology (1992) 148, 2918-2922, dimerizace IgG, způsobená chemickou modifikací (Wolff, E. A. a kol., Cancer Res.

(1993) 53, 2560-2565) a navození efektorové funkce, způsobená změnou aminokyselin v kloubové oblasti protilátky (Norderhaug, L. a kol., Eur. j. Immunol (1991) 21, 23792384). Může se jich dosáhnout cílenou mutagenezí pomocí primerů, přidáním sekvence baží za využití štěpných míst pro restrikční enzymy a chemickými modifikačními činidly, které indukují kovalentní vazby.

in vivo diagnostické činidlo pro myelom

Chimerní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být použita jako in vivo ·» ·· ·· ·· • · · · · · · · • · · · ···· · · · · ·····> · · ·· »» ·« ·· ·· diagnostické činidlo pro myelom tím, že je připojena ke značené sloučenině, jako je radioaktivní izotop nebo podobně.

Navíc fragmenty chimerní anti-HM 1.24 protilátky nebo pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, jako jsou Fab, F(ab')2, Fv nebo jednotlivý řetězec Fv (scFv), kde Fv nebo Fv H řetězec a L řetězec jsou spojeny vhodným linkerem, který je připojen ke značené sloučenině jako je radioaktivní izotop nebo podobně, mohou být použity jako in vivo diagnostické činidlo pro myelom.

Specificky lze tyto protilátkové fragmenty získat zkonstruováním genu, kódujícího tyto protilátkové fragmenty, vnesením do expresního vektoru a poté exprimováním ve vhodných hostitelských buňkách, nebo štěpením chimerní anti-HM

1.24 protilátky nebo pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky vhodným enzymem.

Výše uvedená in vivo diagnostika pro myelom mohou být systémově podávány parenterálním způsobem.

Farmaceutický prostředek a léčebné činidlo pro myelom

Aby byly potvrzeny léčebné účinky chimerní anti-HM 1.24 protilátky nebo zušlechtěné anti-HM 1.24 protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, uvedené protilátky byly podávány živočichům s transplantovanými myelomovými buňkami a byly hodnoceny jejich protinádorové účinky.

Jako myelomové buňky, které jsou transplantovány živočichům, byly preferovány lidské myelomové buňky, z nichž lze uvést např. KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475), RPMI8226 (ATCC CCL 155), ARH-77 (ATCC CRL 1621) a S6B45 (Suzuki, H. a kol., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 1989-1993).

Jako živočichové, kterým jsou uvedené buňky transplantovány, jsou s výhodou používáni takoví, u kterých jsou imunologické funkce potlačeny nebo chybí, zde lze jako příklad uvést nahé myši, myši SCID, béžové myši a nahé krysy.

Navíc protinádorové účinky mohou být potvrzeny změnami v hladinách lidských imunoglobulinů v séru, měřením objemu anebo váhy nádoru, změnami v množství Bence Jonesových proteinů v moči, dobou přežití pokusných zvířat a podobně.

Farmaceutické prostředky nebo léčebná činidla pro myelom, která obsahují jako aktivní složku chimerní anti-HM 1.24 protilátku nebo pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu, mohou být podávány parenterálním způsobem, buď systémově nebo lokálně. Například si lze vybrat intravenózní injekce, jako jsou kapací infúze, intramuskulární injekce, intraperitoneální injekce nebo

• ·· • · • ···	·« • » • ·	·· 9 ···	99 9 · • 9	99 9 9
9 9·	• »	• ·	•
Λ 9 99	• *	* ·	• ·	9 9

subkutánni injekce a dávkový režim lze vybrat vhodně v závislosti na věku a zdravotním stavu pacientů.

Účinné dávkování je obyčejně vybráno v oblasti 0,01 mg až 1000 mg/kg tělesné váhy na dávku. Jinou možností je zvolit dávkování 5 mg na jedince, výhodněji 50 až 100 mg na jedince.

Farmaceutické prostředky nebo léčebná činidla pro myelom, která obsahují jako aktivní složku chimemí anti-HM 1.24 protilátku nebo pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu, mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné nosiče nebo příměsí, závisející na způsobu podání.

Jako příklady takových nosičů nebo příměsí zde mohou být uvedeny voda, farmaceuticky přijatelná organická rozpustidla, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinyl pyrolidon, karboxyvinylový polymer, sodná sůl karboxymetylcelulózy, polyakrylát sodný, alginát sodný, ve vodě rozpustný dextran, sodná sůl karboxymetylového škrobu, pektin, metylcelulóza, etylcelulóza, xanthanová klovatina, arabská guma, kasein, želatina, agar, diglycerin, glycerin, propylenglykol, polyetylenglykol, vazelína, parafin, stearylalkohol, kyselina stearová, lidský sérumalbumin (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmaceuticky přijatelná smáčedla a podobně. Použité příměsi mohou být vybrány z výše uvedených příkladů nebo jejich kombinací, ale nejen z nich.

*

Popis obrázků

Obrázek 1 je graf znázorňující, jak je při FCM analýze, používající linii lidských myelomových buněk KPMM2, intenzita fluorescence chimemí anti-HM 1.24 protilátky posunuta ve srovnání s kontrolní protilátkou podobným způsobem, jako u myší anti-HM

1.24 protilátky.

Obrázek 2 je graf znázorňující, jak při buněčném ELISA testu, používajícím buňky WISH, chimerní anti-HM 1.24 protilátka, podobně jako myší anti-HM 1.24 protilátka, inhibuje vazbu biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky na WISH buňky, v míře, která je úměrná koncentraci.

Obrázek 3 je graf znázorňující, že kontrolní lidský lgG1 nebo myší anti-HM 1.24 protilátka nevykazují cytotoxicitu, zatímco chimerní anti-HM 1.24 protilátka vykazuje při zvýšeném poměru E/T zvýšenou cytotoxicitu k buňkám RPMI 8226.

Obrázek 4 je diagram, představující způsob konstrukce L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky sestavením úseků CDR oblasti pomocí PCR metody.

4 44	44	44	44		44
• 4	4	4	4	4	4	4	4
4 444	4 ·	444	4	4	•	4
4 4 4	•	4	4 4		4		•
44 44	• 4	44	44		44

Obrázek 5 je diagram, představující způsob sestavení oligonukleotidů RVH1, RVH2, RVH3 a RVH4 pomocí PCR metody při přípravě H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 6 je diagram, představující způsob konstrukce V oblasti H řetězce hybridní anti-HM 1.24 protilátky člověk/myš pomocí PCR metody.

Obrázek 7 je diagram, představující způsob konstrukce V oblasti H řetězce hybridní anti-HM 1.24 protilátky myš/člověk pomocí PCR metody.

Obrázek 8 je graf ukazující, že verze a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebnou schopnost pro antigen stejnou, jako chimerní anti-HM 1.24 protilátka. Indexy -1 a -2 ukazují, že se jedná o různé šarže.

Obrázek 9 je graf ukazující schopnost vázat antigen u pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze a L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 10 je graf ukazující schopnost vázat antigen u pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze b L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 11 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze a L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 12 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze b L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 13 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, b, c a d H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 14 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a a e H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky. Indexy -1 a -2 ukazují, že se jedná o různé šarže.

Obrázek 15 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí řetězce a, b, p a r H pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 16 je graf ukazující schopnost vázat antigen u hybridní anti-HM 1.24 protilátky člověk/myš, u hybridní anti-HM 1.24 protilátky myš/člověk a u chimerní antiHM 1.24 protilátky.

Obrázek 17 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, b, c a f H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 18 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a a g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 19 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí a a g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 20 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí h a i H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 21 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí f, h a j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 22 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí h a i H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 23 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí f, h a j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 24 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí h, k, I, m, n a o H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 25 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, h, p a q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti^HM 1.24 protilátky.

Obrázek 26 je graf ukazující inhibici schopnosti vázat se k buňkám WISH u verzí h, k, I, m, n a o H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní antiHM 1.24 protilátky.

Obrázek 27 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí a, h, p a q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 28 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, c, p a r H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 29 je graf ukazující, že verze s pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebnou schopnost pro antigen stejnou, jako verze r pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Obrázek 30 je graf ukazující, že verze s pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebně inhibiční schopnost stejnou, jako verze r pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky.

Obrázek 31 je graf ukazující, že purifikovaná pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má stejnou schopnost vázat antigen, jako chimerní anti-HM 1.24 protilátka.

Obrázek 32 je graf ukazující, že purifikovaná pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má vazebně inhibiční schopnost stejnou, jako chimerní anti-HM 1.24 protilátka.

Obrázek 33 je graf ukazující, že podání chimerní anti-HM 1.24 protilátky prodloužilo ve srovnání s podáním kontrolního lidského lgG1 období přežití u myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami.

Obrázek 34 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z periferní krve zdravého člověka použity jako buňky efektorové, pak kontrolní lidský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pro buňky KPMM2 a myší anti-HM 1.24 protilátka má také slabou cytotoxicitu, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje pro buňky KPMM2 silnou cytotoxicitu.

Obrázek 35 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z periferní krve zdravého člověka použity jako buňky efektorové, kontrolní lidský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pro buňky ARH-77 a myší anti-HM 1.24 protilátka má také slabou cytotoxicitu, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje pro buňky ARH-77 silnou cytotoxicitu.

Obrázek 36 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z kostního morku myši SCID použity jako buňky efektorové, kontrolní lidský lgG1 nevykazuje cytotoxicitu pro buňky KPMM2, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje při zvýšení koncentrace protilátek zvýšenou cytotoxicitu pro buňky KPMM2.

Obrázek 37 je graf ukazující, že hladina lidského IgG v séru myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami je zvýšena po podání kontrolního lidského IgG, ve srovnání sjeho hladinou před podáním, zatímco podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšení hladiny lidského IgG v séru.

Obrázek 38 je graf ukazující, že podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky myším s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami způsobí ve srovnání s podáním kontrolního lidského lgG1 prodloužení období přežití.

Obrázek 39 je graf ukazující, že hladina lidského IgG v séru myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami je zvýšena po podání melphalanu a kontrolního lidského lgG1, ve srovnání s jeho hladinou před podáním, zatímco podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšení hladiny lidského IgG v séru.

• · • ·

Obrázek 40 je graf ukazující, že podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky myším s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami způsobí ve srovnání s podáním melphalanu nebo kontrolního lidského lgG1 prodloužení období přežití.

Příklady provedení vynálezu

Dále bude předkládaný vynález vysvětlen na specifických příkladech.

Příklad 1. Klonování cDNA kódující V oblast myší anti-HM 1.24 protilátky

1. Izolace mediátorové RNA (mRNA)

Mediátorová RNA byla izolována za použití soupravy Fast Track mRNA Isolation Kit Version 3.2 (vyrobeno Invitrogen) podle přiloženého návodu z 2 χ 10⁸hybridomových buněk (FERM BP-5233), které produkují myší anti-HM 1.24 protilátky.

2. Amplifikace genu kódujícího variabilní oblast protilátky PCR metodou

PCR byla provedena na termocykleru firmy Perkin Elmer Cetus.

2-1. Amplifikace a fragmentace genu kódujícího V oblast myšího L řetězce

Podle takto izolované RNA byla syntetizována cDNA za použití soupravy

AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (výrobce Life Science) a použita pro PCR. Jako primery pro PCR byly použity MKV (Mouše Kappa Variable) primery (Jones, S. T. a kol., Bio/Technology, 9, 88-89, (1991)), které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 29 až 39 a které hybridizují s leader sekvencí myšího kappa typu L řetězce.

100 μΙ roztoku PCR, obsahující 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCI₂, 5 jednotek DNA polymerázy Ampli Taq (vyrobeno Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM primery MKV, uvedené v SEQ ID NO: 29 až 39, 3 mM primer MKV, uvedený v SEQ ID NO: 40 a 100 ng jednořetězcové cDNA bylo převrstveno 50 μΙ minerálního oleje, poté zahřáto na počáteční teplotu 94 °C po dobu 3 minut, potom na 94 °C na 1 minutu, na 55 °C 1 na minutu a na 72 °C na 1 minutu, v uvedeném pořadí. Po opakování tohoto cyklu třicetkrát, byla reakční směs inkubována při 72 °C po dobu 10 minut. Amplifikovaný DNA fragment byl vyčištěn v nízkotající agaróze (vyrobeno Sigma) a štěpen Xmal (vyrobeno New England Biolabs) a Sall (vyrobeno Takara Shuzo) při 37 °C.

2-1. Amplifikace a fragmentace cDNA kódující V oblast myšího H řetězce • · * · • · · · • ·

Gen kódující V oblast myšího H řetězce byl amplifikován metodou 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends; Frohman, M. A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J. B. D. M. a kol., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991)). Poté co byla cDNA syntetizována pomocí primeru P1 (SEQ ID NO: 41), který hybridizuje specificky s konstantní oblastí myšího lgG2a, cDNA kódující V oblast myšího H řetězce byla amplifikována pomocí soupravy 5'-AmpliFINDER RACE KIT (vyrobeno CLONTECH), za použití primeru MHC2a (SEQ ID NO: 42), který hybridizuje specificky s konstantní oblastí myšího lgG2a a ukotvovacího primeru (SEQ ID NO: 77), který je součástí soupravy. Amplifikovaný DNA fragment byl vyčištěn v nízkotající agaróze (vyrobeno Sigma) a štěpen EcoRI (vyrobeno Takara Shuzo New England Biolabs) a Xmal (vyrobeno Shuzo New England Biolabs) při 37 °C.

3. Spojení a transformace

DNA fragment obsahující gen kódující V oblast myšího L řetězce typu kappa, připravený výše uvedeným způsobem, byl ligován do vektoru pUC19 (připraveného štěpením Sall a Xmal) v reakční směsi obsahující 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCI₂, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 50 mg/ml polyetylenglykolu (8000) a jednu jednotku T4 DNA ligázy (vyrobeno GIBCO-BRL) při teplotě 16 °C po dobu 2,5 hodiny. Podobně byl připraven DNA fragment obsahující gen kódující V oblast myšího H to řetězce a byl ligován do vektoru pUC19 (připraveného štěpením EcoRI a Xmal) při teplotě 16 °C po dobu 3 hodin.

Pak bylo 10 μΙ výše uvedené ligační směsi přidáno k 50 μΙ kompetentních buněk Escherichia coli DH5a, ponecháno na ledu 30 minut, na 42 °C jednu minutu a znovu jednu minutu na ledu. Po přidání 400 μΙ média 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) byly buňky inkubovány při 37 °C jednu hodinu a poté byly E. coli vysety na agar s 2xYT médiem (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), obsahující 50 gg/ml ampicilinu a inkubovány přes noc při 37 °C, aby byly získány transformanty E. coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc při 37 °C v 10 ml média 2xYT obsahujícího 50 gg/ml ampicilinu a z této kultury byla alkalickou metodou připravena plazmidová DNA (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Takto získaný plazmid, obsahující gen kódující V oblast myšího L řetězce typu kappa, odvozený z hybridomu, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku, byl nazván pUCHMVL9. Plazmid, získaný výše uvedeným postupem a obsahující gen kódující V oblast myšího H řetězce, odvozený z hybridomu, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku, byl nazván pUCHMVHR16.

Příklad 2. Určení sekvence baží DNA

Sekvence baží cDNA kódující oblasti ve výše uvedeném plazmídu byla určena použitím automatického DNA sekvenátoru (vyrobeno Applied Biosystem Inc.) a soupravy Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrobeno Applied Biosystem Inc.) postupem, který uvádí výrobce.

Sekvence baží genu kódujícího V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky obsažená v plazmídu pUCHMVL9 je uvedena v SEQ ID NO: 1. Sekvence baží genu kódujícího V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky obsažená v plazmídu pUCHMVHR16 je uvedena v SEQ ID NO. 2.

Příklad 3. Určení CDR

Základní struktury V oblastí L řetězce a H řetězce se vzájemně podobají, kdy čtyři podpůrné části jsou spojeny třemi hypervariabilními oblastmi, tj. oblastmi určujícími komplementaritu (complementarity determining region - CDR). Aminokyselinová sekvence podpůrné oblasti jsou relativně dosti stálé, ale variabilita v aminokyselinové sekvenci je extrémně vysoká (Kabat, E. A. a kol., „Sequences of Proteins of Immunological Interesť, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Na základě těchto skutečností byla aminokyselinová sekvence variabilní oblasti anti-HM 1.24 protilátky porovnána s aminokyselinovými sekvencemi protilátek v databázi, aby byla zjištěna homologie a byla tak určena oblast CDR, jak je uvedena v Tabulce 5.

Tabulka 5

Plazmid	Sekvence No.	CDR(1)	CDR(2)	CDR(3)
PUCHMVL9	3 až 5	24 až 34	50 až 56	89 až 97
PUCHMVHR16	6 až 8	31 až 35	50 až 66	99 až 100

• · ·

Příklad 4. Potvrzení exprese klonované cDNA (Konstrukce chimerní anti-HM 1.24 protilátky)

1. Konstrukce expresního vektoru

Aby bylo možno zkonstruovat expresní vektor, který exprimuje chimerní antiHM 1.24 protilátku, cDNA klonů pUCHMVL9 a pUCHMVHR16, kódující V oblasti L řetězce a H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky byla modifikována PCR metodou a poté vnesena do expresního HEF vektoru (International Application Publication No. WO 92-19759).

Zpětný primer ONS-L722S (SEQ ID NO: 43) pro V oblast L řetězce a zpětný primer VHR16S (SEQ ID NO: 44) pro V oblast H řetězce byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA, kódující počátek leader sekvence příslušné V oblasti a obsahují Kozákovu konvenční sekvenci (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, (1987)) a rozpoznávací místo pro restrikční enzym HindlII. Přímý primer VL9A (SEQ ID NO: 45) pro V oblast L řetězce a přímý primer VHR16A (SEQ ID NO: 46) pro V oblast H řetězce byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA, kódující konec J oblasti a obsahují donorovou sekvenci pro sestřih a rozpoznávací místo pro restrikční enzym BamHI.

100 μΙ PCR reakční směsi, obsahující 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCI₂, 100 pM každého primeru, 100 ng matricové DNA (pUCHMVL9 nebo pUCHMVHR16) a 5 jednotek enzymu Ampli Taq bylo převrstveno 50 μΙ minerálního oleje, a po počáteční denaturaci při 94 °C, zahřáto na 94 °C na 1 minutu, na 55 °C na 1 minutu a na 72 °C na 1 minutu, a po opakování tohoto cyklu třicetkrát byla reakční směs inkubována pří 72 °C po dobu 10 minut.

PCR produkt byl vyčištěn v 1,5% nízkotajícím agarózovém gelu a štěpen HindlII a BamHI, poté klonován do HEF-VL-gx pro V oblast L řetězce a do HEF-VH-gy1 v případě V oblasti H řetězce. Po určení DNA sekvence byly plazmidy, které obsahují DNA fragment se správnou DNA sekvencí označeny HEF-1.24L-gK, popř. HEF-1.24H9Y1Oblasti kódující příslušné variabilní oblasti byly z výše uvedených plazmidů vyštěpeny restrikčními enzymy HindlII a BamHI a vytvořeny tak restrikční fragmenty, které byly vloženy do HindlII anebo do BamHI místa plazmidového vektoru pUC19 a byly označeny pUC19-1.24L-gK popř. pUC19-1.24H-gy1.

Buňky Escherichia coli, obsahující příslušné plazmidy pUC19-1.24L-gK a pUC 19-1 24H-gy1 byly označeny Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) a byly 29. srpna 1996 uloženy pro mezinárodní použití v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovými čísly FERM BP-5646, popř. FERM BP-5644, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.

2. Transformace buněk COS-7

Aby mohla být pozorována přechodná exprese chimerních anti-HM 1.24 protilátek, byly výše uvedené expresní vektory testovány na buňkách COS-7 (ATCC CRL-1651). HEF-1.24L-gK a HEF-1 24H-gy1 byly společně transformovány do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno Bio Rad). Každá DNA (10 pg) byla přidána k 0,8 ml PBS, obsahujícího 1 χ 10⁷ buněk/ml a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 pF.

Po zotavovací periodě 10 minut při teplotě místnosti byly elektroporezované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10 % fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO₂ inkubátoru

BNA120D (vyrobeno TABAI) byl supernatant z kultur odebrán, zbytky buněk byly * odstraněny centrifugací a použity pro následující pokusy.

3. FCM analýza

Schopnost chimerních anti-HM 1.24 protilátek vázat antigen byla zkoumána průtokovou cytometrií (FCM - flow cytometry) za použití buněk KPMM2. Po promytí 4,7 χ 10⁵ buněk KPMM2 (Japan Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) v PBS(-) k nim bylo přidáno 50 pl kultury COS-7 buněk, které produkují výše uvedené chimerní anti-HM 1.24 protilátky a 50 pl pufru FACS (PBS(-) obsahující 2 % hovězího fetálního séra a 0,1% azid sodný), nebo 5 pl purifikovaných myších anti-HM 1.24 protilátek o koncentraci 500 pg/ml a 95 pl pufru FACS a inkubováno na ledu po dobu 1 hodiny.

Jako kontrola bylo použito 50pl 2 pg/ml chimerní SK2 (International Application Publication No. WO 94-28159) a 50 pl pufru FACS, nebo 5 pl 500 pg/ml purifikovaného myšího lgG2ax (UPC10) (vyrobeno CAPPEL) namísto purifikované myší anti-HM 1.24 protilátky a 95 pl pufru FACS a podobně inkubováno. Po promytí pufrem FACS bylo přidáno 100 pl 25 pg/ml kozí protilidské protilátky (GAH), konjugované s FITC (vyrobeno CAPPEL) nebo 10 pg/ml kozí protimyší protilátky (GAM), konjugované s FITC (vyrobeno Becton Dickinson) a inkubováno na ledu po dobu 30 minut. Po promytí pufrem FACS bylo suspendováno v 1 ml pufru FACS a intenzita fluorescence každé buňky byla měřena přístrojem FACScan (vyrobeno Becton Dickinson).

Jak je uvedeno vObr.1, bylo zjištěno, že se chimerní anti-HM 1.24 protilátky vážou k buňkám KPMM2, protože se vrchol intenzity fluorescence posunul doprava v systému, kde byly k buňkám přidány chimerní anti-HM 1.24 protilátky, ve srovnání s kontrolou, podobně jako v případě, kdy byly přidány myší anti-HM 1.24 protilátky. To potvrdilo, že klonovaná cDNA kóduje variabilní oblast myši anti-HM 1.24 protilátky.

Příklad 5. Příprava buněčné linie CHO, která stabilně produkuje chimerní anti-HM 1.24 protilátku

1. Konstrukce expresního vektoru pro chimerní H řetězec

Po štěpení výše uvedeného plazmidu HEF-1.24H-gy1 restrikčními enzymy Pvul a BamHI byl fragment dlouhý 2,8 kbp, obsahující EF1 promotor a DNA kódující V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky vyčištěn na 1,5% nízkotajícím agarozovém gelu. Poté byl výše uvedený fragment vložen do 6 kbp fragmentu, připraveného štěpením expresního vektoru použitého pro lidský H řetězec, DHFR-ΔΕRvh-PM1f (viz International Application Publication No. WO 92/19759), obsahujícího DHFR gen a gen kódující konstantní oblast lidského H řetězce, restrikčními enzymy Pvul a BamHI, a byl zkonstruován tak expresní vektor DHFR-AE-HEF-1.24H-gy1 pro H řetězec chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

2. Vnesení genu do buněk CHO

Aby byl pro chimerní anti-HM 1.24 protilátku vytvořen stabilní produkční systém, byly geny výše zmíněných expresních vektorů HEF-1 24H-gy1 a DHFR-ΔΕHEF-1.24H-gy1, které byly linearizovány štěpením Pvul, současně vneseny elektroporační metodou do buněk CHO DXB11 (věnované z Medical Research Council Collaboration Center), za podmínek podobných výše uvedeným (výše uvedená transfekce buněk COS-7).

3. Genová amplifikace pomocí MTX

Mezi CHO buňkami s vnesenými geny mohou přežít v beznukleosidovém aMEM kultivačním roztoku (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 pg/ml G418 (výrobce GIBCO-BRL) a 10 % hovězího fetálního séra, pouze ty buňky, do • ·

·..··..* .

kterých byly současně vneseny oba expresní vektory, jak pro L řetězec, tak i pro H řetězec, a tak je možno je selektovat. Potom následovalo přidání 10 nM MTX (vyrobeno Sigma) k výše uvedenému kultivačnímu roztoku. Mezi klony, které se pomnožily, byly vybrány takové, které produkovaly chimerní anti-HM 1.24 protilátku ve velkém množství. Výsledkem byly klony #8 až #13, které vykazovaly účinnost produkce chimérické protilátky asi 20 pg/ml a byly označeny jako buněčné linie, produkující chimerní anti-HM 1.24 protilátky.

Příklad 6. Konstrukce chimerní anti-HM 1.24 protilátky

Chimerní anti-HM 1.24 protilátka byla zkonstruována následujícím způsobem. Výše uvedené buňky CHO, produkující chimerní anti-HM 1.24 protilátku byly nepřetržitě kultivovány 30 dní za použití Dulbeccova media modifikovaného podle Iscoveho (vyrobeno GIBCO-BRL), obsahujícího 5% bezgamaglobulinové sérum novorozených telat (vyrobeno GIBCO-BRL) v zařízení pro kultivaci buněk do vysoké hustoty Verax systém 20 (vyrobeno CELLEX BIOSCIENCE lne ).

Ve dnech 13, 20, 23, 26 a 30 po založení kultury, byl kultivační roztok odebírán pomocí tlakové filtrační jednotky SARTOBRAN (vyrobeno Sartorius) a poté byla chimerní anti-HM 1.24 protilátka čištěny afinitní metodou pomocí velkoobjemového sběrného systému Afi-Prep System (vyrobeno Nippon Gaishi) a sloupce Super Protein A (objem náplně: 100 ml, vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS jako absorbčního a promývacího pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 pg/ml.

Příklad 7. Zjišťování aktivity chimerní anti-HM 1.24 protilátky

Chimerní anti-HM 1.24 protilátka byla hodnocena následujícími testy vazebně inhibiční aktivity.

1. Měření vazebně inhibiční aktivity

1-1. Konstrukce biotinylované anti-HM 1.24 protilátky

Po naředění myší anti-HM 1.24 protilátky v 0,1 M hydrouhličitanovém pufru na koncentraci 4 mg/ml byly přidány 4 pl 50 mg/ml biotin-N-hydroxy sukcinimidu (vyrobeno EY LABS lne.) a ponecháno reagovat 3 hodiny při teplotě místnosti. Potom bylo přidáno 1,5 ml 0,2 M glycinového roztoku, inkubováno při teplotě místnosti po dobu 30 minut, aby došlo k zastavení reakce a pak byly odebírány frakce biotinylovaného IgG za použití sloupce PD-10 (vyrobeno Pharmacia Biotech).

1-2. Měření vazebně inhibiční aktivity

Vazebně inhibiční aktivita biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL 25). Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly připraveny následujícím postupem. Buňky WISH, připravené v koncentraci 4 χ 10⁵ buněk/ml v médiu PRMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, byly přidány do 96ti jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí PBS(-) byly fixovány 0,1% glutaralgehydem (vyrobeno Nakalai tesque).

Po blokování je ke každé jamce přidáno 50 μΙ sériových ředění chimerní antiHM 1.24 protilátky nebo myší anti-HM 1.24 protilátky, získané afinitní purifikací, a současně 50 μΙ 2 μg/ml biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a poté je přidán streptavidin, značený peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a byl přidán roztok substrátu. Po zastavení reakce přidáním 50 μΙ 6 N kyseliny sírové je měřena absorbance při 490 nm na MICRIPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio *

Rad).

Výsledek uvedený v Obr. 2 ukázal, že chimerní anti-HM 1.24 protilátka má k biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátce totožnou vazebně inhibiční aktivitu jako myší anti-HM 1.24 protilátka. To znamená, že chimerní protilátka má tutéž V oblast jako myší anti-HM 1.24 protilátka.

Příklad 8. Měřeni ADCC aktivity chimerní anti-HM 1.24 protilátky

ADCC aktivita (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity - buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách) byla měřena podle metody uveřejněné v Current Protocols of Immunology, kap. 7. Imunologická studia u lidí, Editor, John E, Colligan a kol., John Wiley & Sons, lne., 1993.

1. Příprava efektorových buněk

Monocyty byly odděleny z periferní krve nebo kostního morku zdravých lidských jedinců a pacientů s mnohočetným myelomem pomocí metody hustotní centrifugace. K periferní krvi nebo kostnímu morku zdravých lidských jedinců a ···*··· · ·

9 9 9 9 · · 9 9 9 9 9 9 pacientů s mnohočetným myelomem bylo tedy přidáno stejné množství PBS(-), směs byla navrstvena na Ficoll (vyrobeno Pharmacia)-Conrey (vyrobeno Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.) (specifická hustota 1,077) a centrifugováno při 400 g po dobu 30 minut. Vrstva monocytů byla odebrána, dvakrát promyta médiem RPMI 1640 (vyrobeno Sigma), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno Witaker) a jejich koncentrace upravena na 5 x 10⁶ buněk/ml v témže kultivačním médiu.

2. Příprava cílových buněk

Buňky lidské myelomové linie RPMI 8226 (ATCC CCL 155) byly radioaktivně označeny inkubací v médiu RPMI 1640 (vyrobeno Sigma), doplněném 10 % fetálního hovězího séra (výrobce Witaker) a 0,1 mCi ⁵¹Cr-chromanu sodného při 37 °C po dobu 60 minut. Po radioaktivním označení byly buňky třikrát promyty Hanksovým balancovaným solným roztokem (HBSS) a upraveny na koncentraci 2 x 10⁵ buněk/ml.

3. TestADCC

Do jednotlivých jamek 96ti jamkové destičky (dno ve tvaru U - vyrobeno Corning) bylo přidáno 50 μΙ 2 x 10⁵ cílových buněk/ml, 1 μρ/ηιΙ afinitně purifikované chimerní anti-HM 1.24 protilátky a myší anti-HM 1.24 protilátky, nebo kontrolního lidského IgG (vyrobeno Serotec) a ponecháno reagovat při 4 °C po dobu 15 minut.

Potom bylo přidáno 100 μΙ 5 x 10⁶ efektorových buněk/ml tak, aby poměr (E:T) efektorových buněk (E) k cílovým buňkám (T) byl 0:1, 5.Ί, 20:1 nebo 50:1 a kultivováno v CO₂ inkubátoru 4 hodiny.

Bylo odebráno 100 μΙ supernatantu a radioaktivita uvolněná do supernatantu kultury byla zjišťována na měřiči záření gama (ARC361, vyrobeno Aloka). Pro změření maximální radioaktivity byl použit 1% NP-40 (vyrobeno BRL). Cytotoxicita (v %) byla spočtena jako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti NP-40 a C je radioaktivita (cpm), uvolněná v samotném kultivačním roztoku bez protilátky.

Jak je ukázáno v Obr. 3, když byla přidána chimerní anti-HM 1.24 protilátka, ve srovnání s kontrolním lgG1 se cytotoxicita zvyšovala s rostoucím poměrem E:T, což značí, že tato chimerní anti-HM 1.24 protilátka má ADCC aktivitu. Protože cytotoxicita nebyla pozorována ani po přidání myší anti-HM 1.24 protilátky, ukázalo se tedy, že když efektorová buňka je lidského původu, je pro získání ADCC aktivity potřebná Fc část lidské protilátky.

··· ··· · · · · ···· · · · ·· · ·· ·

Příklad 9. Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

1. Navržení V oblasti pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

Aby bylo možno zkonstruovat pozměněnou lidskou protilátku, v níž by CDR z myší monoklonální protilátky byla vnesena do lidské protilátky, je žádoucí, aby existovala vysoká homologie mezi FR myší protilátky a FR lidské protilátky. Tak byly V oblasti L řetězců a H řetězců myší anti-HM 1.24 protilátky pomoci Protein Data Bank porovnány s V oblastmi všech známých protilátkek, jejichž struktura byla objasněna.

V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci podskupiny IV (HSGIV) V oblasti L řetězce lidské protilátky, přičemž homologie je 66,4 %. Na druhé straně vykazuje 56,9% homologii s HSGI, 55,8% s HSGII a 61,5% homologii s HSGIII.

Pokud je V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblastí L řetězce známých lidských protilátek, vykazuje 67,0% homologii s V oblastí L řetězce lidské protilátky REI, jedné z I podskupiny V oblastí L řetězce lidské protilátky. Proto byla FR z REI použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Byla navržena verze a V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. V této verzi byla FR lidské protilátky vytvořena totožně s FR oblastí odvozenou z REI, která je přítomna v pozměněné lidské CAMPAŤH-1H protilátce (viz Riechmann, L. a kol., Nátuře 322, 21-25, (1988), FR obsažená ve verzi a V oblasti L řetězce pozměněné lidské PM-1 protilátky popsané v International Application Publication No. WO 92-19759), a myší CDR byla vytvořena shodně s CDR ve V oblasti L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.

V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci HSGI V oblasti H řetězce lidské protilátky s homologii 54,7 %. Na druhé straně vykazuje 34,6% homologii s HSGII a 48,1% homologii s HSGIII. Když je V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblastí H řetězce známých lidských protilátek, FR1 až FR3 byly nejvíce podobné V oblasti H řetězce lidské protilátky HG3, jedné z I podskupiny V oblastí lidského H řetězce (Rechavi, G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), přičemž homologie je 67,3 %.

Proto byla FR lidské protilátky HG3 použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. Avšak, protože aminokyselinová sekvence FR4 lidské protilátky HG3 nebyla popsána, byla použita aminokyselinová sekvence FR4 z lidské protilátky JH6 (Ravetch, J. V. a kol., Cell, 27, 583-591), která vykazuje nejvyšší homologii s FR4 H řetězce myší anti-HM

1.24 protilátky. FR4 z JH6 má kromě jedné aminokyseliny sekvenci shodnou s FR4 z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.

V prvé verzi a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly FR1 až FR3 vytvořeny shodně s FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3 a CDR byla vytvořena shodně s CDR V oblasti H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky kromě toho, že aminokyseliny v pozici 30 v lidské FR1 a v pozici 71 v lidské FR3, byly shodné s aminokyselinami myší anti-HM 1.24 protilátky.

2. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl konstruován vnesením CDR oblasti pomocí PCR metody. Postup je znázorněn na Obr. 4. Při konstrukci pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (verze a), která má FR odvozenu z lidské protilátky REI, bylo použito osm PCR primerů. Vnější primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí expresního vektoru HAF-VL-gx.

Primery L1S (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3S (SEQ ID NO: 51) mají negativní DNA sekvenci. Primery L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO. 53) a L3A (SEQ ID NO: 54) mají pozitivní DNA sekvenci, přičemž každý mají komplementární DNA sekvenci (20 až 23 bázových párů) k DNA na 5'-konci primerů L1S, L2S a L3S.

V prvním stupni PCR byly provedeny 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3SH a každý PCR produkt byl vyčištěn. Čtyřem PCR produktům z prvních PCR bylo umožněno vzájemné sestavení na základě jejich vlastní komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759). Poté byly přidány vnější primery A a H a byla amplifikována celková délka DNA kódující V oblast L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (druhá PCR). Ve výše uvedené PCR může být jako matrice použit plazmid HEF-RVL-M21a (viz International Application Publication No. WO 95-14041), kódující verzi a V oblasti L řetězce pozměněné lidské ONS-M21 protilátky, založené na FR odvozené z lidské protilátky REI.

V prvním stupni PCR byla použita PCR směs, obsahující 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCI, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCI₂, 100 ng matricové DNA, 100 pM každého primerů a 5 jednotek Ampli Taq. Každá reakce byla převrstvena 50 μΙ minerálního oleje. Po počáteční denaturaci zahřátím na teplotu 94 °C, byl proveden reakční cyklus 94 °C 1 minutu, 55 °C 1 minutu a 72 °C 1 minutu, potom byla reakční směs inkubována při 72 °C po dobu 10 minut.

PCR produkty A-L1A (215 bázových párů), L1S-L2A (98 bázových párů), L2SL3A (140 bázových párů) a L3S-H (98 bázových párů) byly vyčištěny za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy a byly sestaveny v průběhu 2. PCR. Ve druhé PCR bylo 98 μΙ PCR směsi obsahující 1 pg každého produktu z 1. reakce a 5 jednotek Ampli Taq inkubováno ve dvou cyklech 94 °C 2 minuty, 55 °C 2 minuty a 72 °C 2 minuty, potom bylo přidáno 100 pM každého vnějšího primerů (A a H). PCR reakce byla převrstvena 50 μΙ minerálního oleje a provedeno 30 cyklů PCR za podmínek uvedených výše.

Fragment dlouhý 515 bázových párů, který je výsledkem druhé PCR byl vyčištěn za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy, štěpen BamHI a Hindlll, a takto získané DNA fragmenty byly klonovány do oblasti HEF expresního vektoru HEF-VL-gK. Po určení DNA sekvence byl plazmid, obsahující správnou aminokyselinovou sekvenci

V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, označen jako HEF-RVLaAHM-gx. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9.

Verze b V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována mutagenezí pomocí PCR. Mutagenní primery FTY-1 (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) byly navrženy tak, aby mutovaly fenylalanin v pozici 71 na tyrozín.

Po amplifikaci výše uvedených primerů za použití plazmidu HEF-RVLa-AHMgK jako matrice, byl získaný produkt vyčištěn a štěpen BamHI a Hindlll. Získané DNA fragmenty byly klonovány do HEF expresního vektoru HEF-VL-gK a získán tak plazmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVLb-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.

3. Konstrukce V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky 3-1. Konstrukce verzí a až e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla navržena následujícím způsobem. Připojením DNA sekvence kódující FR1 až FR3 lidské protilátky HG3 a FR4 lidské protilátky JH6 k DNA sekvenci kódující CDR

V oblasti H řetězce myší lidské anti-HM 1.24 protilátky, byla navržena patřičně dlouhá DNA, kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

· 0 ··· * * * * • · · 0 0 0**0 · ·· » • · · « · 0 0 0 0 »00 0 0*

0 0 0 0 0 0 0 0 ··· ·* 0 0 0 0 0* 00

Poté bylo na 5' konec připojeno cílové místo pro Hindlll/Kozakova konvenční sekvence, na 3' konec bylo připojeno cílové místo pro BamHl/donorová sekvence pro sestřih tak, aby bylo umožněno připojení do HEF expresního vektoru.

Takto uspořádaná DNA sekvence byla rozdělena do čtyř oligonukleotidů.

Poté byly oligonukleotidy, které by potenciálně mohly bránit sestavení těchto oligonukleotidů, podrobeny počítačové analýze sekundární struktury. Sekvence čtyř oligonukleotidů RVH1 až RVH4 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO: 60.

Tyto oligonukleotidy mají délku 119 až 144 bází a obsahují 25 až 26 bázových párů dlouhé překrývající se oblasti. Z těchto oligonukleotidů mají RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RVH4 (SEQ ID NO: 60) negativní DNA sekvenci, zatímco RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) mají pozitivní DNA sekvenci. Postup pro sestavení těchto čtyř oligonukleotidů pomocí metody PCR je ukázán na obrázku (viz Obr. 5).

PCR směs (98 μΙ) obsahující 100 ng každého ze čtyř nukleotidů a 5 jednotek Ampli Taq byla napřed denaturována zahřátím na teplotu 94 °C 2 minuty a potom byly provedeny dva cykly inkubace, obsahující 94 °C 2 minuty, 55 °C 2 minuty a 72 °C 2 minuty. Potom bylo přidáno 100 pM každého externího primeru RHP1 (SEQ ID NO: 61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) a reakce byla převrstvena 50 μΙ minerálního oleje. Po počáteční denaturaci 94 °C 1 minutu bylo provedeno 38 cyklů 94 °C 1 minutu, 55 °C 1 minutu a 72 °C 1 minutu a na závěr byla reakce inkubována 10 minut při 72 °C.

Amplifikovaný, 438 bázových párů dlouhý DNA fragment byl vyčištěn na

I, 5% nízkotající agaróze, štěpen HindlII a BamHI a poté klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1. Po určení sekvence bází byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující aminokyselinovou sekvenci správné V oblasti H řetězce označen jako HEF-RVHa-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

II.

Jednotlivé verze b, c, d a e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky jsou konstruovány následovně.

Za použití mutačních primerů BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze b amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHb-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H ·«· · · · · · · · ··«· · · ·· · · · · · • «a···· · · ·· · ·· ·· ·· *· ·· řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHb-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

12.

Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze c amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHc-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHc-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

13.

Za použití mutačních primerů DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin a threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze d amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHd-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHd-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 14.

Za použití mutačních primerů ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 67 na alanin a methionin v poloze 69 na leucin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze e amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu řdEF-RVHe-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15.

3-2. Konstrukce H řetězce hybridní V oblasti

Byly konstruovány dva H řetězce hybridní V oblasti. Jeden je hybridní antiHM 1.24 protilátka myš/člověk, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, zatímco druhá je hybridní anti-HM 1.24 protilátka člověk/myš, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky. Aminokyselinové sekvence CDR oblastí jsou celé odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky.

Dva H řetězce hybridních V oblastí byly konstruovány pomocí metody PCR.

Metoda je schematicky ukázána na Obr. 6 a Obr. 7. Pro konstrukci dvou H řetězců hybridních V oblastí byly použity čtyři primery. Vnější primery a (SEQ ID NO: 71) a h

• 44 • 4 • 444	• •	4 A	• •	44 • 444	44 4 · • ·	• 4
4 4	4 4
4 4 4	•		•	4 ·	•		4
4« 44		··		• 4	44	• 9

(SEQ ID NO: 72) byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1. Konstrukční primer HYS (SEQ ID NO: 73) hybridního H řetězce je navržen tak, že má negativní DNA sekvenci a hybridní primer HYA (SEQ ID NO: 74) H řetězce má pozitivní DNA sekvenci tak, že obě DNA sekvence jsou vzájemně komplementární.

Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda s plazmidem HEF-1.24H-gy1 jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA H řetězce, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, hybridní primer HYS H řetězce (SEQ ID NO: 73) a vnější primer h (SEQ ID NO: 72), a produkty obou PCR byly vyčištěny. Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759).

Poté byla po přidání vnějších primerů a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) v PCR reakci druhého stupně amplifikována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FŘ4 jsou z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky, byla v prvním stupni použita PCR metoda s plazmidem HEF-RVHa-AHM-gy1 jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA H řetězce, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-1 24H-gy1, hybridní primer HYS H řetězce a vnější primer h, a produkty obou PCR byly vyčištěny. Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759).

Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně amplifikována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky.

PCR reakce prvního stupně, čištění PCR produktů, sestavení PCR produktů, PCR reakce druhého stupně a klonování do HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1 byly provedeny podle postupů uvedených v „Příkladu 9. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky“.

Po určení DNA sekvence byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-MH-RVH-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-MH-RVH-AHMgy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 75. Také plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-HM-RVH-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-HMRVH-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 76.

3-3. Konstrukce verzí f až s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

Každá z verzí f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována následujícím způsobem.

Za použití mutačních primerů FS (sekvence 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin a valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze f amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHf-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 16.

Za použití mutačních primerů GS (SEQ ID NO. 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navržených tak, aby mutovaly alanin v poloze 40 na arginin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze g amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHg-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H

řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHg-AHM-gYl jsou uvedeny v SEQ ID NO; 17.

Za použití mutačních primerů FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) a DNA plazmidu HEF-RVHb-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze h amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 18.

Za použití mutačních primerů KS (SEQ ID NO: 86) a ř<A (SEQ ID NO. 87) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze k amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHk-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHk-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 21.

Za použití mutačních primerů LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO: 89) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin a serin v poloze 82B na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze I amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHI-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHI-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22.

Za použití mutačních primerů MS (SEQ ID NO: 90) a MA (SEQ ID NO: 91) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, serin v poloze 82b na izoleucin a threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHh··· · · · · · · · ···· · · · · · · · · ·

AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHm-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHm-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

23.

Za použití mutačních primerů NS (SEQ ID NO. 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navržených tak, aby mutovaly serin v poloze 82b na izoleucin, a DNA plazmídu HEFRVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHn-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHn-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO:

24.

Za použití mutačních primerů OS (SEQ ID NO: 94) a OA (SEQ ID NO: 95) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmídu HEFRVHh-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze o amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHo-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHo-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO.

25.

Za použití mutačních primerů PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmídu HEF-RVHaAHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze p amplifikdvána a byl získán plazmid HEF-RVHp-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHp-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO:

26.

Za použití mutačních primerů QS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin, a DNA plazmídu HEFRVHa-AHM-gy1 jako matrice pro PCR metodu, byla verze q amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHq-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHq-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 27.

Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmídu HEF-RVHp-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze r amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmídu HEF-RVHr-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 28,

Verze s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována mutagenezí pomocí PCR. Mutačních primery SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) byly navrženy tak, aby mutovaly methionin v poloze 69 na izoleucin.

Poté, co výše uvedený primer byl amplifikován za použití HEF-RVHr-AHMgy1 jako matrice, výsledný produkt byl vyčištěn, štěpen BamHI a HindlII a získaný DNA fragment byl klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gy1 a získán tak plazmid HEF-RVHs-AHM-gy1. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHs-AHM-gy1 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 102.

Oblasti, kódující variabilní oblast v každém z výše uvedených plazmidů HEFRVLa-AHM-gx a HEF-RVHr-AHM-gy1 byly vyštěpeny jako restrikční fragmenty restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Byly vloženy do HindlII a BamHI míst plazmidového vektoru pUC19 a získané plazmidy byly označeny pUC19-RVLa-AHM-gK popř. pUC19-RVHr-AHM-gy1.

Buňky Escherichia coli, obsahující příslušné plazmidy pUC19-RVLa-AHM-gK a pUC19-RVHr-AHM-gy1 byly označeny Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gK) popř. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1) a byly 29. srpna 1996 uloženy pro mezinárodní použití v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovými čísly FERM BP-5645, popř. FERM BP5643, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.

Oblasti, kódující variabilní oblast ve výše uvedeném plazmidu HEF-RVHsAHM-gy1 byly vyštěpeny jako restrikční fragmenty restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Byly vloženy do HindlII a BamHI míst plazmidového vektoru pUC19 a získaný plazmid byl označen pUC19-RVHs-AHM-gy1.

Buňky Escherichia coli, obsahující plazmid pUC19-RVHs-AHM-gy1 byly označeny Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1) a byly 29. září 1997 uloženy pro mezinárodní použití v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP-6127, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.

• ·

4. Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, chimerní anti-HM 1.24 protilátky a H řetězce hybridní protilátky

Aby bylo možno zhodnotit každý řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka a chimerní anti-HM 1.24 protilátka jako pozitivní kontrolní protilátka, byly exprimovány. Při konstrukci každé z verzí b a dalších V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byl exprimován H řetězec hybridní protilátky, aby bylo možno posoudit, která aminokyselinová sekvence v FR by měla být nahrazena. Navíc byla exprimována v kombinaci s chimerním H řetězcem, aby bylo možno zhodnotit verzi a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

4-1. Exprese pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (1)

Deset μρ každého z expresních vektorů (HEF-RVHa-AHM-gy1 až HEFRVHr-AHM-gy1) pro H řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresních vektorů (HEF-RVLa-AHM-gK nebo HEF-RVLb-AHM-gK) pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky bylo společně transformováno do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno BioRad). Každá DNA (10 μg) byla přidána k 0,8 ml alikvotům, obsahujícím 1 x 10⁷ buněk/ml v PBS a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 μΡ.

Po zotavovací periodě 10 minut při teplotě místnosti byly elektroporované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10 % fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO2 inkubátoru BNA120D (vyrobeno TABAI) při teplotě 37 °C a 5% CO₂, byl supernatant z kultur odebrán, zbytky buněk byly odstraněny centrifugací při 1000 ot/min po dobu 5 minut v centrifuze 15PR-22 (vyrobeno HITACHI) vybavené rotorem 03 (vyrobeno HITACHI), provedena ultrafiltrace na mikrokoncentrátoru (Centricon 100, vyrobeno Amicon) za použití centrifugy J2-21 (vyrobeno BECKMAN) vybavené rotorem JA-20.1 (vyrobeno BECKMAN) a použit pro „buněčný“ ELISA test.

Exprese pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (2)

Deset μρ expresního vektoru (HEF-RVHs-AHM-gy1) pro verzi „s“ H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a 10 μρ expresního vektoru (HEF-RVLaAHM-gK) pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky bylo společně transformováno do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno

Bio Rad). Každá DNA (10 pg) byla přidána k 0,8 ml alikvotům, obsahujícím 1 x 10⁷buněk/ml v PBS a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 pF.

Po zotavovací periodě 10 minut ph teplotě místnosti byly elektroporované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10 % fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO₂ inkubátoru BNA120D (vyrobeno TABAI) při teplotě 37 °C a 5% CO₂, byl supernatant z kultur odebrán, zbytky buněk byly odstraněny centrifugací při 1000 ot/min po dobu 5 minut v centrifuze 05PR-22 (vyrobeno HITACHI) vybavené rotorem 03 (vyrobeno HITACHI), provedena ultrafiltrace na mikrokoncentrátoru (Centricon 100, vyrobeno Amicon) za použití centrifugy J2-21 (vyrobeno BECKMAN) vybavené rotorem JA-20.1 (vyrobeno BECKMAN) a sterilizován filtrací za použití filtru Millex GV13mm (vyrobeno Millipore) a použit pro „buněčný“ ELISA test.

4-2. Exprese chimerní anti-HM 1.24 protilátky

Za použití 10 pg expresního vektoru HEF-1.24H-gy1 pro H řetězec chimérické anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresního vektoru HEF-1.24H-gK pro L řetězec chimerní anti-HM 1.24 protilátky, byla pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky připravena chimerní anti-HM 1.24 protilátka pro použití v „buněčném“ ELISA testu.

4-3. Exprese anti-HM 1.24 protilátky obsahující verzi a zušlechtěného L řetězce a chimerní H řetězec

Za použití 10 pg každého z expresních vektorů HEF-1 24H-gy1 pro H řetězec chimerní anti-HM 1.24 protilátky a HEF-RVLa-AHM-gK pro verzi a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byla anti-HM 1.24 protilátka pro použití v „buněčném“ ELISA testu a obsahující verzi a zušlechtěného L řetězce a chimerní H řetězec, připravena pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky.

4-4. Exprese H řetězce hybridní protilátky

Za použití 10 pg každého z expresních vektorů (HEF-MH-RVH-AHM-gy1 nebo HEF-HM-RVH-AHM-gy1) pro V oblast hybridního H řetězce a expresního vektoru HEF-RVLa-AHM-gK pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byl připraven pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky H řetězec hybridní protilátky pro použití v „buněčném“ ELISA testu.

• · · * · • to toto • · · · • · · · • toto ··· to · • · ··

4- 5. Měření koncentrace protilátek

Koncentrace získaných protilátek byla měřena testem ELISA. Každá jamka v 96ti jamkové ELISA destičce (Maxisorb, vyrobeno NUNC) byla imobilizována přidáním 100 gl kozí protilátky proti lidskému IgG (vyrobeno BIO SOURCE) o koncentraci 1 gg/ml v pufru (0,1 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃, pH 9,6) a inkubováním při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po blokování se 100 gl ředícího pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCI₂,

0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovězí sérumalbumin (BSA), pH 8,1), bylo ke každé jamce přidáno 100 gl sériového ředění supernatantu z kultur buněk COS-7, které sekretují pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, chimerní anti-HM

1.24 protilátku nebo H řetězec hybridní protilátky, který byl koncentrován ultrafiltrací a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo přidáno 100 gl kozí protilátky proti lidskému IgG, konjugované s alkalickou fosfatázou (vyrobeno DAKO).

Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a promytí bylo přidáno 100 gl roztoku substrátu o koncentraci 1 gg/ml (Sigma104, p-nitrofenylfosfát, SIGMA), rozpuštěného v substrátovém pufru (50 mM NaHC0₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,8) a na přístroji pro odečítání mikrodestiček MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad) byla měřena absorbance při 405 nm. Jako standard pro měření koncentrace byl použit lidský lgG1x (vyrobeno The binding Site).

to

5. Příprava buněčné linie CHO, která stabilně produkuje pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku

5- 1.Konstrukce expresního vektoru pro H řetězec pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky

Po štěpení výše uvedeného plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 restrikčními enzymy Pvul a BamHI byl fragment dlouhý 2,8 kbp, obsahující DNA kódující EF1 promotor a DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, vyčištěn na 1,5% nízkotajícím agarozovém gelu. Poté byl výše uvedený fragment vložen do 6 kbp fragmentu, připraveného štěpením expresního vektoru, použitého pro lidský H řetězec, DHFR-ÁE-RVh-PM1f (International Application Publication No. WO 92-19759), obsahujícího DHFR gen a gen kódující konstantní oblast lidského H řetězce, restrikčními enzymy Pvul a BamHI, a zkonstruován tak expresní vektor DHFRAE-HEF-RVHr-AHM-gy1 pro H řetězec pozměněné anti-HM 1.24 protilátky.

• · • · · • · ·

5-2. Vnesení genu do buněk CHO

Aby byl vytvořen stabilní produkční systém pro pozměněnou lidskou antiHM 1.24 protilátku, byly geny výše zmíněných expresních vektorů DHFR-AE-HEFRVHr-AHM-gy1 a HEF-RVLa-AHM-gK, které byly linearizovány štěpením Pvul, současně vneseny do buněk CHO DXB-11 elektroporační metodou, za podmínek podobných výše uvedeným (transfekce do výše uvedených buněk COS-7).

5-3. Genová amplifikace pomocí MTX

Mezi CHO buňkami s vnesenými geny mohou přežít v beznukleosidovém α-MEM kultivačním roztoku (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 pg/ml G418 (vyrobeno GIBCO-BRL) a 10 % hovězího fetálního séra, pouze ty buňky, do kterých byly vneseny oba expresní vektory, jak pro L řetězec, tak pro H řetězec, a tímto způsobem byly selektovány. Potom následovalo přidání 10 nM MTX (vyrobeno Sigma) k výše uvedenému kultivačnímu médiu. Mezi klony, které se pomnožily, byly vybrány takové, které produkovaly pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku ve velkém množství. Výsledkem byl klon 1, který vykazoval účinnost produkce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky asi 3 pg/ml a byly označen jako buněčná linie, produkující pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

5-4. Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka byla zkonstruována následujícím způsobem. Výše uvedené buňky CHO, produkující pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, byly kultivovány 10 dní v beznukleosidovém α-MEM kultivačním médiu (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 μg/ml G418 (vyrobeno GIBCOBRL) a 10 % bezgamaglobulinového hovězího fetálního séra, v CO₂ inkubátoru BNAS120D (vyrobeno TABAI) při 37 °C v 5% CO₂. Ve dnech 8 a 10 po založení kultury, byl kultivační roztok odebírán, zbytky buněk odstraněny pomocí centrifugace při 2000 ot/min po dobu 10 minut na centrifuze RL-500SP (vyrobeno Tomy Seiko) vybavené rotorem TS-9 a potom sterilizován filtrací za použití filtru (vyrobeno FALCON) s membránou s póry o průměru 0,45 μηη.

Po přidání stejného objemu PBS(-) ke kultivačnímu roztoku z buněk CHO, které produkují pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, byla pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka čištěna afinitní metodou pomocí vysokorychlostního purifikačního systému ConSep LC100 (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS(-) jako absorbčního a promývacího ··· ··· pufru a 0,1 M pufr citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M TrisHCl (pH 8,0), poté byly frakce koncentrovány centrifugační ultrafiltrací na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno MILLIPORE), byla provedena koncentrace a náhrada za PBS(-) a nakonec sterilizovány filtrací pomocí filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 pm a získány tak čištěné pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 pg/ml.

Příklad 11. Zjišťování aktivity pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

U pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena vazebná aktivita k antigenů a vazebně inhibiční aktivity.

1. Metoda měření vazebné aktivity k antigenů a vazebně inhibiční aktivity

1-1. Měření vazebné aktivity k antigenů

Vazebná aktivita k antigenů byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití buněk WISH. Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly připraveny jak bylo popsáno výše v Příkladu 7.1-2.

Po blokování bylo ke každé jamce přidáno 100 pl sériových ředění pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, získané z koncentrátu supernatantu kultur buněk COS-7 nebo čištěné ze supernatantu kultur buněk CHO. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě místnosti byly promyty a poté byla přidána králičí protilátka proti lidskému IgG, značená peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a ke každé jamce bylo přidáno 100 μΙ roztoku substrátu. Po inkubaci byla reakce zastavena přidáním 50 μΙ 6 N kyseliny sírové a byla změřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).

1-2. Měření vazebně inhibiční aktivity

Vazebně inhibiční aktivita biotinylem značené myší anti-HM 1.24 protilátky byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití buněk WISH. Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly, připraveny jak bylo uvedeno výše v Příkladu 7.1-2. Po blokování bylo ke každé jamce přidáno 50 μΙ sériových ředění pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, získané z koncentrátu supernatantu kultur buněk COS-7 nebo čištěné ze supernatantu kultur buněk CHO spolu s 50 μΙ biotinylem značené myší anti-HM 1.24 protilátky. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě místnosti a promytí byl přidán streptavidin značený peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a bylo přidáno 100 μΙ roztoku substrátu. Po inkubaci byla reakce zastavena přidáním 50 μΙ 6 N kyseliny sírové a byla změřena absorbance při 490 nm na přístroji MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).

2. Hodnocení pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

2-1. L řetězec

Verze b L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Jak je uvedeno v Obr. 8, když je verze a L řetězce exprimována v kombinaci s chimérickým H řetězcem, projevoval podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen. S očekáváním dalšího zvýšení aktivity a kompatibility s H řetězcem byla konstruována verze b L řetězce. U verzí a a b L řetězce byly hodnoceny společně vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita při jejich kombinaci s verzemi a, b, f nebo h H řetězce. Jak je uvedeno v Obr. 9, 10, 11 a 12, verze a L řetězce má oproti verzi b vyšší oba tyto druhy aktivity při všech verzích a, b, f nebo h H řetězce. Proto byla pro následující pokusy použita verze a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.

2-2. Verze a až e H řetězce

Verze a až e H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly hodnoceny v kombinaci s verzí a L řetězce, jak bylo uvedeno pro měření vazebné * aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 11, 12, 13 a 14 ukázal, že všechny verze byly ve srovnání s chimerní anti-HM 1.24 protilátkou v obou hodnocených aktivitách slabší, což naznačuje, že je vyžadována substituce další aminokyseliny.

2-3. H řetězec hybridní protilátky

H řetězec hybridní protilátky byl hodnocen stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 16 ukázal, že hybridní anti-HM

1.24 protilátka člověk/myš vykazuje podobnou aktivitu jako chimerní anti-HM 1.24 protilátka, pokud se týká vazebné aktivity pro antigen, zatímco hybridní anti-HM 1.24 protilátka myš/člověk má slabší aktivitu než chimerní anti-HM 1.24 protilátka. To ukazuje, že pro konstrukci pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, která by měla vazebnou aktivitu pro antigen podobnou jako chimerní anti-HM 1.24 protilátka, je nezbytné zaměnit aminokyseliny obsažené v FR3 nebo FR4.

2-4. Verze f až r H řetězce

Verze f H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 17 ukázal, že její vazebná aktivita pro antigen je snížena ve srovnání s chimerní anti-HM 1.24 protilátkou, ale je vyšší ve srovnání s výše uvedenými verzemi a až c, což značí, že kterákoli ze čtyř aminokyselin v pozicích 67, 69, 75 a 78, které byly nově zaměněny v této verzi, je odpovědná za aktivitu pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky.

Verze g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 18 a 19 ukázal, že tato verze vykazovala nanejvýše podobnou úroveň aktivity jako výše uvedená verze a, což ukazuje, že jak je ukázáno pro výše uvedený H řetězec hybridní protilátky člověk/myš, aminokyselina na pozici 40, která byla zaměněna v této verzi, není odpovědná za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.

Verze h až j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 20, 21, 22 a 23 ukázal, že všechny verze měly obě měřené aktivity ve srovnání s chimerní anti-HM 1.24 protilátkou slabší, ale byly podobné s výše zmíněnou verzí f, což značí, že aminokyseliny v pozicích 67 a 69, patřící mezi čtyři aminokyseliny, které byly nově zaměněny ve verzi f, nejsou odpovědné za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.

Verze k až p H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly hodnoceny stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 24, 25, 26 a 27 ukázal, že všechny verze měly obě měřené aktivity ve srovnání s chimerní anti-HM 1.24 protilátkou slabší, ale byly podobné s výše zmíněnou verzí h, což značí, že aminokyseliny v pozici 80, které byly nově zaměněny v těchto šesti verzích, nejsou odpovědné za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.

Verze q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 25 a 27 ukázal, že tato verze měla obě měřené aktivity ve srovnání s výše zmíněnou verzí h nebo p, ale byla podobná výše • · · · ·· ·· zmíněné verzi a, což značí, že substituce aminokyseliny v pozici 78 je podstatná pro zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.

Verze r H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena výše uvedenou metodou. Výsledek uvedený na Obr. 15 a 28 ukázal, že verze r má podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity jako chimerní lidské anti-HM 1.24 protilátka.

Výše uvedené výsledky ukázaly, že minimální záměny, vyžadované k tomu, aby pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka měla podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity jako myší anti-HM 1.24 protilátka nebo chimerní anti-HM 1.24 protilátka, jsou aminokyseliny na pozicích 30, 71 a 78 a dále 73.

Vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita pro verze H řetězce a až r pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky jsou uvedeny souhrnně v Tabulce 6.

Verze H řetězce a

b c

d e

f g

h i

j k

I m

n o

P q

r

Tabulka 6

Vazebná aktivita pro antigen + +

+ +

+ ++ +

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +

+++

Vazebně inhibiční aktivita +

+ +

♦ neměřeno neměřeno ++ +

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +

+++

2-5. Verze s H řetězce

Verze sH řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena v kombinaci s výše uvedenou verzí a L řetězce stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 29 a 30 ukázal, že verze s měla obě měřené aktivity podobné jako verze r.

Jak bylo uvedeno výše, pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, si podržuje svou schopnost vazby k antigenu dokonce i když byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků zaměněn jinými aminokyselinami. V souhlase s tím předkládaný vynález zahrnuje pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, v níž byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků zaměněno jinou aminokyselinou ve variabilní oblasti H řetězce nebo L řetězce, pokud si podrží původní vlastnosti.

3. Hodnocení purifikované pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

U purifikované pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena výše uvedená vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita. Výsledek uvedený na Obr. 31 a 32 ukázal, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka měla obě měřené aktivity na podobné úrovni, jako je vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita chimerní anti-HM 1.24 protilátky. Tato skutečnost znamená, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má stejnou vazebnou aktivitu pro antigen jako myší anti-HM 1.24 protilátka.

Příklad 12. Protinádorový účinek chimérické anti-HM 1.24 protilátky proti myšímu modelu lidského myelomu

1. Příprava protilátek k podávání 1 -1. Příprava chimerní anti-HM 1.24 protilátky

Purifikovaná chimerní anti-HM 1.24 protilátka získaná ve výše uvedeném Příkladě 6 byla koncentrována a pufr byl zaměněn za PBS(-) pomocí centrifugační ultrafiltrace na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno Amicon). Dále byla sterilizována filtrací pomocí membránového filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 pm. Filtrát byl upraven na koncentraci 200 pg/ml pomocí filtrací sterilizovaného PBS(-) a takto byl použit v následujících pokusech. Koncentrace • ··· protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 mg/ml.

1-2. Purifikace kontrolního lidského lgG1

Lidský lgG1, který byl použit jako kontrola pro chimerní anti-HM 1.24 protilátky byl čištěn následujícím způsobem. Po přidání stejného objemu PBS(-) k Hu lgG1 Kappa Purified (vyrobeno BINDING SITES), byl čištěn afinitní metodou pomocí vysokorychlostního purifikačního systému pro protilátky ConSep LC100 (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS(-) jako absorbčního pufru a 0,1 M pufru z citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCl (pH 8,0), poté byly koncentrovány centrifugační ultrafiltrací na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno Amicon), koncentrovány, byla provedena náhrada pufru za PBS(-) a nakonec sterilizovány filtrací pomocí filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 μπι. Filtrát byl upraven na koncentraci 200 μg/ml pomocí filtrací sterilizovaného PBS(-) a použit v následujících pokusech. Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 mg/ml.

2. Způsob kvantifikace lidského sérového IgG v myším séru

Lidský IgG, obsažený v myším séru byl kvantifikován následujícím ELISA testem. Do jamek 96ti jamkové ELISA destičky (vyrobeno NUNC) bylo přidáno 100 μΙ kozího protilidského IgG, naředěného na koncentraci 1 pg/ml pomocí 0,1 M hydrouhličitanového pufru a inkubováno přes noc při 4 °C, aby došlo k imobilizací protilátek. Po blokování bylo přidáno 100 μΙ sériově ředěného myšího séra nebo lidského IgG jako standard (vyrobeno CAPPEL) a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo přidáno 100 μΙ 2000krát ředěného protilidského IgG značeného alkalickou fosfatázou a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí byl přidán roztok substrátu, inkubováno, a na přístroji pro odečítání mikrodestiček MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad) byla měřena absorbance při 405 nm.

3. Protinádorový účinek chimerní anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským myelomem

3-1. Příprava myší s transplantovaným lidským myelomem • ···

Myši s transplantovaným lidským myelomem byly připraveny následujícím způsobem. Buňky KPMM2, pasážované in vivo na myších SCID (pěstované v Nihon CLEA) byly připraveny v koncentraci 3 χ 10⁷ buněk/ml v médiu RPMI 1640, doplněném 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL). Dvěstě μΙ výše uvedené suspenze buněk KPMM2 bylo injikováno do ocasní žíly myším SCID (samci, stáří 8 týdnů, pěstované v Nihon CLEA), které den před tím intraperitoneálně obdržely 100 μΙ anti-asialo GM1 (vyrobeno Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.).

3-2. Podávání protilátek

Dvanáctý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum výše uvedených myší s transplantovaným lidským myelomem a lidský IgG v séru byl kvantifikován pomocí ELISA testu, uvedeného výše v bodě 2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru. Ve dnech 14, 21 a 28 po transplantaci buněk KPMM2 bylo těmto myším intraperitoneálně podáno 100 μΙ protilátek, připravených jak uvedeno výše v bodě 1.

3-3. Hodnocení protinádorového účinku chimerní anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským myelomem

Protinádorový účinek chimerní anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen na základě doby přežívání myší. Jak je ukázáno na Obr. 33, ty myši, které dostaly chimerní anti-HM 1.24 protilátku vykazovaly prodlouženou dobu přežívání ve srovnání s těmi, které dostaly kontrolní lidský IgG. Bylo tedy potvrzeno, že chimerní anti-HM

1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidskému myelomu, transplantovanému myším.

Příklad 13: Měření ADCC aktivity pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky

ADCC aktivita (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity - buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách) byla měřena podle metody uveřejněné v Current Protocols of Immunology, kap. 7. Imunologická studia u lidí, Editor, John E, Colligan a kol., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1. Příprava efektorových buněk

Monocyty byly odděleny z periferní krve zdravých lidských jedinců pomocí metody hustotní centrifugace. K periferní krvi zdravých lidských jedinců tedy bylo přidáno stejné množství PBS(-), směs byla navrstvena na Ficoll-Paque Plus (vyrobeno Pharmacia) a centrifugováno při 400 g po dobu 40 minut. Vrstva mononukleárních «·· · · · ···· • · ·· · · · · · · · · · • * · · · ·· ·· ··· ··· ······· · · ····· · · · · · · · · buněk byla odebrána, čtyřikrát promyta médiem RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) a jejich koncentrace byla upravena na 5 χ 10⁶ buněk/ml v témže kultivačním médiu.

Z buněk kostního morku myší SCID (pěstované v Nihon CLEA) byly indukovány LAK (Limphokine Activated Killer Celíš - lymfokinem aktivované killer buňky). Buňky kostního morku byly tedy izolovány ze stehenní kosti myši a dvakrát promyty médiem RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) a jejich hustota upravena na 2 χ 10⁵ buněk/ml v témže kultivačním médiu. Tyto byly inkubovány s 50 ng/ml rekombinantního lidského IL-2 (vyrobeno R & D SYSTEMS) a 10 ng/ml rekombinantního myšího GM-CSF (vyrobeno R & D SYSTEMS) v CO₂ inkubátoru (vyrobeno TABAI) po dobu 7 dní. Počet buněk byl upraven na 2 χ 10⁶ buněk/ml v témže kultivačním médiu.

2. Příprava cílových buněk

Lidská myelomové buněčná linie KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) nebo z leukemie odvozené plazmatické buňky ARH77 (ATCC CCL-1621) byly radioaktivně označeny inkubací v médiu RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) společně s 0,1 mCi ⁵¹Cr-chromanu sodného (vyrobeno ICN) při 37 °C po dobu 60 minut. Po radioaktivním označení byly buňky třikrát promyty týmž*kultivačním médiem a upraveny na koncentraci 2 x 10⁵/ml.

3. Test ADCC

Do jednotlivých jamek 96ti jamkové destičky (dno ve tvaru U) (vyrobeno Becton Dickinson) bylo přidáno 50 μΙ 2 χ 10⁵ cílových buněk/ml, 50 μΙ pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, myší anti-HM 1.24 protilátky, kontrolního lidského lgG1 (vyrobeno THE BINDING SITES) nebo kontrolního myšího lgG2a (UPC10, vyrobeno CAPPEL) a ponecháno reagovat při 4 °C po dobu 15 minut.

Sto μΙ efektorových buněk bylo kultivováno v CO₂ inkubátoru 4 hodiny, když poměr (E:T) efektorových buněk (E) k cílovým buňkám (T) byl nastaven 0:1, 3,2:1,

8:1, 20:1 nebo 50:1.

Sto μΙ supernatantu bylo odebráno a radioaktivita uvolněná do supernatantu kultury byla zjišťována na měřiči záření gama (ARC-300, vyrobeno Aloka). Pro změření maximální radioaktivity byl použit 1% NP-40 (vyrobeno Nakalai). Cytotoxicita (v %) byla spočtena jako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm), ··· ··· ···· • ··· · · «·· · · · · • · · · · ·· ·· ··· ··· «······ ♦ · ····· ·· ·· ·· ·· uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti NP40 a C je radioaktivita (cpm), uvolněná v samotném kultivačním médiu bez protilátky.

Obr. 34 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky, připravené z periferní krve zdravého lidského jedince použity jako efektorové buňky a buňky KPMM2 byly použity jako cílové buňky. Obr. 35 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky, připravené z periferní krve zdravého lidského jedince použity jako efektorové buňky a buňky ARH-77 byly použity jako cílové buňky. Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, cytototoxicita se zvyšovala se zvýšením koncentrace protilátek ve srovnání s kontrolním lidským lgG1, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu.

Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, cytototoxicita se zvýšila ve srovnání s myší anti-HM 1.24 protilátkou, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje vyšší ADCC aktivitu než myší anti-HM 1.24 protilátka. Dále, když byly buňky KPMM2 použity jako cílové buňky, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci 0,1 μg/ml nebo vyšší nezpůsobilo změny v cytototoxicitě, což ukazuje, že koncentrace 1 pg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu. Když byly buňky ARH-77 použity jako cílové buňky, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci 1 μg/ml nebo vyšší ♦ nezpůsobilo změny v cytototoxicitě, což ukazuje, že koncentrace 1 μg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu.

Obr. 36 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky, připravené z kostního morku myší SCID použity jako efektorové buňky. Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, cytototoxicita se zvyšovala se zvýšením koncentrace protilátek ve srovnání s kontrolním lidským lgG1, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu. Dále, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci 0,1 pg/ml nebo vyšší nezpůsobilo změny v cytototoxicitě, což ukazuje, že koncentrace 0,1 μg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu.

Tyto výsledky ukazují, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu ať jsou efektorové buňky odvozeny z člověka nebo z myši.

Příklad 14: Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidskému myelomu na myším modelu

1. Příprava protilátek k podávání ··· · · * 9 9 9 9

9 99 4 9 4 99 9 9 9 9

9 999 99 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99

Pozměněná anti-HM 1.24 protilátka, získaná vnesením plazmidu HEFRVLa-AHM-gK a plazmidu HEF-RVHr-AHM-gYl do buněk CHO byla připravena v koncentracích 40, 200 a 1000 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a kontrolní lidský lgG1, získaný v Příkladu 12.1-2 byl připraven v koncentraci 200 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a tyto byly použity jako podávané protilátky.

2. Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, trasplantovaným myším

2-1. Příprava myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu

Myši s transplantovanými buňkami lidského myelomu byly připraveny tak, jak je popsáno v Příkladě 12.3-1. Byly použity myši SCID (pět týdnů staré, pěstované v Nihon CLEA).

2-2. Podávání protilátek

Devátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu, připravených ve výše uvedeném bodě 2-1 a byl v něm kvantifikován obsah lidského IgG pomocí testu ELISA, který byl popsán dříve v bodě 12.2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru.

Desátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo bylo těmto myším * intravenózně podáno 100 μΙ každé protilátky, připravené výše v bodě 1.

2-3. Hodnocení protinádorového účinku pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, trasplantovaným myším

Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen podle změny množství lidského IgG v myším séru a podle doby přežívání myší.

Změny v množství lidského IgG v myším séru byly kvantifikovány u séra odebraného 35. den po transplantaci buněk KPMM2 tak, že byl zjišťován lidský IgG pomocí ELISA testu, uvedeného v Příkladě 12.2. Výsledek uvedený na Obr. 37 ukazuje, že ve skupině, které byl podán kontrolní lidský IgG, bylo množství lidského IgG 35. den po transplantaci buněk KPMM2 zvýšeno asi 1000krát, ve srovnání s 9. dnem (den před podáním protilátek), zatímco ve skupině, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, bylo toto množství téměř stejné anebo nižší než 9. den, to platilo pro kteroukoli podanou dávku protilátek, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka potlačuje růst buněk KPMM2. Na druhé • •toto··· * · • «to ·· ·· *♦ ·· ·· straně u doby přežívání, jak je uvedeno na Obr. 38, bylo pozorováno její prodloužení u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, oproti kontrolní skupině s kontrolním lidským IgG. Toto ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším.

Příklad 15: Porovnání protinádorového účinku u pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a používaného léku melphalan proti lidskému myelomu na myším modelu

1. Příprava léků pro podání

-1. Příprava protilátek pro podání

Pozměněná anti-HM 1.24 protilátka, získaná vnesením plazmidu HEFRVLa-AHM-gK a plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 do buněk CHO byla připravena v koncentracích 40, 200 a 1000 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a kontrolní lidský lgG1, získaný v Příkladu 12.1-2 byl připraven v koncentraci 200 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a tyto byly použity jako podávané protilátky.

1- 2. Příprava melphalanu

Melphalan (vyrobeno SIGMA), který je současným lékem proti myelomu, byl připraven v koncentraci 0,1 mg/ml za použití 0,2% karboxymetylcelulózy (CMC) (vyrobeno Daicel Chemical Industries, Ltd.).

2. Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a melphalanu proti buňkám lidského myelomu transplantovaným myším

2- 1. Příprava myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu

Myši s transplantovanými buňkami lidského myelomu byly připraveny podle Příkladu 14.2-1.

2-2. Podávání léků

Devátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum zmíněných myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu, připravených ve výše uvedeném bodě 2-1 a byl v něm kvantifikován obsah lidského IgG pomocí testu ELISA, který byl popsán výše v bodě 12.2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru. Desátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo bylo těmto myším intravenózně podáno 100 μΙ každé protilátky, připravené výše v bodě 1-1. Dále bylo od 10. dne po transplantaci myším podáváno • ·» «· ·· ·· ·· »· » ·«· · · · · • ··· · · ··· · · · ·

0 *·· ·· · · ··· ··· ·····«· · ·

000 ·· ·* ·· 4* ·* orálně jednou denně po dobu 5 dnů 200 μΙ 0,2% roztoku CMC. Na druhé straně ve skupině, která dostávala melphalan, byl melphalanový roztok, připravený výše v odstavci 1-2, podáván v množství 100 μΙ na 10 gramů tělesné váhy (1 mg melphalanu/kg) po dobu 5 dnů od 10. dne po transplantaci buněk KPMM2.

2-3. Hodnocení protinádorového účinku pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, trasplantovaným myším Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen podle změny množství lidského IgG v myším séru a podle doby přežívání myší.

Změny v množství lidského IgG v myším séru byly kvantifikovány u séra odebraného 35. den po transplantaci buněk KPMM2 tak, že byl zjišťován lidský IgG pomocí ELISA testu, uvedeného v Příkladě 12.2. Výsledek uvedený na Obr. 39 ukázal, že ve skupině, které byl podán kontrolní lidský IgG, bylo množství lidského IgG 35. den po transplantaci buněk KPMM2 zvýšeno asi 1000krát, ve srovnání s 9. dnem (den před podáním protilátek), zatímco se zdálo, že buňky KPMM2 v těchto myších rostly.

Ve skupině, které byl podán melphalan, bylo množství lidského IgG v séru zvýšeno oproti stavu před podáním léku, ačkoli ne tolikrát, jako ve skupině s kontrolním lidským IgG. Tento výsledek ukazuje, že podání melphalanu nepotlačuje růst buněk KPMM2 dokonale. Na druhé straně u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM

1.24 protilátka, bylo množství lidského IgG v séru bylo v tento den menší, než 9. den po transplantaci, to platilo pro kteroukoli podanou dávku protilátek, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka potlačuje růst buněk KPMM2.

Na druhé straně u doby přežívání bylo rovněž pozorováno, jak je uvedeno na Obr. 40, její prodloužení u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM

1.24 protilátka, oproti kontrolní skupině s kontrolním lidským IgG nebo oproti skupině s melphalanem. Z předešlého plyne, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším a že protinádorový účinek zde představovaných protilátek je silnější, než používaného léku melphalanu.

Výše uvedené výsledky ukazují, že pokud byly použity efektorové buňky odvozené z lidského organizmu, myší anti-HM 1.24 protilátka měla malý cytotoxícký účinek na lidské myelomové buňky, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka a chimerní anti-HM 1.24 protilátka vykazovaly silnou cytotoxicitu. Tato skutečnost

• · · · · • Β Β Β ·· Β· ukazuje důležitost zušlechtění protilátky a poskytuje naději na užitečnost používání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky o člověka.

Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazovala velmi silný protinádorový účinek u myší SCID s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami. Protože u člověka jsou efektorové buňky lidského původu a lymfocyty jsou normálně přítomny, je očekáván ještě silnější protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM

1.24 protilátky.

U modelu myelomu vykazovala pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka ve srovnání s existujícím lékem silný protinádorový účinek a proto se očekává, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka pomůže vytvořit lék nové generace pro léčení myelomu.

Referenční příklad 1. Konstrukce hybridomů produkujícího myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku

Hybridom, který produkuje myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku, byl připraven pomocí metody popsané v Goto, T. a kol., Blood (1994) 84, 1992-1930.

Buněčná linie plazmatických buněk KPC-32 (1 χ 10⁷ buněk), negativní na jaderný antigen viru Epsteina a Baarové, odvozená z kostního morku lidského pacienta s mnohočetným myelomem (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) byla dvakrát intraperitoneálně podána myším BALB/c (pěstované Charles River) každých 6 týdnů.

Aby se dále zvýšil titr vytvořených protilátek, bylo injikováno 1,5 χ 10⁶ buněk KPC-32 do sleziny myši tři dny před jejím utracením (Goto, T. a kol., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po usmrcení myši jí byla odebrána slezina a slezinné buňky odebrané podle Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) byly použity k buněčné fúzi s myelomovými buňkami SP2/0.

Protilátky v supernatantu hybridomových kultur byly vyšetřovány testem ELISA (Posner, M. R. a kol., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) za použití destiček pokrytých buňkami KPC-32. Padesát tisíc buněk KPC-32 bylo suspendováno v 50 ml PBS a rozplněno do destiček s 96 jamkami (dno tvaru „U“, Corning, vyrobeno lwaki). Po blokování pomocí PBS, obsahujícího 1% hovězí serumalbumin (BSA), byl přidán supernatant z hybridomů a inkubován 2 hodiny při 4 °C. Poté reagoval s kozí protilátkou proti myšímu IgG (vyrobeno Zymed), označenou peroxidázou 1 hodinu při • · · · · · · · • ·· · ···· · ·· · ······ · · • · ·· ·· ·· · · °C, jednou promyt a nakonec byla provedena reakce s roztokem substrátu (ofenyldiamin) (vyrobeno Sumimoto Bakelite) při teplotě místnosti 30 minut.

Po ukončení reakce přidáním 2 N kyselinou sírovou, byla měřena absorbance při 492 nm pomocí přístroje na čtení destiček ELISA (vyrobeno Bio-Rad). Aby se vyloučily hybridomy produkující protilátky proti lidskému imunoglobulinu, byly supernatanty pozitivních hybridomových kultur předem absorbovány s lidským sérem a byla vyšetřována jejich reaktivita s jinými subcelulárními složkami. Pozitivní hybridomy byly vybrány a metodou průtokové cytometrie byla zjišťována jejich reaktivita s různými buněčnými liniemi a lidskými vzorky. Hybridomové klony, které byly nakonec vybrány, byly dvakrát klonovány, injikovány do břišní dutiny myší BALB/c, kterým byl podán přistaň, a nakonec byla z těchto myší získána ascitická tekutina.

Monoklonální protilátka z myších ascitů byla čištěna srážením síranem amonným a pomocí afinitní chromatografické soupravy s Proteinem A (Ampure PA, vyrobeno Amersham). Vyčištěná protilátka byla konjugována sfluorescein izothiokyanátem (FITC) pomocí soupravy Quick Tag FITC konjugační soupravy (vyrobeno Boehringer Mannheim).

Výsledkem bylo, že monoklonální protilátky, produkované 30 hybridomovými klony, reagovalo s buňkami KPC-32 a RPMI 8226. Po klonování byla testována reaktivita supernatantu z těchto hybridomů s jinými buněčnými liniemi a mononukleárními buňkami, odvozenými z periferní krve.

Byly mezi nimi tři klony, které produkovaly monoklonální protilátky specificky reagující s plazmatickými buňkami. Z těchto tří byl vybrán hybridomový klon produkující monoklonální protilátku, která je nejužitečnější pro průtokovou cytometrickou analýzu a která má na komplementu závislou cytotoxicitu proti buňkám RPUI 8226 a byl nazván HM1.24. Podtřída monoklonální protilátky, produkované tímto hybridomem, byla určena testem ELISA za použití králičích protimyších protilátek, specifických k jednotlivým podtřídám (vyrobeno Zymed). Anti-HM 1.24 protilátka byla podtřídy lgG2a k. Hybridom, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku byl uložen pro mezinárodní použití 14. září 1995 v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP-5233 za podmínek Budapešťské smlouvy.

• ··· ···· ··· · ···· · ·· · ·«···· · · • · · · ·· ·· · ·

Referenční příklad 2. Klonování cDNA, kódující polypeptid HM 1.24 antigenu

1. Konstrukce cDNA knihovny

1) Příprava celkové RNA cDNA kódující HM 1.24 antigen, což je polypeptid specificky rozpoznávaný myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátkou, byla připravena následujícím způsobem.

Z lidské buněčné linie KPMM2, odvozené z mnohočetného myelomu, byla připravena celková RNA pomocí metody Chirgwin a kol., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Tedy 2,2 x 10⁸ buněk KPMM2 bylo kompletně homogenizováno v 20 ml 4 M guanidin thiokyanátu (vyrobeno Nakalai tesque).

Homogenát byl nanesen na vrstvu 5,3 M chloridu česného v centrifugační zkumavce a potom centrifugován v rotoru Beckman SW40 při 31 000 ot/min při teplotě 20 °C po dobu 24 hodin, aby došlo k vysrážení RNA. Sraženina RNA byla promyta 70% etanolem, rozpuštěna v 300 μΙ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), obsahujícího 1 mM EDTA a 5% SDS. Po přidání Pronazy (vyrobeno Boehringer) do koncentrace 0,5 mg/ml, bylo inkubováno 30 minut při teplotě 37 °C. Směs byla extrahována fenolem a chloroformem a RNA vysrážena. Poté byla sraženina RNA rozpuštěna v 200 μΙ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), obsahujícího 1 mM EDTA.

2) Příprava póly (A)+RNA

Při použití 500 μρ celkové RNA, připravené jak bylo popsáno výše, jakožto výchozího materiálu, poly(A)+RNA byla čištěna pomocí soupravy Fast Track 2.0m RNA Isolation Kit (vyrobeno Invitrogen), postupem uvedeným v návodu soupravy.

3) Konstrukce knihovny cDNA

Při použití 10 μρ preparátu poly(A)+ RNA, připraveného jak bylo popsáno výše, jakožto výchozího materiálu, byla syntetizována dvojřetězcová cDNA pomocí soupravy pro syntézu cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (vyrobeno Pharmacia), postupem uvedeným v návodu k soupravě, a za použití soupravy Directional Cloning Toolbox (vyrobeno Pharmacia) byl k ní přiligován EcoRI adapter, postupem uvedeným v návodu k soupravě. Kinázování a štěpení EcoRI adaptéru pomocí restrikčního enzymu Notl bylo provedeno podle návodu přiloženého k soupravě. Dále byla dvojřetězcová cDNA s adaptérem, která měla velikost 500 bp nebo vyšší, izolována a vyčištěna pomocí 1,5% nízkotající agarózy (vyrobeno Sigma) a nakonec bylo získáno 40 μΙ dvojřetězcové cDNA s připojeným adaptérem.

o · · · · * · • · ·· · · ··

Takto připravená dvojřetězcová cDNA s připojeným adaptérem byla ligována pomoci T4 DNA ligázy (vyrobeno GIBCO BRL) do vektoru pCOSl (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-255196), který byl předem zpracován restrikčními enzymy EcoRI a Notl a alkalickou fosfatázou (vyrobeno Takara Shuzo), a tím zkonstruována knihovna cDNA. Zkonstruovaná knihovna cDNA byla transdukována do kmene Escherichia coli DH5a (vyrobeno GIBCO BRL) a celkový počet nazávislých klonů byl odhadnut na 2,5 χ 10⁶.

2. Klonování přímou expresí

1) Transfekce do buněk COS-7 cDNA byla amplifikována pěstováním 5 χ 10⁵ klonů Escherichia coli, připravených jak bylo uvedeno výše, v médiu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plazmidová DNA byla získána z Escherichia coli alkalickou izolační metodou (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Získaná plazmidová DNA byla transfekována do buněk COS-7 elektroporací za pomoci přístroje Gene Pulsar (vyrobeno BioRad).

pg čištěné plazmidové DNA bylo přidáno do 0,8 ml buněk COS-7, které byly suspendovány v PBS na koncentraci 1 χ 10⁷ buněk /ml a bylo na ně působeno elektrickými pulzy o napětí 1500 V a kapacitě 25 pF. Po 10 minutovém zotavovacím období při teplotě místnosti byly elektroporézované buňky pěstovány po dobu třech dní při 37 °C a 5% CO₂ v médiu DMEM (vyrobeno GIBCO BRL), doplněného 10% fetálním hovězím sérem.

2) Příprava adsorbční plotny

Adsorbční plotna pokrytá myší anti-HM 1.24 protilátkou byla připravena metodou podle B. Seed a kol., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Myší anti-HM 1.24 protilátka byla přidána do 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 v koncentraci 10 pg/ml. Tři ml takto připraveného roztoku protilátek bylo přidáno na plotnu pro tkáňovou kultivaci o průměru 60 mm a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Poté byla plotna třikrát promyta roztokem 0,15 M NaCl, blokována PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum, 1 mM EDTA, 0,02% NaN₃ a takto připravené plotny byly použity pro následující klonování.

3) Klonování cDNA knihovny

4 4 ··· 4 4 4 4

4 4 4 4 4444 9 94 ·

4 4 · 4 44 · * 994 449

444 4449 9 4

444 44 44 44 44 44

Buňky COS-7 transfekované tak, jak bylo popsáno výše, byly rozptýleny v PBS, obsahujícím 5 mM EDTA a poté jedenkrát promyty PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum. Buňky byly pak suspendovány v PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum a 0,02% NaN₃ na koncentraci 1 χ 10⁶ buněk/ml, která byla pak přidána k adsorbční plotně, připravené jak bylo popsáno výše, a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po trojím opatrném promytí s PBS obsahujícím 5% fetální hovězí sérum a 0,02% NaN₃, byla plazmidová DNA izolována z buněk vázaných k adsorbční plotně, za použití roztoku obsahujícího 0,6% SDS a 10 mM EDTA.

Získaná plazmidová DNA byla opět transdukována do buněk Escherichia coli DH5a. Po amplifikaci plazmidové DNA, jak je výše uvedeno, byla DNA izolována alkalickou metodou. Získaná plazmidová DNA byla transfekována elektroporační metodou do buněk COS-7 a plazmidová DNA izolována z adsorbovaných buněk, jak je popsáno výše. Tentýž postup byl opakován ještě jednou a získaná plazmidová DNA byla štěpena restrikčnimi enzymy EcoRI a Notl. Na závěr byla potvrzena koncentrace inzertu o velikosti 0,9 kbp. Buňky Escherichia coli, transdukované částí získané plazmidové DNA byly naočkovány na plotny s agarem 2YT, obsahujícím ampicilin o koncentraci 50 pg/ml. Po kultivaci přes noc byla z jedné kolonie izolována DNA. Ta byla štěpena restrikčnimi enzymy EcoRI a Notl a získán klon p3.19, nesoucí inzert 0,9 kbp.

Sekvence bází tohoto klonu byla určena pomocí sekvenační soupravy PRISM, Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrobeno Perkin Elmer) podle návodu, přiloženého k soupravě a DNA sekvenátoru ABI 373A (vyrobeno Perkin Elmer). Jeho aminokyselinová sekvence a sekvence bází jsou ukázány v SEQ ID NO: 103.

Komplementární DNA, která kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO. 103 byla vnesena do Xbal štěpícího místa ve vektoru pUC19 a připravena jako plazmid pRS38-pl)C19. Escherichia coli, obsahující tento plazmid pRS38-pUC19 byla uložena pro mezinárodní použití 5. října 1993 jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP-4434 za podmínek Budapešťské smlouvy (viz Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).

······ · · ····· · · ·· ·· ··

Průmyslová využitelnost

Protože chimerní anti-HM 1.24 protilátka je složena z variabilní oblasti, která pochází z myší anti-HM 1.24 protilátky a konstantní oblasti, pocházející z lidské protilátky a pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka je složena z oblasti určující komplementaritu, která pochází z myší anti-HM 1.24 protilátky, podpůrné oblasti pocházející z lidské protilátky a konstantní oblasti pocházející z lidské protilátky, má pro člověka nízkou antigenicitu, a proto se očekává, že bude používána jako léčebný prostředek, zvláště pro léčení myelomu.

Seznam organizmů, uložených pro mezinárodní použití

Název: National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI

Adresa: Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan

1. Escherichia coli DH5a (pRS 38-pUC19)

Přístupové č.: FERM BP-4434 Datum uložení: 5. října 1993

2. Hybridom myš-myš HM1.24

Přístupové č.: FERM BP-5233 Datum uložení: 27. dubna 1995

3. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1)

Přístupové č.: FERM BP-5643 Datum uložení: 29. srpna 1996

4. Escherichia coli DH5ct (pUC19-1 24H-gy1)

Přístupové č.: FERM BP-5644 Datum uložení: 29. srpna 1996

5. Escherichia coli DH5a (pl)C19-RVLa-AHM-gK)

Přístupové č.: FERM BP-5645 Datum uložení: 29. srpna 1996

6. Escherichia coli DH5a (pUC19-1 24L-gK)

Přístupové č.: FERM BP-5646 Datum uložení: 29. srpna 1996

7. Escherichia coli DH5ct (pUC19-RVHs-AHM-gy1)

Přístupové č.: FERM BP-6127 Datum uložení: 29. září 1997

7^///3-99

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chimerní L řetězec vyznačující se tím, že obsahuje konstantní oblast (C oblast) lidského lehkého (L) řetězce a variabilní (V) oblast L řetězce anti-HM

1.24 protilátky.
2. Chimerní L řetězec podle nároku 1, kde uvedená V oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1.
3. Chimerní L řetězec podle nároku 1, kde uvedená C oblast lidského L řetězce je Ck.
4. Chimerní H řetězec vyznačující se tím, že obsahuje konstantní oblast lidského těžkého (H) řetězce a V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
5. Chimerní H řetězec podle nároku 4, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
6. Chimerní H řetězec podle nároku 4, kde uvedená C oblast lidského H řetězce je Cy.
7. Chimerní protilátka vyznačující se tím, že obsahuje (1) L řetězec, obsahující C oblast lidského L řetězce a V oblast L řetězce anti-HM

1.24 protilátky; a (2) H řetězec, obsahující C oblast lidského H řetězce a V oblast H řetězce anti-HM

1.24 protilátky.
8. Chimerní protilátka podle nároku 7, kde uvedená V oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1 a uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
9. Oblast V pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, vyznačující se t i m, že obsahuje (1) podpůrnou oblast (FR) V oblasti lidského L řetězce; a (2) CDR oblast V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
10. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 9, kde uvedená CDR oblast má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v některé z následujících aminokyselinových sekvencí:

CDR1: Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala (SEQ ID NO: 3)

CDR2: Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr (SEQ ID NO: 4)

CDR3: Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr (SEQ ID NO: 5).
11. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 10, kde uvedená FR oblast je odvozena z FR lidské protilátky lidské podskupiny I (HSGI).
12. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 11, kde uvedená FR oblast je odvozena z FR lidské protilátky REI.
13. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku T1, kde uvedená FR oblast je v podstatě shodná s FR lidské protilátky REI.
14. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 11, kde uvedená V oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Tabulce 1 jako RVLa.
15. Oblast V pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky, vyznačující se t i m, že obsahuje (1) FR V oblasti lidského H řetězce; a (2) CDR oblast V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

• · · · · · · · ··· · <*··· · · · · ······ · · • · ·· ·· · · · ·
16. Oblast V pozměněného lidského H řetězce podle nároku 15, kde uvedená CDR oblast má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v některé z následujících aminokyselinových sekvencí:

CDR1: Pro Tyr Trp Met Gin (SEQ ID NO: 6)

CDR2: Ser lle Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 7)

CDR3: Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe AspTyr (SEQ ID NO: 8).
17. Oblast V pozměněného lidského H řetězce podle nároku 16, kde uvedená FR oblast je odvozena z FR lidské protilátky HSGI.
18. Oblast V pozměněného lidského H řetězce podle nároku 16, kde uvedené oblasti FR 1 až 3 jsou odvozeny z FR 1 až 3 lidské protilátky HG3.
19. Oblast V pozměněného lidského H řetězce podle nároku 16, kde uvedené FR oblasti 1 až 3 jsou v podstatě shodné s oblastmi FR 1 až 3 lidské protilátky HG3 a uvedená FR4je v podstatě shodná s oblastí FR4 lidské protilátky JH6.
20. Řetězec H pozměněné lidské protilátky podle nároku 16,* kde aminokyselina v pozici 30 podle Kabátových definicí v uvedené FR1 je threonin, aminokyselina v pozici 71 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin a aminokyselina v pozici 78 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin.
21. Řetězec H pozměněné lidské protilátky podle nároku 16, kde aminokyselina v pozici 73 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je lyzin.
22. Oblast V pozměněného lidského H řetězce podle nároku 17, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr nebo RVHs v Tabulkách 2 až 4.
23. Pozměněný lidský L řetězec anti-HM 1.24 protilátky, vyznačující se tím, že obsahuje (1) C oblast lidského L řetězce; a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR lidského L řetězce a CDR L řetězce anti-HM

1.24 protilátky.
24. Pozměněný lidský L řetězec podle nároku 23, kde uvedená C oblast lidského L řetězce je lidská Ck oblast, uvedená FR oblast lidského L řetězce je odvozena z FR lidské protilátky HSGI a uvedená CDR oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 10.
25. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 23, kde uvedená FR oblast je odvozena z FR lidské protilátky REI.
26. Oblast V pozměněného lidského L řetězce podle nároku 23, kde uvedená FR oblast je v podstatě shodná s FR oblastí lidské protilátky REI.
27. Pozměněný lidský L řetězec podle nároku 23, kde uvedená V oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Tabulce 3 jako RVLa.'
28. Pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky, vyznačující se tím, že obsahuje (1) C oblast lidského H řetězce; a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR lidského H řetězce a CDR H řetězce anti-HM

1.24 protilátky.
29. Pozměněný lidský H řetězec podle nároku 28, kde uvedená C oblast lidského H řetězce je lidská Cy1 oblast, uvedená FR oblast lidského H řetězce je odvozena z FR lidské protilátky HSGI a uvedená CDR H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 16.

• ·
30. Pozměněný lidský H řetězec podle nároku 28, kde uvedené FR 1 až 3 jsou odvozeny z FR 1-3 lidské protilátky HG3 a uvedená FR4 je odvozena z FR4 lidské protilátky JH6.
31. Pozměněný lidský H řetězec podle nároku 28, kde uvedené FR 1 až 3 jsou v podstatě shodné s FR 1 až 3 lidské protilátky HG3 a uvedená FR4 je v podstatě shodná s FR4 lidské protilátky JH6.
32. H řetězec pozměněné lidské protilátky podle nároku 28, kde aminokyselina v pozici 30 podle Kabátových definicí v uvedené FR1 je threonin, aminokyselina v pozici 71 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin a aminokyselina v pozici 78 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin.
33. H řetězec pozměněné lidské protilátky podle nároku 28, kde aminokyselina v pozici 73 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je lyzin.
34. Pozměněný lidský H řetězec podle nároku 28, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr nebo RVHs v Tabulkách 2 až 4.
35. Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, vyznačující se tím, že obsahuje (A) L řetězec obsahující (1) C oblast lidského L řetězce a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR lidského L řetězce a CDR L řetězce antiHM 1.24 protilátky a (Β) H řetězec obsahující (1) C oblast lidského H řetězce a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR lidského H řetězce a CDR H řetězce antiHM 1.24 protilátky.
36. Pozměněná lidská protilátka podle nároku 35, kde uvedená CDR oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 10 a uvedená CDR oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 16.
37. Pozměněná lidská protilátka podle nároku 35, kde uvedená CDR oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 10; uvedená CDR oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v nároku 16; uvedená FR oblast lidského L řetězce je odvozena z FR protilátky HSGI; uvedená FR oblast lidského H řetězce je odvozena z FR protilátky HSGI; uvedená C oblast lidského L řetězce je lidská oblast Ck; a uvedená C oblast lidského H řetězce je lidská oblast Cy1.
38. Pozměněný lidský H řetězec podle nároku 35, kde uvedená FR L řetězce je odvozena z FR lidské protilátky REI, uvedená FR 1 až 3 H řetězce je odvozena z lidské protilátky HG3 a uvedená FR4 H řetězce je odvozena z FR4 lidské protilátky JH6.
39. Pozměněná lidská protilátka podle nároku 35, kde uvedená V oblast L řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Tabulce 1 jako RVLa.
40. Pozměněná lidská protilátka podle nároku 35, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr nebo RVHs v Tabulkách 2 až 4.
41. DNA kódující V oblast L řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
42. DNA podle nároku 41, kde uvedená V oblast L řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1.
43. DNA podle nároku 41, kde DNA, která kóduje uvedenou V oblast L řetězce má nukleotidovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1.
44. DNA kódující V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.

• 0····· · · ····· · · · · ·0 · ·
45. DNA podle nároku 44, kde uvedená V oblast H řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
46. DNA podle nároku 44, kde DNA, která kóduje uvedenou V oblast H řetězce má nukleotidovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
47. DNA kódující chimerní L řetězec vyznačující se tím, že obsahuje:

(1) C oblast lidského L řetězce a (2) V oblast L řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
48. DNA podle nároku 47, kde uvedená V oblast L řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1.
49. DNA podle nároku 47, kde uvedená V oblast L řetězce má nukleotidovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 1.
50. DNA kódující chimerní H řetězec vyznačující se tím, že obsahuje:

(1) C oblast lidského H řetězce a (2) V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
51. DNA podle nároku 50, kde uvedená V oblast H řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
52. DNA podle nároku 50, kde uvedená V oblast H řetězce má nukleotidovou sekvenci, uvedenou v SEQ ID NO: 2.
53. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se tím, že obsahuje:

(1) FR V oblasti lidského L řetězce a (2) CDR V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
54. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce podle nároku 53, kde uvedená CDR má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou nároku 10.

• •toto • ••••to* · · • · · ·· ·· ·· ·· · ·
55. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce podle nároku 53, kde uvedená FRje odvozena z FR lidské protilátky HSGI.
56. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce podle nároku 53, kde uvedená FRje odvozena z FR lidské protilátky REI.
57. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce podle nároku 53, kde uvedená FRje v podstatě shodná s FR lidské protilátky REI.
58. DNA podle nároku 51, kde uvedená V oblast L řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Tabulce 1 jako RVLa.
59. DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce podle nároku 53, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9.
60. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se tím, že obsahuje:

(1) FR V oblasti lidského H řetězce a (2) CDR V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
61. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, kde uvedená CDR má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou nároku 16.
62. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, kde uvedená FRje odvozena z FR lidské protilátky HSGI.
63. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, kde uvedené FR 1 až 3 jsou odvozeny z FR 1 až 3 lidské protilátky HG3.
64. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, kde uvedené FR 1 až 3 jsou v podstatě shodné s FR 1 až 3 lidské protilátky HG3.
65. DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské protilátky podle nároku 60, kde aminokyselina v pozici 30 podle Kabátových definicí v uvedené FR1 je threonin, aminokyselina v pozici 71 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin a aminokyselina v pozici 78 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je alanin.
66. DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské protilátky podle nároku 60, kde aminokyselina v pozici 73 podle Kabátových definicí v uvedené FR3 je lyzin.
67. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr nebo RVHs v Tabulkách 2 až 4.
68. DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce podle nároku 60, která má nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 nebo 102.
69. DNA kódující pozměněný lidský L řetězec anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se t í m, že obsahuje:

(1) C oblast lidského L řetězce a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR a CDR L řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
70. DNA podle nároku 69, kde uvedená V oblast L řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Tabulce 1 jako RVLa.
71. DNA podle nároku 69, kde uvedená V oblast L řetězce má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9.
72. DNA podle nároku 69, kde uvedená C oblast L řetězce je oblast Ck lidského L řetězce.
73. DNA kódující pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se t í m, že obsahuje:

• · • « ······ · · ·· · · ·· · · · · (1) C oblast lidského H řetězce a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR lidského H řetězce a CDR H řetězce anti-HM

1.24 protilátky.
74. DNA kódující pozměněný lidský H řetězec podle nároku 73, kde uvedená V oblast H řetězce má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHI, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr nebo RVHs v Tabulkách 2 až 4.
75. DNA kódující pozměněný lidský H řetězec podle nároku 73, kde uvedená V oblast H řetězce má nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28 nebo 102.
76. DNA kódující pozměněný lidský H řetězec podle nároku 73, kde uvedená C oblast lidského H řetězce je oblast Cy1 z lidského H řetězce.
77. Vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 a 76.
78. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že je transformována vektorem, který obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 a 76.
79. Způsob přípravy chimerní formy anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se tím, že obsahuje kroky: pěstování hostitelských buněk transformovaných současně expresním vektorem, který obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků 41,

42, 43, 47, 48 a 49, a expresním vektorem, který obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků 44, 45, 46, 50, 51 a 52; a získávání požadované protilátky.
80. Způsob přípravy pozměněné lidské protilátky anti-HM 1.24 protilátky vyznačující se tím, že obsahuje kroky: pěstování hostitelských buněk • ·· 44 44 4· 44

4 4 4 4 4 4 4444

4444 4 4444 4 44 4

44 ··· 44 «4 444 444

444 4444 4 4

444 44 44 44 4« 44 transformovaných současně expresním vektorem, který obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 69, 70, 71 a 72, a expresním vektorem, který obsahuje DNA podle kteréhokoli z nároků 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 a 76; a získávání požadované protilátky.
81. Farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku chimerní protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103.
82. Farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku chimerní anti-HM 1.24 protilátku.
83. Léčebné činidlo pro myelom, obsahující jako aktivní složku chimerní protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103.
84. Léčebné činidlo pro myelom, obsahující jako aktivní složku chimerní anti-HM 1.24 protilátku.

*
85. Farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103.
86. Farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou antiHM 1.24 protilátku.
87. Léčebné činidlo pro myelom, obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103.
88. Léčebné činidlo pro myelom, obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku.